techniques biochimiques

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed Boudiaf-M’sila

Faculté des Sciences

Département de Microbiologie & Biochimie

Polycopié de :

Techniques Biochimiques

Polycopié destiné aux Etudiants en 3ième Année Licence en Biochimie

Chargé de TP : Dr. RÉGGAMI Yassine

Année universitaire : 2019-2020

Semestre : 6 Unité d’enseignement Fondamentale 2 (UEF 3.2.): Techniques biochimiques et méthodes spectrales Matière 1: Techniques Biochimiques Crédits : 8

Coefficient : 3

Objectifs de l’enseignement Mettre l’accent sur les techniques de fractionnement et les différentes méthodes de séparation chromatographiques et électrophorétiques ainsi que leurs applications dans le domaine de l’analyse pour l’extraction, l’identification, et la quantification des molécules et plus particulièrement des substances biochimiques. Connaissances requises recommandées : Avoir des connaissances en biophysique et en biochimie acquises en L2. Contenu de la matière : 1. Filtration

1.1. Définition & principe 1.2. Matériels & Applications

2. Sédimentation 2.1. Définition & principe 2.2. Centrifugation 2.3. Ultracentrifugation

3. Méthodes chromatographiques 3.1. Paramètres d'une analyse chromatographique 3.2. Conditions d'une séparation par chromatographie 3.3. Les différents types de chromatographie & leurs applications

4 Méthodes électrophorétiques : 4.1. Définition & principes 4.2. Paramètres et conditions de réalisation 4.3. Différents types d'électrophorèse et leurs applications

Mode d’évaluation : Contrôle continu, Exposés, Posters, Interrogations, Compte rendu de TP, examen de TD et de TP. Références : Thèses, livres et articles scientifiques, polycopies, sites internet.

Techniques biochimiques I. FILTRATION

Page 1 sur 4

1.1. Définition & Principe La filtration et l'essorage sont des procédés de séparation utilisés communément en biochimie,

permettant de séparer les constituants d’un mélange qui possède une phase liquide et une phase solide au travers d’un milieu poreux (Filtre).

Ces deux techniques diffèrent uniquement par la nature de la phase à isoler, mais reposent sur le même principe.

Si le produit d'intérêt est un solide dispersé dans un liquide ; l'opération qui consiste à l'isoler est appelée « essorage », ce que le filtre retient se nomme un résidu (aussi communément appelé "gâteau" ou retentât).

Au contraire, si le produit d'intérêt est une solution tandis que des produits secondaires ou des impuretés sont sous forme solide ; l'opération qui consiste à récupérer la phase liquide est appelée filtration et le liquide obtenu filtrat.

Deux phénomènes accompagnent souvent la filtration:

Le colmatage: La pénétration des particules dans les interstices [petits espaces vides entre les parties du filtre] de la matière filtrante provoque le phénomène du colmatage. Ceci modifie la porosité et ralentie la filtration.

L’adsorption: elle résulte de la charge électrique qui possède la matière filtrante. Ceci induit la rétention de certains produits par le filtre malgré que leurs dimensions permettent leur passage à travers les pores du filtre.

1. 2. Matériel de filtration

Le matériel de filtration regroupe principalement des filtres et des entonnoirs. 1. 2. 1. Les filtres

Il existe deux types de filtre, les filtres d’épaisseur et les filtres membranes. L’utilisation de l’un de ces deux types dépend du but de l’expérience, de la qualité et la quantité du matériel à filtrer. Ils peuvent être utilisés séparément ou ensemble, selon les besoins.

Les filtres doivent être inerte chimiquement et physiquement vis-à-vis du liquide à filtrer; insolubles et ne subissent aucun changement d’état physique (gonflement, rétrécissement, distorsion).

a) Les filtres d’épaisseur (épais ou en profondeur)

Ils retiennent les particules dans un réseau de fibres (papier, amiante, cellulose, coton, fibre de verre, etc.) ou de canalicules (verre fritté, sable, charbon, etc.). L’efficacité d’un filtre en profondeur augmente avec son épaisseur par contre elle diminue lorsque la pression appliquée sur le filtre augmente. Les matériaux utilisés dans les filtres d’épaisseur sont:

Les papiers filtres classiques, qui diffèrent par leurs formes (en feuilles rectangulaires, circulaires, plissées, etc.), leur texture (lâche, fine), leur porosité (Il existe un code de couleur ou de numérotation définissant la porosité du papier), leur pureté (brut, purifié, sans cendre, etc.). Il existe des papiers filtre sans cendres, déminéralisés par lavage aux acides, d’une très grande pureté et qui, après combustion, n’ajoutent aucun élément étranger au précipité.

Les textiles: gaze, coton, laine. Les fibres: laine de verre, amiante.


Page 2 sur 4

Les terres d’infusoires, argiles et porcelaine. Le matériel fritté: le verre fritté est obtenu par compression à température contrôlée de

microbilles de verre. Des porosités différentes sont obtenues selon le diamètre de ces grains et la température de frittage. Les porosités sont codées de 0 (larges pores) à 4 (pores étroits).

b) Les filtres membranes (écrans ou de surface) Les membranes filtrantes sont constituées de cellulose, d’acétate de cellulose, de nitrate de

cellulose ou de téflon. Le diamètre des pores est faible, et varie de 5 à 35 nm pour l’ultra-filtration et de 0.1 à 8 m pour la microfiltration.

Les membranes de la microfiltration permettent une filtration rapide, malgré le faible diamètre des pores, cela est dû à leur faible épaisseur et à la forte densité des pores (1010 pores/cm2). Ces membranes ne sont constituées que par 15 à 35% de leur volume par de la matière, le reste étant occupé par des pores.

1. 2. 2. Les entonnoirs

Ce sont des instruments en forme de cône, terminés par un tube et destinés à recevoir un matériel filtrant. Deux types d’entonnoirs sont distingués: a) Les entonnoirs ordinaires: peuvent être en verre, en porcelaine ou en plastique (Fig. 1).

Figure 1. L’entonnoir ordinaire.

b) Les entonnoirs perforés: Sont des entonnoirs en porcelaine ou en plastique dont le fond est troué à la manière d’un tamis sur lequel est disposé un papier filtre (Fig. 2). Deux types d’entonnoirs se distinguent dans cette catégorie:

Les entonnoirs de BUCHNER: Utilisés pour la filtration de quantités assez importantes de solide. Cet entonnoir a été inventé par l'industriel chimiste allemand Ernst Wilhelm Büchner (1850-1925).

Les entonnoirs de HIRSCH: Utilisés pour la récupération de petites quantités de solide.

Figure 2. Entonnoirs de BUCHNER (a) et de HIRSCH (b).


Page 3 sur 4

c) L'entonnoir en verre fritté : Il s'agit d’un entonnoir en porcelaine sur lequel on verse directement le mélange, il est utilisé pour la filtration des solides constitués de particules trop fines qui risquent de passer à travers le papier filtre. Différentes porosités de verre fritté existent, il convient de choisir celle adaptée à la taille des particules de solide à filtrer. Une porosité moyenne est codifiée de 1 à 5. Lorsque le chiffre augmente, la porosité diminue : le chiffre 4 correspond à des pores de diamètre compris entre 10 et 16 µm contre 40 et 100 µm pour le chiffre 2.

Figure 3 : À gauche : entonnoir Büchner (sans le filtre). À droite : entonnoir en verre fritté.

Vues de dessus (haut) et de profil (bas).

1. 3. Méthodes de filtration

Il existe plusieurs procédés de filtration.

1. 3. 1. Filtration gravimétrique (filtration par gravité) La filtration peut s'effectuer simplement par gravité en utilisant un entonnoir muni d'un papier

filtre plissé et un erlenmeyer pour recueillir le liquide filtré (Fig.4).

Figure 4. Montage de filtration par gravité.

La filtration gravimétrique présente les inconvénients suivants: La filtration est lente. La difficulté de récupération de la phase solide isolée, surtout lorsqu’elle est peu abondante. La séparation est incomplète: le solide retient une quantité non négligeable de liquide.


Page 4 sur 4

1. 3. 2. Filtration sous vide

Le montage de base d’une filtration sous vide (Fig. 5) est constitué d'un entonnoir (Büchner ou en verre fritté) et d'une fiole à vide, cette dernière est branchée sur un système d'aspiration (trompe à eau ou pompe) qui permet d'obtenir un vide relatif (dépression) en aval du matériau filtrant, ceci augment considérablement la vitesse de filtration. L’entonnoir est adapté sur la fiole par l’intermédiaire d’un cône en caoutchouc, qui collera à la fiole et l’entonnoir lorsque la dépression est établie.

Figure 5. Montage de filtration sous vide.

1. 3. 3. Filtration sous pression La vitesse de filtration peut être également augmentée en exerçant une pression sur le

liquide à filtrer en amant du matériel filtrant. La filtration sous pression évite le moussage et l’évaporation du solvant; elle est d’un emploi fréquent dans l’industrie.

Ce système de filtration sous pression avec membranes filtrantes existe également sous forme de cartouches filtrantes (millipore) adaptable sur une seringue pratique (Fig. 6) pour la filtration des petits volumes de solution à filtrer.

Figure 6. Filtration sous pression avec cartouche filtrante.

Techniques biochimiques 2. PROCEDES DE FILTRATION MEMBRANAIRE

Page 1

Introduction : Bien que connus depuis fort longtemps, les procédés de séparation membranaire ont suivi un

développement industriel récent et très rapide. Depuis les années 1970, on retrouve ces techniques principalement dans l’industrie laitière, des boissons, des ovo-produits, des jus et concentrés de fruits et légumes, du traitement de l’eau, ainsi que dans les secteurs pharmaceutique, chimique, biotechnologique et de l’environnement. Elles sont en particulier aussi utilisées pour la potabilisation des eaux, les traitements des eaux usées et la valorisation de sous-produits.

Les procédés de séparation membranaire sont utilisés pour séparer et surtout concentrer des molécules ou des espèces ioniques en solution, ou pour séparer des particules ou des microorganismes en suspension dans un liquide.

Le but recherché peut être de concentrer une solution, d’isoler ou de séparer un ou plusieurs constituants. Pour ce faire, des membranes sélectives sont utilisées, c’est-à-dire des barrières minces, qui sous l’effet d’une force arrêtent ou laissent passer des substances entre les deux milieux qu’elles séparent (Figure 1). Cette force peut être un gradient de pression, un gradient de potentiel électrique ou un gradient de potentiel chimique, souvent assimilé à un gradient de concentration.

Figure 1 : Schéma du principe du fonctionnement d’une membrane sélective.

On distingue deux types de procédés, la filtration tangentielle et la filtration frontale. 1. Principes et principaux paramètres de la filtration :

1.1.Principe de la filtration tangentielle :

Le fluide circule parallèlement à la membrane à partir d’un réservoir sous l’action d’une pompe. Seule une partie, le perméat traverse les pores de la membrane par l’effet d’une différence de pression (pression transmembranaire, ptm) tandis que le reste (retentât) est évacué ou recyclé sur le réservoir. Les pores de la membrane vont arrêter les macromolécules et les particules de taille supérieure, tandis que les microsolutés (molécules et particules plus petites que les pores) passeront dans le perméat.

1.2. Principe de la filtration frontale :

Dans ce cas, le fluide est forcé de traverser la membrane placée perpendiculaire à l’écoulement et la concentration du retentât augmente rapidement. Ce système est surtout employé avec des fluides dilués et le colmatage de la membrane est plus rapide qu’en filtration tangentielle.


Page 2

1.3. Principaux paramètres de la filtration : Le débit de perméat (ou filtrat) QF, est le débit traversant la membrane, en m3/s ou en lit/heure

(L/h). Le flux de perméat est J = QF/S, débit de perméat par unité de surface de la membrane, exprimé

généralement en L/hm2. La pression transmembranaire moyenne ptm est donnée par ; Ptm = (pa + pr)/2 -pF

Où pa est la pression d’alimentation, pr celle du retentât en sortie de la membrane et pF la pression du filtrat.

Le coefficient de tamisage S de la membrane est ; S = CF/Cr, où CF est la concentration du perméat et Cr celle du retentât.

On utilise aussi le taux de rejet R= 1-S; le rejet est total si S=0 ou R=1. Pour une membrane possédant des pores réguliers, le rejet sera nul pour des solutés de diamètre inférieur à celui des pores et sera égal à 1 pour de solutés de diamètres supérieurs à celui des pores. En fait il existe toujours une dispersion de la taille des pores qui fait qu’il arrive fréquemment que des solutés ne passeront qu’à travers une partie des pores et seront partiellement rejetés avec un taux de rejet <1.

Les membranes sont caractérisées par leur perméabilité hydraulique Lp=J/ptm où J est le flux d’eau pure. Son unité se mesure en L/(hm2 bar). Elle dépend du diamètre et de la densité des pores ainsi que de l’épaisseur de la membrane.

