technic etude de cellule.pdf

7/24/2019 technic etude de cellule.pdf

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Techniques dtudes

de la cellule

Dr. Roger OUROUDA


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PLANPLAN

Imagerie cellulaireImagerie cellulaire (microscopie)(microscopie)

Isolement et culture des cellulesIsolement et culture des cellules

CytomCytomtrie en fluxtrie en flux

Exploration molExploration molculaireculaire


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PLANPLAN


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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directe/contraste de phasere directe/contraste de phase fluorescencefluorescence confocalconfocal fluorescencefluorescence

22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique transmission (MET)transmission (MET) balayage (MEB)balayage (MEB)

Imagerie cellulaireImagerie cellulaire -- MicroscopieMicroscopie


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MicroscopesMicroscopes


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Limite de rLimite de rsolution:solution:

Oeil nu: 300m (10-6m)

Microscope optique: 200nm (10-9m)

Microscope lectronique: 100pm (10-12m)

microscopemicroscope lectroniquelectronique

PetitePetitemolmolculecule VirusVirus BactBactrierie

CelluleCelluleanimaleanimale

CelluleCellulevvggtaletale

Taille relative des cellules et de leurs composantsTaille relative des cellules et de leurs composants

microscope optiquemicroscope optique

Imagerie cellulaireImagerie cellulaire MicroscopieMicroscopie

Pouvoir de rsolution


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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique


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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique


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Imagerie cellulaireImagerie cellulaire

--

MicroscopieMicroscopie




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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique :: lumilumire directe/contraste de phasere directe/contraste de phase

Cellules vivantesCellules vivantes


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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique-- FluorescenceFluorescence


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FluorescenceFluorescence

- Elle peut avoir plusieurs origines :

naturelle : ex: chlorophylle

utilisation de substance fluorescente se fixantspcifiquement sur une structure (Ex: DAPI sur ADN ;bleu)

Cellules CHO

DAPI


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FluorescenceFluorescence utilisation de fluorescente substance non spcifiquenaturelle, comme la fluorescine ou la rhodamine, fixe un anticorps spcifique dun antigne. Spcificit due lanticorps


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Fluorescence (cellule vivante)Fluorescence (cellule vivante)

Protine chimre (ex: GFP) naturellement fluorescente


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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directere directe contraste de phasecontraste de phase fluorescencefluorescence

confocalconfocal fluorescencefluorescence

22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique balayage (MEB)balayage (MEB)

transmission (MET)transmission (MET)



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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique-- microscopie confocalemicroscopie confocale


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SurfaceSurface

Profondeur du foyerProfondeur de lacollecte de la lumiere

Profondeur de lacollecte de la lumiere

Microscopie optique Microscopie confocal

Observationau microscope optique

Observationau microscope confocal

11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique-- microscopie confocalemicroscopie confocale


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Z1

Z2

Z3

Z4

Z1Z2

Z4Z3

Microscopie confocaleMicroscopie confocale


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Microscope confocalMicroscope confocal

Microscopie confocaleMicroscopie confocale MicroscopieMicroscopie fluorescencefluorescence


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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique -- Microscopie confocaleMicroscopie confocale fluorescencefluorescence


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confocalconfocal fluorescencefluorescence22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique


balayage (MEB)balayage (MEB)



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1- Microscopie lectronique


29/68

http://www.mos.org/sln/SEM/mhead.html

www.allergybegone.com/newsletter-apr2005.html.

http://www.mos.org/sln/SEM/mhead.html

www.allergybegone.com/newsletter-apr2005.html.

en.wikipedia.org/wiki/Immune_system .

1- Microscopie lectronique


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MicroscopieMicroscopie

RRsumsum

Microscopie optiqueMicroscopie optique MicroscopieMicroscopie lectroniquelectronique

Faisceau de lumiFaisceau de lumirere FaisceauFaisceau lectroniquelectronique

Lentilles optiquesLentilles optiques LentillesLentilles lectromagnlectromagntiquestiques

RRsolution 0,2solution 0,2mm RRsolution 0,2nmsolution 0,2nm

Traditionnel Fluorescencelectronique balayage

(MEB)

lectronique transmission

(MET)

Cellules non vivantesCellules non vivantes

Cellules vivantesCellules vivantes

ou non vivantesou non vivantes Protinesfluorescentes

CellulesCellulesvivantesvivantes

CellulesCellulesnon vivantesnon vivantes


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PLANPLAN


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IsolementIsolement partir dpartir dun tissuun tissu

IsolementIsolement partir de sangpartir de sang



ISOLEMENT ET CULTUREISOLEMENT ET CULTURE

DES CELLULESDES CELLULES


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Culture cellulaireCulture cellulaire

Fragment

tissulaire

Suspension de cellules

Les cellules sont mises dans

un flacon rempli de milieu nutritif

CULTURE PRIMAIRECULTURE PRIMAIRE

CULTURE SECONDAIRECULTURE SECONDAIRE

Prolifration des cellulesjusqu conf luence

Cellu les rcoltes ettransfres dans un nouveau flacon

Passage


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Collag nase H Tampon cordon Cordon ombilical

