Sur la variabilitd de la capacitd rhizoghe d'explantats racinaires de Cichorium intybus (var. Witloof) cultivds in vitro: influence de la dimension des explantats initiaux et de la

durde de conservation des racines au froid

JACQUES VASSEUR, R E N ~ LEFEBVRE ET ENOCH BACKOULA Utziversite'des sciences et techniques de Lille, Laboratoire de Physiologie ve'ge'tale, 59655 Villet~euve d 'Ascq CPdex, France

R e p le 25 mars 1985

VASSEUR, J., R. LEFEBVRE et E. BACKOULA. 1986. Sur la variabiliti de la capaciti rhizogkne d'explantats racinaires de Cichorium itziybus (var. Witloof) cultivCs in vitro: influence de la dimension des explantats initiaux et de la durCe de conservation des racines au froid. Can. J . Bot 64: 242-246.

Sur des fragments de racines de Cidzorium iniyblis de dimensions variCes, il est possible de dkmontrer l'existence d'une relation Ctroite entre le rapport volumelsurface et les capacitCs rhizogknes des explantats. C'est avec un rapport VIS = 1 que I'on observe le plus grand nombre de racines et que le pourcentage des explantats rhizogknes est le plus ClevC. Lorsque ce rapport s'kloigne de l'unitC, le nombre des racines nCo-formCes diminue. Par ailleurs, au cours du stockage B 4"C, les reserves glucidiques des racines, constitukes initialement en majeure partie de polyfructosanes, sont hydrolyskes alors que s'accumulent le saccharose, le glucose et le fructose. Parallklement, aprks 2 mois de conservation des racines au froid, la capacitk rhizogkne des explantats cultivCs it1 vitro diminue. L'adjonction de glucose aux milieux de culture permet alors d'augmenter la production des racines nCo-formCes, quelle que soit la durCe de conservation des racines au froid. Les rksultats obtenus sont discutCs. 11s permettent d'Cmettre I'hypothkse d'une rkgulation probable de la rhizogenkse par le saccharose et les glucides rkducteurs intratissulaires.

VASSEUR, J., R. LEFEBVRE, and E. BACKOULA. 1986. Sur la variabiliti de la capacitC rhizogkne d'explantats racinaires de Cichoriutn itziybus (var. Witloof) cultivCs in vitro: influence de la dimension des explantats initiaux et de la duke de conservation des racines au froid. Can. J . Bot 64: 242-246.

On Cichoriutn intybus root explants of different size, it is possible to demonstrate the existence of a relation between the volumelsurface ratio and adventitious root formation capacities. With a volumelsurface ratio equal to one, the highest number of adventitious roots and percentage of explants able to produce roots have been observed. When this ratio deviates from unity, adventitious root formation declines. Cold storage of chicory roots causes breakdown of fructosans and accumulation of sucrose, glucose, and fructose. At the same time, adventitious root formation on explants cultured in vitro decreases. Inclusion of glucose in culture media increases adventitious root production whatever the duration of chicory root cold storage may have been. Results are discussed and the hypothesis of a regulation of adventitious roots by sucrose and reducing sugars is advanced.

Introduction D e petits explantats (6 mm de diamktre x 2 m m de lon-

gueur) de racines d e Cichoriutn intybus peuvent produire B volontk soit un cal d e proliferation dkpourvu de toute manifes- tation organogkne (26), soit uniquement des bourgeons vkgkta- tifs (15, 20, 25). Les rksultats obtenus sont homogknes au sein de m h e s lots expkrimentaux et reproductibles d'une expk- rience B l'autre. Cependant, lors d'expkriences entreprises pour dkterminer les conditions nkcessaires B la formation ex- clusive d e racines nko-formees, en dehors d e tout phknomkne de bourgeonnement, nous avons not6 une certaine variabilitk des resultats obtenus (24). Cette variabilitk semblait dkpendre de la taille des explantats initiaux ainsi que d e la durke de conservation des racines au froid. C'est pour vkrifier cette hypothese que nous avons entrepris c e travail.

