TD n° 1TD n° 1ElectrophorèseElectrophorèse

L’électrophorèse est – avec la chromatographie – la principale

des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la

caractérisation des molécules.

Elle a quelques applications en chimie, mais est principalement

utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation

des protéines ou celle des acides nucléiques.

Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en

fonction de leur charge et pour des charges identiques, en

fonction de leur taille.

Principe d’Electrophorèse: Principe d’Electrophorèse:

Méthode la plus fréquemment utilisée pour Méthode la plus fréquemment utilisée pour séparerséparer des des

moléculesmolécules ionisées ionisées: : Acide aminé, Acide nucléique, protéinesAcide aminé, Acide nucléique, protéines. Les . Les

molécules se déplacent a une molécules se déplacent a une vitessevitesse déterminée par rapport a déterminée par rapport a

leur leur chargecharge sur leur sur leur massemasse. .

Les molécules Les molécules anioniquesanioniques (-) migrent vers l' (-) migrent vers l'anodeanode (+) et les (+) et les

molécules molécules cationiquescationiques (+) se déplacent vers la (+) se déplacent vers la cathodecathode (−). (−).

Application d’Electrophorèse :

déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de

déterminer leur masse molaire respective ;

d'évaluer le degré de purification d'une protéine ;

de séparer des protéines pour les révéler par la technique du

Western blot (réaction avec un ou des anticorps) ;

de séquencer l'ADN et de déterminer la taille de fragments

d'ADN ;

de séparer des acides nucléiques pour les analyser par la

technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN).

Différentes types d’ElectophorèseDifférentes types d’Electophorèse : :

nommées en fonction du type de support :nommées en fonction du type de support :

a. Electrophorèse sur papier ou acétate de cellulose:a. Electrophorèse sur papier ou acétate de cellulose:

Pour les Pour les petites moléculespetites molécules qui migrent a une qui migrent a une vitessevitesse

proportionnelleproportionnelle à leur à leur chargecharge sur le sur le supportsupport ( (hémoglobinehémoglobine). ).

b. Electrophorèse sur gel:b. Electrophorèse sur gel:

Permet de conjuguer la Permet de conjuguer la mobilité électrophorétiquemobilité électrophorétique à un effet à un effet

de de filtration sur gelfiltration sur gel, la , la taille des porestaille des pores limitant la limitant la vitessevitesse de de

migrationmigration. On utilise généralement des . On utilise généralement des gels d'agarosegels d'agarose ou de ou de

polyacrilamidepolyacrilamide qui se solidifient. qui se solidifient.

cc. Electrophorèse unidimensionnelle ou SDS-PAGE. Electrophorèse unidimensionnelle ou SDS-PAGE::

C’est la séparation des protéines en fonction de leurs C’est la séparation des protéines en fonction de leurs

poids moléculaire. les poids moléculaire. les protéinesprotéines déposées dans un puit déposées dans un puit

du gel au du gel au pôle négatifpôle négatif migrent vers le migrent vers le pôle positifpôle positif

d'autant plus d'autant plus rapidement qu'elles sont petites. rapidement qu'elles sont petites.

d. Electrophorèse unidimensionnelle: Iso-d. Electrophorèse unidimensionnelle: Iso-

Electro-Focalisation:Electro-Focalisation:

C’est la séparation des protéines en fonction de leurs C’est la séparation des protéines en fonction de leurs

charge Une charge Une protéinesprotéines non dénaturéenon dénaturée par le par le SDS SDS

possède une possède une chargecharge globaleglobale qui qui varie varie suivant le suivant le pHpH. .

e. Electrophorèse bi-dimentionnelle (2D-PAGE):e. Electrophorèse bi-dimentionnelle (2D-PAGE):

C’est la séparation des protéines en fonction de C’est la séparation des protéines en fonction de

leurs poids moléculaires et leurs charge .leurs poids moléculaires et leurs charge .

Les Les protéines protéines sont sont séparées par une séparées par une

électrophorèse IEFélectrophorèse IEF puis en puis en SDS-PAGESDS-PAGE. .

b. Gel d'électrophorèse:b. Gel d'électrophorèse:

Les gels de polyacrylamide peuvent être de deux types : Les gels de polyacrylamide peuvent être de deux types :

SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate poly acrylamide gel SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate poly acrylamide gel

elecrophoresis) ou Tris-Tricine. Les gels SDS PAGE sont utilisés elecrophoresis) ou Tris-Tricine. Les gels SDS PAGE sont utilisés

pour faire migrer des protéines, les gels Tris Tricine permettent de pour faire migrer des protéines, les gels Tris Tricine permettent de

visualiser des protéines de petite taille dont le nombre d'acide visualiser des protéines de petite taille dont le nombre d'acide

aminé est inférieur à 150 : les peptides. aminé est inférieur à 150 : les peptides.