Canules

HUVECs Passage 0 (P0):culture primaire

HUVECs Passage 1 (P1): culture secondaire)

Cellules endoth liales

1. Isolement et culture cellulaire1. Isolement et culture cellulaire

partir dpartir dun tissuun tissu


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www.microscopyu.com

Contraste de phase

Cellules HeLaCellules HeLa (Henrietta Lacks)(cellules immortalis(cellules immortalises des drivrives de cellules des de cellules d un cancer cervical)un cancer cervical)


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IsolementIsolement partir dpartir dun tissuun tissu




ISOLEMENT ET CULTUREISOLEMENT ET CULTURE

DES CELLULESDES CELLULES


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Sang hparin

Centrifugation

Surnageant = plasma

Culot = cellules

Remise en suspension

Sparation


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PLANPLAN


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Cytomtrie en flux (taille, granulosit)

Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)

Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)


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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux (taille, granulosit(taille, granulosit))




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BD biosciences


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C tC t t i flt i fl


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C tC tomt i fltrie en fl


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biology.berkeley.edu

Detecteur

Forwardscatter

(FS)

Detecteur Side scatter(SC)

Detecteur Side scatter(SC)

SourceSourcede lumide lumirere

Forward Scatter (FS) est proportionnel la taille de la cellule

Side Scatter (SC) est proportionnel la complexit de la cellule (granulosit)



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LymphocytesLymphocytes

NeutrophilesNeutrophiles

MonocytesMonocytes


Sang total lysSang total lys

(F

S)

(SC)


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CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux (taille, granulosit(taille, granulosit, fluorescence), fluorescence)


C t fl iC t fl i t i flt i fl


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CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux

Antignes

Anticorps spcifiques

FITCFITCPEPE



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Histogramme 2 Paramtres

FITC FLFITC FL

PopulationPopulation

NNgativegative PopulationPopulationpositive (FITC+)positive (FITC+)

PopulationPopulationpositivepositive

(PE+)(PE+)

PopulationPopulationdoublementdoublement

positivepositive

((FITC+FITC+,, PE+PE+))PE

FL

PE

FL


+ +

+ -- -

- +

0

CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux --ApplicationApplication


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Etude du cycle cellulaireEtude du cycle cellulaire

https://reader009.{domain}/reader009/html5/0320/5ab05a6eb

Iodide de propidium sintercale entre lespaires de bases et se lie lADN double brin

Contenu en ADN

2n

4n

G1S G2+M

G1

G1

G2

M

S


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Trieur de cellules par CytofluorimTrieur de cellules par Cytofluorimtrie en fluxtrie en flux(Fluorescence(Fluorescence--activated cell sorter, FACS)activated cell sorter, FACS)

Tri cellulaire parTri cellulaire par


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cytofluorimcytofluorimtrie en fluxtrie en flux

Tri cellulaire parTri cellulaire parC t fl iC t fl i t i flt i fl


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Domaines utilisant la cytomDomaines utilisant la cytomtrie en fluxtrie en flux


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RechercheRecherche CliniqueClinique

IndustrieIndustriePharmacologiePharmacologie

yy

- Fonction immune- Cancer- Biologie molculaire

- Diagnostic in vitro- Transplantation/Transfusion- Qualit contrle pour thrapie cellulaire

- Identification et validation de composs- Etude de safety de mdicaments- Dcouverte de biomarqueurs

- Environnement-Agriculture

PLANPLAN


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PLANPLAN

E ploration molExploration molc laireculaire


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Fractionnement subcellulaireFractionnement subcellulaire

Techniques dTechniques danalyse de lanalyse de l ADN, des ARNADN, des ARN

et des protet des protinesines

Cellule eucaryotiqueCellule eucaryotique


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y qy q


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SSparation des organitesparation des organites

Par centrifugation diffPar centrifugation diffrentiellerentielle

Par gradient de densitPar gradient de densit

SSparation des organites:paration des organites: Centrifugation diffCentrifugation diffrentiellerentielle


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SSparation des organitesparation des organites


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Gradient de densitGradient de densit



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Fractionnement subcellulaireFractionnement subcellulaire

Techniques dTechniques danalyse de lanalyse de l ADN, des ARNADN, des ARN

et des protet des protinesines

La chromatographie d'exclusion ou fi ltration sur gel


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1 : Dpt d'un mlange de deux molcules2 : Les petites molcules3 : Les grosses molcules4 : Les petites molcules sont lues

La chromatographie d'affinit


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g p

Prsence de groupements d'atomes

formant des sites particuliers : Ac-Ag, Enz-substrat

La chromatographie de paires d'ions

La chromatographie : Types


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Charge lectrique

changeuse danions(+)

Ex: Amine tertiaire,DEAE (dithylaminothyle)

changeuse de cations(-)

Ex : Carboxyle coo-,Phosphate Po4-

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