Materiel et methodes Matiriel et cultlire in vitro

Les racines de Cichoriutn itziybus L. (var. Witloof, cv. Zoom) sont conservCes en chambre froide B 4 + 1 "C. IminCdiatement avant leur utilisation, elles sont aseptisCes i l'aide d'une solution filtrCe d'hypo- chlorite de calcium B 140 g.L-l pendant 25 min, puis rincCes par trois bains successifs d'eau stCrile. Dans la partie moyenne de la racine et au niveau de l'assise gCnCratrice, on prClkve des cylindres de tissus au nioyen d'un emporte-pibce, cylindres qui sont ensuite dt- bites en tronGons d'Cpaisseur dCterminCe. Les explantats ainsi calibrks sont dCposCs B la surface de milieux nutritifs solidifiCs par de la gClose (0,6%) et contenant les ClCments minkraux et le Fe-EDTA de la solution de Heller (8). Les milieux de culture dont la composition a

CtC dCfinie ailleurs (24), contiennent Cgalement de l'acide naphtylack- tique ( lop6 M), de la kinCtine (lo-' M) et du glucose (1 %); le pH est ajustC B 5,s avant stCrilisation B l'autoclave pendant 20 min B 110°C. De l'acide gibbkrellique M) stCrilisC par filtration (0,45 pm) est enfin ajoutC au milieu avant sa rkpartition en tubes de culture. Aprks 1 mois de culture B 24°C et sous un Cclairement con- tinu (10 ~ . m - ~ ) foumi par des tubes luminescents (General Electric, type cool white de luxe), on dknombre les explantats organogbnes et on calcule le nombre moyen d'organes qu'ils ont produit. Chacun des essais a CtC effectuC B partir de 24 Cchantillons et rCpCtC trois fois. L'intervalle de confiance de la moyenne est CvaluC au niveau de risque de 5 % .

Analyse des glucides L'extraction des glucides est rkalisCe B partir d'Cchantillons prC-

levCs sur les racines conservCes au froid B 4°C pendant des temps variks, et qui serviront de matCriel expCrimenta1 pour la culture in vitro. PrCalablement lyophilisCs, les tissus i analyser sont rCduits en poudre avant de subir une premibre extraction B 1'Cthanol B 80% (9 mL pour 150 mg). Aprks 30 min de contact B 20°C, la suspension est centrifugke (10 000 X g; 20 min). Le sumageant ainsi que l'al- cool ayant servi au rin~age du culot de centrifugation (2 x 3 mL) sont rkunis et constituent la fraction des glucides alcoolo-solubles comprenant le glucose, le fructose, le saccharose et les oligofructo- sanes de degrC de polymCrisation (DP) 5 7 (4). Le culot est remis en suspension dans 9 mL d'eau distillCe et port6 au bain mane B 40°C pendant 30 min. Aprks centrifugation, le sumageant recueilli contient la fraction hydro-soluble constituie de polyfructosanes (DP compris entre 8 et 35 et dont l'inuline est le polymkre le plus ClevC). Aprks filtration sur papier Whatman puis sur membrane Millipore (0,45

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TABLEAU 1. Relation entre le nombre moyen de racines adventives formCes par explantat et la valeur thCorique calculCe par rapport B I'unitC de volume et de surface. Les fragments de racines de Cichorium intybus, de dimensions variCes, sont ensemencCs sur des milieux nutritifs contenant

1 % de glucose et les racines adventives nCo-formkes sont dCnombrCes aprks 30 jours de culture

Nombre moyen de racines

ThCorique Diamktre Longueur Volume Surface Rapport

(mm) (mm) (mm3) (mm2) V/S RCel Volume Surface

pm), les extraits sont analysCs en chromatographie liquide B haute pression (HPLC).

