rôle des microorganismes symbiotiques (cas de rhizobia) dans l

Seediscussions,stats,andauthorprofilesforthispublicationat:http://www.researchgate.net/publication/256456838

Rôledesmicroorganismessymbiotiques(casderhizobia)dansl’améliorationdelaproductionagricoledePhaseolusvulgarissousstresssalin.

THESIS·JUNE2012

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1AUTHOR:

MustaphaFaghire

UniversityIbnZohr-Agadir

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http://www.researchgate.net/publication/256456838_Rle_des_microorganismes_symbiotiques_%28cas_de_rhizobia%29_dans_lamlioration_de_la_production_agricole_de_Phaseolus_vulgaris_sous_stress_salin?enrichId=rgreq-a4274887-5321-485a-a6cc-b13fa69fa33f&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI1NjQ1NjgzODtBUzoxMDAwMTI5MjMwMzE1NThAMTQwMDg1NjM0NzgyNQ%3D%3D&el=1_x_2

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http://www.researchgate.net/?enrichId=rgreq-a4274887-5321-485a-a6cc-b13fa69fa33f&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI1NjQ1NjgzODtBUzoxMDAwMTI5MjMwMzE1NThAMTQwMDg1NjM0NzgyNQ%3D%3D&el=1_x_1

http://www.researchgate.net/profile/Mustapha_Faghire?enrichId=rgreq-a4274887-5321-485a-a6cc-b13fa69fa33f&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI1NjQ1NjgzODtBUzoxMDAwMTI5MjMwMzE1NThAMTQwMDg1NjM0NzgyNQ%3D%3D&el=1_x_4


http://www.researchgate.net/institution/University_Ibn_Zohr-Agadir?enrichId=rgreq-a4274887-5321-485a-a6cc-b13fa69fa33f&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI1NjQ1NjgzODtBUzoxMDAwMTI5MjMwMzE1NThAMTQwMDg1NjM0NzgyNQ%3D%3D&el=1_x_6


THÈSE

Présentée à la Faculté des Sciences et Techniques de Marrakech

Pour obtenir le grade de :

Docteur

UFR : Biotechnologie et Bio-ingénierie de la Production Végétale

Spécialité : Agro-physiologie et Microbiologie des symbioses

Rôle des microorganismes symbiotiques (cas de rhizobia) dans

l’amélioration de la production agricole de Phaseolus vulgaris sous

stress salin.

Par :

FAGHIRE Mustapha (DESA : Bioprocédés Microbiologiques)

Soutenue le 30 Juin 2012 devant la commission d’examen :

Ahmed QADDOURY PES Faculté des Sciences et Technique Marrakech Président

Mustapha BARAKATE PES Faculté des Sciences Semlalia - Marrakech Rapporteur

Yahia RHARRABTI PH Faculté Polydisciplinaire - Taza Rapporteur

Khalid OUFDOU PES Faculté des Sciences Semlalia - Marrakech Co-directeur

Cherki GHOULAM PES Faculté des Sciences et Technique Marrakech Directeur

N° d’ordre : 05/2012

FICHE PRÉSENTATIVE DE LA THÈSE

- Nom et Prénom de l’auteur: Faghire Mustapha.

- Intitulé du travail: Rôle des microorganismes symbiotiques (cas de rhizobia) dans

l’amélioration de la production agricole de Phaseolus vulgaris sous stress salin.

- Encadrant:

Nom, Prénom et Grade: GHOULAM Cherki, Professeur ES- FST.

Laboratoire et institution: Biotechnologie Végétale et Agrophysiologie des symbioses

(BVAS), Département de Biologie, Faculté des Sciences et Techniques Guéliz,

Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc.

- Co-encadrant:

Nom, Prénom et Grade: OUFDOU Khalid, Professeur ES-FSSM.

Laboratoire et institution: Laboratoire de Biologie et de Biotechnologie des

Microorganismes (LBBM), Département de Biologie, Faculté des Sciences-Semlalia,

Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc.

- Lieux de réalisation des travaux (laboratoires, institutions,…)

Equipe de Biotechnologie Végétale et Agrophysiologie des Symbioses, Département de

Biologie, Faculté des Sciences et Techniques Guéliz, Université Cadi Ayyad, Marrakech.

Laboratoire de Biologie et de Biotechnologie des Microorganismes. Département de

Biologie, Faculté des Sciences, Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech.

Départment de physiologie des plantes, Faculté des Sciences de Granada, Espagne.

UMR Ecologie Fonctionnelle et Bio-géochimie du sol, INRA, Montpellier, France.

Institut des Ressources Naturelles et Agrobiologie, IRNASA-CSIC, Salamanca, Espagne

- Période de réalisation du travail de thèse : De 13 Décembre 2007 à 30 Juin 2012.

- Rapporteurs autres que l’encadrant (nom, prénom, grade, institution) :

Ahmed QADDOURY PES Faculté des Sciences et Technique Marrakech

Moncef BENCHEKROUN PES Faculté des Sciences et Technique - Settat

Mustapha BARAKATE PES Faculté des Sciences Semlalia - Marrakech

Yahia RHARRABTI PH Faculté Polydisciplinaire - Taza

- Cadres de coopération (ou de soutien) :

- Projet de recherche Maroco-Français, PRAD N° 06-08 coordonné par

Ghoulam C. et Drevon J.J.

- Projet conjoint de recherche Maroco-Espagnol, AECID n° A/5033/06

coordonné par Ghoulam C. et Herrera Cervera J.A.


coordonné par Ghoulam C. et Tejera García N.


coordonné par Oufdou K. et Peix A.

Ce travail a donné lieu aux résultats suivants (publications, communications,…) :

Publications :

- Faghire M, Mandri B, Oufdou K, Bargaz A, Ghoulam C, Ramírez-Bahena, MH, Velázquez E,

Peix A, 2012. Identification at species and biovar levels of strains nodulating Phaseolus vulgaris

in saline soils of the Marrakech region (Morocco) and analysis of otsA gene putatively involved

in osmotolérance. Systematic and Applied Microbiology, 35:156-164 (Cf Annexe2).

- Faghire M, Bargaz A, Farissi M, Palma F, Mandri B, Lluch C, Tejera García NA, Herrera-

Cervera JA, Oufdou K, Ghoulam C, 2011. Effect of salinity on nodulation, nitrogen fixation and

growth of common bean (Phaseolus vulgaris) inoculated with rhizobial strains isolated from the

Haouz region of Morocco. Symbiosis, 55:69-75 (Cf Annexe3).

Communications :

Mustapha Faghire, Adnane Bargaz, Btissam Mandri, Khalid Oufdou, Jean-Jacques Drevon,

Cherki Ghoulam. Genotypic variation in nodule enzymes activity for SNF among common bean

(Phaseolus vulgaris L.) genotypes grown under salinty constrainte. The first International

Congress ‘’Microbial Biotechnology for Development’’, Marrakech, Morocco. 02th-05th,

November.

Faghire M., Bargaz A, Mandri B, Oufdou K., Herrera-Cervera J.A., Lluch C, Ghoulam C.

Effect of the inoculation by the RhM15 strain on the growth of bean genotypes (Phaseolus

vulgaris) cultivates in marrakech of morroco. 13th AABNF Congress, December 15th-18th 2008

Hammamet, Tunisia.

Faghire Mustapha, Bargaz Adnane, Mandri Btissam, Oufdou Khalid, Ghoulam Cherki.

Évaluation du comportement de la symbiose haricot (Phaseolus vulgaris)- rhizobia sous stress

salin en conditions controlees. La deuxième édition du Congrès National sur l’Amélioration de la

Production Agricole (APA2). Settat, Morocco. April 03-04, 2008.

REMERCIEMENTS

Avant de présenter les résultats de ce travail, je voudrais remercier tous ceux qui, d’une

manière ou d’une autre, ont contribué à sa réalisation.

Je tiens tout d’abord à remercier le professeur GHOULAM Cherki, mon directeur de thèse,

pour sa disponibilité, son soutien et son encadrement efficace tout au long de ce travail. Je

tiens également à remercier le professeur OUFDOU Khalid, mon co-directeur de thèse, pour

son aide précieuse et pour m’avoir fait confiance dans tout ce que j’ai entrepris au cours de

ma thèse.

Je voudrais remercier les professeurs : C. Lluch, N. A. Tejera García et J. A. Herrera-Cervera

pour m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire à la Faculté de Sciences de Granada,

Espagne. Merci aussi au Dr. J.J. Drevon pour son accueil au sein de son Laboratoire à l’UMR

1222, INRA Montpellier, France.

Un grand merci au Dr. Alvaro Peix pour m’avoir si chaleureusement accueilli au sein de son

laboratoire à l’IRNA-CSIC, Salamanca, Espagne. Je tiens à le remercier également pour le

temps et l’aide précieux qu’il m’a accordés avec beaucoup d'enthousiasme.

Un grand merci aussi à tous ceux qui ont directement participé à ce travail: Abdelaziz,

Abderrahmane, Adnane, Alice, Aziz, Btissam, Carmen, Catherine, Elatiqi, Faiza, Farid,

Francisco, Fayçal, Hanane, Helene, Helene-Marta, Miguel, Jihad, Khaoula, Khadijattou,

Laurie, Lkhaldi, Majida, Mohammed, Monica, Mouna, Rachid, Raja, Saadia, Said…

J'adresse mes remerciements aux professeurs : A. Qaddoury, Chef de l’équipe BVAS-FSTG,

L. Hassani, Directeur du LBBM-FSSM et C. El Modafar, Directeur de l’UFR Biotechnologie

et Bio-ingénierie de la Production Végétale, pour la sympathie qu'ils m'ont témoignée.

Je tiens à remercier, Monsieur le Président de l’Université Cadi Ayyad, Messieurs les Doyens

de la FSTG et de la FSSM ainsi que Messieurs les Chefs des Départements de Biologie de la

FSTG et de la FSSM.

Je tiens à remercier, CNRST Maroc, Egide France, AECID Espagne et les personnels du

Consulat d’Espagne à Agadir.

Je tiens également à remercier tous les professeurs de la commité scientifique de la FSTG, les

rapporteurs et les membres de jury de ma thèse pour le temps qu’ils m’ont accordé malgré

leur charge de travail.

A tous mes ami(e)s nombreu(se)x et mes collègues pour le respect et la bonne ambiance qui

ont toujours accompagnée nos discussions.

Je tiens également à remercier mes sœurs et mes frères qui ont toujours étaient avec moi. Je

remercie mon père, ma mère et ma grand-mère qui m’ont toujours soutenu et qui ont toujours

cru en moi, tout au long de mes études. Sans vous, je ne serais certainement pas là où j’en suis

aujourd’hui.

Pour finir, merci à toi, ma chère épouse Khadijattou, pour m’avoir soutenu toutes ces années.

Merci pour le fait d’être toujours avec moi, pour me pousser, me rassurer et pour m’aider à

reprendre la confiance en moi dans les moments les plus difficiles. Pour tout cela et bien plus

encore, merci.

RESUME

L’étude de l’effet du stress salin sur la symbiose P. vulgaris-rhizobia a été réalisée à travers

des essais sous serre et complétée par l’identification moleculaire des isolats, ces isolats ont

été isolés à partir des nodules des plantes de P. vulgaris cultivées dans le périmètre du Haouz.

Les essais menés sous serre ont porté sur différents génotypes de haricot et trois souches de

rhizobia, R. tropici CIAT899 comme souche de référence et deux souches de notre collection,

RhM11 et RhM14. Les cultures des plantes ont été établies en utilisant trois systèmes; en pots

contenant de la vermiculite stérilisée ou des sols naturels ou en système hydro-aéroponique.

Ces essais ont été toujours réalisés sous deux niveaux de salinité 0 mM de NaCl (témoin) et

25 mM NaCl (stress salin). Au stade de floraison des plantes, les essais ont été évalués en se

basant sur différents paramètres agro-physiologiques. Les résultats obtenus ont montré une

variabilité au niveau des réponses des combinaisons symbiotiques testées. En effet, la salinité

a négativement affecté la croissance des plantes, la performance symbiotique de toutes les

combinaisons testées et leur activités métaboliques nodulaires telles que l’activité PEPC,

MDH, APase et TPase. Nous avons noté aussi une différence significative entre la réponse

de ces combinaisons symbiotiques au stress salin en particulier au niveau de la stimulation du

stress oxydatif nodulaire et foliaire, les activités des enzymes anti-oxydantes PO, PPO, SOD

et CAT, sont plus prononcées dans les nodules et associées à des teneurs faibles en H2O2. La

tolérance de la symbiose au stress salin semble être principalement liée, d’une part à la

tolérance de la légumineuse hôte aux conditions salines et d’autre part à son interaction avec

la souche de rhizobia. L'inoculation avec la souche locale de rhizobia RhM11, caractérisée

par une bonne nodulation et l’efficacité symbiotique élevée, a pu améliorer les activités

enzymatiques nodulaires et augmenter la croissance de la plante hôte affectée par la salinité.

D’autre part, l’association entre les isolats indigènes des sols naturels et l’inoculation avec les

souches CIAT899 et RhM11, a montré un effet positif sur l’amélioration de la tolérance de la

combinaison symbiotique à la contrainte saline. L’analyse des gènes rrs, atpD, recA, nodC et

du gène otsA, a montré que toutes les souches de notre collection de rhizobia, isolés dans la

région du Haouz, appartiennent à des espèces du genre Rhizobium, R. gallicum, R. phaseoli/R.

etli et R. tropici et que les souches RhM11 et RhM14, utilisées dans ce travail, sont

respectivement R. gallicum et R. tropici.

Mots clés: Phaseolus vulgaris ; rhizobia ; salinité ; nodosités ; croissance ; activités

enzymatiques ; identification moléculaire.

ABSTRACT

The study of the salt stress effect on the P. vulgaris-rhizobia symbiosis was performed

through the glass house trials and completed by the genetic diversity study of rhizobia strains

isolated from nodules of P. vulgaris plants grown in the Haouz region. The trials were

established using different bean genotypes and three rhizobia strains, R. Tropici CIAT899 as a

reference strain and two local strains of our rhizobial collection RhM11 and RhM14. Cultures

were conducted under salt conditions 0 mM (control) or 25 mM NaCl (salt stress) in pots

containing sterilized vermiculite or natural soil or in hydroaéroponique system. At the plant

flowering stage, trials were assessed based on different agro-physiological parameters. The

obtained results showed response variability to salt stress, either for agronomical or

physiological parameters, in the tested symbiotic combinations. Indeed, salinity negatively

effected plant growth, metabolic activity as PEPC, MDH, APase and TPase activites, and

symbiotic performance in all tested combinations with substantial variability between them

particularly for the stimulation of oxidative stress in nodules and leaves, the activities of

antioxidant enzymes PO, PPO, SOD and CAT, more pronounced in the nodules and

associated with low H2O2 concentrations. The salt tolerance in Phaseolus vulgaris –rhizobia

symbiosis seems to be mainly determined by the host legume tolerance and its interaction

with the rhizobia strain. Inoculation with the local rhizobia strain RhM11, characterized by

high nodulation and symbiotic efficiency, improved nodular enzyme activities and

compensate the salt induced loss of the host plant growth. The association between soil

indigenous strains and the inoculation with CIAT899 or RhM11 strains has a positive effect

on salt stress tolerance level. The analysis of rrs, atpD, recA, nodC, and otsA genes, showed

that all strains of our rhizobial collection, isolated at the Haouz region, clustered with several

species of the genus Rhizobium, R. gallicum, R. phaseoli / R.etli and R. tropici and RhM11

and RhM14 strains, used in this work, respectively identified as R. gallicum and R. tropici.

Keywords: Phaseolus vulgaris ; rhizobia ; salt stress ; nodules ; growth ; enzymatic activities;

genetic diversity.

ملخص

زوبيا من خالل عدة تجارب تم القيام بها داخل البيتير-حة على التعايش فاصولياتاثير الملو تمت دراسة

خل تجارب بدراسة التنوع البيوجيني لسالالت الريزوبيا المعزولة من داوتم استكمال هذه ال. الزجاجي

جارب عدة انواع من ولقد استعملت في هذه الت .العقد الجذرية لنبات الفاصوليا المزروعة في منطقة الحوز

وهي 11م و ر 11م و ر ,كساللة مرجع 988سيات : وهي زوبيايالفاصوليا وثالثة سالالت من الر

اوعية تحتوي على : انظمة ةخدام ثالثو تم انجاز هذه التجارب باست.سالالت محلية لمنطقة الحوز

0: تحت مستويين من الملوحةو ذلك ,تربة طبيعية او نظام مائي على تحتوي الفيرميوكوليت المعقم او

ة لو قد تم تقييم هذه التجارب في مرح .وهو المعرض للملوحة ميليومولير 52 ميليومولير كشاهد و

النتائج المحصل عليها اظهرت اختالفا على مستوى .االزهار وذلك باالعتماد على محددات فيزيوزراعية

لقد اثرت الملوحة سلبيا على نمو النباتات , الواقعفي .للملوحة استجابات التركيبات التكافلية المدروسة

الجذرية لهذه التركيبات مثل للعقدوعلى االداء التكافلي لكل التركيبات المدروسة وعلى النشاط االيضي

فوسفات 6روجينيز و حمض الفوسفاتيز و طرهالوز الفسفواينول كربوكسالز و ماالت الديهيدنشاط

بين استجابة هذه التركيبات التكافلية للملوحة وذلك بشكل خاص اواضح اتالفوسجلنا ايضا اخ. الفوسفاتيز

و قد كان نشاط االنزيمات ,اتواوراق النب الجذرية لعقدعلى مستوى تحفيز ميكانزم االكسدة في ا

الجذرية مرفوقا لعقدا في ااكثر وضوحالبيروكسيديز و البوليفينول بيروكسيديز و لكاتالز و سيبروكسيديز

يبدو تحمل هذا التكافل للملوحة مرتبطا بشكل اساسي من جهة لتحمل . ماء االوكسجينة من نسب منخفضب

تحت, استطاع تلقيح نبات الفاصوليا و. زوبيامن جهة اخرى لتفاعلها مع الر و للملوحةيف ضالنبات الم

كل تحسين ( ءة تكافلية عاليةالجذرية و بكفا لعقدالمميزة بوفرة ا) 11 مربالساللة المحلية ,الملوحة تاثير

السالالت بين الجمعقد بين من جهة اخرى و. يفضالنشاط االنزيمي للعقد الجدرية و نمو النبات الممن

وجود تاثير اجابي , 11 مربالساللة المحلية 988سيات الرزوبيا طبيعية و التلقيح بساللةاالصلية للتربة ال

جميع السالالت نبا دراسة تحليل الجينات تكما بين. للملوحة على تحسين تحمل التركيبات التكافلية

ريزوبيوم و ريزوبيوم كاليكم: ريزوبيومانواع من جنس ةثمنطقة الحوز تنتمي الى ثال المعزولة من

مستعملة في هذه ال, 11و رم 11رم السالالت انبو .تروبيسي ريزوبيومو ريزوبيوم اتلي -فازيولي

.ريزوبيوم تروبيسيو ريزوبيوم كاليكم تواليالدراسة هي على ال

.التحديد الجزيئي, نشاط ايضي, نمو, عقد جذرية, الملوحة, ريزوبيا, الفاصوليا: المفاتيح

ABREVIATIONS

ABA : Acide abscissique

ANA : Taux de production d’hydrogène

dans l'air

APase : Phosphatase acide

CAT: Catalase

CEl : Conductivité électrique

CE : Cortex externe

CI : Cortex interne

CIN : Cellules infectées

CM : Cortex moyen

CNI : Cellules non infectées

DEPC : Pyro-carbonate di-éthylique

E : Endoderme

EDTA : Acide éthylène diamine

tétraacétique

FRO : Formes réactives de l'oxygène

FSA : Fixation Symbiotique de l'Azote

gMF : Grame de matiére fraiche

H2O2 : Peroxydes d’hydrogène

IC : Cortex interne

INF : Zone infectée

K+ : Potassium

MDA : Dialdéhyde malonique

MDH : Malate déshydrogénase

MMLV : Moloney Murine Leukemia Virus

N : Azote

N2 : Azote atmosphérique

Na+ : Sodium

O2- : Radicales superoxides

OC : Cortex externe

OH- : Radicaux hydroxyles

P : Phosphore

PBS : Tampon salin phosphaté

PCR : Polymerase chain reaction

PEPC : Phosphoenolpyruvate carboxylase

PFA : Paraformaldéhyde

PNP : Para-nitrophénol

pNPP : Para-nitrophényl phosphate

PO: Peroxydase

PPO: Poly-phénols oxydases

PSA : Poids sec de la partie aérienne

PSN : Poids secs nodulaires

PSP : Poids sec des plantes

pSym : Plasmide symbiotique

PVP : Polivinylpirrolidone

RAPD : Random Amplification of

Polymorphic DNA

rrs : Gène codant pour l’ARN ribosomal

16S

SAB : Sérum albuminé du bovin

SAR : Taux d’absorption du sodium

SAU : Surface agricole utile

SOD: Superoxydes dismutases

TBA: Acide thiobarbiturique

TCA: Acide trichloracétique

TFA : Taux de fixation de l'azote

TNA : Activité nitrogénase totale

TPPase : Tréhalose 6-phosphate

phosphatase

TV : Trace vasculaire

ZD : Zone de distribution

LISTE DES FIGURES

Figure I. 1 : Différentes étapes de l’établissement de la symbiose rhizobia-

légumineuse. ……………………………………………………………………………. 7

Figure I. 2 : Coupe transversale d'un nodule de haricot (A) montrant la zone infectée

(ZI) entourée du cortex nodulaire. Agrandissement (B) d'une zone corticale proche

d'une trace vasculaire (TV) ……………………….………………………………….…. 8

Figure I. 3: Schéma illustrant le métabolisme général de la fixation symbiotique de N2

au niveau des nodules et les échanges de métabolites avec la partie aérienne…………. 9

Figure II.1 : Aspect des graines et nomenclature des génotypes de haricot utilisés….... 21

Figure II.2: Dispositif expérimental de la culture……………………………………… 22

Figure II.3 : Effet de la salinité sur la fixation symbiotique de l'azote. ………………... 27

Figure II.4 : Variations de la fixation symbiotique de l'azote (FSA) et la croissance

nodulaire (PSN) par rapport aux témoins sous stress salin (A) et les variations

d'efficacité des nodules (B), estimées par les quantités d'azote fixé par ces organes

pendant la période du traitement………………………………………………………… 27

Figure II.5: Effet de la salinité sur les activités enzymatiques nodulaire : A)

phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) et B) malate dehydrogenase (MDH) chez

les plantes de deux génotypes de P. vulgaris inoculées avec différentes souches de

rhizobia (CIAT899, RhM11 ou RhM14). …………...……………………………………... 30

Figure III.1: Dispositif expérimental de la culture hydroaéroponique en bacs et en

bouteilles du haricot sous serre …………………………………………………………. 35

Figure III. 2: Effet de la salinité sur les paramètres de croissance: (A) le poids sec

aérienne (PSA, g MS), (B) le poids sec racinaire (PSR, g MS), (C) le poids sec

nodulaire (PSN, g MS), chez quatre génotypes de P vulgaris inoculées avec des

différents souches de rhizobia (CIAT899 ou RhM11). ………………………………..… 39

Figure III. 3: Effet de la salinité sur les activités enzymatiques nodulaire: A; acide

phosphatase (APase, nmol min-1

.g MF-1

) and B; Trehalose 6-phosphate phosphatase

(TPPase, nmol min-1

.g MF-1

) chez quatre génotypes de P vulgaris inoculées avec

différents souches de rhizobia (CIAT899 ou RhM11) ……………………….............. 41

Figure III 4: La dépendance de l’activité APase nodulaire en fonction de l'activité

TPPase nodulaire de quatre génotypes de haricot (A&E: 83 ; B&F: 104 ; C&G: 115

et D&H: 147) inoculés avec le CIAT 899 (A, B, C et D) ou RhM11 (E, F, G et H)

cultivés sans et avec 25 mM de NaCl. ………………………………………………………. 41

Figure III. 5: Coupe transversale d'un nodule de haricot. Abréviations: (INF) zone

infectée, (E) endoderme, (VT) trace vasculaire, (IC) cortex interne, (OC) cortex

externe …………………………………………………………………………………... 42

Figure III. 6: Localisation in situ des isoformes des transcrits de la phosphatase acide

dans les nodules des combinaisons symbiotiques 115-CIAT899 et 147-CIAT899. A)

Témoins sans transcription inverse, B) Nodules des plantes non stressées C) Nodules

des plantes stressées …………………………………………………………………….. 43

Figure IV.1 : Dispositif expérimental de la culture semi-hydroponique du haricot sous

serre. (A) plantes de haricot à la première semaine après l’application de NaCl. (B)

plantes de haricot au stade floraison ……………………………………………………. 47

Figure IV. 2: Effet de la salinité sur l’accumulation de MDA (A et B) et sur le contenu

en H2O2 (C et D), foliaire (A et C) et nodulaire (B et D), chez deux génotypes de P.

vulgaris inoculées ou non avec des différents souches de rhizobia …………………….. 52

Figure IV.3: Effet de la salinité sur l’activité PO (A, B) et PPO (C, D), foliaire (A, C)

et nodulaire (B, D), chez deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec

différentes souches de rhizobia. ……………………………………..…………………..

53

Figure IV.4: Effet de la salinité sur l’activité SOD (A, B) et CAT (C, D), foliaire (A,

C) et nodulaire (B, D), chez deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec des

différents souches de rhizobia. ………………………………………………………….. 54

Figure IV.5: Effet de la salinité sur le contenu en phénols totaux foliaires (A) et

nodulaires (B), chez deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec des

différents souches de rhizobia .………………………………………………………….. 55

Figure V.1: Photos du test de nodulation sous serre des plantes inoculées avec les

souches étudiées ……………………………………………………………………….... 62

Figure V. 2 : Dendrogramme de la diversité génétique intraspécifique des populations

de rhizobia, en utilisant le coefficient de Pearson et de l'analyse UPGMA des profils

RAPD …………………………………………………..……………………………….. 65

Figure V. 3 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène rrs des

souches de rhizobia isolées dans la région du Haouz, apparentées au sein du genre

Rhizobium. La signification de chaque branche est indiquée par une valeur de bootstrap

calculée pour 1000 sous-ensembles ……………... 68

Figure V. 4 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène recA

des souches de rhizobia isolées dans la région du Haouz, apparentées au sein du genre


calculée pour 1000 sous-ensembles ……………………………………………………. 69

Figure V. 5 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène atpD



calculée pour 1000 sous-ensembles …………………………………………………….. 70

Figure V. 6 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène nodC



calculée pour 1000 sous-ensembles …………………………………………………...... 73

Figure V. 7 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène otsA des

souches de rhizobia isolées dans la région du Haouz, apparentées au sein du genre


calculée pour 1000 sous-ensembles …………………………………………………….. 76

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I. 1: Différences principales entre les nodules de type déterminé et

indéterminé ……………………………………………………………………………... 7

Tableau I. 2 : Classification des sols salinisés …………………………………………….. 12

Tableau I. 3 : Classification des eaux d’irrigation selon leurs CEl et le taux

d’absorption du sodium (SAR) ………………………………………………………………. 12

Tableau II.1 : Effet de la salinité sur la croissance, la nodulation et la fixation d'azote:

PSP, poids sec des plantes (g plante-1

); le rapport PSR /PSA, poids sec racinaire/poids

sec aérien; PSN, poids sec nodulaire (g plante-1

) et TFA, le taux de fixation de l'azote

(N2 µmol g-1

PSN h-1

) chez les plantes de deux génotypes de P. vulgaris inoculées avec

différentes souches de rhizobia (CIAT899, RhM11 ou RhM14)………………………. 25

Tableau II. 2: Effet de la salinité sur les concentrations des éléments minéraux :

sodium, potassium et phosphore dans la partie aérienne et racinaire des plantes de deux

génotypes de P. vulgaris inoculées avec différentes souches de rhizobia (CIAT899,

RhM11 ou RhM14) ……………………………………………………………………... 29

Tableau IV.1 : Effet de la salinité sur le poids sec aérien (PSA, g plante-1

), le poids

sec racinaire (PSR, g plante-1

),le poids sec nodulaire (PSN, g plante-1

) et le nombre des

nodules, chez les plantes de deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec

différents souches de rhizobia …………………………………………………….…….. 51

Tableau V. 1: Résumé des résultats obtenus dans l'analyse des souches de rhizobia …. 64

SOMMAIRE

Introduction Générale………………………………………………………………..….. 1

Chapitre I : Revue bibliographique …………………………………………………….. 3

1. Données sur la culture du haricot (P. vulgaris L.) …………………………………… 4

1.1. Description morphologique et botanique du haricot ……………………………. 4

1.2. Classes commerciales …………………………………………………………… 4

1.3. Origine et extension de la culture du haricot …………………………………… 4

1.4. Nutrition azotée chez le haricot …………………………………………………. 5

2. Les rhizobia associés au haricot ……………………………………………………… 5

2.1. Historique ……………………………………………………………………….. 5

2.2. Classification ……………………………………………………………………. 6

3. La symbiose rhizobia-légumineuse fixatrice d'azote ………………………………… 6

3.1. La nodulation …………………………………………………………………… 6

3.2. Fonctionnement des nodosités ………………………………………………….. 8

3.3. Fixation d’azote par la symbiose rhizobienne du haricot ……………………….. 10

4. Facteurs affectant la fixation biologique de l’azote atmosphérique chez le haricot …. 10

5. Généralités sur la salinité …………………………………………………………….. 11

5.1. Définition de la salinité …………………………………………………………. 11

5.2. Sols et eaux salés ………………………………………………………………... 11

5.3. Mesure de la salinité …………………………………………………………….. 12

5.4. Importance de la salinité au monde et au Maroc ………………………………... 12

6. Effets de la salinité sur la symbiose rhizobia-légumineuses …………………………. 13

6.1. Effet sur le processus d’infection et le développement des nodules……………. 13

6.2. Effet sur l’activité de la nitrogénase et la respiration nodulaire ………………… 13

6.3. Effet sur le métabolisme carboné ……………………………………………….. 14

7. Mécanismes physiologiques de tolérance au stress salin ……….……………………. 14

7.1. Ajustement osmotique …………………………………………………………... 14

7.2. Régulation de la croissance ……………………………………………………... 15

7.3. Biosynthèse d’osmoprotecteurs ………………………………………………… 15

7.4. Induction du métabolisme oxydatif ……………………………………………... 16

8. Taxonomie et phylogénie des bactéries ……………………………………………… 17

9. Conclusion …………………………………………………………………………… 19

Chapitre II : Effet de la salinité sur la nodulation, la fixation d'azote et la croissance du

haricot (P. vulgaris) inoculés avec des souches de rhizobia isolées de la région du

Haouz au Maroc ………………………………………………………………………… 20

I. Introduction ………………………………………………..…………………………. 20

II. Matériel et méthodes ………………………………………………………………… 20

1. Matériel biologique et conduite des cultures ……………………………………... 20

2. Biomasse de la partie aérienne, racinaire et nodulaire ……………………………. 22

3. Mesure de la fixation de l'azote …………………………………………………… 22

4. Dosages des activités enzymatiques de la PEPC et MDH nodulaires ……………. 22

5. Dosage du Sodium (Na+), du Potassium (K

+), du Phosphore (P) et du Azote (N).. 23

6. Analyse statistique ………………………………………………………………... 24

III. Résultats ……………………………………………………………………………. 24

1. Paramètres de croissance et de nodulation ………………………………………... 24

2. Fixation symbiotique de l'azote (FSA) ……………………………………………. 26

3. Effets du traitement salin sur les teneurs en certains éléments nutritifs …………. 28

4. Effet de NaCl sur les activités de certaines enzymes nodulaires impliquées dans

le métabolisme carboné ………………………………………………………………… 30

IV. Discussion ………………………………………..………………………………… 31

V. Conclusion ………………………………………………………………………...… 33

Chapitre III : Variation génotypique des activités enzymatiques nodulaire (APase et

TPPase) chez certains cultivars de haricot (P. vulgaris) cultivés sous la contrainte

saline. ………………………………………..………………………………………….. 34

I. Introduction ………………………………………………………………………...… 34


1. Culture de haricot en système hydroponique aéré ………………………………... 35

2. Détermination de la biomasse de la partie aérienne, racinaire et nodulaire ……… 36

3. Préparation des extraits et dosages enzymatiques ………………………………… 36

3.1. Dosage de l’activité APase ………………………………………………… 36

3.2. Dosage de l’activité TPPase ……………………………………………….. 36

4. Hybridation in situ du transcrit de l’acide phosphatase (APase) …………………. 37

4.1. Préparation des sections de nodosités ……………………………………… 37

4.2. RT- PCR in situ ……………………………………………………………. 37

5. Analyse statistique ………………………………………………………………. 38

III. Résultats ……………………………………………………………….……………. 38

1. Paramètres de croissance des plantes ……………………………………………. 38

2. Effet de NaCl sur les activités enzymatiques phosphatase acide (APase) et

tréhalose phosphate phosphatase (TPPase) …………………………………………….. 40

3. Hybridation in situ du transcrit de l’acide phosphatase (APase) 42

IV. Discussion …………………………………………………………………………... 43

V. Conclusion ………………………………………………………………………..…. 44

Chapitre IV : Effet de la contrainte saline sur le métabolisme oxydatif au niveau des

nodosités et des feuilles chez la symbiose P. vulgaris-rhizobia…..……………………. 45

I. Introduction…………………………………………………………………………… 45

II. Matériel et méthodes…………………………………………………………………. 46

1. Installation et conduite de la culture sous serre…………………………………… 46

2. Evaluation de l’essai………………………………………………………………. 47

2.1. Paramètres de croissance et de nodulation ………………………………… 47

2.2. Teneur de la partie aérienne des plantes et des nodosités en MDA ………... 47

2.3. Teneur des feuilles et nodosités en H2O2……………………………...……. 47

2.4. Dosage de l’activité PO, PPO et SOD……………………………………… 48

2.5. Dosage de l’activité CAT …………..………………………………………. 48

2.6. Teneur de la partie aérienne des plantes et nodosités en poly-phénols …….. 49

III. Résultats ……………………………………………………………………………. 49

1. Effet de NaCl sur la croissance et la nodulation des plantes …………………….. 49

2. Effet de NaCl sur les teneurs en MDA et sur les teneurs en H2O2 ….…………… 50

3. Effet de NaCl sur l’activité des PO, PPO, SOD et CAT ………………………… 52

4. Effet de NaCl sur les teneurs en phénols totaux ………………………………….. 55

IV. Discusion ………………………………………………………………………...…. 56

V. Conclusion …………………………………………………………………………... 58

Chapitre V : Identification des espèces et des symbiovars des souches de rhizobia

nodulantes P. vulgaris isolées dans la région de Marrakech et étude des gènes otsA

impliqués dans l’osmotolérance ………………………………………………………… 60

I. Introduction ………………………………………………………………………….. 60


1. Isolement des souches de rhizobia ………………………………………………... 60

1.1. Milieu d'isolement ou de culture …………………………………………… 60

1.2 Technique d’isolement ……………………………………………………… 61

1.3. Conservation des souches ………………………………………………….. 61

2. Test du nodulation ………………………………………………………………… 61

2.1. Stérilisation et germination des graines ……………………………………. 61

2.3. Préparation de l’inoculum et inoculation …………………………………... 61

2.2. Mise en place du test de nodulation ………………………………..……… 61

3. La PCR-RAPD …………………………………………………………………… 62

4. Analyse des séquences des gènes rrs, recA, atpD, nodC et otsA ………………… 62

5. Tolérance à la salinité ……………………………………………………………... 63

III. Résultats et discussion ……………………………………………………………… 63

1. Isolement de souches et le RAPD ………………………………………………… 63

2. Identification à l’échelle de l’espèce ……………………………………………… 64

3. Identification au niveau de symbiovar ……………………………………………. 71

4. Tolérance à la salinité et l'analyse des gènes otsA ………………………………... 72

Conclusion générale et perspectives...…………………………………………………... 78

Références bibliographiques ……………………………………………………………. 80

Annexes ..…………………………..…………………………………………………… 94

Introduction Générale

1

INTRODUCTION GÉNÉRALE

La fixation biologique de l’azote constitue l’un des processus majeurs de transformation

de l'azote gazeux en une forme assimilable par les plantes (Kaminski, 1991). C’est une voie

importante d'entrée de l'azote dans le cycle biogéochimique (Graham et Vance, 2003).

