rôle de la ptpase shp1 dans les adipocytes · 2018-04-25 · iii résumé l’obésité, liée à...
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Rôle de la PTPase Shp1 dans les adipocytes
Mémoire
Marie-Pier Forest
Maîtrise en médecine moléculaire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Marie-Pier Forest, 2017
Rôle de la PTPase Shp1 dans les adipocytes
Mémoire
Marie-Pier Forest
Sous la direction de :
André Marette, directeur de recherche
iii
Résumé
L’obésité, liée à la résistance à l’insuline, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires, est un
problème de santé majeur de notre société. Nous avons démontré que la protéine tyrosine phosphatase Shp1,
dont l’expression est significativement augmentée dans les tissus cibles de l’insuline chez les souris obèses, est
un régulateur de l’homéostasie du glucose dans le foie et le muscle. Shp1 est impliqué dans la modulation de
l’expression et de l’activité du récepteur nucléaire PPAR dans le foie. Nos recherches ont porté sur la
caractérisation de Shp1 dans les adipocytes, la signalisation de l’insuline et le transport du glucose soit en sous-
exprimant ou en exprimant de façon constitutive Shp1 dans les cellules adipeuses 3T3-L1. L’état physiologique
des cellules a été caractérisé par la mesure de la coloration Oil-Red-O, des triglycérides, de l’expression de
PPAR et de ses gènes cibles et de leurs protéines, de la réponse à l’insuline par le transport du glucose ainsi
que l’expression et de la phosphorylation des protéines impliquées dans la signalisation de l’insuline. La
diminution de l’expression de Shp1 a entraîné un délai lors du début de la différenciation mesurée par
l’expression retardée de PPAR et certains de ses gènes cibles, mais n’a pas beaucoup affecté le phénotype
des cellules complètement différenciées. Bien que la réduction de Shp1 ait augmenté la phosphorylation d’Akt
stimulée par l’insuline, le transport de glucose n’a pas été modifié dans ces cellules, et l’expression de glut4 a
légèrement diminué. L’expression constitutive de Shp1 a entraîné une forte diminution des niveaux de PPAR,
inhibant totalement la différenciation, l’expression de glut4 et le transport du glucose. Nos données suggèrent
que Shp1 joue un rôle important dans les adipocytes comme régulateur de l’adipogenèse par la modulation de
l’expression et l’activité de PPAR et par la régulation de la signalisation de l’insuline.
iv
Abstract
Obesity, which is causally linked to the development of insulin resistance, type 2 diabetes (T2D) and
cardiovascular disease (CVD), is a major health issue in our society. We have demonstrated that the protein
tyrosine phosphatase Shp1, whose expression is significantly increased in insulin target tissues of obese mice,
is a regulator of glucose homeostasis in liver and muscle. Shp1 is implicated in the modulation of expression
and activity of the nuclear receptor PPAR in liver. Here, we describe the characterization of Shp1 in adipocytes
by analyzing its role in adipocyte differentiation, insulin signaling and glucose transport by either knocking-down
or constitutively expressing Shp1 in 3T3-L1 adipose cells. The physiological state of the cells was characterized
by measuring Oil-Red-O staining, triglyceride content, expression of PPAR and its target genes and their
proteins, insulin response by glucose uptake and the expression and phosphorylation of proteins involved in
insulin signaling. Knockdown of Shp1 led to a retardation in the onset of differentiation as measured by delayed
expression of PPAR and some of its target genes, but did not much affect the phenotype of fully differentiated
cells. Although reducing Shp1 increased insulin-stimulated Akt-phosphorylation, glucose transport was not
changed in these cells, and glut4 expression was slightly decreased. Constitutive expression of Shp1, resulted
in a strong decrease of PPAR levels thereby totally inhibiting differentiation, glut4 expression and glucose
transport. Our data suggest that Shp1 plays an important role in adipocytes both by acting as a regulator of
adipogenesis through modulation of the expression and activity of PPAR and by regulating the insulin signaling
pathway.
v
Table des matières
Résumé .............................................................................................................................................................. iii
Abstract ............................................................................................................................................................... iv
Table des matières .............................................................................................................................................. v
Liste des tableaux .............................................................................................................................................. vii
Liste des figures ................................................................................................................................................ viii
Liste des abréviations ......................................................................................................................................... ix
Remerciements ................................................................................................................................................. xiii
Avant-propos .................................................................................................................................................... xiv
Chapitre 1 : Introduction ...................................................................................................................................... 1
L’obésité ......................................................................................................................................................... 1
Le concept de résistance à l’insuline .............................................................................................................. 3
Le diabète ....................................................................................................................................................... 7
Le tissu adipeux.............................................................................................................................................. 9
La lipogenèse ........................................................................................................................................... 11
La lipolyse ................................................................................................................................................ 11
L’adipogenèse .......................................................................................................................................... 12
PPAR...................................................................................................................................................... 13
Modèles pour étudier l’adipogenèse ........................................................................................................ 17
Shp1 ............................................................................................................................................................. 18
Hypothèse et objectifs .................................................................................................................................. 20
Chapitre 2 : Role of Shp1 in adipocyte differentiation and insulin signaling ...................................................... 21
Résumé ........................................................................................................................................................ 22
Abstract ........................................................................................................................................................ 23
Introduction ................................................................................................................................................... 24
Results ......................................................................................................................................................... 25
Expression of Shp1 and PPAR in differentiating adipose cells............................................................... 25
Knockdown of Shp1 in 3T3-L1 cells ......................................................................................................... 26
vi
Effect of Shp1 knockdown on adipogenesis ............................................................................................. 26
Shp1 knockdown affects the expression of key players of adipogenesis ................................................. 27
Knockdown of Shp1 does not affect glucose transport ............................................................................ 28
Akt phosphorylation is improved by knockdown of Shp1 ......................................................................... 28
Discussion .................................................................................................................................................... 29
Experimental procedures .............................................................................................................................. 33
Cell culture ............................................................................................................................................... 33
shRNA for Shp1 ....................................................................................................................................... 33
Immunoblotting ......................................................................................................................................... 33
qPCR........................................................................................................................................................ 34
Oil Red O staining and triglyceride content .............................................................................................. 34
Glucose transport ..................................................................................................................................... 34
Statistical Analysis ................................................................................................................................... 34
Acknowledgements ...................................................................................................................................... 34
Conflict of interest ......................................................................................................................................... 35
Author contributions...................................................................................................................................... 35
REFERENCES ............................................................................................................................................. 36
TABLES ........................................................................................................................................................ 39
Figures ......................................................................................................................................................... 40
Supplementary figures ...................................................................................................................................... 47
Chapitre 3 : Conclusion et perspectives ........................................................................................................... 52
Bibliographie ..................................................................................................................................................... 62
vii
Liste des tableaux
Table 1. shRNA sequences .............................................................................................................................. 39
Table 2. qPCR primer sequences ..................................................................................................................... 39
viii
Liste des figures
Figure 1.1 Prévalence (%) de l’obésité chez les adultes (âgés de 18 ans et plus) ............................................. 1
Figure 1.2 L'obésité induit des altérations qui entraînent une résistance à l'insuline et une inflammation.......... 4
Figure 1.3 La voie de signalisation de l'insuline .................................................................................................. 6
Figure 1.4 Estimations mondiales de la prévalence du diabète chez les adultes (âgés de 35 à 64 ans) ........... 8
Figure 1.5 La différenciation adipocytaire ......................................................................................................... 12
Figure 1.6 Rôles de PPAR dans le tissu adipeux. ........................................................................................... 14
Figure 1.7 Structure primaire de PPAR représentant les modifications post-traductionnelles ........................ 16
Figure 2.1 Shp1 and PPAR are co-expressed during early differentiation of 3T3-L1 cells ............................. 40
Figure 2.2 Knockdown efficiency varies between different, Shp1-specific shRNAs. ......................................... 41
Figure 2.3 Shp1 knockdown does not affect the final differentiation of adipose cells. ...................................... 42
Figure 2.4 Shp1 knockdown delays the expression of Pparg and some of its target genes in adipogenesis. .. 43
Figure 2.5 Shp1 knockdown affects protein accumulation of PPAR, CD36 and FABP4. ................................ 44
Figure 2.6 Glucose uptake and glut4 mRNA levels are not changed after knockdown of Shp1 in 3T3-L1. ...... 45
Figure 2.7 Phosphorylation of Akt, but not of its substrates is increased in differentiated 3T3-L1 cells with
reduced expression of Shp1. ............................................................................................................................ 46
Figure S2.1 Reduction of Shp1 by shShp1.65 and shShp1.66 seems to slightly affect the differentiation of
adipose cells. .................................................................................................................................................... 47
Figure S2.2 Knockdown of Shp1 by shShp1.65 and shShp1.66 delays the expression of Pparg and some of its
target genes in adipogenesis. ........................................................................................................................... 48
Figure S2.3 Decrease of Shp1 by shShp1.65 and shShp1.66 affects protein expression of PPAR, CD36 and
FABP4. ............................................................................................................................................................. 49
Figure S2.4 Glucose uptake and glut4 mRNA levels seem to be minimally affected by reduction of Shp1 with
shShp1.65 and shShp1.66. ............................................................................................................................... 50
Figure S2.5 Decreased Shp1 expression leads to increased phosphorylation of Akt and GSK3................... 51
Figure 3.1 L’expression constitutive de Shp1 dans les cellules 3T3-L1 affecte PPAR. .................................. 54
Figure 3.2 L’expression constitutive de Shp1 affecte la différenciation terminale des cellules 3T3-L1. ............ 55
Figure 3.3 Le transport de glucose et les niveaux d’expression de glut4 sont diminués en présence de Shp1
exprimé de façon constitutive dans les cellules 3T3-L1 différenciées. ............................................................. 56
Figure 3.4 PPAR endogène peut être phosphorylé sur ses résidus de tyrosine. ............................................ 60
ix
Liste des abréviations
AF1 Domaine de transactivation N-terminal
AF2 Domaine de transactivation dépendante du ligand
AKT/PKB Protéine kinase B
aP2 Adipocyte protein 2
apoB Apolipoprotein B
ATGL Adipose triglycéride lipase
c-Abl Nonreceptor tyrosine kinase Abelson murine leukemia viral oncogene
C/EBP CCAAT enhancer binding proteins
CD36 Cluster of differentiation 36
Cdk Cyclin-dependent kinases
CEACAM1 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1
ChREBP Carbohydrate-responsive element-binding protein
CVD Cardiovascular disease
DN Dominant-negative
DBD Domaine de liaison à l’ADN hautement conservé
eEF2 Eukaryotic elongation factor
EGFR Récepteur du facteur de croissance épidermique
FABP4 Fatty acid binding protein 4
FAS Fatty acid synthase
x
FAT Fatty acid translocase
FoxO Forkhead box sub-group O
GLUT1 Transporteur de glucose 1
GLUT4 Transporteur de glucose 4
GSK3 Glycogen synthase kinase-3
HDL Lipoprotéine à haute densité (high density lipoprotein)
HFD Diète riche en gras (high fat diet)
HSL Hormone-sensitive lipase
IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
IL-1β Interleukin 1 beta
IL-6 Interleukin 6
IL-10 Interleukin 10
IMC Indice de masse corporelle
INF Interféron gamma
IR Récepteur de l’insuline
IRS Substrat du récepteur de l’insuline
JNK c-Jun N-terminal kinases
KD Knockdown
KO Knockout
LBD Domaine de liaison au ligand C-terminal
LDL Lipoprotéine de faible densité (low density lipoprotein)
xi
LPL Lipoprotéine lipase
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MCP-1 Monocyte chemotactic protein 1
MGL Monoacylglycerol lipase
MEF Mouse embryo fibroblast
MSC Cellules souches mésenchymateuses (mesenchymal stem cells)
mTOR Mechanistic target of rapamycin
NAFLD Stéatose hépatique non alcoolique
OMS Organisation mondiale de la santé
ORO Oil-red-O
PDK1 Phosphoinositide-dependent kinase-1
PH Pleckstrin homology
PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase
PIP2 Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate
PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate
PPAR Peroxisome proliferator activated receptor alpha
PPAR Peroxisome proliferator activated receptor delta
PPAR Peroxisome proliferator activated receptor gamma
PPRE Élément de réponse à PPAR
PTB Phosphotyrosine-binding domain
PTP Protéine tyrosine phosphatase
xii
Ptpn6 Protein tyrosine phosphatase non receptor 6
Rheb RAS homolog enriched in brain
RSK Ribosomal S6 kinase
RXR Récepteur X de l’acide rétinoïque
S6K S6 kinase
SEM Standard error of the mean
SH2 Scr-homology 2
Shp1 Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1
SREBPs Sterol regulatory element-binding proteins
TG Triglycéride
TNF-α Tumor necrosis factor
TZD Thiazolidinediones
T2D Diabète de type 2
VLDL Lipoprotéine de très faible densité (very low density lipoprotein)
WT Wildtype
xiii
Remerciements
Je tiens à remercier avant tout mon directeur de recherche Dr André Marette pour m’avoir offert l’opportunité de
faire de la recherche fondamentale dans un laboratoire bien équipé ayant tout le nécessaire pour avancer mon
projet de recherche, et ce, dans un environnement de recherche très dynamique. Au cours de ces années, j’ai
acquis de nombreuses connaissances utiles à ma carrière scientifique. Merci de m’avoir encouragé à présenter
mes travaux de recherche, sous forme de présentation orale ou d’affiche, lors de divers congrès. Ensuite, je
pense à Kerstin Bellmann et Michael Schwab. Je voudrais les remercier d’avoir pris le temps de me superviser
tout au long de mes stages et de ma maîtrise, sans qui ma formation académique n’aurait pas été aussi
enrichissante. J’admire les personnes que vous êtes et vous demeurez un modèle à mes yeux. J’aimerais
également dire un gros merci à Marie-Hélène Lavallée-Bourget pour ces moments de travail d’équipe de qualité.
Tu es la « best partner ever » que tout le monde aimerait avoir. J’ai une pensée toute spéciale pour l’homme de
la situation Bruno Marcotte. Il a été d’une aide extraordinaire pour tous les étudiants désemparés que nous
sommes de temps en temps. Je tiens à remercier toute l’équipe exceptionnelle du Dr Marette pour cet accueil
chaleureux. Un merci tout spécial à mes collègues et amis sans qui mon passage au sein de l’équipe du Dr
Marette n’aurait été le même.
La recherche ne pourrait pas être autant d’envergure si ce n’était pas des nombreuses collaborations. Plusieurs
collaborations interuniversitaires ont permis des échanges scientifiques bénéfiques. Dr Nicole Beauchemin est
impliquée depuis le début dans le projet Shp1 dû à ses conseils judicieux. Je remercie le Dr Pedro Miguel
Geraldes de ses précieux conseils et échanges suite à mon passage dans son laboratoire de recherche, où j’ai
effectué des crédits de recherche lors de mon baccalauréat en biologie moléculaire et cellulaire à l’Université
de Sherbrooke. Sans oublier Dr Mathieu Laplante, chercheur du CRIUCPQ dans l’axe Obésité-Métabolisme,
qui a été d’une aide précieuse pour la caractérisation du rôle de Shp1 au niveau du tissu adipeux. Il nous a
fourni la lignée cellulaire 3T3-L1 qui a été un outil indispensable à la réalisation de mon projet de recherche en
plus de nous donner gracieusement les plasmides viraux nécessaires à l’infection des cellules adipeuses par
des shRNA spécifiques pour Shp1.
Merci également à la Direction de la recherche universitaire de l’IUCPQ, au Département de médecine via la
bourse d’études Louise-Côté, au Conseil Professionnel de Diabète Québec (CPDQ) ainsi qu’à l’Institut sur la
nutrition et les aliments fonctionnels (INAF) pour leur support financier à mes travaux de recherche.
Je tiens également à remercier l’amour inconditionnel de ma famille et amis, tout spécialement mes parents qui
m’ont supporté tout au long de mes études universitaires.
N’oubliez surtout pas que l’on recueille ce que l’on sème. Je garderai toujours une petite pensée pour vous.
xiv
Avant-propos
Ce mémoire porte sur l’étude du rôle de la protéine tyrosine phosphatase Shp1 dans la modulation du tissu
adipeux et des perturbations métaboliques de l’obésité via la régulation du récepteur nucléaire PPAR. Les
cellules 3T3-L1 sont utilisées dans le cadre de ce projet de recherche.
Le premier chapitre comprend une revue de la littérature en lien avec le projet de recherche.
Le deuxième chapitre comprend les résultats de recherches sous forme d’un article scientifique en anglais. Étant
donné qu’il s’agit d’une sous-section du projet de recherche sur Shp1, l’article sera soumis en intégralité avec
quelques modifications et expériences supplémentaires. Je présente les résultats en tant que premier auteur
avec l’élaboration de l’écriture de cet article scientifique et la réalisation de l’ensemble du projet. Le design
expérimental, la contribution à certaines expériences, l’interprétation des résultats ainsi que la révision du
manuscrit ont été réalisés conjointement par les auteurs.
