Introduction Introduction

La microbiologie est la science qui étudie les organismes La microbiologie est la science qui étudie les organismes vivants microscopiques appelés communément microbes, soit: vivants microscopiques appelés communément microbes, soit:

Certains eucaryotesCertains eucaryotes Champignons et certaines algues (végétaux). Champignons et certaines algues (végétaux). Protozoaires (êtres unicellulaires animaux). Protozoaires (êtres unicellulaires animaux).

Tous les procaryotesTous les procaryotes Cyanophycées ou algues bleues (végétaux). Cyanophycées ou algues bleues (végétaux). Bactéries. Bactéries.

Les VirusLes Virus

La microscopieLa microscopie

La La microscopiemicroscopie est un ensemble de techniques permettant est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures biologiques. d'obtenir une image des structures biologiques.

Le principe est dans tous les cas le même : une onde est Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la préparation ou émise par la préparation. envoyée sur la préparation ou émise par la préparation.

Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands groupes, différents par la nature de la particule élémentaire groupes, différents par la nature de la particule élémentaire impliquée : impliquée :

Le microscope optiqueLe microscope optique Le microscope électroniqueLe microscope électronique

1. La microscopie optique1. La microscopie optique

Le premier microscope fut sans doute fabriqué par Le premier microscope fut sans doute fabriqué par Hans et Hans et Zacharias Janssen,Zacharias Janssen, deux fabricants de lentilles néerlandais, deux fabricants de lentilles néerlandais, en 1590, mais le modèle final fut inventé par en 1590, mais le modèle final fut inventé par Antoine van Antoine van LeeuwenhœkLeeuwenhœk en 1664, puis fut amélioré par en 1664, puis fut amélioré par Christian Christian Huygens.Huygens.

La microscopie optique regroupe:La microscopie optique regroupe:

Le microscope à fond clairLe microscope à fond clair

Le microscope à fond noirLe microscope à fond noir

Le microscope à contraste de phaseLe microscope à contraste de phase

Le Microscope à fluorescenceLe Microscope à fluorescence

1-1. La microscopie à fond clair1-1. La microscopie à fond clair

Utilise des les rayons lumineux. Utilise des les rayons lumineux.

Permet le grossissement de 1500-2000 fois.Permet le grossissement de 1500-2000 fois.

Épaisseur de coupe ( 1-5 µm).Épaisseur de coupe ( 1-5 µm).

Observation vitale et colorée. Observation vitale et colorée.

Microscope à fond clairMicroscope à fond clair

Protozoaire

Bactérie

1-2. La microscopie en contraste de phase1-2. La microscopie en contraste de phase

Cette technique permet d'observer les cellules sans Cette technique permet d'observer les cellules sans préparation ni coloration dans leur milieu d'origine. préparation ni coloration dans leur milieu d'origine.

Le principe est basé sur le fait que les structures biologiques Le principe est basé sur le fait que les structures biologiques sont transparentes (n’absorbe pas la lumière transmise).sont transparentes (n’absorbe pas la lumière transmise).

Nécessite un éclairage très précis dite éclairage de Nécessite un éclairage très précis dite éclairage de KoehlerKoehler..

A l’observation, on voit une image en noir et blanc où les A l’observation, on voit une image en noir et blanc où les différentes structures apparaissent bordées de blanc d’un différentes structures apparaissent bordées de blanc d’un côté et de noir de l’autre.côté et de noir de l’autre.

Culture cellulaireCulture cellulaireLe microscope à contraste Le microscope à contraste

de phasede phase

1-3. La microscopie à fond noir 1-3. La microscopie à fond noir

Utilise les rayons lumineux dans un fond noir.Utilise les rayons lumineux dans un fond noir.

Les zones de la préparation qui diffusent la lumière Les zones de la préparation qui diffusent la lumière apparaissent lumineuses ( apparaissent lumineuses ( clairesclaires ) sur ce fond ) sur ce fond noir.noir.

Utilisé pour les éléments trop transparents.Utilisé pour les éléments trop transparents.

Les éléments observés apparaissent très brillants ( les Les éléments observés apparaissent très brillants ( les flagelles, les fibres ).flagelles, les fibres ).