La résistance membranaire Rm (m-1) est donnée par Rm =(µ Lp)-1 et, contrairement à la perméabilité hydraulique, dépend du fluide par sa viscosité.

2. Classification des procédés membranaires :

A. Procédés de filtration utilisant la pression transmembranaire :

2.1. Microfiltration (MF) : Ces membranes sont caractérisées par leur diamètre moyen de pores (dp) compris entre 0,05 et 5 µm.

La ptm se situe entre 0.1 et 3 bar car la résistance de la membrane est relativement faible. La membrane arrête les particules, mais pas les molécules, lors du passage tangentiel (et non perpendiculaire) du fluide à traiter, il n’y donc pas de pression osmotique. La MF peut aussi se pratiquer en filtration frontale pour des fluides peu concentrés. Eléments retenus : les bactéries, les fragments de cellules biologiques, les matières colloïdales. Domaines d'application : purification de l'eau, traitement des effluents, clarification des jus de fruits, séparation de cellules, bioréacteur à membranes. Il y a de nombreuses applications en agroalimentaire, en biotechnologie,…. 2.2. Ultrafiltration (UF) :

Ces membranes ont des pores plus petits que celles de microfiltration : 2nm < dp <50nm avec 1nm = 10-9 m. On peut aussi les caractériser par leurs seuils de coupure qui est la masse molaire minimale des molécules rejetées par la membrane et qui se situe entre 2000 et 106 Dalton (Da). La pression transmembranaire moyenne est plus élevée qu’en microfiltration et se situe entre 1 et 8 bar, car les pores sont plus petits et la pression osmotique, qui diminue la ptm effective, est plus élevée. En plus des particules, ces membranes arrêtent les macromolécules, les protéines, et les colloïdes. Eléments retenus : les polymères, les protéines, les colloïdes. Domaines d'application : concentration des protéines du lait pour la fabrication de fromages, industrie agro-alimentaire, bio-industries, pétrochimie...


Page 3

La pression osmotique est faible, car la concentration molaire n’est pas élevée, Les flux de perméat sont élevés.

2.3. Nanofiltration (NF) :

Les diamètres moyens de pores de ces membranes se situent entre 0,5 et 2 nm, et la ptm entre 5 et 25 bar à cause de la pression osmotique et de la résistance membranaire élevée. Ces membranes arrêtent les moyennes molécules, les sels ionisés multivalents (calcium, magnésium, ...) et les composés organiques de masse molaire inférieurs <2000 Da et produit ainsi une eau qui n'est pas totalement déminéralisée contrairement à l’osmose inverse (OI), c’est un procédé intermédiaire entre l’osmose inverse et l’ultrafiltration. Domaines d'application : nombreux, même si les premières applications industrielles sont récentes déminéralisation sélective avec élimination d'ions multivalents, traitement d’effluents, extraction de petites molécules, fractionnement…. 2.4. Osmose inverse (OI): dp<0,5 nm ptm : 10-100 bar

Ces membranes, appelées denses, arrêtent les petites molécules de poids moléculaire <300 Da, par exemple le sel, le sucre, etc. Cette méthode est la moins onéreuse pour éliminer de 90 à 99% des contaminants d'un fluide. Domaines d'application : le dessalement d’eau de mer, la fabrication d’eau pure, le traitement d’effluents et de lactosérum, la diminution de la pollution environnementale, ....

Figure 2 : Schéma du principe de l’osmose inverse.

Pression osmotique. La pression osmotique Dp est donnée par Dp =CRT Où C=concentration molaire, R=8,31 (unités SI), T= température absolue.

Elle est d’autant plus grande que la concentration molaire est élevée, ce qui est le cas des petites molécules. Par exemple pour l’eau salée à 30 g/L : C=500 mole/m3 et Dp=12,5 bar. Si l’on sépare de l’eau pure à pression p1 et de l’eau salée à pression p2 par une membrane semi perméable, et si p1 = p2

l’eau pure tend à diluer l’eau salée pour uniformiser les concentrations. Il n’y aura pas de transfert si p2 = p1+ Dp. L’osmose inverse correspond au cas où p2 > p1 + Dp et il y aura un transfert d’eau salée vers l’eau pure.


Page 4

En microfiltration la pression osmotique est négligeable, car C est de l’ordre de 1 mole/m3. En ultrafiltration, C sera de l’ordre de 10 mole/m3 et Dp de 0.1 à 1 bar. En nanofiltration, C sera de l’ordre de 100 mole/m3 et Dp de 3 à 10 bar. En osmose inverse, Dp variera de 10 à 40 bar. Il faut donc des pressions transmembranaires élevées pour obtenir des flux de perméat importants en

nanofiltration et osmose inverse. De manière générale, les flux de perméat décroissent de la microfiltration à l’osmose inverse à cause

de la diminution de la taille des pores. Le transfert des solutés ne s'effectue plus au travers de pores (certains chercheurs pensent

néanmoins qu'il existerait des nanopores) mais par dissolution des composants de la solution dans la membrane puis diffusion au travers de celle-ci. Cette méthode est la moins onéreuse pour éliminer de 90 à 99% des contaminants d'un fluide.

. B. Procédés basés sur la diffusion ou la migration :

2.5. Dialyse : Le transfert de soluté à travers la membrane s’effectue par diffusion et est proportionnel à la

différence de concentration entre les deux cotés de la membrane. On utilise des membranes d’ultrafiltration fines pour limiter la résistance à la diffusion. Le flux massique est donné par : JS = k (CS -CD) où k est le coefficient de transfert de masse, CS la concentration de la solution, et CD celle de la dialysat, qui circule à contre courant pour maximiser les transferts. Application principale : l’hémodialyse (rein articiel), 3 séances par semaine pour 1,9 million de patients dans le monde, soit une consommation de 108 m2 de membranes/an. La membrane élimine de l’eau correspondant à l’urine non produite.

2.6. Electrodialyse :

Les membranes d’électrodialyse sont chargées électriquement et alternativement anioniques (+) repoussant les anions (-) et cationiques (-) repoussant les cations (+) avec un champ électrique perpendiculaire aux membranes et fourni par deux électrodes. Les modules sont de type filtre presse avec des membranes rectangulaires parallèles. La migration des ions s’effectue dans les compartiments pairs et l’eau pure est recueillie dans les compartiments impairs. Les membranes sont des résines échangeuses d’ions hydrophobes avec des charges fixes (PO3

2-, COO-, NR3+, PR3

+) séparées par un grillage. Variante : les membranes bipolaires (possédant 1 coté + et 1 coté -) permettent de séparer les ions + et – et d’effectuer une séparation acide-base. Applications : dessalement d’eaux saumâtres, déminéralisation et dénitrification d’eau potable et de produits alimentaires (pâte à fromage, lactosérum) récupération de sels métalliques. Citons aussi le traitement d’effluents, la séparation d’acides aminés, la production d’acide lactique par membrane bipolaire, la récupération de sels métalliques de bains de rinçage, l’extraction d’ions organiques produits par fermentation.


Page 5

Tableau 1 : Principales caractéristiques des différents procédés de séparation membranaire.

Figure 3 : Positionnement des opérations de filtration par membrane relativement à la taille des pores et des composés retenus


Page 6

3. Appareillage : (Membranes et Modules) A chaque technique de filtration (Micro ltration MF, Ultrafiltration UF, Nanofiltration NF, Osmose

inverse OI) correspondent divers types de membranes dont les pores vont se rétrécissant jusqu'à devenir des membranes sans porosités apparentes comme dans le cas de l'osmose inverse. Ces membranes sont habituellement composées d’une couche sélective assurant la séparation, associée à un support (Module) renforçant la résistance mécanique. Les caractéristiques des membranes influent sur le choix des éléments que l'on désire retenir ou que l'on voudrait au contraire empêcher de passer.

3.1. Les Membranes : 3.1.1. Définition:

Une membrane est une barrière sélective de quelques centaines de nanomètres à quelques millimètres d'épaisseur, qui sous l'effet d'une force de transfert, va permettre ou interdire le passage de certains composants entre deux milieux qu'elle sépare.

La sélectivité ou permsélectivité correspond à l'ensemble des taux de perméabilité aux différentes substances contenues dans une solution.

La force de transfert recouvre le gradient de pression, de concentration, d'activité, de potentiel électrique ou encore de température.

De ce fait les membranes incluent une grande variété de matériaux et de structure qui forment autant de possibilités de configuration et de classification.

Trois types de structures sont définies : symétriques, asymétriques ou composites. Les deux premières sont élaborées à partir d’un même matériau, alors que la dernière est composée d’un assemblage de matériaux.

Les matériaux utilisés sont de nature organique (polymères) ou minérale (céramiques...).

3.1.2. Classification : La structure des matériaux permet de distinguer 3 types de membranes :

Membranes symétriques ou isotropes, sont composées d’un même matériau ayant une porosité sensiblement uniforme dans toute l’épaisseur. Elles peuvent être denses (absence de pores) ou poreuses. Dans ce cas la membrane, dans toute son épaisseur, forme la couche sélective (figure 4.1) ;

Membranes asymétriques ou anisotropes, Les membranes asymétriques ont une porosité variable dans l’épaisseur de la membrane. On distingue deux parties bien distinctes : la (ou les) peau(x) et la sous-couche poreuse (figure 4.2).

La peau est la partie sélective de la membrane. Elle possède la porosité la plus faible et les pores les plus petits. Son épaisseur est très faible devant celle de la membrane : de l’ordre de 1 µm ou moins. Cette faible épaisseur permet d’associer une haute sélectivité à une haute perméabilité. Les performances en filtration de la membrane ne dépendent donc que des performances de la peau. La peau sera donc mise directement en contact avec le fluide à filtrer.

La sous-couche poreuse forme la plus grande partie de la membrane. Elle possède une porosité souvent très importante (60 à 80 %), associée à des pores de grandes dimensions (à l’échelle du micromètre). Elle n’offre pas de sélectivité et n’influe pas sur la perméabilité. Son rôle est d’assurer la résistance mécanique de la membrane;


Page 7

Membranes composites, sont constituées d’un assemblage de deux ou plusieurs couches de matériaux de différentes porosités et de différentes compositions chimiques (figure 4.3). Elles ont été développées afin d’augmenter la perméabilité des membranes en diminuant l’épaisseur de la couche active sélective. Des épaisseurs de l’ordre de 10 à 100 nm sont utilisées. Les autres couches ont une porosité croissante et permettent de garantir la tenue mécanique de la couche active. Les membranes composites sont essentiellement des membranes planes ou tubulaires de nanofiltration ou d’osmose inverse (à l’exception près d’une fibre creuse de nanofiltration).

Figure 4.1 : Membranes symétriques.

Figure 4.2 : Membranes asymétriques ou anisotropes.

Figure 4.3 : Membranes composites.


Page 8

Selon la nature des matériaux constitutifs des membranes on parle également de : Membranes organiques : la plupart d'entre elles sont actuellement fabriqués à partir de

polymères organiques d’origine synthétique ou naturelle, réticulés ou non (acétate de cellulose, polysulfones, polyamides, polymères uorés, etc) dont les qualités (disponibilité dans toutes les tailles de pores, mise en œuvre aisée, faible coût de production) leurs confèrent une grande adaptabilité aux différentes applications. La majeure partie des membranes d'ultrafiltration et de microfiltration sont constituées de membranes organiques (90%) ; Le principal défaut des membranes organiques est leur faible résistance thermique et chimique comparée à celle des membranes minérales.

Membranes minérales ou inorganiques : de commercialisation plus tardive que les membranes organiques, ces membranes sont composées de corps entièrement minéraux, principalement les matières céramiques, le carbone poreux, les métaux ou le verre fritté. Leur arrivée a permis de travailler dans des conditions extrêmes de température, d'agression chimique et de pressions élevée (10 à 100 bar), ce qui a ouvert de nouvelles voies dans la séparation par membrane ; Comparées aux membranes organiques, les membranes minérales présentent un certain nombre de défauts : elles sont disponibles uniquement sous forme de membrane plane ou tubulaire, du fait de la rigidité des matériaux utilisés ; les faibles tailles de pore ne sont pas disponibles ; les membranes minérales sont fragiles et cassent facilement ; elles ont un coût supérieur à dix fois le coût des membranes organiques.

3.2. Les modules : Pratiquement, les membranes sont assemblées sous forme de modules regroupant généralement plusieurs membranes. Actuellement, quatre principaux types de module sont commercialisés : il s’agit des modules plans, spiralés, tubulaires et en fibres creuses.

3.2.1. Modules plans : sont les plus anciens et les plus simples : les membranes sont empilées en mille-feuilles séparés par des cadres intermédiaires qui assurent la circulation des fluides.