Le troisième chapitre sert à appuyer les résultats présentés dans l’article par la démonstration du modèle inverse
à celui utilisé pour l’élaboration de l’article.
1
Chapitre 1 : Introduction
L’obésité
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), le surpoids et l’obésité se définissent comme une
accumulation anormale ou excessive de graisse corporelle qui peut nuire à la santé (OMS). L’indice de masse
corporelle (IMC) est une mesure du poids par rapport à la taille (kg/m2) qui permet de classer le surpoids (IMC
≥ 25) et l’obésité (IMC ≥ 30). L’obésité est un problème de santé publique à l’échelle mondiale. Le nombre de
cas d’obésité a doublé depuis 1980 (OMS). En 2014, plus d’un adulte sur trois, âgé de plus de 18 ans, était en
surpoids et plus d’un sur dix était obèse (OMS). Autrefois considéré comme un problème lié aux pays
développés, la prévalence de l’obésité est désormais en augmentation partout dans le monde autant chez les
adultes (figure 1.1) que chez les enfants (OMS).
Figure 1.1 Prévalence (%) de l’obésité chez les adultes (âgés de 18 ans et plus) selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé en 2014 (OMS).
La principale cause du surpoids et de l’obésité est un déséquilibre énergétique entre la consommation et la
dépense calorique (OMS). Des facteurs environnementaux et génétiques influencent le développement de
l’obésité (Kopelman, 2000). Plusieurs chercheurs associent l’industrialisation et la mondialisation aux problèmes
liés à l’obésité (Hawkes, 2006; Kopelman, 2000; Malik et al., 2013). La croissance économique est associée
avec une augmentation de la consommation d’aliments à haute densité énergétique, de céréales raffinées et la
présence de sucres ajoutés (Malik et al., 2013). La mondialisation affecte l’industrie alimentaire en modifiant la
2
quantité, le type, le coût et la disponibilité des aliments (Hawkes, 2006). Le rythme de vie rapide favorise la
consommation de mets préparés ayant une qualité nutritionnelle moindre. La restauration rapide amène les
gens à consommer plus que nécessaire par la commercialisation des aliments et la grosseur des portions. Ce
changement est combiné à une réduction de l’activité physique, dû aux avancements technologiques
(ascenseur, escalier roulant, moyen de transport, automatisation du travail physique, etc.), ce qui résulte un
bilan énergétique positif. Les éléments de l’environnement obésogène interagissent avec des variations
génétiques, et possiblement épigénétiques, qui augmentent la susceptibilité de certains individus à cet
environnement (Sellayah et al., 2014). L’obésité est l’adaptation normale au mode de vie dans lequel on vit,
qu’on peut caractériser comme un environnement obésogène.
Le surpoids et l’obésité sont des facteurs de risque pour certaines maladies chroniques telles que les maladies
cardiovasculaires, le diabète de type 2, les troubles musculo-squelettiques et certains cancers (OMS). En tant
que société, un programme de santé publique s’impose pour diminuer les risques associés à l’obésité en
favorisant un environnement plus sain. L’accès à des aliments bons pour la santé et à des activités physiques
permet aux gens de faire un choix plus éclairé. Voici quelques recommandations de l’OMS : limiter l’apport
énergétique provenant des lipides et des sucres ; consommer davantage de fruits et légumes, de légumineuses,
de céréales complètes et de noix ; avoir une activité physique régulière. L’industrie agro-alimentaire a également
son rôle à jouer : réduire la teneur en graisse, sucre, sel des aliments préparés ; proposer des produits sains et
nutritifs à un prix abordable ; limiter la commercialisation d’aliments riches en lipides, sel et sucre (OMS). Par
contre, certaines interventions politiques spécifiques sont mieux adaptées pour améliorer les habitudes
alimentaires. Les mesures d’information visant à soutenir un choix éclairé ont généralement eu un faible effet
positif sur l’amélioration des habitudes alimentaires, tandis que les campagnes d'information ont permis de
sensibiliser les gens aux mauvaises habitudes alimentaires. De plus, les mesures visant à cibler l'environnement
de marché, telles que les mesures fiscales et les normes nutritionnelles, sont plus intrusives mais peuvent être
plus efficaces (Brambila-Macias et al., 2011). L’intervention sur les habitudes de vie a ses limites et la
compréhension de la biologie adipocytaire permettra peut-être éventuellement de mieux intervenir, par exemple,
en ciblant certains individus ou certaines parties de la population.
La définition de l’obésité par la mesure de l’IMC agit seulement à titre indicatif, car elle ne distingue pas les
différents types d’obésité : androïde et gynoïde. L’obésité androïde, une morphologie en forme de « pomme »,
est caractérisée par le dépôt de graisses viscérales, également appelé dépôt ectopique, c’est-à-dire près des
organes. L’obésité gynoïde, une morphologie en forme de « poire », est la présence de graisses sous-cutanées
pour protéger les organes internes. Il est bien connu que la distribution des graisses montre un dimorphisme
sexuel chez l’humain. La composition corporelle des hommes est de type androïde tandis que celle des femmes
est plutôt gynoïde. La présence de tissu adipeux sous-cutané est associée à un meilleur profil métabolique et
3
de moins grands risques pour la santé comparativement au tissu adipeux viscéral. Afin d’évaluer le risque
associé à l’obésité, d’autres mesures sont nécessaires. Pour un IMC donné, un tour de taille élevé est associé
à une augmentation du risque de diabète et de maladies cardiovasculaires (Balkau et al., 2007). En plus de la
mesure de l’IMC et du tour de taille, la mesure des triglycérides est essentielle pour distinguer le type d’obésité
et évaluer les risques associés à l’obésité viscérale, également appelée obésité abdominale (Lemieux et al.,
2000).
L’obésité sous-cutanée est considérée comme un tissu adipeux « en santé » tandis que l’obésité viscérale est
un marqueur d’un tissu adipeux dysfonctionnel par l’accumulation excessive de graisse intra-abdominale. La
présence de dépôt de graisses ectopiques dans les autres tissus, qui ne sont pas faits pour emmagasiner les
graisses, altère le profil métabolique. Le muscle, le cœur ainsi que le foie sont ciblés par ce surplus lipidique
(Despres & Lemieux, 2006). La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est caractérisée par l’accumulation
de gouttelettes lipidiques au niveau du foie et en présence d’inflammation, la maladie progresse vers une
stéatose hépatique non alcoolique plus sévère, et peut conduire à la cirrhose. Bien qu'une augmentation de la
graisse corporelle totale soit associée à une augmentation des risques pour la santé, la quantité de graisse
abdominale a été associée à un risque accru de comorbidités comme le diabète de type 2, la maladie
coronarienne, l’accident vasculaire cérébral, l'apnée du sommeil, l'hypertension, la dyslipidémie,
l'insulinorésistance, l'inflammation, et certains types de cancer (Tchernof & Despres, 2013).
Le concept de résistance à l’insuline
La résistance à l’insuline se développe chez les individus obèses et précède le diabète de type 2. Le concept
de ce syndrome métabolique silencieux est illustré dans la figure 1.2 (Olefsky & Glass, 2010). L’insuline est une
hormone peptidique sécrétée par les cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas (Wilcox, 2005). La
résistance à l’insuline s’installe quand les cellules des tissus métaboliques (i.e. foie, muscles, tissu adipeux)
répondent moins à l’insuline. Ceci va mener à une sécrétion compensatoire de l’insuline par les cellules bêta du
pancréas afin de gérer les épisodes d’hyperglycémie post-prandiale (Olefsky & Glass, 2010).
4
Figure 1.2 L'obésité induit des altérations qui entraînent une résistance à l'insuline et une inflammation dans le tissu adipeux, le foie et le muscle squelettique (Olefsky & Glass, 2010).
L’insuline exerce ses effets métaboliques en activant des voies de signalisation qui permettent, entre autres, de
stimuler la captation et le métabolisme du glucose dans les cellules de façon spécifique par des protéines de
transport (transporteurs de glucose ou GLUT). Tel qu’illustré à la figure 1.3, l’insuline se lie à son récepteur (IR),
qui consiste en un hétérotétramère composé de deux sous-unités et deux sous-unités situé à la membrane
cellulaire, et engendre un changement de conformation. L’auto-phosphorylation de l’IR permet la liaison de ses
« insulin receptor substrate » (IRS) et phosphoryle ces derniers sur tyrosine. Les substrats IRS phosphorylés
sont reconnus spécifiquement par le domaine « Src homology 2 (SH2) » et le domaine de liaison à la
5
phosphotyrosine (PTB) (Taniguchi et al., 2006) de protéines impliquées dans différentes voies de signalisation.
La phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) est une enzyme permettant la transformation du phosphatidylinositol
(4,5)-bisphosphate (PIP2) en phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3) (Wilcox, 2005). PIP3 active la
protéine phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) et recrute Akt, également connu sous le nom de protéine
kinase B, à la membrane cellulaire. PDK1 phosphoryle Akt sur le site Thr308, l’un des deux résidus clés requis
pour l’activation d’Akt, et la protéine p70 S6 kinase (S6K). À son tour Akt va activer AS160 pour faciliter
l’absorption du glucose dans les adipocytes et les cellules musculaires en permettant la translocation de GLUT4
à la membrane. Parmi les cibles d'Akt, les facteurs de transcription, tels que glycogen synthase kinase-3 (GSK3)
et forkhead box sub-group O (FoxO), jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du glucose. La
phosphorylation inactive de GSK3 par Akt conduit à une augmentation de la synthèse du glycogène (Manning
& Cantley, 2007). FoxO est inactivé par la phosphorylation d’Akt, ce qui résulte en l’inhibition de la
gluconéogenèse dans le foie, tandis que dans le tissu adipeux, cela permet l’activation de PPAR engendrant
ainsi la différenciation des adipocytes (Nakae et al., 2003; Puigserver et al., 2003). Dans le muscle, FoxO joue
un rôle dans la différenciation des myoblastes en myotubes et ce, indépendamment de sa phosphorylation
(Gross et al., 2008). Le mechanistic target of rapamycin (mTOR) joue également un rôle au niveau de la
signalisation de l’insuline. mTOR est une sérine (ser)/thréonine (thr) kinase sensible à la rapamycine qui se
retrouve dans deux complexes protéiques distincts, soit mTORC1 et mTORC2. La signalisation de mTOR
Complex 1 (mTORC1) est facilitée par raptor, une protéine adaptatrice. La GTPase RAS homolog enriched in
brain (Rheb) déclenche la signalisation de mTORC1. Lorsqu’il est activé, mTORC1 phosphoryle p70 S6K, ce
qui inhibe la signalisation de l’insuline. mTOR Complex 2 (mTORC2) contient la protéine adaptatrice rictor, ce
qui permet la phosphorylation d’Akt au site S473, qui est l’autre résidu clé nécessaire à l’activation d’Akt. Ainsi,
mTOR est un régulateur clé de la voie de signalisation de l’insuline qui phosphoryle et active à la fois p70 S6K
et Akt (Hajiaghaalipour et al., 2015).
6
Figure 1.3 La voie de signalisation de l'insuline favorise l’absorption du glucose, la traduction de protéines
et la croissance cellulaire (Hajiaghaalipour et al., 2015)
Il existe 3 gènes Akt : Akt1, Akt2 et Akt3. La sérine/thréonine kinase Akt/PKB joue un rôle clé dans la régulation
de la croissance cellulaire, la survie et le métabolisme. La fonction de chaque isoforme est distincte. Les souris
invalidées pour Akt1/PKB présentent un retard de croissance tandis que les souris invalidées pour alpha
Akt2/PKB beta développent une résistance à l’insuline (Garofalo et al., 2003). Ainsi, Akt1 favorise la survie
cellulaire en bloquant l’apoptose, ce qui est d’ailleurs un facteur important dans de nombreux types de cancer.
Akt2 est impliqué dans la signalisation de l’insuline. Akt3 joue quant à lui un rôle au niveau du cerveau. Selon
une étude menée afin de déterminer l’importance des isoformes d’Akt, il a été démontré que les souris
déficientes en Akt2 et Akt3 sont viables. L’isoforme Akt1 est en mesure d’effectuer les fonctions d’Akt
essentielles, comme l’homéostasie du glucose, la prolifération, la différenciation et le développement. Par
contre, les souris Akt2 KO et Akt3 KO présentent une intolérance au glucose et à l’insuline, ce qui démontre le
rôle de ces derniers (Dummler et al., 2006).
Tel que mentionné précédemment, le glucose pénètre dans les cellules de façon spécifique par des protéines
membranaires intégrales, les transporteurs de glucose (GLUT). Plusieurs isoformes de GLUT maintiennent
l’homéostasie du glucose (Herman & Kahn, 2006). GLUT1 se retrouve dans toutes les cellules, dont les cellules
endothéliales de la barrière hémato-encéphalique, et permet le transport du glucose basal afin d’assurer les
fonctions vitales. Ce transporteur agit par diffusion facilitée. Il n’a donc pas besoin d’insuline pour être activé, ce
7
qui permet de conserver son activité pendant l’état de jeûne. Issu de la même famille, GLUT4 est le principal
transporteur de glucose sous l’action de l’insuline dans les cellules adipeuses et musculaires (Huang & Czech,
2007). En période de jeûne, GLUT4 est localisé à l’intérieur des cellules. Après stimulation par l’insuline, il est
recruté à la membrane, ce qui permet l’entrée subséquente de glucose dans la cellule. La cascade de
signalisation de l’insuline (figure 1.3) illustre bien l’importance d’Akt dans la translocation de GLUT4 à la
membrane cellulaire via AS160 (Hajiaghaalipour et al., 2015). Dans l’obésité et le diabète type 2, l’expression
de GLUT4 est diminuée dans le tissu adipeux, mais conservée dans le muscle (Abel et al., 2001). La résistance
à l’insuline s’explique notamment par une translocation inadéquate de GLUT4 de vésicules intracellulaires à la
surface des cellules (Tremblay et al., 2003).
En temps normal, la cascade de l’insuline mène à l’internalisation du glucose et la diminution de la glycémie.
Par contre, lors d’une résistance à l’insuline, l’insuline est incapable d’effectuer son action. Plusieurs molécules
inhibitrices interfèrent avec la phosphorylation de la tyrosine du récepteur d’insuline (Taniguchi et al., 2006). En
plus d’être phosphorylé positivement sur les résidus tyrosine par une stimulation insulinique, IRS-1 est
phosphorylé sur des résidus sérines ce qui inhibe la signalisation d’insuline (Draznin, 2006). Lors d’un excès de
nutriments, la voie mTORC1/S6K1 est suractivée ce qui mène à la phosphorylation d’IRS1 sur plusieurs serines
(Tremblay & Marette, 2001). De plus, l’insuline et l’hyperglycémie active p90 ribosomal S6 kinase (RSK), qui est
connu pour activer la voie mTORC1. RSK est un nouveau régulateur de la signalisation de l’insuline, qui agit en
phosphorylant la sérine S1101 de l’IRS-1 (Smadja-Lamere et al., 2013). Ainsi, mTORC1/S6K1 et RSK sont
impliquées dans le développement de la résistance à l’insuline, de l’obésité et du diabète de type 2 par la
phosphorylation sur sérine de IRS-1. De plus, l’inflammation chronique associée à l’obésité rend les personnes
plus susceptibles de devenir résistantes à l’insuline. Les c-Jun N-terminal kinases (JNK) sont activées par des
cytokines inflammatoires et des acides gras libres. Son activité est élevée dans l’obésité et conduit également
à la phosphorylation de la sérine d’IRS-1. Les souris invalidées pour JNK démontrent une diminution de
l’adiposité et une amélioration de la sensibilité à l’insuline (Hirosumi et al., 2002).