Différents microorganismes sont capables de fixer l'azote atmosphérique tels que les

microorganismes libres (espèces d'Azospirillum, Azotobacter) et des endophytes fixateurs

associés par exemple à la canne à sucre et au blé. D'autres microorganismes fixent l'azote

atmosphérique en symbiose avec un végétal supérieur comme la symbiose légumineuse-

rhizobia, qui représente la majeure partie des symbioses fixatrices d'azote (Eardly et al., 1995

; Zahran, 1999 ; Moushine et al., 2007).

Dans le bassin méditerranéen, la symbiose légumineuse-rhizobia est une composante

importante de cet agrosystème vu ses intérêts agronomiques, économiques et écologiques

(FAO, 2009). En effet, cette symbiose pourrait, lorsqu’elle fonctionne bien, assurer une

nutrition azotée adéquate aux plantes et garantir une production convenable permettant ainsi

aux agriculteurs d’épargner le coût des fertilisants chimiques et soulager l’environnement de

leur pollution (Faghire et al., 2011). Cependant, ce processus naturel est affecté par plusieurs

contraintes abiotiques qui réduisent son efficacité telles que les variations de température, la

déficience des sols en éléments minéraux, l’acidité des sols, la toxicité due à certains éléments

tels que le manganèse et l’aluminium, le stress hydrique et la salinité (Dita et al., 2006;

Borucki et Sujkowska, 2008 ; Cesar et al., 2011).

Dans les zones arides et semi-arides, la contrainte saline reste l’un des facteurs

majeurs limitant la production des légumineuses particulièrement lorsque la nutrition azotée

est assurée par la FSN. Dans ce contexte, de nombreuses études agrophysiologiques ont mis

en évidence l’effet de la contrainte saline sur la croissance des légumineuses dépendantes de

la FSN (CIAT, 1992 ; Jansa et al., 2011).

Le haricot (Phaseolus vulgaris) est une plante sensible au stress salin et sa symbiose

rhizobienne est caractérisée par une faible efficacité de fixation d’azote (Dita et al., 2006). Au

Maroc, le cycle de cette culture coïncide avec les périodes de l’année les plus chaudes ce qui

accentue l’effet du stress salin sur la symbiose haricot-rhizobia surtout dans la moitié sud du

pays comme le Haouz (Debbarh et Badraoui, 2002). Malgré l’importance de cette contrainte,

Introduction Générale

2

peu d’études ont été entreprises pour évaluer et caractériser l’impact de la salinité sur cette

symbiose.

C’est dans ce cadre que s’insère notre présente étude qui s’est fixée comme principaux

objectifs :

i) évaluer l’impact de la salinité sur la symbiose rhizobia-haricot à travers des essais

en conditions contrôlées sous serre;

ii) mettre l’accent sur certains mécanismes physiologiques et moléculaires associés à

la tolérance de cette symbiose au stress salin.

iii) étudier la biodiversité d’une collection de souches de rhizobia isolées de la région

du Haouz au Maroc.

Le présent mémoire comporte cinq chapitres qui sont indiqués ci-dessous:

Chapitre I : Revue bibliographique rapportant l’importance de la symbiose P. vulgaris-

rhizobia et l’effet de la contrainte saline sur la croissance et le développement des

légumineuses en général et de la symbiose P. vulgaris-rhizobia en particulier.

Chapitre II : Effet de la salinité sur la nodulation, la fixation d'azote et la croissance du

haricot (P. vulgaris) inoculés avec des souches de rhizobia isolées de la région du Haouz au

Maroc.

Chapitre III : Variation génotypique des activités enzymatiques nodulaires (APase et

TPPase) chez certains cultivars de haricot (P. vulgaris) cultivés sous la contrainte saline.

Chapitre IV : Effet de la contrainte saline sur le métabolisme oxydatif au niveau des

nodosités chez la symbiose P. vulgaris-rhizobia.

Chapitre V : Identification des espèces et des symbiovars des souches de rhizobia nodulantes

P. vulgaris isolées dans la région de Marrakech et étude des gènes otsA impliqués dans

l'accumulation du tréhalose.

Chapitre I

3

Chapitre I

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

Les légumineuses sont cultivées principalement comme source de protéines pour la

consommation humaine (haricot, pois, fève,…) ou l’alimentation animale (soja, luzerne,

féverole…). Elles constituent aussi une source importante d’huiles végétales (arachide) et de

bois de qualité (bois de rose, ébène).

Les légumineuses à graines restent toujours une part importante de l’alimentation

particulièrement dans les pays en développement où elles sont la principale source de

protéines pour l’homme (Broughton, 2003 ; Kangfu, 2011). Citons le haricot (P. vulgaris) en

Amérique Latine, le Pois chiche (Cicer arietinum), la lentille (Lens culinaris) et la fève (Vicia

faba) dans le bassin méditerranéen, le soja (Glycine max) en Asie sans oublier l’arachide

(Arachis hypogea) et le pois (Pisum sativum) dans le monde entier (FAO, 2009). Au Maroc,

la culture des légumineuses alimentaires est surtout localisée dans les régions à pluviométrie

favorable. Elles couvrent 4,8% de la surface agricole utile (SAU) estimée à 8,7 millions

d’hectares soit 13% de la superficie totale du pays (FAO, 2009). Les légumineuses

alimentaires cultivées au Maroc sont diverses (fève, pois-chiche, lentilles, petits pois, haricot

…) et présentent des variations en terme de superficie occupée et de rendement moyen qui, en

2009 avaient été respectivement de l’ordre de 402700 hectares (Ha) et 5,614 Q/Ha (FAO,

2009). A l’image de la production mondiale des légumineuses sèches la FAO (2009) a

estimée qu’environ 64 millions de tonnes (18041 tonnes au Maroc), dont le haricot sec ne

présente que 1,1 millions de tonnes (836 tonnes au Maroc) tout en notant que la production la

plus élevée a été enregistrée en Inde (180000 tonnes). Mais ces statistiques sont probablement

incomplètes étant donnée l’importance de la culture vivrière de cette plante, consommée

localement dans de nombreux pays en développement.

1. Données sur la culture du haricot (P. vulgaris L.)

Le genre Phaseolus se classe dans la sous-tribu des Phaseolinae, tribu des Phaseoleae,

famille des Fabaceae et ordre des Fabales. Au sein des Phaseolinae (à stylet barbu sous le

stigmate), les deux genres Phaseolus et Vigna sont les plus importants et contiennent à eux

seuls le plus grand nombre d’espèces cultivées comme légumineuses vivrières. La section

Phaseolus du genre Phaseolus est la plus importante et regroupe notamment les cinq espèces

cultivées : P. acutifolius A. Gray., P. coccineus L., P. lunatus L., P. polyanthus Greenm. et P.

vulgaris L. (Maréchal et al., 1978 ; Freytag et Debouck, 2002 ; Gepts et al., 2008).

Chapitre I

4

1.1. Description morphologique et botanique du haricot

Le haricot est une plante herbacée annuelle à croissance déterminée ou indéterminée. A la

germination, la plante est généralement à racine pivotante mais qui forme après des racines

secondaires longues de 10 à 15 cm se développant sur toute la racine principale (Ndèye,

2002). A l’issue de la germination épigée, deux feuilles opposées simples puis des feuilles

trifoliées à folioles cordiformes se forment sur une tige angulaire. Les fleurs sont portées en

grappes axillaires et terminales. Elles sont zygomorphes composées de deux pétales en

carène, deux pétales latéraux ailés et un pétale standard disposé extérieurement (Ndèye,

2002). La couleur de la fleur est généralement indépendante de celle des graines, mais

l'association entre fleurs particulières et couleur des graines est connue. Ces fleurs peuvent

être blanches, roses ou violettes (souvent rouges chez P. coccineu). La fleur contient dix

étamines et un sac ovarien multiple. Dans la plupart des cas, la fleur réalise une

autofécondation et développe un fruit ou gousse droite ou légèrement courbée. Les graines

sont riches en protéines (22 %) et en glucides (56 % des graines) (Bewley et Black, 1994 ;

Broughton, 2003). Elles sont rondes, ellipticales légèrement aplaties ou arrondies (Ndèye,

2002).

1.2. Classes commerciales

Chez le haricot, on distingue deux classes commerciales majeures, les haricots verts et les

haricots secs. Les cultivars de haricot vert possèdent un mésocarpe épais et succulent avec peu

ou pas de fibres dans le péricarpe des gousses vertes (Myers, 2000). Ces cultivars sont

souvent classés sur la base de la forme, la couleur et la taille des gousses et présentent une

large variabilité liée à leurs caractères d’adaptation.

De même, une variabilité importante des caractères phénotypiques, du calibre, de la forme

et de la couleur des graines a été observée chez les cultivars du haricot sec (Singh, 1992). La

majeure partie de la production et de la consommation du haricot, à l’échelle mondiale, est

représentée par les haricots secs (FAO, 2009).

1.3. Origine et extension de la culture du haricot

Le haricot est originaire d'Amérique Latine et Centrale où il a été domestiqué depuis plus

de 8000 ans (Gepts et Debouck, 1991 ; Chacon et al., 2005). La distribution géographique du

haricot dans des zones très diversifiées, tant de point de vue climatique que de point de vue

pédologique, en ont fait une culture adéquate pour des systèmes agro-culturaux très variés. On

le trouve dans les assolements de systèmes vivriers, extensifs ou non, des zones d'agriculture

marginales ou cultivé en association avec d'autres cultures (maïs…) ou encore en rotation

Chapitre I

5

avec d'autres cultures non légumineuses (maïs, patate douce...) (Woolley et Davis, 1991 ;

Belay et al., 2009).

1.4. Nutrition azotée chez le haricot

Comme pour la plupart des légumineuses, la nutrition azotée du haricot est assurée soit

par assimilation des nitrates du sol (par la nitrate réductase de la plante) soit par fixation

biologique d'azote atmosphérique (par la nitrogénase de la bactérie). Ces deux processus sont

complémentaires au cours du cycle de croissance de la plante. La nitrate réductase intervient

essentiellement avant la floraison et la nitrogénase prend la relève soit deux semaines après le

semis (Franco et al., 1979) et se poursuit jusqu'au début de la formation des gousses. Une

deuxième période d'activité maximale de la nitrate réductase peut apparaître après la

formation des gousses et les deux processus peuvent être concurrents lors d'un apport d'azote

nitrique, qui augmente l'activité de la nitrate réductase tout en diminuant l'activité de la

nitrogénase (Félix et al., 1981). L'activité nitrogénasique suit une courbe de croissance

exponentielle avec une activité maximale pendant la période de floraison et diminue pendant

le remplissage des gousses. Thibodeau et Jaworski (1975), puis Obaton et al., (1982) ont

montré qu'au champ c'est essentiellement l'assimilation du nitrate qui prédomine au début du

cycle tandis que la fixation d'azote intervient au dernier stade.

2. Les rhizobia associés au haricot

2.1. Historique

Le terme Bacillus-Phaseolus a été appliqué au Rhizobium du haricot par Beijerinck (1888)

afin de le distinguer de toutes les autres souches de Rhizobium. Plus tard, Schneider (1892)

proposa le nom de Rhizobium frankü var majus pour les Rhizobium symbiotiques en les

distinguant de Rhizobium frankü var minus pour P. vulgaris. Cependant les désignations de

Schneider n'étaient pas valables sur le plan taxonomique et Rhizobium phaseolus devient la

forme acceptée en 1926 (Dangeard, 1926). C'était une des 10 espèces du genre Rhizobium

décrits par Dangeard (1926) dans une nouvelle tribu des Hyphodea de la famille des

Bacteriaceae.

L'appellation R. phaseolus fut cependant surestimée. R. phaseolus est couramment utilisée

pour l'identification des Rhizobium munis de flagelles, bien vacuolisé et plus petits que le

Rhizobium du haricot. Les bactéroïdes sont généralement ronds avec des formes branchées et

leur culture au laboratoire est rapide. Les colonies sont à moitié translucides, glissantes et

blanches (Baldwin et Fred, 1928).

Chapitre I

6

2.2. Classification

Le haricot est une plante capable de former des nodules effectifs avec des groupes

bactériens génétiquement hétérogènes d'origines différentes (Laguerre et al., 1993 ; Eardly et

al., 1995 ; Moushine et al., 2007). En plus de R. leguminosarum bv. phaseoli (Jordan, 1984),

R. tropici (Martinez-Romero et al., 1991 ; Moushine et al., 2007), R. etli (Segovia et al.,

1993), Sinorhizobium meliloti et R.. leguminosarum bv. trifolii (Michiels et al., 1998), deux

nouvelles espèces capables de former des nodules sur les racines du haricot ont été décrites, R.

gallicum bv. phaseoli et R.giardinii bv. phaseoli (Amarger et al., 1997). D'autres espèces déjà

caractérisées mais non classées génétiquement, Rhizobium sp. BR816 (Hungria et al., 1993),

Rhizobium sp. NGR234 (Van Rhijn et al., 1994) et Rhizobium sp. GRH2 (Herrera et al.,

1985) sont également capables d'induire la nodulation du haricot. Selon la littérature, ces

souches de rhizobia nodulant le haricot peuvent être séparées en deux groupes. Le premier

groupe contient les Rhizobium qui forment des nodules effectifs chez le haricot. Ce sont R.

leguminosarum bv. phaseoli (Jordan, 1984), R. leguminosarum bv. trifolii, R. etli, R. tropici,

Rhizobium sp. BR816, GRH2, et Rhizobium sp. NGR234. Le second groupe contient les

rhizobia qui sont capables de former des nodules ineffectifs tels que B. japonicum, A.

caulinodans, and R. leguminosarum bv. viciae (Sardowsky et a1., 1988 ; Waelkens et a1.,

1995 ; Michiels et a1., 1998).

3. La symbiose rhizobia-légumineuse fixatrice d'azote

3.1. La nodulation

Dans l'interaction entre la plante hôte et le rhizobia, les composés phénoliques

(Flavonoïdes, chémoattracteurs) exsudés par la plante hôte entraînent chez la bactérie la

production de lipo-oligosaccharides spécifiques dénommés les facteurs nod (Mulder et al.,

2005 ; Rodriguez-Navarro et al., 2007). Ce sont des signaux moléculaires qui déclenchent la

division des cellules corticales de la racine conduisant à la formation d'un nouvel organe

différencié chez la plante, le nodule ou nodosité (Fig. I. 1). Il existe deux types de nodules:

des nodules déterminés et des nodules indéterminés. Les nodules déterminés sont issus de

l'auxèse des cellules du méristème apical qui cesse son activité à maturation de la nodosité

(Tableau I. 1). Les nodules indéterminés sont issus de mérèses du méristème apical persistant

qui leur confère une croissance longitudinale. Le nodule du haricot est de type déterminé. Une

coupe transversale (Fig. I. 2) montre un cortex qui entoure la zone infectée. Ce cortex

nodulaire est divisé en cortex externe (CE), moyen (CM) et interne (CI), les traces vasculaires

sont localisées entre le CI et le CM (Ianetta et al., 1993 ; Drevon et al., 1995). Une assise, dite

Chapitre I

7

zone de distribution (ZD), séparerait le CI de la zone infectée (ZI) centrale, siège de la

fixation de l'azote atmosphérique (Parsons et Day, 1990).

Figure I. 1 : Différentes étapes de l’établissement de la symbiose rhizobia-légumineuse.

Tableau I. 1: Différences principales entre les nodules de type déterminé et indéterminé

(Sutton, 1983 ; Hirsch,1992).

Type de nodosité déterminée indéterminée

Exemples

Cordon d'infection

Site d'initiation du primordium nodulaire

Méristème nodulaire

Croissance nodulaire

Morphologie

Cellules infectées matures

Forme d'exportation de l'azote fixé

Glycine, Phaseolus, Vigna, Lotus

Etroit

cortex externe

activité limitée

division cellulaire

circulaire

non vacuolisées

uréides (allantoïne ...)

Acacia, Medicago, Trifolium, Pisum

large

cortex interne

apical et persistant

expansion cellulaire

allongée,

ramifiée petites vacuoles

acides aminés (asparagine, glutamine)

Chapitre I

8

Figure I. 2 : Coupe transversale d'un nodule de haricot (A) montrant la zone infectée (ZI)

entourée du cortex nodulaire. Agrandissement (B) d'une zone corticale proche d'une trace

vasculaire (TV), on observe les subdivisions en cortex externe (CE), cortex moyen (CM),

cortex interne (CI) et zone de distribution (ZD), on distingue des cellules infectées (CIN) et

des cellules non infectées (CNI). (Drevon et al., 1995)

3.2. Fonctionnement des nodosités

Chacun des deux symbiontes constitue pour l'autre une source d'un des éléments clefs de

son métabolisme : l'azote moléculaire réduit par la nitrogénase des bactéroïdes (Dommergues

et al., 1999) est assimilé dans les cellules infectées de la plante hôte et exporté aux autres

organes de la plante par le flux xylémien en échange de photosynthétats acheminés sous

forme de saccharose par le flux phloémien jusqu'aux nodosités (Dixon et Wheeler, 1986) (Fig.

I. 3). Les nodosités sont des composantes nécessaires au fonctionnement de la nitrogénase.

Chapitre I

9

Figure I. 3: Schéma illustrant le métabolisme général de la fixation symbiotique de N2 au

niveau des nodules et les échanges de métabolites avec la partie aérienne.

Les deux composants de cette enzyme sont la protéine Mo-Fe et la protéine-Fe. La

dinitrogénase (protéine Mo-Fe) est un hétéro-tétramère composé de deux sous-unités non

identiques α2β2 codées par nifD et nifK. Les protéines α (NifD) et β (NifK) ont un poids

moléculaire de 59 et 54 kDa respectivement. La dinitrogénase est composée du cofacteur

MoFe contenant du fer, du molybdène et du soufre (Bishop et al., 1977), qui est le site

d’attachement et de réduction du substrat, ainsi qu’un centre composé de fer et de soufre qui

reçoit l’électron transféré directement de la dinitrogénase réductase (NifH ou protéine-Fe)

(Peters et al., 1997). La dinitrogénase réductase (protéine-Fe) est un homo-dimère de 64 KDa

(Hausinger et al., 1983 ; Georgiadis et al., 1992). Codée par le gène nifH, elle contient un

centre d’oxydoréduction (4Fe-4S) (Yamamoto et al., 2008). La protéine-Fe joue un rôle dans

le transfert d’électrons à la dinitrogénase, nécessaire à la réduction du substrat (N2)

(Yamamoto et al., 2008).

L’activité de la nitrogénase se fait selon un cycle précis qui comporte quatre étapes

essentielles. En premier lieu, on a la formation du complexe entre la protéine-Fe, deux

molécules d’ATP et la protéine-MoFe, suivie du transfert d’électrons entre les deux protéines

Chapitre I

10

avec hydrolyse de l’ATP. Ensuite, une dissociation de la protéine-Fe du complexe aura lieu

avec une réduction du centre (4Fe-4S) et une tranformation de l’ATP en ADP. Ce cycle se

répète plusieurs fois jusqu'à l’accumulation d’un nombre suffisant d’électrons apte à réduire

le substrat, ce processus de réduction nécessite un environnement anaérobie vu la sensibilité

de la nitrogénase à l’oxygène (Pope et al., 1986).

3.3. Fixation d’azote par la symbiose rhizobienne chez le haricot

Le haricot a été décrit par plusieurs auteurs comme étant une légumineuse à faible

capacité de fixation d'azote, comparée à d'autres espèces de légumineuses comme le soja

(Preira et Bliss, 1987 ; Isoi et Yoshida, 1991). Ce phénomène est dû en partie aux conditions

des sols de la culture mais aussi, à la compétitivité des souches de Rhizobium indigènes

ineffectives. De ce fait le haricot produit en système intensif est fertilisé en azote et la gestion

des intrants azotés dans l'agriculture génère d’importants reliquats azotés en début de culture,

ce qui empêche le haricot d'exprimer au mieux son potentiel de fixation symbiotique.

Cependant, l'existence d'une grande variabilité génotypique pour le potentiel fixateur d'azote

du haricot décrit par Bliss (1993) permet de sélectionner des variétés à très fort potentiel

fixateur d'azote.

4. Facteurs affectant la fixation biologique de l’azote atmosphérique chez le haricot

Le haricot cultivé est extrêmement sensible aux contraintes biotiques (maladies,

ravageurs…), ainsi qu’aux contraintes abiotiques telles que la chaleur, le froid, la sécheresse,

l’excès de lumière, l’excès d’eau, le choc osmotique et la salinité. On estime que 90% des

terres arables sont soumises aux stress abiotiques (Dita et al., 2006). Certaines de ces

contraintes, telles que la sécheresse, les températures extrêmes et la haute salinité limiteraient

fortement la productivité des cultures.

La sécheresse est l’un des principaux facteurs limitant la productivité des cultures dans le

monde (Sharma et Lavanya, 2002) et les variétés ayant une forte tolérance à cette contrainte

sont importantes pour le maintien d’un bon rendement dans les régions où les saisons sèches

sont fréquentes. Environ 60% des haricots produits proviennent des régions soumises à un

déficit hydrique. La sécheresse qui réduit de plus de 50% le rendement du haricot, est la

deuxième contrainte affectant le rendement de cette espèce après les maladies (Teran et

Singh, 2002 ; Martinez et al., 2007).

Les hautes températures (> 30°C le jour et > 20°C la nuit) entraînent une réduction de

rendement chez le haricot à cause d’une transpiration excessive de la plante (Rainey et

Griffiths, 2005).

Chapitre I

11

La salinité du sol peut inhiber la croissance et réduire le rendement du haricot à cause

d’une toxicité et d’un déséquilibre ioniques, et d’une réduction du potentiel hydrique de la

plante (Ashraf, 1997 ; Jansa et al., 2011). Le haricot est extrêmement sensible à la salinité et

on estime qu’environ 5 à 30% des zones de production du haricot sont affectées par la salinité

du sol (CIAT, 1992 ; Jansa et al., 2011).

5. Généralités sur la salinité

5.1. Définition

La salinité des sols et celles des eaux d’irrigation désigne la surcharge de ces derniers

en sels minéraux solubles. Elle est causée par la combinaison de quatre cations (Ca2+

, Mg2+

,

K+ et Na

+) et de quatre anions (Cl

-, SO4

2-, NO3

- et HCO3

-) (Hu et Schmidhalter, 2001 ;

Geetanjali et Neera, 2008).

Les sols salins se caractérisent par la présence dans la rhizosphère de sels solubles en

concentration suffisamment élevée pour nuire à la plupart des plantes (Munns et Termaat,

1986). La salinité du sol est causée par une combinaison de facteurs géologiques, climatiques

et agronomiques (Rengasamy, 2006). La salinité qui était présente avant la colonisation des

terres est souvent appelée salinité historique ou primaire, tandis que les cas de salinité

soupçonnés s’être développés principalement après cette colonisation sont souvent appelées

remontées salines ou la salinisation secondaire (Ghassemi et al., 1995).

5.2. Sols salin et eaux salées

L’évaluation de la salinité des sols et celles des eaux d’irrigation est en général définie

par leurs conductivités électriques (CEl) à 25 °C. Cette dernière est exprimée en décisiemens

par mètre (ds/m) qui est équivalent au mmhos par centimètre (mmhos/cm).

Un sol est dit salin lorsqu’il présente une CEl supérieure à 4 mmhos/cm à 25 °C

(Dommergue et Mougenot, 1970). Le Comité d’experts sur la prospection pédologique formé

en 1984 a classé les sols salins selon leur teneur en sels (modérée ou forte) à deux profondeurs

(tableau I. 2) (Brady, 2002).

Les eaux dont la CEl est inférieure à 0,25 mmhos/cm sont faiblement salines alors que

celles dont la CEl est comprise entre 0,75 et 2,25 mmhos/cm sont très salines. Une autre

classification des eaux d’irrigation (tableaux I. 3) est proposée par Durand (1983) celle-ci est

basée sur la conductivité électrique et le taux d’absorption du sodium (SAR).

Chapitre I

12

Tableau I. 2 : Classification des sols salinisés (Brady, 2002).

Classification

Conductivité

électrique

(dS m-1

)

pH du sol

Ratio

d’adsorption

du sodium

Condition

physique

du sol

Saline > 4.0 < 8.5 < 13 Normal

Salin-sodique > 4.0 < 8.5 > 13

Normale

Sodique < 4.0 > 8.5 > 13 Pauvre

Tableau I. 3 : Classification des eaux d’irrigation selon leurs CEl et le taux d’absorption du

sodium (SAR) (Durand, 1983).

Classe de salinité

C1

C2

C3

C4

C5

Classe d’alcalinité

S1

S2

S3

S4

CEl (mmhos/cm)

0,00 à 0,25

0,25 à 0,75

0,75 à 2,25

2,25 à 5

> 5

SAR

< 10

10 à 18

18 à 26

> 26

Degré de salinité

Faible

Moyen

Fort

Très fort

Excessif

Degré d’alcalinité

Faible

Moyen

Fort

Très fort

5.3. Mesure de la salinité

On dispose de nombreuses méthodes pour mesurer la salinité d'un sol. Certaines sont

fondées sur des procédures analytiques et permettent de connaître la concentration d'un

élément soluble, ce qui implique des prélèvements d'échantillons de sol, ou de solution du sol.

D'autres utilisent les propriétés électriques du sol soit par propagation de signaux (induction

électromagnétique, résistivité, réflectométrie), soit par capteurs in situ (conductivité). La mise

en œuvre de ces dernières techniques demande moins d'investissements financiers et humains

que les méthodes analytiques. Cependant, une combinaison de ces deux méthodologies est

souhaitable pour minimiser le nombre de prélèvements, caractériser de plus grandes surfaces

et suivre les évolutions temporelles (Rhoades, 1984).

5.4. Importance de la salinité au monde et au Maroc

Plusieurs contraintes environnementales sont limitantes pour la croissance et le

développement des légumineuses (Zahran, 1999). La salinité et la sécheresse sont considérés

comme deux facteurs majeurs influant l’agriculture dans les zones arides et semi arides.

Approximativement 40 % des surfaces agricoles sur terre sont caractérisés par la présence

d’un problème potentiel de salinité (Zahran, 1999). Les sols salins sont repartis à travers le

globe terrestre et aucun contient n’échappe à la salinisation. Ils existent non seulement dans

les zones désertiques mais aussi dans les zones fertiles telles que les plaines, les vallées et les

Chapitre I

13

zones côtières. La superficie totale affectée par la salinité est estimée à plus de 400 millions

d’hectares (ha) et chaque minute le monde perd en moyenne 10 hectares de terres cultivables

dont 3 ha (plus de 1,5 Mha par an) à cause de la salinisation (Kovda, 1983 ; Geetanjali et

Neera, 2008). En Afrique, près de 40 millions ha sont affectés par la salinisation, soit près de

2% de la surface totale (Geetanjali et Neera, 2008).

Au Maroc, la salinité a affecté de nombreuses nappes des principales zones agricoles

telles que le Tafilalet, Moulouya, Gharb, Loukous, Souss Massa, Tadla, Doukkala et Haouz,

et elle a aussi affecté quelques oueds (Oum er Rbia dans le Tadla, Oued El Malh à

Ouarzazate, etc.). En général, le phénomène continuerait à s'aggraver. La concentration en

sels augmente et les zones atteintes s'étendent. Il y a des effets dommageables très rapides sur

les sols, les cultures et l'hydrobiologie. Dans plusieurs régions, les concentrations salines ont

atteint des valeurs qui les rendent non appropriées à l’irrigation (Debbarh et Badraoui, 2002).

6. Effets de la salinité sur la symbiose rhizobia-légumineuses

6.1. Effet sur le processus d’infection et le développement des nodules

Le stress salin peut affecter la symbiose légumineuse-rhizobia indirectement, en réduisant

la croissance de la plante hôte et en affectant certains de ses processus physiologiques ou bien

directement en inhibant le processus d'infection et le développement des nodules (Zahran,

1999 ; Cesar et al., 2011). Chez des cultivars tolérants de pois chiche, la salinité a inhibé le

processus d'infection et elle a affecté la taille et le nombre de nodules (Borucki et Sujkowska,

2008), chez la fève, on observe une inhibition du cordon infectieux (Zahran et Sprent, 1986).

Cependant, une stimulation de la croissance des nodules a été observée chez certaines

légumineuses comme les cultivars tolérants du pois chiche (Soussi et al., 1999) ou de luzerne

(Aydi et al., 2004). En général, les premières étapes de la nodulation sont plus sensibles au

stress salin que plus tard (Cordovilla et al., 1999 ; Cesar et al., 2011).

6.2. Effet sur l’activité de la nitrogénase et la respiration nodulaire

La salinité inhibe l’activité de la nitrogénase (Aydi et al., 2008 ; Faghire et al., 2011) et la

respiration nodulaire (Serraj et al., 1994) qui provoque, par la suite, une diminution des teneur

en azote total dans la plante (Salehi et al., 2008 ; Faghire et al., 2011). La réduction de

l'activité fixatrice de N2 par le stress salin est généralement due à la réduction de la respiration

nodulaire (Drevon et al., 1994 ; Bargaz et al., 2011a et b). Cette réduction est due à une

limitation de l'O2 ou du substrat N2 (Soussi et al., 2001 ; Serrat, 2002) ou une diminution de la

production de protéines cytosoliques, surtout la léghemoglobine, par les nodules (Delgado et

al., 1994 ; López et al., 2008a). Vadez (1996) et Serraj et al. (1994), ont montré que

Chapitre I

14

l’augmentation de la pression d’oxygène dans le milieu d’une racine nodulée permet de

supprimer l’effet inhibiteur du stress salin sur l’activité réductrice de l’acétylène. D’autres

résultats suggèrent que l’accumulation des ions toxiques (Na+ et Cl

-) dans les nodosités peut

affecter le métabolisme dans ces organes et inhiber leur activité fixatrice de N2 (Cordovilla et

al., 1995 ; Serraj et al., 1998).

6.3. Effet sur le métabolisme carboné

L’azote moléculaire fixé par la nitrogénase des bactéroïdes est acheminé aux feuilles par

le flux xylémien et l'énergie nécessaire à cette fixation est fournie par la plante sous forme du

saccharose à travers le phloème. Dans le cytosol des cellules infectées, de fortes activités

sucrose synthase et invertase sont présentes et ces activités permettent l'hydrolyse du

saccharose en glucose. Le glucose est ensuite métabolisé en phosphoénol pyruvate, en

oxaloacétate, en malate et en succinate. Le malate et le succinate constituent la principale

source carbonée des bactéroïdes (Kahn et al., 1998). Le malate est une composante clé chez le

metabolisme carboné des plantes et il est synthétisé par l’action de phosphoénolpyruvate

carboxylase (PEPC, EC 4.1.1.31) et la malate déshydrogénase (MDH, EC 1.1.1.37).

