SECONDE ENSEIGNEMENT COMMUN La Terre, la vie et l’organisation du vivant

Chapitre : L’organisme pluricellulaire, un ensemble de cellules spécialisées

Notion à construire : Les cellules s’associent pour former des tissus. La matrice extracellulaire, constituée de différentes molécules, permet l’adhérence cellulaire.

Démarche: Comparer l’aspect de protoplastes (forme des cellules, absence de paroi, pas d’adhérence) avec celui du tissu végétal initial (aspect organisé, cellules jointives à parois) En déduire le rôle de la paroi pecto-cellulosique des végétaux (protection, adhérence) Comparer éventuellement avec d’autres exemples chez les végétaux (lignine du bois) et animaux (collagène de la peau, matrice osseuse, cartilagineuse)

Activités possibles et typologie: Mise en œuvre d’un protocole d’obtention de protoplastes (action mécanique ou enzymatique) Observation microscopique de protoplastes isolés et de tissus végétaux

Situation-problème: Certaines plantes comme les salades peuvent développer des pathologies provoquant le ramollissement (voire une liquéfaction) du tissu des feuilles (pourriture molle bactérienne). L’examen microscopique montre une désorganisation des tissus (séparation des cellules) Les bactéries à l’origine de cette pathologie (exemple : Pectobacterium carotovorum) produisent des enzymes qui hydrolysent la pectine (parfois la cellulose) entre des cellules végétales .

https://bsvguyane.wordpress.com/pourritures-molles-bacterienne/#jp-carousel-1888

Feuilles de salades atteintes de la « pourriture molle bactérienne »

La paroi des cellules étant constituée de pectine et de cellulose, on peut supposer qu’elle assure l’adhérence cellulaire et contribue à l’organisation tissulaire.

Biologie, tout le cours en fiches – Licence CAPES – Prepas - DUNOD

Pour le vérifier : Soumettre un tissu végétal à un traitement enzymatique qui détruit les constituants de la paroi et observer au microscope de résultat. Résultat attendu : protoplastes isolés

Activité •Isolement enzymatique de protoplastes (Technique Roger Pratt)

Voir aussi : https://planet-vie.ens.fr/article/1464/culture-protoplastes

Activité •Isolement enzymatique de protoplastes (Protocoles fournis par Emile Laguna, d’après CIRAD)

Isolement des protoplastes (d’après la méthode du CIRAD) A partir de feuilles d’agrumes Des feuilles épanouies du dernier flush (environ 1g) sont stérilisées pendant 15 minutes dans une solution à 1,8% d’hypochlorite de sodium 36°Cl puis rincée 3 fois 10 minutes dans le l’eau distillées stérile. Une fois lacérées, les feuilles sont transférées dans un flacon en verre de 100ml contenant le mélange (solution enzymatique + bH3 0,6M) en proportion 3/8. Le flacon est ensuite bouché puis placé sous agitation à 40 rpm à l’obscurité durant 15 heures à 27°C. Purification : Après digestion, les protoplastes de feuilles sont versés dans un tamis de 48µ monté sur l’orifice d’un tube de 50ml. La suspension est ensuite transférée dans un tube conique de 15ml, puis centrifugée pendant 10 minutes à 100g frein désactivé. Après élimination du surnageant les protoplastes culottés sont remis doucement en suspension à l’aide d’une pipette avec 5ml d’une solution CPW25 % saccharose. Les protoplastes peuvent ensuite être observés au microscope.

REMARQUE: La qualité et la quantité des protoplastes obtenus dépendent beaucoup de la qualité des enzymes. Très bons résultats avec la méthode du CIRAD. Solutions fournies par le laboratoire du CIRAD. Le kit Sordalab est moins performant mais beaucoup plus facile à mettre en œuvre

Activité •Isolement enzymatique de protoplastes (Protocoles fournis par Emile Laguna, d’après CIRAD)

Protoplastes « agrumes », infos CIRAD

Activité •Isolement enzymatique de protoplastes (Protocoles fournis par Emile Laguna, d’après CIRAD)

Protoplastes « agrumes », infos CIRAD

Activité •Isolement enzymatique de protoplastes (Sordalab)

Composition pour 20 binômes (100 ml de solution) : • 0,5 g d'hémicellulose • 0,1 g de pectinase. • 1 g de cellulase • 10 g de mannitol • 1,39 g de NaH2PO4. • 1,34 g de Na2HPO4 Notice technique et pédagogique disponible sur notre site.