Le diabète
La prévalence mondiale du diabète ne cesse d’augmenter. Chez les adultes de plus de 18 ans, elle est passée
de 4,7% en 1980 à 8,5% en 2014 (figure 1.4) (OMS). Selon l’organisation mondiale de la santé (OMS), le nombre
de personnes vivant avec le diabète a pratiquement quadruplé depuis 1980 (OMS). Le diabète est une maladie
chronique qui apparaît lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline ou que l’organisme n’est pas
en mesure d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit. Il existe différentes formes de diabète : diabète de type
1, le diabète de type 2 et le diabète gestationnel. Le diabète de type 1, anciennement appelé diabète insulino-
8
dépendant ou juvénile, peut être diagnostiqué à n’importe quel âge mais c’est l’une des maladies chroniques
les plus courantes de l’enfance (Atkinson et al., 2014). La prise en charge du diabète de type 1 nécessite
l’injection quotidienne d’insuline. Le diabète de type 2 est le plus fréquent et résulte d’une surcharge pondérale
et de la sédentarité. La prévention du diabète est essentielle car la maladie est souvent diagnostiquée des
années après son apparition lorsque les complications sont déjà présentes. L’intervention est requise lorsque
la glycémie à jeun est égale ou supérieure à 7,0 mmol/L (OMS). Comme son nom l’indique, le diabète
gestationnel apparaît temporairement chez la femme durant sa grossesse ayant des valeurs de glycémie
supérieures à la normale sans pour autant atteindre le seuil du diagnostic. Elle est alors plus à risque de
développer un diabète de type 2 à long terme. Le diabète est une cause majeure de cécité, d’insuffisance rénale,
d’accidents cardiaques, d’accidents vasculaires cérébraux et d’amputation des membres inférieurs. La
prévention du diabète de type 2 nécessite une alimentation saine en évitant la consommation de sucre, de gras
saturés et également l’usage du tabac. De plus, il est recommandé de pratiquer régulièrement une activité
physique pour le maintien d’un poids corporel sain (OMS).
Figure 1.4 Estimations mondiales de la prévalence du diabète chez les adultes (âgés de 35 à 64 ans) pour 2000 et 2030 selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).
9
Le tissu adipeux
Le tissu adipeux est composé d’une variété de cellules : adipocytes, préadipocytes, fibroblastes, cellules
endothéliales, cellules mésothéliales, monocytes, macrophages et cellules souches multipotentes pouvant se
différencier en plusieurs types cellulaires (Moreno-Navarrete & Fernández-Real, 2012). La formation du tissu
adipeux est liée à sa capacité de vascularisation. La fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux contient des
cellules souches mésenchymateuses (en anglais : mesenchymal stem cells (MSC)) multipotentes qui possèdent
la capacité de se différencier in vitro en différentes cellules de la lignée mésenchymateuse, y compris les
adipocytes, ostéoblastes, les chondrocytes et les myoblastes (Zuk et al., 2002). Deux types de tissu adipeux
sont présents chez l’humain : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Le premier constitue la principale
source d’énergie tandis que le second est le lieu de la thermogenèse. Étant donné les propriétés biochimiques
et fonctionnelles distinctes, le tissu adipeux blanc sera considéré dans le cadre de ce mémoire. Le tissu adipeux
blanc se distingue également en deux catégories : le tissu adipeux blanc sous-cutané et le tissu adipeux blanc
viscéral. Tel que mentionné précédemment, les propriétés sont différentes dépendamment de la localisation du
tissu adipeux blanc. Généralement, le tissu adipeux est situé sous la peau dans divers dépôts sous-cutanés et
occupe un rôle protecteur en agissant comme isolant thermique. À l’inverse, le tissu adipeux peut s’établir près
des organes internes, et constituer ce que l’on nomme graisse viscérale. Le corps peut ainsi utiliser les réserves
pour produire de l’énergie par catabolisme, ce qui permet d’alimenter les fonctions vitales, c’est-à-dire le système
nerveux central et le cœur. Le tissu adipeux a une capacité d’expansion impressionnante suite à un apport
calorique excessif. Deux mécanismes sont impliqués dans le développement du tissu adipeux : l’hyperplasie et
l’hypertrophie. L’hyperplasie est l’augmentation du nombre d’adipocytes tandis que l’hypertrophie est
l’augmentation de la taille des cellules (Spalding et al., 2008). Ces processus sont influencés par l’alimentation
et la génétique (Jo et al., 2009).
La proximité avec les vaisseaux sanguins permet au tissu adipeux de communiquer avec les autres tissus. Ainsi,
le tissu adipeux joue un rôle endocrinien essentiel pour maintenir l’homéostasie physiologique. Il synthétise et
sécrète des cytokines/chimiokines, telles que TNF-, IL-1, IL-6, IL-10 et la protéine chimiotactique des
monocytes 1 (MCP-1). La production des cytokines est augmentée chez les personnes obèses (Grundy, 2004).
La sécrétion d’adipokines (leptine, adiponectine, résistine, etc.) exerce des effets négatifs ou positifs sur la
sensibilité à l’insuline (Rajala & Scherer, 2003). Ces hormones circulantes permettent de communiquer avec le
système nerveux central et de l’informer des réserves d’énergie. Par exemple, la leptine réduit l’apport
alimentaire tandis que la ghréline, produite principalement par l’estomac, le stimule (Meier & Gressner, 2004).
Ce système de régulation permet de maintenir l’équilibre énergétique du corps. Un déficit en leptine cause
l’obésité. Dans le cadre d’essai clinique, l’administration quotidienne de leptine humaine recombinante à des
patients présentant un déficit congénital en leptine a entraîné une perte de poids impressionnante (Farooqi &
10
O'Rahilly, 2009). Par contre, un traitement à la leptine ne s’avère pas à être une solution efficace chez les
obèses n’ayant pas de déficit congénital en leptine. Au contraire, chez les obèses, la concentration de leptine
est élevée, ce qui résulte plutôt à une résistance à la leptine, empêchant ainsi de réduire l’apport alimentaire
(Meier & Gressner, 2004). L’adiponectine est sécrétée de façon constitutive dans le tissu adipeux.
L’adiponectine a plusieurs effets. Dans le foie, elle améliore l’oxydation des acides gras et réduit la production
de glucose hépatique (Turer & Scherer, 2012; Yamauchi et al., 2002). Dans le muscle, elle stimule l’utilisation
du glucose et de l’oxydation des acides gras (Yoon et al., 2006). Dans le tissu adipeux, l’adiponectine augmente
la captation des acides gras (Turer & Scherer, 2012). Elle est un bon biomarqueur de la résistance à l’insuline
étant donné que son expression et sa sécrétion sont diminuées dans l’obésité viscérale (Turer & Scherer, 2012).
Le tissu adipeux est également un site majeur pour le métabolisme des stéroïdes sexuels et des glucocorticoïdes
(Kershaw & Flier, 2004). Dans l’obésité, on observe des dysfonctionnements hormonaux. Les glucocorticoïdes
sont impliqués dans la régulation du métabolisme et de la distribution de la graisse corporelle. Chez les individus
obèses, il y a augmentation de la production locale de cortisol, un glucocorticoïde, ce qui contribue en partie à
l’obésité viscérale. La progestérone, quant à elle, compétitionne pour le même récepteur que le cortisol, ce qui
peut protéger contre les effets délétères du cortisol. Ainsi, la présence des différentes hormones dans les dépôts
adipeux détermine le patron de distribution des graisses (Wajchenberg, 2000).
Tel que mentionné, le tissu adipeux peut subir une expansion importante suite à un surplus calorique, ce qui
n’est pas nécessairement associée à des désordres pathologiques. Lorsque l’expansion du tissu adipeux est
saine et anatomiquement limitée à la graisse sous-cutanée, on parle alors d’obèses métaboliquement sains.
Lors du recrutement des cellules précurseurs d’adipocytes, il y a vascularisation du tissu jusqu’à la limite d’apport
en oxygène. L’expansion adipeuse malsaine, associée à l’inflammation chronique dans le tissu adipeux viscéral,
survient lorsque l’expansion rapide engendre l’hypertrophie des adipocytes, l’infiltration massive de
macrophages, le développement limité de vaisseaux sanguins et la présence de fibrose (Sun et al., 2011). Ainsi,
l’hypoxie est un déterminant qui limite la capacité de remodelage du tissu adipeux. Cette inflammation chronique
joue d’ailleurs un rôle majeur dans le développement de la résistance à l'insuline et du diabète de type 2 (Neels
& Olefsky, 2006; White & Marette, 2008). Le nombre d’adipocytes morts, positivement corrélé avec
l’augmentation de la taille des adipocytes, est augmenté chez les individus obèses. Les macrophages entourent
les adipocytes morts et constituent des « structures en forme de couronne », ce qui est une caractéristique de
l’inflammation chronique (Cinti et al., 2005). Les macrophages ont deux phénotypes différents : M1 (pro-
inflammatoire) et M2 (anti-inflammatoire). Il a été démontré chez la souris qu’une alimentation riche en matières
grasses augmente le nombre de macrophages de type M1 et change le ratio M1/M2 (Fujisaka et al., 2009) ce
qu’il rend l’environnement plus pro inflammatoire.
11
La lipogenèse
Les adipocytes permettent de conserver les surplus de lipides provenant de l’alimentation. Ils sont stockés sous
forme de triglycérides, qui contiennent trois molécules d’acides gras formant un ester avec une molécule de
glycérol. Par contre, les adipocytes peuvent également synthétiser de nouveaux lipides à partir de glucides en
utilisant la lipogenèse de novo. Le contrôle de la lipogenèse s’effectue par une régulation hormonale et
transcriptionnelle. L’insuline joue un rôle essentiel dans l’absorption et le stockage des sucres par le tissu
adipeux via SREBP-1 (Kersten, 2001). La leptine est également impliquée dans le processus, en partie, via la
voie SREBP-1 en limitant le stockage des graisses par l’inhibition de l’apport de glucose (Kersten, 2001). De
plus, les hormones de croissance empêchent la stimulation de la lipogenèse dans les cellules adipeuses. La
régulation transcriptionnelle s’effectue par les facteurs de transcription SREBPs (sterol regulatory element-
binding proteins), qui sont des régulateurs importants de l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme
des lipides. Les différents isoformes permettent la synthèse d’acides gras et de cholestérol, principalement au
niveau hépatique. Dans le tissu adipeux, ChREBP (Carbohydrate-responsive element-binding protein) est un
facteur de transcription important pour la synthèse des acides gras et la sensibilité à l’insuline (Herman et al.,
2012) PPAR est également un acteur majeur impliqué dans la lipogenèse au niveau du tissu adipeux. Une
diminution de l’expression de PPAR peut conduire à une augmentation des taux de leptine et, par conséquent,
diminuer la prise alimentaire (Kersten et al., 2000). Paradoxalement, l’expression de PPAR et de la leptine est
faible à jeun, mais même dans cet état, la lipogenèse continue et dépend de PPAR (Kersten et al., 2000).
La lipolyse
Pendant la période de jeûne, l’hydrolyse enzymatique des lipides (triglycérides, diglycérides et monoglycérides)
par le processus de la lipolyse, produit du glycérol et des acides gras libres (ou non estérifiés). La lipolyse est
effectuée par trois enzymes majeures. Le clivage primaire du triacylglycérol en diacylglycérol est effectué par
l’enzyme Adipose triglyceride lipase (ATGL). La lipase hormono-sensible (HSL) est une lipase de diglycérides
essentielle dans les adipocytes. La lipase de monoglycérides (MGL) complète le processus en générant du
glycérol et des acides gras libres afin qu’ils puissent être oxydés par les autres organes et produire une grande
quantité d’ATP (Young & Zechner, 2013).
Les individus obèses ont une quantité importante d’acides gras non estérifiés dans la circulation sanguine,
notamment dans le jeûne, étant donné le tissu adipeux imposant. Après un repas, l’insuline bloque la lipolyse
via l’activation d’Akt. Lorsqu’il y a résistance à l’insuline, ce processus est inefficace dû à l’inaction de l’insuline
entraînant une dyslipidémie (Choi et al., 2010). L’insuline ne peut pas contrôler la quantité d’acides gras libres.
12
L’excès d’acides gras non estérifiés, via une lipolyse basale augmentée à jeun ou une diminution de l’effet
inhibiteur de l’insuline en condition postprandiale, est un déterminant important des altérations métaboliques
associées à l’obésité abdominale. La concentration élevée d’acides gras non estérifiés provoque la résistance
à l’insuline (Boden & Shulman, 2002).
Ainsi, le tissu adipeux agit comme régulateur du bilan énergétique en étant un site de réserve d’énergie dans
l’état postprandial et une source d’acides gras libres pendant le jeûne. Le tissu adipeux a cependant une
capacité de réserve limitée. Le débordement d’acides gras non estérifiés dans la circulation sanguine se dirige
vers d’autres organes non spécialisés pour le stockage de lipides et altère leur fonctionnement normal.
L’adipogenèse
Les cellules adipeuses, aussi appelées adipocytes, sont dynamiques et constamment en renouvellement. Grâce
à l’analyse de l’intégration du carbone 14 généré lors des essais des bombes nucléaires durant la guerre froide,
une étude a démontré qu’environ 10% des cellules adipeuses sont renouvelées chaque année chez l’adulte
(Spalding et al., 2008). Le nombre d’adipocytes est fixé durant l’adolescence et reste relativement stable à l’âge
adulte. Ainsi, une perte de poids induit une réduction de la taille mais non du nombre d’adipocytes. La formation
d’un adipocyte mature se produit en deux phases : la détermination et la différenciation terminale. La
détermination implique l’engagement de la cellule précurseur en un pré-adipocyte. Ce dernier acquiert, lors de
sa différenciation terminale, les caractéristiques d’un adipocyte mature (figure 1.5) (Lefterova et al., 2014).
Figure 1.5 La différenciation adipocytaire se fait à travers deux ondes d’activation des facteurs de transcription.
Ce processus est associé à des changements dans l’accessibilité de la chromatine (Lefterova et al., 2014).
13
La coordination d’un réseau complexe de signaux, stimulants ou inhibiteurs, régule l’adipogenèse comprenant
les facteurs de transcription, les régulateurs du cycle cellulaire, les signaux extracellulaires, les hormones,
facteurs angiogéniques et les petites molécules (Rosen & MacDougald, 2006). Deux facteurs de transcription,
C/EBP- et C/EBP-, induisent le processus de différenciation cellulaire selon lequel des pré-adipocytes
deviennent des adipocytes matures, ce qui conduit à l’expression du « Peroxisome proliferator-activated
receptor gamma (PPAR) » et de C/EBP- (Hishida et al., 2009). Ces ondes d’activation sont associées à des
changements dans l’accessibilité de la chromatine pour la liaison des facteurs de transcription (Lefterova et al.,
2014). La réaction en chaîne des C/EBPs et de PPAR permet d’assurer la différenciation complète des pré-
adipocytes. Le maître de l’adipogenèse est le facteur de transcription PPAR.
PPAR
PPAR est un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Cette famille est également composée de
PPAR et PPAR. Grâce à leur distribution tissulaire distincte et à une activation spécifique du gène cible, les
trois PPARs contrôlent divers aspects du métabolisme des acides gras, du bilan énergétique, de la sensibilité à
l'insuline et de l'homéostasie du glucose (Evans et al., 2004).
Fortement exprimé dans les adipocytes, PPAR est requis pour la différenciation du tissu adipeux in vivo et in
vitro (Rosen et al., 1999). Dépendant de la liaison à un ligand, PPAR forme un hétérodimère avec le récepteur
X de l’acide rétinoïque (RXR) et se dissocie des corépresseurs. Le complexe PPAR/RXR se fixe sur une
séquence spécifique de l’ADN appelée PPRE (peroxisome proliferator response element), suivi du recrutement
de coactivateurs et de la machine transcriptionnelle pour initier l’expression des gènes cibles (Tontonoz. et al.,
1994). PPAR a plusieurs rôles dans l’adipocyte (figure 1.6), en contrôlant l’expression de gènes impliqués dans
l’adipogenèse (C/EBP, CCAAT/enhancer-binding protein ; STAT1, STAT5A and STAT5B, signal transducer
et activator of transcription 1, 5A and 5B), le métabolisme lipidique (aP2, fatty acid binding protein 2; ACBP,
acyl-CoA–binding protein; LPL, lipoprotein lipase; CD36, cluster of differentiation 36; PEPCK,
phosphoenolpyruvate carboxykinase; ACS, acyl-CoA synthetase; GyK, glycerol kinase) et l’homéostasie du
glucose (GLUT4, glucose transporter 4; PI3K, phosphoinositide 3 kinase; IRS-1 and IRS-2, insulin receptor
substrate 1 and 2). De plus, PPAR contrôle l’expression de nombreux facteurs sécrétés par le tissu adipeux,
tels que l’adiponectine, les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), TNF- et la résistine, qui influencent
également la sensibilité à l’insuline (Ahmadian et al., 2013).
14
Figure 1.6 Rôles de PPAR dans le tissu adipeux. La diète riche en gras (HFD), les ligands ou les thiazolidinediones (TZD) (1) activent les hétérodimères
fonctionnels PPAR-RXR (2) et maintiennent l’homéostasie métabolique par la régulation de gènes impliqués dans la différenciation des adipocytes (adipogenèse), le métabolisme lipidique et l’homéostasie du glucose.
De plus, PPAR contrôle l’expression de facteurs sécrétés à partir du tissu adipeux (3), ce qui influence également la sensibilité à l’insuline (Ahmadian et al., 2013).