Dans les nodules de luzerne et de haricot, la salinité provoque une inhibition des activités

phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC, EC 4.1.1.31) et de la malate déshydrogénase

(MDH, EC 1.1.1.37), ces dernières sont nécessaires pour fournir aux bactéroïdes le carbone à

partir des hexoses-6P (López et al., 2008a ; Faghire et al., 2011). Dans les nodules de pois

chiche, ces activités enzymatiques ont montré le même comportement sous stress hydrique

(Gálvez et al., 2005).

7. Mécanismes physiologiques de tolérance au stress salin chez la symbiose légumineuse

- rhizobia

La prévention des dommages causés par le stress salin et leur réparation sont nécessaires

pour la survie des cellules. Ces stratégies peuvent inclure des changements morphologiques,

biochimiques et physiologiques (l'ajustement osmotique, l'accumulation des osmoprotecteurs,

induction de stress anti-oxydatif et d'autres adaptations physiologiques telles que la

modification de la croissance de la partie racinaire et aérienne et la transpiration) (Geetanjali

et Neera, 2008).

7.1. Ajustement osmotique

Les plantes en général et la symbiose rhizobienne en particulier, détectent le stress salin à

travers le signal ionique (Na+) et osmotique. L’excès de Na

+ peut être détecté par les protéines

transmembranaires ou les enzymes récepteurs de Na+ (Zhu, 2003). L’excès de Na

+ et Cl

-

Chapitre I

15

provoque des changements conformationnels de structures de protéines et de la dépolarisation

membranaire qui peuvent conduire à la perception de la toxicité ionique. Le stress osmotique

imposé par la salinité conduit à la perte de la turgescence des cellules et le changement du

volume cellulaire (Sanders et al., 1999).

En général, les ions Na+ entrent en concurrence avec les ions K

+, à travers les

cotransporteurs Na+/K

+ et peuvent également bloquer les transporteurs spécifiques de K

+ de

cellules racinaires. Les antiports Na+/H

+ de membrane plasmique, pompent le Na

+ à partir des

cellules racinaires pour être transporté vers les feuilles. Ce transport est la première ligne de

défense qui sert à empêcher l'accumulation de Na+ dans le cytosol (Zhu, 2003). Sous la

salinité, la séquestration vacuolaire de Na+ est une stratégie importante et rentable pour

l'ajustement osmotique et au même temps elle peut réduire la concentration de Na+

cytosolique. Les antiports vacuolaires Na+/H

+ utilisent le gradient de protons générés par la

H+

vacuolaire/adénosine triphosphatase (H+/ATPase) et H

+/pyrophosphatase inorganique

(H+/PPase) pour la séquestration Na

+ dans la vacuole. Le stress salin active les H

+/ATPase et

H+/PPase des tonoplastes (Fukuda et al., 2004). Par conséquence, la coordination entre les

antiports Na+/H

+, H

+/ATPase et H

+/PPase est cruciale pour la tolérance au stress salin.

7.2. Régulation de la croissance

Sous stress salin, Munns et Termaat (1986) ont mentionné que la croissance racinaire est

moins touchée par rapport à celle de la partie aérienne. En effet, le maintien d’une croissance

racinaire constitue un caractère adaptatif dans un environnement de faible disponibilité en eau

tel que le milieu salin. L’allongement racinaire peut être dû à une augmentation de l’activité

des enzymes impliquées dans la construction du cytosquelette: telle que la xyloglucan

endotransglycosylase (Wu et al., 1994). L’autre cause peut être l’accumulation de la proline

(Ober et Sharp, 1994). Ces deux actions sont régulées par l’acide abcissique (ABA), qui est

induit par le stress salin (Jia et al., 2002). Ainsi chez le maïs, il a été montré que l’élongation

racinaire est inhibée par la présence d’un inhibiteur de la biosynthèse d’ABA. Mais elle peut

être restaurée par un traitement des racines avec un inhibiteur de synthèse d’éthylène. Ces

données suggèrent que l’élongation racinaire par l’intermédiaire de l’ABA doit être causée

par une inhibition de la biosynthèse d’éthylène (Spollen et al., 2000).

7.3. Biosynthèse d’osmoprotecteurs

Sous stress salin, la concentration des sucres solubles augmente dans les nodules des

légumineuses. Parmi ces sucres on trouve le tréhalose comme substrats osmoprotecteurs

(Lopez et al., 2008b ; Lopez et Lluck, 2012). En plus, la salinité provoque l’augmentation des

Chapitre I

16

aminoacides dans les nodules de haricot qui peut être expliquée par l’ajustement osmotique ou

la dégradation des protéines (Tejera et al., 2005). Chez M. truncatula transgénique la salinité

a provoqué l’accumulation de proline dans les nodules qui a amélioré la croissance et la

fixation symbiotique d’azote (Verdoy et al., 2006).

7.4. Induction du métabolisme oxydatif

Le stress salin induit la production et la formation des formes réactives de l’oxygène

(FRO, les radicaux superoxides (O2-), les peroxydes d’hydrogène (H2O2) et les radicaux

hydroxyles (OH-). Ces formes causent des dommages oxydatifs à différentes composantes

cellulaires tels que les lipides membranaires, les protéines et les acides nucléiques (Halliwell

et Gutteridge, 1989). En effet, l’oxygène est un facteur critique pour la FSA sachant que la

nitrogénase est très sensible à sa présence et irréversiblement inhibée dans un temps très court

(Hill, 1988 ; Burris, 1991). En outre, des études ont montré que l’inhibition de la nitrogénase

par l’O2 est le résultat de la formation du radical hydroxyle au niveau du site actif de l’enzyme

et que les FRO peuvent résulter de l’oxydation de la nitrogénase et de la ferrédoxine, mais

surtout de l’auto-oxydation de la leghémoglobine (Puppo et Halliwell, 1988).

Pour atténuer et réparer les dommages causés par la production de ces FRO, les nodules

ont un système complexe des antioxydants (Rubio et al., 2007 et 2008). Parmi les

composantes de ce système on trouve les caroténoïdes, ascorbates, tréhaloses, glutathions,

tocophérols et les enzymes comme les peroxydases (PO), polyphénoloxydases (PPO),

superoxyde dismutase (SOD), catalase (CAT).

7.4. 1. Peroxydases (PO)

Les peroxydases sont des hémoprotéines largement distribuées chez les plantes

supérieures (Van Huystee, 1987). Les peroxydases jouent un rôle important dans la fine

régulation de la concentration des différentes ROS à l’intérieur des cellules par l’activation et

la désactivation du peroxyde d’hydrogène (Elstner, 1987 ; Lamb et Dixon, 1997 ; Yusupova

et al., 2006). En effet, la génération des ROS est associée avec l’induction des enzymes

extracellulaires localisées dans le plasmalemme et la membrane cellulaire tels que les

peroxydases (Dumas et al., 1995; Thordal-Christensen et al.,1997; Khairullin et al., 2001).

Ces enzymes peuvent être classifiés sur la base de leurs points isoélectrique. Ainsi, on

peut distinguer les peroxydases basiques ou cationiques et les peroxydases acides ou

anioniques (Robinson, 1990). Les PO sont groupées en familles et en subfamilles selon leur

homologie et leur fonction (Lagrimini et al., 1987 ; Robberts et Kolattukudy, 1989 ; Ito et al.,

1994). Outre sa fonction antioxydants, les PO peuvent participer à différents processus

Chapitre I

17

physiologiques, tels que l'élongation cellulaire, la synthèse de la lignine et le catabolisme de

l'auxine (Yoshida et al., 2003).

7.4. 2. Polyphénoloxydases (PPO)

La polyphénoloxydase (PPO) est une enzyme plastidique largement distribuée dans le

monde végétal (Whitaker, 1972 ; Vaughn et duc, 1984a). PPO catalyse généralement

l'oxydation des composés phénoliques aux quinones en utilisant la molécule d'oxygène

comme accepteur d'électron (Sommer et al., 1991). Ces enzymes catalysent deux types de

réactions oxydantes: l'hydroxylation des monophénols aux o-diphénols, et l'oxydation de l'o-

diphénol aux o-quinones. Les activités PO et PPO augmentent en réponse à différents types de

stress biotiques et abiotiques (Rivero et al., 2001) et les activités peroxydases les plus élevées

ont été détectées chez les symbioses pois chiche-rhizobia les plus tolérantes au stress salin

(Mhadhbi et al., 2004).

7.4. 3. Superoxyde dismutase (SOD)

Le superoxyde dismutase est identifié comme un groupe de metalloenzymes qui catalyse

la disproportionation des radicaux superoxide, générés dans différents compartiments

cellulaires, en O2 et en H2O2 (Rubio et al, 2007). Dans les nodules de L. japonicus, le

superoxyde dismutase existe sous multiples formes enzymatiques et l’induction de FeSOD

cytosolique maintient un niveau élevé de l’activité SOD durant toutes les étapes de

développement nodulaire (Rubio et al, 2007). La surexpression de l’activité SOD détectée

dans les nodules de P. vulgaris exposés à la salinité, explique l’amélioration de la tolérance au

stress salin (Tejera et al., 2004b).

7.4. 4. Catalase (CAT)

La CAT mise en évidence dans les peroxysomes, est une enzyme à fonction synergétique

avec le SOD. Après l’élimination de l’anion superoxyde par la SOD, H2O2 est produit et

dégradé par la suite en H2O et en O2 par l’action de la catalase (Adam et al., 1995). Dans les

nodules de P. vulgaris et de M. sativa, la CAT est inhibée par le traitement salin (Tejera et al.,

2007) et cette inhibition est étroitement associée à la fixation de l’azote confirmant la relation

entre l’activité de cette enzyme et le fonctionnement de la symbiose (Mhadhbi et al., 2004).

8. Taxonomie et phylogénie des bactéries

Pour pouvoir accéder à la grande diversité des microorganismes et la manipuler d’une

façon objective, la taxonomie a développé un système de classification qui permet la

Chapitre I

18

reconnaissance de différentes unités microbienne. Le principal objectif de la taxonomie

consiste à classer des groupes d’individus qui se ressemblent selon des critères prédéfinis et à

établir un arbre généalogique et phylogénétique des bactéries (Schleifer et Stackebrandt,

1983; Schlegel, 1997). Cette classification des microorganismes est une discipline majeure

permettant d’identifier et de mettre en place une nomenclature informative, c’est à dire

l’affiliation d’une bactérie à une espèce donnée.

L’espèce est l’unité taxonomique de la classification. On peut définir une espèce

bactérienne comme un ensemble de souches montrant une grande similitude pour tous ses

caractères en comparaison avec autres groupes de souches apparentées (Altas, 1988 ; Colwell

et al., 1995 ; Rosello et Rudolf, 2001). Cette dernière est une parmi les définitions des espèces

bactériennes les plus largement acceptées. Cependant, ce concept semble être plus approprié

pour les organismes supérieurs que pour les micro-organismes car il est difficile de définir

une espèce d’une manière objective. En effet, il n'existe aucune définition, universellement

admise, de l'espèce bactérienne et l’application de cette définition antérieure est encore

contestée par certains auteurs (Cohan, 2002).

L’étude du gène rrs est très utilisée en taxonomie bactérienne. L’analyse comparative de

la séquence du gène rrs est une excellente méthode pour élucider les relations

phylogénétiques entre les microorganismes (Fox et al., 1980 ; Rosello et Rudolf, 2001 ;

Schleifer, 2004). Le gène rrs a comme avantages d’être constitué de domaines hautement

conservés entourant des domaines variables, de présenter une taille de 1540 nucléotides

aisément séquençables et d’avoir une séquence suffisamment informative (Stackebrandt et al.,

1994 ; Ludwig, 1998). Ces régions hautement conservées servent de cibles pour des amorces

dites "universelles" servant à l’amplification in vitro par PCR puis au séquençage (Weisburg

et al., 1991). Cette évaluation a conduit a la construction de l’arbre phylogénétiques qui a

permis d’établir les relations entre tous les organismes connus jusqu’a maintenant.

Mais l’étude du séquençage du gène rrs n’est pas très descriptive au niveau d’espèces en

particulier entre souches phylogénétiquement très proches (Vinuesa et Silva, 2004). Pour cette

raison, de nouveaux marqueurs ont été proposés pour établir les relations physiologiques entre

les microorganismes, parmi lesquels le séquençage de l’ARNr 23S (Ludwig et al., 1995 ;

Ludwig et Schleifer, 1994), le séquençage de la région intergénique ITS localisé entre l’ARNr

23S et l’ARNr 16S pour des groupes spécifiques des bactéries (Broughton, 2003 ; Kwon et

al., 2005), le séquençage des gènes reconnus comme housekeeping (atpD et recA) qui codent,

respectivement, pour la sous unité β de l’ATPase F1F0 et la protéine RecA (Gaunt et al.,

2001; Faghire et al., 2012).

Chapitre I

19

La caractérisation symbiotique consiste à réaliser un test de nodulation entre les deux

symbiotes compatibles, les rhizobia et les plantes légumineuses. Elle est basée aussi sur

l’analyse moléculaire des gènes responsables de la symbiose comme ceux de la nodulation

(nod) et de la fixation de l’azote (nif) (Laguerre et al., 2001 ; Vinuesa et al., 2005a ; Faghire et

al., 2012).

La caractérisation phénotypique consiste à décrire plusieurs aspects parmi ces aspects,

l’étude du comportement de croissance des souches de rhizobia sous des conditions salines.

Ainsi, la caractérisation et le séquençage du gène otsA impliqué dans l’osmotolérance

(Salminen et Streeter, 1986), peut être un bon marqueur pour les études phylogénétiques du

genre Rhizobium (Faghire et al., 2012).

9. Conclusion

Cette synthèse bibliographique souligne l'importance du haricot (P. vulgaris) en tant

que légumineuse à graines très consommée dans le monde, mais aussi pour son extrême

diversité en terme de variabilité morphologique et génétique conférant une souplesse de son

utilisation et sa culture au sein des environnements auxquels elle est adaptée. Quoique cette

espèce est connue par sa faible capacité de fixation d’azote, Hardarson et al. (1993) ont

montré que certaines lignées présentent un bon potentiel de fixation d'azote même sous

contraintes environnementales. Généralement, du fait de sa production sous des contraintes

environnementales sévères (sécheresse, salinité, faible disponibilité en P et en N), les

rendements de cette culture sont en dessous de son potentiel. Cette situation est largement

expliquée par l'irrégularité de la nodulation chez cette légumineuse malgré la grande diversité

des rhizobia qui peuvent la noduler. La limitation de son rendement semble aussi être due à

l’insuffisance de sa FSN pour la croissance et la production, d’où la nécessité de sélectionner

des symbioses haricot-rhizobia performantes sous conditions de culture hostiles.

Dans le cadre d’une agriculture durable, le développement de cultivars tolérants et

particulièrement des symbioses rhizobiennes performantes est l’une des approches les plus

envisageables pour réduire les effets délétères de diverses contraintes biotiques et abiotiques

dont la salinité. A travers cette étude bibliographique, il ressort que la tolérance au stress salin

est un phénomène complexe qui intègre aussi bien des modifications morphologiques que des

ajustements physiologiques et biochimiques représentant une approche largement étudiée par

la communauté scientifique. Cependant, il existe certains aspects qui sont moins étudiés, au

moins chez les symbioses haricot-rhizobia, et qui ont fait l’objet de notre étude menée dans ce

travail.

Chapitre II

20

Chapitre II

Effet de la salinité sur la nodulation, la fixation d'azote et la croissance du

haricot (P. vulgaris) inoculés avec des souches de rhizobia isolées de la

région du Haouz au Maroc

I. Introduction

La fixation symbiotique de l'azote (FSA) s'est révélée être limitée, en particulier dans les

conditions semi-arides où la salinité constitue souvent un problème en raison de la mauvaise

qualité de l'eau d'irrigation pendant la saison sèche. Les légumineuses sont classées comme

espèces végétales sensibles au sel (Läuchli, 1984 ; Martinez et al., 2007). La limitation de leur

productivité est liée à la réduction de la croissance de la plante hôte et à l’inhibition de

l’initiation, du développement et du fonctionnement des nodules (Georgiev et Atkins, 1993 ;

Cesar et al., 2011) et par conséquent, une réduction de la capacité de fixation de l'azote

(Delgado et al., 1993). Chez les plantes, la salinité affecte considérablement la photosynthèse

(Seeman et Sharkey, 1986 ; Soussi et al., 1998), la teneur en azote (Cordovilla et al., 1994 ;

Mansour, 2000 ; Santos et al., 2002), le métabolisme du carbone (Balibrea et al., 2003) et

perturbe la nutrition des plantes en provoquant une accumulation du sodium (Na+) dans les

tissus végétaux (Cordovilla et al. 1995 ; Grattan et Grieve, 1999 ; Mengel et Kirkby, 2001).

La perturbation de ces processus physiologiques conduit à une diminution considérable de la

croissance des plantes et par conséquent la réduction du rendement des cultures.

Ce chapitre est consacré à l’étude de l'effet de la contrainte saline sur la croissance, la

fixation d'azote, l'accumulation des nutriments, les activités PEPC et MDH dans les nodules

de deux cultivars de P. vulgaris cultivé à la région du Haouz (Paulista et Efequince) inoculés

avec des souches de rhizobia (RhM11 ou RhM14) isolées de cette région.

II. Matériel et méthodes

1. Matériel biologique et conduite des cultures

Le matériel biologique ayant fait l’objet de cette étude est constitué de deux variétés du

haricot, Paulista et Efequince, cultivées au Maroc (Figure II.1). La variété Paulista est

fréquemment cultivée au Haouz grâce à son inflorescence indéterminée qui permet aux

agriculteurs de récolter en vert et en sec. La variété Efequince, d’origine espagnole, est

cultivée pour la haute qualité de ses gousses et son rendement (ORMVAH, communication

personnelle). Trois souches de rhizobia, R. Tropici CIAT899 comme souche de référence

fournie par le Laboratoire de Fixation Biologique de l’Azote de l’Université de Granada,

Espagne et deux isolats de notre collection : RhM11 et RhM14 isolées après diagnostic

Chapitre II

21

nodulaire réalisé sur des plantes nodulées issues d’essais aux champs menés chez les

agriculteurs de la région du Haouz. La souche RhM11 est tolérante à la salinité (2,5% de

NaCl), tandis que la souche RhM14 est sensible à la salinité (0,5% de NaCl) (Faghire et al.,

2012).

Figure II.1 : Aspect des graines et nomenclature des génotypes de haricot utilisés.

.

Les graines ont été stérilisées superficiellement par une solution de NaClO (5%) pendant 5

min, rincées quatre fois à l'eau distillée stérile et mises à germer pendant 48 h dans la

vermiculite humide autoclavée. Les jeunes plants ont été transplantés (trois par pot) dans des

pots de 20 cm de diamètre et 30 cm de hauteur contenant de la vermiculite stérilisée et arrosés

par une solution nutritive adéquate, contenant au début (la première semaine) de l’azote sous

forme d’urée (3 mmol par plante correspondant à 84 mg N) et à pH 6,8, elle est composée de

KH2PO4 (0.2 g/l), MgSO4 .7H2O (0.2 g/l), KCl (0.2g/l), CaSO4.2H2O (120 mg/l), Na2FeEDTA

(25 mg/l), Na2MoO4.2H2O (4 mg/l), MnSO4 .2H2O (2 mg/l), CuSO4.5H2O (2 mg/l),

ZnSO4.7H2O (3 mg/l), H3BO3 (18 mg/l) et CoCl2.4H2O (0.120 mg/l) (Rigaud et Puppo,

1975). Chaque plante a été inoculée avec 1 ml de la suspension bactérienne de CIAT899,

RhM11 ou RhM14 multipliées sur milieu YEM à 28°C pendant 48h pour obtenir une

concentration d’environ 109 UFC ml

-1. L’inoculation consiste en l’application directe de la

solution rhizobienne sur les racines de la plante. La conduite des essais a été réalisée dans une

chambre contrôlée avec une photopériode de 16/8 h (lumière/obscurité), une température de

28/19ºC (jour/nuit), une humidité relative 55/75% et la densité de flux de photons

photosynthétiques (400–700 nm) de 450 μmol m–2

s–1

, fournies par des lampes fluorescentes

combinées et incandescentes. Les plantules ont été réparties en deux lots : le premier est

régulièrement irrigué avec de la solution nutritive (témoin), le second lot est irrigué avec la

solution nutritive additionnée de NaCl à 25 mM tous les trois jours (Figure II.2). Une

irrigation à l’eau distillée est appliquée après toutes les deux irrigations afin d’éviter

l’accumulation du NaCl dans le substrat de culture. Après 25 jours de l’application du

traitement salin, les plantes ont été récoltées, rincées à l'eau distillée et des échantillons ont été

utilisés pour différents analyses ou bien conservés congelés à -80°C.

Chapitre II

22

Figure II.2: Dispositif expérimental de la culture.

2. Biomasse de la partie aérienne, racinaire et nodulaire

Les parties aériennes, racinaires et les nodules des plantes ont été séparés et les biomasses

sèches ont été déterminées après séchage à 80 °C pendant 48 heures. Après détermination des

paramètres de croissance et de nodulation, les échantillons secs des plantes et nodosités ont

été utilisés pour la détermination de leurs teneurs en Na+, K

+, P et N. Des échantillons secs ont

été broyés en poudre végétale fine à l’aide d’un broyeur puis analysés.

3. Mesure de la fixation de l'azote

L'activité nitrogénase (EC 1.7.9.92) a été mesurée en suivant l'évolution de H2 dans un

système de flux ouvert (Witty et Minchin, 1998) utilisant une sonde électrochimique H2

(Qubit System Inc, Canada). Les mesures d'hydrogène ont été effectuées sur le système

racinaire des plantes intactes juste après la récolte. L’activité de la nitrogénase apparente

(ANA, le taux de production de H2 dans l'air) a été déterminée sous N2: O2 (80%: 20%) avec

un débit total de 0,4 l min-1

. Après avoir atteint l'état d'équilibre, l'activité nitrogénase totale

(TNA) a été déterminée sous Ar: O2 (79%: 21%). Le taux de fixation de l'azote (TFA) a été

calculé comme (TNA-ANA) / 3. Les normes de haute pureté H2 ont été utilisées pour

étalonner le détecteur.

4. Dosages des activités enzymatiques de la PEPC et MDH nodulaires

Des échantillons de 0.2 g de nodules frais ont été broyés dans un mortier avec le tampon

maleique-KOH 0.1M pH=6.8 à une proportion de 1/10 (poids/volume) et polivinylpirrolidone

(PVP) insoluble à une quantité équivalente à 33% de poids frais de l’échantillon. Le broyat

obtenu est centrifugé à 30000g durant 20 minutes à 4°C. Le surnagent obtenu a constitué

l’extrait enzymatique brut (Vance et Stade, 1984).

L’activité phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) a été déterminée selon la méthode de

Vance et Stade, (1984). Le milieu de réaction contient le tampon bicine 100mM pH 8.5,

NaHCO3 10 mM, MgCl2 5mM, Phosphoenolpyruvate 2 mM, NADH 0.2 mM et 10-50 µl de

l’extrait. L’activité est exprimée en µmol NADH. mg prot-1

. h-1

.

Chapitre II

23

L’activité malate déshydrogénase (MDH) a été déterminée selon la méthode de Vance et

Johnson (1983). Le milieu de réaction contient le tampon bicine 100mM pH 8.5, acide

oxaloacétique 1mM, MgCl2 5mM, NADH 0.2 mM et 10-50 µl de l’extrait. L’activité est

exprimée en µmol NADH. mg prot-1

. h-1

.

5. Dosage du Sodium (Na+), du Potassium (K

+), du Phosphore (P) et du Azote (N)

Le dosage du Na+, K

+ et P a été effectué après minéralisation du matériel végétal. Les

échantillons ont été repartis dans des creusets à raison de 0,25 g de matière sèche fine par

creuset, puis placées pendant 6 h au four à 550°C. Les cendres obtenues ont été ensuite

additionnées de 3 mL d’HCl 6N, évaporées sur plaque chauffante puis ont été récupérées dans

l’eau distillée chaude.

Les cations K+ et Na

+ sont dosés par photométrie d’émission de flamme.

Pour doser le Phosphore, un aliquote de la solution (0,25 ml) est additionné de 1,25 ml du

réactif MS (molybdate de sodium (2.5%) et sulfate d’hydrazine (0.15%)) et 1 ml d’eau

distillée, puis porté à ébullition pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été laissés se

refroidir avant de procéder à la lecture au spectrophotomètre à 820 nm.

Le dosage de l’azote a été effectué à raison de 4 répétitions par traitement par

combinaison symbiotique. Il s’agit d’analyser le contenu de la partie aérienne des plantes. Les

étapes de cette analyse se sont succédées comme suit :

i) Minéralisation : une prise d’essai de 0,5 g de matière sèche a été finement broyée

puis placée dans un tube Buchi avec une pincée du catalyseur (sulfate de potassium (100 g),

sulfate de cuivre (20 g) et sélénium en poudre (2g)) et 10 ml de H2SO4 concentré. Les tubes

ont été ensuite placés dans le bloc de digestion B435 et fermés à l’aide d’un couvercle.

L’aspiration et la pompe à vide ont été mises en marche et la digestion s’est déroulée durant 2

h à température égale à 400°C.

ii) Distillation : les tubes ainsi refroidit ont été placés au niveau du distillateur

programmé pour additionner 70 ml de NaOH (10N) et 20 ml d’eau distillée. Une distillation

durant 4 min permet de récupérer un volume d’environ 100 ml dans un erlenmeyer contenant

50 ml d’acide borique H3BO3 (20 g. l-1

) et 5 gouttes d’indicateur coloré (rouge de méthyle et

bleu de bromothymol).

iii) Titration : Le distillat recueilli a été titré par une solution d’acide chlorhydrique

(N/100) jusqu’au virage de la coloration verdâtre à la coloration rouge initiale. Le volume

d’acide chlorhydrique qui a servit au titrage a été utilisé pour calculer le pourcentage d’azote

exprimé ensuite en mg d’azote par g de poids sec.

Chapitre II

24

6. Analyse statistique

Le dispositif expérimental adopté étant le bloc aléatoire. Les valeurs des paramètres de

croissance et ceux de la fixation d'azote représentent les moyennes de cinq répétitions par

traitement par combinaison symbiotique et les autres paramètres étudiés représentent les

moyennes de six répétitions par traitement. L’analyse des données a été réalisée par ANOVA

à deux facteurs. Les comparaisons entre les différentes moyennes ont été effectuées par le test

de Fisher LSD à 5% de probabilité en utilisant CoStat.

III. Résultats

1. Paramètres de croissance et de nodulation

Chez les plantes témoins et sous les conditions de la fixation symbiotique de l'azote, la

variété Efequince inoculée avec les souches locales (RhM11 ou RhM14) a montré des poids

secs des plantes (PSP) significativement supérieurs à ceux de la variété Paulista inoculée avec

les mêmes souches. Les plantes inoculées avec la souche de référence CIAT899 n’ont pas

montré de différences entre les deux variétés sous traitement témoin (0 mM NaCl) (Tableau

II.1). L'addition de 25 mM de NaCl à la solution nutritive, a réduit de façon significative la

croissance des plantes issues des associations symbiotiques RhM11-Paulista, RhM11-

Efequince et CIAT899-Paulista de 41, 43 et 52% respectivement. Les plantes des deux

variétés n'ont montré aucune réduction significative de la croissance sous traitement salin

lorsqu'elles ont été inoculées avec la souche RhM14.

Afin de caractériser le comportement d'organes végétaux, nous avons déterminé le

rapport (poids sec racinaire / poids sec aérien) (Tableau II.1). Le traitement salin n'a pas

affecté significativement ce paramètre sauf pour la combinaison Efequince-RhM11 qui a

montré une réduction significative de l’ordre de 54%.

Pour le poids sec nodulaire (PSN), l'effet du traitement salin sur ce paramètre n'a montré

aucune variation significative pour toutes les combinaisons symbiotiques haricots-rhizobia

testées. La comparaison entre les souches de rhizobia chez la variété Paulista a montré que les

plantes inoculées avec RhM11 ont présenté des PSN plus élevés que ceux obtenus chez les

plantes inoculées par les autres souches, RhM14 ou CIAT899 (Tableau II.1). En général, la

salinité a provoqué une diminution du taux de fixation de l'azote (TFA) chez toutes les

combinaisons symbiotiques testées, mais cet effet négatif est significatif seulement pour

CIAT899-Paulista, RhM14-Paulista et RhM14-Efequince (Tableau II.1). Pour les témoins (0

mM NaCl), la combinaison CIAT899-Paulista a présenté le TFA le plus élevé et qui est égale

à 1.634 µmol N2. g PSN-1

. h-1

.

Chapitre II

25

Tableau II.1 : Effet de la salinité sur la croissance, la nodulation et la fixation d'azote: PSP, poids sec des plantes (g plante-1

); le rapport

PSR /PSA, poids sec racinaire/poids sec aérien; PSN, poids sec nodulaire (g plante-1

) et TFA, taux de fixation de l'azote (µmol N2. g PSN-1

.

h-1

) chez les plantes de deux génotypes de P. vulgaris inoculées avec différentes souches de rhizobia (CIAT899, RhM11 ou RhM14).

Souches Génotypes NaCl (mM) PSP

(g plant-1

) PSR/PSA

PSN

(g plant-1

)

TFA

(µmol N2. g PSN-1

. h-1

)

CIAT899

Paulista 0 1.489 ef 0.644 ab 0.058 de 1.634 a

25 0.720 g 0.492 b 0.087 bcde 0.729 efg

Efequince 0 1.273 fg 0.489 ab 0.081 cde 0.991 bc

25 1.972 cde 0.534 ab 0.129 bcd 0.795 cdef

RhM11

Paulista 0 2.540 bc 0.770 ab 0.164 ab 0.747 defg

25 1.497 ef 0.450 b 0.227 a 0.603 fg

Efequince 0 3.271 a 1.030 a 0.140 bc 0.941 bcd

25 1.851 def 0.472 b 0.146 bc 0.839 bcde

RhM14

Paulista 0 1.351 ef 0.675 ab 0.047 e 0.999 b

25 1.327 fg 0.617 ab 0.079 cde 0.599 fg

Efequince 0 2.727 ab 0.567 b 0.121 bcde 0.879 bcde

25 2.251 bcd 0.795 ab 0.126 bcde 0.550 g

Les moyennes suivies par la même lettre dans une colonne ne sont pas différentes significativement (P ≤ 0,05) en utilisant le test LSD

Chapitre II

26

2. Fixation symbiotique de l'azote (FSA)

La FSA a été estimée comme étant la différence entre les quantités d’azotes finale (%

d’azote) dosée à la récolte et celles de l'azote fournies au début sous forme d’urée (3 mmol

par plante correspondant à 84 mg N) (Vadez et Drevon, 2001 ; Aydi et al., 2008 ; Bargaz et

al., 2011a). Les données illustrées dans la Figure II.3, montrent que la salinité a provoqué une

réduction de FSA chez toutes les combinaisons symbiotiques testées. Cette réduction est

significative seulement chez RhM11-Efequince, RhM14-Paulista et RhM14-Efequince. Chez

les traitements témoins, RhM11-Efequince a présenté la plus faible teneur en N fixé (2.88%)

alors que CIAT899-Paulista a présenté la teneur la plus élevée en N fixé (3.7%).

RhM11-Efequince, RhM14-Paulista et RhM14-Efequince ont montré un haut pourcentage

de réduction de FSA atteignant des valeurs d’environ 28%, 39% et 27% respectivement

(Figure II.4A). Parallèlement, le pourcentage de réduction de PSN sous salinité, a montré une

variation irrégulière suivant les combinaisons symbiotiques (Figure II.4A). Ainsi, CIAT899-

Paulista, CIAT899-Efequince et RhM11-Paulista ont montré des augmentations de plus de

30% par rapport à leurs témoins correspondants, mais RhM14-Paulista a enregistré le

pourcentage de réduction le plus élevé atteignant 67% du témoin.

Chez toutes les combinaisons testées, le traitement salin a négativement affecté l'efficacité

nodulaire avec quelques variations entre les combinaisons symbiotiques testées (Figure

II.4B). En effet, RhM14-Efequince a montré la plus faible réduction (30%) et la symbiose

RhM14-Paulista a enregistré la plus forte réduction qui a atteint 63% de son témoin

correspondant.

A partir des résultats de ces deux figures nous notons la présence d’un effet du génotype

du Haricot qui est très évident. Et nous notons aussi la présence de l’effet significatif de

combinaison et du traitement salin.

Chapitre II

27

Figure II.3 : Effet de la salinité sur la fixation symbiotique de l'azote. Les bars avec la même

lettre ne sont pas différentes significativement (P ≤ 0,05), en utilisant le test LSD.

Figure II.4 : Variations de la fixation symbiotique de l'azote (FSA) et la croissance nodulaire

(PSN) par rapport aux témoins sous stress salin (A) et les variations d'efficacité des nodules

(B), estimées par les quantités d'azote fixé par ces organes pendant la période du traitement.

Chapitre II

28

3. Effets du traitement salin sur les teneurs en certains éléments nutritifs

Les résultats illustrés dans le Tableau II. 2 montrent que les teneurs en sodium et en

potassium présentent des variations entre les différentes combinaisons symbiotiques haricot-

rhizobia. Sous traitement salin, les teneurs en sodium de la partie aérienne, ont montré une

augmentation significative chez CIAT899-Paulista et CIAT899-Efequince. Pour les autres

combinaisons symbiotiques, l’application de NaCl a causé soit une augmentation soit une

diminution des teneurs en Na+, mais ces variations ne sont pas significatives. Pour la partie

racinaire, la salinité a induit une augmentation des teneurs en Na+ qui n’est significative que

pour RhM11-Paulista et RhM14-Paulista. Pour K+, les teneurs accumulées sont plus

importantes dans la partie racinaire que dans la partie aérienne chez la majorité des

combinaisons symbiotiques testées. Au niveau de la partie aérienne, le traitement salin a

induit des réductions significatives des teneurs en K+ chez les plantes des deux variétés

inoculées avec CIAT899 et RhM11 et elles sont non significatives lorsque les plantes ont été

inoculées avec RhM14. Au niveau des racines des plantes, le NaCl a induit une diminution

des teneurs en K+ qui est significative seulement pour les combinaisons RhM11-Paulista et

RhM14-Efequince (Tableau II. 2).