L'analyse des glucides est effectuke B l'aide d'un appareil Waters (modkle 6 000 A) CquipC d'une vanne d'injection (modkle U6K), d'une dCtecteur rCfractomCtrique (skrie R400) et d'une colonne (6,5 x 300 mm) de microgel Cchangeuse d'ions (Waters Sugars Pack 1). L'Clution s'opkre B 85°C dans une solution aqueuse d'acktate de calcium (100 mg .L-I), ?i un dCbit de 0,s mL.min-'; le mannitol est utilisC cornrne tCmoin interne. Dans ces conditions nous avons pu quantifier sCparCment (1) le glucose, le fructose et le saccharose ainsi que globalement les oligofructosanes (DP 5 7) et les polyfruc- tosanes.

Rbultats Dimensions des explantats

Le nombre moyen de racines nCo-formCes par des explantats de 6 mm de diamktre augmente jusqu'i ce que ces demiers atteignent 6 mm de longueur (tableau 1); au-deli de cette lon- gueur, le nombre moyen de racines nCo-formCes cesse d'Ctre fonction de la surface ou du volume des explantats. Par contre, mCme lorsque le diamktre des fragments vane, la formation des racines semble toujours Ctre en relation Ctroite avec le rapport volumelsurface des explantats. Dans nos conditions expirimentales, la rhizogenkse est stirnulie lorsque ce rapport tend vers 1, et diminue i mesure qu'il s'en Cloigne. La condi- tion la plus favorable est reprCsentCe par les explantats de 6 mm de diamktre et de 6 mm de longueur pour laquelle on observe le plus grand nombre de racines par unit6 de volume ou de surface.

Durke de conservation des racines Les racines de Cichorium intybus rCcoltCes aux champs,sont

stockCes immkdiatement en chambre froide i 4 1 "C. A in- tervalle de 2 mois, on prClkve des racines dont on dCtermine le contenu en glucides endogknes. On teste Cgalement en culture in vitro les capacitCs organogknes de ce matCrie1.

Les rksultats sont diffkrents selon que les explantats dispo- sent de leurs seules rCserves glucidiques endogknes ou, au contraire, bCnCficient d'un apport supplCmentaire sous forme de glucose dans le milieu de culture. Dans le premier cas (tableau 2), le nombre moyen des racines adventives nCo-formtes est plus important sur les explantats provenant de racines ayant CtC conservCes 2 mois i 4°C que sur les explan- tats issus de racines n'ayant pas subi l'action du froid. Au-deli de 2 mois de stockage au froid, les capacitCs rhizogknes dimi- nuent i mesure que la durCe de conservation augmente. Cela se

traduit i la fois par une riduction du pourcentage d'explantats producteurs et par une diminution du nombre de racines pro- duites. De plus, on observe sur les fragments provenant de racines ayant sCjoumC 4 mois ou plus i 4"C, l'apparition de quelques bourgeons adventifs. Dans le deuxikme cas, en prC- sence de 1 % de glucose dans le milieu de culture (tableau 3), l'action rhizogkne de la conservation au froid se prolonge, au contraire, au-deli du deuxikme mois. Les explantats alimentCs en glucose se rCvklent capables de produire davantage de ra- cines que leurs homologues dCpourvus de cet apport glucidique exogkne.

A l'arrachage au champ, les rCserves glucidiques du matCriel racinaire que nous avons utilisC sont compostes essentielle- ment (tableau 4) de polyfructosanes (73 %) et d'oligofructo- sanes DP < 7 (21 %). Le reste des glucides est reprksentk, par ordre dCcroissant, par le saccharose, le fructose et le glucose. Au cours de la conservation des racines, la quantitt des poly- fructosanes diminue nettement; cela reprisente, aprks 6 mois i 4"C, une baisse de 71,s % de la valeur initiale. Parallklement, on note une augmentation de tous les glucides de faible poids molCculaire, que ceux-ci soient des oligofructosanes, du sac- charose, du glucose ou du fructose. C'est d'ailleurs le glucose qui prCsente la plus grande accumulation (+ 826,3 1 %), suivi du fructose et du saccharose qui augmentent respectivement de 410% environ.