3.2.2. Modules spirales : une membrane plane est enroulée sur elle-même autour d'un tube poreux qui recueille le filtrat. On obtient ainsi un cylindre multi-couches où le perméat s'écoule selon un chemin spiralé vers le tube poreux tandis que l'alimentation circule axialement dans les canaux.

3.2.3. Modules tubulaires : sont basés sur une technologie simple, facile d'utilisation et de nettoyage, mais ils sont grands consommateurs d'énergie pour une très faible surface d'échange par unité de volume (compacité réduite).

3.2.4. Modules en fibres creuses : rassemblent un ensemble de fibres creuses de diamètre inférieur au micromètre, en un faisceau. Cette configuration leur procure la plus forte densité d'écoulement par module.

Techniques biochimiques 3. Techniques de centrifugation

Page 1

1. Principe de la technique : La centrifugation permet de séparer des constituants de taille et de masse très variables contenus dans un

liquide, depuis des molécules jusqu'à des cellules entières. Tous les particules en suspension dans un liquide sont soumis à la gravité, force qui s'exerce du haut

vers le bas, et à la poussée d'Archimède, force qui s'exerce du bas vers le haut. En dehors du cas particulier dans lequel ces deux forces sont parfaitement équilibrées, on pourrait donc s'attendre qu'avec le temps tous les constituants finissent par tomber au fond du récipient dans lequel ils se trouvent (sédimentation) ou remontent à la surface. C'est d'ailleurs ce qui arrive pour certains. Mais pour la majorité d'entre eux, un autre phénomène intervient qui empêche ce résultat : l'agitation moléculaire. Elle n'a pas de direction privilégiée, et à l'échelle microscopique l'agitation moléculaire est de très loin plus importante que la gravité et la poussée d'Archimède, de sorte que les effets de ces dernières sont négligeables (Fig. 1A).

Figure 1A : Force s'exerçant sur une particule en suspension dans un liquide. La gravité et la poussée d'Archimède sont faibles comparées à l'agitation moléculaire. Elle peut entraîner un mouvement de la particule, mais comme elle n'a pas de direction privilégiée, statistiquement l'ensemble des particules ne se déplace pas.

Figure 1B : Force s'exerçant sur une particule en suspension dans un liquide soumis à centrifugation. La gravité et la poussée d'Archimède sont augmentées, au contraire de l'agitation moléculaire, et ne sont plus négligeables. Ayant une direction privilégiée, elles peuvent entraîner un mouvement global des particules vers le haut, si la poussée d'Archimède est supérieure à la gravité apparente, ou vers le bas dans le cas contraire.

En faisant tourner l'échantillon, on fait apparaître une nouvelle force, la force centrifuge, qui est une accélération qui s'exerce radialement vers l'extérieur de l'axe de rotation (fig. 2). Pour un constituant donné, en choisissant correctement la vitesse de rotation, l'accélération obtenue peut devenir prépondérante par rapport à l'agitation moléculaire (Fig. 1B), ce qui entraîne sa sédimentation vers le fond du récipient ou sa remontée.

Figure 2 : La force centrifuge.


Page 2

2. Appareillage : 2.1. La centrifugeuse :

Une centrifugeuse est constituée d’une chambre de centrifugation (enceinte) dans laquelle sort l’axe de rotation, qui est relié au moteur. Sur l’axe on fixe le rotor et dans les emplacements du rotor on met les tubes contenants l’échantillon à centrifuger.

Figure 3: principaux constituants d’une centrifugeuse.

Excepté pour les centrifugeuses dont la vitesse de rotation et le temps typique d'utilisation sont relativement limités, il est nécessaire d'empêcher l'échauffement des échantillons. Pour cela, l'enceinte est réfrigérée et souvent soumise à un vide poussé pour éviter les frottements. Par ailleurs, un rotor qui tourne à haute vitesse (jusqu'à 100 000 rotation par minute, rpm) possède beaucoup d'énergie cinétique. Potentiellement, il peut donc faire beaucoup de dégâts en cas de problème. C'est pourquoi l'enceinte de la centrifugeuse est blindée.

Les centrifugeuses peuvent être subdivisées en 4 groups:

Les centrifugeuses de paillasse : Les modèles les plus simples permettent d'atteindre de faibles accélérations (1000 à 2000g) à des vitesses de rotation relativement basses (moins de 1000 rpm). Certains modèles sont réfrigérés, certains autres non.

Les micro-centrifugeuses de paillasse : On a aussi développé des centrifugeuses spécialement conçues pour les micro-volumes souvent employés en biochimie moderne. Les microtubes à centrifuger sont des petits tubes coniques généralement de 1.5 ml fait de polypropylène et assez peu dispendieux. Les centrifugeuses de ce type peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de l'ordre de 12-15 000 g. Les modèles les moins coûteux n'ont pas de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés.

Les centrifugeuses de sol : Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles permettent d'obtenir

des vitesses de rotation de l'ordre de 30 000 rpm, donnant pour les plus petits rotors des accélérations d'environ 20 000 g. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces centrifugeuses permettent de centrifuger des relativement gros volumes. Certains rotors peuvent contenir quatre ou six bouteilles de 250 mL.

Les ultracentrifugeuses : Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent d'atteindre

des accélérations très élevées (jusqu'à 300 000 g) en faisant tourner des rotors très rapidement (50-75 000 rpm). De telles vitesses de rotation ne peuvent s'obtenir que sous pression très réduite. Les faibles pressions permettent aussi d'éviter la surchauffe du rotor et de l'échantillon. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces appareils doivent donc être munis de pompe à vide et de systèmes de réfrigération. Les volumes sont quelques peu limités, généralement on ne trouve pas de rotors pouvant contenir plus d'une dizaine de tubes de 40 ml Récemment, la compagnie Beckman a fabriqué un modèle d'ultracentrifugeuse tournant à 130 000 rpm générant des accélérations de plus d'un million de g!


Page 3

Figure 4: Différent modèles de centrifugeuses.

2.2. Le rotor : Est le support des tubes contenant les échantillons à centrifuger; il doit à la fois être suffisamment

solide pour supporter les forces qui s'exercent sur lui (on peut atteindre plusieurs dizaines de tonnes pour des gros rotors) et le plus léger possible, sa propre masse étant soumise à l'accélération centrifuge. Le meilleur matériau actuel est le titane, avec son excellent rapport poids/résistance, d'autant qu'il est également non-magnétique. Le seul inconvénient est son prix élevé. On le réserve pour les rotors de forte capacité et/ou à haute vitesse de rotation. On utilise sinon des alliages d'aluminium, plus rarement de l'acier (pour des rotors ne tournant pas très vite). Chaque rotor possède une vitesse maximum de rotation (donc d'accélération) pour laquelle il est garanti. Ce maximum est diminué après un certain nombre de rotations effectuées pour tenir compte du vieillissement. Il est évident que chaque rotor est adapté à certains modèles de centrifugeuses, qui elles aussi ont une vitesse maximum de rotation.

Il existe essentiellement deux grands types de rotors, les rotors à angle fixe, et les rotors à godets mobiles. Il existe également un troisième type de rotors, les rotors verticaux, mais ils sont beaucoup moins utilisés.

Dans un rotor à angle fixe, les tubes sont placés dans des logements creux généralement inclinés entre 20 et 40°. La surface du liquide, horizontale à l'arrêt, devient verticale en rotation sous l'effet de l'accélération centrifuge. Ce type de rotor est parfaitement adapté à une centrifugation différentielle mais moins à une centrifugation à l'équilibre.

Figure 5: Un rotor à angle fixe.

Dans les rotors à godets mobiles, les tubes sont placés dans des godets qui sont libres de prendre tous les angles possibles entre la verticale et l'horizontale. Lors de la rotation, le godet va donc adopter l'angle pour lequel l'accélération subie s'exercera toujours du haut vers le bas du tube. Cette situation est particulièrement intéressante dans le cas d'une centrifugation à l'équilibre.

Figure 6: Un rotor à angle mobile.

Les rotors verticaux, Sont beaucoup moins répandus et sont essentiellement utilisés pour les centrifugations en gradients de type isopicniques ou zonaux.


Page 4

L’équilibrage du rotor : Quelque soit le rotor utilisé, un point crucial concerne l'équilibrage. Un rotor doit être parfaitement

équilibré, c'est à dire que la masse en chaque point doit être idéalement identique à celle du point symétrique par rapport à l'axe de rotation. Concernant le rotor en lui-même, cela est du ressort du constructeur. Notons cependant que pour les rotors à angle variable, les godets sont numérotés et ont une place assignée sur le rotor qu'il convient de respecter. Mais bien entendu l'expérimentateur doit équilibrer les échantillons qu'il va centrifuger. Pour cela, il faut équilibrer les tubes deux à deux, chaque couple de tubes devant être placé symétriquement par rapport à l'axe de rotation. En revanche, il n'est pas nécessaire que tous les tubes aient exactement la même masse. La tolérance est fonction de l'accélération qui sera imposée. Pour donner une idée, dans le cas d'une centrifugation à 100 000 g (vitesse classique pour du fractionnement subcellulaire) une différence de 0,1 gramme entre deux tubes entraînerait un balourd de 10 kg que l'axe de rotation devrait supporter, contre 100 g pour une centrifugation à 1 000 g.

3. Principaux paramètres de la centrifugation : 3.1. La vitesse de rotation ( ):

Quand la centrifugeuse atteint la vitesse de centrifugation désirée, l'échantillon est soumis à un mouvement circulaire uniforme. La vitesse de rotation ou vitesse angulaire ( , exprimé en rad.sec-1) est:

3.2. L’accélération centrifuge (f) :

Ou champ centrifuge, généré par le mouvement circulaire uniforme, est dirigé radialement vers l'extérieure et dépend de la vitesse angulaire ) et de distance (r en cm) de l’axe de rotation, selon l'équation:

3.3.La force centrifuge (Fc) :

Sur l’échantillon s’exerce une force centrifuge (Fc) qui dépend du champ centrifuge (f) et de la masse (m) de la particule:

3.4. La force centrifuge relative (RCF): Etant donné que tout les corps sur terre sont soumis à la force de gravité (Fg) on peut définir

La force centrifuge relative ou le Champ Centrifuge Relatif (RCF, relative centrifugal field) comme le rapport entre la force centrifuge appliquée par la centrifugeuse sur la particule et la force de gravité (Fg = mg où g = 981 cm.sec-2).

Le Champ Centrifuge Relatif est exprimé en nombre de g et il n’a pas de dimension (NB. le rad

n’a pas de dimension). Il nous indique le nombre de g nécessaire pour sédimenter ou séparer une particule.

Si l’on exprime la vitesse angulaire en rotation par minute (rpm) et on substitue à g sa valeur (981

cm.sec-2), on obtient:

Le Champ Centrifuge Relatif nous dit donc de combien de fois le champ d’accélération centrifuge doit être multiple de l’accélération gravitationnelle, il est donc une valeur absolue à laquelle je soumets la particule pour la séparation. Par la formule nous mettons cette valeur en relation avec la vitesse de la centrifugeuse (vitesse de rotation en rpm) et le rayon du rotor.


Page 5

Nomogramme : Bien qu’il soit possible de calculer facilement la valeur de RCF avec la formule:

Il est possible d’utiliser un nomogramme pour calculer la valeur de RCF en g en connaissant le

rayon de rotation d’un déterminé rotor et la vitesse de rotation en rpm. Ex. rayon de rotation 9 cm; vitesse de rotation 12000 RCF = 15000 g Inversement, si l’on connaît la valeur de RCF et le rayon du rotor on peut calculer la vitesse de

rotation en rpm pour obtenir un tel champ centrifuge relatif Ex. RCF 15000 g; rayon de rotation 6 cm rpm = 14500

Figure 7: Deux exemples de nomogramme.

3.5. La Vitesse de sédimentation (v): La vitesse de sédimentation d’une particule en solution dépend de: la masse de la particule (volume

et densité), de la densité et viscosité de la solution et de la forme de la particule. La force de sédimentation (Fs) qui s’exerce sur une particule est égale à la force de centrifugation

(Fc) moins la force de flottaison (PA) exercée par la solution:

Cependant le déplacement d’une particule dans une solution est contrecarré par la force de friction (F0):

Quand la force de sédimentation (Fs) et la force de friction (F0) s'équilibrent le mouvement est

rectiligne uniforme et on obtient:


Page 6

La vitesse à laquelle sédimente une particule dépend de la loi de Stokes:

Pour que une particule sédimente sa densité doit être majeure de la densité de la solution:

Si la densité de la particule est égale à celle de la solution, alors la vitesse de sédimentation est nulle

et la particule ne sédimente pas:

Deux particules se séparent si leur densité est différente, si leur taille est différente (rayon), si

leur forme est différente.