Sous traitement salin, les teneurs en phosphore (P) dans la partie aérienne ont montré des

réductions non significatives pour toutes les combinaisons symbiotiques testées (Tableau II.

2). Au niveau des racines, le traitement salin a causé une variation irrégulière des teneurs en

P. En effet, chez les plantes des deux variétés, inoculées avec CIAT899, la salinité a provoqué

une augmentation significative des teneures en P racinaire par contre la même contrainte a

provoqué une diminution significative de ce paramètre chez la combinaison RhM14-

Efequince (Tableau II. 2).

Chapitre II

29

Tableau II. 2: Effet de la salinité sur les concentrations des éléments minéraux : sodium, potassium et phosphore dans la partie aérienne et

racinaire des plantes de deux génotypes de P. vulgaris inoculées avec différentes souches de rhizobia (CIAT899, RhM11 ou RhM14).

Strains Genotypes NaCl (mM) Sodium (%) Potassium (%) Phosphore (%)

Partie aérienne Partie racinaire Partie aérienne Partie racinaire Partie aérienne Partie racinaire

CIAT899

Paulista 0 1.33 bc 1.36 bcd 2.36 cd 4.8 bc 2.74 d 2.05 e

25 3.43 a 1.90 abc 1.33 ef 3.17 c 2.26 d 6.37 bc

Efequince 0 0.90 c 1.79 abcd 2.47 cd 4.70 bc 3.90 cd 2.29 de

25 2.43 a 2.16 abc 0.84 f 3.77 bc 2.47 d 7.30 bc

RhM11

Paulista 0 0.40 c 0.58 d 3.80 a 6.90 a 6.03 bc 2.15 e

25 0.90 c 1.93 abc 2.08 de 3.37 c 4.51 cd 3.13 de

Efequince 0 0.35 c 0.92 cd 3.52 ab 4.36 bc 7.48 ab 5.32 cd

25 0.81 c 0.98 cd 0.75 f 3.15 c 5.49 bc 6.87 bc

RhM14

Paulista 0 1.21 bc 1.17 cd 2.85 abcd 4.66 bc 4.50 cd 8.79 ab

25 0.55 c 2.70 a 2.52 cd 3.87 bc 3.92 cd 6.82 bc

Efequince 0 0.27 c 1.42 abcd 3.14 abc 5.40 ab 8.56 a 10.68 a

25 0.19 c 2.56 ab 2.77 bcd 3.41 c 8.61 a 7.33 bc

Les moyennes suivies par la même lettre dans une colonne ne sont pas différentes significativement (P ≤ 0,05) en utilisant le test LSD

Chapitre II

30

4. Effet de NaCl sur les activités de certaines enzymes nodulaire impliquées dans le

métabolisme carboné

Le traitement salin a induit des réductions significatives de l’activité enzymatique PEPC

nodulaire chez les plantes des deux variétés inoculées avec RhM11 ou RhM14 alors que cette

contrainte reste sans effet sur cette activité enzymatique chez les plantes inoculées avec

CIAT899 (Figure II.5A). La plus grande réduction est enregistrée chez la combinaison

RhM11-Efequince (67%) et la plus petite réduction est enregistrée chez RhM14-Efequince

(24%).

La salinité a négativement affecté l’activité enzymatique de la MDH nodulaire et a causé

des réductions significatives chez les combinaisons CIAT899-Efequince (26%), RhM11-

Efequince (57%) et RhM14-Paulista (37%) (Figure II. 5B). Pour les autres combinaisons

symbiotiques testées, cette contrainte n’a pas significativement affecté l’activité MDH

nodulaire.

Figure II.5: Effet de la salinité sur les activités enzymatiques nodulaire: A)

phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) et B) malate dehydrogenase (MDH) chez les

plantes de deux génotypes de P. vulgaris inoculées avec différentes souches de rhizobia

(CIAT899, RhM11 ou RhM14). Les bars avec la même lettre ne sont pas différentes

significativement (P ≤ 0,05), selon le test LSD.

Chapitre II

31

IV. Discussion Dans le présent travail, l'effet de NaCl sur la croissance des plantes, le développement des

nodules, la fixation symbiotique de l'azote et les activités de PEPC, MDH, a été étudié chez

deux variétés de haricot inoculées avec deux souches locales (RhM11 ou RhM14) ou avec

une souche de référence CIAT899. Pour le traitement témoin (0 mM NaCl), l'inoculation avec

RhM11 a amélioré la croissance des plantes et des nodules en comparaison avec celles

inoculées avec les souches RhM14 ou CIAT899. Le PSP de la symbiose CIAT899-Paulista

n’a pas atteint des valeurs aussi élevées que celles obtenues pour les autres combinaisons

testées, malgré son fort potentiel de fixation biologique d'azote mesuré (FSA et TFA)

(Tableau II.1 et Figure II.3). Le traitement salin a négativement affecté ces paramètres chez la

majorité des symbioses rhizobia-haricot testées avec quelques variations. Ces effets de

l’inoculation rhizobienne sur le développement du haricot, ont été également rapportés dans

d’autres travaux (Wood et al., 1984 ; Peoples et al., 1995 ; Ndakidemi et al., 2006 ; Bambara

et Ndakidemi, 2010). L'inoculation avec les souches locales de rhizobia, en particulier

RhM11, pourrait jouer un rôle crucial dans la croissance des plantes et l'amélioration de la

biomasse des nodules sous la contrainte saline et surtout lorsque la croissance des plantes est

sous dépendance de la FSA. Ce constat est en accord avec ceux des études menues par notre

groupe de recherche, où la même souche a été testée sous déficience en P et elle a révélé une

augmentation importante à la fois de l'activité d’acide phosphatase nodulaire (Mandri et al.,

2011) et la perméabilité d’O2 dans les nodules (Bargaz et al., 2011b).

Sous traitement salin, la FSA n’est pas affectée de façon significative chez CIAT899-

Paulista, CIAT899-Efequince et RhM11-Paulista en comparaison avec les autres

combinaisons (Figures II.3 et II.4A). Chez ces combinaisons, le maintien d’une importante

activité de FSA, sous traitement salin, pourrait être attribué à leur capacité à assurer une

nutrition carbonée suffisante au niveau des nodules. En effet, Velagaleti et Marsh (1989) ;

Garg et Singla (2004) et Aydi et al. (2008) ont rapporté que l'inhibition de la FSA pourrait

être due à une diminution de l'approvisionnement des nodules en carbohydrates, puisque la

FSA nodulaire dépend énergiquement du carbone fourni par la partie aérienne, comme il a été

décrit par James et al. (1993) pour des nodules de soja soumis au stress salin. En revanche,

l'efficacité des nodules (pourcentage d'azote fixé par g PSN) a été réduite par la salinité chez

le RhM14-Paulista comparée à celle observée chez les autres symbioses testées (Figure

II.4B). Ainsi, cette réduction de l'efficacité des nodules a largement contribué à la limitation

de la FSA sous les conditions de salinité. La diminution de l'efficacité des nodules peut être

expliquée par l’inhibition de l'activité nitrogénase (TFA) (Tableau II.1). Une telle explication

Chapitre II

32

est soutenue par la concordance positive entre ces deux paramètres pour leurs variations sous

stress salin. Il est proposé que la diminution de l'activité nitrogénase sous stress salin pourrait

être due à une diminution de la respiration nodulaire comme une conséquence d'une limitation

d’approvisionnement des nodules en O2 (James et al., 1993 ; Serraj et al., 1995 ; Soussi et al.,

2001) résultant d'une diminution de la conductance nodulaire à l'O2 (James et al., 1993 ; Aydi

et al., 2004). En effet, l’augmentation de la pression d'oxygène dans l'environnement

rhizosphérique des racines de haricots nodulées a permis la suppression de l'effet inhibiteur du

sel sur l'activité acétylène-réductase de la nitrogénase (Serraj et al., 1998).

Le traitement salin a négativement affecté la nutrition minérale (sodium, potassium et

phosphore) des plantes chez la plupart des combinaisons symbiotiques testées. Cependant,

une variabilité évidente entre les combinaisons symbiotiques dans leurs réponses à la salinité

a été mise en évidence dans ce travail. Les plantes inoculées avec CIAT899 et RhM11 sont

plus tolérantes que celles inoculées avec RhM14. Cette variabilité est observée au niveau de

l'activité nitrogénase (Tableau II.1) et les concentrations des éléments minéraux (Tableau II.2)

pour lesquelles les plantes inoculées avec RhM11 ont montré de faibles concentrations en Na

dans leurs parties aériennes et racinaires concomitante avec une haute FSA. Inversement, les

plantes inoculées avec RhM14 ont montré de fortes concentrations en Na dans leurs parties

aériennes et une faible FSA. À cet égard, Soussi et al. (1998) et Aydi et al. (2008) ont

rapporté des résultats similaires et ils ont suggéré une relation entre l'accumulation de Na dans

les parties aériennes et la réduction FSA.

Chez le génotype Paulista inoculé avec la souche de référence CIAT899, les activités

enzymatiques nodulaire PEPC et MDH ont montré des valeurs élevées qui n'ont pas varié

avec la salinité, par rapport aux autres symbioses testées (Figure II.5). Ces enzymes sont

impliquées dans le métabolisme carboné et sont responsables de la fourniture du carbone aux

bactéroïdes par la formation de dicarboxylates considérés comme les premières sources de

carbone pour les bactéroïdes (Lopez et al., 2008a). Ces données pourraient soutenir notre

explication donnée ci-dessus au sujet de la capacité des plantes inoculées par CIAT899 pour

maintenir des quantités élevées de l’azote fixé sous stress salin. En plus de son impact positif

dans l'activation du métabolisme du carbone sous les conditions stressantes telles que la

déficience en P (Hinsinger et al., 2003), nous suggérons que le renforcement de l'activité de

ces enzymes pourraient jouer un rôle crucial dans la tolérance au stress salin, mais peu

d'informations sont disponibles pour prouver une telle relation. C’est intéressant de

mentionner que l'implication de la PEPC et MDH dans l'allocation du carbone en particulier

dans les nodules pourrait influencer la FSA. Dans ce contexte, Schulze (2004) a considéré que

Chapitre II

33

l'allocation du carbone est l'une des théories concurrentes qui contribuent à la régulation de la

FSA des légumineuses.

V. Conclusion

En s'appuyant sur nos résultats, discutés ci-dessus, nous pouvons conclure que le

traitement salin a réduit la croissance des plantes, l'activité métabolique et la performance

symbiotique chez la plupart des combinaisons testées avec une variabilité importante entre

elles. La meilleure performance de la symbiose sous les conditions salines semble être

principalement déterminée par la tolérance de la légumineuse hôte et son interaction avec la

souche de rhizobia. L'inoculation avec une souche locale de rhizobia, caractérisée par une

bonne performance symbiotique pourrait compenser la perte de la croissance de la plante

hôte, induite par la salinité. Par ailleurs, la variabilité génotypique dans les activités PEPC et

MDH nodulaires impliquées dans l’allocation métabolique du carbone semble être un trait de

tolérance au sel qui mérite plus d'exploration.

Chapitre III

34

Chapitre III

Variation génotypique des activités enzymatiques nodulaires (Acide

phosphatase et Tréhalose 6 phosphate phosphatasease) chez certains

cultivars de haricot (P. vulgaris) cultivés sous la contrainte saline.

I. Introduction

Dans le chapitre précédent, l’étude a porté sur l’analyse de l'effet de la contrainte saline

sur la croissance, la fixation de l’azote, l'accumulation des éléments minéraux et les activités

enzymatiques PEPC et MDH. Par ailleurs, d’autres mécanismes biochimiques et

physiologiques tels que l'accumulation d'osmolytes compatibles (Zhu, 2002 ; Parida et Das,

2005) sont mis en œuvre pour protéger les processus cellulaires majeurs vis-à-vis du stress

osmotique tels que la respiration cellulaire, l'activité photosynthétique, le transport des

éléments minéraux, la fixation de l'azote et le métabolisme carboné.

L’activité phosphatase acide (APase, EC 3.1.3.2) contribue dans la tolérance à la

contrainte saline par le maintien d’un niveau élevé de phosphate inorganique qui peut être co-

transporté avec le H+ le long d'un gradient de la force proton motrice (Olmos et Hellin, 1997).

La TPPase est une enzyme qui catalyse la réaction chimique (alpha,alpha-trehalose 6-

phosphate + H2O alpha,alpha-trehalose + phosphate) (Cabib et Leloir, 1958). Un produit de

cette réaction est le tréhalose. Cette dernière molécule joue un rôle important dans la

stabilisation des enzymes déshydratées et les membranes ainsi que la protection des structures

biologiques contre les dommages de dessiccation (Lopez et al., 2008b).

Dans ce chapitre nous nous sommes intéressés à l’analyse de l'effet du stress salin sur la

croissance et la nodulation des plantes chez certaines combinaisons symbiotiques haricot-

rhizobia. Notre étude a été focalisée sur les variations des activités enzymatiques des

phosphatases acides (APase, EC 3.1.3.2), la tréhalose 6-phosphate phosphatase (TPP, CE

3.1.3.12) nodulaires et la transcription du gène APase in situ dans ces organes.

.

Chapitre III

35


1. Culture de haricot en système hydroponique aéré

Le matériel végétal ayant fait l’objet de cette étude est constitué de 4 génotypes de

haricot qui sont les lignées 83, 104, 115 et 147. Ces quatre lignées recombinantes ont été

sélectionnées dans le cadre d’une coopération entre le CIAT et l'INRA-Montpellier (France)

et nous ont été fournies par cette dernière.

Sous des conditions aseptiques, les graines des différents génotypes ont été mises à

germer sur papier filtre. La germination a été effectuée à l’étuve à 28°C pendant 96 h.

L’inoculation a été réalisée en boite de Pétri en imprégnant les racines des différentes

plantules dans l’inoculum bactérien liquide de la souche locale RhM11 ou la souche

Rhizobium tropici CIAT899 comme souche de référence préalablement incubée et multipliée

pendant 48 h à 28°C. La conduite des essais a été effectuée sous serre en hydroaéroponie en

solution nutritive (MgSO4 (100 μM), K2SO4 (700 μM), CaCl2 (1650 μM), Fe-EDTA (16 μM),

MnCl2 (4 μM), H3BO3 (22 μM), ZnSO4 (0.4 μM), NaMoO4 (0.05 μM), et CuSO4 (1.6 μM)).

Cette solution est renouvelée chaque semaine et a été additionnée de 2 mM d’urée au cours

des deux premières semaines seulement. Dès la troisième semaine, le stress salin a été

appliqué par addition de NaCl à une concentration finale de 25 mmol pour le lot stressé

(Figure III.1) (Vadez et al. 1996). Les plantes ont été ensuite transférées dans des bouteilles

de volume d’un litre, et enrobées par du papier aluminium, pour une culture individuelle. De

même, dans les bouteilles, la solution nutritive est renouvelée chaque semaine sans apport

d’urée (Figure III.1).

Figure III.1: Dispositif expérimental de la culture hydroaéroponique en bacs et en bouteilles

du haricot sous serre.

Chapitre III

36

2. Détermination de la biomasse de la partie aérienne, racinaire et nodulaire

La récolte des plantes a été effectuée au stade de floraison des plantes de haricot. Les

biomasses des parties aériennes, des racines et des nodosités ont été déterminées. L’ensemble

de ces mesures ont été effectuées comme décrit dans le chapitre II (Cf paragraphe II. 2 page

22).

3. Préparation des extraits et dosages enzymatiques

3.1. Dosage de l’activité APase

Les phosphatases acides (APase) désignent les enzymes qui catalysent l’hydrolyse des

liaisons ester phosphorique pour libérer l’ortho-phosphate. Pour leurs extractions, 0.2 g des

nodosités fraiches et de taille homogène (3 à 5mm) ont été broyées dans un tube eppendorf

contenant 500 µl du tampon d’extraction d’acétate de Na (0.1 M, pH 5,6), 33 % du PVP et 5

µl de β-mercaptoéthanol. Les broyats obtenus ont été centrifugés (13000g) à 4°C pendant 30

min. Les surnageants ont été récupérés et utilisés pour le dosage des activités APase. Toutes

ces opérations ont été menées à 4°C. L’activité APase a été déterminée dans le surnageant en

utilisant comme substrat, le para-nitrophényl phosphate (pNPP) (5 mM). L’APase réagit avec

le pNPP pour libérer une molécule de Pi en produisant le para-nitrophénol (PNP) de

coloration jaune. Après 30 min d’incubation à 30°C, la réaction est arrêtée en ajoutant dans le

milieu réactionnel 1 ml de NaOH (0.5 N). Cette dernière réagit avec le PNP pour donner le

para-nitrophénolate coloré en jaune. L’activité de l’APase est déterminée par la mesure de la

formation de la para-nitrophénolate à 410 nm. L’activité enzymatique de l’APase a été

exprimée en nmole de PNP produit par min par g matière fraîche nodulaire.

3.2. Dosage de l’activité TPPase

Des extraits ont été préparés par homogénéisation de 0,2 g de nodules frais dans un

mortier avec 33% de PVP (p/p) et 2 ml de 50 mM tampon Tris-HCl (pH 7,5) contenant 2,5

mM de MgCl2, 100 mM de NaCl et 10 mM β-mercaptoéthanol. Les broyats obtenus ont été

centrifugés à 30000g pendant 30 min à 4°C. Les surnageants ont été récupérés et utilisés pour

le dosage des TPPase. Toutes ces opérations ont été menées à 4°C. L'activité TPPase a été

dosée par la libération de phosphate de surveillance du tréhalose 6-phosphate (Padilla et al.,

2004). La réaction a été effectuée dans un volume final de 0,25 ml, contenant 25 mM Tris-

HCl (pH 7,0), 10 mM de MgCl2 et 1 mM de tréhalose-6-phosphate. Les échantillons ont été

utilisés pour le dosage de phosphate selon la méthode de vert de malachite (Ohno et Zibilske,

1991). L’activité TPPase a été mesurée par le dosage du Pi libéré à partir du tréhalose-6P

Chapitre III

37

(Padilla et al., 2004). L’activité TPPase a été ensuite exprimée en µmole de P libéré par min

par g de nodules frais.

4. Hybridation in situ du transcrit de l’acide phosphatase (APase)

4.1. Préparation des sections de nodosités

Pour la RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) in situ, des nodosités de

3 à 5 mm ont été récoltées 5 semaines après inoculation et lavées dans de l’eau traitée au

pyro-carbonate di-éthylique (DEPC) (1 ml. l-1

). Les deux extrémités des nodosités ont été

excisées selon l’orientation transversale par rapport à la racine afin d’exposer directement la

zone infectée et le cortex au fixateur à température ambiante pendant 2 h sous vide dans un

fixateur (Paraformaldéhyde (PFA) 4%, éthanol 45°C, acide acétique 5%) (Van Aarle et al.,

2007). Les nodosités ont été conservées toute la nuit à 4°C dans le fixateur. Par la suite elles

ont été lavées 2 fois pendant 5 min puis 2 fois pendant 10 min dans de l’eau traitée au DEPC

avant d’être inclus dans l’agarose à température de fusion et de gélification basse (Agarose

low meling) 9% dans du PBS (Na2HPO4 25 mmol. l-1

, NaCl 0,65 mmol. l-1

, pH 7,5) (Cellier et

al., 2004). Des sections de 50 µm ont été réalisées avec un vibratome. Elles ont été lavées 3

fois à l’eau traitée au DEPC à 65°C et conservées dans 20 µl à température ambiante.

4.2. RT- PCR in situ

La RT PCR a été réalisée avec des amorces spécifiques du gène étudié. Il a été ajouté aux

20 µl contenant les sections de nodosités, 19 µl de mélange de transcriptase inverse réalisé

avec le tampon de la Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) Reverse Transcriptase de

Promega. L’amorce reverse (0,3 nmol. µl-1

), des dNTP (1 nmol. µl-1

) selon les

recommandations du fournisseur. Ces 39 µl ont été incubés 2 min à 65°C. La MMLV

transcriptase (5 U. µl-1

) reverseR a été ajoutée après que les tubes aient été incubés 2 min dans

la glace. Les tubes ont été incubés 1 h à 42°C dans le thermocycleur. Les coupes ont été

lavées 3 fois avec 100 µl d’eau DEPC en agitation puis conservées dans 20 µl d’eau traitée au

DEPC. Un mélange PCR avec amorce reverse (0,1 nmol. µl-1

) primer dir (0,1 nmol. µl-1

),

dNTP (1 nmol µl-1

), DIG-dUTP (0,1 nmol µl-1

) (Roche, basel, Switzerland) et la taq polyR

0,125 U. µl-1

(Invitrogen, Carlsbad, USA) en condition du fournisseur ont été ajoutés aux 20

µl des sections nodulaires. Un cycle PCR (30 cycles) a été réalisé ; 95°C pendant 30 s; 55°C

pendant 30 s; 72°C pendant 45 s, 72°C pendant 2 min. Un contrôle négatif a été réalisé sans

transcriptase reverse. Après la PCR, les coupes nodulaires ont été rincées 3 fois avec 200 µl

du PBS sous agitation puis incubées 30 min sous agitation dans 100 µl de tampon de blocage

(PBS additionné de BSA 2%, triton 0,3%) et conservées à 4°C toute la nuit. La solution de

Chapitre III

38

blocage a été remplacée par 100 µl de tampon Alcaline phosphatase (BSA 2%, PBS triton

03%, anti-Dig (75 U. µl-1

) (Roche, basel, Switzerland). Les coupes ont été incubées dans le

tampon AP durant 1 h 30 mn à l’obscurité à température ambiante puis rincées 3 fois avec du

PBS.

Le kit de détection ELF-97R « endogenous phosphatase detection kitR » (Molecular

Probes, Leiden, the Netherlands) a été utilisé pour détecter la phosphatase alcaline conjuguée

à l’anti-Dig. Cette méthode a été mise au point pour avoir une sensibilité élevée de la

détection de phosphatase en comparaison avec des méthodes basées sur les sels de tétrazolium

et leurs précipités (Van Aarle et al., 2007). Le substrat (dilué et filtré) a été ajouté aux coupes

nodulaires à raison de 40 µl par tube. Les coupes ont été incubées 20 mn à l’obscurité puis

lavées 3 fois 10 min avec du tampon d’arrêt (PBS, EDTA 25 mmol. l-1

, Lévamisol 5 mmol. l-1

à pH 8) avant d’être montés sur lames pour microscope à épifluorescence d’une lampe au

mercure. Le filtre utilisé permet de visualiser des longueurs d’ondes d’excitation à 360 nm et

d’émission à 420 nm. Les images ont été prises avec la caméra noir et blanc puis traités par le

logiciel de traitement d’images (Image J) Soft Imaging system.

5. Analyse statistique

Le dispositif expérimental adopté étant en blocs aléatoires complets. Les valeurs des

paramètres de croissance représentent les moyennes de sept répétitions par traitement et les

valeurs des autres paramètres étudiés représentent les moyennes de trois répétitions par

traitement. L’analyse des données a été réalisée par ANOVA à deux facteurs. Les

comparaisons entre les différentes moyennes ont été effectuées par le test LSD à 5% de

probabilité en utilisant CoStat. L'erreur standard (ES) et les coefficients de corrélation ont

également été calculés.

III. Résultats

1. Paramètres de croissance des plantes

Pour les symbioses témoins, les combinaisons symbiotiques 83-CIAT899, 104-CIAT899

et 104-RhM11, ont exprimé un poids sec élevé de la partie aérienne (PSA) et qui a atteint 2,4

g par plante. La combinaison symbiotique 115-CIAT899 a présenté un faible PSA qui a été

inférieur à 2 g par plante (Figure III.2A). L'ajout de 25 mM de NaCl à la solution nutritive, a

réduit de façon significative le PSA chez les combinaisons symbiotiques 83-CIAT899, 104-

RhM11 et 147-RhM11 respectivement de 57, 15 et 40% par rapport à leurs témoins

correspondants. Les autres combinaisons symbiotiques n’ont montré aucune variation

Chapitre III

39

significative de croissance sous traitement salin à l'exception de 83-RhM11 chez laquelle la

salinité a provoqué une augmentation significative de ce paramètre (Figure III.2A).

L’analyse des données du poids sec racinaire (PSR) (Figure III. 2B) et du poids sec

nodulaire (PSN) (Figure III. 2C) a montré que l'effet du traitement salin sur ces deux

paramètres n'a montré aucune variation régulière ou significative chez toutes les

combinaisons symbiotiques testées à l'exception de 83-CIAT899 dans laquelle il a causé une

réduction significative sur ces deux paramètres PSR (47%) et PSN (52%) alors que chez 104-

RhM11 cette contrainte a provoqué une augmentation significative de ces paramètres (Figures

III 2B and C).

Figure III. 2: Effet de la salinité sur les paramètres de croissance: (A) le poids sec

aérienne (PSA, g MS), (B) le poids sec racinaire (PSR, g MS), (C) le poids sec nodulaire

(PSN, g MS), chez quatre génotypes de P. vulgaris inoculées avec des différents souches de

rhizobia (CIAT899 ou RhM11). Les bars avec la même lettre ne sont pas différentes

significativement (P ≤ 0,05), en utilisant le test LSD.

Chapitre III

40

2. Effet de NaCl sur les activités enzymatiques phosphatase acide (APase) et tréhalose

phosphate phosphatase (TPPase)

En absence du NaCl, les nodules de la majorité des associations symbiotiques testées ont

montré de fortes activités APase qui ont dépassé 1000 nmol min-1

g-1

FM (Figure III. 3A). La

contrainte saline a induit une diminution significative de l'activité APase nodulaire chez tous

les génotypes de haricot inoculés avec CIAT899. Cette diminution n'a pas été significative

lorsque les plantes ont été inoculées avec RhM11 sauf pour la combinaison symbiotique 147-

RhM11 chez laquelle nous avons noté une réduction de 26% par rapport au témoin. Sous

traitement salin, l'activité APase nodulaire des associations symbiotiques 147-CIAT899 et

115-CIAT899 a été plus affectée et nous avons enregistré des réductions de 24% et 34%

respectivement par rapport à leurs témoins correspondants (Figure III. 3A).

Pour les symbioses témoins, les nodules de 147-RhM11 ont présenté une activité TPPase

élevée suivie par celles du génotype 83 inoculés avec CIAT899 ou avec RhM11. La

combinaison symbiotique 104-RhM11 a présenté la plus faible activité TPPase nodulaire qui

n’a pas dépassé 100 nmol. min-1

. g-1

FM (Figure III. 3B). Généralement, le traitement salin a

causé une réduction de l’activité TPPase dans les nodules des combinaisons symbiotiques

testées. Toutefois, cette réduction n’a été significative que pour les nodules des combinaisons

symbiotiques 83-CIAT899, 83-RhM11 et 147-RhM11 avec des pourcentages de réduction

plus prononcés et qui ont atteint 30.5%, 34.5% et 28% respectivement (Figure III. 3B).

La figure III. 4 a montré la relation entre l’activité APase nodulaire et l'activité TPPase

nodulaire pour quatre lignées recombinantes (83, 104, 115 et 147) inoculés avec la CIAT 899

(Figures III. 4A, B & C) ou RhM11 (Figure III. 4D, E & F) sous traitement avec ou sans NaCl

(0 et 25 mM de NaCl). Nous avons noté une corrélation positive (r = 0,6) entre l’activité

APase nodulaire et l'activité TPPase nodulaire pour toutes les lignées recombinantes. A partir

de cette corrélation obtenue, nous pouvons déduire qu'une augmentation de l'activité de

TPPase est associée à une augmentation de l’activité APase nodulaire chez les lignées

étudiées sous traitement avec ou sans sels.

Chapitre III

41

Figure III. 3: Effet de la salinité sur les activités enzymatiques nodulaire: A; acide

phosphatase (APase, nmol min-1

g MF-1

) and B; Tréhalose 6-phosphate phosphatase (TPPase,

nmol. min-1

. g MF-1

) chez quatre génotypes de Phaseolus vulgaris inoculées avec des

différents souches de rhizobia (CIAT899 ou RhM11). Les bars avec la même lettre ne sont

pas différentes significativement (P ≤ 0,05), en utilisant le test LSD.

Figure III 4: La dépendance de l’activité APase nodulaire en fonction de l'activité

TPPase nodulaire de quatre génotypes de haricot (A&E: 83 ; B&F: 104 ; C&G: 115 et D&H:

147) inoculés avec le CIAT 899 (A, B, C et D) ou RhM11 (E, F, G et H) cultivés sans et avec

25 mM de NaCl. Les données sont les moyens de six répétitions.

Chapitre III

42

3. Hybridation in situ du transcrit de l’acide phosphatase (APase)

Pour tester la transférabilité de l'information entre les profils Uni-Tag et d'autres

plateformes, des transcrits des nodules sélectionnés, ont été localisés dans les nodules de

haricot. Pour cet objectif, in situ PCR de l’UniTags de la phosphatase acide a été effectuée

dans des coupes de nodules. Les principales caractéristiques de l'anatomie des nodules haricot

sont illustrées dans la figure III.5.

Les transcrits du gène de la phosphatase acide se sont montrés abondants dans le cortex

externe et à faible intensité dans le cortex interne et dans la zone infectée des nodosités issues

sous traitement témoin et stressé (Figures III. 6B et C). La figure III.6C a montré clairement

que, sous traitement salin, un niveau élevé de l’ADNc de l’APase a été détecté dans le cortex

externe. Nous notons que les contrôles négatifs n'ont montré aucun signal fluorescent (Figure

III.6A). Les nodules stressés de la combinaison symbiotique 115-CIAT899, ont montré un

signal fluorescent faible en comparaison avec celui obtenu chez les nodules du témoin. Ce

résultat prouve que l’expression du gène de la phosphatase acide a été fortement réduite par le

traitement salin. En revanche, les nodules de la combinaison symbiotique 147-CIAT899 ont

montré un signal fluorescent important chez les nodules des témoins et même chez celles

issues de symbioses soumises au traitement salin (Figure III.6).

Figure III. 5: Coupe transversale d'un nodule de haricot. Abréviations: (INF) zone infectée,

(E) endoderme, (VT) trace vasculaire, (IC) cortex interne, (OC) cortex externe.

Chapitre III

43

Figure III. 6: Localisation in situ des isoformes des transcrits de la phosphatase acide dans

les nodules des combinaisons symbiotiques 115-CIAT899 et 147-CIAT899. A) Témoins sans

transcription inverse, B) Nodules des plantes non stressées, C) Nodules des plantes stressées.

IV. Discussion

En général, le stress salin a induit une diminution de la croissance des plantes et des

processus de développement (Sairam et Tyagi, 2004). Néanmoins, il est connu que les plantes

ont une gamme de stratégies morphologiques et physiologiques qui leur permettent de

survivre dans des conditions de stress salin. La capacité d'adaptation à la salinité peut varier

considérablement entre les génotypes.

Nos résultats ont montré que sous les conditions symbiotiques, la réaction de la plante

hôte à la salinité varie selon le génotype et la souche de rhizobia utilisée pour l'inoculation

(RhM11 ou CIAT 899).

À cet égard, le traitement salin a affecté la nodulation des plantes du haricot chez la

majorité des combinaisons symbiotiques testées à l'exception de la lignée 83 inoculées avec la

souche RhM11. Sous traitement salin, le poids sec nodulaire de la ligne 104 inoculées avec

RhM11 a augmenté significativement par rapport au témoin correspondant. Dans notre travail,

la biomasse des nodules a représenté environ 8% de la biomasse de la plante entière. Cette

valeur est comparable aux résultats publiés pour d’autres génotypes de haricot (Tang et al.,

2001 ; Kouas et al., 2005). La salinité n’a pas affecté, le PSA des plantes chez la plupart des

combinaisons testées à l’exception des symbioses 83-CIAT899 et 147-RhM11 pour lesquels

ce paramètre a été réduit (Figure III. 2A). La proportion de la masse allouée à la partie

Chapitre III

44

aérienne a diminué de 74% (témoin) à 69% (stressé) et cette proportion a augmenté pour les

racines de 19% à 22%. En se basant sur ces observations, la partie aérienne a été plus sensible

à la salinité que la partie racinaire. Ce résultat est en accord avec des conclusions antérieurs

rapportées chez d'autres génotypes de légumineuses à graines comme Cicer arietinum (Soussi

et al., 1998) et P. vulgaris (Tejera et al., 2004a ; Lopez et al., 2006).

Très peu d'études antérieures sont disponibles sur l'activité APase nodulaire en particulier

sous stress salin. Les valeurs que nous avons obtenu pour les témoins (0 mM de NaCl),

peuvent être comparées à celles obtenues par Adelson et al., (2008) et Mandri et al., (2011)

pour des nodules des plantes de haricot cultivées sous suffisance en phosphore. Les résultats

de dosage biochimique de l'activité APase sont cohérents avec les résultats d’hybridation in

situ du transcrit du gène de la phosphatase acide. Les activités enzymatiques déterminées dans

les extraits nodulaires dans notre travail, ainsi que dans les autres études antérieures de

Penheiter et al., (1997) et Tejera et al., (2004a), ne permettent pas de déduire si cette activité

enzymatique correspond à des APases végétales ou rhizobiennes ou les deux au même temps.

