talen -tagaattacggggcttaa----------- … · principe de la modification du génome par les talens...

I)  Plateforme TALGENE :

Production de TALENs et premiers exemples d’utilisation

TALEN

-TAGAATTACGGGGCTTAA------------TTAAGCCCCGTAATTCTA- -ATCTTAATGCCCCGAATT------------AATTCGGGGCATTAAGAT-

FokI FokI

Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris jean‐[email protected]

TALENs : des nucléases pour modifier le génome

-  étudier la fonction de gènes (KO, KI)

-  créer des modèles de maladies -  corriger des mutations responsables de maladies

-  des applications biotechnologiques (production de protéines, de lignées cellulaires, …)

-  …

Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris

TALEN, Transcription Activator-Like Effector Nuclease

NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN NI

Répé..ons Ac.va.on

TALE1LTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHG34

Codedeliaisonàl’ADNdécouvertchezleseffecteursTALEdesbactériesdugenreXanthomonas(UBonasetal,Science,2009)

NIA HDC NNG NGT

TALE

TALEN

-TAGAATTACGGGGCTTAA------------TTAAGCCCCGTAATTCTA- -ATCTTAATGCCCCGAATT------------AATTCGGGGCATTAAGAT-

FokI FokI


Rec.Homologue

NHEJ

Principe de la modification du génome par les TALENs

TALEN TALEN

0‐100%Inac.va.ondegène(KO)

0‐10%Modifica.oncontrôlée(KI)


Modification du génome à l’aide de TALENs

‐  rat Juillet2011,NatureBiotechnol

‐  zebrafish Juillet2011,NatureBiotechnol‐  Celegans‐  riz Mai2012,NatureBiotechnol

•modifica.ondegèneparKIdansdescellulesenculture ‐dansdeslignées Février2011,NatureBiotechnol

‐dansdesESetiPS Juillet2011,NatureBiotechnol

•Inac.va.ondegènesinvivo

TALEN -TAGAATTACGGGGCTTAA------------TTAAGCCCCGTAATTCTA- -ATCTTAATGCCCCGAATT------------AATTCGGGGCATTAAGAT-

FokI FokI


TALENs vs ZFNs : séquencesciblespoten.elles

TN17‐‐x14‐19—N17A

≈partout(presque!)

(Reyonetal,NatureBiotechnol,2012)

NNCNNCNNC‐‐x5‐7—GNNGNNGNN

≈tousles1000pb

(reviewMIsalan,NatureMethods,2012)

ZFN

>TALEN


CriblagedebanquesdedoigtsdezincContextdependentAssembly(CoDA)àfaçonSigma‐Aldrich

GoldenGatecloning(Addgene)liga.onssuccesives(Addgene,TALGENE)àfaçonCellecFs,Invitrogen,plateformeTALGENE

TALENs vs ZFNs : méthodesdesynthèse

NNCNNCNNC‐‐x5‐7—GNNGNNGNNTN17‐‐x14‐19—N17A

ZFN

>TALEN


Plateforme TALGENE

ObjecBfs

‐  ConcevoirlesnucléasesTALENsenfoncBondesprojets‐  Produirelesnucléases

‐TesterleuracBvité

⇒  MeQreàdisposiBonlesplasmidescodantlesTALENsoulesprotéinesTALENspurifiées⇒  Développerlesdomainesd’applicaBondecesnouveauxouBls

DéterminaBondelaséquence

cible

AssemblagedesrépéBBons

TALE

ConstrucBonduplasmide

TALENTestsinvitroetinvivo

GèneetobjecBf

PlasmidesTALENetefficacité

Contrôleparséquençage


NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN



NI NINI NI HDNG NG NG NGNNNN NN HD NINNNN

Assemblage de TALEN par Golden Gate cloning

Etape de ligation 1

Etape de ligation 2

Etape de ligation 3

1 2 3 4 5 6 7 8

Zhang et al, Nat. Biotechnol, 2011 Cermak et, Nucleic Acids Res, 2011 Weber E et al, PLoS ONE, 2011Geissler R et al, PLoS ONE, 2011 Sanjana N et al, Nat Protoc, 2012

NI

HD

NN

NG

NI

HD

NN

NG

NI

HD

NN

NG

NI

HD

NN

NG

NI

HD

NN

NG

NI

HD

NN

NG

NI

HD

NN

NG

NI

HD

NN

NG

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

Collection de plasmides de départ






NI NINI NI HDNGNG NG NGNNNN NN HD NINNNN

NI NINI NI HDNG NG NG NGNNNN NN HD NINNNN

Assemblage de TALEN par ligations successives

Etape de ligation 1

Etape de ligation 2

Etape de ligation 3

Etape de ligation 4

Etape de ligation 5

Sanders et al, Nat. Biotechnol, 2011 Huang et al, Nat. Biotechnol, 2011

NI HD NN NG 4 plasmides de départ


Produc.on MéthodeTALEUnitassembly2.0 Banquede256modules => 140plasmidesTALEN MarineCharpenIer, Jean‐PaulConcordet,InsItutCochin,Paris

Testsd’ac.vité‐Invitro 40/44testésavecplusde20%decoupure 91%

‐encellules32/36testésavec5‐40%InserBonDéléBons89%

AnneDecian,CharloMeBoix,Jean‐BapIsteRenaud, CarineGiovannangeli,MNHN,Paris

Plateforme TALGENE


Modifygenesinlivingorganisms

Targetgene

KOmutant

DeleBonduringDSBrepairbyNHEJ

TALEN‐directedgeneinac.va.oninrat,xenopus,zebrafishandmedaka:efficiency0‐100%ExperimentsinprogressinmouseandDrosophila…

TALEN

TALENsàfaçon:lesapplica.ons


Applica.onsdesTALEs

FokI

VP16 act.

KRAB rep.

ADN methyl transferase

GFP

transposase SB

Contrôler la transcription

Induire une cassure ADN et modifier le gène cible

Suivre les mouvements de séquences spécifiques d’ADN ?

Ciblage de la transposition ?

Modifier le statut épigénétique ?

TALE

TALE

TALE

TALE

TALE

TALE

Zhang F et al, Nat Biotechnol, 2011 Cong et al, Nat Commun, 2012 Tremblay JP et al, Hum Gene Ther, 2012

Miller JC et al, Nat Biotechnol, 2011 Christian M at al, Genetics, 2010


«Genomeengineeringandtarge.ngwithar.ficialTALEs»

Phasethéorique:Bordeaux,24‐25Avril2013

UBonas,MJasin,BStoddard,KJJoung,TCathomen,ZIvics,BZhang,DCarroll,…IAnegon,PDuchateau,JPouysségur,BLopez,…

Phasepra.que:Paris,Juin2013

AssemblagedeTALENscontregènesciblesdesparFcipants,TestsfoncFonnels,ciblagedegènes

Contactpourrenseignementsetinscrip.ons:[email protected]

AtelierINSERM


PlateformeTALGENE:

ProducFondenucléasesTALENsetapplicaFons

pourlamodificaFoncontrôléedugénome

MarineCharpenBer,MarieGuilbaud,FlavieMascarell,Jean‐PaulConcordetInsItutCochin,DptGénéIqueetDéveloppement,CNRSUMR8104,InsermU1016,UniversitéParisDescartes

AnnedeCian,CharloQeBoix,Jean‐BapBsteRenaud,OlivierRené,CarineGiovannangeliMuséumNaIonald’HistoireNaturelle,CNRSUMR7196,InsermU565

jean‐[email protected]

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