3.6. Coefficient de sédimentation (S) : Une formulation plus pratique de l'équation de la vitesse de sédimentation est celle qui utilise le

coefficient de sédimentation (S):

Les unités de mesure du coefficient de sédimentation sont les secondes et comme la majorité des

molécules d'intérêt biologique ont un S supérieur à 10-13 sec, cette quantité est défini une unité Svedberg du nom du chercheur qui l’a défini.

Le coefficient de sédimentation trouvé expérimentalement est corrigé à la valeur qu’il aurait dans une solution ayant la densité et la viscosité de l’eau à 20°. La correction est effectuée par l’équation suivante :


Page 7

Figure 8: Coefficient de sédimentation de molécules et organites biologiques.

3.7. Temps de sédimentation (T):

Si on intègre l’équation:

sur l’intervalle de temps de t0 à tt, alors on obtient:

Il est maintenant possible de calculer le temps nécessaire pour sédimenter une particule de

coefficient de sédimentation connu. Si rt et r0 sont le rayon maximale au fond du tube et le rayon minimale au sommet du tube, alors

T=tt-t0 est le temps nécessaire pour sédimenter la particule de coefficient de sédimentation (S).

L’unité de mesure du temps de sédimentation est l’heure.

4. Les Techniques de centrifugation : 4.1. La Centrifugation différentielle :

Dans ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus souvent à l'aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante (fig.9). Dans une première centrifugation à faible accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au fond du tube. Tous les autres éléments (pour lesquels l'accélération a été trop faible pour contrebalancer les effets de l'agitation moléculaire, ou pour lesquels le temps de centrifugation a été trop court) vont rester dans la fraction liquide appelée alors surnageant. On récupère alors séparément le surnageant et le culot ce qui revient à avoir séparé les constituants qui les composent. Cette méthode est par exemple couramment utilisée pour récupérer les éléments figurés (les cellules) du sang qui sédimentent pour des accélérations très faibles (quelques dizaines de g).

Figure 9: centrifugation différentielle.


Page 8

Au besoin, on peut recommencer un second cycle de centrifugation avec le surnageant précédent, mais avec une accélération plus importante. Progressivement, on sépare ainsi les différents constituants en terminant pas les éléments les plus petits et ayant le moins de différence de densité avec le solvant. Précisons que les fractions obtenues sont généralement loin d'être pures, d'autant que les échantillons initiaux sont souvent complexes (exemple du broyat total d'un tissu). L'intérêt est justement de pouvoir traiter des échantillons très complexes, et ce sur des volumes importants avec des rotors adaptés.

Le choix des accélérations dépend du matériel à traiter. Le plus souvent, il y a une phase de mise au point permettant d'adapter le protocole à partir des données de la littérature. Une fois mis au point, le protocole est utilisé dans un but préparatif.

Les valeurs de sédimentation peuvent varier en fonction du matériel utilisé, la composition des membranes pouvant en particulier modifier la densité des constituants. On constate que des constituants différents sédimentent approximativement dans les mêmes conditions. Pour pouvoir les séparer il faut d'autres méthodes, par exemple une centrifugation à l'équilibre sur gradient de saccharose qui permet de séparer les différents compartiments de l'appareil de Golgi (on parle plutôt de fractions enrichies).

La centrifugation différentielle se base ainsi sur les différences de vitesse de sédimentation entre particules qui différent par densité et dimensions; la centrifugation sédimentera d’abord les particules les plus grandes, puis les plus petites.

Si deux particules ont même masse mais différente densité, alors les plus dense sédimenterons plus rapidement que les moins dense.

Par cette technique est difficile d’obtenir des fractions pures car toutes les composants se

retrouvent à r min et à r max

En utilisant la formule :

Il est possible de calculer le temps nécessaire à sédimenter la particule de coefficient de

sédimentation (S).

Pour un type de tube et donc de rotor rmin / rmax est défini. Si m est la vitesse angulaire maximale du rotor, alors on peut définir une constante k pour le

rotor:

Où 1013 est le facteur de correction pour les Svedberg et 3600 celui pour exprimer le temps en

heures. Donc le temps de sédimentation est:

Temps maximale de centrifugation à la vitesse max du rotor pour sédimenter une particule

de coefficient de sédimentation (S).


Page 9

4.2.La Centrifugation à l’équilibre en gradient de densité : Dans une centrifugation à l'équilibre, les différents constituants atteignent une position dont ils ne

vont plus bouger, car étant en équilibre. Or l'équilibre est atteint lorsque la densité d'une particule est égale à la densité du solvant, ce qui entraîne que la force gravitationnelle est égale à la poussée d'Archimède. On va donc utiliser un solvant dont la densité va varier en fonction de la position dans le tube permettant aux différents constituants de rejoindre la zone de densité équivalente à la sienne : on parle de gradient. Pour obtenir des solutions de densités différentes, la méthode la plus classique est d'utiliser des solutions de concentration croissante en saccharose, mais on utilise aussi du chlorure de césium. D'autres molécules sont aussi utilisées mais beaucoup plus marginalement.

Il existe deux types de gradients : les gradients discontinus sont constitués d'un empilement de solutions de moins en moins dense (Fig.

10A). Les différents éléments s'accumulent aux interfaces entre les solutions de densité différentes. Au dessus, leur densité étant plus élevée, ils migrent vers le bas, et au dessous, leur densité étant plus faible ils migrent vers le haut. Il arrive de limiter le gradient à deux densités seulement avec une solution inférieure très dense. On peut alors utiliser ce gradient minimaliste pour une centrifugation différentielle. La différence est qu'au lieu de former un culot, les éléments les plus denses resteront en phase liquide. Cette méthode est donc beaucoup plus douce que la formation d'un culot (qui impose entre autre de resolubiliser) c'est pourquoi on parle de coussin.

les gradients continus pour lesquels la variation de densité est continue (comme leur nom l'indique; Fig. 10B). Les différents constituants vont alors migrer jusqu'à atteindre le point précis où leur densité est égale à celle du solvant formant des bandes parfois visibles à l'œil nu (diffusion de la lumière).

Figure 10A : Exemple de gradient discontinu. L'échantillon a été représenté au sommet ce qui suppose qu'il soit moins dense que la première couche de solution de saccharose. Il arrive qu'on place l'échantillon au fond, au besoin en ayant au préalable augmenté sa densité en ajoutant du saccharose (par exemple).

Figure 10B : Exemple de gradient continu. Le gradient peut être linéaire (cas présenté) mais aussi exponentiel ou logarithmique selon les besoins. On le coule en faisant varier en continu le débit de deux pompes qui mélangent deux solutions, l'une à 10% et l'autre à 60% de saccharose dans le cas présent.

Dans les deux cas la vitesse de sédimentation ne doit pas intervenir. Il est donc nécessaire de laisser le temps aux particules d'atteindre leur position d'équilibre ce qui implique des temps de centrifugation assez longs. Bien entendu, les particules les moins denses peuvent se retrouver au sommet du tube (particules moins denses que la solution la plus haute) et les particules les plus denses peuvent former un culot (particules plus denses que la solution la plus basse). Le contenu du tube peut être récupéré par fractions successives, souvent du bas vers le haut, pour utilisation et/ou analyse ultérieure.

L’échantillon est chargé en haut d’un gradient, les particules ne son pas sédimentées au fond du tube en éliminant ainsi les problèmes de co-sédimentation.

4.3. La Centrifugation à l’équilibre de sédimentation (isopycnique).


Page 10

Dans cette technique l’échantillon est déposé sur un gradient de forte pente où la densité majeur du gradient est supérieure à celle de la molécule la plus dense.

Pendant la centrifugation, chaque type de particule traverse le gradient avec une vitesse qui dépend essentiellement de sa densité jusqu’à attendre la zone du gradient où sa densité est égale à celle de la solution

Bandes bien distinctes. La centrifugation est complète jusqu’à l’équilibre. Grande vitesse de centrifugation, temps de centrifugation long.

Figure 11: Centrifugation à l’équilibre de sédimentation (isopycnique).

Cette méthode est donc de choix pour séparer des organelles ou des macromolécules de même taille mais densité différente.

4.4.La Centrifugation de zone (isocinétique) : Dans cette technique l’échantillon est déposé sur un gradient de pente faible (5-20% de saccharose ou

glycérol) car la densité majeure du gradient doit être inférieure à celle de la molécule la moins dense. Pendant la centrifugation, chaque type de particule traverse le gradient avec une vitesse qui dépend

essentiellement de son coefficient de sédimentation bandes bien distinctes. La centrifugation est arrêtée avant la sédimentation (temps court, vitesse lente)

Figure 12: Centrifugation de zone (isocinétique).

Cette méthode est donc de choix pour séparer des organelles ou des macromolécules qui différent en taille. Des organelles comme les mitochondries, les lysosomes et les peroxisomes qui ont des densités différentes mais taille similaires ne sont pas séparées par cette méthode.


Page 11

4.5.La Centrifugation de zone (isocinétique) avec rotor zonale :

Figure 13: Centrifugation de zone (isocinétique) avec rotor zonale.

Une des limitations des centrifugations sur gradient de densité est la quantité d’échantillon que peut être chargée (assez petite). Pour pouvoir charger de plus grand volumes on utilise le rotor zonale.

1. Le gradient est chargé dans le rotor. 2. Le rotor est accéléré lentement, le gradient se ré-oriente. 3. L’échantillon est pompé à une extrémité du rotor. 4. L’échantillon sédimente radialement. 5. A la fin de la centrifugation le rotor décélère lentement, 6. Le gradient se ré-oriente sans déranger les bandes de

particules. 7. Les bandes sont extraites à l’aide d’une pompe

péristaltique.

4.6.Ultracentrifugation analytique :

On peut déterminer avec une grande précision la masse et le coefficient de sédimentation des protéines et autres particules par ultracentrifugation analytique (UCA). Cette technique exige un appareillage (centrifugeuse, rotor, etc.) spécialisé à cette fin. D'autres techniques beaucoup moins coûteuses sont utilisées de nos jours: électrophorèse, filtration sur gel...

5. Application à la biochimie :

5.1. · Séparation de phases :

La séparation de deux phases liquides non miscibles qui peut être effectuée de façon beaucoup plus rapide par centrifugation. Il suffit de les centrifuger quelques minutes et la séparation se fera.

Le phénol est souvent séparé d'une phase aqueuse de cette façon dans les méthodes d'extraction au phénol des acides nucléiques.

5.2. Fractionnement cellulaire : On utilise fréquemment la centrifugation différentielle pour séparer les composantes cellulaires.

Évidemment les vitesses exactes et les durées de centrifugation peuvent varier en fonction du type de tissus, du tampon ou d'autres facteurs.

Typiquement, on peut sédimenter les noyaux à 1-2000g durant 5-10 minutes. Les mitochondries et les chloroplastes tombent à environ 10-15000g durant 10-15 minutes. Les microsomes, petites vésicules produites lors de l'homogénéisation des compartiments membranaires comme le golgi ou le réticulum endoplasmique, peuvent sédimenter après une trentaine de minutes à cette vitesse. Les ribosomes sont obtenus à 100 000g après 1 ou 2 heures.

Le surnageant résiduel contient le matériel cytosolique. Il faut bien comprendre que la centrifugation différentielle ne donne que des préparations grossièrement purifiées.

Techniques biochimiques 4. Méthodes chromatographiques

Page 1 sur 12

1. Généralités 1.1. Définition, principe et historique

La chromatographie est une méthode qui permet de séparer les constituants d’un mélange en phase homogène liquide ou gazeux. Elle tient une place très importante en analyse biochimique pour purifier, identifier et quantifier, même à l’état de traces, toutes sortes de composés présents dans des échantillons les plus divers. Son champ d’application s’étend aussi aux échantillons à l’état solide ou hétérogènes à condition de disposer d’un solvant pour les mettre sous forme d’une solution homogène.

Le principe de la chromatographie consiste à entraîner l’échantillon à l’aide d’un éluant (gazeux ou liquide) appelé ici phase mobile (PM), qui se déplace au contact d’une seconde phase fixée sur un support (colonne ou surface plane). Celle-ci, dite stationnaire (PS), est insoluble dans la première. Si les différents composés de l’échantillon (les solutés) présentent des affinités différentes pour le couple PM/PS, ils vont être plus ou moins ralentis dans leur progression par la phase stationnaire. Sous l’effet antagoniste des forces de rétention soluté/PS et des forces d’entraînement soluté/PM, ces composés vont pouvoir être recueillis séparément à l’issue de cette migration (chacun en solution dans la PM utilisée).

Chaque composé est caractérisé par son coefficient de distribution de Nernst K (appelé également coefficient de partition) défini comme suit :

Ce paramètre quantifie le rapport de concentration de chaque composé entre les deux phases en présence. Plus sa

valeur est élevée, plus le soluté est retenu. K dépend de la température et de trois forces d’interaction : PS/soluté, PM/soluté et PM/PS.