Au niveau du métabolisme lipidique, deux protéines ont retenu notre attention, soit FABP4 et CD36. Le cluster
de différenciation 36 (CD36) est aussi connu sous le nom de fatty acid translocase (FAT), est une protéine
15
transmembranaire codée par le gène CD36. Elle permet l’importation des acides gras dans les cellules (Aitman
et al., 1999). Les souris CD36 KO ont une réduction de la taille ainsi que du nombre d’adipocytes matures.
L’absence de CD36 affecte négativement le recrutement de préadipocytes, ce qui augmente la lipolyse
(Vroegrijk et al., 2013). La protéine de liaison aux acides gras FAPB4, aussi appelé aP2, codée par le gène
Fabp4, est fortement sécrétée par les adipocytes pour réguler le métabolisme du glucose dans le foie. Les taux
circulants de FABP4 sont plus élevés chez les individus obèses (Cao et al., 2013). Les études sur les souris
déficientes en aP2 ont montré que cette protéine joue un rôle important dans le diabète de type 2 et
l’athérosclérose. Ainsi, il a été démontré qu’un inhibiteur de la protéine aP2 est un agent thérapeutique efficace
contre ces maladies (Furuhashi et al., 2007).
Ayant un rôle central dans les adipocytes, PPAR est une cible intéressante pour le traitement du diabète. La
structure linéaire de PPAR, représentée dans la figure 1.7, est constituée de domaines fonctionnels distincts,
y compris un domaine de transactivation N-terminal (AF1), un domaine de liaison à l’ADN hautement conservé
(DBD) et un domaine de liaison au ligand C-terminal (LBD) contenant une fonction de transactivation
dépendante du ligand (AF2). Ces domaines sont tous des cibles potentielles pour la modulation de PPAR. Les
coactivateurs se lient à la région AF2 de PPAR et cette liaison est souvent caractérisée par un segment
hydrophobe d’acides aminés contenant un motif LXXLL (Rosen et al., 2000).
Il existe 2 isoformes de PPAR, soit PPAR1 et PPAR2 (Tontonoz. et al., 1994). Ce dernier contient 30 acides
aminés supplémentaires à son extrémité N-terminale (Tontonoz. et al., 1994). PPAR2 est un inducteur puissant
de l’adipogenèse et spécifique dans le tissu adipeux, tandis que PPAR1 est plutôt ubiquitaire (Harris & Phipps,
2001). Il a été démontré que l’expression rétrovirale de PPAR2 est suffisante pour induire la différenciation des
fibroblastes en adipocytes (Tontonoz et al., 1994). Les co-activateurs de PPAR2 favorisent la différenciation
cellulaire selon une dose-réponse (Tontonoz et al., 1994).
Plusieurs mécanismes permettent la régulation de l’activité de PPAR, tels que par des interactions protéines-
protéines, les cofacteurs nucléaires (co-represseurs et co-activateurs), la phosphorylation ainsi que différentes
modifications post-traductionnelles covalentes (acétylation, ubiquitylation, O-GlcNacylation et SUMOylation)
(figure 1.7) (Ahmadian et al., 2013). PPAR est phosphorylé dans la région AF1 sur la sérine 112 par la mitogen-
activated protein kinase (MAPK), ce qui inhibe son activité transcriptionnelle en réprimant la liaison du ligand et
en modifiant le recrutement des cofacteurs (Hu et al., 1996). Fait surprenant, la phosphorylation du même site
par les cyclin-dependent kinases (Cdk7 et Cdk9) augmentent l’activité de PPAR (van Beekum et al., 2009). Un
autre site bien connu de phosphorylation sur sérine est le site Ser273 dans la région LBD par Cdk5 (Choi. et al.,
2011), une protéine kinase qui peut être activée par diverses cytokines pro-inflammatoires dont les quantités
16
sont élevées dans l’obésité (Ahmadian et al., 2013). De nouvelles études portent sur la phosphorylation sur
tyrosine de PPAR. Parmi celles-ci, une étude a démontré que la nonreceptor tyrosine kinase Abelson murine
leukemia viral oncogene (c-Abl), activée pendant la phase précoce de la différenciation des préadipocytes 3T3-
L1, favorise la différenciation des adipocytes en ciblant PPAR2. L’activité de la protéine tyrosine kinase c-Abl
est essentielle et son inhibition bloque la différenciation des adipocytes matures. C-Abl augmente la stabilité de
PPAR2 en phosphorylant deux résidus de tyrosine (Y78 et Y102) (Keshet et al., 2014). Au contraire, le
récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) induit la phosphorylation du résidu Y74 de PPAR, ce
qui conduit à la dégradation de ce dernier (Xu. et al., 2016). Selon une autre récente étude, la phosphorylation
du résidu Y78 par la kinase c-Src supprime l’expression de gènes pro-inflammatoire ainsi que la sécrétion de
chimiokines et de cytokines dans les adipocytes. De plus, la phosphorylation sur tyrosine (Y78) améliore la
sensibilité à l’insuline. Ce processus est d’ailleurs inversé par la protéine tyrosine phosphatase PTP-1B (Choi et
al., 2015).
Figure 1.7 Structure primaire de PPAR représentant les modifications post-traductionnelles qui influencent à la fois son activité transcriptionnelle et sa stabilité protéique de manière dépendante du type cellulaire et du contexte. Ac : acétylation; P : phosphorylation; SUMO : sumoylation; Ser : serine; Lys : lysine;
AF1: domaine de transactivation N-terminal; DBD : domaine de liaison à l’ADN hautement conservé; LBD : domaine de liaison au ligand C-terminal (Ahmadian et al., 2013)
17
Les thiazolidinediones (TZD) forment une classe de médicament, utilisée autrefois pour le traitement du diabète
de type 2, qui permet de réguler PPAR en réduisant la glycémie. Ces molécules de TZD (rosiglitazone,
pioglitazone, troglitazone, etc.) sont des agonistes synthétiques activant PPAR. La structure tertiaire de
PPARrévèle une poche de liaison au niveau de la région LBD où se lient les TZD. Cela entraîne un
changement conformationnel, permettant la dissociation des co-répresseurs ainsi que la liaison des co-
activateurs, ce qui active PPAR (Nolte et al., 1998). Par contre, plusieurs effets secondaires ont été signalés
tels que : prise de poids, risque maladie cardiaque, œdème pulmonaire et défaillance hépatique (Nesto et al.,
2003; Scheen, 2001).
Modèles pour étudier l’adipogenèse
La lignée cellulaire de souris, 3T3-L1, est l’un des modèles les plus utilisés pour étudier l’adipogenèse in vitro.
Les cellules 3T3-L1 dérivent des cellules 3T3 obtenu pour la première fois en 1963 par Todaro et Green (Todaro
& Green, 1963). Le nom « 3T3 » fait référence au protocole utilisé « 3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells ».
Cette lignée cellulaire a été générée à partir de fibroblastes embryonnaires de souris qui ont été trypsinisés pour
permettre le transfert tous les 3 jours à une densité cellulaire de 3 x 105. Après 20-30 générations, les cellules
étaient immortalisées. À partir de la lignée 3T3, ils ont isolé des cellules qui accumulent des triglycérides,
lorsqu’elles ont atteint la confluence. Cette autodifférenciation a permis de générer la lignée 3T3-L1 (Green &
Kehinde, 1974). Les 3T3-L1 permettent ainsi d’étudier le processus de différenciation terminale.
En pratique, les fibroblastes sont mis en plaques lors de la phase de croissance exponentielle et un arrêt de
croissance est observé lorsque les cellules atteignent la confluence (Gregoire et al., 1998). Les cellules sont
exposées à un cocktail de différenciation (insuline, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)) 2 jours
post-confluence pour enclencher le processus de différenciation (Ruiz-Ojeda et al., 2016). Des événements
morphologiques, biochimiques et moléculaires sont enclenchés. Une variété de gènes est influencée sous le
contrôle de facteurs de transcription, tel que démontré précédemment dans la figure 1.6 (Ahmadian et al., 2013).
D’autres modèles in vitro, ayant des avantages et des inconvénients, permettent d’étudier l’adipogenèse. Les
modèles de cellules souches, de cellules trans-différenciées et de cellules dédifférenciées sont relativement
nouveaux (Poulos et al., 2010). Des modèles in vivo peuvent également permettre d’étudier les étapes précoces
du développement du tissu adipeux (dépôt viscéral) et la différenciation terminale (dépôt sous-cutané) (Berry et
al., 2013; Rodeheffer et al., 2008). Par contre, dans les deux cas, il faut considérer l’effet de la présence d’autres
types cellulaires ainsi que la variabilité entre les individus (Berry et al., 2013).
18
Shp1
La régulation de la voie de signalisation de l’insuline est issue de l’interaction entre les kinases et les
phosphatases, dont les protéines tyrosine phosphatases (PTPs), ce qui permet de conserver une fine régulation
de la concentration de glucose dans le sang. Les PTPs sont des enzymes qui déphosphorylent leur substrat sur
leurs résidus de tyrosine, tandis que les protéines tyrosine kinases (PTKs) les phosphorylent. La plupart du
temps, les PTPs sont des régulateurs négatifs de la cascade de signalisation de l’insuline, comme par exemple,
la Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1 (Shp1).
La protéine tyrosine phosphatase Shp1 est produite grâce aux informations contenues dans le gène protein
tyrosine phosphatase, non-receptor type 6 (Ptpn6) et est un membre de la famille des PTPs (Xu et al., 2014).
Les PTPs régulent une variété de processus cellulaires, y compris la croissance cellulaire, la différenciation et
l’adhésion (Wheeler et al., 2002). Dans les années 90, Shp1 a été identifiée pour la première fois dans les
cellules hématopoïétiques (Matthews et al., 1992). Fortement exprimée dans les cellules hématopoïétiques, les
cellules neuronales, les astrocytes, les oligodendrocytes, les microglies, les cellules épithéliales, Shp1 est
également exprimée dans les cellules cibles de l’insuline, soit les cellules hépatiques, musculaires et adipeuses
(Dubois et al., 2006). Shp1 se retrouve dans le cytoplasme et le noyau. Shp1 possède 2 domaines SH2 au N-
terminale pour la liaison de substrat et un domaine phosphatase catalytique au C-terminale. Sa forme inactive
est une structure repliée qui bloque son site catalytique. Son activité est stimulée lors de la liaison avec le site
phosphorylé de la tyrosine du substrat (Xu et al., 2014).
Shp1 est impliquée dans une variété de voies de signalisation telles que PI3K/Akt, Jak-STAT, MAPK (ERK et
JNK) et NFB, qui sont responsables de nombreuses fonctions cellulaires dans la survie, le développement, la
régulation immunitaire, l’oncologie et le métabolisme. Shp1 est important pour la survie et le développement en
agissant à différents stades de développement des cellules hématopoïétiques en régulant ainsi le processus
d’hématopoïèse (Paling & Welham, 2005). La preuve la plus significative que Shp1 régule les fonctions
immunitaires provient des modèles de souris avec l’absence de Shp1 dans tout le corps, ce qui provoque de
l’inflammation et la mort prématurée (Lorenz, 2009). Ainsi, pour étudier le rôle de Shp1, un modèle viable de
souris est utilisé par un épissage différent, ce qui la rend inactive (Lorenz, 2009). De plus, Shp1 est impliquée
dans les cellules cancéreuses, où elle exerce différentes fonctions dans le contrôle de la croissance cellulaire
et la médiation des activités des cellules immunitaires. Shp1 a été proposé comme un gène suppresseur de
tumeur (Wu et al., 2003). La dysfonction de la régulation de Shp1 peut provoquer une croissance cellulaire
anormale et induire différents types de cancers (Wu et al., 2003). Au niveau du métabolisme, Shp1 est
également exprimée dans les tissus cibles de l’insuline tel que le muscle, le foie et le tissu adipeux et son
expression est augmentée dans un contexte d’obésité (Xu et al., 2014). Shp1 régule négativement l’homéostasie
19
du glucose (Dubois et al., 2006). Shp1 agit sur la voie de régulation de l’insuline et de sa clairance en ciblant
plusieurs molécules (Xu et al., 2014). Shp1 module l’activité de Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion
molecule 1 (CEACAM1), un régulateur clé dans la clairance de l’insuline et de son action, en la déphosphorylant
sur la membrane plasmique, réduisant ainsi l'endocytose du complexe insuline-IR, mais aussi en la
déphosphorylant après l'internalisation, empêchant ainsi sa dégradation lysosomale et favorisant son recyclage
sur la surface de la cellule (Huber et al., 1999). Shp1 déphosphoryle l'IR à la fois sur la membrane plasmique et
après internalisation dans les endosomes (Xu et al., 2014). Cette protéine tyrosine phosphatase inhibe
également PI3K en déphosphorylant la sous-unité régulatrice p85 (Cuevas et al., 2001).
En utilisant une forme inactive de Shp1 qui augmente le captage des substrats, le transport de glucose est
augmenté dans les cellules musculaires. L’inhibition de Shp1 augmente la signalisation de l’insuline et
l’expression du transporteur de glucose GLUT4 (Bergeron et al., 2011). La délétion spécifique de Shp1 dans les
hépatocytes protège les souris contre la résistance à l’insuline liée à l’obésité (Xu et al., 2012). Ces dernières
accumulent plus de gouttelettes lipidiques que les souris obèses contrôles, mais elles sont protégées contre
l'inflammation et les dommages hépatocellulaires. Une analyse de type « microarray » a révélé une
augmentation significative de l’expression de Pparg en l’absence de Shp1 dans les hépatocytes
comparativement aux souris contrôles. De plus, l’activité de PPARs’est révélée être directement régulée par
Shp1 in vitro. Donc, Shp1 joue potentiellement un rôle dans le métabolisme des lipides hépatiques via la
régulation de PPAR (Xu. et al., 2014).
20
Hypothèse et objectifs
Sachant que Shp1 joue un rôle clé dans la signalisation de l’insuline dans le foie et le muscle, il était de mise de
caractériser le rôle de Shp1 dans le tissu adipeux, un tissu également insulino-dépendant. Des travaux
antérieurs du laboratoire ont montré une possible interaction entre Shp1 et PPAR dans les hépatocytes. Dans
les souris Shp1 KO dans les hépatocytes, l’absence de Shp1 augmente l’expression et l’activité de PPAR (Xu.
et al., 2014). Étant donné que PPAR est un régulateur majeur du stockage des acides gras dans le tissu
adipeux, notre hypothèse de recherche est que Shp1 joue un rôle dans l’adipogenèse via la régulation de
PPAR. Peu de recherches ont été effectuées jusqu’à présent sur le rôle de Shp1 dans les cellules adipeuses.
Les objectifs spécifiques du projet étaient de déterminer le rôle de Shp1 dans :
1. le processus de différenciation des adipocytes.
2. la signalisation de l’insuline, et
3. la fonction adipocytaire.
Afin de caractériser le rôle de Shp1 dans la différenciation des cellules 3T3-L1 nous avons utilisé des lentivirus
spécifiques pour diminuer l’expression de Shp1 ou pour surexprimer de façon constitutive son expression dans
ces cellules. L’état physiologique des cellules a été mesuré par la coloration Oil-Red-O (ORO), le contenu en
triglycérides (TG), l’expression de gènes cibles et de leurs protéines, la réponse à l’insuline par le transport du
glucose et l’expression et la phosphorylation de protéines associées à la cascade de l’insuline.
21
Chapitre 2 : Role of Shp1 in adipocyte
differentiation and insulin signaling
Marie-Pier Forest1, Marie-Hélène Lavallée-Bourget1, Michael Schwab1, Kerstin
Bellmann1, and André Marette1
1Department of medecine, Cardiology Axis of the Institut Universitaire de Cardiologie et de
Pneumologie de Québec, Québec, Canada.
Running title: Role of Shp1 in adipogenesis
To whom correspondence should be addressed: André Marette, Ph.D. Cardiology Axis of the Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec (IUCPQ),
Québec, Canada. Tel: 418-656-8711 (ext. 3781); Fax: 418-656-4749 ; E-mail: [email protected]
Keywords: Shp1, PPAR, adipogenesis
22
Résumé
La protéine tyrosine phosphatase Shp1 régule négativement la signalisation de l’insuline et l’homéostasie du
glucose dans le foie et le muscle, mais son rôle dans le métabolisme des glucides et des lipides dans le tissu
adipeux est inconnu. Les travaux récents ont montré un lien possible entre Shp1 et PPARdans le foie. En
utilisant les cellules 3T3-L1 pour étudier l’adipogenèse, nous avons observé une régulation fine de l’expression
de Shp1 lors de la différenciation. La réduction de l’expression de Shp1 par shRNA n'a pas montré d'effet majeur
sur la différenciation terminale des adipocytes, mais l'expression de plusieurs régulateurs clés incluant PPARa
été retardée. Le transport du glucose des cellules différenciées n'a pas été affecté par la réduction de Shp1,
bien que la phosphorylation d'Akt après stimulation à l'insuline ait été augmentée. Shp1 semble être impliquée
dans l'adipogenèse et régule négativement la voie de signalisation de l'insuline PI3K-Akt dans les adipocytes.
