td dosage de proteines et electrophorese - www … · dosage des protéines pendant une...
TRANSCRIPT
TD DOSAGE DE PROTEINES ET ELECTROPHORESE :
PARTIE THÉORIQUE
BST1 SVT
Daniela LENER
IBMC
Texte conseillé pour consultation : Biochimie, Voet & Voet, ed. De Boeck.
Dosage des protéines
Pendant une purification il est nécessaire de vérifier la présence de protéine avant de passer à l étapesuivante. Il est possible de vérifier la présence aussi bien que l'activité d'une protéine.
Les premières étapes se contentent généralement de vérifier la présence de protéines parspectrophotométrie.
Plus tard pendant la purification on commencera à vérifier la présence d'une protéine particulière oude son activité:
anticorps spécifiquesréaction enzymatique--->produit détectable directement ou indirectementfixation de ligands spécifiques radioactifs ou fluorescent
REGLE GENERALE : Il faut toujours garder des aliquotes de matériel à chaque étape pour retracer ledéroulement de la purification et améliorer le protocole.
La spectrophotométrie
Méthode analytique quantitative, rapide et non destructive, qui consiste à mesurer l'absorbance
ou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution. Plus cette espèce est
concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalité énoncées par la loi de
Beer-Lambert.
La densité optique des solutions est déterminée par un spectrophotomètre préalablement
étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier.
Spectrophotomètre
Le monochromateur génère, à partir d’une source de lumière visible ou ultraviolette, une lumière monochromatique, dont la
longueur d’onde est choisie par l’utilisateur.
La lumière monochromatique incidente d’intensité I0 traverse alors une cuve contenant la solution étudiée, et l’appareil mesure
l’intensité I de la lumière transmise. La valeur affichée par le spectrophotomètre est l’absorbance à la longueur d’onde étudiée.
Loi de Beer-Lambert
Lorsqu’un faisceau d’intensité I0 traverse une solution contenant une substance dissoute il est
partiellement absorbé et le faisceau émergeant possède une intensité inférieure:
I = I0 . 10 - lc
= coefficient d’extinction molaire du soluté
l = longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solution
c = concentration du soluté
L’intensité de la lumière transmise diminue de façon exponentielle en fonction de , de c et de l.
Transmittance ou transmission
T = I/I0= 10 - lc
La transmittance est définie comme pourcentage de lumière transmise.
I = I0 . 10 - lc
I/ I0 = 10 - lc si on prends le logarithme décimal
Log I/ I0 = Log T= - lc
Log I0/ I = Log 1/ T = lc on défini absorbance A le Log I0/ I = Log 1/ T
A = lc
La loi de Beer-Lambert établi, donc, une relation de proportionnalité directe entre A, la concentration du soluté àdoser (c), la longueur (l) du trajet parcouru par la lumière dans la solution et la nature du soluté ( ).
A est une valeur positive sans unité. Elle est d’autant plus grande que l’intensité transmise est faible car A = Log
1/ T.
Le coefficient d'extinction molaire , caractéristique de la substance étudiée à une longueur d'onde donnée, est
exprimé en molmol-1-1 L cm L cm-1-1 et correspond à l’absorbance à une certaine longueur d’onde d’une solution de
concentration 1M obtenue en utilisant une cuvette de trajet optique de 1 cm ( 1M1M = A / = A / l .c).
x nm
l l'épaisseur traversée est exprimé en cmcm
c la concentration est exprimé en mol.Lmol.L-1-1.
Remarques
-La loi de Beer-Lambert est additive (mais pas la transmittance) : si la solution contient différentes
substances qui absorbent dans une longueur d'onde donnée, l'absorbance totale pour cette
longueur d'onde est la somme des absorbances de chaque substance.
- La loi de Beer-Lambert a des limites. A = f(c) n'est linéaire que dans un intervalle de
concentrations réduit : les concentrations ne doivent pas dépasser 10-2 M (10 mM).
D'autres facteurs peuvent dégrader la loi de Beer-Lambert :
-Erreurs de lecture du détecteur : le domaine de mesure est idéal pour 20%<T<60%.
-Erreurs due à la lumière diffuse (un peu de lumière arrive au détecteur sans traverser la solution).
-Erreurs due à des particularités chimiques.
- Aberrations optiques (diffusions, réflexions, diffractions indésirées).
A
c
Method Range Accuracy Convenience Interference
UV Absorbance
280 nm 0.05- 2 mg/ml Fair Excel lent Detergents, nucleic acids
191-194 nm 0.01-0.05mg/ml
Fair Poor
280-260 nm Fair Excel lent
Colorimetric
Biuret 1-6 mg/ml Good Good Ammonium salts
Lowry 0.1-1.5mg/ml Good Fair strong acids, ammonium sulfate
Bicinchoninic 0.1-2 mg/ml Good Excel lent strong acids, ammonium sulfate, lip ids
Dye binding Bradford 0.05-1.4 mg/ml
Good Excel lent
Quelle méthode de dosage des protéines?