Nous avons confront6 ces demiers rksultats avec ceux de l'organogenkse (fig. 1). En l'absence de glucose dans le milieu de culture, on constate que la capacitt rhizogkne des explantats cultivCs in vitro Cvolue parallklement au rapport saccharosel (glucose + fructose) dei glucides intratissulaires des racines, au cours de leur conservation i 4°C. Par ailleurs, lorsque le glucose (1 %) est prCsent dans le milieu de culture, c'est cette fois le rapport glucoselfructose qui suit la m&me Cvolution que le nombre moyen de racines formCes par l'explantat.

Discussion et conclusion La rkgulation des phCnomknes de rhizogenkse sur les explan-

tats racinaires de ~ichorium intybus cul6vCs in vitro apparait complexe, car elle implique de nombreux facteurs, en particu- lier de l'acide naphtylacktique, de la kinktine et de l'acide gibbkrellique ainsi qu'un glucide (24). Nos rksultats semblent pouvoir Ctre replacks dans le cadre gCntral de l'hypothkse Cmise par Bouillenne (2) et qui a CtC reprise ensuite par d'autres chercheurs (7, 18, 27). Selon cette hypothkse, la formation

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TABLEAU 2. Capacitt organogtne d'explantats (6 mm de diamttre x 6 mm de longueur) prtlevts sur des racines de Cichorium infybus conservtes i 4°C pendant des temps variables. Les cultures sont effectutes surdes milieux

ne contenant pas de glucose et les organes adventifs sont dtnombrts aprts 30 jours

Capacitt organogtne

Durte de Date de conservation % d'explantats avec Nombre moyen de Nombre moyen de

prtltvement (mois) racines racineslexplantat bourgeons/explantat

TABLEAU 3. Capacitt organogtne d'explantats (6 mm de diamttre x 6 mm de longueur) prtlevts sur des racines de Cichorium infybus conservtes ti 4°C pendant des temps variables. Les cultures sont effectutes sur des milieux

contenant 1 % de glucose

Capacitt organogtne

Durte de Date de conservation % d'explantats avec Nombre moyen de Nombre moyen de

prtltvement (mois) racines racineslexplantat bourgeons/explantat

27110183 0 100 6,67+0,63 0,65 21/12/83 2 100 8,20+ 1,03 0,52

7/2/84 4 100 10,70k0,91 0,31 21/4/84 6 100 9,69+0,80 0

TABLEAU 4. ~volution (en pourcentage) des glucides intratissulaires au cours de la conservation des racines de Cichorium infybus. Les racines, stocktes en chambre froide, ont t t t prtlevtes pour analyse aprts 0, 2, 4 ou 6

mois de conservation ti 4°C

Temps de conservation ti 4°C (mois) Bilan aprts 6 mois de

Glucide 0 2 4 6 conservation

Poly fructosanes 73,38 45,26 27,72 20,92 -71,49 Oligofructosanes 21,34 43,64 54 , l l 49,82 + 133,46 Saccharose 3,56 8,77 13,05 18,36 +415,73 Glucose 0,38 0,78 3,41 3,52 +826,31 Fructose 1 ,44 1 3 5 1,71 7,38 +412,50

des racines serait sous la dtpendance d'un "complexe rhizo- caline" qui comprendrait un glucide, une auxine et un com- post non auxinique, ce demier pouvant d'ailleurs correspondre B des prtcurseurs de nature probablement phknolique (6). I1 est en outre probable que l'acide gibbtrellique dont nous avons montr6 l'efficacitt (24), puisse, dans ce contexte, jouer un r81e important. On sait, en effet, que cette hormone stimule cer- taines activitts enzymatiques, en particulier de type a-amyla- sique et 6-fructofuranosidasique (3, 10, 14).