23
Abstract
The protein-tyrosine phosphatase Shp1 negatively regulates insulin signaling and glucose homeostasis in liver
and muscle, but its role in carbohydrate and lipid metabolism in adipose tissue is unknown. Recent work has
shown a possible link between Shp1 and PPAR in the liver. Using 3T3-L1 cells as a model for adipogenesis,
we observed a fine regulation of Shp1 expression during differentiation. Knocking down Shp1 by shRNA did not
show any major effect on the final differentiation of adipocytes, but the expression of several key regulators
including PPAR was delayed during early adipogenesis. Glucose transport in fully differentiated cells was not
affected by knockdown of Shp1, although Akt phosphorylation after stimulation with insulin was increased in
those cells. Shp1 appears to be involved in adipogenesis and negatively regulates the PI3K-Akt insulin signaling
pathway in adipocytes.
24
Introduction
Adipocytes are dynamic and constantly renewed (Spalding et al., 2008). The formation of a mature adipocyte
occurs in 2 phases: determination and terminal differentiation. Determination is defined as the commitment of a
precursor cell to become a pre-adipocyte. During terminal differentiation, the pre-adipocyte acquires the mature
adipocyte characteristics. Adipogenesis is regulated by a complex network of signals, stimulators or inhibitors
such as transcription factors, cell cycle regulators, extracellular signals, hormones, angiogenic factors and small
molecules (Rosen & MacDougald, 2006). Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR), a
transcription factor, is a master regulator of adipogenesis. Its activity is modulated on many different levels
including transcription, posttranslational modifications and binding of co-activators and co-repressors. A
prerequisite for activation of PPAR is the formation of a heterodimer with the retinoid X receptor (RXR) and
dissociation of co-repressors. By binding to a specific sequence of the DNA called peroxisome proliferator
response element (PPRE) the PPAR-RXR heterodimer in complex with other co-activators recruits the
transcriptional machinery and initiates expression of the target genes (Tontonoz. et al., 1994). PPAR regulates
many genes involved in lipid metabolism, such as FABP4 and CD36.
Protein tyrosine phosphatases (PTPs) are critical regulators of cellular phosphorylation acting on processes
such as cell growth, differentiation, and adhesion (Wheeler et al., 2002). Different PTPs play a role in
adipogenesis, such as PTP1B and Shp2. Adipocyte-specific PTP1B deletion increases lipogenesis and
adipocyte cell size (Owen et al., 2012). Also, these mice exhibit decreased glucose tolerance. On the other hand,
Shp2 promotes adipogenesis through inhibition of p38 MAP kinase (He et al., 2013). Ablation of Shp2 in
adipocytes leads to premature death, lack of white fat, low blood pressure, compensatory erythrocytosis, and
hepatic steatosis. Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1 (Shp1), another member of the PTP
family related to Shp2, is encoded by the protein tyrosine phosphatase gene, non-receptor type 6 (Ptpn6) (Yi et
al., 1992). Shp1 contains two SH2 domains located in the N-terminal half for binding to phospho-tyrosine motifs
and a C-terminal catalytic phosphatase domain. In its inactive form, the N-terminal SH2-domain folds back to
the catalytic site thereby inhibiting its activity. Shp1 is activated upon binding of either one of the SH2-domains
to a phospho-tyrosine site rendering the catalytic domain accessible for its substrates.
Although Shp1 is predominantly expressed in hematopoetic cells (Yi et al., 1992), it has also been shown to be
expressed in insulin-sensitive organs such as skeletal muscle, liver and adipose tissue (Dubois et al., 2006).
Shp1 plays a major role in immunity as revealed by the impact of mutations in the Ptpn6 gene, which leads to
inflammation and premature death, known as the motheaten (me/me) phenotype. To study the role of Shp1, a
viable mouse model (mev/mev) was used via a different splicing making it non-functional (Tsui et al., 1993). We
have shown that Shp1 also plays a major role in the modulation of glucose homeostasis and insulin signaling,
25
and is implicated in the pathogenesis of obesity-linked insulin resistance via modulation of the PI3K-Akt pathway
(Dubois et al., 2006; Xu et al., 2012; Xu et al., 2014). Using an interfering mutant of Shp1 (dominant negative
(DN)Shp1), Bergeron et al. demonstrated that glucose uptake is augmented in skeletal muscle cells and that
Shp1 inhibition increases insulin receptor signaling and GLUT4 expression. Also, specific deletion of Shp1 in
hepatocytes protects from obesity-linked hepatic insulin resistance (Xu et al., 2012). Furthermore, hepatocyte-
specific Shp1 knockout mice (Shp1-KO) accumulate more lipid droplets in the liver compared to obese control
mice (Shp1f/f), but are protected from development of severe hepatic inflammation and hepatocellular damage
in steatotic livers. Interestingly, the increased hepatic lipid accumulation in hepatocyte-specific Shp1 knockout
mice went along with an increase in the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR activity and
expression suggesting a new role for hepatocyte Shp1 in hepatic lipid metabolism via the regulation of PPAR
(Xu. et al., 2014). PPAR is mainly expressed in adipose tissue and regulates diverse functions such as the
differentiation of fat cells and their capacity to store lipids (Medina-Gomez et al., 2007). Interestingly, Shp1
expression is augmented in insulin target tissues of obese mice, such as visceral fat depots (epididymal and
perirenal white adipose tissues) (Xu et al., 2012) but little is known about the role of Shp1 in adipogenesis.
Therefore, in this paper, we wanted to study the role of Shp1 in adipocytes. We observed that Shp1 expression
is upregulated in in 3T3-L1 adipocytes during differentiation. Using shRNAs to knock-down Shp1 we found that
downregulation of Shp1 did not affect the terminal differentiation of adipose cells, although we observed a delay
and a decrease in the expression of PPAR and its target genes such as CD36 and FABP4 as well as their
protein levels. Glucose uptake and insulin response were not affected by Shp1 downregulation, although insulin
stimulated Akt phosphorylation was increased in differentiated 3T3-L1 cells. These findings suggest that Shp1
is involved in early adipogenesis possibly by modulating PPAR expression and activity, and that Shp1 also
plays an important role in the regulation of insulin signaling in adipocytes.
Results
Expression of Shp1 and PPAR in differentiating adipose cells
Since Shp1 is expressed in adipose tissue and modulates PPAR in the liver (Xu. et al., 2014), we investigated
the expression of this protein during the differentiation of fat cells. The pre-adipose 3T3-L1 cells were
differentiated (see experimental procedures) into mature adipocytes. As expected, PPAR1 protein expression
was increased at day 1 of differentiation and reached its maximal expression at day 3. PPAR2 protein
expression significantly increased later than PPAR1 at day 3. Interestingly, Shp1 protein expression was
26
increased simultaneously at day 3 and remained elevated until day 7 of differentiation (Figure 2.1). These results
suggest a possible co-regulation between both proteins.
Knockdown of Shp1 in 3T3-L1 cells
To determine the role of Shp1 in adipogenesis, 3T3-L1 cells were infected with lentivirus carrying either a non-
target control shRNA (shControl) or one of five shRNAs specific for Shp1, which target different regions in the
coding sequence of Shp1. After puromycin selection, three of five shRNA, shShp1.65 shShp1.66 and
shShp1.68, allowed a substantial reduction in Shp1 expression. The percentage of knockdown by shShp1.65,
shShp1.66 and shShp1.68 on the mRNA level of Shp1 was 60%, 70% and 90% respectively (Figure 2.2A). The
knock-down efficiency of these three shRNAs is also reflected on the protein level of Shp1 both in growing 3T3-
L1 cells (data not shown) as well as during differentiation, e.g. on day 4 (Figure 2.2B). Quantification revealed
95% reduction of Shp1 protein expression in the cell line called shShp1.68 compared to the control (shControl).
ShShp1.65 and shShp1.66 significantly reduced protein expression of Shp1 by 60% and 80%, respectively
(Figure 2.2C). Since shShp1.68 showed the best knockdown of Shp1, we chose to do the following analyses
with cells expressing this shRNA, but also carried out the same experiments in parallel with cells containing
either shShp1.65 or shShp1.66 (see supplementary figures). As control, we used cells carrying the non-target
shRNA (shControl) throughout the experiments.
Effect of Shp1 knockdown on adipogenesis
We previously showed that the knockout of Shp1 in hepatocytes regulated the expression and the activity of
PPAR (Xu. et al., 2014). To investigate whether inhibition of Shp1 expression in adipocytes, which express
high amounts of PPAR compared to liver, would increase lipid accumulation and adipocyte differentiation, we
analyzed the phenotype of adipocytes after knockdown of Shp1 at day 7, when the cells reached maturity.
Surprisingly, we did not observe any increase in the number of cells containing lipid droplets or any difference
in the size and shape of the lipid droplets in the shShp1.68 cells compared to the control cells (shControl) after
oil red O (ORO) staining (Figure 2.3A). This result was confirmed by elution of oil red O, which revealed a small,
but non significant reduction in the shShp1.68 cells compared to the shControl cells (Figure 2.3B). Furthermore,
evaluation of the triglyceride (TG) content in these cells was not significantly different in shShp1.68 and control
cells (Figure 2.3C). Interestingly, cells carrying either shShp1.65 or shShp1.66 seemed to be less differentiated,
but to have bigger fat droplets compared to the control cells (Figure S2.1A). However, quantification of the ORO
staining showed only a tendency to reduce fat accumulation in shShp1.65 and shShp1.66 cells compared to
shControl (Figure S2.1B), while the TG content was not significantly altered amongst these different cells (Figure
S2.1C). Together, these results suggest that the final differentiation of adipocytes is not increased.
27
Shp1 knockdown affects the expression of key players of adipogenesis
To better understand the role of Shp1 during early differentiation, we evaluated the expression of some major
regulatory genes implicated in adipogenesis. Since we observed that Shp1 and PPAR seemed to be
upregulated at the same time (e.g. at day 3 of the differentiation process) we analyzed whether Shp1 knockdown
would lead to a modulation of gene expression of Pparg and its target genes during differentiation. Starting at
day 3 of differentiation, we observed a significantly slower increase of total Pparg expression in shShp1.68 cells
compared to the control cells (Figure 2.4A), while Pparg2 expression was not affected by the knockdown of
Shp1 (Figure 2.4B) suggesting that the phosphatase controls Pparg1. Next, we looked at two PPAR target
genes, CD36 and FABP4. While the effect of Shp1 knockdown was limited to CD36 expression (Figure 2.4C) it
was more robust for FABP4, whose expression was significantly reduced in shShp1.68 cells starting at day 3
and remained lower until day 7 of differentiation (Figure 2.4D). Cells carrying shShp1.65 and shShp1.66 showed
a very similar gene expression pattern compared to shShp1.68 cells (Figure S2.2A-D). Total Pparg expression
was reduced from day 3 to 5 (Figure S2.2A), but as seen in shShp1.68 cells, no effect on Pparg2 was observed
(Figure S2.2B). mRNA expression of CD36 was slightly delayed at day 3 and 4 (Figure S2.2C) and FABP4
expression was reduced from day 3 until day 5 in shShp1.65 and shShp1.66 cells (Figure S2.2D). These data
show that knockdown of Shp1 causes a transient reduction of the expression of Pparg and its target genes
during early differentiation.
To corroborate the data from the gene expression analysis, we also looked at protein levels of these important
key players of adipogenesis during the same time course experiment. We found that PPAR1 protein increased
at day 1 of differentiation and reached its maximal expression at day 3, whereas PPAR2 protein accumulated
later than PPAR1 at day 3 in control cells (Figure 2.5). In shShp1.68 cells, where Shp1 levels stay very low
during the whole differentiation process compared to control cells, PPAR1 seemed to reach its maximum
expression later and PPAR2 also accumulated one day later than in the shControl cells (Figure 2.5). As with
the CD36 mRNA expression, we found that its protein level was only slightly decreased in shShp1.68 at day 3
compared to control cells (Figure 2.5) whereas the expression levels were similar to control cells at the later
stages of differentiation. Protein expression of FABP4 confirmed the significant effect of knockdown of Shp1
observed on mRNA expression. The reduction of Shp1 in shShp1.68 cells significantly reduced FABP4 protein
expression during almost all days of differentiation (Figure 2.5). Similar results as in shShp1.68 cells were
obtained in shShp1.65 and shShp1.66 cells (Figure S2.3). Both PPAR targets, CD36 and FABP4, as well as
PPAR were reduced early during differentiation confirming the mRNA expression data and suggesting that
knockdown of Shp1 causes a delay in the expression of PPAR and its targets probably leading to a later onset
of adipogenesis.
28
Knockdown of Shp1 does not affect glucose transport
To determine the effect of Shp1 knockdown on one of the physiological functions of adipocytes, we measured
glucose uptake in 3T3-L1 cells infected with different shRNA for Shp1. It has been shown that in muscle,
expression of DNSHP-1 results in enhanced glucose transport (Bergeron et al., 2011). Surprisingly, we found
no difference between shShp1.68 and shControl cells (Figure 2.6A-B). The shShp1.65 and shShp1.66 cells
even showed a reduction of glucose uptake both in the basal and insulin stimulated state (Figure S2.4A-B),
which might be explained by the small effect of these two knockdowns on differentiation (Fig. S2.1A). After
normalization to the basal glucose uptake the fold increase did not show any differences between the shShp1.65,
shShp1.66 and shControl cells. Since GLUT4 is the major insulin-regulated glucose transporter found in adipose
tissues and muscles (Huang & Czech, 2007), we analyzed glut4 mRNA expression levels in shShp1.68 (Figure
2.6C), shShp1.65 and shShp1.66 cells (Figure S2.4C). We did not find any significant effect on glut4 mRNA
levels in all three knockdown cells. These data imply that Shp1 knockdown does not lead to an amelioration of
glucose transport and glut4 expression.
Akt phosphorylation is improved by knockdown of Shp1
We have previously reported that inactivation of Shp1 enhances insulin signaling in the liver (Dubois et al., 2006).
Furthermore, using an adenovirus to overexpress an interfering mutant of Shp1 in skeletal muscle, Bergeron et
al. (2011) showed an increase of insulin-induced Akt phosphorylation which has also been observed in the liver
of hepatocyte- specific Shp1 knockout mice (Xu et al., 2012). To examine if Shp1 has an effect on Akt signaling
in 3T3-L1 cells, we treated these cells with insulin for 10 and 30 minutes (Figure 2.7 and Figure S2.5). In the
shShp1.68 cell, which had the highest percentage of Shp1 knockdown, we observed a significant increase of
Akt phosphorylation on serine 473 after 10 min of insulin treatment and threonine 308 after 10 and 30 min of
insulin treatment compared to shControl cells, whereas the increase of Akt phosphorylation was only minor in
shShp1.66 and shShp1.65 cells. Akt can have an impact on different downstream pathways. Therefore, we
analyzed some of the downstream targets of Akt, such as FoxO and GSK3, in more detail. Phosphorylation of
serine 21 of GSK3 was increased in shShp1.68 cells treated with insulin for 10 min, but not for 30 min and not
for any of the other two Shp1 knockdown cells. Phosphorylation of serine 9 of GSK3 and serine 256 of FoxO
was not affected in any of the shShp1 cells. These results indicate that knockdown of Shp1 enhances
phosphorylation of Akt in adipose cells similar to other insulin target cells, but that this hyperactivation of Akt is
not very well transferred to downstream targets like GSK3 and FoxO.
29
Discussion
We have previously shown that Shp1 expression is increased in insulin target tissues, such as liver, muscle and
adipose tissue, in obesity and demonstrated that it plays a role in insulin signaling in liver and muscle (Bergeron
et al., 2011; Dubois et al., 2006; Xu et al., 2012; Xu. et al., 2014). In liver, Shp1 was shown to negatively regulate
PPAR expression and activity (Xu. et al., 2014). However, little is known about the physiologic role of Shp1 in
adipocytes. In this study, we investigated whether Shp1 modulates PPAR expression and activity, adipocyte
differentiation, glucose uptake, glut4 expression and insulin signaling in 3T3-L1 cells. When downregulating
Shp1 expression, we observed some small differences in the mature adipocyte morphology and lipid droplet
appearance, but no significant differences in the amount of triglycerides. On the other hand, the expression and
activity of PPAR appeared to be decreased given a delayed accumulation of PPAR and some of its target
genes involved in adipogenesis. Knockdown of Shp1 did not improve glucose uptake, insulin sensitivity and
glut4 mRNA expression, but we observed an increase in Akt phosphorylation proportional to reduced Shp1
expression, which corresponds to the results found in other cellular and animal models of hepatic and skeletal
muscle Shp1 invalidation.