Le terme de "chromatographie"(du grec khroma qui signifie couleur) a été crée par le botaniste russe Mikhail

TSWETT en 1905, pour décrire une technique de séparation de pigments végétaux (chlorophylles et caroténoïdes) sur des colonnes remplies de carbonate de calcium avec de l'éther de pétrole). Il évoque donc la couleur des substances analysées, mais il est possible que l’origine du nom soit tout autre : en effet, le nom de l’auteur signifie "couleur" en russe, et il est donc possible que ce dernier ait voulu donner son nom à la technique qu’il avait mise au point (Jaussaud, 1996).

Des évolutions ont suivi la première expérience de Tswett. Citons parmi les plus importantes, l'apparition de :

- la chromatographie sur colonne (ou chromatographie liquide-solide CLS) (Kuhn et Lederer, 1931) - la chromatographie sur couches minces (CCM ou TLC) (Ismailov et Shraiber, 1938) ; - la chromatographie par échanges d'ions (Samuelson, 1939) ; - la chromatographie de partage liquide-liquide (Martin et Synge, 1941) ; - la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC) sur colonnes remplies (James et Martin, 1952) ; - la chromatographie en phase gazeuse sur colonnes capillaires (Golay, 1959) ; - la chromatographie en phase supercritique (Klesper, 1962) ; - la chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP ou HPLC) (Giddings et Kirkland, 1968).

1.2. Terminologie générale de la chromatographie • Soluté: toute substance constituant d’un mélange, séparée par chromatographie. • Phase mobile: le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté. • Phase stationnaire: le produit qui, par ses affinités avec les solutés, va permettre leur séparation quand la phase

mobile les déplace. • Support: Un substrat inerte qui porte la phase stationnaire. • Remplissage: l’ensemble des produits (adsorbant, support + phase stationnaire, etc...) qui garnissent une colonne

chromatographique. • Colonne chromatographique: tube de diamètre et longueur variable, en verre, métal, ou autre substance, à

l’intérieur duquel s’opèrent les séparations chromatographiques.


Page 2 sur 12

• Développant: une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui déplace les solutés dans la phase stationnaire, de telle manière qu’ils demeurent dans celle-ci : cas de la CP et de la CCM.

• Éluant: une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui déplace les solutés dans la phase stationnaire, jusqu’à ce qu’ils sortent de celle-ci.

• Chromatographie d’élution: celle dans laquelle la phase mobile parcourt en permanence la phase stationnaire afin que les solutés introduits à une extrémité de celle-ci sortent à l’extrémité opposée. Dans cette méthode, la phase mobile est inerte vis-à-vis de la phase stationnaire.

• Chromatographie de déplacement: procédé dans lequel la phase mobile a plus d’affinité que le soluté pour la phase stationnaire, donc le pousse devant elle.

• Rapport frontal: rapport entre la distance parcourue par un soluté dans une phase stationnaire et la distance parcourue dans le même temps par le développant.

• Coefficient de partage: rapport des concentrations respectives du soluté dans la phase stationnaire et la phase mobile, au cours de l’analyse.

• Valeurs de rétention: toutes données qui permettent de chiffrer l’action spécifique d’une phase stationnaire donnée sur un soluté donné, au cours d’une analyse chromatographique.

• Chromatogramme: trace sur un papier enregistreur des réponses successives du détecteur, au cours de l’élution des solutés hors des colonnes.

1.3. Classification des méthodes chromatographiques

Les méthodes chromatographiques regroupent des techniques très variées qui peuvent être classées selon trois modalités différentes :

• Classification selon la nature physique des phases. • Classification selon le phénomène mis en œuvre. • Classification selon le procédé opératoire.

1.3.1. Classification selon la nature des phases

la phase mobile est un fluide, donc soit un liquide, soit un gaz (soit encore un fluide "supercritique") la phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide.

La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités :

• chromatographie liquide—solide (cas de Tswett) (LSC) • chromatographie liquide—liquide (LLC) • chromatographie gaz—solide (GSC ou GC) • chromatographie gaz—liquide (GLC ou GC) • la chromatographie supercritique (SFC)

La SFC représente un cas intermédiaire entre LC et GC, les fluides supercritiques possédant des propriétés à la frontière entre celles des liquides et celles des gaz.

1.3.2. Classification selon le phénomène chromatographique

Ce dernier dépend de la nature (et de la structure) de la phase stationnaire utilisée. On distinguera donc : • la chromatographie d'adsorption (LSC, GSC) (lorsque la phase stationnaire est un solide); par extension on

pourrait y rattacher la chromatographie d'affinité, qui correspond à un cas où les propriétés d'adsorption de la phase stationnaire sont spécifiques vis-à-vis d'un (ou une famille de) composé(s).

• la chromatographie de partage (LLC, GLC), lorsque la phase stationnaire est un liquide non miscible avec la phase mobile (mise en jeu de coefficients de partage).

• la chromatographie d'échange d'ions (IEC), où la phase stationnaire porte des groupes fonctionnels acides ou basiques, destinée à séparer des composés ionisés.

• la chromatographie d'exclusion (SEC) où la phase stationnaire (poreuse) se comporte comme un tamis et sépare les composés en fonction de leur taille; on parle aussi de chromatographie de perméation de gel (GPC).


Page 3 sur 12

1.3.3. Classifications selon les procédés utilisés

Selon le conditionnement de la phase stationnaire, on distinguera : • la chromatographie sur colonne. • la chromatographie sur papier • la chromatographie sur couche mince.

Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera

• la chromatographie par développement (les constituants de l'échantillon restent sur la phase stationnaire) • la chromatographie d'élution (les substances sont entraînées hors de la phase stationnaire).

Les méthodes chromatographiques, bien que très diverses, mettent en jeu un certain nombre de principes communs :

les substances se répartissent entre deux phases non miscibles, selon un équilibre lié à un coefficient de partition, qui dépend à la fois de la nature des composés et de celle des deux phases considérées;

le renouvellement continu de la phase mobile remet en cause cet équilibre et entraîne une succession d'autres équilibres, ce qui se traduit par une migration des substances le long de la phase stationnaire;

la séparation est obtenue car chaque composé migre avec une vitesse qui lui est propre (et dépend du coefficient de partition décrit ci-dessus).

1.4. Choix de la technique Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes. Le choix de l’une ou l’autre dépend :

- de la nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide, macromolécule, espèce organique, polaire, ionique,…

- du but de l’analyse : identification de composants d’un mélange, nécessité ou non de “coupler” la chromatographie avec une méthode spectroscopique ou avec la spectrométrie de masse (CPG/SM ou GC/MS), contrôle de pureté, purification de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des paramètres, dosages (quantification)…

1.5. Chromatogramme Les instruments de chromatographies sur colonne modernes (CPG, HPLC…) comportent une colonne renfermant la

phase stationnaire ainsi qu’un détecteur situé en aval pour repérer les changements de composition de la phase mobile au cours de son élution.

A chaque séparation correspond un enregistrement appelé chromatogramme. Le passage de chaque composé au niveau du détecteur se traduit par un pic sur cet enregistrement. Sur la figure 1, la courbe de gauche correspond à une image isochrone de la concentration d’un composé en cours de migration sur la colonne et la courbe de droite au chromatogramme correspondant, lorsque le composé a traversé la colonne puis le détecteur. Cette courbe est tracée en fonction du temps (tR représente le temps de rétention du composé).

Figure 1 : chromatogramme et image isochrone de la concentration d’un composé en cours de migration.

Les chromatographes actuels permettent de contrôler de manière très précise tous les paramètres pouvant influer sur la migration (température, débits, composition des phases mobile et stationnaire). On atteint ainsi une parfaite reproductibilité des temps de migration pour un soluté donné au cours d’analyses successives même s’il est présent dans des échantillons différents. De ce fait, la chromatographie est devenue en soi une méthode d’analyse en se basant uniquement sur la mesure des temps de migration des composés pour les identifier.


Page 4 sur 12

Méthode. L’identification d’un composé se fait par comparaison de son temps de rétention avec celui d’un

composé authentique étudié dans les mêmes conditions.

Cette méthode comporte néanmoins une part aléatoire, l’identification à partir du seul chromatogramme n’étant pas absolue. Aussi, la pratique actuelle consiste à choisir un détecteur permettant de recueillir des informations complémentaires sur le composé élué. On regagne ainsi, outre le temps de rétention, des informations indépendantes (données spectrales caractéristiques par exemple) qui vont permettre de déterminer avec certitude la nature et la composition de mélanges complexes, à partir de quantités qui, souvent, ne dépassent pas quelques nanogrammes (analyses de confirmation). 1.6. Principales données théoriques 1.6.1. Coefficient de partage

La séparation des composés est due à la différence relative de leur vitesse d'élution et donc à la différence de vitesse d'échange entre la phase mobile et la phase stationnaire. Les vitesses d'élution dépendent des coefficients de partage de la molécule entre les deux phases :

avec K le rapport des concentrations du soluté dans la phase stationnaire (Cs) et dans la phase mobile (Cm). K varie avec la température (T) selon :

où A et B sont des constantes dépendant des interactions entre la molécule et la phase stationnaire. Le coefficient de partage est également appelé «constante de distribution».

1.6.2. Grandeurs de rétention Le calcul des grandeurs de rétention nécessite la

détermination préalable d'un certain nombre de paramètres. Selon que l'on dispose d'un enregistreur ou d'un intégrateur, les grandeurs de rétention sont exprimées en fonction de la distance parcourue par le papier ou en fonction du temps écoulé entre l'injection du mélange et la détection du composé, les expressions en distance (dr) étant reliées aux expressions en temps (tr) par la vitesse de défilement du papier (vd) (figure 2) :

Figure 2 : Chromatogramme d'une substance non retenue

et d'une substance retenue.

Temps de rétention nul (tm) Il est déterminé par l'injection d'un composé non retenu et représente le temps passé par ce composé dans la phase

mobile; il tient compte du temps de parcours des tubulures et des connexions.

Temps de rétention du soluté (tr) Il représente le temps passé par le composé dans le chromatographe. La différence entre tr - tm représente le temps

passé par le composé dans la phase stationnaire.

Volume mort (Vm) Il est relié au tm par l'équation : Vm = tm • D

où D est le débit de la phase mobile. Il représente le volume de la phase mobile dans la colonne et les tubulures et connexions.


Page 5 sur 12

Volume de rétention (Vr) Il est donné par la relation : Vr = tr • D

et représente le volume de phase mobile nécessaire pour transporter le composé de l’injecteur au détecteur. La différence Vr - Vm représente le volume de phase mobile nécessaire à éluer le composé de la phase stationnaire.

Facteur de rétention k' (ou de capacité) Il représente la capacité de la colonne à retenir une substance. Plus k' est élevé, plus le composé est retenu. Lors de la

chromatographie, le composé se répartit entre les deux phases mobile et stationnaire. Le facteur de capacité représente cette répartition massique entre les deux phases :

Le volume de phase stationnaire (Vs) est calculé en soustrayant le volume de phase mobile (Vm) du volume total du système. Expérimentalement, le facteur de rétention est calculé à partir de l'équation suivante :

1.6.3. Effïcacité de la colonne

Efficacité théorique (nombre de plateaux théoriques) L'efficacité d'une colonne est évaluée par son

nombre de plateaux théoriques (N) donné par l'équation suivante :

où tr (ou dr) est le temps (ou la distance) de rétention et la largeur du pic à 13,5 % de la base; ces valeurs peuvent être exprimées en temps ou en distance (figure 3). Plus la colonne est longue, plus le nombre de plateaux est élevé et plus ce nombre est élevé, plus la colonne est efficace. N dépend à la fois du soluté étudié et des conditions opératoires.

Figure 3 : Grandeurs caractéristiques du pic chromatographique idéal.

