SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR

Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré

Département de Chimie-Biologie, Université du Québec à Trois-Rivières.

Plan de la présentation •Maladie de Parkinson•Hypothèse de travail•Brassinostéroïdes (BRs)•Synthèse•Résultats in vitro neuroprotection

Maladie de Parkinson •25 000 personnes atteintes au Québec

(130 000 au Canada)•Mort des neurones dopaminergiques

(produisant la dopamine, un neurotransmetteur) dans la substantia nigra

W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.

Maladie de Parkinson •Aucun traitement curatif disponible

–Seulement traitement des symptômes (L-DOPA) mais après quelques années de traitement → dyskinésie

•De + en + indices semblent démontrer que le stress oxydant jouerait un rôle dans la mort des cellules nerveuses

NH2

HO

HO

Dopamine

Dopa DécarboxylaseHO

HO NH2

COOH

L-dopa

L.M. Sayre et al., Curr. Med. Chem., 2001 , 8, 721.H. Ehsan et al ,Plant J., 2005, 43(2), 251.

BRs et effet neuroprotecteur ??

• BRs et neuroprotection = nil • Étude sur la gourgane (H. Apaydin, S. Eratn, S. Ozekmekci, Movement Disorders, 15 (1), 2000)

On fait manger de la gourgane (250g, 2 X / jour) à des patients atteints du Parkinson, car gourgane riche en L-dopa. Mais la [L-dopa] n’explique pas l’effet ultrabénéfique chez les patients.• BRs présents dans la gourgane !

Gourgane

Effet neuroprotecteur ??M. Nunez, P. Mazzafera, L.M. Mazorra, W.J. Siquiera, M.A.T. Zullo, Biologia Plantarum 47(1), 67-70 (2003/4) ; L.M. Mazorra, M. Nunez, M. Hechavarria, F.Coll, M.J. Sanchez-Blanco, Biologia Plantarum 45(4), 593-6(2002).

Étude de l’effet de BRs sur les enzymes antioxydantes de riz et de tomates.

Effet neuroprotecteur ??Hypothèse de travail :

• Comme les BRs sont connus pour activer les enzymes anti-oxydantes de certaines plantes,• Que l’effet neuroprotecteur chez la gourgane (contient BRs) n’est pas seulement dû à la L-DOPA

Il est possible que les BRs aient un effet neuroprotecteur sur le système nerveux.

Brassinostéroïdes

• phytostérols• dans les plantes• comestibles du Qc (betterave, carotte, maïs, radis, …)

OH

HO

HO

OH

OH

28-homocastatérone

22 23

28

• Découverts en 1979 (brassinolide) ; extrait de Brassica napus L. (colza) (4 mg à partir de 40 kg de pollen)• phytohormones (croissance)• si on traite les plantes avec BRs, leur développement augmente• [BRs] dans les plantes : 10-6 à 10-11 %.• BRs non toxique sur les mammifères (>5g/kg pour voir un effet sur souris ; Kutzmtiskii et al. , Technical Report, 1991, Institute of Bioorganic Chem., Minsk (Belarus))

Colza

A. Bajguz & A. Tretyn ,Phytochem., 2003, 62(7) ,1027.

Brassinostéroïdes

OH

HO

HO

OH

OH

28-homocastatérone

22 23

28

2

3

24

HO cholestérol

O

HO

HO

O

O

R1R2

R1 = OH, R2 = HR1 = H, R2 = OH

O

O

O

O

OH

OH

R1

R1 = H, Me, EtR2 = H, Me

OH

OH

OH

OH

R1

R1 = H, Me

R2

R2 = H, Me

R2

70 BRs caractérisés et isolés

Brassinostéroïdes

• synthèse totale ; non• produit de départ : stigmastérol

OH

HO

HO

OH

OH

28-homocastatérone

22 23

28

H

H

H

H

13C* (11 contigus)

Synthèses

1HO

Stigmastérol(10g = 277$)

MsCl , Et3N . Toluène0°C, 1h , atm de N2

2MsO

3 OH

KHCO3

Acétone/Eau 3:1reflux 4h

4 O

Jones 8N-CrO3

Acétone0°C, 10 min

T.C.,McMorris et al, J. Chem. Soc.Perkin Trans. 1, 1996, 295 ; K. Mori et al.,Agric. Biol. Chem.,1987, 51(7),1909.