Nos valeurs de l'activité TPPase ont représenté 1/10 de celles rapportées par Lopez et al.,

(2006) dans les nodules des plantes de haricots cultivées avec ou sans NaCl en utilisant le

système des jars de Leonard. L’activité TPPase nodulaire est restée pratiquement stable entre

les deux niveaux de salinité (0 et 25 mM de NaCl) et elle a montré une corrélation positive (r

= 0,6) avec l'activité APase nodulaire. Lopez et al., (2006) ont également observé que

l'activité du TPPase dans les nodules de haricot a été moins affectée par la salinité. Sous

stress salin, l'activité APase est connue pour sa contribution à la résistance en maintenant un

niveau élevé de phosphate inorganique qui peut être co-transportés avec H+ le long d'un

gradient de la force proton motrice (Olmos et Hellin, 1997).

V. Conclusion

En général, l'inoculation avec la souche RhM11 a amélioré les activités enzymatiques

nodulaires chez les lignes testés sous les deux traitements avec ou sans NaCl par rapport à des

plantes inoculées avec le CIAT 899. Et que le stress salin a provoqué une répression de

l’expression du transcrits du gène encode le phophatase acide et que son expression est

abondante au niveau du cortex externe et faible au niveau du cortex interne et la zone infecté.

Chapitre IV

45

Chapitre IV

Effet de la contrainte saline sur le métabolisme oxydatif au niveau des

feuilles et des nodosités chez la symbiose P. vulgaris-rhizobia.

I. Introduction

Dans les chapitres précédents, les résultats obtenus ont montré que la salinité a

négativement affecté la majorité des paramètres étudiés. Malgré ça, nous constatons que

l’inoculation avec les souches locales de rhizobia pourrait compenser, au moins partiellement,

la perte d'efficacité nodulaire. Dans le présent chapitre, nous avons étudié l’effet de

l’inoculation naturelle sous serre en utilisant des sols provenant de la région du Haouz. Nous

nous sommes intéressés à l’effet de la salinité sur le métabolisme oxydatif nodulaire.

Bien que les légumineuses nodulées ont développé plusieurs stratégies adaptatives face

aux contraintes abiotiques représentées essentiellement par la sécheresse, les déficiences

nutritionnelles et la salinité, il demeure encore incompréhensible pour quels objectifs les

nodosités pourraient s’approvisionner d’un arsenal antioxydant aussi important. Ainsi, dans la

littérature, une relation étroite entre l'augmentation des activités des enzymes antioxydantes et

la tolérance aux contraintes environnementales a été mise en évidence (Bor et al., 2003 ;

Demiral et al., 2005 ; Turkan et al., 2005). Cette tolérance fait intervenir des mécanismes de

défense aux contraintes impliquant des enzymes antioxydantes et des composés antioxydants

de faible poids moléculaire (Mittler, 2002 ; Foyer et al., 2005) qui ont démontré , in vivo,

l’existence d'une relation directe avec le déclin de la FSA (Marino et al., 2007). En outre, la

majorité des contraintes abiotiques, y compris le stress salin, induisent un déséquilibre du

métabolisme oxydatif, provoquent des altérations dans les composantes de la membrane

mitochondriale et limitent le transport des électrons à travers la chaîne respiratoire des

cytochromes (Juszczuk et al., 2001) et par la suite causent l'accumulation des radicaux libres

d'oxygène (Wang et al., 2009). En dépit de l’ensemble des résultats disponibles concernant

l’effet de cette contrainte sur le métabolisme oxydatif des plantes légumineuses, les rapports

examinant son impact sur le métabolisme oxydatif nodulaire restent limités. Par conséquence,

l’objectif de cette étude réalisée sous serre est d’analyser l’impact de la salinité des sols sur

certains aspects du métabolisme oxydatif des nodosités et des feuilles de plusieurs

combinaisons symbiotiques P. vulgaris-rhizobia. Il s’agit d'examiner, le degré d’émergence

du stress oxydatif dans ces organes des plantes nodulées en analysant l’état de l’intégrité

membranaire nodulaire et foliaire à travers l’évaluation du niveau de la peroxydation des

Chapitre IV

46

lipides membranaires (MDA), les phénols totaux, le taux du peroxyde d'hydrogène ainsi que

l’analyse de l'activité de la peroxydase (PO), les poly-phénols oxydases (PPO), les

superoxydes dismutases (SOD) et la catalase (CAT).


1. Installation et conduite de la culture sous serre

Cette expérience a été menée sous serre, au laboratoire de Biotechnologie Végétale et

Agro-physiologie des Symbioses à la FST de Marrakech. Les essais ont été réalisés dans des

pots en plastique ayant des dimensions de 30 cm de diamètre et 30 cm de hauteur et d’une

capacité de 5 kg perforés à leurs bases (Figure IV.1). Les pots ont été d’abords désinfectés par

trempage dans un bain d’hypochlorite de sodium pendant une nuit, ensuite lavés

abondamment à l’eau distillée.

Les semences des deux génotypes de haricot, Flamingo et Efequince ont été stérilisées

dans de l’hypochlorite de calcium à 6% pendant 5 min, rincées plusieurs fois à l’eau distillée

stérile et mises en germination dans des pots en plastique, contenant 5 kg du sol agricole non

stérilisé ou d’autres pots contenant du sol agricole stérile (afin d’éliminer l’effet d’inoculation

naturelle). Ces sols ont été prélevés de la région de Haouz. Ce sol a une conductivité

électrique de 1.78 mmhos cm-1

et il contient 1.09 g. Kg-1

en azote total.

Après l’émergence des cotylédons, le nombre de plantules a été ajusté à raison de 6

plantules par pot. Les plantes cultivées dans le sol non stérilisé, ont été subdivisées en trois

blocs, deux blocs ont été inoculés soit avec CIAT899 ou soit avec RhM11 en déposant 5ml

d’inoculum bactérien (approximativement 109 cellules ml

-1) sur les racines de chaque plante

et le troisième bloc a été resté sans inoculation. Après une semaine de culture, une deuxième

inoculation a été appliquée avec la même quantité de l’inoculum précédemment utilisé. Après

le 15ème jour de la mise en germination, les pots contenant les plantes ont été répartis en

blocs aléatoires. Les plantes ont été irriguées soit par de l’eau distillée (Témoin, 0mM NaCl)

ou par une solution de NaCl à 25 mM comme traitement salin. Deux pots (12 plantes) ont été

considérés par traitement et par cultivar et chaque plante correspond à une répétition.

Chapitre IV

47

Figure IV.1 : Dispositif expérimental de la culture semi-hydroponique du haricot sous serre.

(A) plantes de haricot à la première semaine après l’application de NaCl. (B) plantes de

haricot au stade floraison.

2. Evaluation de l’essai :

2.1. Paramètres de croissance et de nodulation

La récolte des plantes a été effectuée 42 jours après la mise en germination, coïncidant

avec le stade de floraison des plantes de haricot. Les biomasses des parties aériennes, des

racines et des nodosités ont été déterminées. L’ensemble de ces mesures ont été effectuées

comme décrit dans le chapitre II (Cf paragraphe II. 2 page 22).

2.2. Teneur de la partie aérienne des plantes et des nodosités en MDA

Le niveau de peroxydation des lipides dans les tissus de nodosités et feuilles, a été

déterminé en estimant les teneurs en dialdéhyde malonique (MDA) selon la méthode décrite

par Heath et Packer (1968). Une prise d’essai de 100 mg de nodosités ou de feuilles a été

broyée dans 0,5 ml de TCA (10%). L’homogénat a ensuite été additionné de 0,5 ml d’acétone

puis centrifugé à 8000 g pendant 15 min. A 500 µl de l’extrait MDA, nous avons ajouté 1ml

d’acide phosphorique (H3PO4) et 1 ml de TBA (0.6%). Ensuite, le mélange a été porté en

agitation puis chauffé à 95°C pendant 30 min. A la sortie du bain-marie, la réaction a été

stoppée par un bain de glace puis ajouté de 1,5 ml du 1-butanol suivie d’une centrifugation à

8000 g pendant 15 min. La couche butanolique ainsi obtenue a été récupérée afin de lire son

absorbance à 532 nm. Le contenu en substances réactives à l’acide thiobarbiturique a été

exprimé en µmol MDA par g du poids frais en se référant au coefficient d’extinction

moléculaire du complexe MDA-TBA : 155 mM−1

cm−1

.

2.3. Teneur des feuilles et nodosités en H2O2

La teneur nodulaire et foliaire en H2O2 a été déterminée selon la méthode de Velikova et

al. (2000). Un aliquote de 100 mg d’échantillon nodulaire ou foliaire, a été broyé dans 2 ml de

TCA (20%) puis centrifugé à 15000 g pendant 15 min à 4°C. Les surnageants ont été ensuite

Chapitre IV

48

récupérés pour déterminer la teneur de ces extraits en H2O2. A 0,5 ml de l’extrait a été ajouté

0,5 ml du tampon phosphate potassique (10 mM, pH 7) et 1 ml du potassium iodique 1 M. la

DO a été ensuite déterminée à 390 nm après 1h d’incubation à l’obscurité. La teneur en H2O2

a été exprimée en µmol H2O2 par g du poids frais en référence à une gamme étalon établie

dans les mêmes conditions avec des concentrations connues de H2O2.

2.4. Dosage de l’activité PO, PPO et SOD

L’extraction consiste à broyer 100 mg de disques foliaires ou des nodosités de même taille

dans 1,5 ml de tampon phosphaté (0.1 M, pH 6) contenant 5% de polyvinylpolypyrolidone

(PVP) (Tejera et al., 2004a). Le surnageant récupéré après agitation et centrifugation du

broyat à 12000 g pendant 30 min, a constitué l’extrait enzymatique.

La réaction peroxydasique a été réalisée à 30 °C. Le mélange réactionnel contient 100 µl

de l'extrait enzymatique, 300 µl de gaïacol 20 mM et 2 ml de tampon phosphate (0.1 M, pH

6). La réaction est déclenchée par addition de 200 µl de l'eau oxygénée (H2O2) puis la

cinétique de formation du tétragaiacol a été suivie par spectrophotométrie à 470 nm (Hori et

al., 1997).

Le milieu réactionnel conçu pour le dosage de l’activité des PPO contient 500 µl de la

catéchol (1.6%) dans le tampon phosphate (0.1 M, pH 6). La réaction a été amorcée par

addition de 100 µl d’extrait enzymatique et s’est étendu durant 3 min à température ambiante,

par la suite l'absorbance a été lue à 410 nm (Hori et al., 1997).

L’activité de la PO et PPO a été définit en étant la quantité d’enzyme utilisé pour

l’oxydation de 1 µmol de Gaïacol ou du catéchol par mg de protéine par min.

L’activité de la SOD est déterminée à partir de la capacité de cette enzyme d’inhiber la

réduction du nitro blue tetrazolium par les radicaux libre superoxyde, générés en milieu de

réaction par la photo-réduction de la riboflavine (Iordachescu, 1988). Le dosage est

colorimétrique à 560 nm.

Le dosage des protéines a été réalisé par la méthode de Bradford (1976). 2 ml d’extraits

enzymatiques dilués ont été prélevés dans des tubes et additionnés de 2 ml du réactif de

Bradford. Après agitation suivie d’un repos de 4 min à température ambiante, la densité

optique (DO) a été mesurée à 595 nm. Les quantités de protéines ont été déterminées en

utilisant une gamme étalon établie par des solutions de sérum albuminé du bovin (SAB).

2.5. Dosage de l’activité CAT

L’activité catalase a été déterminée selon la méthode décrite par Gong et al. (2001). Un

aliquote de 100 mg d’échantillon nodulaire ou foliaire frais a été homogénéisé dans 5 ml de

Chapitre IV

49

tampon Tris-HCl (pH 8.5) contenant 2 mM d’EDTA, 10% de PVP (p/v). L'homogénat a été

centrifugé à 16 000 rpm pendant 14 min à 4° C. Le surnageant a été utilisé pour la mesure de

l'activité. L'activité CAT a été déterminée par suivi de la disparition de H2O2 dans le mélange

réactionnel (Brennan et Frenkel, 1977 ; Du et Bramlage, 1995). L'extrait d'enzyme a été

ajouté à 2 ml de mélange réactionnel (50 mM de tampon Tris-HCl pH 6.8, contenant 5 mM

H2O2). La réaction a été stoppée par l’addition de 0.25 ml de 20% de tétrachlorure Titanic

après 10 min à 20°C. Un blanc a été préparé par addition de 0.25 ml de tétrachlorure de titane

de 20% au temps zéro afin d'arrêter la réaction enzymatique. L'absorbance des solutions de

réaction a été lue à 415 nm. L'activité de la CAT a été exprimée en µmol H2O2 mg-1

de

protéine min-1

.

2.6. Teneur de la partie aérienne des plantes et nodosités en poly-phénols

Le dosage des composés phénoliques a été réalisé selon la méthode de Folin-Ciocalteu

(Macheix, 1974). L’extraction des phénols totaux nodulaire et foliaire a été réalisée à 4°C

dans 1.5 ml du méthanol (80%). L’extrait a été centrifugé pendant 10 min à 4°C. 0.5 ml du

surnageant a été ensuite transféré dans un tube de 5 ml et additionné de 1 ml d’éthanol (95%),

2.5 ml d’eau distillée et 0.25 ml du réactif Folin-Ciocalteu. Après 5 min d’incubation, 1 ml de

carbonate de sodium (20%) a été ajouté. Le mélange a été immédiatement agité puis incubé à

l’obscurité pendant 1 h à 40°C. En suite la DO des échantillons a été déterminée à 760 nm. La

teneur en composés phénoliques a été exprimée en µg équivalent en acide gallique par mg de

poids frais en référence à une gamme étalon établie dans les mêmes conditions avec des

solutions standard d’acide gallique (El Modafar et al., 1996).

III. Résultats

1. Effet de NaCl sur la croissance et la nodulation des plantes

Les résultats du poids sec aérien (PSA) (Tableau IV.1) ont montré que les biomasses

obtenues chez la majorité des combinaisons symbiotiques étudiées ont montré une réduction

de ce paramètre sous traitement salin. Pour les témoins (0 mM NaCl), le PSA le plus élevé a

été enregistrée chez les combinaisons CIAT899-Efequince et RhM11-Efequince. Cependant,

les valeurs les plus basses en termes de PSA ont été notées en absence de symbiose

rhizobienne (st-Flamingo et st-Efequince). Les plantes non inoculées (Sol-Efequince et Sol-

Flamingo) par rhizobia ont présenté un PSA moyen. L’application du traitement salin a

engendré une réduction significative du PSA chez la majorité des combinaisons. En effet, les

grandes réductions, par rapport aux témoins, ont été observées chez la combinaison

Chapitre IV

50

Flamingo-rhizobia naturel (64%) et la variété Efequince inoculée par RhM11 (54%) et par

CIAT899 (38%).

L’analyse statistique des valeurs obtenues du PSR a montré que l’effet du traitement salin

sur ce paramètre n’est pas significatif. Des valeurs relativement élevées du PSR ont été

obtenues chez la combinaison symbiotique RhM11-Efequince sans application de traitement

salin et puis RhM11-Flamingo sous traitement salin. Considérant l'ensemble des

combinaisons symbiotiques, le PSR a été influencée significativement par l’inoculation

(Tableau IV.1).

Le poids sec nodulaires (PSN) n’a pas présenté de différences significatives entre les

différentes combinaisons symbiotiques testées soit en absence ou en présence du traitement

salin (Tableau IV.1). Par ailleurs, les combinaisons RhM11-Efequince et CIAT899-Flamingo

ont montré une bonne production de PSN en absence du NaCl par rapport aux autres

combinaisons. En général, nous avons constaté une tendance vers la réduction de ce

paramètre, sous traitement salin , chez les combinaisons symbiotiques étudiées en particulier

chez CIAT899-Efequince (53%) et RhM11-Efequince (37%).

Chez les plantes témoins, les combinaisons symbiotiques CIAT899-Efequince et RhM11-

Efequince ont montré un nombre de nodules supérieur à celui des autres combinaisons

symbiotiques testées. L'application de 25 mM de NaCl, a donné des résultats variables selon

la combinaison symbiotique considérée. (Tableau IV.1).

2. Effet de NaCl sur les teneurs en MDA et sur les teneurs en H2O2

Les résultats de la Figure IV.2A montrent qu’au niveau de la partie aérienne, la présence

de NaCl dans le milieu rhizosphérique a déclenché une augmentation de la teneur en MDA

dans la partie aérienne chez la majorité des symbioses et les plantes non nodulées. En effet,

une accumulation significative de ce métabolite a été observée chez les plantes nodulées ou

non de la variété Flamingo. En revanche, chez la variété Efequince les variations des teneurs

en MDA sous stress salin ne sont pas significatives chez les plantes nodulées alors que chez

les plantes non nodulées nous avons noté une augmentation significative. Au niveau de la

partie nodulaire, les variations des teneurs en MDA, sous stress salin, ne sont pas

significatives chez la plupart des combinaisons testées. Particulièrement cette contrainte a

induit une augmentation significative des teneurs en MDA chez CIAT899-Efequince et Sol-

Flamingo pour lesquelles elle a dépassé les 100% (Figure IV.2B).

Chapitre IV

51

Tableau IV.1 : Effet de la salinité sur le poids sec aérien (PSA, g plante), le poids sec racinaire (PSR, g plante),le poids sec nodulaire (PSN, g

plante) et le nombre des nodules, chez les plantes de deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec différents souches de rhizobia.

Souches Génotypes NaCl

(mM)

PSA

(g plante)

PSR

(g plante)

PSN

(g plante)

Nombres

des nodules

CIAT899

Flamingo 0 1,40 bcde 0,20 abcd 0,15 a 74 c

25 1,77 b 0,21 abcd 0,13 ab 94 c

Efequince 0 2,29 a 0,23 abcd 0,13 ab 180 ab

25 1,4 bcde 0,26 abcd 0,06 bc 114 bc

RhM11

Flamingo 0 1,32 cdef 0,26 abc 0,09 abc 72 c

25 0,86 ghi 0,27 ab 0,12 abc 93 c

Efequince 0 2,42 a 0,30 a 0,16 a 214 a

25 1,11 defgh 0,23 abcd 0,10 abc 188 a

Sol

Flamingo 0 1,47 bcd 0,25 abc 0,11 abc 62 c

25 0,52 i 0,19 bcd 0,09 abc 79 c

Efequince 0 1,63 bc 0,23 abcd 0,09 abc 118 bc

25 1,25 cdefg 0,22 abcd 0,05 c 75 c

Sol St

Flamingo 0 1,00 efgh 0,15 cd - -

25 0,95 fghi 0,18 bcd - -

Efequince 0 1,23 cdefgh 0,18 bcd - -

25 0,80 hi 0,14 d - -

Les moyennes suivies par la même lettre dans une colonne ne sont pas significativement différentes (P ≤ 0,05) en utilisant le test LSD.

Chapitre IV

52

Sous l’effet de la salinité, les teneurs des feuilles en H2O2 ont significativement augmenté

chez la majorité des combinaisons symbiotiques testées (Figure IV.2C). Ces augmentations

n’ont pas été significatives pour RhM11-Flamingo et Sol-Efequince. Les plus hautes

augmentations de ce paramètre ont été enregistrées chez les plantes d’Efequince inoculées

par CIAT899 (7,1 fois par rapport leur témoins), par rhizobia du sol (5,4 fois par rapport leur

témoins) et non nodulées (3,4 fois par rapport leur témoins). Pour les nodules, les teneurs

obtenues en H2O2 sont faibles par rapport à celles obtenues enregistrées au niveau des feuilles

(Figure IV.2D). Le traitement salin a induit des augmentations de ce paramètre et qui ne sont

significatives que pour RhM11-Efequince et sol- Flamingo.

Figure IV. 2: Effet de la salinité sur l’accumulation de MDA (A et B) et sur le

contenu en H2O2 (C et D), foliaire (A et C) et nodulaire (B et D), chez deux génotypes de P.

vulgaris inoculées ou non avec des différents souches de rhizobia. Les bars avec la même

lettre ne sont pas significativement différentes (P ≤ 0,05), en utilisant le test LSD.

3. Effet de NaCl sur l’activité des PO, PPO, SOD et CAT

Au niveau de la partie aérienne, l’activité peroxydase n’a pas présenté de variations

importantes entre les témoins des différentes combinaisons symbiotiques testées (Figure

IV.3A). Les plantes témoins de Flamingo, non nodulées, ont montré la plus haute valeur de

l’activité PO qui est de 103.6 µmole H2O2. mg prot-1

.min-1

. La présence de NaCl dans le

milieu rhizosphérique a provoqué une augmentation au niveau de l’activité de cette enzyme

chez la plupart des combinaisons en question. Cependant, ces augmentations ne sont

significatives que pour CIAT899-Efequince, RhM11-Flamingo, RhM11-Efequince et les

Chapitre IV

53

plantes non nodulées des deux variétés. Dans la partie nodulaire (Figure IV.3B) la salinité a

induit une augmentation significative de l’activité PO chez les symbioses CIAT899-

Flamingo, CIAT899-Efequince et RhM11-Efequince. Ces symbioses ont développé l’activité

peroxydasique la plus élevée par rapport à leurs témoins respectifs. Nous notons que les

activités PO enregistrées au niveau des nodules sont très élevées par rapport à celles

enregistrées dans les parties aériennes (Figure IV.3A, B).

L’analyse de la figure IV.3C nous a permis de constater que pour la partie aérienne,

l’application du stress salin a engendré une augmentation significative de l’activité PPO par

rapport aux témoins correspondants chez la plupart des symbioses testées à l’exception de

CIAT899-Flamingo, Sol-Efequince et Flamingo non nodulée. Les réponses des différentes

combinaisons étaient également différentes. En effet, les combinaisons RhM11-Flamingo,

RHM11-Efequince et Flamingo nodulée par les rhizobia natifs du sol ont montré les plus

grandes augmentations par rapport à leurs témoins non stressés respectifs. En ce qui concerne,

la partie nodulaire (Figure IV.3D), la stimulation de l’activité PPO sous stress salin n’est

significative que pour les symbioses CIAT899-Flamingo et CIAT899-Efequince qui ont

montré les plus grandes augmentations. Nous avons noté aussi que les activités PPO au

niveau des nodules sont très élevées par rapport à celles enregistrées au niveau de la partie

aérienne.

Figure IV.3: Effet de la salinité sur l’activité PO (A, B) et PPO (C, D), foliaire (A, C)

et nodulaire (B, D), chez deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec différentes

souches de rhizobia. Les bars avec la même lettre ne sont pas significativement différentes (P

≤ 0,05), en utilisant le test LSD.

Chapitre IV

54

Les résultats illustrés par la Figure IV.4A montrent qu’en présence du NaCl, l’activité

SOD aérienne a présenté de légères variations par rapport aux témoins qui, dans le cas de la

combinaison Sol-Flamingo, est une augmentation significative. Au niveau nodulaire (Figure

IV.4B) le stress salin a induit une importante augmentation significative de l’activité SOD

chez la plupart des combinaisons testées l’exception des plantes nodulées par les rhizobia

natifs du sol. La plus grande augmentation de cette activité a été enregistrée chez la

combinaison CIAT899-Efequince et qui a dépassé les 300%.

L’activité CAT a montré des variations contrastantes entre les deux parties des plantes. En

effet, les valeurs de cette activité enzymatique sont très faibles au niveau de la partie aérienne

par en comparaison avec celles enregistrées dans la partie nodulaire. (Figure IV.4C, D).

L’application du traitement salin a induit une diminution significative de l’activité CAT

foliaire chez les combinaisons symbiotiques CIAT899-Flamingo, RhM11-Flamingo, RhM11-

Efequince et sol-Flamingo (Figure IV.4C). Cette activité a été plus élevée chez ces

combinaisons symbiotiques. L’analyse des résultats a aussi montré que l’activité CAT

nodulaire a été significativement réduite chez toutes les symbioses soumises au traitement

salin, et la plus haute réduction a été enregistrée chez la combinaison CIAT899-Flamingo

(FigureIV.4D).

Figure IV.4: Effet de la salinité sur l’activité SOD (A, B) et CAT (C, D), foliaire (A,

C) et nodulaire (B, D), chez deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec des

différents souches de rhizobia. Les bars avec la même lettre ne sont pas significativement

différentes (P ≤ 0,05), en utilisant le test LSD.

Chapitre IV

55

4. Effet de NaCl sur les teneurs en phénols totaux

Les résultats obtenus en termes du contenu foliaire et nodulaire en phénols totaux ont

montré des variations qui semblent dépendre à la fois de la combinaison symbiotique et du

traitement (Figure IV.5).

La partie aérienne des plantes exposées au traitement salin a présenté des teneurs en

phénols totaux significativement élevées chez les deux symbioses CIAT899-Efequince et

RhM11-Efequince. Cette augmentation était plus importante chez la première symbiose qui a

montré la valeur la plus élevée (69 mg d’acide gallique. gMF-1

) parmi toutes les combinaisons

testées. Toutefois, de l’ensemble des combinaisons symbiotiques testées, sol-Efequince avait

montré la plus faible teneur en phénols totaux foliaires sous stress salin et qui n’a pas varié

par rapport au témoin correspondant (Figure IV.5A).

Similairement à la partie aérienne, ce paramètre a significativement augmenté dans les

nodosités des deux combinaisons symbiotiques (CIAT899-Flamingo et sol-Efequince)

soumises au traitement salin, alors que pour les autres symbioses, les différences étaient

statistiquement non significatives. Considérant l’ensemble des combinaisons symbiotiques

étudiées, sous salinité, il en ressort que ce paramètre s’est élevé d’une valeur moyenne de 24 à

35 mg d’acide gallique gMF-1

dans la partie aérienne et de 10 à 21 mg d’acide gallique gMF-1

dans les nodosités. (Figure IV.5).

Figure IV.5: Effet de la salinité sur le contenu en phénols totaux foliaires (A) et

nodulaires (B), chez deux génotypes de P. vulgaris inoculées ou non avec des différents

souches de rhizobia. Les bars avec la même lettre ne sont pas significativement différentes, en

utilisant le test LSD.

Chapitre IV

56

IV. Discussion

Dans cette étude, les réponses oxydatives se sont montrées variables selon les

combinaisons symbiotiques testées et le traitement considéré. Particulièrement, dans les

nodosités que dans les feuilles, une stimulation du stress anti-oxydatif y était notée sous

traitement salin.

Il ressort de cette étude que le traitement par NaCl a un effet négatif sur les biomasses

aériennes et nodulaires chez les différentes combinaisons symbiotiques étudiées par rapport à

leurs témoins (Tableau IV.1). Ce résultat confirme la sensibilité particulière de la symbiose

haricot-rhizobia à cette contrainte environnementale (Tejera et al., 2004a ; Faghire et al., 2011

; Refik et Ummühan, 2011 ). Saadallah et al. (2001) ont montré que la réduction de la

croissance pondérale est associée à une inhibition de l’initiation et la mise en place des

nodules. Ce comportement est lié à une diminution des sites potentiels d’infection résultant

essentiellement soit de la réduction du nombre et du diamètre des poils absorbants soit encore

de l’inhibition de l’émergence et de l’élongation de ces organes (Zahran et Sprent, 1986).

Cette sensibilité au sel est également décrite chez d’autres légumineuses telles que la

luzerne (Fougère et al., 1991 ; Abdelly et al., 1995), le trèfle (Ben Khaled et al., 2003) et la

fève (Amira et Abdul, 2011).

En général, le stress salin induit chez les plantes nodulées des réponses physiologiques et

biochimiques ayant un rôle crucial dans la réduction des effets nuisibles du stress salin (Selote

et al., 2004 ; Lopez et Lluck, 2012). Nous rappelons que, nos résultats ont montré que la

réduction de la croissance pondérale chez les génotypes étudiés du haricot s’accompagne de

modifications du métabolisme oxydatif. En effet, ces processus résulteraient d’une

décompartimentation cellulaire liée à la désorganisation des membranes plasmiques qui

représente l’une des réactions précoces à la présence d'un stress abiotique (Bestwick et al.,

1995 ; Shetty et al., 2003). Cette désorganisation des membranes est associée à l’effet des

formes actives de l’oxygène, particulièrement les radicaux libres, aboutissant à la production

massive d’hydroperoxydes d’acides gras polyinsaturés (Rustérucci et al., 1996 ; Bestwick et

al., 1997 ; Shetty et al., 2003). Ainsi, d’après nos résultats, l’application du stress salin a

engendré une forte peroxydation lipidique qui s’est traduite par l’accumulation de MDA et la

formation de H2O2 dans les feuilles et dans les nodules (Figure IV.2). L’accumulation de

MDA et la formation de H2O2 sous la contrainte saline a été déjà rapportée par plusieurs

études (Dhanda et al., 2004 ; Bohnert et al., 2006). Il semble donc qu’un faible contenu en

MDA montre une grande capacité anti-oxydative, reflétant une grande tolérance à la salinité

(Dhanda et al., 2004 ; Shao et al., 2007).

Chapitre IV

57

La performance anti-oxydative chez les plantes apparaît aujourd’hui comme un

mécanisme de défense contre des stress abiotiques (Shao et al., 2005). Les résultats obtenus

dans ce travail nous ont permis de constater que le stress salin a provoqué une activation des

enzymes du métabolisme oxydatif (PO, PPO et SOD). Ainsi, nos résultats viennent pour

confirmer ceux de Fu et Huang (2001) ; Lima et al. (2002) ; Zucchini et al. (2003) ; Badawi et

al. (2004) ; Ramachandra et al. (2004) ; Darko et al. (2004) ; Dhanda et al. (2004) ; Shao et

al. (2005 et 2007).

Les antioxydants sont impliqués dans plusieurs processus physiologiques, biochimiques

et anti-oxydatifs (Lin et Kao, 1999 ; Shao et al., 2007). L’augmentation de l’activité des

enzymes antioxydants en particulier les peroxydases peut être utilisée comme un indicateur de

défense contre le stress salin via sa grande capacité dans la décomposition du peroxyde

d’hydrogène (H2O2) généré par la présence du NaCl dans le milieu rhizosphérique. Nos

résultats viennent pour confirmer ceux de Molina et al. (2002) ; Appel et Hirt (2004) ; Shao

et al. (2007) qui ont rapporté le rôle crucial des PO dans la protection des cellules de la plante

contre le stress salin. Similairement à l'activité des PO, le stress salin a induit une

augmentation significative de l’activité SOD chez les variétés en symbiose. Nos résultats sont

en accord avec ceux trouvés par Sairam et al. (2002) ; Selote et al. (2004) ; Shao et al. (2005

et 2007). La diminution de l’activité SOD remarquée en particulier chez les variétés étudiées

en absence de symbiose pourrait être responsable des niveaux élevés de la peroxydation

lipidique et aussi d’une production des quantités excessives des formes actives d’oxygène tel

que le radical superoxyde comme il a été signalé par ailleurs par Muckenschnabel et al.

(2001). La diminution de l’activité SOD confirme alors l’augmentation de la production du

radical superoxyde induite par le stress salin. Par conséquent, la restriction du radical

superoxyde par l’augmentation de l’activité SOD est l’un des processus cellulaires importants

dans l’induction de la tolérance du Haricot au stress salin comme il a été rapporté par Selote

et al. (2004) et Brou et al. (2007). En plus des enzymes PO et SOD, les polyphénoloxydases

(PPO) sont considérés parmi les facteurs inclus dans le stress oxydatif (Kormutak et Vookova,

2001 ; Jukanti et al., 2003 ; Tang et Newton, 2004).

Il est intéressant de noter aussi que la CAT est 4 fois plus active dans les nodules que dans

les feuilles (Figure IV.4), ce qui signifie que la CAT nodulaire est important pour éliminer le

H2O2 formé pendant le fonctionnement du nodule (Gogorcena et al., 1995). La salinité a

inhibé l'activité CAT foliaire et nodulaire au stade floraison (Figure IV.4), la CAT nodulaire

était plus active que la CAT foliaire chez les combinaisons étudiées sous cette contrainte

stressante, et donc plus tolérante à la salinité. Des études ont montré la sensibilité ou la

Chapitre IV

58

tolérance du CAT nodulaire à NaCl (Tejera et al., 2004a ; Jebara et al., 2005), ce qui suggère

qu'elle est essentielle dans l'élimination des espèces réactives de l'oxygène produites sous

stress salin (Willekens et al., 1997). En général, nos résultats ont montré, des activités

antioxydatives plus élevées au niveau des nodules en comparaison avec celles enregistrées au

niveau des feuilles. Ce résultat pourrait être expliqué par acheminement des espèces réactives

de l’oxygène vers les nodules qui jouent le rôle de détoxification de ces molécules. Une telle

explication serait supportée par les valeurs élevées en MDA et H2O2 enregistrées au niveau

des feuilles des plantes non nodulées (Figure IV.2 A, C).

Nous avons noté que le niveau des phénols totaux a augmenté plus dans les feuilles que

dans les nodosités (Figure IV.5). Une telle augmentation sous stress salin suggère que ces

composés pourraient contribuer à la protection de la plante aux méfaits de cette contrainte.

Cette constatation est en accord avec des résultats montrant que les poly-phénols sont

impliqués dans la tolérance de soja aux concentrations élevées en aluminium (Dechassa et al.,

2010). Par ailleurs, il a été décrit que la synthèse des composés phénoliques a été déclenchée

dans les plantes en réponse aux stress biotiques et abiotiques (Kidd et al., 2001). Nos résultats

ont montré que les activités PPO au niveau des nodules sont très élevées par rapport à celles

enregistrées au niveau de la partie aérienne (Figure IV.3B). Il a été proposé que des composés

phyto-phénoliques, en particulier les flavonols et phénylpropanoïdes dans les vacuoles et les

apoplastes sont capables de détoxifier le H2O2 en s’en servant comme donneurs d'électrons

pour les phénols peroxydases (peroxydases gaïacols) localisés dans ces compartiments, ce qui

entraîne la formation des radicaux phénoxyles (Takahama et Oniki, 2000). Une étude

antérieure avait indiqué que la suppression génique de l'activité PPO de la plante de tomate a

amélioré sa tolérance à la sécheresse par rapport à des plantes non-transformées et/ou ayant

subit une surexpression de cette protéine (Thipyapong et al., 2004). La même étude avait

soulignée que la surexpression de la PPO semble être directement liée à la perte de

chlorophylle en générant des quinines très réactives (Thipyapong et al., 2004).