Efficacité réelle Le nombre de plateaux théoriques dépendant de la longueur de la colonne, le concept d'efficacité réelle a été introduit

pour pouvoir comparer les performances de colonnes différentes (capillaire et remplie, par exemple) pour un même composé. Dans l'équation précédente, la valeur de tr tient compte du temps passé par le soluté dans la phase mobile, à savoir tm. Pour calculer le nombre de plateaux effectifs (Neff), on utilise le temps de rétention réduit t'r: t'r = tr - tm et le nombre de plateaux effectifs est donné par l'équation:

Hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) La hauteur équivalente à un plateau théorique dépend également du soluté et des conditions opératoires puisqu'elle est

calculée à partir de la longueur de la colonne (L) et du nombre de plateaux théoriques (N) en utilisant l'équation suivante :


Page 6 sur 12

Hauteur équivalente à un plateau théorique réduite En chromatographie en phase liquide sur colonne remplie de particules sphériques, on détermine la HEPT réduite (h),

qui est calculée en faisant intervenir le diamètre moyen (dm) des particules. On élimine ainsi l'influence de la taille des particules sur l'efficacité. Ainsi des colonnes remplies avec des particules de diamètres moyens différents mais ayant la même HEPT réduite auront-elles des performances semblables:

1.6.4. Qualité de la séparation

Facteur de sélectivité Le facteur de sélectivité ( ) pour deux composés 1 et 2 est défini par:

Expérimentalement, il est calculé à partir de l'équation suivante :

Facteur de résolution Le facteur de résolution permet d'évaluer la qualité de la séparation de deux composés. Il dépend de la sélectivité de la

méthode et est représenté par 1'équation :

où la sélectivité est le rapport k'2/k'1 des deux molécules 1 et 2 à séparer (figure 4). La formule utilisée en pratique est :

Ce facteur doit être le plus élevé possible ; on considère que la séparation est bonne à partir d'un facteur de résolution Rs égal à 1,5 puisqu'à cette valeur le taux de chevauchement des deux pics est de l'ordre de 0,3 %. Cependant, il faut garder à l'esprit que toute augmentation du temps de rétention est préjudiciable à la qualité du chromatogramme obtenu puisqu'elle entraîne un élargissement des pics.

Figure 4 : Chromatogramme de deux composés 1 et 2,


Page 7 sur 12

Effet de la vitesse de a phase mobile L'efficacité de la colonne dépend en grande partie du temps de contact entre la phase mobile et la phase stationnaire,

conditionné par la vitesse linéaire ( ) de la phase mobile. La variation de HEPT en fonction de n'est pas linéaire. En CPG, pour les colonnes remplies, elle est donnée par l'équation de van Deemter :

Cette équation montre que, pour chaque colonne, il existe une HEPT minimale (figure 5) et donc une efficacité maximale pour une vitesse linéaire optimale ( opt) de la phase mobile donnée par la relation :

Le terme A est relié au remplissage de la colonne : diamètre des particules, régularité... Le terme B dépend de la diffusion du composé dans la phase mobile; ainsi, si le débit est trop faible lors de la chromatographie de plusieurs composés ceux-ci se remélangent plus vite qu'ils ne migrent. Le terme C représente le transfert de masse du composé entre les deux phases :

Cl et Cg étant les coefficients de diffusion du composé dans les phases stationnaire liquide et mobile gazeuse, respectivement. La vitesse optimale du gaz vecteur correspond à H minimal, donc à la plus grande efficacité.

Figure 5 : Représentation graphique de la loi de van Deemter.

Équation de Golay Cette équation est utilisée en phase gazeuse pour les colonnes capillaires :

Si l'on connaît le facteur de rétention k' du composé, on peut calculer la HEPT minimale théorique (Hmt) pour une colonne de rayon r :

Cette relation montre que si le rayon r de la colonne diminue, l'efficacité augmente; la valeur de Hmt caractéristique de la qualité de la colonne tend vers une valeur de 2r pour une valeur de k' de l'ordre de 10, soit 0,25 mm pour les colonnes capillaires classiques, ce qui fournit un nombre de plateaux (N = L/H) de 100 000 pour une colonne de L = 25 m.

Équation de Knox L'équation de Knox est appliquée aux différentes chromatographies en phase liquide. Elle donne la valeur de la HEPT

réduite h :


Page 8 sur 12

Choix de la géométrie de la colonne La longueur dépend du nombre de plateaux nécessaires pour effectuer la séparation (Nec) :

La tendance est à la diminution de la longueur et du diamètre des colonnes pour des analyses rapides (fast GC), ce qui présente un grand intérêt dans les analyses toxicologiques. On maintient le rapport de phase constant en diminuant l'épaisseur du film (L = 10 m et f = 0,1 µm); cela permet un plus grand nombre d'analyses et facilite la détection par spectrométrie de masse (faible débit). En revanche, pour les molécules les plus volatiles, il faut augmenter l'épaisseur de phase (limite 5 µm).

2. Chromatographie liquide haute performance Les techniques chromatographiques faisant appel à une phase mobile liquide sont parmi les plus nombreuses. Parmi

celles-ci figure la CLHP qui recouvre un large champ d'applications. Tant par le choix des phases en présence que par la conduite des opérations, cette technique permet d'agir de manière très fine sur les facteurs de sélectivité dans le but d'améliorer les séparations. 2.1. Principes de base

La chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) est, en analyse, l'aboutissement de la chromatographie classique sur colonne dont les performances se sont trouvées grandement améliorées par :

La miniaturisation, rendue possible par les progrès technologiques ; La mise au point de nombreuses phases stationnaires. Celles-ci permettent de réaliser des colonnes garnies

très compactes, mais imposent a contrario l'emploi de pompes hautes pression pour assurer un débit suffisant de la phase mobile dans la colonne ;

L'usage de colonnes de petits diamètres internes – moins de 1 mm (nano- ou ultra-CLHP), ce qui permet d'économiser les quantités de phase mobile nécessaires aux séparations.

Un chromatographe pour CLHP : comporte plusieurs modules spécialisés (pompes, injecteur, colonne, détecteur), reliés entre eux par l'intermédiaire de canalisations de très faible diamètre et qui apparaissent soit séparés, soit intégrés dans un même châssis (figure 6).

Figure 6 : schéma de principe d’un chromatographe pour CLHP

L'injecteur est conçu autour d'une vanne à boucle pour permettre l'introduction de l'échantillon sous très forte pression.

Le détecteur est choisi en fonction des applications projetées. Ce peut être un réfractomètre différentiel ou un spectrophotomètre (UV, IR, Fluorimètre) ou encore un spectromètre de masse.

La température T de la colonne est un facteur important de la séparation. Elle intervient dans l'expression de la constante K de l'équilibre que l'on exprime par :


Page 9 sur 12

Comme k varie dans le même sens que K, on écrit également

Quand on augmente la température, on réunit divers avantages : La viscosité de la PM diminue, donc la perte de charge dans la colonne ; Le temps d'analyse diminue ainsi que l'asymétrie des pics ; Un gradient de température permet de remplacer un gradient de solvant (PM).

2.2. Phases stationnaires

Les matériaux à usage de phases stationnaires se présentent sous forme soit de micro-sphères mono-disperse (diamètre de 1 à 12 µm) soit de solides poreux de type monolithe. Ils comportent des macropores (quelques µm) permettant à la PM de circuler et des mésopores (quelques nm) qui créent la grande surface de contact (plusieurs centaines de m2 par gramme) afin de favoriser les mécanismes de partition avec les solutés. Les colonnes monolithes, macroporeuses, sont plus perméables que celles obtenues par tassement des particules sphériques.

Dans l'élaboration des phases stationnaires actuelles, le gel de silice continue à tenir une place prépondérante en tant que matériau précurseur de beaucoup d'entre elles.

Le gel de silice : Est un solide amorphe ayant pour formule de composition SiO2 (H2O)n (avec n très proche de 0). Il est tout à fait

différent de la silice naturelle cristalline (SiO2) qui sert à le fabriquer. C'est un polymère inorganique réticulé, porteur de groupements silanols (Si–OH), responsables des propriétés catalytiques acides de ce matériau très polaire (Si–OH a un pK de 10, comme le phénol par ex.).

Ses propriétés dépendent de nombreux paramètres : structure interne, porosité ouverte (dimension et répartition des pores), surface spécifique, résistance à l'écrasement et polarité. Les gels de silice courants comportent quelques groupes silanols par nm2.

Le mécanisme d'action du gel de silice repose sur l'adsorption (figure 7), phénomène qui consiste en l'accumulation d'un composé à l'interface entre deux phases à la différence de l'absorption.

Figure 7 : comparaison entre les deux phénomènes « Absorption » et «Adsorption ».

Le gel de silice ainsi décrit permet un certain nombre d'applications en chromatographie d'adsorption, mais il présente une polarité jugée excessive pour de nombreuses séparations. Pour la diminuer, on le rend essentiellement hydrophobe en mettant à profit la réactivité des fonctions silanols pour greffer, par des liaisons covalentes, des molécules organiques à la polarité choisie. La surface du gel de silice devient assimilable à un liquide immobilisé si bien que la séparation met enjeu les coefficients de partage et non plus les coefficients d'adsorption.

Les applications de la chromatographie de partage à polarité de phase inversée (par rapport au gel de silice initial) sont très nombreuses. Les gels de silice greffés sont soit polyvalents (Phase RP-8, RP-18, aux greffons alkyles), soit adaptés à des familles de composés (greffons nitrile, cyanopropyle, aminopropyle, benzyle ou encore cyclodextrines et polysaccharides pour séparer les composés chiraux).


Page 10 sur 12

2.3. Phases mobiles En chromatographie en phase normale (phase stationnaire polaire), on choisit une phase mobile peu polaire. Inversement avec une phase inversée peu polaire («RP-HPLC») la phase mobile (polaire) est le plus souvent constituée d'un mélange d'eau et d'un modifiant tel le méthanol ou l'acétonitrile. En changeant sa composition et en ajoutant des additifs (ex. acide trifluoroacétique) pour améliorer la résolution des composés non-neutres, on modifie les coefficients de partage, donc les facteurs de rétention k des composés. Avec une phase stationnaire peu polaire de type RP :

l'ordre d'élution est opposé à celui obtenu avec les phases stationnaires polaire ; les composés peu polaires migrent d'autant plus lentement que l'éluant est polaire ; en additionnant à la phase mobile un sélecteur chiral, ou en choisissant une phase stationnaire chirale (PSC), il est

possible de séparer les énantiomères ; les composés polaires sont peu retenus sur les phases de type RP, donc difficiles à séparer entre eux.

3. Chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique dans laquelle l'échantillon doit être porté à l'état de

vapeur avant de parcourir la colonne. C'est la raison pour laquelle la CPG se limite aux composés suffisamment volatils et thermiquement stables. Néanmoins, sa grande sensibilité, sa polyvalence et la rapidité de mise au point de nouvelles analyses en font une technique irremplaçable.

3.1. Une installation de CPG

Toute installation de CPG présente deux particularités: la phase mobile qui est un gaz (dihydrogène, hélium ou diazote) et la présence d'une enceinte thermostatée afin de pouvoir porter la colonne jusqu'à plus de 350 °C dans certaines applications. À l'aide d'une microseringue, l'échantillon est introduit sous forme liquide ou gazeuse dans l'injecteur, qui a pour fonction de le porter à l'état de vapeur et de l'amener en tête de la colonne. Celle-ci se présente comme un tube de faible section enroulé sur lui-même, de 1 à plus de 100 m de longueur et contenant la phase stationnaire. La phase gazeuse traverse enfin un détecteur situé en aval de la colonne. En CPG quatre paramètres sont ajustables pour une phase stationnaire donnée :

L, longueur de la colonne ; u, vitesse linéaire de la phase mobile (qui conditionne N) ; T, température de la colonne (facteur de modification important) ; , rapport de phase ( = VM /VS conditionne k).

Les différents réglages du chromatographe permettent d'agir sur T et sur u, donc sur N et k. Sachant qu’il n'existe pratiquement pas d'interaction entre gaz et solutés, la nature du gaz vecteur modifie peu les valeurs des coefficients K des différents solutés. En revanche, la viscosité et la vitesse du gaz vecteur agissent sur l'efficacité de la colonne, le dihydrogène étant le gaz qui permet les séparations les plus rapides, à performances égales (figure 8).

Figure 8 : effet du gaz vecteur sur l’HEPT.


Page 11 sur 12

3.2. Injecteurs et détecteurs 3.2.1. Injecteurs Il en existe plusieurs types, choisis en fonction des applications ou des colonnes utilisées. Ils permettent des modes d'injection différents.

Injecteur à vaporisation directe. C'est le modèle le mieux adapté à l'analyse quantitative pour colonne remplie et colonne capillaire « 530 um».

Injecteur avec ou sans division (split / splitless). Réservé aux colonnes capillaires, il comporte une vanne de fuite qui divise le débit du gaz vecteur en deux fractions, dont seule la plus petite pénètre dans la colonne. Le rapport de division (split ratio) peut varier entre 20 et 500. Cet injecteur peut également fonctionner en mode splitless. Cependant, pour certains échantillons la composition de la fraction passant dans la colonne peut différer de celle de l'échantillon (phénomène de discrimination).

Injection à froid dans la colonne. L'échantillon est injecté directement à l'intérieur de la colonne capillaire, sa

vaporisation se faisant après dépôt.

3.2.2. Détecteurs Ils reposent sur des principes de détection très variés. On choisit un modèle approprié aux applications envisagées.