97%

77%

72%

Synthèses

O4

O

5

O

HO

HO

OH

HO

+

O

HO

HO

OH

HO

6a 6b

py-HClLiBrDMAReflux 4,5h

OsO4, K3Fe(CN)6, K2CO3,

Hydroquinidine 4-chlorobenzoate MeSO2NH2, 36j

Rdt = 41%

K.B. Sharpless et al, J. Am.Chem.Soc.,1988,1968.

68%

N

Et

N

OCH3

O

O

Cl

~ 1:1

Synthèses

O2

O

3

O

HO

HO 7py-HClLiBrDMAReflux 4,5h

OsO4

NMOAcétone/Eau 9:112h, tp 92:8 en faveur

du produit désiré

60%68%

Synthèses

O2 8

OAcOi) AcOH ,

H2SO4, H2O, reflux , 1h30

ii) DMAP, Ac2O, Pyridine, tp, 3h,

KOH 5% dans MeOH, Tp, 1h30

Dihydroxylation(OsO4)

3-acétyl-28-Homotéastérone

OHO 10

O

AcO 9

OH

OH

70%89%

Synthèses

p-NO2C6H4COOH, DEAD, P(Ph)3, THF, 0°C 15 min puis → tp 10h

NaOH, MeOH,tp , 1h , Dihydroxylation

(OsO4)

28-Épihomotéastérone

65%(2 étapes)

OHO10

O11

OO Ar

OHO12

Synthèses

H2 , 1 atm, Pd/C 10%, EtOAc, 24 h

95%

OHOO

10

13HO

BRs commerciaux

22S, 23S-28-Homobrassinolidenaturel

(pureté 96%!)non naturel

(pureté >99%)

O

HO

HO

OH

OH

O

O

HO

HO

OH

OH

O

24-épibrassinolide

24 2223

28

Neuroprotection• Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF

Cellules PC12 non-différenciées Cellules PC12 différenciées(après traitement au NGF)

L.A.Greene, A.S. Tischler, PNAS, 1976, 73(7), 2424.

Neuroprotection• Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF• La neurodégénérescence cellulaire du Parkinson reproduite avec MPP+

NMe

MPP+1-Méthyl-4-PhénylPyridinium

W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.

Neuroprotection

Dosage de la LDH par colorimétrie

• Cellules traitées avec MPP+ et nos molécules préparées• Mortalité cellulaire évaluée par dosage de la LDH libérée par les cellules abîmées

C. Korzeniewski, D.M. Callewaert, J. Immunological Methods, 1983, 64, 313.

Neuroprotection

0

10

20

30

Ctrl Épi 10-9 M MPP+ Épi 10-9 MMPP+

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l) ***

ooo

HO

HO

O

O

OH

OH

HO

HO

O

O

OH

OH

0

10

20

30

40

Ctrl Ho 10-7 M Ho 10-9 M

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l)

Control

MPP+ 5 mM

*** ******

ANOVA, Student-Newman-Keuls ***p<0,001 vs Ctrl; ooop<0,001 vs MPP+ (n=3).

Épibrassinolide

22S, 23S-Homobrassinolide

Neuroprotection

0

10

20

30

40

Ctrl 60B 10-7 M 60B 10-9 M

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l) Control

MPP+ 5 mM***

ooo* ooo

O

HO

HO

OH

HO

0

10

20

30

40

Ctrl 57B 10-7 M 57B 10-9 M

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l) Control

MPP+ 5 mM***

oooooo

O

HO

HO

homocastastérone

MB 57B

Neuroprotection

0

10

20

30

40

140 10-7 M 140 10-9 M

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l)