Les gels d'agarose sont quant à eux utilisés pour faire Les gels d'agarose sont quant à eux utilisés pour faire

migrer des acides nucléiques.migrer des acides nucléiques.

A. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions A. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantesdénaturantes

La technique du gel La technique du gel

d'électrophorèse en d'électrophorèse en

conditions dénaturantes : conditions dénaturantes :

(SDS-PAGE(SDS-PAGE) a été décrite ) a été décrite

par par Ulrich Laemmli en Ulrich Laemmli en

19701970

Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un

support et un peigne est enchâssé entre ces plaques. support et un peigne est enchâssé entre ces plaques.

Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant

ainsi des puits.ainsi des puits.

La taille et le nombre des dents des peignes sont variables La taille et le nombre des dents des peignes sont variables

ce qui permet de déposer des volumes allant de ce qui permet de déposer des volumes allant de 20 µL à 200µL 20 µL à 200µL

d'échantillon de protéines à séparer.d'échantillon de protéines à séparer.

Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont

placées dans une cuve d'électrophorèse.placées dans une cuve d'électrophorèse.

Le tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis Le tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis

dans la cuve et la migration s'effectue sous l'action d'un champ dans la cuve et la migration s'effectue sous l'action d'un champ

électrique : électrique :

Tampon d'électrophorèse : Tris 50 mM - Glycine 0,2 M - SDS Tampon d'électrophorèse : Tris 50 mM - Glycine 0,2 M - SDS

0,1% - pH 8,3 - 8,8 ;0,1% - pH 8,3 - 8,8 ;

Tris : nom commun du 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-Tris : nom commun du 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-

propanediol ;propanediol ;

Glycine : acide faible (forme zwitterion non chargé ou anion) ;Glycine : acide faible (forme zwitterion non chargé ou anion) ;

voltage : 100 V - 150 V. voltage : 100 V - 150 V.

Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans

les puits. les puits. 

Après migration, le gel est démoulé. Après migration, le gel est démoulé.

Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui

contient du méthanol et de l'acide acétique qui dénaturent de contient du méthanol et de l'acide acétique qui dénaturent de

manière irréversible les protéines dans les mailles du gel.manière irréversible les protéines dans les mailles du gel.

Les Les protéinesprotéines sont sont révélées révélées par une par une coloration coloration : par exemple : par exemple

avec le avec le bleu de Coomassie ou le nitrate d'argentbleu de Coomassie ou le nitrate d'argent (plus sensible). (plus sensible).

On obtient différentes bandes pour chaque

piste de la figure (la flèche indique le sens de

migration).

La masse molaire des protéines est

déterminée à l'aide de marqueurs qui sont des

protéines standards de masses molaires connues

(piste de droite).

Exemple de marqueurs :

myosine (205 kDa)

b galactosidase (116 kDa)

phosphorylase b (97,4 kDa)

albumine (66 kDa)

ovalbumine (45 kDa)

anhydrase carbonic(29 kDa)

Source: E. Jaspard (2004)

Tampon d'électrophorèse :Tampon d'électrophorèse :

TAE : Tris/Acétate 40mM - TAE : Tris/Acétate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8 EDTA 1 mM - pH 8

TBE : Tris/Borate 40mM - TBE : Tris/Borate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8EDTA 1 mM - pH 8

Tampon de charge : bleu Tampon de charge : bleu de bromophénol 0,02% - de bromophénol 0,02% - xylène cyanol 0,02% - glycérol xylène cyanol 0,02% - glycérol 3% - tampon TBE.3% - tampon TBE.

B. Gel d'électrophorèse d'ADNB. Gel d'électrophorèse d'ADN

Préparation du gelPréparation du gel

Réalisation du gel Réalisation du gel

d’agarose par dissolution à d’agarose par dissolution à

chaud de poudre d’agarose chaud de poudre d’agarose

dans un  tampon TBE à pH dans un  tampon TBE à pH

8.2 et refroidissement 8.2 et refroidissement

jusqu’à une température jusqu’à une température

voisine de 50°C.voisine de 50°C.

Préparation du moule Préparation du moule

pour couler le gel :pour couler le gel :

après avoir obturé les après avoir obturé les

deux extrémités du moule deux extrémités du moule

avec un scotch fort, placer le avec un scotch fort, placer le

moule sur une surface bien moule sur une surface bien

horizontale et disposer dans horizontale et disposer dans

les encoches prévues à cet les encoches prévues à cet

effet le peigne nécessaire à la effet le peigne nécessaire à la

réalisation des puits dans le réalisation des puits dans le

gel. gel.

Coulage du gel :Coulage du gel :

verser lentement le gel verser lentement le gel

dans la cuve sans dépasser le dans la cuve sans dépasser le

niveau supérieur des dents du niveau supérieur des dents du

peigne.peigne.