V. Conclusion

En guise de conclusion, nous pouvons dire dans un premier plan que le comportement des

combinaisons symbiotiques étudiées était différent en absence et en présence de NaCl dans le

milieu racinaire. L’application du traitement salin a causé un effet dépressif sur la production

de la biomasse sèche aérienne et nodulaire des génotypes en question. Nos résultats nous ont

permis également de conclure que le stress salin a un effet différent sur le métabolisme

oxydatif au niveau des feuilles et des nodules et que cet effet est dépendant du génotype

Chapitre IV

59

végétal et de la souche de rhizobia. Les réponses agronomiques ou métaboliques de la

symbiose haricot-rhizobia au stress salin ont montré des variations selon les combinaisons

testées. Cette variation génotypique pourrait constituer une voie prometteuse pour la sélection

de symbioses tolérantes à la salinité.

Chapitre V

60

Chapitre V

Identification des espèces et des symbiovars des souches de rhizobia

nodulantes P. vulgaris isolées dans la région de Marrakech et étude de gène

otsA impliqués dans l'accumulation du tréhalose

I. Introduction

La salinité est un problème majeur qui limite considérablement la production agricole

dans les zones arides et semi-arides (Zahran, 1999), en particulier lorsque la nutrition azotée

est assurée par la fixation symbiotique de l'azote (Hasegawa et al., 2000 ; Estévez et al.,

2009). Pour la symbiose rhizobia-haricot, il a été rapporté que la fixation symbiotique de N2

sous salinité pourrait être efficace si les deux partenaires symbiotiques, ainsi que les

différentes étapes de leurs interactions, sont tous tolérants à ce stress (Bouhmouch et al.,

2005 ; Parida et Dasa, 2005 ; Manchanda et Garg, 2008). Plusieurs souches de rhizobia ont

développé des mécanismes d'adaptation pour survivre dans des conditions d’hyperosmolarité

en accumulant des solutés intracellulaires compatibles, tels que le glutamate, le tréhalose ou

des composés apparentés (Bostford et Lewis, 1990 ; Brique et al., 2010 ; Fernández-Aunión

et al., 2010 ; Sugawara et al., 2010). Par conséquent, l'étude de la biodiversité des souches

nodulant le haricot dans des sols salins, est crucial car la survie de la symbiose peut dépendre

de l’inoculation avec des souches de rhizobia tolérantes au sel montrant une haute efficacité

de fixation symbiotique de l'azote (Bouhmouch et al., 2001). Ceci peut être particulièrement

important dans les sols sous climat aride tels que les sols de la région de Marrakech, puisque

l'aridité affecte le rendement des cultures.

Ainsi, le premier objectif de cette partie de travail est d’étudier la caractérisation des

souches de rhizobia isolées à partir des nodules du haricot cultivé dans le périmètre du Haouz,

à l’échelle de l’espèce et du symbiovar. Pour cette raison, nous avons analysé les gènes rrs,

atpD, recA, le gène symbiotique nodC. Le deuxième objectif est l’étude de la tolérance de ces

isolats aux différentes concentrations de NaCl ainsi que l’analyse du gène otsA codant pour la

tréhalose-6-phosphate synthase impliquée dans l'accumulation du tréhalose.


1. Isolement des souches de rhizobia

1.1. Milieu d'isolement ou de culture

Le milieu d'isolement utilisé est le milieu Yeast-Extract- Mannitol (YEM, Cf Annexe1)

(Vincent, 1970).

Chapitre V

61

1.2 Technique d’isolement

L'isolement est réalisé à partir des nodules de couleur rose-marron prélevés des racines

des plantes de haricot cultivées aux champs dans le Haouz de Marrakech.

La technique d'isolement consiste à stériliser superficiellement les nodules par une

solution de Javel à 10% pendant 5min. Par la suite, les nodules ont été lavés 5 à 6 fois avec

de l'eau distillée stérile puis à l'aide d'une tige en verre, préalablement trempée dans l'alcool et

flambée, les nodules ont été broyés dans 3 ml d'eau stérile.

A l'aide d’une pipette pasteur stérile, on place une goutte du liquide dans une boîte de

Petri contenant le milieu YEM et on l’étale aseptiquement avec un étaloir.

1.3. Conservation des souches

Les souches ainsi purifiées ont été conservées soit pour de courtes périodes à +4°C dans

des tubes de gélose inclinée soit congelées à -20°C ou à -80°C dans des tubes stériles

contenant le glycérol 50% (1ml de culture + 1ml de glycérol).

2. Test du nodulation

2.1. Stérilisation et germination des graines

Les graines de haricot ont été stérilisées et mises à germer selon la technique décrite au

chapitre II (Cf paragraphe II-1 page 21).

2.3. Préparation de l’inoculum et inoculation

L'inoculum est préparé en prélevant, à l’aide d’une anse, quelques colonies de la culture

bactérienne en phase exponentionelle à partir des précultures bactériennes préparées sur

milieu solide et en le mettant dans un tube contenant 5ml d’eau distillée stérile.

2.2. Mise en place du test de nodulation

Afin de déterminer l’infectivité des souches isolées des nodosités, l’inoculum préparé a

été utilisé pour l’inoculation de jeunes plantules issues de germination des graines. Après leur

transfert dans des pots contenant la vermiculite stérilisée, ces plantules ont été inoculées par

dépôt de 1 ml de la suspension bactérienne préparée dans leurs rhizosphères. Ce lot de plantes

a été arrosé par une solution nutritive dépourvue d’azote (Rigaud et Puppo, 1975) alors que le

lot de plantes non inoculées (témoins) a été arrosé avec la même solution contenant l’azote.

Les deux lots de plantes ont été incubés sous serre à une température de 28°C et une

photopériode de 16/8 heure (Figure V.1). Les plantes ont été récoltées 6 semaines après

inoculation pour une évaluation de la nodulation basée sur le nombre et la taille des nodules.

Chapitre V

62

Figure V.1: Photos du test de nodulation sous serre des plantes inoculées

avec les souches étudiées.

3. La PCR-RAPD

Les profils RAPD ont été obtenus selon la méthode décrite par Rivas et al., (2006) en

utilisant l'amorce M13 (5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’) et la Taq polymérase (Promega). Le

programme d’amplification a été réalisé selon les étapes suivantes :

- Préchauffage à 95 °C pendant 9 min,

- 35 cycles de :

+ Dénaturation à 95 °C pendant 1 min,

+ Hybridation de l’amorce à 45 °C pendant 1 min,

+ Polymérisation de l’ADN à 75 °C pendant 2 min,

- Elongation finale à 72°C pendant 7 min.

- Pause finale à 12°C.

Par la suite, 10 µl de chaque produit de PCR ont été utilisés pour la migration

électrophorétique sur gel d'agarose 1.5% dans le tampon TBE (100 mM de Tris, 83 mM

d'acide borique, 1 mM d’EDTA, pH 8.5) à 6 V/cm. La révélation a été réalisée dans une

solution contenant 0.5 g/ml de bromure d'éthidium et photographiés sous la lumière

Ultraviolette. Le Standard VI (Roche, Etats-Unis) a été utilisé comme marqueur de poids

moléculaire. Un dendrogramme a été construit sur la base de la matrice générée en utilisant la

méthode UPGMA et le coefficient de Pearson avec BioNumerics version du logiciel 4.0

(Applied Maths, Austin, TX).

4. Analyse des séquences des gènes rrs, recA, atpD, nodC et otsA

Le gène rrs, codant pour l’ARN ribosomal 16S, a été amplifié et séquencé comme décrit

par Rivas et al. (2007a), l’analyse des gènes recA et atpD a été faite suivant la méthodologie

décrite par Gaunt et al. (2001), et celle du gène nodC a été réalisée selon la méthodologie

décrite par Laguerre et al. (2001), tandis que celle du gène otsA a été étudiée conformément à

Chapitre V

63

la méthodologie décrite par Fernández-Aunión et al. (2010). Leur amplification PCR a été

effectuée avec un kit PCR REDExtract-N-Amp (Sigma) selon les instructions du fabricant.

L’extraction et la purification d’ADN ont été effectuées par élution, après avoir révélé et

coupé les bandes correspondantes aux gènes étudiés, en utilisant du kit Qiagen d’extraction

d’ADN (Qiagen, Allemagne). Par la suite, la qualité et la quantification de l’ADN purifié a

été évaluée par migration électrophorèse sur gel d’agarose (0.6%).

Le séquençage a été réalisé par le service de séquençage de l’Université de Salamanca

utilisant le système automatique ABI PRISM 3100 génétique séquenceur (Applied

Biosystems, États-Unis). Les séquences obtenues ont été comparées à celles tenues dans

GenBank en utilisant le programme BLASTN (Altschul et al., 1990) et elles ont été alignées

par le logiciel Clustal W (Thompson et al., 1997). Les arbres phylogénétiques ont été

construits en utilisant le modèle de Kimura à 2 paramètres (Kimura, 1980) et la méthode

neighbor-joining (Saitou et Nei, 1987) avec le logiciel MEGA5 (Tamura et al., 2011).

5. Tolérance à la salinité

La tolérance des souches à la salinité a été évaluée par la détermination de la croissance

sur milieu YEM solide additionné de NaCl à des concentrations allant de 0 à 5% NaCl, p/v.

Les boîtes de Pétri ont été inoculées, à l’aide d’une micropipette, à partir des précultures

bactériennes préparées sur milieu YEM liquide sans sel. La croissance des bactéries a été

estimée par l'importance du diamètre de la colonie en comparaison avec leurs témoins

respectifs.

III. Résultats et discussion

1. Isolement de souches et le RAPD

Une collection de 71 souches de rhizobia a été établie par isolement à partir des nodules

de haricots cultivés dans des sols du périmètre irrigué du Haouz présentant des conductivités

électriques de 1,8 à 9 mmhos/cm.

Afin de faire une première identification des souches de rhizobia, le séquençage partiel

des gènes rrs a été réalisé (données non présentées). L’analyse de ces séquence a montré que

38 souches de cette collection sont des Rhizobium radiobacter (ancient nom : Agrobacterium

radiobacter). D’autres études, par exemple celle de Saïdi et al., (2011) ont montré la présence

assez commune des agrobactéries comme endophytes bactériales de P. vulgaris, non capables

de réinfecter cette légumineuse. Pour cette raison, ces 38 souches ne sont pas incluses dans

cette étude avec les 33 souches restantes de notre collection.

Chapitre V

64

Le test de nodulation a été réalisé sur ces 33 souches de rhizobia qui étaient capables de

réinfecter efficacement P. vulgaris. Leur diversité génétique a été évaluée par la technique

RAPD, c’est une technique adaptée à l'analyse de la diversité intraspécifique des populations

de rhizobia (Rivas et al., 2002 ; Moschetti et al., 2005 ; Valverde et al., 2006 ; Iglesias et al.,

2007 ; Mulas et al., 2011). L'analyse des profiles de RAPD a montré que ces souches

appartiennent à huit groupes (Tableau V.1 et Figure V. 2). Cette analyse nous a permis aussi

de sélectionner des souches représentatives de chaque groupe afin de réaliser le séquençage

des gènes et l’étude de la tolérance à la salinité.

Tableau V. 1: Résumé des résultats obtenus dans l'analyse des souches de rhizobia

Souches Groupe RAPD Tolérance à la

salinité (%)

Espèces Symbiovar

RhM46, RhM50 1 1.5 R. tropici unnamed*

RhM54 1 2 R. tropici unnamed*



RhM1, RhM19, RhM21, RhM25 3 2.5 R. phaseoli /R. etli phaseoli

R19, R24 4 2 R. phaseoli /R. etli phaseoli

R23 4 2.5 R. phaseoli /R. etli phaseoli

R26 4 3 R. phaseoli /R. etli phaseoli

RhM69, RhM72 4 2.5 R. phaseoli /R. etli phaseoli

RhM70, RhM74 4 2 R. phaseoli /R. etli phaseoli

RhM36, RhM37, RhM39, RhM40 5 2 R. phaseoli /R. etli phaseoli

RhM41 5 2.5 R. phaseoli /R. etli phaseoli

RhM67 6 2.5 R. phaseoli /R. etli phaseoli

R15, RhM15 7 3 R. gallicum gallicum

RhM47, RhM56 7 1.5 R. gallicum gallicum

RhM62, RhM64, RhM11 7 2.5 R. gallicum gallicum

RhM3, RhM5, RhM14 8 0.5 R. tropici gallicum

Souches types

CFN42T 0.5 R. etli phaseoli

ATCC 14482T 0.5 R. phaseoli phaseoli

R602spT 1 R. gallicum gallicum

CIAT 899T 2.5 R. tropici unnamed*

* Ces souches appartiennent au groupe nodC inclus par R. tropici CIAT 899T.

2. Identification à l’échelle de l’espèce

Actuellement, le gène rrs est la base de la classification des rhizobia au niveau du genre

(Gaunt et al., 2005) et son séquençage a permis de classer les souches représentatives dans le

genre Rhizobium.

L’analyse des séquences du gène rrs ont présenté des séquences identiques pour les

souches de groupes RAPD 1, 2 et 8 et dans l'arbre phylogénétique rrs, nous avons montré

seulement les souches RhM54 et RhM14 (Figure V.3). Ces séquences sont identiques 100% à

la souche R. tropici CIAT 899T.

Chapitre V

65

Figure V. 2 : Dendrogramme de la diversité génétique intraspécifique des populations de

rhizobia, en utilisant le coefficient de Pearson et de l'analyse UPGMA des profils RAPD.

Chapitre V

66

Les souches RhM15, RhM11 et RhM47 représentatives du groupe 7 sont identiques à la

souche type de R. gallicum R602spT et à la souche PhD12 isolées en Europe à partir des

nodules de P. vulgaris par Amarger et al. (1997).

Enfin, les souches de groupes RAPD 3, 4, 5 et 6 ont aussi présenté des séquences

identiques du gène rrs et nous avons sélectionné seulement les souches RhM19 et RhM67

comme souches représentatives pour ces groupes (Figure V.3). Ces souches ont été groupées

avec plusieurs espèces du genre Rhizobium (R. phaseoli, R. etli, R. pisi et R. fabae). Toutefois,

elles ont présenté des différences au niveau de la séquence du gène rrs par rapport à toutes

ces espèces à l’exception du R. etli CFN42T avec seulement deux différences de nucléotides

aux positions 170 et 1078 en prenant comme référence la séquence de la souche CFN42T dont

son génome est entièrement séquencé (González et al., 2006). La séquence du gène rrs pour

la souche RhM19 est aussi très étroitement liée aux souches RP305 et RP218 précédemment

isolées au Maroc par Moushine et al. (2007) et en Ethiopie par Beyene et al. (2004) comme la

souche AK-3. Il est intéressant aussi de noter que ces séquences sont également liées avec

celles de plusieurs souches classées dans l’espèce R. etli (représentée par la souche IE4804) et

qu’elles ont été isolées au Mexique (Amérique centrale) dans un centre de domestication du

haricot (Silva et al., 2003; 2005) (Figure V.3).

Le séquençage du gène rrs n’est pas très descriptive au niveau d’espèces entre souches

phylogénétiquement trés proches. Pour cette raison, nous avons fait le séquençage des gènes

houskeeping recA et atpD, qui permettent de faire une identification précise au niveau de

l’espèce. Les résultats de l’analyse de séquences des gènes recA et atpD (Figures V.4 et 5),

sont en harmonie avec ceux de l'analyse de séquences du gène rrs. Les souches RhM15,

RhM11 et RhM47 sont identifiées comme R. gallicum, car elles ont des gènes recA et atpD

qui sont presque 100% identiques à ceux de la souche type de cette espèce et à ceux de la

souche PhD12 isolée à partir des nodules de P. vulgaris en France (Amarger et al., 1997).

Elles sont également liées phylogénétiquement à plusieurs souches classées comme R.

gallicum (IE4868, IE2703, IE992 et IE4770) qui ont été isolées au Mexique (Amérique

centrale) dans un centre de domestication du haricot comme mentionné ci-dessus, pour lequel

l'origine américaine de cette espèce a été supposée (Silva et al., 2003 et 2005). Toutefois, les

isolats américains ont des gènes housekeeping différents de ceux des souches européennes ou

africaines et elles pourraient éventuellement avoir des origines diverses. Ce serait le soutien

de la seconde hypothèse de Silva et al. (2005) qui ont suggéré une possible distribution dans

le monde entier de R. gallicum qui a acquis différents plasmides symbiotiques le long de

Chapitre V

67

l'évolution des différents écosystèmes. Dans ce cas, les souches marocaines pourraient avoir

la même origine que les souches européennes plutôt que les souches américaines.

Les souches RhM14 et RhM54 sont également 100% identiques à la souche type CIAT

899T de R. tropici. Ces gènes sont également proches de ceux d’une autre souche américaine

Br859 isolée au Brésil (Martínez-Romero et al., 1991). La souche R. tropici a été isolée en

Amérique à partir de nodules de Leucaena leucocephala et elle est aussi capable de noduler

Phaseolus (Martínez-Romero et al., 1991). Initialement cette espèce contient deux groupes, A

et B, mais récemment les souches du groupe A ont été reclassées en une nouvelle espèce

nommée R. leucaenae (Ribeiro et al., 2011). C’est intéressant de noter que curieusement les

souches isolées au Maroc appartiennent à la souche R. tropici (Moushine et al., 2007), tandis

que celles trouvées en Europe appartiennent à la souche R. leucaenae (Laguerre et al., 1993 ;

Valverde et al., 2011). Cela pourrait être dû à une meilleure adaptation de chacune de ces

espèces à différentes conditions environnementales, y compris aux variétés locales de haricot.

Au contraire à la phylogénie obtenue pour les autres groupes, les souches RhM19 et

RhM67 ont des gènes recA et atpD différents de ceux de R. etli malgré leur proximité par le

gène rrs. Ils étaient plus étroitement liés à ceux de R. phaseoli, selon l’analyse des gènes

housekeeping c’est une espèce parfaitement distinguée du reste des espèces du genre

Rhizobium (Ramírez-Bahena et al., 2009). Les gènes recA et atpD des souches RhM19 et

RhM67 sont presque identiques (plus de 99%) à plusieurs souches déjà isolées au Mexique

(Silva et al., 2005) et présentent 100% de similarité à ceux d'une souche isolée aux Etats-

Unis (KIM5s, Figures V. 4 et 5). Bien que ces souches sont nommées R. etli, l'analyse des

gènes recA et atpD suggère qu'elles n'appartiennent pas à cette espèce (Silva et al., 2005).

Malgré le fait que nos souches sont plus proches de R. phaseoli que de R. etli selon l'analyse

du gène housekeeping, les différences constatées au niveau du gène rrs ne permettent pas

d’inclure ces souches dans R. phaseoli. L'échange génétique entre les espèces pourrait

expliquer la position phylogénétique de souches représentées par RhM19 et RhM67 mais

avant d'établir des conclusions, une révision taxonomique du groupe complet R. phaseoli-R.

etli serait souhaitable.

Chapitre V

68

Figure V. 3 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène rrs des

souches de rhizobia isolées dans la région du Haouz, apparentées au sein du genre Rhizobium.

La signification de chaque branche est indiquée par une valeur de bootstrap calculée pour

1000 sous-ensembles.

Chapitre V

69

Figure V. 4: Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène recA des




Chapitre V

70

Figure V. 5 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène atpD des




Chapitre V

71

3. Identification au niveau de symbiovar

Tandis que l'identification au niveau des espèces a été basée sur l'analyse génétique

chromosomique, l'identification de symbiovars a été basée sur les gènes de nodulation qui

sont portés par le plasmide symbiotique (pSym) dans le genre Rhizobium. Bien que les gènes

nodA (Villegas et al., 2006 ; Nandasena et al., 2007) et nodB (Radeva et al., 2001 ; Silva et

al., 2003 et 2005) ont été utilisés pour cet objectif, le gène nodC est couramment utilisé pour

définir les symbiovars (Vinuesa et al., 2005b ; Iglesias et al., 2007 ; Rivas et al., 2007b ;

Mnasri et al., 2007 ; León-Barrios et al., 2009 ; García-Fraile et al., 2010). L'analyse des

symbiovars en rhizobia est aussi importante que celle des espèces, puisque la diversité d'hôtes

de rhizobia, la promiscuité des légumineuses et des études de biogéographie-coévolution

doivent être fondées sur l’analyse des symbiovars plutôt que sur celle des espèces. Par

exemple, P. vulgaris n'est pas considérée comme une légumineuse de promiscuité du fait

qu'elle peut être nodulée par plusieurs espèces de rhizobia, et aussi par le fait qu'elle forme

des nodules avec de nombreux symbiovars différents (qui abritent différents gènes nodC). De

cette façon, le haricot est fréquemment nodulé par les symbiovars phaseoli, gallicum,

giardinii, mediterranense (Rogel et al., 2011) et par des souches provenant d'autres groupes

qui appartiennent à des symbiovars indéfinis (Valverde et al., 2011). Parmi ces symbiovars,

seulement sv. phaseoli semble être exclusif pour la nodulation du haricot (Amarger et al.,

1997 ; Valverde et al., 2011) et donc le plasmide de symbiovar phaseoli devrait avoir évoluer

avec les plantes du haricot indigène en Amérique (Martínez-Romero et Caballero-Mellado,

1996 ; Aguilar et al. 2004). Par ailleurs, comme R. etli est le majeur endosymbiote du haricot

dans les centres de domestication américaine de cette légumineuse (Aguilar et al., 2004 ;

Silva et al., 2005) donc la combinaison R. etli sv phaseoli est avec une forte probabilité

d'origine américaine. Aussi, R. phaseoli est considérée R. etli pendant de nombreuses années,

la combinaison R. phaseoli sv phaseoli est également un indigène susceptible du continent

américain (Silva et al., 2005). Les souches marocaines représentées par RhM19 et RhM67 et

par les souches précédemment isolées PR218 et PR305 (Moushine et al., 2007) appartiennent

au symbiovar phaseoli (Figure V. 6) et au groupe chromosomique R. etli-R. phaseoli (Figures

V. 3, 4 et 5). Elles ont donc probablement une origine américaine comme il a été mentionné

par Diouf et al. (2000) qui ont proposé que les rhizobia de haricot soient introduits en Afrique

par les graines issues de l’Amérique.

Le groupe des souches identifiées comme R. gallicum et représentées par RhM15, RhM11

et RhM47, appartiennent au symbiovar gallicum et elles ont des gènes nodC identiques à celui

des souches RP421 précédemment isolées au Maroc à partir des nodules de P. vulgaris

Chapitre V

72

(Moushine et al., 2007) et à celui de la souche type de R. gallicum R602spT isolée en France

(Amarger et al., 1997) (Figure V. 6). Cependant, le gène nodC de la souche PhD12, dont ses

gènes housekeeping sont identiques à ceux de nos souches (RhM15 et RhM47), est typique du

symbiovar phaseoli. Puisque le symbiovar phaseoli n'est pas trouvé dans les souches R.

gallicum isolées en Amérique centrale (Silva et al., 2005) et considérant que ce symbiovar a

évolué avec R. etli. Il est possible que le transfert des gènes typiques de nodulation de ce

symbiovar à la souche R. gallicum, ait eu lieu dans les sols européens. Dans tous les cas, la

présence de symbiovar gallicum dans différents continents pourrait indiquer une distribution

mondiale de R. gallicum qui a acquis différents plasmides symbiotiques le long de l'évolution

des différents écosystèmes, comme il a été suggéré par les travaux de Silva et al. (2005).

Concernant le groupe des souches identifiées comme R. tropici, RhM14 et RhM54, elles

sont identiques à la souche RP261 marocaine (Moushine et al., 2007) et de plusieurs souches

américaines de R. tropici et de R. leucaenae (Figure V. 6). Leurs gènes nodC sont également

identiques au gène nodC de la souche type de R. lusitanum, c’est une espèce portugaise,

nodulant le haricot, qui a probablement acquis son gène nodC de R. leucaenae, puisque cette

dernière espèce a été trouvée dans les nodules du haricot au Portugal et elle porte des gènes

nodC identiques (Valverde et al., 2011). Par conséquent, l'origine américaine des souches de

R. tropici nodulant P. vulgaris au Maroc semble être claire et en accord avec les suggestions

de Diouf et al. (2000).

4. Tolérance à la salinité et l'analyse des gènes otsA

Les sols dans lesquels nous avons isolé les souches qui ont fait l’objet de cette étude sont

affectés par la salinité sous un climat aride. Nous avons analysé leurs degrés d’osmotolérance

(Tableau V. 1). Cette caractéristique a été variable, mais toutes les souches étaient capables de

croître en présence de concentrations de NaCl allant de 1,5% à 3%. Ces valeurs sont

similaires à celles précédemment rapportés pour les souches isolées dans d’autres régions du

Maroc (Bouhmouch et al., 2005) et plus basses que celles rapportés pour des souches de

rhizobia isolées de P. vulgaris en Egypte, et qui peuvent tolérer jusqu'à 4% de NaCl

(Shamseldin et Werner, 2005).

Chapitre V

73

Figure V. 6 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène nodC des




Chapitre V

74

Parmi les trois espèces démontrées dans cette étude, nous avons trouvé que les souches

marocaines ont la capacité de croître à des concentrations élevées en NaCl par rapport à la

souche type correspondante de chaque espèce. R. tropici CIAT899 est la souche type la plus

osmotolérance (2.5%), tans dis que R. gallicum R602sp a la capacité seulement de croître

jusqu’à 1% de NaCl. Le cas le plus significatif est pour R. etli, R. leguminosarum et R.

phaseoli dont les souches types n’ont pu tolérer des concentrations en NaCl supérieures à

0,5% alors que nos souches phylogénétiquement liées à ces espèces (les souches des groupes

RAPD 3, 4, 5 et 6), étaient capables de croître à des concentrations supérieures ou égales à

2%.

Cela implique une adaptation des souches américaines qui arrivent avec les graines de

haricots, aux conditions édapho-climatiques des sols salins marocains caractérisés par des

températures assez élevées, une faible humidité relative, un taux d'évaporation élevés et de

faibles précipitations. Le stress salin peut provoquer une faiblesse de la mise en place

d'infection et de nodulation dans la rhizosphère (Zahran et Sprent, 1986), mais les rhizobia

osmotolérants peuvent tolérer des grandes modifications de l'osmolarité, sans diminution du

nombre de cellules viables (Singleton et al., 1982 ).

Lorsque les bactéries ont été soumises à un stress osmotique sévère, l'accumulation de

tréhalose a été constatée (Miller et Wood, 1996 ; McIntyre et al., 2007 ; Iturriaga et al., 2009).

Chez les rhizobia, ce disaccharide joue un rôle important dans leur adaptation aux conditions

de stress osmotique (El Sheikh et Wood, 1990 ; McIntyre et al., 2007 ; Brechenmacher et al.,

2010). Les gènes codant la tréhalose-6-phosphate synthase sont impliqués dans le processus

d'accumulation de tréhalose et le gène otsA a été séquencé chez certaines souches de rhizobia

osmotolérantes isolées en Tunisie à partir des nodules P. vulgaris (Fernández-Aunión et al.,

2010). Dans ce précédent travail, seulement six espèces du genre Rhizobium sont analysées et

toutes ces espèces appartiennent à un même groupe phylogénétique lié au sein de ce genre.

Dans notre présent travail, nous avons séquencé ce gène chez des souches isolées dans la

région du Haouz ainsi que les souches types de six espèces étroitement apparentées aux

isolats africains (Maroc et Tunisie). En outre, dans l'analyse phylogénétique des gènes otsA

nous avons aussi inclus les souches dont les génomes complets sont actuellement disponibles

à l'exception d’Agrobacterium tumefaciens (actuellement R. radiobacter) C58 dont le gène

otsA n'est pas présent (Figure V. 7). Ce gène otsA est présent chez toutes les autres souches,

mais à des emplacements différents. Chez les souches de Rhizobium, il est chromosomique

alors que dans celles d’Ensifer, il est situé dans des plasmides symbiotiques (Faghire et al.,

Chapitre V

75

2012). Dans le cas de la souche E. meliloti AK83, le gène otsA est situé dans le chromosome

3 qui correspond vraiment à un plasmide symbiotique car il contient des gènes nod (Faghire et

al., 2012). Ces différences dans la localisation des gènes, essentiels pour l'adaptation à

l'environnement, sont déjà trouvées comme c’est le cas du gène celC qui se trouve également

dans des plasmides d’Ensifer et dans les chromosomes de Rhizobium. Cependant dans le cas

du gène celC qui code pour une cellulase, sa phylogénie est complètement en harmonie avec

celle des autres principaux gènes. Cependant, les gènes celC de souches Ensifer sont

différents de ceux de genre Rhizobium (Robledo et al., 2011). Dans le cas du gène otsA, la

phylogénie n'est pas complètement en harmonie avec celles des autres principaux gènes, par

exemple les espèces du genre Ensifer sont plus étroitement liées au groupe R. gallicum-R.

mongolense qu’à d’autres espèces de Rhizobium. Néanmoins, au niveau des espèces, la

phylogénie du gène otsA est en harmonie avec celle des principaux gènes puisque les souches

des espèces spécifiques ont été regroupées avec les souches types correspondantes. Par

exemple, la souche RhM15 a un gène otsA identique à celui de la souche type R. gallicum

R602spT et à celui de la souche osmotolérante 8a3 isolée en Tunisie par Fernández-Aunión et

al. (2010). Très étroitement lié à ce groupe se trouvent les espèces R. mongolense, R.

yanglingense et R. loessense en accord avec les résultats des autres principaux gènes, ce qui

appuie l'hypothèse de leur appartenance à la même espèce (Silva et al., 2005 ; Ferreira et al.,

2011 ; Robledo et al., 20011). Le gène otsA de RhM14 était presque identique à celui de la

souche type de R. tropici CIAT 899T qui en accord avec les résultats obtenus après l'analyse

des gènes rrs, recA et atpD. Enfin, RhM19 était étroitement liée à la souche 12a3 isolée en

Tunisie par Fernández-Aunión et al. (2010). Ces deux souches sont plus étroitement liées à R.

phaseoli qu’à R. etli et en accord avec les résultats de l'analyse du gène housekeeping. Il est

remarquable que la souche CIAT 652, actuellement incluse dans R. etli, soit plus liée à R.

phaseoli ATCC 14482T qu’à R. etli CFN42

T et comme il est précédemment souligné, cette

souche appartient probablement à R. phaseoli (Robledo et al., 2011). Les deux espèces R. etli

et R. phaseoli sont clairement séparées entre elles et du groupe formé par R. leguminosarum

qui inclut des souches non osmotolérantes telle que la souche type USDA 2370T et celles

osmotolérantes telle que 31c3 isolée en Tunisie par Fernández-Aunión et al . (2010).

Chapitre V

76

Figure V. 7 : Arbre phylogénique généré par l’analyse des séquences du gène otsA des




Chapitre V

77

L’analyse phylogénétique du gène otsA réalisée dans le cadre de ce travail, a montré que ce

gène est étroitement lié chez les souches de la même espèce.

Par ailleurs, certains souches types de références de R. phaseoli et R. etli qui ne sont pas très

osmotolérantes, présentent certaines ressemblances dans leurs gènes otsA avec ceux de

souches osmotolérantes de la même espèce (Fernández-Aunión et al., 2010 ; Faghire et al.,

2012). Ainsi, le gène otsA peut être un bon marqueur et être inclus comme un gène codant une

protéine utile pour les études phylogénétiques du genre Rhizobium (Faghire et al., 2012).

D’autres gènes jouant un rôle dans l’osmotolérance peuvent avoir également un rôle dans la

protection des souches bactériennes dans des conditions de stress salin ; comme les gènes

impliqués dans l’accumulation du glutamate, de la glycine, la proline, la bétaïne, l’éctoine …

(Bostford et Lewis, 1990 ; Alloing et al., 2006 ; Vriezen et al., 2007 ; Brique et al., 2010 ;

Sugawara et al., 2010). L’étude de ces gènes fera l’objet de nos travaux ultérieurs.

http://jb.asm.org/search?author1=Genevi%C3%A8ve+Alloing&sortspec=date&submit=Submit

http://aem.asm.org/search?author1=Jan+A.+C.+Vriezen&sortspec=date&submit=Submit

Conclusion générale et perspectives

78

CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES

Conclusion Générale

A la lumière des résultats obtenus dans ce travail, nous pouvons conclure que la salinité a

un effet néfaste sur les différents aspects de symbiose étudiés.

L’étude de l’effet de la salinité sur la croissance, la fixation d'azote, l'accumulation des

éléments minéraux et les activités enzymatiques PEPC et MDH, nous a permis de conclure

que la salinité a un effet dépressif sur la croissance des plantes, l'activité métabolique et de la

performance symbiotique chez les combinaisons testées avec une variation importante entre

elles. En effet, la performance de la symbiose sous traitement salin semble être principalement

déterminée par l’interaction entre le génotype du haricot et la souche de rhizobia.

L'inoculation avec la souche locale RhM11, caractérisée par une efficacité symbiotique élevée

pourrait compenser la perte de la croissance de la plante hôte, induite par la salinité. Par

ailleurs, la variabilité génotypique de PEPC et MDH nodulaires impliqués dans l’allocation

métabolique du carbone semble être un trait de tolérance au sel qui mérite plus d'exploration.