Certains sont universels, c'est-à-dire sensibles à tous les solutés, alors que d'autres dits spécifiques ne détectent que des catégories particulières de composés. Les plus performants reposent sur des méthodes spectrales, ou sur la spectrométrie de masse, ce qui permet de disposer, en plus du chromatogramme, d'une empreinte spectrale. 3.3. Colonnes et phases stationnaires 3.3.1. Colonnes Il en existe trois types dont les performances diffèrent :

Colonnes remplies, de 1 à 3 m de long, en acier ou en verre et d'un diamètre de 1/8 ou 1/4 d'inch (3,18 ou 6,35 mm). Elles contiennent un support poreux et inerte sur lequel un grand nombre de phases stationnaires peuvent être fixées par greffage ou imprégnation.

Colonnes capillaires, généralement en silice fondue (diamètre interne entre 75 et 250 µm et longueur de 10 à 100 m). La phase stationnaire recouvre la paroi interne sur une épaisseur comprise entre 0,05 et 5 µm. Elle est greffée par l'intermédiaire des fonctions silanols présentes sur la paroi de silice.

Colonnes pseudo-capillaires, également en silice, d'un diamètre particulier de 530 um et de 5 à 50 m de long. Greffées comme les précédentes, leurs performances restent néanmoins inférieures.

3.3.2. Phases stationnaires Elles sont considérées comme des liquides immobilisés par le support (ici, K est le coefficient de partage). Pour les colonnes remplies, on choisit, pour imprégner le remplissage, des composés organiques peu volatils. Pour les colonnes capillaires ont été sélectionnés des polymères appartenant à quelques types peu nombreux : les polysiloxanes et les polyéthylèneglycols, auxquels on peut rattacher des phases particulières pour l'étude des composés optiquement actifs.

Les polysiloxanes (huiles et gommes silicones) correspondent à la répétition d'un motif de base comportant diverses compositions de chaînes alkyle ou aryle (méthyle ou phényle) pouvant comporter en plus des fonctions (ex. cyanopropyle, trifluoropropyle). Grâce à leur gamme de température très étendue, ce sont, pour les colonnes capillaires, les phases les plus utilisées.

Les polyéthylèneglycols (PEG). Les représentants les plus connus de cette famille sont les Carbowax®, polymères polaires (M = 1500 à 20000 – pour le Carbowax 20M).

Les phases stationnaires chirales. Conçues pour séparer les isomères optiques (ou énantiomères) entre eux par un procédé direct.

Les phases stationnaires solides. À base d'adsorbants divers : silice ou alumine, tamis moléculaires, polymères poreux, carbone graphité. On les utilise pour séparer les composés gazeux ou très volatils.

Le squalane, hydrocarbure saturé (C30H62), a été sélectionné comme phase stationnaire de référence ayant par définition une polarité nulle. Sur cette phase utilisable entre 20 et 120 °C, les composés sont élués dans l'ordre de leur température d'ébullition croissante.


Page 12 sur 12

4. Chromatographie sur couche mince En dehors de la CLHP et la CPG dont les applications sont très nombreuses, la chromatographie a également donné

naissance à d'autres techniques utilisables dans des domaines plus restreints. Parmi celles-ci, on remarque la chromatographie par échange d'ions qui permet de séparer les composés très polaires ou ioniques, la chromatographie en phase supercritique et la chromatographie sur couche mince qui fait l'objet de ce cours. 4.1. Rappels La chromatographie sur couche mince (CCM), est une technique complémentaire de la CLHP. La colonne est ici remplacée par un support plan sur lequel est déposée une fine couche (100 – 200 µm) de phase stationnaire, de même type qu'en CLHP. La phase mobile se déplace uniquement par l'effet des forces de capillarité. Parmi ses principaux atouts :

elle est plus rapide et meilleur marché que la CLHP; elle s'accommode de matrices complexes; elle permet des analyses bidimensionnelles (rotation de la plaque et autre PM) ; elle rend possible le lancement de plusieurs analyses simultanément.

Après les trois étapes successives, propres à cette technique : dépôt de l'échantillon, entraînement par la phase mobile et révélation post-chromatographique, la plaque présente autant de taches que de composés séparés. Pour chacun d'eux, on définit le R . (figure 9) :

La vitesse de progression du front de solvant n'est pas constante. Elle obéit à une loi quadratique : x 2 = k • t où x

représente la hauteur du front, t le temps et k une constante. Il en résulte que la résolution entre deux taches atteint généralement son maximum pour un Rf d'environ 0,3. D'autre part, on ne peut pas faire varier le débit de la phase mobile pour améliorer l'efficacité de la séparation.

Figure 9 : comparaison entre les chromatogrammes de CCM et d’ HPLC.

Remarque. Contrairement aux autres formes de chromatographie, en CCM, trois phases distinctes sont présentes entre lesquelles se font les équilibres : la phase stationnaire, la phase mobile liquide et la phase vapeur.

Techniques biochimiques 5. Méthodes électrophorétiques

Page 1 sur 9

1. Historique L’origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se sont inspirés des études

d’Hermann Von Helmholtz menées sur l’électro-osmose. Celui-ci constate qu’il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe opposé à leur charge.

En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l’électrophorèse en veine liquide «ou électrophorèse libre ». Cette technique lui a permis de séparer les protéines du sérum sanguin en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en « U » de section carrée afin de réaliser des mesures optiques au travers du tube. Il a pu obtenir sur le pôle positif des protéines de charge très négative comme l’albumine et sur le pôle négatif des protéines de charge plus positive comme les globulines.

En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant la technique d’électrophorèse sur papier.

En 1952, Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode d’analyse immuno-électrophorétique, qui permet d’analyser des mélanges très complexes d’antigènes. Dès la première application de cette méthode à l’analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30 constituants indépendants, alors que l’électrophorèse en veine liquide ou sur papier ne permettait d’isoler que 5 ou 6 groupes de protéines.

En 1955, O. Smithies met au point l’électrophorèse en gel d’amidon pour la séparation de protéines sériques. En 1957, Joachim Kohn sépare les phénotypes de l’hémoglobine en élaborant la technique d’électrophorèse sur

membrane d’acétate de cellulose. En 1959, Raymond et Weintroub introduisent les gels de polyacrylamide, meilleure séparation de protéines par

électrophorèse (au gel d’amidon) En 1969, Beber et Osbom introduisent l’agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les

différentes sous-unités protéiques. En 1975 O’ Farell développe les gèles bidimensionnelle (focalisation isoelectrique, SDS-PAGE) séparation de

plus de 1000 protéines sur un même gel. En 1984 Schwartz et Cantor développent l’électrophorèse en champ pulsé ; séparation de grosses molécules

d’ADN.

2. Principes L’électrophorèse : est une technique de séparation, caractérisation ou purification de particules chargées par migration différentielles sous l’action d’un champ électrique.

Applications principales : biochimie et biologie moléculaire (Séparation des protéines et des acides nucléiques). Principe : Cette technique se repose sur ;

La migration des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) dissoutes ou en suspension dans un solvant, sous l’effet d’un champ électrique (créé par une tension continue).

Ces particules chargées se déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge. Cation : ion chargé (+). Attiré lors de l’électrolyse par la CATHODE (ou électrode négative). Anion : ion chargé (–). Attiré lors de l’électrolyse par l’ANODE (ou électrode positive).

Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l’électrophorèse, la vitesse de migration et la distance parcourue par ces ions diffèrent, ce qui permet leur séparation.

3. Différents types d’électrophorèse Selon le support électrophorétique, il existe deux types d’électrophorèse: 3. 1. Sur support liquide ou « Electrophorèse en veine liquide »

Il s’agit de la première méthode électrophorétique décrite. La solution échantillon est placée dans un tube en « U » et recouverte d’une solution tampon de densité plus faible que celle de l’échantillon pour éviter les courants de convection. Les électrodes sont placées dans le tube où l’on applique le champ électrique. La migration dans ce cas s’effectue au sein d’un liquide constitué par une solution tampon de pH et de concentration convenable dont les ions


Page 2 sur 9

conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce type de d’électrophorèse présente de multiples inconvénients (Appareillage couteux, mise en œuvre longue et délicate, séparation incomplète des particules).

3. 2. Sur support poreux ou « Electrophorèse de zone»

On a différents supports d’électrophorèse de zones - papier - acétate de cellulose - semi-solide (gels)

On a plusieurs types d’électrophorèse sur gel électrophorèse sur gel d’agarose électrophorèse en champ pulsé électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) électrophorèse bi-dimensionnelle

Les électrophorèses peuvent aussi être réalisées en conditions dénaturantes (détergents type SDS ou urée)

Figure 1. Principe de base de l’électrophorèse sur support poreux.

Les molécules à séparer sont déposées sur un support dont chaque extrémité est en contact avec une solution tampon. Dans chaque solution tampon se trouve une électrode. Les électrodes sont reliées à un générateur de courant. Lorsque le générateur envoie du courant, les molécules chargées se déplacent sur le support en direction de

l’électrode de signe opposé à leur charge.

Les mobilités obtenues en ce type d’électrophorèse sont plus faibles que celles de l’électrophorèse en veine liquide. Ce type utilise un support poreux stabilisant la phase liquide. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, homogène, poreux, inerte et imprégné de tampon. Ce support peut être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de l’agarose, du polyacrylamide (PAGE), etc.. Les fractions séparées par électrophorèse de zone migrent comme des zones individuelles. La taille des pores pour le support en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentissement du déplacement des grosses molécules).

6. Autres types d’électrophorèse

Il existe d’autres types d’électrophorèse: Electrophorèse bidimensionnelle, isoélectrofocalisation, électrophorèse en champ pulsé et immunoélectrophorèse. 6. 1. Electrophorèse bidimensionnelle

C’est une méthode de séparation des protéines selon leur point isoélectrique (pHi) et leur masse moléculaire. La séparation se fait en deux dimensions: La première dimension consiste à séparer les protéines selon leur pHi par isoélectrofocalisation (IEF) et la deuxième dimension consiste à séparer les protéines selon leur masse moléculaire par électrophorèse en présence de SDS. 6. 2. Isoélectrofocalisation

La focalisation électrique ou isoélectrofocalisation (IEF) est une méthode de séparation des protéines en fonction de leurs points isoélectriques (valeur de pH à laquelle la molécule ne présente aucune charge nette). L’IEF est pratiquée sur lame ou sur colonne, dans lesquelles un gradient de pH est préétabli. Le gradient de pH est réalisé en imprégnant le gel avec un mélange de substances amphotères de points isoélectriques différents.


Page 3 sur 9

Lorsque la différence de potentiel est appliquée, les différents ampholytes se rangent dans l’ordre de leur point isoélectrique et réalisent un gradient de pH entre les deux électrodes. Les protéines déposées migrent vers l’anode ou la cathode selon leur charge mais, au fur et à mesure de leur déplacement, le pH extérieur varie, ainsi que leur propre charge: elles ne migrent plus quand leur charge nette est nulle (elles focalisent à l’endroit où le pH est égal à leur propre point isoélectrique (Fig. 7). Les ampholytes sont des mélanges d’un certains nombre de molécules de faible masse moléculaire, donc très mobiles, et comportant chacune plusieurs groupements acide carboxylique et amine.

Figure 7. Gradient de pH en isoélectrofocalisation.

A, B, C, D, E, F et G sont des ampholytes de pHi croissant de pHi A à pHi G. Les ampholytes à pH acide migrent vers l’anode, les ampholytes à pHi basique migrent vers la cathode. L’échantillon protéique est déposé dans un large puits au centre du gel. Les protéines migrent dans une direction ou dans l’autre jusqu’à ce qu’elles rencontrent leur point isoélectrique, point où elles cessent de migrer. Dans l’IEF, le gel de polyacrylamide doit être de forte porosité pour que la taille des protéines n’influence pas leur migration. L’IEF est utilisée pour déterminer le point isoélectrique d’une protéine inconnue par l’utilisation des marqueurs de point isoélectrique (standards), en traçant la droite d’étalonnage: pHi standards = f(Rf). Il ya une relation linéaire entre le point isoélectrique des protéines et leur rapport frontal (Fig. 8).

Figure 8. Mobilité des protéines en fonction de leur point isoélectrique.

(pnA: protéine A de pHi inconnu).

6. 3. Electrophorèse en champ pulsé En 1984, Schwartz et Cantor, proposent une méthode d’électrophorèse sur gel d’agarose dont le pouvoir

de séparation peut aller au moins jusqu’à 9 000 kb. Cette technique est utilisée lorsque l’électrophorèse en gel d’agarose ou de polyacrylamide ne permet pas de séparer des molécules d’ADN dont la taille excède 50000 paires de bases (50 kb). Les fragments d’ADN à séparer sont soumis à l’action alternative de deux champs électrophorétiques perpendiculaires agissant à une certaine fréquence et à une certaine valeur des champs, judicieusement choisies en fonction de la taille des fragments à séparer. L’un des champs étire le fragment d’ADN et lui permet de sortir du piège dans lequel il était bloqué, l’autre assure l’avancement du fragment au


Page 4 sur 9

sein du gel. Grâce à cette technique, il est pratiquement possible, pour tous les organismes à petit génome, procaryotes et eucaryotes inférieurs, de localiser très rapidement un gène quelconque. Par exemple, 16 des 17 chromosomes de la levure Saccharomyces cerevisiae peuvent être séparés par ce type d’électrophorèse. Donc, le marqueur de tailles utilisé le plus fréquemment, servant de référence pour la taille des fragments, est l’ADN de Saccharomyces cerevisae.