N'est pas utilisé pour l'observation d'objets colorés. N'est pas utilisé pour l'observation d'objets colorés.

Bulles d'air dans l'eau

Treponema pallidum

Cryptococcus neoformans

Le microscope à fond noir Le microscope à fond noir

1-4. La Microscopie à fluorescence1-4. La Microscopie à fluorescence

Cette technique est utilisées pour Cette technique est utilisées pour certaines molécules qui émettent de certaines molécules qui émettent de la lumière quand on les éclaire avec la lumière quand on les éclaire avec une lumière de longueur d'onde une lumière de longueur d'onde supérieure. supérieure.

On éclaire l'échantillon avec une On éclaire l'échantillon avec une lumière ultraviolette, violette ou lumière ultraviolette, violette ou bleue.bleue.

Consiste à utiliser une coloration fluorescente. Deux Consiste à utiliser une coloration fluorescente. Deux colorants très utilisés sont : colorants très utilisés sont : la rhodaminela rhodamine (émet une lumière (émet une lumière rouge) et rouge) et la fluorescéinela fluorescéine (lumière verte). (lumière verte).

Le microscope à fluorescence Le microscope à fluorescence Legionella pneumophila

Culture cellulaire

2. La microscopie électronique 2. La microscopie électronique

Il existe deux variantes de la microscopie Il existe deux variantes de la microscopie électronique :électronique :

La microscopie à transmission La microscopie à transmission

La microscopie à balayage La microscopie à balayage

2-1. La microscopie électronique à transmission2-1. La microscopie électronique à transmission

Utilise comme rayonnement des Utilise comme rayonnement des électronsélectrons. .

Observation sous ultravide. Observation sous ultravide.

Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.

Les échantillons sont sous forme de lames extrêmement fines Les échantillons sont sous forme de lames extrêmement fines ( 50 nanomètre ).( 50 nanomètre ).

L'image obtenue peut être vue sur un écran.L'image obtenue peut être vue sur un écran.

L'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui L'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l'entoure, d'où le nom de coloration négative. L'échantillon l'entoure, d'où le nom de coloration négative. L'échantillon apparaît blanc sur un fond sombre. apparaît blanc sur un fond sombre.

BactériophageBactériophage Le microscope électronique Le microscope électronique

à transmissionà transmission

2-2. La Microscopie électronique à balayage 2-2. La Microscopie électronique à balayage

Utilise des électrons. Utilise des électrons.

Observation sous ultravide.Observation sous ultravide.

Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.Permet le grossissement de 75000 – 5000000 fois.

Fournis des images en 3D.Fournis des images en 3D.

Permet l’observation des coupes d’une épaisseur Permet l’observation des coupes d’une épaisseur de 300 – 600 A°. de 300 – 600 A°.

Bifidobacterium adolescentisLe microscope Le microscope électronique électronique

à balayageà balayage

DéfinitionDéfinition La La stérilisationstérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet, et de manière durable. micro-organismes d'un objet, et de manière durable.

En microbiologie, le but de la stérilisation est:En microbiologie, le but de la stérilisation est:

D'une part de maîtriser les micro-organismes introduits D'une part de maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude. dans le milieu d'étude.

D'autre part d'éviter la contamination du milieu D'autre part d'éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes.extérieur et des personnes.

Le choix d’une méthode de stérilisation est en fonction de:Le choix d’une méthode de stérilisation est en fonction de:

La nature de la substance ou l’objet à stériliser.La nature de la substance ou l’objet à stériliser.

Sa pollution présumée.Sa pollution présumée.

L’équipement disponible au laboratoire.L’équipement disponible au laboratoire.