En outre, les résultats de l’étude de la variation génotypique basée sur les activités

enzymatiques APase et TPPase nodulaires, chez certains génotypes de haricot (P. vulgaris)

cultivés sous la contrainte saline en système hydroponique, ont aussi montré que l'inoculation

avec la souche RhM11 a été associée à des activités enzymatiques nodulaires plus élevées par

rapport à celles des plantes inoculées avec la CIAT899 chez les lignées testées en présence ou

en absence du NaCl.

L’étude de l’effet de la contrainte saline sur le métabolisme oxydatif dans la partie

aérienne et les nodosités de la symbiose P. vulgaris-rhizobia a montré que le traitement salin a

négativement affecté la stabilité membranaire reflétée par l’augmentation des teneurs en

MDA dans ces organes. En outre, sous cette contrainte, nous avons constaté des

augmentations des activités des enzymes anti-oxydantes telles que PO, PPO et SOD

impliquées dans le balayage des formes réactives de l’oxygène comme le H2O2. Ces activités

anti-oxydantes plus prononcées dans les nodules et associées à des teneurs faibles en H2O2

permettraient d’attribuer à ces organes le rôle d’un centre de détoxification des formes

réactives de l’oxygène. Des différences importantes ont été décelées entre les combinaisons

symbiotiques testées pour leur tolérance au stress salin. L’association entre les souches

indigènes des sols et l’inoculation avec des souches CIAT899 et RhM11 multipliées au

laboratoire, a un effet positif dans l’amélioration de la tolérance à la contrainte saline. Les

Conclusion générale et perspectives

79

plantes de cette association semblent être plus tolérantes par rapport à celles cultivées

seulement en présence des souches naturelles du sol.

Dans le dernier volet de ce travail nous avons exploré la biodiversité des souches de

rhizobia isolées des nodules de haricot provenant de la région du Haouz en analysant les

gènes rrs, atpD, recA, le gène symbiotique nodC et le gène otsA codant la tréhalose-6-

phosphate synthase. Cette analyse nous a permis d’identifier des souches efficaces,

compétitives et tolérantes à la salinité. Les souches ainsi sélectionnées pourraient être utilisées

pour l’identification d’une symbiose plante-bactérie bien adaptée à cette contrainte.

En plus, cette analyse nous a permis aussi de conclure que toutes ces souches

appartiennent au genre Rhizobium et que les souches RhM11 et RhM14, utilisées dans ce

travail, sont des Rhizobium gallicum et Rhizobium tropici respectivement.

Perspectives

Dans cette perspective, il est fortement souhaitable de mieux comprendre les

interactions entre les nodosités fixatrices d’azote et leur environnement rhizosphérique se

trouvant souvent sous contraintes particulièrement nutritionnelles et osmotiques.

Au niveau moléculaire, la recherche des gènes candidats impliqués dans la tolérance de

cette symbiose au stress salin est l’une des perspectives les plus importantes comme

complément du présent travail. Dans ce sens, nous avons commencé à étudier le gène otsA

comme marqueur moléculaire de la tolérance à la salinité (Chapitre V) et à mettre en évidence

la localisation histologique de certains gènes de phosphatase acide spécifique sur des coupes

nodulaires (Chapitre II). Et au niveau microbiologique l’étude de la biodiversité des bactéries

endophytes nodulaire qui pourraient interférer avec les rhizobia. Cette étude nous serait

intéressante pour expliquer d’avantage les réponses de cette symbiose au stress salin.

Références bibliographiques

80


Abdelly C, Lachaâl M, Grignon C, Soltani A, Hajji M, 1995. Association épisodique d’halophytes

strictes et de glycophytes dans un écosystème hydromorphe salé en zone semiaride. Agronomie

15:557-568

Adam AL, Bestwick CS, Barna B, Mansfield JW, 1995. Enzymes regulating the accumulation of

active oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringe pv.

Phaseolicola Planta. 197: 240-249.

Adelson PA, Claude P, Drevon JJ, 2008. Phosphatase and phytase activities in nodules of common

bean genotypes at different levels of phosphorus supply. Plant Soil. 312:129-138.

Aguilar OM, Riva O, Peltzer E, 2004. Analysis of Rhizobium etli and of its symbiosis with wild

Phaseolus vulgaris supports coevolution in centers of host diversification. Proc. Natl. Acad. Sci.

U S A. 101:13548-13553.

Alloing G, Travers I, Sagot B, Le Rudulier D, Dupont L, 2006. Proline Betaine Uptake in

Sinorhizobium meliloti: Characterization of Prb, an Opp-Like ABC Transporter Regulated by

both Proline Betaine and Salinity Stress. J. Bacteriol 188(17):6308-6317.

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ, 1990. Basic local alignment search tool. J.

Mol. Biol. 215:403–410.

Amarger N, Macheret V, Laguerre G, 1997. Rhizobium gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinii sp.

nov, from Phaseolus vulgaris nodules. Int.J. of Syst. Bact. 47:996-1006.

Amira MS, Abdul Qado, 2011. Effect of salt stress on plant growth and metabolism of bean plant

Vicia faba (L.). Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences 10: 7–15.

Appel K, Hirt H, 2004. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal

transduction. Annu Rev Plant Biol 55:373-399.

Ashraf M, 1997. Improvement of salt tolerance in some native pulse crops. In : Jaiwal P.K, Singh R.P,

and Gulati A, eds. Strategies for improvement of salt tolerance in higher plants. New Delhi,

India : Oxford and IBH Publishing Co. Pvt. Ltd, 413-434.

Atlas RM, 1988. Microbiology: Fundamentals and Applications. Mcmillan Publishing Company, New

York, USA, pp. 269-312.

Aydi S, Drevon JJ, Abdelly C, 2004. Effect of salinity on root nodule conductance to the oxygen

diffusion in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant Physiology and

Biochemistry 42: 833-840.

Aydi S, Sassi S, Abdelly C, 2008. Growth, nitrogen fixation and ion distribution in Medicago

truncatula subjected to salt stress. Plant and Soil 312: 59-67.

Badawi GH, Yamauchi Y, Shimada E, Sasaki R, Kawano N, Tanaka K, 2004. Enhanced tolerance to

salt stress and water deficit by overexpressing superoxide dismutase in tobacco (Nicotiana

tabacum) chloroplasts. Plant Science. 166:919-928.

Baldwin IL, Fred EB, 1928. Nomenclature of the root-nodule bacteria of the leguminosae. University

of Wisconsin, Madison, Wisconsin.

Balibrea ME, Cuartero J, Bolarin MC, Perez-Alfocea F, 2003. Sucrolytic activities during fruit

development of Lycopersicon genotypes differing in tolerance to salinity. Physiol Plant

118(1):38-46

Bambara S, Ndakidemi PA, 2010. Phaseolus vulgaris response to Rhizobium inoculation, lime and

molybdenum in selected low pH soil in Western Cape, South Africa. Afr J Agr Res 5(14):1804-

1811

Bargaz A, Drevon JJ, Oufdou K, Mandri B, Faghire M, Ghoulam C, 2011a. Nodule phosphorus

requirement and O2 uptake in common bean genotypes under phosphorus deficiency. Acta

Agric Scan Section B-Soil and Plant Sci. 61:602-611.

Bargaz A, Ghoulam C, Faghire M, Aslan Attar H, and Drevon J.J, 2011b. The nodule conductance to

O2 diffusion increases with high phosphorus content in the Phaseolus vulgaris-rhizobia

symbiosis. Symbiosis. 53: 157-164.

Beijerinck MW, 1888. Die Bacterien der papilionaceen-Knôllchen. Bot. Ztg. 46:725-735.


81

Belay D, Schulthess F, Omwega C, 2009. The profitability of maize–haricot bean intercropping

techniques to control maize stem borers under low pest densities in Ethiopia. Phytoparasitica

37:43-50.

Ben Khaled L, Morte Gõmez A, Honrubia M, Oihabi A, 2003. Effet du stress salin en milieu

hydroponique sur le trèfle inoculé par le Rhizobium. Agronomie 23:553-560.

Bestwick CS, Brown IR, Bennett MH, Mansfield JW, 1995. Enzymes regulating the accumulation of

active oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringe pv.

Phaseolicola Planta. 197: 240-249.

Bestwick CS, Brown IR, Bennett MH, Mansfield JW, 1997. Localization of hydrogen peroxide

accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv

phaseolica. Plant Cell 9:209-221.

Bewley JD, Black M, 1994. Seeds: Physiology of development and germination. Plenum Press, New

York, London, 445 pp. Second Edition.

Beyene D, Kassa S, Ampy F, Asseffa A, Gebremedhin T, van Berkum P, 2004. Ethiopian soils harbor

natural populations of rhizobia that form symbioses with common bean (Phaseolus vulgaris L.).

Arch. Microbiol. 181:129-136.

Bishop PE, Gordon JK, Shah VK, Brill WJ, 1977. Transformation of nitrogen fixation genes in

Azotobacter. Basic. Life. Sci. 9: 67-80.

Bliss FA, 1993. Breeding common bean for improved biological nitrogen fixation. Plant Soil 152:71-

79.

Bohnert HJ, Gong Q, Li P, Ma S, 2006. Unravelling abiotic stress tolerance mechanisms-getting

genomics going. Curr Opin Plant Biol. 9:180-188.

Bor M, Ozdemir F, Turkan I, 2003. The effect of salt stress on lipid peroxidation and antioxidants in

leaves of sugar beet Beta vulgaris L. and wild beet Beta maritima L, Plant Sci. 164:77-84.

Borucki W, Sujkowska M, 2008. The effects of sodium chloride salinity upon growth, nodulation, and

root nodule structure of pea (Pisum sativum L.) plants. Acta Phys. Plant. 30:293-301.

Botsford JL, Lewis TA, 1990. Osmoregulation in Rhizobium meliloti: production of glutamic acid in

response to osmotic stress. Appl. Environ. Microbiol. 56:488-494.

Bouhmouch I, Brhada F, Filali-Maltouf A, Aurag J, 2001. Selection of osmotolerant and effective

strains of Rhizobiaceae for inoculation of common bean (Phaseolus vulgaris) in Moroccan

saline soils. Agronomie 21: 591–599.

Bouhmouch I, Souad-Mouhsine B, Brhada F, Aurag J, 2005. Influence of host cultivars and

Rhizobium species on the growth and symbiotic performance of Phaseolus vulgaris under salt

stress. J. Plant Physiol. 162:1103-1113.

Bradford MM, 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem, 72: 248-254.

Brady NC, 2002. The Nature and Properties of Soils, New Jersey, USA, Prentice Hall.

Brechenmacher L, Lei Z, Libault M, Findley S, Sugawara M, Sadowsky MJ, Sumner LW, Stacey G,

2010. Soybean Metabolites Regulated in Root Hairs in Response to the Symbiotic Bacterium

Bradyrhizobium japonicum. Plant Physiology 153:1808-1822.

Brennan T, Frenkel C, 1977. Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in

pear. Plant Physiol, 59: 411-416.

Brique A, Devassine J, Pilard S, Cailleub D, Gosselin I, 2010. Osmoregulated trehalose-derived

oligosaccharides in Sinorhizobium meliloti. FEBS Lett. 584:3661–3666.

Brou YC, Zézé A, Diouf O, Eyletters M, 2007. Water stress induces overexpression of superoxide

dismutases that contribute to the protection of cowpea plants against oxidative stress. African

Journal of Biotechnology. 6:1982-1986.

Broughton W J, 2003. Roses by Other Names: Taxonomy of the Rhizobiaceae. J Bacteriol. 185:2975-

79.

Burris RH, 1991. Nitrogenases. Journal of Biological Chemistry 266: 9339-9342.

Cabib E, Leloir L, 1958. The biosynthesis of trehalose-6-phosphate. J. Biol. Chem. 231:259–275.

Cellier F, Conéjéro G, Ricaud L, Luu DT, Lepetit M, Gosti F, Casse F, 2004. Characterization of

AtCHX17, a member of the cation/H+ exchangers, CHX family, from Arabidopsis thaliana

suggests a role in K+ homeostasis. Plant J. 39:834-46.

http://www.febsletters.org/article/S0014-5793%2810%2900609-5/abstract




82

Cesar AI, Esther MG, Daniel M, Ruben L, Estibaliz L, Erena GQ, 2011. Physiological response of

legume nodules to drought. Plant stress. 5:24-31.

Chacón MI, Pickersgill SB, Debouck DG, 2005. Domestication patterns in common bean (Phaseolus

vulgaris L.) and the origin of the Mesoamerican and Andean cultivated races. Theor. Appl.

Genet. 110:432-444.

CIAT, 1992. Constraints to and opportunities for improving bean production. A planning document

1993–98. An achievement document 1987-92, CIAT (Centro Internacional de Agricultura

Tropical), Cali, Colombia.

Cohan FM, 2002. What are bacterial species?. Annu Rev Microbiol. 56:457-87.

Colwell RR, Clayton RA, Ortiz-Conde BA, Jacobs D et Russek-Cohen E, 1995. The microbial species

concept and biodiversity. En: Allsopp, D, Colwell, R. R. et Hawksworth, D. L. (Eds.), Microbial

Diversity and Ecosystem Function. CAB International, Cambridge, pp. 3-15.

Cordovilla MP, Ligero F, Lluch C, 1994. The effect of salinity on N2 fixation and assimilation in Vicia

faba. J Exp Bot 45(10):1483-1488

Cordovilla MP, Ligero F, Lluch C, 1999. Effects of NaCl on growth and nitrogen fixation and

assimilation of inoculated and KNO3 fertilized Vicia faba L. and Pisum sativum L. plants. Plant

Science 140:127-136.

Cordovilla MP, Ocana A, Ligero F, Lluch C, 1995. Salinity effects on growth analysis and nutrient

composition in four grain legumes Rhizobium symbiosis. J Plant Nutr 18(8):1595-1609

Dangeard PA, 1926. Recherches sur les tubercules radicaux des Légumineuses. Le Botaniste, Series

16, Pads. 270 p.

Darko E, Ambrus H, Stefanovits Banyai E, Fodor J, Bakos F, Barnabas B, 2004. Aluminum toxicity,

Al tolerance and oxidative stress in an Alsensitive wheat genotype and in Altolerant lines

developed by in vitro microspore selection. Plant Science. 166:583-591.

Debbarh A, Badraoui M, 2002. Irrigation et environnement au Maroc : situation actuelle et

perspectives. Serge Marlet et Pierre Ruelle (éditeurs scientifiques). Vers une maîtrise des

impacts environnementaux de l’irrigation. Actes de l’atelier du PCSI, 28-29 mai 2002,

Montpellier, France. CEMAGREF, CIRAD, IRD, Cédérom du CIRAD.

Dechassa D, Khairy S, Ernst C, 2010. Protein and polyphenol profile changes in soybean roots under

aluminum stress. Int. J. Plant Physiol. Biochem. 3:38-45.

Delgado MJ, Garrido JM, Ligero F, Lluch C, 1993. Nitrogen fixation and carbon metabolism by

nodules and bacteroids of pea plants under sodium chloride stress. Physiol Plant 89:824-829

Delgado MJ, Ligero F, Lluch C, 1994. Effects of salt stress on growth and nitrogen fixation by pea,

faba-bean, common bean and soybean plants. Soil Biol Biochem 26:371-376.

Demiral T, Turkan I, 2005. Comparative lipid peroxidation, antioxidant systems and proline content in

roots of two rice cultivars differing in salt tolerance, Environ. Exp. Bot. 53:247-257.

Dhanda SS, Sethi GS, Behl RK, 2004. Indices of Drought Tolerance in Wheat Genotypes at Early

Stages of Plant Growth. Agronomy et Crop Science. 190: 612.

Diouf A, de Lajudie P, Neyra M, Kersters K, Gillis M, Martinez-Romero E, Gueye M, 2000.

Polyphasic characterization of rhizobia that nodulate Phaseolus vulgaris in West Africa

(Senegal and Gambia). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50:159–170.

Dita MA, Rispail N, Prats E, Rubiales D, Singh KB, 2006. Biotechnology approaches to overcome

biotic and abiotic stress constraints in legumes. Euphytica 147:1-24.

Dixon ROD, Wheeler CT, 1986. Nitrogen fixation in plants. Blackie. Glasgow. 152p.

Dommergue R, Mougenot F, 1970. Symbiose Rhizobium-légumineuses. Ecologie microbienne du sol.

Ed. Masson et Cie, Paris.

Dommergues Y, Duhaux E, Hoang GD, 1999. Les arbres fixateurs d’azote: Caractéristiques

fondamentales et rôle dans l’aménagement des écosystèmes méditérranéens et tropicaux. Y.

Dommergues (ed.). Édition espaces 34. Paris. 475 p.

Drevon JJ, Deransart C, Fleurat-Lessard P, Jaillard B, Ndjiondjop MN, Payre H, Ribet J, Roy G,

Serraj R, 1995. Is the symbiotic fixation osmoregulated by reversible contraction of cells in the

legume-nodule innercortex? In: Tikhonovitch, I.A, Provorov, N.A, Romanov, V.I, Newton,

W.E. (Eds.), Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Kluwer Academic, Dordrecht,

p.598.


83

Drevon JJ, Deransart C, Ireki H, Payre H, Roy G et Serraj R, 1994. La salinité abaisse la conductance

des nodosités de légumineuses à la diffusion de l’oxygène, in: Drevon J.J. (Ed), Facteurs

limitant la fixation symbiotique de l’azote dans le bassin méditerranéen, INRA Editions, les

colloques 77:73-84.

Du Z, Bramlage WJ, 1995. Peroxidative activity of apple peel in relation to development of

poststorage disorders. Hortscience, 30, 205-209.

Durand JH, 1983. Les sols irrigables. Agence de coopération culturelle et technique. Ed. Presse

universitaire, pp: 339, Paris.

Eardly BD, Wang FS, Whittam TS, Selander RK, l995. Species limits in Rhizobium populations that

nodulate the common bean (Phaseolus vulgaris L.). Applied and Environmental Microbiology

61:507-512.

El Modafar C, Clérivet A, Macheix JJ, 1996. Flavan accumulation in stems Platanus x acerifolia

seedlings inoculated with Ceratocystis fimbriata .sp platani, the canker stain disease agent.

Can. J. of Bot. 74:1982-1997.

El Sheikh EAE, Wood M, 1990. Rhizobia and bradyrhizobia under salt stress: possible role of

trehalose in osmoregulation. Letters in Applied Microbiology, 10:127-129.

Estévez J, Soria-Díaz ME, de Córdoba FF, Morón B, Manyani H, Gil A, Thomas-Oates J, van Brussel

AA, Dardanelli MS, Sousa C, Megías M, 2009. Different and new Nod factors produced by

Rhizobium tropici CIAT899 following Na+ stress. FEMS Microbiol. Lett. 293:220–231.

Faghire M, Bargaz A, Farissi M, Palma F, Mandri B, Lluch C, Tejera García NA, Herrera-Cervera JA,

Oufdou K, Ghoulam C, 2011. Effect of salinity on nodulation, nitrogen fixation and growth of

common bean (Phaseolus vulgaris) inoculated with rhizobial strains isolated from the Haouz

region of Morocco. Symbiosis, 55:69-75.

Faghire M, Mandri B, Oufdou K, Bargaz A, Ghoulam C, Ramírez-Bahena MH, Velázquez E, Peix A,

2012. Identification at species and symbiovar levels of strains nodulating Phaseolus vulgaris in

saline soils of the Marrakech (Morocco) and analysis of otsA gene putatively involved in

osmotolérance. Systematic and Applied Microbiology Journal, 35:156-164.

FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), 2009. FAOSTAT.

http://faostat.fao.org/DesktopDefault.aspx?PageID=291etlang=fr

Felix JF, Obaton M, Messiaem CM, Salsac L, 1981. Nitrate reductase and nitrogenase activities of

common bean (Phaseolus vulgaris L.) from different geographic locations. Plant and Soil

63:427-438.

Fernández-Aunión C, Ben Hamouda T, Iglesias-Guerra F, Argandoña M, Reina-Bueno M, Nieto JJ,

Aouani ME, Vargas C, 2010. Biosynthesis of compatible solutes in rhizobial strains isolated

from Phaseolus vulgaris nodules in Tunisian fields. BMC Microbiol. 192.

Ferreira L, Sánchez-Juanes F, García-Fraile P, Rivas R, Mateos PF, Martínez-Molina E, González-

Buitrago JM, Velázquez E, 2011. MALDI-TOF mass spectrometry is a fast and reliable

platform for identification and ecological studies of species from family Rhizobiaceae. PLoS

One. 6:220-223.

Fougère F, Le Rudulier D, Streeter JG, 1991. Effet of Salt Stress on Amino Acid, Organic Acid, and

Carbohdrate Composition of Roots, Bacteroids, and Cytosol of Alfalfa (Medicago sativa L.).

Plant Physiology 96:1228-1236.

Fox GE, Stackebrant E, Hespell RB, Gibson J, Maniloff J, Dyer TA, Wolfe RS, Balch WE, Tanner

RS, Magrum LJ, Zablen LB, Blakemore R, Gupta R, Bonen L, Lewis BJ, Stahl DA, Luehrsen

KR, Chen KN, Woese CR, 1980. The phylogeny of prokaryotes. Science. 209:457-63.

Foyer CH, Noctor G, 2005. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-evaluation of the concept

of oxidative stress in a physiological context. Plant Cell Environ. 28:1056-1071.

Franco AA, Preira JC, Neyra CA, 1979. Seasonal patterns of nitrate reductase and nitrogenase

activities in Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol. 63:421-424

Freytag GF, Debouck DG, 2002. Taxonomy, distribution, and ecology of the genus Phaseolus

(Leguminosae–Papilionoideae) in North America, Mexico and Central America. Sida Bot Misc

23. Botanical Research Institute of Texas.


84

Fu J, Huang B, 2001. Involvement of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation of two

coolseason grasses to localized drought stress. Environmental and Experimental Botany.

45:105-114.

Fukuda A, Chiba K, Maeda M, Nakamura A, Maeshima M, Tanaka Y, 2004. Effect of salt and

osmotic stresses on the expression of genes for the vacuolar H+-pyrophosphatase, H

+-ATPase

subunit A, and Na+/H

+ antiporter from barley. J Exp Bot 55:585–94

Gálvez L, González EM, Arrese-Igor C, 2005. Evidence of carbon flux shortage and carbon/nitrogen

interactions in pea nodules in conditions of water stress. J Exp Bot 56: 2551-2560

García-Fraile P, Mulas-García D, Peix A, Rivas R, González-Andrés F, Velázquez E, 2010. Phaseolus

vulgaris is nodulated in northern Spain by Rhizobium leguminosarum strains harboring two

nodC alleles present in American Rhizobium etli strains: biogeographical and evolutionary

implications. Can. J. Microbiol. 56:657-666.

Garg N, Singla R, 2004. Growth, photosynthesis, nodule nitrogen and carbon fixation in the chickpea

cultivars under salt stress. Braz J Plant Physiol 16(3):137-146

Gaunt MW, Turner SL, Rigottier-Gois L, Lloyd-Macgilp SA, Young JWP, 2001. Phylogenies of atpD

and recA support the small subunit rRNA-based classification of rhizobia. Int. J. Syst. Evol.

Microbiol. 51:2037-2048.

Geetanjali M, Neera G, 2008. Salinity and its effects on the functional biology of legumes. Acta

Physiol Plant. 30:595–618.

Georgiadis MM, H Komiya, P Chakrabarti, D Woo, JJ Kornuc, DC Rees, 1992. Crystallographic

structure of the nitrogenase iron protein from Azotobacter vinelandii. Science. 257:1653-1659.

Georgiev GI, Atkins CA, 1993. Effects of salinity on N2 fixation, nitrogen metabolism and export and

diffusive conductance of cowpea root nodules. Symbiosis 15(3):239-255

Gepts P, Debouck D, 1991. Origin, domestication, and evolution of the common bean (Phaseolus

vulgaris L.). p. 7-53. In A. van Schoonhoven and O. Voysest (ed.) Common beans: Research for

crop improvement. C.A.B. Intl, Wallingford, UK and CIAT, Cali, Colombia.

Gepts P, Francisco JL, Aragão Everaldo de Barros, Matthew W. Blair, Rosana Brondani, 2008.

Genomics of Phaseolus Beans, a Major Source of Dietary Protein and Micronutrients in the

Tropics, In: P.H. Moore, R. Ming (eds.), Genomics of Tropical Crop Plant. Springe, pp. 113-

143

Ghassemi F, Jakeman AJ, Nix HA, 1995. Salinization of land and water resources. Human causes,

extent management and case studies. University of New South Wales Press Ltd, Sydney

Gogorcena Y, Iturbeormaetxe I, Escuredo PR, Becana M, 1995. Antioxidant defenses against

activated oxygen in pea nodules subjected to water-stress. Plant Physiology 108:753-759.

Gong Y, Toivonen P, Lau OL, Wiersma PA, 2001. Antioxidant system level in `Braeburn` apple is

related to its browning disorder. Bot. Bull. Acad. Sin. 42:259-264.

Gonzalez V, Santamaria RI, Bustos P, Hernandez-Gonzalez I, Medrano-Soto A, Moreno-Hagelsieb G,

Janga SC, Ramirez MA, Jimenez-Jacinto V, Collado-Vides J, 2006. The partitioned Rhizobium

etli genome: Genetic and metabolic redundancy in seven interacting replicons. Proc Natl Acad

Sci U S A.

Graham PH, 1981 Some problems of nodulation and symbiotic nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris

L. a review, Field Crops Res. 4:98-112.

Graham PH, Vance CP, 2003. Legumes: Importance and constraints to greater use. Plant Physiol 131:

872–877

Grattan SR, Grieve CM, 1999. Salinity mineral nutrient relations in horticultural crops. Sci Hortic

78(1-4):127-157

Halliwell B, Gutteridge JMC, 1989. Free radicals in biology and medicine. Clarendon Press, Oxford.

Hardarson, G, Danso SKA, 1993. Methods for measuring biological nitrogen fixation in grain

legumes. Plant Soil 152: 19-23.

Hasegawa, PM, Bressan RA, Zhu JK, Bohnert HJ, 2000. Plant cellular and molecular responses to

high salinity. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bio. 51:463-499.

Hausinger RP, JB Howard, 1983. Thiol reactivity of the nitrogenase Fe-protein from Azotobacter

vinelandii. J. Biol. Chem. 258:13486-13492.


85

Heath RL, L Packer, 1968. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stochiometry of

fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophy. 125: 189-198.

Herrera MA, Bedmar EJ, Olivares J, 1985. Host specificity of Rhizobium strains isolated from

nitrogen-fixing trees and nitrogenase activities of strain GRH2 in symbiosis with Prosopis

chilensis. Plant Sci. 42:177-182.

Hill S, 1988. How is nitrogenase regulated by oxygen? FEMS Microbiology Letters, 54:111-129.

Hinsinger P, Plassard C, Tang C, Jaillard B, 2003. Origins of roots mediated pH changes in the

rhizosphere and their response to the environmental constraints. A review Plant soil 248: 43-59

Hirsch AM, 1992. Tansley Review no 40: Developmental biology of legume nodulation. New

Phytologist 122:211-237.

Hori K, Wada A, Shibuta T, 1997. Changes in phenoloxidase activities of the gals on leaves of Ulmus

davidana formed by Tetraneura fusiformis (Homoptera: Eriosomatidae). Appl.Entomol. Zool.

32:365-371.

Hu Y, Schmidhalter U, 2001. Reduced cellular crosssectional area in the leaf elongation zone of wheat

causes a decrease in dry weight deposition under saline conditions. Aust. J. Plant Physiol, 28:

165-170.

Hungria M, Franco Aet Sprent JI, 1993. New sources of high temperature tolerant rhizobia for

Phaseolus vulgaris L. Plant and Soil 149:103-109.

Ianetta PM, de Lorenzo C, James EK, Fernandez-Pascual M, Sprent JI, Lucas M, WittYF J, de Felipe

MR, Minchin FR, 1993. Oxygen diffusion in lupin nodules. I. Visualisation of diffusion barrier

operation. J. Exp. Bot. 44:1461-1467.

Iglesias O, Rivas R, García-Fraile P, Abril A, Mateos PF, Martínez-Molina E, Velázquez E, 2007.

Genetic characterization of fast-growing rhizobia able to nodulate Prosopis alba in North Spain.

FEMS Microbiol. Lett. 277:210-216.

Iordăchescu D, Dumitru IF, 1988. Biochimie practică, ed. 2a, Univ. Bucureşti, p. 132.aducti

Isoi T & Yoshida S, 1991. Low nitrogen fixation of cornmon bean (Phaseolus vulgaris). Soil Sci. and

Plant Nutrition 37:559-563.

Iturriaga G, Suárez R, Nova-Franco B, 2009. Trehalose Metabolism: From Osmoprotection to

Signaling. Int. J. Mol. Sci., 10:3793-3810.

James EK, Sprent JI, Hay GT, Minchin FR, 1993. The effect of irradiance on the recovery of soybean

nodules from sodium chloride induced senescence. J Exp Bot 44:997-1005

Jansa J, A Bationo, E Frossard, IM Rao, 2011. Options for Improving Plant Nutrition to Increase

Common Bean Productivity in Africa. Fighting poverty in sub-saharan africa: the multiple roles

of legumes in integrated soil fertility management 2011:201-240.

Jebara S, Jebara M, Limam F, Aouani ME, 2005. Changes in ascorbate peroxidase, catalase, guaiacol

peroxidase and superoxide dismutase activities in common bean (Phaseolus vulgaris) nodules

under salt stress. Journal of Plant Physiology 162:929-936.

Jia W, Wang Y, Zhang S, Zhang J, 2002. Salt-stress-induced ABA accumulation is more sensitively

triggered in roots than in shoots. J Exp Bot 53:2201-2206

Jordan DC, 1984. Family III. Rhizobiaceae, p. 234-242. In N. R. Krieg, and J. G. Holt (ed.), Bergey's

manual of systematic bacteriology. Williams and Wilkins Co, Baltimore, Md.

Jukanti AK, Bruckner PL, Habernicht DK, Foster CR, Martin GM, Fischer AM, 2003. Extraction and

activation of wheat polyphenol oxidase by detergents: biochemistry and applocation. Cereal

Chem. 80:712-716.

Juszczuk I, Malusà E, Rychter AM, 2001. Oxidative stress during phosphate deficiency in roots of

bean plants (Phaseolus vulgaris L.) J. Plant Physiol. 158:1299-1305..

Kahn ML, McDermott TM, Udvardi MK, 1998. Carbon and Nitrogen Metabolism in Rhizobia En:

“The rhizobiaceae” HP Spaink, A Kondorosi, PJJ Hooykaas (Eds.). pp.461-485 Kluwer

Academisc Publishers Dordrecht, Netherland.

Kaminski A, 1991 Symbiose fixatrices d'azote Rhizobium-Légumineuses. Bull. Soc. Franç. Microbiol.

6 :19-22

Kangfu Yu, 2011. Bacterial Artificial Chromosome Libraries of Pulse Crops: Characteristics and

Applications. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Article ID: 493186, 8 pages.


86

Kidd PS, Llugan M, Poschhenrieder C, Gunse B. and Barceló J, 2001. The role of root exudates in

aluminum resistance and silicon induced amelioration of aluminum toxicity in three varieties of

maize (Zea mays L.). J. Exp. Bot. 52:1339-1352.

Kimura M, 1980. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through

comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16, 111–120.

Kormutak A, Vookova B, 2001. Peroxidase activity in nonembryogenic and embryogenic calli and in

developing somatic embryos of white fir (Abies concolor Gord. Et Glend). Plant Biosyst.

135:101-105.

Kouas S, Labidine N, Debez A, Abdelly C, 2005. Effect of P on nodule formation and N fixation in

bean, Agron. Sustain. Dev. 25:389-393.

Kovda VA, 1983. Loss of productive land due to salinization. Ambio. 12:91-93.

Kwon SW, Park JY, Kim JS, Kang JW, Cho YH, Lim CK, Parker MA, Lee GB, 2005. Phylogenetic

analysis of the genera Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium and Sinorhizobium on the

basis of 16S rRNA gene and internally transcribed spacer region sequences. Int J Syst Evol

Microbiol. 55(1):263-70.

Laguerre G, Fernandez MP, Edel V, Normand P, Amarger N, 1993. Genomic heterogeneity among

French Rhizobium strains isolated from Phaseolus vulgaris L. Int. J. Syst. Bacteriol. 43:761-

767.

Laguerre G, Nou MN, Macheret V, Sanjuan J, Drouin P, Amarger N, 2001. Classification of rizobia

based on nodC and nifH gene analysis reveals a close phylogenetic relationship among

Phaseolus vulgaris symbionts. Microbiology. 147:981-993.

Läuchli A, 1984. Salt Exclusion: An adaptation of legumes for crops and pastures under saline

conditions. 171-187. In: Staples RC, Toenniessen G H (eds) Salinity Tolerance in Plants:

Strategies for Crop Improvement, John Wiley and Sons, Inc.

León-Barrios M, Lorite MJ, Donate-Correa J, Sanjuán J, 2009. Ensifer meliloti bv. lancerottense

establishes nitrogen-fixing symbiosis with Lotus endemic to the Canary Islands and shows

distinctive symbiotic genotypes and host range. Syst. Appl. Microbiol. 32:413-420.

Lima ALS, DaMatta FM, Pinheio HA, Totola MR, Loureiro ME, 2002. Photochemical responses and

oxidative stress in two clones of Coffea canephora under water deficit conditions.

Environmental and Experimental Botany 47:239-247.

Lin CC, Kao CH, 1999. NaCl induced changes in ionically bound peroxidase activity in roots of rice

seedlings. Plant Soil. 216:147-153.