Laisser refroidir 30 mn  Laisser refroidir 30 mn 

environ avant d’enlever environ avant d’enlever

délicatement le peigne. Les délicatement le peigne. Les

puits sont alors prêts pour puits sont alors prêts pour

recevoir les dépôts d’ADN et le recevoir les dépôts d’ADN et le

scotch fermant la cuve peut-scotch fermant la cuve peut-

être enlevé.être enlevé.

Mise en place du gel dans la Mise en place du gel dans la

cuve : cuve :

les puits sont placés du côté les puits sont placés du côté

de la cathode et la cuve est de la cathode et la cuve est

remplie de tampon TBE remplie de tampon TBE

jusqu’au niveau supérieur du jusqu’au niveau supérieur du

gel.gel.

..

Préparation de l’ADNPréparation de l’ADN

Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre

certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient

pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc

thermique à 65°c avant de le refroidir brutalement.thermique à 65°c avant de le refroidir brutalement.

Dilution et densification Dilution et densification

de l’ADN par une solution de l’ADN par une solution

de charge permettant que de charge permettant que

le dépôt s’enfonce bien au le dépôt s’enfonce bien au

fond de chaque puits. Cette fond de chaque puits. Cette

solution est colorée par du solution est colorée par du

bleu de bromophénol  et bleu de bromophénol  et

elle permettra de suivre elle permettra de suivre

l’avancement de l’avancement de

l’électrophorèse.l’électrophorèse.

Dépôt de l’ADN dans Dépôt de l’ADN dans

les puits et la migration les puits et la migration

se fait dans le gel.se fait dans le gel.

la cuve est mise la cuve est mise

sous tension pendant une sous tension pendant une

heure environ. heure environ.

Quand le front de Quand le front de

migration atteint migration atteint

l’extrémité du gel, on l’extrémité du gel, on

coupe le courant.coupe le courant.

Révélation des fragmentsRévélation des fragments : :

pendant la migration, il pendant la migration, il

faut préparer la solution pour faut préparer la solution pour

révéler les fragments d’ADN : révéler les fragments d’ADN :

il s’agit d’un colorant bleu il s’agit d’un colorant bleu

dans une solution tampon dans une solution tampon

dont on ajuste le pH à pH 5.2. dont on ajuste le pH à pH 5.2.

Les 2 colorants permettent Les 2 colorants permettent

de suivre la migration des de suivre la migration des

fragments d'ADN:fragments d'ADN:

la migration du bleu de la migration du bleu de

bromophénol est "comparable" bromophénol est "comparable"

à celle d'un fragment d'ADN de à celle d'un fragment d'ADN de

300 paires de base 300 paires de base

la migration du Xylène la migration du Xylène

cyanol est "comparable" à cyanol est "comparable" à

celle d'un fragment d'ADN de celle d'un fragment d'ADN de

4000 paires de base.4000 paires de base.

Le gel, toujours Le gel, toujours

sur son support, est sur son support, est

sorti de la cuve et sorti de la cuve et

placé dans un bac. On placé dans un bac. On

le recouvre alors de la le recouvre alors de la

solution de colorant solution de colorant

pendant 10 pendant 10

mn.                       mn.                      

La dernière opération La dernière opération

consiste à décolorer le gel consiste à décolorer le gel

par passage successif dans par passage successif dans

plusieurs bains d’eau plusieurs bains d’eau

déminéralisée. Les bandes déminéralisée. Les bandes

d’ADN conservent la d’ADN conservent la

coloration bleue et sont de coloration bleue et sont de

plus en plus visibles dans les plus en plus visibles dans les

heures qui suivent. On peut heures qui suivent. On peut

alors retirer le gel de son alors retirer le gel de son

support et le conserver support et le conserver

quelques jours à l’obscurité quelques jours à l’obscurité

dans un bac rempli d’eaudans un bac rempli d’eau

Détermination de la taille Détermination de la taille

d'un fragment d'ADN:d'un fragment d'ADN:

Gel d'électrophorèse sur Gel d'électrophorèse sur

agarose sur lequel on voit : agarose sur lequel on voit :

les marqueurs (ou échelle, les marqueurs (ou échelle,

""ladderladder") de longueur (en paires ") de longueur (en paires

de base) de fragments d'ADN de base) de fragments d'ADN

un fragment d'ADN inconnuun fragment d'ADN inconnu

La droite :La droite :

log (taille) = f(distance log (taille) = f(distance

de migration) permet de de migration) permet de

déterminer la taille en déterminer la taille en

paires de base d'un paires de base d'un

fragment d'ADN inconnu fragment d'ADN inconnu

(figure de droite).(figure de droite).

Exercice:Exercice:

Analyse du gel de la figure ci-Analyse du gel de la figure ci-contre :contre :

a/ De quels type a/ De quels type d'électrophorèse s'agit-il ?d'électrophorèse s'agit-il ?

b/ Calculer la taille du fragment b/ Calculer la taille du fragment d'ADN inconnu.d'ADN inconnu.