La stérilisation peut être réalisée par:La stérilisation peut être réalisée par:

1.1. Des procédés physiques:Des procédés physiques:

Stérilisation par la chaleur Stérilisation par la chaleur

Chaleur sèche Chaleur sèche

Chaleur humide Chaleur humide

Pasteurisation Pasteurisation

Tyndallisation Tyndallisation

Stérilisation par filtration Stérilisation par filtration

Stérilisation par radiations Stérilisation par radiations

2.2. Des procédés chimiques:Des procédés chimiques:

Antiseptiques Antiseptiques

Désinfectants Désinfectants

Antibiotiques Antibiotiques

I. La chaleur I. La chaleur 1.1. Chaleur sèche Chaleur sèche

Bec BunsenBec Bunsen ((chauffage directchauffage direct): ): Crée un globe virtuel stérile de 10 cm de rayon de la Crée un globe virtuel stérile de 10 cm de rayon de la flammeflamme. . A utiliser pour les objets en verre ( pipettes, baguettes A utiliser pour les objets en verre ( pipettes, baguettes de verre...), pour certains objets en métal (anse , pince).de verre...), pour certains objets en métal (anse , pince).

Fours Pasteur, Poupinel ( Fours Pasteur, Poupinel ( stérilisateurs à air chaudstérilisateurs à air chaud ): ): C'est un four classique utilisé pour la verrerie, C'est un four classique utilisé pour la verrerie, porcelaine et instruments métalliques. porcelaine et instruments métalliques. Les spores et germes sont détruits en chaleur sèche, par Les spores et germes sont détruits en chaleur sèche, par un chauffage de : 4 heures à 140 °C ; 2 heures 30 à un chauffage de : 4 heures à 140 °C ; 2 heures 30 à 160°C ; 30 min à 180°C.160°C ; 30 min à 180°C.

Bec bunsen Four de Pasteur

2. Chaleur humide2. Chaleur humide

2-1. Autoclavage:2-1. Autoclavage: Cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans Cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans une enceinte close pour augmenter la une enceinte close pour augmenter la pressionpression et donc et donc dépasser les 100°C d‘dépasser les 100°C d‘ébullitionébullition. Ceci est réalisé à . Ceci est réalisé à 121°C pendant 15 minutes au minimum. 121°C pendant 15 minutes au minimum. A utiliser pour les milieux de culture, matériel en A utiliser pour les milieux de culture, matériel en caoutchouc, la verrerie…caoutchouc, la verrerie…

2-2. Les bain-marie ou bain- thermo statés ( 2-2. Les bain-marie ou bain- thermo statés ( ébullition ébullition ):):Un chauffage de 30 minutes à 100°C par ébullition ou Un chauffage de 30 minutes à 100°C par ébullition ou un maintien dans la vapeur d'eau bouillante suffit à un maintien dans la vapeur d'eau bouillante suffit à détruire toutes les formes végétatives. détruire toutes les formes végétatives. A utiliser pour la stérilisation des produits liquides A utiliser pour la stérilisation des produits liquides délicats : milieux albumineux, lait, gélatine, solutions délicats : milieux albumineux, lait, gélatine, solutions concentrées de glucides, ... concentrées de glucides, ...

AutoclaveAutoclave Bain marin Bain marin

2-3. Pasteurisation:2-3. Pasteurisation: Conservation des produits naturels pendant un temps Conservation des produits naturels pendant un temps limité, ne détruit que les formes végétatives mais pas limité, ne détruit que les formes végétatives mais pas les spores.les spores. Le liquide est porté rapidement à 90°C pendant 30s, Le liquide est porté rapidement à 90°C pendant 30s, par exemple,puis on le refroidit brusquement à 10°C.par exemple,puis on le refroidit brusquement à 10°C. Conservation des produits alimentaires. Conservation des produits alimentaires.

2-4. Tyndallisation:2-4. Tyndallisation: La tyndallisation est une série de chauffages brefs à des La tyndallisation est une série de chauffages brefs à des températures de 70°C à intervalles réguliers (températures de 70°C à intervalles réguliers (3 3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffageschauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffages), ), ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. de germer pour les tuer au chauffage suivant. Utilisation très limitée aux substances thermolabiles Utilisation très limitée aux substances thermolabiles non filtrables (émulsion de jaune d'oeuf, vaccins), non filtrables (émulsion de jaune d'oeuf, vaccins), préparation de milieux à base de sérum ou de jaune préparation de milieux à base de sérum ou de jaune d'oeuf.d'oeuf.