L’électrophorèse peut être en des conditions non dénaturantes ou en des conditions dénaturantes (SDS-

PAGE). 5. 1. Electrophorèse en des conditions non dénaturantes

Les molécules sont séparées dans leur état le plus proche possible de leur état natif. La vitesse de migration dépend de la charge native de la molécule et de sa structure tridimensionnelle. 5. 2. Electrophorèse en des conditions dénaturantes

Les molécules sont soumises à un traitement dénaturant avant la séparation électrophorétique, détruisant la structure tridimensionnelle native. La séparation est donc en fonction de la masse moléculaire. Les agents de dénaturation sont le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) et le -mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des protéines. Le SDS (Fig. 1) est un dénaturant doux et un surfactant, il agit sur les protéines de plusieurs façons:

Si la protéine est oligomérique, ses sous unités sont séparées les unes des autres. Il se fixe sur les protéines, les tapissant de charge négative (Fig. 2). Les protéines transformées en

manopolyanions, possèdent toutes la même mobilité électrophorétique. La charge négative globale permet la migration vers l’anode, mais les molécules sont séparées uniquement en fonction de leur masse moléculaire.

Figure 2. Structure chimique du SDS.

Figure 2. Action du SDS sur les protéines.

A) Appareillage d’électrophorèse L’appareillage usuel est constitué de (Fig. 3):

Un générateur du courant continu stabilisé relié aux électrodes de la cuve. Ce courant crée un champ électrique qui va permettre de faire migrer les molécules.

Une cuve d’électrophorèse fermée (horizontale ou verticale) et éventuellement thermostatée comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du tampon de migration.


Page 5 sur 9

Des accessoires comme le support d’électrophorèse, les plaques de verre pour couler le gel et les peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composés à analyser seront déposés.

Figure 3. Appareillage d’électrophorèse.

B) Mode opératoire Il consiste à:

Préparer le gel de concentration et le gel de séparation. Couler le gel de séparation entre des plaques de verre fixées sur un support suivi par le gel de

concentration. Déposer un peigne entre ces plaques. Retirer le peigne après polymérisation du gel (formation des puits). Déposer l’échantillon et les marqueurs de masse moléculaire dans les puits. Placer les plaques de verre contenant le gel polymérisé dans une cuve d’électrophorèse. Remplir la cuve avec le tampon de migration. Mettre en marche le générateur de courant. Enlever le gel à partir des plaques à la fin de la migration. Colorer puis décolorer le gel. Analyser le gel.

Préparation du gel Elle consiste à préparer deux gels: un gel de séparation dont les pores sont sérés et un gel de concentration

dont les pores sont lâches. Le gel de polyacrylamide est une macromolécule réticulée utilisée comme support d’électrophorèse. C’est

un copolymère d’acrylamide qui forme des chaînes et de NN’-méthylène bis-acrylamide qui assure le potage entre les chaînes de polyacrylamide (Fig. 4). La polymérisation de l’acrylamide nécessite la présence de deux catalyseurs: Le TEMED (N, N, N’, N’-tétraméthyléthylène diamine: TMEDA) et le persulfate d’ammonium [(NH4)2S2O8] qui deviennent des anions hyperactifs en présence de lumière. La porosité du gel varie en fonction du taux de l’acrylamide, de bis-acrylamide, du TEMED (Fig. 5) et du persulfate d’ammonium. Plus que le pourcentage d’acrylamide est élevé, plus que la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées. Par conséquence, plus le pourcentage d’acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses peuvent migrer (Tab. 1). Donc, plus que la masse moléculaire du composé est élevée, plus que la migration est lente. Tableau 1. Pourcentage d’acrylamide en fonction de la taille des protéines à séparer.


Page 6 sur 9

Figure 4. Formation du gel de polyacrylamide.

Figure 5. Structure chimique du TEMED.

Le gel de séparation permet la séparation de la solution à analyser. La densité typique de ce gel peut être 6, 8, 10, 12, ou 15%. Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des composés. Le gel de concentration est coulé en haut du gel de séparation et sa densité est de l’ordre de 5%. Il permet une entrée homogène de l’échantillon dans le gel de séparation.

Préparation de l’échantillon: L’échantillon est soumis à l’action de plusieurs composés: Le mercaptoéthanol: Composé qui exerce une action dénaturante sur les protéines oligomériques en

rompant les ponts disulfures ce qui désorganise leur structure tridimensionnelle. Les sous unités des protéines sont donc dissociées.

Le SDS: Composé capable de venir se fixer sur la périphérie des chaînes de protéines tout en leur conférant une charge négative.

Le sucrose ou le glycérol: Qui donnent une densité à l’échantillon permettant ainsi à ce dernier d’être déposé facilement au fond des puits.

Le bleu de bromophénol: Est également utilisé comme marqueur coloré afin de vérifier le bon déroulement d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou en gel d’agarose. En conséquence, les protéines sont dénaturées (elles ont perdu leur structure tridimensionnelle) et n’ont plus de ponts disulfures (elles sont sous une forme monomérique).


Page 7 sur 9

Les marqueurs de masse moléculaire: La détermination de la masse moléculaire des protéines inconnues nécessite l’utilisation des protéines standards de masse moléculaire connue.

Le tampon de migration: Il contient des électrolytes qui sont responsables du transport du courant électrique. Si la concentration de ces électrolytes est faible, la totalité du courant est transportée par le soluté et une faible proportion est transportée par les électrolytes, ce qui entraine la migration des protéines et donc leur séparation. Le tampon d’électrophorèse est constitué de glycine qui joue le rôle de conducteur de courant.

La coloration: Une fois la migration électrophorétique terminée, le gel est démoulé, séché puis plongé dans un colorant. Les protéines sont révélées par une coloration spécifique (par exemple avec le bleu de Coomassie).

La décoloration: Une succession de bains dans la solution de décoloration permet d’éliminer la coloration du fond de façon à faire apparaître les bandes correspondant aux diverses protéines séparées. Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui contient du méthanol et de l’acide acétique. C) Applications L’électrophorèse est utilisée pour vérifier la pureté d’une fraction chromatographique et pour déterminer la masse moléculaire d’une protéine inconnue à l’aide des protéines standards.

Détermination de la masse moléculaire Le fait que le SDS rende négatives les protéines permet de les séparer en fonction de leur taille (masse moléculaire) et non pas en fonction de leurs charges. Il existe une relation de linéarité entre le logarithme de la masse moléculaire et le déplacement électrophorétique (Rf) au sein du gel. Cette technique est utilisée pour déterminer la masse moléculaire d’une protéine inconnue. Dans les mêmes conditions, on soumet la protéine à analyser à une électrophorèse, la connaissance de son déplacement (Rf) et l’extrapolation de ce Rf sur la droite: Log M = f (Rf), permettent la détermination de sa masse moléculaire (Fig. 6).

Figure 6. Mobilité des protéines en fonction du logarithme de leur masse moléculaire. (pnA: protéine A de masse moléculaire inconnue). A l’aide de marqueurs protéiques (protéines pures de masse moléculaire connue) (Tab. 2) on trace la droite d’étalonnage Log M=f (Rf). Le rapport frontal (Rf) représente le rapport de la distance parcourue par la protéine sur la distance parcourue par le front de migration (Fm). Tableau 2. La masse moléculaire et les rapports frontaux de quelques protéines standards.


Page 8 sur 9

6. 4. Immunoélectrophorèse Cette technique permet de séparer les composés par électrophorèse et de les détecter par réaction

immunologique par formation d’arc de précipitation entre antigène et anticorps. Les précipités peuvent être facilement visualisés sur un gel. Donc, c’est une méthode qui associe l’électrophorèse de protéines (Ag) à une immuno-diffusion contre des Ac spécifiques.

Les antigènes sont séparés en électrophorèse de zones sur une lame de gel d’agar tamponné à pH variable de 8.2 à 8.6 est percée de deux puits au centre. Les fractions protéiques particulièrement mobiles du sérum (sérum-albumine, 1 lipoprotéine, 1 antitrypsine, haptoglobine, transférrine, lipoprotéine, etc.) migrent vers l’anode à pH 8.2-8.6, comme sur l’acétate de cellulose (sens 1) (Fig. 9). Par contre, les fractions les moins mobiles comme les IgG sont entrainées vers la cathode par le courant d’électro-endosmose. Elles migrent donc en apparence vers la cathode bien que chargées négativement (sens 2) (Fig. 9).

Figure 9. Lame d’immunoélectrophorèse.

L’antisérum spécifique est déposé dans une rigole découpée parallèlement à la direction de la migration électrophorétique (Fig. 10). La plaque est placée en chambre humide pendant 24 à 48 heures. Après cette période, les arcs de précipitation apparaissent.

Figure 10. Immunoélectrophorèse d’un sérum.

Cette technique est une méthode analytique qui permet de dénombrer une trentaine de protéines dans le sérum humain. L’exploitation de la plaque est faite visuellement:

Par observation directe sur fond noir, ou à la loupe éclairante. Par photographie et agrandissement. Par coloration après lavage et séchage.

L’interprétation des résultats nécessite la comparaison de l’échantillon à analyser et un sérum normal. La comparaison porte sur:

La position électrophorétique des arcs. Leur forme et leur épaisseur. Leur netteté.

Remarque: Un arc épais, plus long et plus près de la rigole indique un accroissement de la teneur en cette protéine. Un arc plus fin, plus court et plus éloigné de la rigole indique l’inverse. Un arc flou qui indique un mauvais rapport stoechiométrique Ag-Ac, près de la rigole, signifie une

augmentation de l’antigène; éloigné de la rigole, une diminution.


Page 9 sur 9

3. Facteurs influençant la mobilité électrophorétique Plusieurs facteurs peuvent influencer la mobilité électrophorétique.

3. 1. Nature de la molécule La taille et la charge de la molécule influencent le processus électrophorétique. En effet, les petites

molécules migrent facilement mais leur mobilité dépend des autres substances dissoutes susceptibles de les solvater et de diminuer leur vitesse. De même, la charge des molécules influence directement leur mobilité. La charge est fonction du pH pour les molécules ionisables, de la force ionique et de la formation éventuelle de complexes. Le signe de la charge détermine le sens de migration et sa vitesse. 4. 2. Composition ionique du tampon d’électrophorèse

La présence d’ions étant nécessaire au passage du courant, un compromis est obtenu avec une force ionique comprise entre 0.05 et 1 mol/l. Le pH influe sur l’ionisation des acides faibles et bases faibles, pour lesquels il s’avère nécessaire de travailler dans un milieu tamponné.

A pH et force ionique identiques, deux tampons de nature différente ne produisent pas toujours des mobilités électrophorétiques identiques. Certaines substances ajoutées au tampon de migration modifient aussi les comportements électrophorétiques. Ainsi:

La présence d’EDTA ou d’acide citrique favorise par complexation la séparation de certains ions minéraux.

Les ions boratés forment avec les sucres des complexes chargés rendant ainsi possible leur séparation. L’addition d’urée modifie le comportement électrophorétique des macromolécules par rupture de

liaisons hydrogène. 4. 3. Support

Certains supports possèdent des propriétés adsorbantes et peuvent fixer les molécules de solvants ou de solutés. Il en résulte un ralentissement de la migration entrainant un élargissement des zones sur l’électrophorégramme. Ces propriétés adsorbantes sont liées à la présence de certains groupements fonctionnels comme les hydroxyles. 4. 4. Champ électrique

Il représente la chute de potentiel par unité de longueur entre deux électrodes séparées par une distance. Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le support de ce champ est constitué par un tampon de pH dont les ions conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce support peut être liquide: on parle alors d’électrophorèse en veine liquide. Dans une large majorité des cas, on utilise un support poreux stabilisant la phase liquide: on parle alors d’électrophorèse sur support ou d’électrophorèse de zones. Le mélange à séparer est déposé sur un support poreux imprégné de tampon. Ce support peut être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de l’agarose, du polyacrylamide, etc. Le support doit être homogène et inerte. Les particules à séparer peuvent être de nature et de taille très différentes: des composés organiques ou minéraux, de la taille d’une cellule ou de celle d’un ion. Cette méthode est souvent utilisée pour séparer des acides nucléiques, des petits peptides ou des protéines.

techniques biochimiques

Documents