Lopez M, Herrera CJA, Iribarne C, Tejera NA, Lluch C, 2006. Growth and nitrogen fixation in Lotus

japonicus and Medicago truncatula under NaCl stress: Nodule carbon metabolism. Journal of

Plant Physiology 165, 641-650.

Lopez M, Herrera-Cervera JA, Iribarne C, Tejera NA, Lluch C, 2008a. Growth and nitrogen fixation

in Lotus japonicus and Medicago truncatula under NaCl stress: nodule carbon metabolism.

Journal of Plant Physiology 165: 641-650.

Lopez M, Tejera GNA, Iribarne C, Lluch C, Cervera HJA, 2008b. Trehalose and trehalase in root

nodules of Medicago truncatula and Phaseolus vulgaris in response to salt stress. Physiologia

Plantarum. 134:575–582.

López-Gómez M, Lluch C, 2012. Trehalose and Abiotic Stress Tolerance. Abiotic stress responses in

plants. 253-265, DOI: 10.1007/978-1-4614-0634-1_14

Ludwig W, Amann R, Martinez-Romero E, Schönhuber W, Bauer S, Neef A, Schleifer KH, 1998.

rRNA based identification systems for rhizobia and other bacteria. Plant and Soil. 204:1-19.

Ludwig W, Rossello-Mora R, Aznar R, Klugbauer S, Spring S, Reetz K, Beimfohr C, Brockmann E,

Kirch-hof G, Dorn S, Bachleitner M, Klugbauer N, Sprin-ger N, Lane D, Weizenegger M,

Schleifer KH, 1995. Comparative sequence analysis of 23S rRNA from Proteobacteria. Syst

Appl Microbiol. 18:164-88.

Ludwig W, Schleife KH, 1994. Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis.

FEMS Microbiol Reviews. 15:155-173.

Macheix JJ, 1974. Les esters hydroxycinnamiques de la pomme : Identification, variation au cours de

la croissance du fruit et métabolisme. Thèse doctorat état sci. nat, Paris, 168 p.


87

Manchanda G, Garg N, 2008. Salinity and its effects on the functional biology of legumes. Acta

Physiol Plant 30:595-618

Mandri B, Drevon JJ, Bargaz A, Oufdou K, Faghire M, Plassard C, Payre H, Ghoulam C, 2011.

Interactions between common bean (Phaseolus vulgaris) genotypes and rhizobia strains isolated

from Moroccan soils for growth, phosphatase and phytase activities under phosphorus

deficiency conditions. J Plant Nutr.34: (article in press).

Mansour MM, 2000. Nitrogen containing compounds and adaptation of plants to salinity stress. Biol

Plant 43(4):491-500

Maréchal R, Mascherpa JM, Stainier F, 1978. Etude taxonomique d’un groupe complex d’espèces des

genres Phaseolus et Vigna sur la base de données morphologiques et polliniques traitées par

l’analyse informatique. Boisiera 28: 273.

Marino D, Frendo P, Ladrera R, Zabalza A, Puppo A, Arrese-Igor C, González EM, 2007. Nitrogen

fixation control under drought stress: localised or systemic? Plant Physiol. 143:1968-1974.

Martinez JP, Silva H, Ledent JF, Pinto M, 2007. Effect of drought stress on the osmotic adjustment,

cell wall elasticity and cell volume of six cultivars of common beans (Phaseolus vulgaris L.).

European Journal of Agronomy 26: 30-38.

Martinez Romero E, Segovia L, Martins Mercante F, Franco A, Graham P, Pardo MA, 1991.

Rhizobium tropici, a novel species nodulating Phaseolus vulgaris L. beans et Leucaena sp.

International Journal of Systematic Bacteriology, 417-426

Martínez-Romero E, Caballero-Mellado J, 1996. Rhizobium Phylogenies and Bacterial Genetic

Diversity. Crit. Rev. Plant Sci. 15:113-140.

McIntyre HJ, Davies H, Hore TA, Miller SH, Dufour JP, Ronson CW, 2007. Trehalose biosynthesis

in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii and its role in desiccation tolerance. Appl. Environ.

Microbiol. 73:3984-3992

Mengel K, Kirkby EA, 2001. Principles of Plant Nutrition. Kluwer Academic Publishers,

Dordrecht/Boston/London.

Mhadhbi H, Jebara M, Limam F, Aouani ME, 2004. Rhizobial strain involvement in plant growth,

nodule protein composition and antioxidant enzyme activities of chickpea rhizobia

symbioses: modulation by salt stress. Plant Physiology and Biochemistry 42: 717-722.

Michiels J, Moris M, Dombrecht B, Verreth C, Vanderleyden J, 1998. Differential regulation of

Rhizobium etli rpoN2 gene expression during symbiosis and free-living growth. J Bacteriol

180:3620-3628.

Miller KJ, Wood JM, 1996. Osmoadaptation by rhizosphere bacteria, Annu. Rev. Microbiol. 50:101-

136.

Mittler R, 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance, Trends Plant Sci. 7:405-410.

Mnasri B, Mrabet M, Laguerre G, Aouani ME, Mhamdi R, 2007. Salt-tolerant rhizobia isolated from a

Tunisian oasis that are highly effective for symbiotic N2-fixation with Phaseolus vulgaris

constitute a novel biovar (bv. mediterranense) of Sinorhizobium meliloti. Arch. Microbiol.

187:79-85.

Molina A, Bueno P, Marin MC, RodriguezRosales MP, Belver A, Venema K, Donaire JP, 2002.

Involvement of endogenous salicylic acid content, liPODygenase and antioxidant enzyme

activities in the response of tomato cell suspension cultures to NaCl. New Phytologist. 156:409-

415.

Moschetti G, Peluso A, Protopapa A, Anastasio M, Pepe O, Defez R, 2005. Use of nodulation pattern,

stress tolerance, nodC gene amplification, RAPD-PCR and RFLP-16S rDNA to discriminate

genotypes of Rhizobium leguminosarum biovar viciae. Syst. Appl. Microbiol. 28:619-631.

Mouhsine B, Prell J, Filali-Maltouf A, Priefer UB, Aurag J, 2007. Diversity, phylogeny and

distribution of bean rhizobia in salt-affected soils of North-West Morocco. Symbioses 43:83-96.

Muckenschnabel I, Williamson B, Goodman BA, Lyon GD, Stewart D, Deighton N, 2001. Markers

for oxidative stress associated with soft rots in French beans (Phaseolus vulgaris) infected by

Botrytis cinerea. Planta. 212:376-381.

Mulas D, García-Fraile P, Carro L, Ramírez-Bahena MH, Casquero P, Velázquez E, González-Andrés

F, 2011. Distribution and efficiency of Rhizobium leguminosarum strains nodulating Phaseolus


88

vulgaris in Northern Spanish soils: Selection of native strains that replace conventional N

fertilization. Soil Biol. Biochem. 43:2283-2293.

Mulder L, Hogg B, Bersoult A, Cullimore JV, 2005. Integration of signalling pathways in the

establishment of the legume-rhizobia symbiosis. Physiol. Plant. 123:207-218.

Munns R, Termaat A, 1986. Whole plant responses to salinity. Aust J Plant Physiol 13:143-160.

Myers JR, 2000. Tomorrow’s snap bean cultivars. p.39-51. In Singh, S.P. (ed.) Bean reseach,

production and utilization. Proc. Idaho bean workshop. Univ. of Idaho, Moscow, ID. Singh, S.P.

1992. Common bean improvement in the tropics. Plant Breed. Rev. 10:199-269.

Nandasena KG, O'Hara GW, Tiwari RP, Willlems A, Howieson JG, 2007. Mesorhizobium ciceri

biovar biserrulae, a novel biovar nodulating the pasture legume Biserrula pelecinus L. Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. 57:1041-1045.

Ndakidemi PA, Dakora FD, Nkonya EM, Ringo D, Mansoor H, 2006. Yield and economic benefits of

common bean (Phaseolus vulgaris L.) and soybean (Glycine max L. Merr.) inoculation in

northern Tanzania. Aust J Exp Agric 46(4):571-577

Ndèye FD, 2002. Utilisation des inoculums de rhizobium pour la culture du haricot (Phaseolus

vulgaris) au Sénégal. Thèse de docteur de biologie végétale. Pages 97. Faculté des Sciences et

Techniques, Université Cheikh Anta Diop , Dakar, Sénégal.

Obaton M, Miquel M, Robin P, Conejero G, Domenach AM, Bardin R, 1982. Influence d'un déficit

hydrique sur l'activité nitrate réductase et nitrogénase chez le soja. CR.Acad. Sei. (Paris)

294:1007-1112.

Ober ES, Sharp RE, 1994. Proline accumulation in maize (Zae Mays L.) primary roots at low water

potentials.I. Requirement for increased levels of abscisic acid. Plant Physiol 105: 981-987.

Ohno T, Zibilske LM, 1991. Determination of low concentrations of phosphorus in soil extracts using

malachite green. Soil Sci. Soc. Am. J. 55:892–895

Olmos E, Hellin E, 1997. Cytochemical localization of ATPase plasma membrane and acid

phosphatase by cerium based in a salt-adapted cell line of Pisum sativum. J. Exp. Bot. 48:1529-

1535.

Padilla L, Kramer R, Stephanopoulos G, Agosin E, 2004. Overproduction of trehalose: heterologous

expression of Escherichia coli trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate

phosphatase in Corynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol. 70:370–376.

Parida AK, Das AB, 2005. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Ecotoxicol Environ

Saf. 60: 324-349.

Paridaa AK, Dasa AB, 2005. Salt tolerance and salinity effects on plants. Ecotoxicology and

Environmental Safety 60:324-349.

Parsons R, Day DA, 1990. Mechanism of soybean nodule adaptation ta different oxygen pressures.

Plant, Cell et Environment, 13: 501-512.

Penheiter AR, Duff SMG, Sarath G, 1997. Soybean root nodule acid phosphatase. Plant Physiol.

114:597–604

Peoples MB, Lilley DM, Burnett VF, Ridley AM, Garden DL, 1995. Effects of surface application of

lime and superphosphate to acid soils on growth and N2 fixation by subterranean clover in

mixed pasture sward. Soil Biol. Biochem. 27(4-5):663-671

Pereira PA, Bliss FA, 1987. Nitrogen fixation and plant growth of common bean (Phaseolus vulgaris

L.) at different levels of phosphorus availability. Plant Sail 104: 79-84.

Peters JW, MH Stowell, SM Soltis, MG Finnegan, MK Johnson, DC Rees, 1997. Redox-dependent

structural changes in the nitrogenase P cluster. Biochemistry. 36:1181-1187.

Pope MR, LL Saari, PW Ludden, 1986. N-glycohydrolysis of adenosine diphosphoribosyl arginine

linkages by dinitrogenase reductase activating glycohydrolase (activating enzyme) from

Rhodospirillum rubrum. J. Biol. Chem. 261:10104-10111.

Puppo A, B Halliwell, 1988. Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence

of iron. Is hemoglobin a biological Fenton reagent? Biochem. Jour. 249:185-190

Radeva G, Jurgens G, Niemi M, Nick G, Suominen L, Lindström K, 2001. Description of two biovars

in the Rhizobium galegae species: biovar orientalis and biovar officinalis. Syst. Appl.

Microbiol. 24:192-205.


89

Rainey KM, Griffiths PD, 2005. Inheritance of heat tolerance during reproductive development in

snap bean (Phaseolus vulgaris L.). J. Am. Soc. Hortic. Sci. 130:700-706.

Ramachandra Reddy A, Chaitanya KV, Jutur PP, Sumithra K, 2004. Differential antioxydative

responses to water stress among five mulberry (Morus alba L.) cultivars.Environmental and

Experimental Botany. 52:33-42.

Ramírez-Bahena MH, Velázquez E, Fernández-Santos F, Peix A, Martínez-Molina E, Mateos PF,

2009. Phenotypic, genotypic and symbiotic diversity in strains nodulating clover in different

soils in Spain. Can. J. Microbiol. 55:1207-1216.

Refik U, Ümmühan K, 2011. Effects of different salt concentrations and Rhizobium inoculation (native

and Rhizobium tropici CIAT899) on growth of dry bean (Phaseolus vulgaris L.). European

Journal of Soil Biology 47:387-391

Rengasamy P, 2006. World salinization with emphasis on Australia. J Exp Bot 57:1017-1023.

Rhoades JD, 1984. Principles and methods of monitoring soil salinity. In soil salinity and irrigation:

processes and management, Shainberg and Shalhevet. Berlin SpringerVerlag 130-142.

Ribeiro RA, Rogel MA, López-López A, Ormeño-Orrillo E, Gomes-Barcellos F, Martínez J, Lopes-

Thompson F, Martínez-Romero E, Hungria M, 2011. Reclassification of Rhizobium tropici type

A strains as Rhizobium leucaenae sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

doi:10.1099/ijs.0.032912-0

Rigaud J, Puppo A, 1975. Indole-3-acetic acid (IAA) oxidation by leghemoglobin from soybean

nodules. Physiol. Plant, 35:181-185.

Rivas R, García-Fraile P, Mateos PF, Martínez-Molina E, Velázquez E, 2007a. Characterization of

xylanolytic bacteria presents in the bract phyllosphere of the date palm Phoenix dactylifera.

Lett. Appl. Microbiol. 44:181-187.

Rivas R, Laranjo M, Velázquez E, Mateos PF, Oliveira S, Martínez-Molina E, 2007b. Strains of

Mesorhizobium amorphae and M. tianshanense carrying symbiotic genes of common chickpea

endosymbiotic species constitute a novel biovar (ciceri) able to nodulate Cicer arietinum. Lett.

Appl. Microbiol. 44:412-418.

Rivas R, Peix A, Mateos PF, Trujillo ME, Martinez-Molina E, Velázquez E, 2006. Biodiversity of

populations of phosphate solubilizing rhizobia that nodulate chickpea in different Spanish soils.

Plant Soil, 287:23-33.

Rivas R, Velázquez E, Palomo JL, Mateos P, García-Benavides P, Martínez-Molina E, 2002. Rapid

identification of Clavibacter michiganensis subspecies sepedonicus using two primers random

amplified polymorphic DNA (TP-RAPD) fingerprints. Eur. J. Plant Pathol. 108:179-184.

Robledo M, Velázquez E, Ramírez-Bahena MH, García-Fraile P, Pérez-Alonso A, Rivas R, Martínez-

Molina E, Mateos PF, 2011. The celC gene, a new phylogenetic marker useful for taxonomic

studies in Rhizobium. Syst. Appl. Microbiol. 34:393-399.

Rodriguez-Navarro DN, Dardanelli MS et Ruiz-Sainz JE, 2007. Attachment of bacteria to the roots of

higher plants. FEMS Microbiol Lett. 272:127-136.

Rogel MA, Ormeño-Orrillo E, Martinez Romero E, 2011. Symbiovars in rhizobia reflect bacterial

adaptation to legumes. Syst. Appl. Microbiol. 34:96-104.

Rossello-Mora R, Rudolf A, 2001. The species concept for rokaryotes. FEMS Microbiology Reviews.

25 39-67.

Rubio LM, Ludden PW, 2008. Biosynthesis of the iron molybdenum cofactor of nitrogenase. Annual

Review of Microbiology 62: 93-111.

Rubio MC, Becana M, Sato S, James EK, Tabata S, Spaink HP, 2007. Characterization of genomic

clones and expression analysis of the three types of superoxide dismutases during nodule

development in Lotus japonicus. Molecular Plant–Microbe Interactions 20: 262-275.

Rustérucci C, Stallaert V, Pugin A, Ricci P, Blein JP, 1996. Relationship between AOS, lipid

peroxidation, necrosis and phytoalexin production induced by elicitins in Nicotiana. Plant

Physiol. 111:885-891.

Saadallah K, Drevon JJ, Abdelly C, 2001. Nodulation et croissance nodulaire chez le haricot

(Phaseolus vulgaris) sous contrainte saline. Agronomie. 21: 627-634.

Saïdi S, Mnasri B, Mhamdi R, 2011. Diversity of nodule-endophytic agrobacteria-like strains

associated with different grain legumes in Tunisia. Syst. Appl. Microbiol. 34:524-530.


90

Sairam RK, Tyagi A, 2004. Physiological and molecular biology of salinity stress tolerance in plants.

Curr. Sci. 86:407-420.

Sairam RK, Veerabhadra R, Srivastava GC, 2002. Differential response of wheat genotypes to long

term salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity andosmolyte

concentration. Plant Science. 163:1037-1046.

Saitou N, Nei M, 1987. A neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetics

trees. Mol. Biol. Evol. 44:406-425.

Salehi M, Salehi F, Poustini K, Heidari-Sharifabad H, 2008. The effect of salinity on the nitrogen

fixation in four cultivars of Medicago sativa L. in the seedling emergence stage. Research

Journal of Agriculture and Biological Sciences 4:413-415.

Salminen SO, JG Streeter, 1986. Enzymes of a,a-trehalose metabolism in soybean nodules. Plant

Physiol 81:538-541

Sanders D, Brownlee C, Harper JF, 1999. Communicating with calcium. Plant Cell 11, 691-706.

Santos CV, Falcao IP, Pinto GC, Oliveira H, Loureiro J, 2002. Nutrient responses and glutamate and

proline metabolism in sunflower plants and calli under Na2SO4 stress. J Plant Nutr Soil Sci

165(3):366-372

Sardowsky MJ, Cregan P, Band Keyser H, 1988. Nodulation and nitrogen fixation efficacy of

Rhizobium fredii with Phaseolus vulgaris genotypes. Appl. Environ. Microbiol. 54:1907-1910.

Schlegel Hans G, 1997. Microbiología General, 7ª edición, Ediciones Omega S. A, Barcelona, España.

Schleifer KH, 2004. Microbial diversity: facts, problems and prospects. Syst Appl Microbiol. 27:3-9.

Schleifer KH, Stackebrandt E, 1983. Molecular systematics of prokaryotes. Ann Rev Microbiol.

37:143-87.

Schneider A, 1892. Observations on some American rhizobia. Bull. Torrey Bot. Club 19:203-218.

Schulze J, 2004. How are nitrogen fixation rates regulated in legumes? J Plant Nutr Soil. Sci. 167:

125-137.

Seeman JR, Sharkey TD, 1986. Salinity and nitrogen effects on photosynthesis, ribulose 1, 5

biphosphate carboxylase and metabolite pool sizes in Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol

82(2):555-560

Segovia L, Young JPW, Martinez-Romero E, 1993. Reclassification of American Rhizobium

leguminosarum biovar phaseoli type 1 strains as Rhizobium etli sp. Nov. Int. l. Syst. Bactcriol.

43:374-377.

Selote DS, Bharti S, Khanna Chopra R, 2004. Drought acclimation reduces Accumulation and lipid

peroxidation in wheat seedlings. Biochemical and Biophysical Research Communications.

314:724-729.

Serraj R, Fleurat LP, Jaillard B, Drevon JJ, 1995. Structural changes in the inner-cortex cells of

soybean root-nodules are induced by short-term exposure to high salt or oxygen concentrations.

Plant Cell Environ 18(4):455-462

Serraj R, Roy G, Devron JJ, 1994. Salt stress induces a decrease in the oxygen uptake of soybean

nodules and their permeability to oxygen diffusion. Physiol Plant 91:161-168.

Serraj R, Vasquez DH, Drevon JJ, 1998. Effects of salt stress on nitrogen fixation, oxygen diffusion

and ion distribution in soybean, common bean and alfalfa. J Plant Nutr 21(3): 475-488

Serrat R, 2002. Response of symbiotic nitrogen fixation to drought and salinity stress. Physiology

Molecular Biology Plant 8: 77-86.

Shamseldin A, Werner D, 2005. High salt and high pH tolerance of new isolated Rhizobium etli strains

from Egyptian soils. Curr. Microbiol. 50:11-16.

Shao HB, Liang ZS, Shao MA, Wang BC, 2005. Changes of antioxidative enzymes and membrane

peroxidation for soil water deficits among 10 wheat genotypes at seedling stage. Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces. 42:107-113.

Shao N, KriegerLiszkay A, Schroda M, Beko CF, 2007. A reporter system for the individual detection

of hydrogen peroxide and singlet oxygen: its use for the assay of reactive oxygen species

produced in vivo. The Plant Journal 50:475-48.

Sharma KK, Lavanya M, 2002. Recent developments in transgenics for abiotic stress in legumes of the

semi-arid tropics. JIRCAS Working Report 23:61-73.


91

Shetty NP, Kristensen BK, Newman MA, Moller K, Gregersen PL, Jorgensen HJL, 2003. Association

of hydrogen peroxide with restriction of Septoria tritici in resistant wheat. Physiol. Mol. Plant

Pathol. 62:333-346.

Silva C, Vinuesa P, Eguiarte LE, Martínez-Romero E, Souza V, 2003. Rhizobium etli and Rhizobium

gallicum nodulate common bean (Phaseolus vulgaris) in a traditionally managed milpa plot in

Mexico: population genetics and biogeographic implications. Appl. Environ. Microbiol. 69:884-

893.

Silva C, Vinuesa P, Eguiarte LE, Souza V, Martínez-Romero E, 2005. Evolutionary genetics and

biogeographic structure of Rhizobium gallicum sensu lato, a widely distributed bacterial

symbiont of diverse legumes. Mol. Ecol. 14:4033-4050.

Singh SP, 1992. Common bean improvement in the tropics. Plant Breed. Rev. 10: 199-269.

Singleton PW, El-Swaifi SA, Bohlool BB, 1982. Effect of salinity on Rhizobium growth and survival.

Appl. Environ. Microbiol. 44:884-890.

Soussi M, Khadri M, Lluch C, Ocana A, 2001. Carbon metabolism and bacteroid respiration in

nodules of chick-pea (Cicer arietinum L.) plants grown under saline conditions. Plant Biosyst

135(2):157-164

Soussi M, Lluch C, Ocaña A, 1999. Comparative study of nitrogen fixation and carbon metabolism in

two chickpea (Cicer arietinum L.) cultivars under salt stress. Journal of Experimental Botany

50:1701-1708.

Soussi M, Ocana A, Lluch C, 1998. Effect of salt stress on growth, photosynthesis and nitrogen

fixation in chick-pea (Cicer arietinum L.). J Exp Bot 49(325):1329-1337

Spollen WG, LeNoble ME, Timmy DS, Bernstein N, Sharp RE, 2000. Abscisic acid accumulation

maintains maize primary root elongation at low water potentials by restricting ethylene

production. Plant Physiol 122: 967-976

Stackebrandt E, Goebel BM, 1994. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S

rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J Syst Bacteriol.

44:846–849.

Sugawara M, Cytryn EJ, Sadowsky MJ, 2010. Functional role of Bradyrhizobium japonicum trehalose

biosynthesis and metabolism genes during physiological stress and nodulation. Appl. Environ.

Microbiol. 76:1071-1081.

Sutton WD , 1983. Nodule developpe, et and senescence. In: Broughton ZJ, ed. Nitrogen fixation,

Volume 1 (Legumes). Oxford: Clarendon Press. 144-212

Takahama U, Oniki T, 2000. Flavonoid and some other phenolics as substrates of peroxidase:

physiological significance of the redox reactions. J. Plant Res. 113:301-309.

Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S, 2011. MEGA5: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and

Maximum Parsimony Methods. Mol. Biol. Evol. 4. doi: 10.1093/molbev/msr121

Tang C, Hinsinger PJ, Jaillard B, Rengelz Z, Drevon JJ, 2001. Effect of phosphorus deficiency on the

growth, symbiotic N2 fixation and proton release by two bean (Phaseolus vulgaris) genotypes,

Agronomie. 21:683-689.

Tang W, Newton RJ, 2004. Increase of polyphénol oxidase and decrease of polyamines correlate with

tissue browning in Virginia pine (Pinus virginiana Mill.). Plant science. 167:621-628.

Tejera G NA, Olivera M, Iribarne C, Lluch C, 2004a. Partial purification and characterization of a

non-specific acid phosphatase in leaves and root nodules of Phaseolus vulgaris. Plant Physiol

Biochem 42:58-5591.

Tejera NA, Campos R, Sanjuan J, Lluch C, 2004b. Nitrogenase and antioxidant enzyme activities in

Phaseolus vulgaris nodules formed by Rhizobium tropici isogenic strains with varying

tolerance to salt stress. Journal of Plant Physiology 161: 329-338.

Tejera NA, Campos R, Sanjuan J, Lluch C, 2005. Effect of sodium chloride on growth, nutrient

accumulation, and nitrogen fixation of common bean plants in symbiosis with isogenic

strains. Journal of Plant Nutrition 28: 1907-1921.

Tejera NA, Iribarne C, Palma F, Lluch C, 2007. Inhibition of the catalase activity from Phaseolus

vulgaris and Medicago sativa by sodium chloride. Plant Physiology and Biochemistry 45:

535-541.


92

Teran H, Singh SP, 2002. Comparison of sources and lines selected for drought resistance

incommonbean. Crop Sci 42: 64-70.

Thibodeau P, Sand Jaworski EG, 1975. Pattern of nitrogen utilization in soybcan. Planta 127:133-147.

Thipyapong P, Melkonian J, Wolfe DW, Steffens JC, 2004. Suppression of polyphenol oxidases

increases stress tolerance in tomato. Plant Sci. 167:693-703.

Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG, 1997. The CLUSTAL_X

Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis

tools. Nucleic Acids Res. 25:4876-4882.

Turkan I, Bor M, Ozdemir F, Koca H, 2005. Differential responses of lipid peroxidation and

antioxidants in the leaves of drought-tolerant P. acutifolius Gray and drought-sensitive P.

vulgaris L. subjected to polyethylene glycol mediated water stress, Plant Sci. 168:223-231.

Vadez V, 1996. Variabilité génétique de la fixation d’azote sous carence en phosphore chez le haricot :

relations avec l’efficacité d’utilisation du P et la perméabilité nodulaire à l’oxygène. Thèse,

INRA de Montpellier.

Vadez V, Drevon JJ, 2001. Genotypic variability in phosphorus use efficiency for symbiotic N2

fixation in common bean (Phaseolus vulgaris). Agronomie 21(6-7):691-699.

Vadez V, Rodier F, Payre H, Drevon JJ, 1996. Nodule conductance to O2 and nitrogenase-linked

respiration in bean genotypes varying in the tolerance of N2 fixation to P deficiency, Plant

Physiol Biochem 34:871-878.

Valverde A, Igual JM, Peix A, Cervantes E, Velázquez E, 2006. Rhizobium lusitanum sp. nov. a

bacterium that nodulates Phaseolus vulgaris. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:2631-2637.

Valverde A, Velázquez E, Cervantes E, Igual JM, van Berkum P, 2011. Evidence of an American

origin for symbiosis-related genes in Rhizobium lusitanum. Appl. Environ. Microbiol. 77:5665-

5670.

Van Aarle V, Viennois G, Amenc LK, Tatry MV, Luu DT, Plassard C, 2007. Fluorescent in situ Rt-

PCR to visualise the expression of a phosphate transporter gene from an ectomycorrhzal fungus.

Mycorrihiza 17:487-494.

Van Rhijn P, Desair Vlassak K, Vanderleyden J, 1994. Functional analysis of nodD genes of

Rhizobium tropici CIAT899. Mol. Plant Microbe Interact. 7:666-677.

Vance CP, Johnson LEB, 1983. Plant determined ineVective nodules in alfalfa (Medicago sativa):

structural and biochemical comparisons. Canadian Journal of Botany 61:93-100.

Vance CP, Stade S, 1984. Alfalfa root nodule carbon dioxide fixation. II. Partial purification and

characterization of root nodule phosphoenolpyruvate carboxylase. Plant Physiology; 75:261-

264.

Velagaleti RR, Marsh S, 1989. Influence of host cultivars and Bradyrhizobium strains on the growth

and symbiotic performance of soybean under salt stress. Plant Soil 119(1):133-138.

Velikova VI, Yordavow, A. Edreva, 2000. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-

treated bean plants: Protective role of exogenous polyamines. Plant Sci, 151:59-66.

Verdoy D, De la Pena TC, Redondo FJ, Lucas MM, Pueyo JJ, 2006. Transgenic Medicago truncatula

plants that accumulate proline display nitrogen fixing activity with enhanced tolerance to

osmotic stress. Plant Cell and Environment 29: 1913-1923.

Villegas MC, Rome S, Mauré L, Domergue O, Gardan L, Bailly X, Cleyet-Marel JC, Brunel B, 2006.

Nitrogen-fixing sinorhizobia with Medicago laciniata constitute a novel biovar (bv.

medicaginis) of S. meliloti. Syst. Appl. Microbiol. 29:526-538.

Vincent JM, 1970. The cultivation, isolation and maintenance of rhizobia. In: Vincent, J.M. (Ed.). A

manual for the practical study of root-nodule. Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp. 1-

13.

Vinuesa P, León-Barrios M, Silva C, Willems A, Jarabo-Lorenzo A, Pérez-Galdona R, Werner D,

Martínez-Romero E, 2005b. Bradyrhizobium canariense sp. nov, an acid-tolerant endosymbiont

that nodulates endemic genistoid legumes (Papilionoideae: Genisteae) from the Canary Islands,

along with Bradyrhizobium japonicum bv. genistearum, Bradyrhizobium genospecies alpha and

Bradyrhizobium genospecies beta. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55:569-575.


93

Vinuesa P, Silva C, 2004. Species delineation and biogeography of symbiotic bacteria associated with

cultivated and wild legumes. En: Werner, D, Biological resources and migration. University of

Marburg, Germany (Ed.), pp. 143-155.

Vinuesa P, Silva C, Lorite MJ, Izaguirre-Mayoral ML, Bedmar EJ, Martínez-Romero E, 2005a.

Molecular systematics of rhizobia based on maximum likelihood and Bayesian phylogenies

inferred from rrs, atpD, recA and nifH sequences, and their use in the classification of Sesbania

microsymbionts from Venezuelan wetlands. Syst Appl Microbiol. 28:702-16.

Vriezen JAC, de Bruijn FJ, Nüsslein K, 2007. Responses of Rhizobia to Desiccation in Relation to

Osmotic Stress, Oxygen, and Temperature. Applied and Environmental Microbiology, 73:3451-

3459.

Waelkens F, Voets T, Vlassak K, Vanderleyden J, van Rhijn P, 1995. The nodS gene of Rhizobium

tropici strain CIAT899 is necessary for nodulation on Phaseolus vulgaris and on Leucaena

Leucocephala. Mol. Plant Microbe Interact. 8:147-154.

Wang HH, Feng T, Peng XX, Yan ML, Zhou P.L, Tang X-K. 2009. Ameliorative Effects of

Brassinosteroid on Excess Manganese-Induced Oxidative Stress in Zea mays L. Leaves.

Agricultural Sciences in China. 8:1063-1074.

Weisburg WG, SM Barns, DA Pelletier, DJ Lane, 1991. 16S ribosomal DNA amplification for

phylogenetic study. J. Bacteriol, 173: 697-703.

Willekens H, Chamnongpol S, Davey M, Schraudner M, Langebartels C, VanMontagu M, Inze D. and

VanCamp W, 1997. Catalase is a sink for H2O2 and is indispensable for stress defence in C3

plants. EMBO Journal 16:4806-4816.

Witty JF, Minchin FR, 1998. Methods for the continuous measurement of O2 consumption and H2

production by nodulated legume root systems. J Exp Bot 49(323):1041-1047.

Wood M, Cooper JE, Holding AJ, 1984. Soil acidity factors and nodulation of Trifolium repens. Plant

Soil 78(3):367-379

Woolley J, Davis JHC, 1991. The agronomy of intercropping with beans. Schoonhoven, A van;

Voysest, O (ed.). Common beans: Research for crop improvement. Melksham, Wiltshire, UK:

Redwood Press Ltd. p.707-735.

Wu Y, Spollen WG, Sharp RE, Hetherington PR, Fry SC, 1994. Root growth maintenance at low

water potentials increased activity of xyloglucan endotransglycosylase and it's possible

regulation by abscisic acid. Plant Physiol 106: 607-615.

Yamamoto H, J Nomata, Y Fuita, 2008. Functional expression of nitrogenase-like protochlorophyllide

reductase from Rhodobacter capsulatus in Escherichia coli. Photochem. Photobiol. Sci. 7:1238-

1242.

Yusupova Z, khairullin R, Maksimov I, 2006. The activity of peroxidase in various celle fractions of

wheat plants infected with Septoria nororum berk. Russ. J. Plant physiol. 53: 807-813.

Zahran HH, 1999. Rhizobium-Legume Symbiosis and Nitrogen Fixation under Severe Conditions and

in an Arid Climate. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:968-989.

Zahran HH, Sprent JI, 1986. Effects of sodium chloride and polyethylene glycol on root-hair infection

and nodulation of Vicia faba L. plants by Rhizobium leguminosarum, Planta 167:303-309.

Zhu JK, 2002. Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol 53:247-273.

Zhu JK, 2003. Regulation of ion homeostasis under salt stress. Cur. Opin. in plant biology 6:441-445.

Zucchini M, Rea E, Tullio M, De Agazio M, 2003. Increased antioxidative capacity in maize calli

during and after oxidative stress induced by a long lead treatment. Plant Physiology and

Biochemistry 41:49-54.

Annexes

94

ANNEXES

ANNEXE1

Milieu Yeast-Extract- Mannitol (YEM)

Extrait de levure 0.1 g

Manitol 1 g

K2HPO4 0.05 g

MgSO4 0.02 g

NaCl 0.01 g

Agar 1.5 g

Eau distellée 100 mL qsp

Annexes

95

ANNEXE2

Annexes

96

ANNEXE3

rôle des microorganismes symbiotiques (cas de rhizobia) dans l

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