2. Stérilisation par filtration2. Stérilisation par filtration La filtration consiste à faire passer le liquide à stériliser à La filtration consiste à faire passer le liquide à stériliser à travers une paroi poreuse ou une membrane qui retient les travers une paroi poreuse ou une membrane qui retient les bactéries.bactéries. Il existe plusieurs types de filtration:Il existe plusieurs types de filtration:

Les bougies de type Chamberland:Les bougies de type Chamberland: tubes à fond tubes à fond arrondi dont les parois sont poreuses, en porcelaine. la arrondi dont les parois sont poreuses, en porcelaine. la dimension de ces pores varie de quelques µm au dimension de ces pores varie de quelques µm au 1/10ème de µm.1/10ème de µm.Disques:Disques: disques en verre fritté de porosité de 150 à 1 disques en verre fritté de porosité de 150 à 1 µm.µm.Membranes:Membranes: membranes plastiques minces comportant membranes plastiques minces comportant des millions de pores par cm2 dont la taille, très des millions de pores par cm2 dont la taille, très uniforme, varie de 8 à 0.01 µm. uniforme, varie de 8 à 0.01 µm.

Stériliser des liquides altérables par la chaleur: sérums, Stériliser des liquides altérables par la chaleur: sérums, solutions hydrolysables, solutions glucidiques, vitamines solutions hydrolysables, solutions glucidiques, vitamines

Différents filtres

3. Stérilisation par radiations3. Stérilisation par radiations

C'est la lumière C'est la lumière U.VU.V qui est la plus souvent utilisée ( lampes qui est la plus souvent utilisée ( lampes germicides ou stérilampes ).germicides ou stérilampes ).

Stérilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des locaux Stérilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des locaux ou des hottes, servant aux manipulations en atmosphère ou des hottes, servant aux manipulations en atmosphère stérile.stérile.

Utilisation en virologie, cultures cellulaires, préparation et Utilisation en virologie, cultures cellulaires, préparation et conditionnement des produits pharmaceutiques, conditionnement des produits pharmaceutiques, ensemencements bactériens, préparation de milieux. ensemencements bactériens, préparation de milieux.

Les rayons Les rayons XX ou ou yy sont utilisés pour la conservation de sont utilisés pour la conservation de certains produits alimentaires.certains produits alimentaires.

3-1. Antiseptiques:3-1. Antiseptiques: Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est instantannée. Leur action est instantannée. ex:ex: teinture d'iode, teinture d'iode, permanganate de potassium, eau oxygénée ...permanganate de potassium, eau oxygénée ...Utilisation locale chez les êtres vivants, au niveau des Utilisation locale chez les êtres vivants, au niveau des plaies et des muqueuses.plaies et des muqueuses.

3-2. Désinfectants:3-2. Désinfectants: Empêche les contaminations humaines et animales. Empêche les contaminations humaines et animales. VapeursVapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène ) ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène )LiquidesLiquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel ) ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel )SolideSolide ( chaux vive ) ( chaux vive )Utiliser pour tous les milieux extérieurs à l'Homme: eau, Utiliser pour tous les milieux extérieurs à l'Homme: eau, air, sol ( objets inanimés, désinfection du air, sol ( objets inanimés, désinfection du matériel plastique utilisé en microbiologie )matériel plastique utilisé en microbiologie )

3-3. Antibiotiques:3-3. Antibiotiques: Les antibiotiques bactériostatiques:Les antibiotiques bactériostatiques: stoppent stoppent la multiplication des bactéries sans les détruire. la multiplication des bactéries sans les détruire.Les antibiotiques bactéricides:Les antibiotiques bactéricides: qui tuent les bactéries qui tuent les bactériesUtilisation in vivo.Utilisation in vivo.

Pipette jaugées Pipette graduées Pipette pasteurPipette pasteur

Ballon

Erlenmeyer

Verre à pied

Becher

Éprouvette

Fiole

Cristalloir Cristalloir

Boire de Boire de pétri pétri

Dessiccateur Dessiccateur

FlaconFlacon

Entonnoir Entonnoir

Tube à essai Tube à essai