Control

MPP+ 5 mM

Ctrl MPP+

***

oooo

O

HO

22,23-Dédihydroxy-28-homotéastérones

0

10

20

30

40

145 10-7 M 145 10-9 M

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l)

Control

MPP+ 5 mM

Ctrl MPP+

***

oooooo

O

HO

Neuroprotection

O

HO

0

10

20

30

40

158 10-7 M 158 10-9 M

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l)

Control

MPP+ 5 mM***

*

ooo

Ctrl MPP+MB 158 ( C=C absent)

Conclusion

 

 

• Synthèse de 5 BRs ou précurseurs

•Molécules préparées (en particulier homocastatérone) → effet neuroprotecteur

• Les groupements OH en 22 et 23 ne contribue à l’activité neuroprotecteur que lorsque qu’ils sont en .

• Stéréochimie du 3-OH des précurseurs de la 28-homotéastérone n’influence pas l’effet de neuroprotection de manière significative

• Le précurseur sans C=C en 22-23 ne présente pas l’effet de protection recherché à faible concentration (10-9M).

• Une alimentation riche en betteraves, carottes, … pourrait aider à prévenir le Parkinson dû à la présence de BRs ? On ne peut pas le dire encore !

Travaux futurs 

• Poursuivre l’étude RSA (et aussi dihydroxylation !)

• Autres tests bioEffet antioxydant des BRs : SOD, catalase, glutathion

peroxidase, dihydrorhodamineEffet anti-apoptotique des BRs : Tunel, Caspase 3, Bax/Bcl2, fragmentation ADN (elisa)

• Métabolisme des BRs

Travaux futurs 

• BRs de structure “ergostane”

OMe

CHO

OMe

1. O3

2. DMS BRs

• Nouvelle méthodologie

ergostane

Z. Li et al., Tet. Lett., 2003, 44, 3991.T.G. Back et al., Can. J. Chem., 1993, 71, 156.B.H. Hazra et al., Tetrahedron, 1994, 50(8), 2523.

Travaux futurs 

• BRs de structure “ergostane” • Nouvelle méthodologie

CHO

CHO

OAc Acide de Lewisbidentate

OAc

OH

1.

S

S

Li

2. Ac2O, pyridine

3. NBS, BaCO3

M

M = SnBu3, SiMe3

2324

ou sans AL, borolane de Roush

Notre hypothèse de travail

Remerciements

 

 

Martin BoisvertFanny Longpré

Maria-Grazia MartinoliJulie Carange

Jennyfer MerckléPauline Dubromez

Questions ?

H CH3

OMn+

O

H

R

Ac

H3C

M

H CH3

OMO

H

R

Ac

H3C

R

OAc

OH

Sélection Mallyl (état de transition non-cyclique)

BOOAcR

H

H

O

O

CO2iPr

CO2iPr

Zimmerman-Traxler favorisé

Anti-Felkin

BOOAcR

H

H

O

O

CO2iPr

CO2iPr

HR

OAc

OH

B OR OAc

H

H

O

O

Zimmerman-Traxler défavorisé

Felkin (pas de syn-pentane)

E

E

(défavorisé)

(favorisé)

R

OAc

OH

Sélection Mallyl (état de transition cyclique)

Brassinostéroïdes

OH

HO

HO

OH

OH

28-homocastatérone

22 23

28

2

3

24

Squelettes des brassinostéroïdes

cholestane

Brassinostéroïdes

OH

HO

HO

OH

OH

28-homocastatérone

22 23

28

2

3

24

Squelettes des brassinostéroïdes

ergostane

Brassinostéroïdes

OH

HO

HO

OH

OH

28-homocastatérone

22 23

28

2

3

24

Squelettes des brassinostéroïdes

stigmastane

Brassinostéroïdes

H

R1 R2

HO

H

HO

Produits de départs ?