Dans les petits explantats de racines de Cichorium intybus, la plus grande part de l'activitt mitotique like ii l'organogenkse conceme les cellules cambiales et la ptriphtrie des fragments (20). I1 est d'autre part evident que les potentialitts organo- gknes dependent du contenu en tltments nutritifs et hormo- naux intratissulaires. I1 n'est donc pas ttonnant que le nombre de racines nto-formtes puisse croitre en fonction de la surface ou du volume des explantats. Toutefois, l'existence d'un optimum de production de racines pour un certain rapport vo-

lumelsurface des fragments (VIS = 1 dans nos conditions ex- ptrimentales) ttmoigne d'un conditionnement interne qui n'est pas de nature strictement quantitative. I1 est alors probable que pour des fragments de mCme diamktre, la quantite des rtserves nutritives et hormonales (volume) et l'importance de la zone d'activitt mtristtmatique (surface) conditionnent d'abord de facon prtdominante la nto-formation des racines. Mais B me- sure que l'augmentation de la surface rtactive intensifie les tchanges avec le milieu exttrieur (absorption des tltments nutritifs, tchanges avec l'atmosphkre, oxydations . . .), ac- croit le nombre des cellules ltstes susceptibles de libtrer leur contenu cellulaire dans le milieu de culture et modifie donc les phtnomknes d'activation (13), il s'ttablirait alors des condi- tions de plus en plus prtjudiciables B la rhizogenkse. La plus grande htttrogtntitk tissulaire occasionnte par une augmenta- tion du diamktre des explantats ne modifie pas sensiblement les rtsultats. Le rapport initial volume/surface des fragments de 6 mm de diamktre ensemencts apparait donc comme un bon critkre d'apprtciation de leurs potentialitts rhizogknes.

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FIG 1. ( a ) Evolution, au cours de la conservation B 4 ° C du contenu en glucides intratissulaires des racines de Cichorium intybus. V, saccharose/(glucose + fructose); W, glucose/fructose. ( b ) CapacitC rhizogkne des explantats cultivCs in vitro sur des milieux avec glucose 1 % (0) ou sans glucose(V). Le nombre moyen de racines formCes par explantat est calculC apks 30 jours de culture.

On savait dej i que la conservation au froid des racines de chicoree entraine des modifications de leurs contenus en hor- mones (11, 12, 17, 19) et en glucides (4, 5 , 9 , 21, 22, 23), mais nous montrons maintenant que les changements en glucides intratissulaires des racines peuvent expliquer la varia- bilite des phenomknes de rhizogenkse observes en culture in vitro. En effet, au cours de la conservation 2 4°C des racines, lorsque les reserves glucidiques deviennent disponibles sous forme de composCs alcoolo-solubles de faible poids moltcu- laire (fructose: glucose et saccharose), la capacitt rhizogkne des explantats cultivCs in vitro commence par augmenter. L'adjonction de glucose dans les milieux de culture confirme le r6le jouC par les glucides simples et souligne plus particu- likrement l'efficacite de cet hexose dans les phCnomknes de rhizogenkse. Toutefois, en l'absence de glucides exogknes, c'est le saccharose qui semble jouer le r6le le plus dkterminant. Ces rksultats sug&rent donc la nCcessitC d'un Cquilibre dynamique entre les diffkrentes formes glucidiques alcoolo- solubles existant dans les explantats et c'est pourquoi nous Cmettons l'hypothkse d'une rkgulation probable des phtno- mknes de rhizogenkse par le saccharose et les glucides rCduc- teurs intratissulaires. ConformCment i des travaux anttrieurs (15, 16), nos rCsultats montrent Cgalement que les glucides

simples exogknes exercent un effet globalement dkfavorable sur la nCo-formation des bourgeons. Ces effets pourraient d'ailleurs aussi s'exercer i l'encontre de la nCo-formation des racines lorsque, par exemple, la quantitC des glucides simples intratissulaires est trop importante; la rhizogenkse, cependant, serait moins sensible i ce facteur que la caulogenkse.