Shp1 has been shown to negatively or positively regulate a plethora of different signaling pathways in different
cell types. Shp1 knock-down delayed expression of PPARduring the early stages of adipogenesis. PPAR is
tightly regulated by several pathways including Wnt/-catenin-, JAK/STAT- and PI3K/Akt-signaling. The Wnt/-
catenin signaling pathway negatively regulates adipogenesis by inhibiting expression of early adipogenic
transcription factors (Longo et al., 2004; Ross et al., 2000; Singh et al., 2006). In epithelial cells, it has been
demonstrated that Shp1 inhibits -catenin by inducing its degradation (Duchesne et al., 2003; Simoneau et al.,
2011). Thus, knocking down Shp1 in 3T3-L1 cells might lead to an increase in the amount of -catenin, which
then would lead to a retardation and decrease in the expression of PPARand adipocyte differentiation The
JAK/STAT pathway, especially STAT5 and to a lesser extent STAT1 and 3, have been well characterized as
activators of adipogenesis and PPAR-expression (Richard & Stephens, 2014). Mainly Shp2, but also Shp1 and
other PTPs have been implicated in the downregulation of JAK/STAT-signaling through dephosphorylation of
STATs (Xu & Qu, 2008). The PI3K/Akt signaling pathway plays also an important, positive role in adipocyte
differentiation. It has been shown that PI3K inhibitors completely blocked the adipocyte differentiation
(Christoffersen et al., 1998). Akt is well-known to play a key role in the regulation of cell growth, survival and
metabolism. The different Akt isoforms (Akt1, Akt2 and Akt3) each have distinct effects. A loss of Akt1 in primary
mouse embryo fibroblast (MEF) cells resulted in a defect of adipocyte differentiation (Yun et al., 2008).
Furthermore, Akt1 knockout mice show a growth retardation whereas mice harboring a knockout of Akt2 develop
insulin resistance (Garofalo et al., 2003). Here, we showed an increase of Akt activity when we downregulate
30
Shp1. Another study showed that expression of a constitutively activated form of Akt1 caused spontaneous
adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells (Magun et al., 1996). Also, it was shown that Akt1 plays an important
role in inducing differentiation of adipocytes via IGF-1 receptor stimulation (Xu & Liao, 2004). The transcriptional
activation of PPAR requires the activation of Akt during the differentiation of adipocytes (Kim et al., 2010).
Therefore, activation of the JAK/STAT- and PI3K/Akt-pathways by knockdown of Shp1 should enhance
adipogenesis. In our study we saw a delay in early adipogenesis, but terminal differentiation did not seem to be
very much affected by Shp1 knockdown, especially in the cells with the highest percentage of Shp1 reduction.
Increasing the Akt activity might alleviate the early defect in adipogenesis leading to an almost indistinguishable
final differentiation phenotype after downregulation of Shp1. Thus, Shp1 seems to be involved in adipogenesis
both as a negative and positive regulator.
In a previous study, we observed an increase in PPAR expression and activity in hepatocytes invalidated for
Shp1 (Xu. et al., 2014) suggesting that knockdown of Shp1 increases PPAR activity. Unexpectedly, we did not
find a more rapid adipocyte differentiation after Shp1-knockdown in 3T3-L1 cells. Also, the expression of PPAR
target genes was delayed, which might however just reflect the retardation of PPARexpression Measurement
of PPAR activity with different techniques such as luciferase assay or a transcription factor binding assay could
have given a better readout of PPAR activity in adipocytes invalidated for Shp1. The exact mechanism, how
Shp1 controls PPAR remains to be elucidated. Recently, it has been shown that tyrosine-phosphorylation of
PPAR2on Tyr78 seems to promote adipocyte differentiation and suppress expression of pro-inflammatory
genes in adipocytes (Choi et al., 2015; Keshet et al., 2014). PTP1B has been implicated in the dephosphorylation
of this tyrosine residue. Preliminary results from our laboratory suggest that Shp1 modulates PPARactivity in
liver cells by dephosphorylating another, newly identified phospho-tyrosine site (data not shown). Whether this
tyrosine residue is also phosphorylated in adipocytes and its phosphorylation plays a role in adipocyte
differentiation, remains to be tested.
Previous studies showed that reducing Shp1 protein and activity led to an increase of insulin sensitivity via the
PI3K-Akt pathway in liver and muscle (Dubois et al., 2006). Knockdown of Shp1 in 3T3-L1 cells resulted in an
increase of Akt phosphorylation, which normally reflects its activation, after insulin stimulation inversely
proportional to the Shp1 level. Activated Akt phosphorylates many target proteins including GSK3 and FoxO1
thereby modulating their activity (Manning & Toker, 2017). Moreover, glucose uptake by 3T3-L1 cells is normally
positively correlated with increased Akt phosphorylation, because Akt triggers the transport of glucose into
adipocytes by regulating GTPases, which are involved in the translocation of GLUT4 to the cell membrane.
Surprisingly, we saw no effect on glucose transport and FoxO1 phosphorylation, and only a small, transient
increase in GSK3 phosphorylation in cells with reduced Shp1. As for adipocyte differentiation, Akt1 and Akt2,
31
seem to affect signals regulating glucose homeostasis differently, which could possibly explain why total Akt
phosphorylation, as analysed in our study, is increased in Shp1 knockdown cells, but downstream events are
barely altered. Interestingly, Akt2 rather than the Akt1 or Akt3 isoforms appears to control GLUT4 trafficking in
adipose and muscle cells as well as mediate insulin signaling to control glucose output in liver (Bae et al., 2003;
Cho et al., 2001). In muscle, expression of a dominant-negative mutant of Shp1 (DN-Shp1) results in improved
glucose transport, mainly dependent on higher glut4 expression (Bergeron et al., 2011). However, the
overexpression of a dominant-negative version of Shp1 might not have the same effect compared to a
knockdown. Also, the timing of the Shp1 inactivation between our study and the study in muscle cells was very
different. The muscle cells were infected by an adenovirus expressing DN-Shp1 after they were fully
differentiated, whereas knockdown of Shp1 was achieved before differentiation. We saw an increase in Akt
phosphorylation, but a decrease in glut4 expression, which might be an indirect result of the slower and maybe
not complete differentiation in Shp1 knockdown cells compared to control cells. Hence, increased Akt
phosphorylation might be compensated by reduced GLUT4 expression. Nevertheless, the most important
regulation of GLUT4 transport to the cell membrane after insulin stimulation in adipocytes unlike in muscle cells,
is controlled by two different pathways, the PI3K/Akt-dependent insulin signalling and the APS-insulin signalling
pathway (Leto & Saltiel, 2012). The PI3K-independent pathway is initiated when APS (adaptor protein with
pleckstrin homology (PH) and Src homology 2 (SH2) domains) binds to insulin receptor, recruits the c-Cbl and
CAP (c-Cbl adaptor protein) complex thereby activating a signaling cascade involving GTPases and effector
proteins, which finally lead to GLUT4 exocytosis. Tyrosine-phosphorylation of c-Cbl by the insulin receptor is
important for downstream signaling in this pathway, but it also has been shown that increased tyrosine-
phosphorylation in T-cells lacking Shp1 induces ubiquitination and degradation of c-Cbl (Xiao et al., 2015). Thus,
knockdown of Shp1 might interfere with the APS-signaling pathway reducing GLUT4 exocytosis. A more detailed
analysis of GLUT4 trafficking to the membrane would be necessary to understand why an increase of Akt-
phosphorylation after Shp1-knockdown does not result in an augmented glucose transport.
PTP1B and Shp2 play opposing roles in adipocytes. Deletion of PTP1B increased lipogenesis whereas ablation
of Shp2 caused several problems resulting from the lack of adipogenesis (He et al., 2013; Owen et al., 2012)
though the targets of these phosphatases are not yet identified. Moreover, it has been shown that liver-specific
PTP1B KO mice exhibit improved glucose homeostasis and lipid profiles, independent of changes in adiposity.
(Delibegovic et al., 2009). It is thus possible that PTP1B can compensate for the absence of Shp1 in adipocytes.
For example, one study demonstrated that PTP1B plays a role in regulating EGFR and PDGFR phosphorylation,
but that compensatory mechanisms, suggesting the action of other PTPs, can help regulate EGFR and PDGFR
in PTP1B KO mice, which probably explains the lesser effects of PTP1B suppression (Haj et al., 2003).
32
A recent publication has shown that Shp1 affects differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs), precursors
of adipocytes, via the Wnt signaling pathway (Jiang et al., 2016). In this study, the time point of down-regulation
of Shp1 seemed to be important for this phenotype. The authors also found that mev/mev mice, which express
a form of Shp1 with reduced functionality, at 8 weeks of age develop increased osteoporosis and that MSCs
from mev/mev mice had reduced osteogenesis and increased adipogenesis (Jiang et al., 2016). Nevertheless,
Dubois et al. have shown that mev/mev mice have lower fat mass compared to wild type mice. Thus, although it
seems clear from the study of Jiang et al. that Shp1 plays a critical role in osteogenesis, its role in adipogenesis
is not yet clear. Our results in 3T3-L1 adipocytes rather suggest that invalidation of SHP1 leads to a slight delay
in adipogenesis. Another difference between our study and the paper of Jiang et al is the fact that they worked
with pluripotent stem cells, whereas we have analyzed the effect of Shp1 in 3T3-L1 cells, which are already
committed to adipogenesis and therefore are less sensitive to the effects of Shp1. Thus, it seems important at
which time point in the differentiation process Shp1 is playing a role.
In conclusion, this study suggests that Shp1 is involved in the regulation of adipocyte differentiation and function.
The complex phenotype of Shp1 knockdown implies that Shp1 has both a positive and negative influence in
adipocytes. However, Shp1 protein expression increased in parallel to PPAR and preliminary data from our
laboratory showed that constitutive expression of Shp1 in 3T3-L1 cells totally blocks adipocyte differentiation
(data not shown), which rather indicates an inhibitory function for Shp1. Further investigations are needed to
analyze the fine regulation between Shp1 and PPARas well as insulin dependent glucose transport An
adipose-specific knockout of Shp1 could give further insights into thein vivo role of Shp1 in adipogenesis and
adipose tissue function. Research to better understand the regulation of adipocyte differentiation is important
considering that adipose tissue is a potential target for the treatment of obesity.
33
Experimental procedures
Cell culture
3T3-L1 cells were grown in DMEM low glucose medium (GIBCO) with 20% Calf serum (GIBCO) to confluence
and differentiation was induced 2 days later in post-confluent cells in DMEM low glucose medium with 10%
bovine growth serum (Thermo Scientific) supplemented with adipogenic cocktail (10 g/mL insulin, 115g/mL
IBMX, 0.39 g/mL dexamethasone) for 2 days (day 0-2). The medium was replaced by DMEM low glucose
medium with 10% bovine growth serum and 5 g/mL insulin for 2 days (day 2-4) and after was replaced by
DMEM low glucose medium with 10% bovine growth serum for the rest of the differentiation process (day 4-7).
Cells were incubated in a humidified environment containing 10% CO2 at 37°C.
shRNA for Shp1
The lentivirus plasmids for knocking down Shp1 were purchased from GE, PTPN6 MISSION shRNA Bacterial
Glycerol Stock protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 6 (mouse) and the vector for the shRNA
constructs was pLKO.1 (Table 1). The lentiviral vectors (gift from M. Laplante) were transfected in 293T cells at
70% confluence. Transfection cocktail consists of DMEM high glucose without serum, transfection agent (PEI),
lentiviral vectors (PAX2 and pMD2.G) and shRNA vectors. After 21 h, medium was replaced by DMEM high
glucose medium with 30% bovine growth serum. After 24-48h, the medium containing the virus was collected,
filtered (45 µm) and kept it at -80°C. 3T3-L1 cells were infected with lentivirus containing different shRNA for
Shp1 in low glucose DMEM supplemented with 8 µg/ml polybrene. After 48h, infected 3T3-L1 cells were selected
in medium containing puromycin (4 µg/ml) to obtain stable cell lines.
Immunoblotting
Cells were lysed using Tris-buffer containing 1% NP-40 and protein concentration was measured with a BCA
protein assay kit (Thermo Scientific Pierce). Protein samples were separated by SDS-PAGE and transferred to
a nitrocellulose membrane. After blocking, membranes were incubated with specific primary antibodies followed
by anti-mouse-HRP or anti-rabbit-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories) and staining was detected with
ECL (Millipore). Antibodies used in IB were: actin, eef2, PPAR, total akt, p-akt (ser473), p-akt (thr308), GSK3,
pGSK3 (Ser21/9), CD36, FABP4, FoxO, p-FoxO (ser256) (Cell Signaling Technology), Shp1 and PPAR (Santa
Cruz Biotechnology). Quantification was done using ImageJ (National Institutes of Health).
34
qPCR
Total RNA was extracted (Qiagen) and used for cDNA synthesis using a reverse transcription PCR kit (Applied
Biosystems). qPCR was performed using the SYBR Green Jump-Start Gene Expression Kit (Sigma) with 1:25
diluted cDNA product from 2 g RNA or TAQMAN (Applied Biosystems) with 1:10 diluted cDNA product from 2
g RNA (for glut4 only). Primers used are shown in Table 2. Gene expression was normalized by -actin mRNA.
Oil Red O staining and triglyceride content
Cells were fixed in 10% formalin (Sigma-Aldrich), washed with 60% isopropanol, dried completely and then
stained with oil red O (Sigma-Aldrich) for 10 minutes. Immediately after washing with H2O pictures were taken.
To quantify triglycerides, the ORO staining was eluted by adding 100% isopropanol and the OD measured at
500 nm. Triglycerides content was determined by using Infinity reagent (Thermo Fisher Scientific). Briefly, cells
were harvested in PBS. Triglycerides were extracted with methanol:chloroform (1:2) solution and centrifuged at
max speed for 3 min. The clear supernatant was removed and the solvent evaporated. The dry lipid residue was
dissolved in isopropanol. The dosage was performed according to the kit and OD was measured at 500 nm.
Glucose transport
The glucose transport was determined by 2-Deoxyglucose (2-DG) uptake. The cells were deprived for 3 hours
before insulin (100 nM) stimulation for 45 minutes. Cells were rinsed once with glucose free Hepes buffer (pH
7.4) at room temperature and were incubated for 8 minutes with radioactive solution, 2-DG and 2-DG [3H] (Perkin
Elmer) in the same buffer followed by immediate washing for three times with cold saline solution. The cells were
harvested with NaOH (50 mM). Radioactivity was determined by liquid scintillation counting and corrected by
protein content.
Statistical Analysis
Statistical analyses were performed by two-tailed Student t-test. P values were considered significant if less than
0.05 (*) and 0.01 (**). Standard errors of the mean (SEM) are represented in the graph.
Acknowledgements
The authors thank Dr Mathieu Laplante for providing the 3T3-L1 cells and shRNA plasmid. This study was funded
by grants from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR). M.-P. F. received Annual Fellowship from
Direction de la recherche universitaire de l’IUCPQ. M-P.F. received Louise-Côté award from Department of
Medecine at Laval University and other scholarships from Conseil Professionnel de Diabète Québec (CPDQ)
and lnstitut sur la nutrition et les aliments fonctionnels (INAF).
35
Conflict of interest
The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.
Author contributions
M.-P. F. wrote the manuscript and conducted the whole project. M.-H. L.-B., K.B. and M.S. contributed to the
experiments. A.M. supervised the overall research.