Dosage des protéines: absorption aux UV (280 nm)
Systèmes de chromatographie ---> cellule spectrophotométrique.
Le tryptophane (Trp, W) et la tyrosine (Tyr, Y) absorbent la lumière UV avec un pic à 280 nmd intensité décroissante.
Le coefficient d'extinction de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y.
H2N CH C
CH2
OH
O
HN
H2N CH C
CH2
OH
O
OH
Tryptophane Tyrosine
Formes de résonance de l’anneau benzénique.
Il est présent dans le tryptophane et la tyrosine.
Absorbance à 280 nm.
Hybride
Dosage des protéines: absorption aux UV (280 nm)
Le coefficient d'extinction molaire de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y.
Dosage de la concentration des protéines totales d un extrait: on utilise le coefficient d extinctionmassique générique pour toutes les protéines qui correspond à l absorbance à 280 nm d unesolution protéique de concentration de 1mg / mL mesuré dans une cuvette de 1 cm. Cette valeurest de 1.
1mg/mL = 1,0 280nm
Méthode de Warburg-Christian: lecture de l absorbance à 280 nm et à 260 nm (correction pourles acides nucléiques). On calcule le rapport des absorbances 280/260 et on détermine lepourcentage d acides nucléiques dans la solution en utilisant le tableau.
On calcule la concentration des protéines (mg /mL) par larelation suivante:
C = d x ( A280 nm x 1,55 - A260 nm x 0,76)
d = facteur de dilution de la solution protéiqueutilisé pour les mesures d absorbance.
Rapport A280nm /A260nm
Teneur en acides nucléiques (%)
1.75 0.0 1.52 0.5 1.36 1.0 1.25 1.5 1.16 2.0 1.03 3.0 0.94 4.0 0.82 6.0 0.75 8.0 0.67 12.0
Formes de résonance de la liaison peptidique.
Absorbance à 191-194 nm.
..
Dosage des protéines: absorption aux UV (~ 190 nm)
Tous les peptides pourraient absorber l'UV aux environs de 190-200nm, mais la plupart destampons absorbent aussi massivement dans cette région.
Cette mesure est moins dépendante de la composition en acides aminées des protéines.
NB Toutes les mesures d absorbance aux UV sont effectuées avec des cuves en quartz, car ellesont les seules à ces longueurs d onde à permettre 100% de transmission des rayons.
Dosage des protéines: par méthodes colorimétriques.
Ces techniques demandent un traitement del'échantillon à mesurer par une substancechimique qui, au contact des protéines, produiraun changement de couleur que l'on peut quantifierpar spectrophotométrie si on dispose d'unecourbe standard fiable.
Méthode du biuretTechnique pour détecter les protéines dans une solution, qui prends son nom de la substance
biuret (H2NCONHCONH2), formée quand l’urée est chauffée (elle présente une liaison de type
peptidique).
En conditions alcalines le cuivre (Cu2+) apporté sous forme de sel (sulfate de cuivre) réagit avec
les liaisons peptidiques des protéines et la solution se colore en violet avec une absorption
maximum à 550 nm. Cette coloration ne se développe pas en présence de acides aminées libres.
Méthode linéaire : couleur ---> complexe liaison peptidique et ion cuivre Cu2+ , pas dedépendance de la composition en aa.Peu sensible (1-6 mg/mL): complexe à bas coefficient d extinction.Interférence avec les sels d'ammonium.
Méthode de Lowry
En condition alcalines, dans la méthode du biuret, le cuivre (Cu2+) se réduit en oxydant les aaaromatiques. Dans la méthode de Lowry, qui est une modification de la méthode du biuret, le cuivreréduit (Cu+) est utilisé pour réduire le réactif de Folin (une solution phénolique contenant descomposés de tungstène et de molybdène) qui change sa couleur du jaune au bleu. On lit la réactionà 750 nm.
Plus sensible que le biuret, quantités de 0,1-1,5 mg/mL.
Elle est sensible à plusieurs agents, dont l'EDTA, le DTT, le -mercapto, l'Hepes, le Tris, le triton X-100, le NP-40, etc.
Dosage des protéines: par méthodes colorimétriques.
Dosage des protéines: par liaison de colorant
Méthode de Bradford
Le bleu de Coomassie se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W),l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F).
En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470nm. Lié aux protéines, il a une formeanionique bleue qui absorbe à 595nm.