Afin de pkciser davantage l'influence particulikre exercte par les glucides intratissulaires sur les phtnomknes de rhizogenkse, il sera ntcessaire de suivre leur Cvolution dans differentes conditions exptrimentales, en faisant varier, par exemple, l'apport exogkne en glucides et en hormones. De plus, l'examen des activitCs enzymatiques impliquCes dans le mCtabolisme des glucides et, en particulier, celle de l'invertase devrait nous permettre d'obtenir des renseignements complB mentaires sur le determinisme rhizogkne.

BACKOULA, E., B. FOURNET, R. LEFEBVRE, J. SOBASZKIEWICZ et J. VASSEUR 1984. Application de la chromatographie liquide B haute performance B la ditermination des glucides intratissulaires de la racine de Cichorium intybus L., au cours de la production de chicons en for~age hydroponique et de la formation de bour- geons en culture in vitro. C. R. Acad. Sci. Ser. 3, 199: 827-830. BOUILLENNE, R. 1964. Aspects physiologiques de la formation des racines. Bull. Soc. R. Bot. Belg. 95: 194-204. BROUGHTON, W. J., et A. J. MCCOMB. 1971. Changes in the pattern of enzyme development in gibberellin treated pea inter- nodes. Ann. Bot. (London), 35: 213 -228. FIALA, V. 1982. Approche biochimique de la racine de ChicorCe Witloof par 1'Ctude des variations de sa composition en glucides TEse de docteur-ingCnieur, UniversitC de Paris 6. FIALA, V., et E. JOLIVET. 1980. The aptitude of roots of Witloof Chicory for chicon production studied by their carbohydrate composition. Sci. Hortic. (Amsterdam), 13: 125 - 134. GAUTHERET, R. J. 1965. Sur l'intenction des principaux fac- teurs de la nCoformation des racines par les tissus de Topinam- bour cultivCs in vitro. C. R. Congr. Nat. Soc. Savantes, Sect. Sci. 90e, 1965. Vol. 2. pp 355-368. HAISSIG, B. E. 1982. Carbohydrate and amino acid concentra- tions during adventitious root primordium development in Pinus Banksiana Lamb. cuttings. For. Sci. 28: 813-821. HELLER, R. 1953. Recherches sur la nutrition minerale des tissus vCgCtaux cultivCs in vitro. Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. Ser. 11, 14: 1-23. JOLIVET, E., S. LEFEVRE et B. DE CONN~NCK. 1976. DCtermina- tion de 1'Ctat physiologique de la racine tubCrisCe de ChicorCe de Bruxelles (Cichorium intybus L.) par son pouvoir riducteur B I'Cgard du 2,6-dichlorophCnol-indophCnol: application au rep6 rage de la pCriode optimale de for~age. Physiol. Veg. 14: 849 - 863. JONES, R. L. 1973. Gibberellins: their physiological role. Annu. Rev. Plant Physiol. 24: 571 -598. JOSEPH, C., et P. PAULET. 1973. Variations de la teneur en cytokinines endogknes dans la racine de Cichorium intybus L., en fonction du traitement de vernalisation par le froid. C. R. Acad. Sci. Ser. D, 277: 785 -788. JOSEPH, C., J. M. SEIGNEURET, G. TOURAUD et J. BILLOT. 1983. The free gibberellins of Cichorium intybus L. root: identi- fication and changes during vernalization. Z. Pflanzenphysiol. 110: 401 -407 KAHL, G. 1973. Genetic and metabolic regulation in differentiat- ing plant storage tissue cells. Bot. Rev. 39: 274-299. LEE, T. T., et N. ROSA. 1969. Regulation of starch and sugar levels in tobacco leaves by gibberellic acid. Can. J. Bot. 47: 1595- 1598. LEFEBVRE, R. 1977. Influence de I'anaCrobiose sur le bour- geonnement des tissus de racine d'Endive (Cichorium intybus L.). Rev. Cytol. Biol. Veg.: 40: 185-291.

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