TD Noyau, Chromatine,

Chromosome, Caryotype

(S. Delbecq)

N. Boulle Année 2014-2015

NOYAU

Caractéristique des cellules eucaryotes +++

- Limité par l’enveloppe nucléaire (2 membranes: interne et externe)

- Contient presque la totalité de l’information génétique (le génome nucléaire)

L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau

Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études ∼1950

chromatine

L’enveloppe nucléaire

Description:

Enveloppe constituée de 2 membranes :- membrane externe: en continuité avec le RER- membrane interne- espace périnucléaire Membrane

externe

Membrane interne

Enveloppe nucléaire Réticulum

Endoplasmique

Lumière du RE

Espace périnucléaire

Lamina nucléaire

Pore nucléaire

ribosome

L’espace périnucléaire

Espace en continuité avec la lumière du RE:- contenu similaire- stockage du calcium

Percée par les pores nucléaires

Interface entre le cytosquelette (cytosol) et le nucléosquelette (nucléoplasme)

Exercice 1

Transport nucléo-cytoplasmique

Transport nucléo-cytoplasmique:

Via les pores nucléaires

- Pores nucléaires: seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme

- Passage dans les 2 sens; notion de sélectivité

- Passage de petites molécules, ions

Protéines

ARNm, ARNt, ARNr

ribonucléoprotéines, particules ribosomales…

- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)

Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues~ 450 protéines en tout (par pore)

Molécules de taille variable!

Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable

Les pores nucléaires

16 bras radiaires (2x8)

16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)

Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757

Structure 3D des pores nucléaires

Microscopie electronique, cryofracture

8 unités répétées

notion de sélectivité

Les pores nucléaires

Les éléments du transport nucléo-cytoplasmique

- Signaux d’adressage sur la protéine (cargo) à transporter (NLS, NES, NRS)

- Importines, exportines: Récepteurs de transport

-Les Nucléoporines:

-Système Ran GTP / GDP → orientation du transport à travers le pore

Transport à travers le pore nucléaire dans les 2 sensÉlément transporté = cargo

Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):

Domaine FG ( Ex: motif FXFG)

Séquences de reconnaissance pour les Importines / ExportinesInterviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!

Signaux d’adressage: se comportent de manière auton ome!-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)-NES (Nuclear Exportation Signal)-NRS (Nuclear Retention Signal)

Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠≠≠≠ mitochondrie / peroxysome)

Masquage/démasquage des signaux d’adressage par par tenaires d’interaction

REM: 40% des protéines nucléaires n’ont pas de NLS classique

Les signaux d’adressage nucléaires

GEF

GTPGDP

PiGAP

GDPGTP

RanRan

GAP: GTPase-Activating Protéin

GEF: Guanine –nucleotide

Exchange Factor

Le système Ran → orientation du transport NC

Ran = GTPase

Echange

Hydrolyse

• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la membrane nucléaire:

GEF / GAP

noyau / cytosol

• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme

Le système Ran

Ran GDP Cytosol

Ran GTP

NoyauRan GDP

Ran GTP

GEF

GAPcytosolique

GEFnucléaire

Gradient de Ran à travers l’enveloppe nucléaire

Cytosol

Noyau

Figure 1

Excitation - λλλλ Emission - λλλλ

E = h c / λλλλE = h c / λλλλ

QCM 1

Nucléoporine

L’importation :QCM 3

Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153

Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG

Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757

Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 1 53

Extrémité flexible

Fixe importines / exportine

QCM 3

Exercice 1

Figures 2A et 2B

Méthodologies:

production de protéines «recombinantes »

Bactérie

Cellule eucaryote

purifiée

ADN

Protéine rec.

LysatWestern blot

IP…

Protéine rec.

Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps

- Western-blot

Gel d’électrophorèse

+

- Immuno-précipitation Billes de résine

Lysat

(protéines)

TAGprotéineAnticorps anti-TAG

- TAG TAG = FLAG, Histidine6, GST…

Lysat

(protéines)

Anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt

Méthodologies: Interactions protéine-protéine

- « Pull –down » → Protéines purifiées ou domaines protéiques

- Immuno-précipitation → Protéines produites dans la cellule

Figure 2A

Importine αFLAG

FLAG

Importine αFLAG

FLAG

lysat

CP

Histidine6 (His)

Bactérie Cellules HEK293

purifiée

Billes de résine

Figure 2A

CP

His

Anti-Histag

Importine α (1 ou 2 ou 3 ou 4)

FLAG

FLAG

Cellules HEK293

lysat

?CP

Imp αααα

Western-blot anti FLAG

Western blot anti-Histag /

Western-blot anti FLAG

Figure 2A

Billes de résine

CP

Billes de résine

Billes de résine

Imp αααα

Pull downFLAG-imp αααα + CP

Figure 2A

Billes de résine

Billes de résine

His

FLAG

CP

impα4

QCM 4

Le recyclage des importines :

cytosol

nucléoplasme

RanGTP

exportine

Imp. αααα

RanGTP

exportine

Imp. αααα

RanGAP

RanGDP

exportine

Imp. αααα

! Imp. αααα a un signal NES

≠ export direct de l’importine ββββ – Ran GTP sans exportine

Hydrolyse du GTP → libération de imp. αααα

QCM 4

Figure 2B

Billes de résine

CP

GFP

Importine α4

FLAGlysat

Billes de résine

IgG contrôle

Cellules HEK293= co-expression

Western blot anti GFP

Western-blot anti FLAG

(WB anti-GFP)

Anticorps anti-FLAG

Billes de résine IP

Figure 2B

Immunoprécipitation

Importine α4FLAG

FLAGAnticorps anti-FLAG

Billes de résine

Anticorps anti-FLAG

Billes de résine

CP

GFP

Importine α4

FLAG

Importine α4FLAG

Billes de résine

lysat

Western blot anti GFP

Figure 2B - Piste 4

Figure 2B

Importine α4FLAG

Billes de résine

Anti-GFP

Anti-GFP

QCM 5

Figures 3A – 3B

CP-GFP

cytosol

nucléoplasme

RanGTP

NES

exportine

RanGTP

exportine

NES

RanGTP

exportine

NES

RanGAP

RanGDP

exportine

NES

exportine

Leptomycine

(LMB)

L’exportation :

CRM1

QCM 6

Figures 3C

Pull-down

CP

Histidine6

GST

CRM1(exportine)

Billes de résine

Billes de résine

GST

CRM1(exportine)

+

Western blot anti His

Western blot anti GST

GST

Billes de résine

Figure 3C

CP

Histidine6

?

(146 kDa)

GST(26 kDa)

Piste 2 Piste 3 Piste 4

Pull-down

Piste 1

Figures 3C

Pull-down

GST

CRM1(exportine)

CP

Histidine6

Billes de résine

CP

CRM1(exportine)

NES

QCM 7

CP (30 kDa)

(protéine de capside du virus Chikungunya)

NLSNH2 COOH

NESIm

pα 4

Exportine

(CR

M1)

ConclusionQCM 7

cytosol

nucléoplasme

exportine

CP

CP

Imp

α α α α 4

Imp

ββ ββ

CP

Imp

α α α α 4

Imp

ββ ββ

Ran

GT

P

RanGTP

exportine

CP

RanGTP

Chromosomes - Caryotype

Accumulation de cellules

Synchronisation / blocage

Culture cellulaire: cellules somatiques

Prométaphase ou métaphase

Solution hypotonique

Obtention d’un caryotype

Dispersion chromosomique

Fixation, coloration

Division cellulaire

Colchicine

lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)(Cellules tumorales)

Obtention d’un caryotypeQCM 7

Répétition 5’ TTAGGG 3’

sur 5-10 kpb

Se raccourcit à chaque division

Structure d’un chromosome métaphasique

Observation après coloration

Classement des chromosomes ?