H

HO

OStigmastérol (R1=Et, R2=H) (10g = 277$)Crinostérol (R1=Me, R2=H) (pas commercial)Brassicastérol (R1=H, R2=Me) (5mg = 377$)

Ergostérol (10g = 112$)

Pregnénolone (25g = 120$)

Synthèses

Signal « large » car JHax-Hax ↑ (~ 180°)

Signal « étroit » car les J ↓ (≠ 0 ou 180°)

OHO

OHO

HO

H

H

H

H

H

H

OH

H

H

H

H

A

A

cycle A

cycle A

4

ppm

6,7 Hz de largeur

4 3ppm

22,9 Hz de largeur

Parkinson • traitement au MPP+

NMe

MPTP1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine

NMe

MPP+1-Méthyl-4-PhénylPyridinium

Passe la barrière hématoencéphalique

NMe

MPDP+MAO-B

spontanée

Parkinson • Les cellules gliales transforment le MPTP en MPP+• MPP+ entre dans les neurones dopaminergiques par le DAT• Une fois dans le neurone, MPP+ (via différents mécanismes) augmente la production de ROS (reactive oxygen species) et diminue la synthèse de l’ATP, donc perte de neurones dopaminergiques

NMe

MPTP1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine

NMe

MPP+1-Méthyl-4-PhénylPyridinium

Parkinson

Dauer et Al, Neuron, 2003, 39 ,1027-1046

Synthèses

OHO N

HOHN HO

7

11

12

Ts

pTsNHNH2, PTSAMeOH/CHCl3Reflux, 4h30 (67%)

NaBH4, EtOHReflux, 8h (62%)

Dihydroxylation ?

Pas encore testé

NeuroprotectionEffet du stigmastérol sur la toxicité du MPP+

dans les cellules PC12 neuronales.

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

Ctrl Stigma 10-7 M Stigma 10-9 M

Cy

toto

xic

ity

(%

ctr

l)

Control

MPP+ 5 mM***

ooo ooo

ANOVA, Student-Newman-Keuls ***p<0,001 vs Ctrl; ooop<0,001 vs MPP+ (n=2)

HO

Dihydroxylation

Hydroquinidine 4-chlorobenzoate

Dihydroxylation

Dihydroxylation

Conditions Rendement Particularités%

OsO4,NMO, THF 0 pas de réaction après 30 jours

OsO4,NMO, Acétone/Eau 9 :1, t= 50-60°C 0 pas de produit désiré après 48h, dégradation

OsO4, DHDQ, K3Fe(CN)6, K2CO3, CH3SO2NH2 41% 36 jours de réaction, contamination sévère, difficile à purifier

AD Mix 0 pas de réaction après 30 joursI2 , AcOAg, AcOH , H2O 0 pas de réaction après 24 h

I2 , AcOAg, AcOH , H2O, Reflux 0 pas de produit désiré après 24h, dégradation

Activité antioxydante des BRs

Activité antioxydante des BRs

Activité antioxydante des BRs

Brassica vegetables

Test LDH

Réactif

Mitsunobu

Ph

P

Ph

PhN

N

O

EtO

O

OEt

DEAD

N

N

O

EtO

O

OEt

PPh

PhPh

N

N

O

EtO

O

OEt

PPh

Ph

+ N

HN

O

EtO

O

OEt

PPh

PhPh

N

HN

O

EtO

O

OEt

PPh

PhPh

HO

+

N

HN

O

EtO

O

OEt

PPh

PhO

Ph

H

Formation d'un lien O=P!

HOOC

NO2

DEAD, p-NO2ArCOOH, PPh3

THF (anh)

O

HO

O

HO

Mitsunobu

+

PPh

Ph

Ph

ON

HN

O

EtO

O

OEt

Excellent groupe partantPasse par une SN2 d'òu l'inversion

Une des sources du produit secondaire

pO2NAr

O

O

PPh

Ph

Ph

OpO2NArCO2

OsmylationR1

R2

OsO4 L

HO

HO

R1

R2

Os

O

O

OH

OH

-LOs

O

O

O O

L

[O]O

OsO

R1

R2O

OL

Osmylation

O

OsO

R1

R2O

OL

OsO4 + R1CH=CHR2 + L

[3+2]

[2+2]

O

Os

O

R1

R2

O

O

Os

O

L

O

OL

O

R1

R2