Il est assez insensible aux agents des tampons, mais est sensible aux détergents.
La méthode de Bradford est encore plus sensible que celle de Lowry (5-100 μg/mL enmicroplaque).
Blue de Coomassie brilliant
Purification des protéines
Tout le long de la procédure de purification il faut déterminer des paramètres précis pour vérifier si
notre procédure est adéquate:
1) Volume de la solution
2) Concentration protéique
3) Activité enzymatique
Ces trois paramètres nous permettrons de calculer:
4) Activité spécifique
5) Activité totale
6) L’enrichissement
7) Le rendement
Unités d’activité enzymatique
Unité enzymatique ou unité internationale (UI): quantité d’enzyme permettant la formation d’une
mmole de produit par minute dans des conditions définies de pH, T°C, force ionique,
concentration saturante de substrat.
Si l’on rapporte le nombre de UI au volume de la fraction de purification, on obtient l’Activité
enzymatique (AE) exprimée en UI/ml. Ce paramètre augmente avec la purification.
Si l’on rapporte le nombre de UI à la masse de protéines contenue dans la fraction de purification, on
obtient l’Activité spécifique (AS) exprimé en UI/mg. Ce paramètre augmente avec la purification
et il est une mesure de la pureté de la fraction enzymatique.
L’Activité totale (AT) correspond au nombre de Ui contenus dans le volume total de la fraction de
purification. On l’obtient en multipliant l’AE pour le volume totale de la fraction. Elle est
exprimée en Ui. Ce paramètre diminue avec la purification.
Le Rendement R correspond à la totalité d’UI en fin de purification divisée par la totalité UI avant la
purification (en %).
L’Enrichissement (ou degré de purification, E) correspond à l’AS en fin de purification divisée par
l’AS avant la purification.
L’Activité Moléculaire (AM) correspond au nombre de UI/μmol d’enzyme.
L’Activité spécifique et l’Enrichissement atteignent une valeur maximale lorsque l'enzyme est pure.
Suivi de purification: dosage d’activité enzymatique
Pour pouvoir calculer l’activité enzymatique il faut calculer la vitesse initiale de la réaction catalysé
par l’enzymes que nous sommes en train de purifier.
Phosphatase = catalyse la déphosphorilation du substrat (par ex. L-histidinol phosphatase -
dephosphorile le L-histidinol phosphate).
Dephosphorilation du paranitrophénylphosphate (PNPP) en paranitrophénol (PNP).
415nm PNP= 18800 M-1cm-1
Vitesse initiale est la pente de la tangente à la courbe.
viA= 0,296-0,093/ 3-1= 0,102 (variation d’absorbance - A- par minute)
A = lc
A/ t = l c/ t => c / t = A / t . 1/ l => 0,102 . 1 / 18800 mol -1 L cm-1. cm
Cinétique :
Temps min
0 1 ’ 2 ’ 3 ’ 4 ’
A 0 0,093 0,191 0,296 0,401
B dil 20X 0 0,075 0,146 0,221 0,292
A/ t = l c/ t c / t = A / t . 1/ l . d d = facteur de dilution
(1 dans notre cas)
c / t = 0,102 /min . 1 / 18800 mol -1 L cm-1 cm
c / t = AE = 0,102 mol / 18800 L min
AE = 0,102 . 106 μmol / 18800 103 mL . min
AE = 0,102 . 103 μmol / 18800 mL . min
AE = 0,0054 μmol / mL . min Mais μmol / min = Ui
AE = 0,0054 Ui / mL
ELECTROPHORESE
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
Les gels de polyacrylamide sont obtenus par polymérisation de molécules linéaires d’acrylamide
pontées par la bis acrylamide.
La réaction est réalisée en présence d’un catalyseur (tétraéthylméthyldiamide - TEMED) et d’un
initiateur (persulfate d’ammonium).
Réseau de mailles dont la porosité est déterminé par la concentration de l’acrylamide et bis-
acrylamide.
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
Déplacement des protéines (et acides nucléiques) :
en fonction de la charge sous la force du champ
électrique
en fonction de l’encombrement à cause des mailles
du gel
Déplacement du cathode (-) vers l’anode (+) dans l’ordre:
de la charge nette (-) croissante
de l’encombrement décroissant
On peut effectuer des électrophorèses en conditions natives à
pH acide ou basique selon le point isoélectrique de la protéine
d'intérêt.
-
+
Cham
p é
lectr
ique
Dépôt du mélange de
protéines
__
_
__
_
_ _
__
_
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide: l’appareillage
Electrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide
Le système le plus utilisé pour l'analyse d'un mélange de protéines est le gel de SDS (ou SDS-PAGE, pour sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis).