36
REFERENCES
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39
TABLES
Table 1. shRNA sequences
shRNA Name Clone ID Sequence
shControl pLKO.1-Scramble shRNA
1864 CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG
shShp1.64 TRCN0000028964
NM_013545.1-1224s1c1
CCGGCCGGAACAAATGTGTCCCATACTCGAGTATGGGACACATTTGTTCCGGTTTTT
shShp1.65 TRCN0000028965
NM_013545.1-1318s1c1
CCGGGAATACAAACTGCGAACATTACTCGAGTAATGTTCGCAGTTTGTATTCTTTTT
shShp1.66 TRCN0000028966
NM_013545.1-889s1c1
CCGGGAGGAGTTTGAGAGTCTACAACTCGAGTTGTAGACTCTCAAACTCCTCTTTTT
shShp1.67 TRCN0000028967
NM_013545.1-435s1c1
CCGGCCACCTTAAGTACCCACTGAACTCGAGTTCAGTGGGTACTTAAGGTGGTTTTT
shShp1.68 TRCN0000028968
NM_013545.1-1584s1c1
CCGGGCTAGACTGTGACATTGATATCTCGAGATATCAATGTCACAGTCTAGCTTTTT
Table 2. qPCR primer sequences
Gene Forward sequence Reverse sequence
Ptpn6 (Shp1) TGGTTTCACCGGGACCTCAGC AGTAAGGCTGCCGCAGGTAGA
Glut4 CTCAGCTGTGCTTGGCTCCCTTCAGTTTGGC GATGGAGTCCGGTCCCCCAGGACCCTGCCTAC
Pparg GAAAGACAACGGACAAATCACC GGGGGTGATATGTTTGAACTTG
Pparg2 ACTGCCTATGAGCACTTCAC CAATCGGATGGTTCTTCGGA
CD36 GTCCTGGCTGTGTTTGGAGG GCTGCTACAGCCAGATTCAG
FABP4 GACGACAGGAAGGTGAAGAG ACATTCCACCACCAGCTTGT
Actb CTCTAGACTTCGAGCAGGAG AGAGTACTTGCGCTCAGGAG
40
Figures
Figure 2.1 Shp1 and PPAR are co-expressed during early differentiation of 3T3-L1 cells
(A) 3T3-L1 cells were grown to confluence and differentiation was induced in post-confluent cells in the presence
of adipogenic cocktail for 2 days (day 0-2). The medium was replaced by medium containing serum and insulin
for 2 days (day 2-4) and after was replaced by medium containing serum for the rest of the differentiation process
(day 4-7). Shp1 and PPAR proteins were detected by immunoblotting (IB). Arrow: unspecific reaction of the
antibody. (B) Quantification of Shp1, PPAR1 and PPAR2 corrected by eef2 and normalized to the respective
protein at day 7. Data are expressed as the mean of three independent experiments ± SEM. Differentiation time
in days.
A
Days of differentiation: 0 1 2 7 3 6 4 5
PPAR 2
eef2
← Shp1
PPAR 1
B
0
0,5
1
1,5
0 1 2 3 4 5 6 7
Rel
ativ
e pr
otei
n ex
pres
sion
Shp
1/ee
f2
Days of differentiation
0
0,5
1
1,5
0 1 2 3 4 5 6 7
Rel
ativ
e pr
otei
n ex
pres
sion
PP
AR1
/eef
2
Days of differentiation
0
0,5
1
1,5
0 1 2 3 4 5 6 7
Rel
ativ
e pr
otei
n ex
pres
sion
PP
AR2
/eef
2
Days of differentiation
41
Figure 2.2 Knockdown efficiency varies between different, Shp1-specific shRNAs.
3T3-L1 cells were infected with lentivirus carrying shRNAs specific for Shp1 or a control shRNA. (A) Shp1 mRNA
expression was measured by qPCR in the 3T3-L1 cells infected by different shRNA for Shp1 and normalized to
Actb mRNA levels and compared to shControl cells. (B) Shp1 protein was detected by IB at day 4. Arrow:
unspecific reaction of the antibody. (C) Quantification of Shp1 corrected by eef2. Data are expressed as the
mean of three independent experiments ± SEM. * p < 0.05 ** p < 0.01.
A
B
S 65 66 68
eef2
Shp1
S: shControl 65: shShp1.65 66: shShp1.66 68: shShp1.68
←
C
0
0,5
1
1,5
Shp1
Rel
ativ
e pr
otei
n ex
pres
sion
Shp
1/ee
f2 shControl
shShp1.65
shShp1.66
shShp1.68
* *
* *
* *
0,0
0,5
1,0
1,5
mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
Shp1
shControl
shShp1.65
shShp1.66
shShp1.68
**
* *
42
Figure 2.3 Shp1 knockdown does not affect the final differentiation of adipose cells.
(A) shShp1.68 and shControl 3T3-L1 cells were differentiated (day 7) and then stained with oil red O (ORO) for
lipid droplets. Representative pictures (10X magnification) of three independent experiments at day 7. (B)
Quantification of ORO staining measured at 500 nm. Data are expressed as the mean of three independent
experiments ± SEM for n=3 per condition. (C) Triglycerides were extracted and quantified at day 7 of
differentiation. Data are expressed as the mean of three independent experiments ± SEM.
shControl shShp1.68 A
B C
0
0,5
1
1,5
OR
O(R
elat
ive
Uni
t)
shControl
shShp1.68
Day 7
0
0,5
1
1,5
Trig
lyce
rides
(Rel
ativ
e U
nit)
shControl
shShp1.68
Day 7
43
Figure 2.4 Shp1 knockdown delays the expression of Pparg and some of its target genes in adipogenesis.
(A-D) Gene expression analysis in 3T3-L1 cells expressing shShp1.68 or shControl as a control during
differentiation (day 0-7). mRNA expression of Pparg (A), Pparg2 (B), CD36 (C) and FABP4 (D) were measured
by qPCR and normalized to Actb mRNA levels. Data are expressed as the mean of three independent
experiments ± SEM.* p < 0.05 ** p < 0.01.
A
B
C
D
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
FABP4
shControl
shShp1.68
Days of differentiation
* **
* * *
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
CD36
shControl
shShp1.68
Days of differentiation
*
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
Pparg2
shControl
shShp1.68
Days of differentiation
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7
mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
Pparg
shControl
shShp1.68
Days of differentiation
*
**
44
Figure 2.5 Shp1 knockdown affects protein accumulation of PPAR, CD36 and FABP4.
Protein expression analysis in 3T3-L1 cells expressing shRNA against Shp1 (shShp1.68) or shControl as a
control during differentiation (day 0-7). Experiment was repeated three times with similar results. Data are
expressed as the mean of three independent experiments ± SEM. Arrow: unspecific reaction of the antibody.
shControl
1 2 4 5 3 Days of differentiation : 0 6 7
shShp1.68
1 2 4 5 3 7 6 0
FABP4
CD36
eef2
PPAR 2
PPAR 1
Shp1 ←
45
Figure 2.6 Glucose uptake and glut4 mRNA levels are not changed after knockdown of Shp1 in 3T3-L1.
(A-B) Serum-deprived 3T3-L1 cells were incubated without or with 10 nM insulin for 45 min. Uptake of [3H] 2-
deoxyglucose was measured in the absence or presence of insulin using differentiated 3T3-L1 (day 7) cells,
which had been infected with shShp1.68 or shControl. Data are expressed as the mean of six independent
experiments ± SEM for n=2-3 per condition. (C) Glut4 mRNA expression was measured by qPCR in the
differentiated 3T3-L1 cells (day 7) infected by shShp1.68 or shControl and normalized to Actb mRNA levels.
Data are expressed as the mean of six independent experiments ± SEM.
A
B
C
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
basal insulin (10 nM)
Rel
ativ
e gl
ucos
e up
take
(fol
d st
imul
atio
n of
sh
Con
trol
)
shControl
shShp1.68
Day 7
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
basal insulin (10nM)
Rel
ativ
e gl
ucos
e up
take
(fol
d st
imul
atio
n of
bas
al)
shControl
shShp1.68
Day 7
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glut4
mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
shControl
shShp1.68
46
Figure 2.7 Phosphorylation of Akt, but not of its substrates is increased in differentiated 3T3-L1 cells with reduced expression of Shp1.
Serum-deprived 3T3-L1 cells at day 7 of differentiation were stimulated with 10 nM insulin for 30 minutes.
Measurement of total Akt and phosphorylation of Akt on Ser473 and Thr308, FoxO and p-FoxO on Ser256 and
GSK3 as well as their phosphorylated forms, were analyzed by IB in shShp1.68 cells and compared to shControl
cells. Representative figure of two independent experiments.
Insulin 10 nM 30 min
Akt
eef2
p-Akt (Ser473)
p-Akt (Thr308)
GSK3-α
FoxO
p-FoxO (Ser256)
GSK3-β
p-GSK3-α(Ser21) p-GSK3-β(Ser9)
shC
ontr
ol
+
shS
hp1.
68
+
shS
hp1.
68
-
shC
ontr
ol
-
47
Supplementary figures
Figure S2.1 Reduction of Shp1 by shShp1.65 and shShp1.66 seems to slightly affect the differentiation of adipose cells.
(A) shShp1.65, shShp1.66 knockdown and shControl 3T3-L1 cells were differentiated (day 7) and stained with
oil red O (ORO) for lipid droplets. Representative pictures (10X magnification) of three independent experiments
at day 7. (B) Quantification of ORO staining measured at 500 nm. Data are expressed as the mean of three
independent experiments ± SEM for n=3 per condition. (C) Triglycerides were extracted at day 7 of differentiation
and then quantified. Data are expressed as the mean of three independent experiments ± SEM.
shControl shShp1.65 shShp1.66
A
B C
0
0,5
1
1,5
OR
O(R
elat
ive
Uni
t)
shControl
shShp1.65
shShp1.66
Day 7
0
0,5
1
1,5T
rigly
cerid
es(R
elat
ive
Uni
t)
shControl
shShp1.65
shShp1.66
Day 7
48
Figure S2.2 Knockdown of Shp1 by shShp1.65 and shShp1.66 delays the
expression of Pparg and some of its target genes in adipogenesis.
(A-D) Gene expression analysis in 3T3-L1 expressing shShp1.65, shShp1.66 or shControl during differentiation
(day 0-7). mRNA expression of Pparg (A), Pparg2 (B), CD36 (C) and FABP4 (D) were measured by qPCR and
normalized to Actb mRNA levels. Data are expressed as the mean of three independent experiments ± SEM. *
p < 0.05 ** p < 0.01.
A
B
C
D
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7
mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
Pparg
shControl
shShp1.65
shShp1.66
Days of differentiation
* *
**
* * ** * *
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
Pparg2
shControl
shShp1.65
shShp1.66
Days of differentiation
*
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
CD36
shControl
shShp1.65
shShp1.66
Days of differentiation
**
**
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 1 2 3 4 5 6 7mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
FABP4
shControl
shShp1.65
shShp1.66
Days of differentiation
**
* ** **
49
Figure S2.3 Decrease of Shp1 by shShp1.65 and shShp1.66 affects protein
expression of PPAR, CD36 and FABP4.
Protein expression analysis in 3T3-L1 expressing shControl or shRNAs against Shp1 (shShp1.65 and
shShp1.66) during differentiation (day 0-7). Experiment was repeated three times with similar results. Arrow:
unspecific reaction of the antibody.
shControl
1 2 4 5 3 0 6 7
shShp1.65
1 2 4 5 3 0 6 7
FABP4
CD36
shShp1.66
eef2
PPAR2
PPAR1
Shp1
1 2 4 5 3 0 6 7
←
Days of differentiation :
50
Figure S2.4 Glucose uptake and glut4 mRNA levels seem to be minimally affected by reduction of Shp1 with shShp1.65 and shShp1.66.
(A-B) Serum-deprived 3T3-L1 cells were incubated without or with 10 nM insulin for 45 min. Uptake of [3H] 2-
deoxyglucose was measured in the absence or presence of insulin using differentiated 3T3-L1 (day 7) cells,
which had been infected with shShp1.65 and shShp1.66 or shControl. Data are expressed as the mean of six
independent experiments ± SEM for n=2-3 per condition. (C) Glut4 mRNA expression was measured by qPCR
in the differentiated 3T3-L1 (day 7) infected by shShp1.65, shShp1.66 or shControl and normalized to Actb
mRNA levels. Data are expressed as the mean of three independent experiments ± SEM.
A
B
C
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
basal insulin (10nM)
Rel
ativ
e gl
ucos
e up
take
(fol
d st
imul
atio
n of
bas
al)
shControl
shShp1.65
shShp1.66
Day 7
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
basal insulin (10 nM)
Rel
ativ
e gl
ucos
e up
take
(fol
d st
imul
atio
n of
sh
Con
trol
)shControl
shShp1.65
shShp1.66
Day 7
* * * *
* * * *
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glut4
mR
NA
exp
ress
ion
(Rel
ativ
e U
nit)
shControl
shShp1.65
shShp1.66
51
Figure S2.5 Decreased Shp1 expression leads to increased phosphorylation of
Akt and GSK3.
(A) Serum-deprived 3T3-L1 cells at day 7 of differentiation were incubated without or with 10 nM insulin for 10
or 30 minutes. Measurement of total Akt and phosphorylation of Akt on Ser473 and Thr308, GSK3 (total protein
and phosphorylated) were analysed by IB for cells infected with any of the three shShp1 or shControl constructs.
(B-C) Quantification of p-Akt and p-GSK corrected by their respective total proteins and normalized to eef2. Data
are expressed as the mean of three independent experiments ± SEM. * p < 0.05 ** p < 0.01.
Insulin 10 nM
No ins 10 min 30 min
S 65 66 68 S 65 66 68 S 65 66 68
eef2
Akt
S: shControl 65: shShp1.65 66: shShp1.66 68: shShp1.68
p-Akt (Ser473)
p-Akt (Thr308)
B
A
GSK3-α GSK3-β p-GSK3-α(Ser21)
C
p-GSK3-β(Ser9)
0
2
4
6
8
10
ins 10 min ins 30 min
Rel
ativ
e ph
osph
oryl
atio
np-
Akt
(Ser
473)
/Akt
shControl
shShp1.65
shShp1.66
shShp1.68
*
0
2
4
6
8
10
ins 10 min ins 30 min
Rel
ativ
e ph
osph
oryl
atio
np-
Akt
(Thr
308)
/Akt
shControl
shShp1.65
shShp1.66
shShp1.68
* *
* *
*
0
2
4
6
8
10
ins 10 min ins 30 min
Rel
ativ
e ph
osph
oryl
atio
np-
GS
K-3
α(S
er21
)/G
SK
-3α
(Ser
21) shControl
shShp1.65
shShp1.66
shShp1.68
*
0
2
4
6
8
10
ins 10 min ins 30 min
Rel
ativ
e ph
osph
oryl
atio
np-
GS
K-3
β(S
er9)
/GS
K-
3β(S
er9)
shControl
shShp1.65
shShp1.66
shShp1.68
52
Chapitre 3 : Conclusion et perspectives
L’intérêt pour contrôler l’épidémie de l’obésité et ses complications, tel que le diabète de type 2, est grandissant.
Différents travaux de recherche permettent de comprendre les mécanismes impliqués afin de donner des
traitements ciblés. Principalement exprimée dans les cellules hématopoïétiques (Yi et al., 1992), Shp1 est
également exprimée dans les cellules cibles de l’insuline, telles que les cellules musculaires, hépatiques et
adipeuses (Dubois et al., 2006). Il a été démontré que Shp1 joue un rôle dans la modulation de l'homéostasie
du glucose et de la signalisation de l'insuline et est impliqué dans la pathogenèse de la résistance à l'insuline
liée à l'obésité par la voie PI3K-Akt (Dubois et al., 2006; Xu et al., 2012; Xu. et al., 2014). Sachant que Shp1 est
impliqué au niveau du diabète de type 2, nous avons caractérisé son rôle dans l’obésité, au niveau des
adipocytes. Pour ce faire, l’utilisation de shRNAs a permis de diminuer l’expression de Shp1 dans les cellules
adipeuses 3T3-L1 et d’évaluer le rôle de Shp1 au cours de la différenciation. Par la simple observation d’une
possible régulation de Shp1 en lien avec PPAR, maître de l’adipogenèse, une étude approfondie des effets
physiologiques de l’absence de Shp1 dans les 3T3-L1 a été effectuée. Plusieurs shRNA spécifiques pour Shp1
ont été générés en parallèle pour diminuer son expression. Les cellules infectées par shShp1.68 ont diminué
l’expression de Shp1 de façon plus significative que les autres, ce qui nous a permis d’évaluer les effets
physiologiques au niveau d’expression de Shp1 le plus bas. Nous avons constaté que la réduction de
l’expression de Shp1 ne semblait pas affecter la différenciation finale des cellules adipeuses, bien que nous
ayons noté, contrairement à notre hypothèse, un délai et une diminution de l’expression de PPAR et de ses
gènes cibles tels que CD36 et FABP4 ainsi que leur expression protéique. Le transport de glucose, la sensibilité
à l’insuline et l’expression de glut4 n’ont pas été significativement affectés par la diminution de l’expression de
Shp1, bien que la phosphorylation d’Akt stimulée par l’insuline ait été augmentée dans les cellules 3T3-L1
différenciées. D’ailleurs, l’augmentation de la phosphorylation d’Akt et de son substrat GSK-3 étaient
inversement proportionnelles à la réduction de l’expression de Shp1. Ces résultats suggèrent que Shp1 est
impliqué dans l'adipogenèse précoce, probablement en modulant l'expression et l'activité de PPAR et que Shp1
joue également un rôle important dans la régulation de la signalisation d'insuline dans les adipocytes.