DOCUMENT : Principe d’obtention de protoplastes par digestion enzymatique

Document et ressources complémentaires

DOCUMENT : Tissu chlorophyllien (Funaria, mousse)

Document et ressources complémentaires

https://ohioplants.org/bryophytes-variability/

DOCUMENT : Tissu chlorophyllien (Funaria, mousse)

Document et ressources complémentaires

http://jean-jacques.auclair.pagesperso-orange.fr/funaria/intro.htm

DOCUMENT : Protoplastes chlorophylliens

https://planet-vie.ens.fr/article/1400/cellule-unite-vivant

Document et ressources complémentaires

DOCUMENT : Protoplastes de chou rouge

https://planet-vie.ens.fr/article/1400/cellule-unite-vivant

Document et ressources complémentaires

DOCUMENT : Structure des fibres de collagène

Document et ressources complémentaires

Biologie, tout le cours en fiches – Licence CAPES – Prepas - DUNOD

DOCUMENT : Modèle d’organisation de la matrice du tissu conjonctif chez les eumétazoaires

Document et ressources complémentaires

Biologie, tout le cours en fiches – Licence CAPES – Prepas - DUNOD

DOCUMENT : Coupe de peau observée au microscope

Document et ressources complémentaires

http://benjamin.tello.free.fr/chapitre_manuel/protection_de_l_organisme/co/lecon1.html

DOCUMENT : Coupe de peau observée au microscope

Document et ressources complémentaires

http://campus.cerimes.fr/anatomie-pathologique/enseignement/anapath_53/site/html/iconographie.html

DOCUMENT : Coupe de peau observée au microscope

Document et ressources complémentaires

http://campus.cerimes.fr/anatomie-pathologique/enseignement/anapath_53/site/html/iconographie.html

Autres pistes: Cultiver des plants de salades (sains) et de faire des inoculations de bactéries cellulolytiques / pectinolytiques issues de cultures sur milieu nutritif pour induire l’apparition des symptômes de « feuilles molles »

Voir laboratoire de pathologie végétale de l'INRA à Montfavet

Autres pistes: Coloration in situ de la cellulose du collenchyme de celeri Mais rouge Congo cancérigène et acide sulfurique dangereux !!! Voir « Expérimentation en bio et physio végétale, Roger Pratt , p14)

Autres pistes: Coloration in situ des pectines du collenchyme de celeri (même principe avec autre colorant) Réaliser coupes à main levée , plonger quelques minutes dans solution de rouge de ruthénium, monter entre lame et lamelle et observer au microscope Voir « Expérimentation en bio et physio végétale, Roger Pratt , p14)

Autres pistes: Mettre en évidence l’importance de la paroi des cellules végétales en provoquant la turgescence puis l’éclatement de protoplastes Voir « Expérimentation en bio et physio végétale, Roger Pratt , p131)

Autres pistes: Mettre en évidence l’importance de la paroi des cellules végétales en provoquant la turgescence puis l’éclatement de protoplastes Voir « Expérimentation en bio et physio végétale, Roger Pratt , p131)

Autres pistes: Digestion enzymatique de feuilles de poireau par une pectinase qui préserve la cellulose seule la lamelle moyenne est détruite, ce qui provoque la séparation des cellules sans détruire la paroi Voir « Expérimentation en bio et physio végétale, Roger Pratt , p252)

Autres pistes: Isolement mécanique de protoplastes à partir d’oignon rouge. Technique de « dissection au hasard » qui permet d’isoler le protoplasme par microdissection. Voir « Expérimentation en bio et physio végétale, Roger Pratt , p253)

Bibliographie: Maladies des salades, Identifier, connaître et maîtriser - Hervé Lot, Brigitte Maisonneuve, Dominique Blancard, INRA Editions

Biologie, tout le cours en fiches – Licence – CAPES – Prépas – DUNOD

Experimentation en biologie et physiologie végétale – Roger Pratt – HERMANN Quae

Sitographie: Bactéries foliaires : http://ephytia.inra.fr/fr/C/5936/Salades-Bacteries-foliaires http://ephytia.inra.fr/fr/C/5391/Salades-Maladies-bacteriennes https://alchetron.com/Pectobacterium-carotovorum Culture de protoplastes (chou rouge, poireau): https://planet-vie.ens.fr/article/1464/culture-protoplastes