On met 2% de SDS dans le gel d'électrophorèse, dans le tampon de migration et dans le tamponde charge.
Le SDS = détergent anionique (1charge négative par molécule) qui dénature les protéines enenveloppant la chaîne polypeptidique selon un ratio de masse de 1,4g SDS pour 1g protéine.Charge négative proportionnelle à leur longueur; même densité de charge par unité de longueur(1charge négative pour 2 aa).
On utilise aussi 0,1M -mercaptoethanol (HO-CH2-CH2-SH) dans le tampon de charge deséchantillons. Le -mercaptoéthanol brise les ponts disulfures intra et inter-protéiques.
Puisque les protéines sont uniformément chargées par le SDS, leur vitesse de migration sur gelpendant l électrophorèse, sera proportionnelle à leur seule masse.
Les protéines dans le gel sont colorées avec le bleu de Coomassie qui se lie à l'arginine (Arg, R),la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F).
Electrophorèse sur gel dénaturant à pH discontinu
Gel de concentration
(Stacking gel)
Gel de séparation
(Running gel)
Ions glycine
Ions glycine
Cl- prend de l’avance et laisse unvide ionique dans lequel lesprotéines n’avancent pas.
Les ions glycine avancentlentement: leur front de migrationporte les protéines qui vont seconcentrer en une bande fine
A l’interface entre le gel deconcentration et le gel de séparationles ions glycine deviennent plusmobile (pH 9) et le front de ionsdépasse les protéines qui sontconcentrées en une bande
Les protéines ont maintenant assezd'électrolytes de part et d’autre pourse séparer selon leur poidsmoléculaire.
Electrophorèse sur gel dénaturant à pH discontinu
Electrophorèse sur gel dénaturant à pH discontinu
Cette technique peut être utilisé pour déterminer le poids moléculaire d’une protéine car dans ces
condition la mobilité est directement proportionnelle au Log de la masse moléculaire.
On peut aussi déterminer l'oligomèrie d’une protéine en mettant en corrélation le poids moléculaire
trouvé par gel filtration (conditions natives) avec ceux des sous-unités trouvés par SDS-PAGE .
Mo
bili
téLog MM
Protéine
inconnue
Marqueur
de poids
moléculaire
Protéine
inconnue
Focalisation isoélectrique (FIE)
Le principe de base de la focalisation isoélectrique (FIE) est de créer un gradient de pH danslequel les protéines pourront se déplacer soumises à un champ électrique.
Arrivées au pH correspondant à leur pHi, les protéines s'immobiliseront puisque leur charge nettesera nulle.
De cette façon, il est possible de séparer les protéines d'une préparation selon leur pHi.
On peut créer un tel gradient de pH avec des
ampholytes.
Ampholytes = oligomères de faible masse
moléculaire (300 à 600 Da) qui portent des
groupes amino (+) et carboxyliques (-)
aliphatiques ---> éventail de pHi sous l’effet de E.
Acide phosphorique
H3PO4
triéthanoamine
Ampholytes
-CH2-N-(CH2)n-N-CH2
(CH2)n R
NR2
n = 2 ou 3
R = H ou -(CH2)n-COOH
Electrophorèse bidimensionnelle
L’électrophorèse bidimensionnelle (E2D) est la combinaison d'une focalisation isoélectrique, qui
sépare selon le pHi, suivie d'une électrophorèse dénaturante SDS, séparant selon le poids
moléculaire.
E2D = séparer un mélange selon deux paramètres complètement indépendants.
Ainsi, une FIE ou une SDS-PAGE peuvent séparer environ 60 à 100 composantes. Combinant ces
deux méthodes dans une E2D, on peut résoudre au-delà de 1000 polypeptides.
10
20
30
50
70
100
200
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8
PM
pH
Electrophorèse bidimensionnelle
Western blot
Révéler la présence d une protéine à l aide d un anticorps spécifique.
Transfert de protéines d'un gel SDS à une membrane pouvant être ensuite traitée avec unanticorps. L'anticorps reconnaît sa protéine cible.
Un deuxième anticorps, qui reconnaît le premier, est alors appliqué.
Ce second anticorps est d'ordinaire couplé à une phosphatase alcaline qui dégradera soit unsubstrat qui génère la production de photons (chemioluminescence) ou l'apparition locale d'unecoloration foncée.
Western blot
Cette technique permet de suivre la purification de protéines qui n ont pas d activité enzymatique,si un anticorps spécifique contre la protéine en question est disponible.
Cette technique est utilisé lors des premières étapes de purification, quand la protéines d'intérêt
est mélangée à beaucoup d’autres protéines.
Avec l’avancement de la purification on doit pouvoir suivre la protéines par coloration des gels par
Coomassie.