- Taille

- Position du centromère

Ic= p/(p+q)

- Bandes (G, R…)

Classement en 7 groupes (A à G)

Caryotypes:

A B

C

D E

F G C G

métacentriques

submétacentriques

acrocentriques

Classement d’après la longueur et l’index centromér ique :7 groupes de A–>G

acrocentriques

13 14 15

21 22

Obtention d’un caryotype

Coloration des chromosomes au Giemsa

Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine

- Bandes G: sombres, digestion enzymatique ménagée + Giemsa

- Bandes R: sombres, digestion thermique ménagée + Giemsa

• Bandes:

→ Caractéristiques d’une paire chromosomique

→ Reproductible d’une mitose à l’autre

→ Caractéristique d’une espèce donnée

• Métaphase: 200 – 500 bandes

• Caryotype standard = 400-550 bandes (résolution 5-10 Mpb)

FISH: Hybridation In Situ Fluorescente

Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)

+Ne nécessite pas de cellules en division (noyaux en métaphase ou interphase)

Bonne résolution

Outil de recherche

-Etude ciblée (sonde spécifique)

Les différents types de sonde

Cytogénétique moléculaire:

FISH: Fluorescent in situ hybridization:

- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise

- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée

- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)

• Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX

• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3

Exemple: 47, XY, +21

Les anomalies chromosomiques

Exercice 2

Figure 1 : Caryotype classique (bandes G) de la mère (A) et du patient (B)

Exercice 2

der(11)t(1; 11)(q41; p15.5)

Régions NORQCM 8

NOR = - Coloration spéciale (nitrate d’argent)

- Constrictions secondaires au niveau des chromosomes acrocentriques

- Centre fibrillaire des nucléoles

Constrictions secondaires

Région NOR

N = 5 chromosomes acrocentriques x 2 = 10 régions NOR

Réparties sur plusieurs nucléoles

QCM 8

Possibilité de translocations

robertsoniennes:fusion centrique des

chromosomes acrocentriques

ADNr ADNr ADNr ADNr

Organisation des gènes en tandem (environ 20 copies)

ARNr 45S

Grande sous-unité ribosomale (60S)

Petite sous-unité ribosomale (40S)

Clivage / maturation de l’ARN

(Polymérase III)

NOR (organisateur nucléolaire)

ARN Polymérase I

Cf cours sur la transcription (UE1)

Régions NOR - Le nucléole

+ protéines = Grande particule RNP

QCM 8

En Microscopie électronique (MET)

- Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR

- Composant fibrillaire dense (grande particule RNP)

- Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)

QCM 8

Exercice 2

Figure 2Hybridation Génomique Comparative

CGH : Comparative Genomic Hybridization

Préparation de l’ADN

Hybridation sur support contenant les sondes (« puce »)

Acquisition des signaux d’hybridation

Analyse quantitative des données

1 point = 1 sonde

→ Plus résolutif qu’un caryotype classique : cf nombre de sondes sur le support

Mais on ne voit pas les chromosomes

Anomalie équilibrée ?

Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization

Figure 2 : analyse par hybridation génomique compara tive ( array CGH ) des chromosomes 1 (A) et 11 (B)

Position approximative des centromères et de la région 11p11?

centromère

centromère

11p11

Numérotation des bandes

QCM 9

Figure 3 : Analyses par hybridation in situ (FISH) .

A : sondes 1q43 (rouge) et 1p13.2 (vert). B : sondes 11p15.5 (rouge) et 11p11.11-11p11.12 (vert).

L’ADN est visualisé à l’aide de DAPI (bleu).

QCM 10-11

Figure 2 : analyse par hybridation génomique compara tive ( array CGH ) des chromosomes 1 et 11

centromère

centromère

11p11

NB: Position approximative des centromères et de la région 11p11

Sondes utilisées pour la figure 3A (rouge) et 3B (b leu)

sonde 1p13.2 Sonde 1q43

Sonde 11p15.5Sonde 11p11.11

QCM 10-11

Chromosome 1

Chromosome 11

1q

11p

Mère

Translocation réciproque entre les chromosomes 1 et 11: t(1; 11)(q41; p15.5)

Conclusion

mère

père

Fille Patient

111

1

11

gamètes