Différentes hypothèses peuvent expliquer l’effet surprenant de la réduction de l’expression de Shp1. La
possibilité que Shp1 puisse agir sur diverses voies de signalisation expliquerait pourquoi Shp1 peut avoir des
effets divergents sur la différenciation des cellules 3T3-L1. L’expression de PPAR est également régulée par
plusieurs voies, y compris Wnt/-caténine, JAK/STAT et PI3K/Akt (Kim et al., 2010; Richard & Stephens, 2014;
Ross et al., 2000). Dans la voie de signalisation Wnt/-caténine, l’inhibition de Shp1 dans les cellules 3T3-L1
pourrait entraîner une augmentation de la quantité de -caténine, ce qui entraînerait un délai et une diminution
de l'expression de PPAR et la différenciation des adipocytes (Duchesne et al., 2003; Longo et al., 2004; Ross
53
et al., 2000; Simoneau et al., 2011; Singh et al., 2006). Dans la voie JAK/STAT, la diminution de l’expression de
Shp1 entraînerait l’activation de l’adipogenèse et l’expression de PPAR (Richard & Stephens, 2014). Dans le
même sens, l’augmentation de la phosphorylation d’Akt, via la voie de PI3K-Akt, lors de la réduction de
l’expression de Shp1 devrait améliorer l’adipogenèse (Christoffersen et al., 1998; Kim et al., 2010; Yun et al.,
2008). Nous avons plutôt observé un délai au début de la différenciation sans affecter la différenciation terminale,
malgré l’augmentation de la phosphorylation d’Akt.
Des études antérieures ont montré que la réduction de Shp1 et de son activité améliore la sensibilité à l’insuline
via la voie Akt-PI3K dans le foie et le muscle (Bergeron et al., 2011; Dubois et al., 2006; Xu et al., 2012). Nous
avons également observé une augmentation de la phosphorylation d’Akt inversement proportionnelle au niveau
d’expression de Shp1 dans les cellules adipeuses. L'Akt activé phosphoryle de nombreuses protéines cibles, y
compris GSK3 et FoxO1, modulant ainsi leur activité (Manning & Toker, 2017). Akt, plus spécifiquement Akt2,
est également responsable du transport de glucose dans les adipocytes en régulant les GTPases, qui sont
impliqués dans la translocation de GLUT4 à la membrane cellulaire. En effet, parmi les différents isoformes
d’Akt, l’absence dAkt2, et non Akt1 ou Akt3, entraîne une réduction de l’absorption de glucose régulée par
l’insuline (Bae et al., 2003; Cho et al., 2001). Étonnamment, aucun effet sur le transport du glucose et la
phosphorylation des substrats, FoxO1 et GSK3 n’a été clairement observé dans les cellules infectées par des
shRNAs spécifiques pour Shp1. Les différences de fonction entre les isoformes d’Akt pourraient expliquer ce
phénotype, mais notre étude n’a pas permis d’évaluer la distinction entre Akt1 et Akt2. Au contraire, dans le
muscle, le DN-Shp1 favorise le transport de glucose dû à l’augmentation de glut4 (Bergeron et al., 2011). En
plus d’utiliser différentes techniques pour inactiver Shp1, il faut noter qu’il s’agit de deux types cellulaires
différents et que les cellules ont été infectées à différents moment de la différenciation. Une analyse plus
détaillée de GLUT4 à la membrane serait nécessaire pour comprendre pourquoi une augmentation de la
phosphorylation d’Akt après l’inactivation de Shp1 n’entraîne pas un meilleur transport de glucose.
Une publication récente a montré que Shp1 affecte la différenciation des cellules souches mésenchymateuses
(MSC), des précurseurs d’adipocytes, via la voie de signalisation Wnt (Jiang et al., 2016). Dans cette étude, le
moment de la régulation négative de Shp1 semble être important. Les travaux ont été effectués à partir de
cellules souches pluripotentes tandis que nous avons utilisé les 3T3-L1 qui sont déjà engagées dans
l’adipogenèse. Les souris mev/mev, qui expriment une forme inactive de Shp1, ont une adipogenèse accrue. Par
contre, Dubois et al., ont montré que les souris mev/mev ont une masse adipeuse moindre par rapport aux souris
de type sauvage. Cet article explique le rôle critique de Shp1 dans l’ostéogenèse sans définir clairement son
rôle dans l’adipogenèse. Notre étude suggère que Shp1 est impliqué dans la régulation de la différenciation et
de la fonction des adipocytes. Le phénotype complexe de la diminution de l’expression de Shp1 montre que
Shp1 joue à la fois un rôle positif et négatif dans les adipocytes.
54
Dans une étude antérieure, nous avons observé que la diminution de l’expression de Shp1 dans les hépatocytes
entraîne une légère augmentation de l’activité et de l’expression de PPAR, mais la surexpression de Shp1 a
un effet important sur l’activité de PPAR(Xu. et al., 2014). Nous avons donc décidé d’analyser les effets d’une
expression constitutive de Shp1 dans les cellules 3T3-L1. L’expression constitutive de Shp1 a été validée par
immunobuvardage (IB) (figure 3.1 A). Selon notre hypothèse de recherche, en surexprimant Shp1, il y a une
diminution de l’expression de PPAR. L’expression constitutive de Shp1 dans les 3T3-L1 affecte de façon
évidente l’expression de PPAR (figure 3.1 B).
Figure 3.1 L’expression constitutive de Shp1 dans les cellules 3T3-L1 affecte PPAR.
(A) Expression protéique dans les cellules 3T3-L1 infectées par un lentivirus portant Shp1-V5 (Shp1) ou actin-V5 (contrôle).
(B) Expression protéique de PPAR des cellules exprimant de façon exogène ou non Shp1 (Jour 4). Flèche : Réaction non
spécifique de l’anticorps.
Cette diminution de l’expression de PPAR a affecté la différenciation des cellules adipeuses. Les cellules 3T3-
L1 exprimant de façon constitutive Shp1 se sont peu différenciées en adipocytes matures, après 7 jours,
comparativement au contrôle (figure 3.2).
eef2
Contrôle Shp1
PPAR 2 PPAR 1
Shp1-V5
actin-V5
Shp1
eef2
cont
rôle
Shp
1
B A
←
55
Figure 3.2 L’expression constitutive de Shp1 affecte la différenciation terminale des cellules 3T3-L1.
Les cellules contrôles et les cellules exprimant Shp1 de façon constitutive ont été différenciées (Jour 7). Photo
représentative (grossissement 10x) de trois expériences indépendantes au jour 7 de la différenciation adipocytaire.
L’expression constitutive de Shp1 affecte le transport de glucose dans les adipocytes (figure 3.3 A-B). Tel que
démontré précédemment, ayant des cellules peu différenciées, il est normal d’observer des cellules moins
stimulées par l’insuline afin de permettre l’entrée de glucose dans la cellule. Cet effet est en majeur expliqué
par une diminution significative de l’expression de glut4 dans les cellules exprimant de façon constitutive Shp1
(figure 3.3 C). En utilisant un mutant dominant-negative de Shp1 (DN-Shp1), Bergeron et al. ont démontré que
le transport du glucose est augmenté dans les cellules musculaires squelettiques et que l’inhibition de Shp1
augmente l’expression de glut4.
Contrôle Shp1
56
Figure 3.3 Le transport de glucose et les niveaux d’expression de glut4 sont diminués en présence de Shp1 exprimé de façon constitutive dans les cellules 3T3-L1 différenciées.
(A-B) Les cellules 3T3-L1 privées de sérum ont été incubées sans ou avec 10 nM d’insuline pendant 45 min. Le transport
de glucose a été mesuré en l’absence ou en présence d’insuline en utilisant des 3T3-L1 différenciées (jour 7) qui avaient
été infectées par un lentivirus portant Shp1-V5 (Shp1) ou actin-V5 (contrôle). Les données sont exprimées comme la
moyenne de deux expériences indépendantes ± SEM pour n=3 par condition. (C) L’expression de l’ARNm de glut4 a été
mesuré par qPCR dans les 3T3-L1 différenciés (jour 7) ayant une expression constitutive de Shp1 ou non et normalisé aux
niveaux d’ARNm d’Actb. Les données sont exprimées comme la moyenne de trois expériences indépendantes ± SEM pour
n=2 par condition.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
basale insuline (10 nM)
Tra
nspo
rt d
e gl
ucos
e(u
nité
s re
lativ
es p
ar
rapp
ort a
u co
ntôl
e no
n tr
aité
)
Contrôle
Shp1
Jour 7
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
basale insuline (10 nM)
Tra
nspo
rt d
e gl
ucos
e(u
nité
s re
lativ
es p
ar
rapp
ort a
u ba
sale
)
Contrôle
Shp1
Jour 7
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glut4
expr
essi
on m
RN
A(u
nité
s re
lativ
es)
Contrôle
Shp1*
A
B
C
57
Selon les données préliminaires, la cascade de signalisation d’Akt ne semble pas être affectée suite à
l’expression constitutive de Shp1. Par contre, la phosphorylation de GSK3 est légèrement réduite en présence
de Shp1 (données non présentées), ce qui concorde avec les données obtenues en inhibant Shp1 où la
présence de p-GSK-3 était légèrement augmentée.
Les résultats préliminaires obtenus suite à l’expression constitutive de Shp1, sont plus en accord avec notre
hypothèse qu’aux expériences avec les shRNAs pour inactiver Shp1. La surexpression de Shp1, telle
qu’observée in vitro, en utilisant un système cellulaire indépendant, diminue l’activité de PPAR mesurée par
essai luciférase (Xu. et al., 2014). Lorsqu’on exprime Shp1 de façon constitutive dans les cellules 3T3-L1, on
confirme notre hypothèse réduisant considérablement les niveaux protéiques de PPAR, bloquant ainsi la
différenciation adipocytaire. Dans le même ordre d’idées, le transport de glucose, la sensibilité à l’insuline et
l’expression de glut4 sont diminués dans les cellules infectées par Shp1. Ces expériences confirment que Shp1
semble être un régulateur important de l’adipogenèse.
Différentes approches expérimentales auraient pu être utilisées pour améliorer et confirmer les résultats
obtenus. Les avancées récentes dans les technologies pour l’édition du génome, soit CRISPR, permettrait de
faire un knockout (KO) au lieu d’un knockdown (KD) comparativement à l’utilisation de shRNAs. Dans nos
expériences, la quantité restante de Shp1 a peut-être été suffisante pour avoir encore quelques effets. Une autre
technique, par siRNAs, avaient été exploré en début de projet mais elle n’offrait pas des niveaux d’expression
de Shp1 assez bas pour bien distinguer le rôle de cette protéine dans les cellules adipeuses, de plus, étant
donné le temps accordé au processus de différenciation, il était nécessaire de travailler avec un système qui
générait des lignées cellulaires stables. Avec l’utilisation de siRNA, on aurait été obligé d’infecter à nouveau les
cellules à différents temps. Une expérience supplémentaire pourrait confirmer les résultats en réintroduisant
Shp1 dans les cellules infectées par les différents shRNAs, ce qui pourrait éviter les effets non ciblés. Par contre,
il est difficile d’obtenir le même niveau d’expression basal de Shp1 que les cellules non infectées, sachant que
ce dernier varie naturellement au cours de la différenciation. Une autre façon de comprendre le rôle de Shp1 en
cours de différenciation est de créer des lignées cellulaires de 3T3-L1 stables infectées par des shRNAs
spécifiques pour Shp1 exprimés par un promoteur inductible. Il serait alors possible de contrôler l’expression de
Shp1 au cours du temps et déterminer le moment critique de son expression, ce qui confirmerait nos résultats
selon l’importance de Shp1 au début de la différenciation des adipocytes. Dans le même ordre d’idées, en
supprimant complètement l’expression de Shp1 à l’aide de la technologie CRISPR, on serait en mesure de
mieux caractériser son rôle et confirmer les résultats obtenus (Evers et al., 2016). Ce nouveau système en
développement demande toutefois certaines optimisations qui impliqueraient beaucoup plus d’efforts pour
parvenir à générer des cellules 3T3-L1 Shp1 KO. De plus, différents modèles permettent d’étudier le processus
de différenciation des cellules adipeuses. Nous avons utilisé les 3T3-L1, qui est une lignée cellulaire de
58
préadipocyte, mais il est également possible d’utiliser des cellules souches capables de s’engager en adipocytes
(Moreno-Navarrete & Fernández-Real, 2012). Le choix du modèle et le moment de l’infection peut avoir un
impact sur les résultats.
Ce phénotype surprenant obtenu suite à la sous-expression de Shp1, dont l’allure des cellules semblent
inchangée, laisse croire qu’il y a d’autres protéines importantes qui viennent compenser le manque de Shp1.
Les protéines tyrosine phosphatases (PTP) sont des régulateurs critiques de la phosphorylation cellulaire
agissant sur des processus tels que la croissance cellulaire, la différenciation et l'adhésion (Wheeler et al.,
2002). Différents PTP jouent un rôle dans l'adipogenèse, tels que PTP1B et Shp2. La délétion PTP1B spécifique
d'un adipocyte augmente la lipogenèse et la taille des cellules adipocytaires. En outre, ces souris présentent
une diminution de la tolérance au glucose (Owen et al., 2012). D'autre part, Shp2 favorise l'adipogenèse par
inhibition de la MAP kinase p38. L'ablation de Shp2 dans les adipocytes entraîne une mort prématurée, un
manque de graisse blanche, une pression artérielle faible, une érythrocytose compensatoire et une stéatose
hépatique (He et al., 2013). Par contre, une autre étude a montré l’effet contraire, soit la surexpression de Shp2
a inhibé la différenciation terminale des adipocytes, en supprimant la voie de signalisation de STAT3 dans les
cellules 3T3-L1 tandis que son knockdown a augmenté la production de gouttelettes lipidiques. Fait intéressant,
l’expression de Shp2 est diminuée au début de la différenciation lors de l’ajout du cocktail de différenciation (Tao
et al., 2016). Ainsi PTP1B et Shp2 jouent des rôles importants dans les adipocytes. D’ailleurs, tout comme Shp1,
les souris PTP1B KO spécifiques dans le foie présentent une meilleure sensibilité à l’insuline et des profils
lipidiques améliorés (Delibegovic et al., 2009). Ainsi, il est possible que PTP1B ou Shp2 soit en mesure de
compenser l’absence de Shp1 dans les adipocytes. Par exemple, une étude a démontré que PTP1B joue un
rôle dans la régulation de la phosphorylation EGFR et PDGFR, mais que des mécanismes compensatoires,
suggérant l’action d’autres PTP, peuvent aider à réguler l'EGFR et le PDGFR dans les souris PTP1B - / -, ce
qui explique probablement les effets moindres de la suppression de PTP1B (Haj et al., 2003).
Nous avons également observé que la phosphorylation d’Akt est inversement proportionnelle à l’expression de
Shp1. Ces résultats confirment ceux obtenus antérieurement dans les autres tissus cibles de l’insuline, soit le
foie et le muscle (Bergeron et al., 2011; Dubois et al., 2006; Xu et al., 2012). Akt est nécessaire pour induire
l’expression de PPAR pour la différenciation des cellules adipeuses. Des souris invalidées pour Akt1 et Akt2
présentent un déficit de croissance sévère et meurent peu de temps après la naissance (Peng et al., 2003). Par
ailleurs, la perte de Akt1 dans les MEFs résulte en un défaut de la différenciation des adipocytes en régulant
FoxO1 et p27(Kip1) (Yun et al., 2008). Également, un autre groupe de recherche a rapporté que PI3K et Akt
jouent un rôle crucial dans la différenciation adipocytaire. La présence d'inhibiteurs de PI3K bloque
complètement le processus de différenciation (Christoffersen et al., 1998). Le manque d’Akt dans les adipocytes
de souris provoque une lipodystrophie sévère, avec des niveaux diminués d’adipokines circulantes, telles que
59
la leptine, l’adiponectine et la résistine. Ces souris invalidées pour Akt dans les adipocytes accumulent les
triglycérides au niveau du foie et augmentent le volume de ce dernier (Shearin et al., 2016), ce qui peut mener
à des complications, telle que la stéatose hépatique non alcoolique. De plus, étant donné que PPAR est connu
pour être un régulateur clé de l’adipogenèse, la surexpression d’un mutant négatif dominant de PPAR, qui ne
possède pas 16 acides aminés de la partie COOH terminale, empêche la différenciation induite par les
thiazolidinediones (Tamori et al., 2002). Cela a engendré la diminution de la taille des cellules et son contenu
en triglycérides, une augmentation de la lipolyse et une réduction du taux d’absorption des acides gras libres.
Également, une réduction de GLUT4, IR, IRS et C/EBP a été observé tout en réduisant l’absorption de glucose
stimulé par l’insuline (Tamori et al., 2002). Selon notre hypothèse, un KO spécifique de Shp1 dans le tissu
adipeux permettrait une meilleure sensibilité à l’insuline et par le fait même diminuer les complications
métaboliques tel que le diabète de type 2. Le tissu adipeux pourrait mieux gérer le stockage des lipides et éviter
le débordement d’acides gras libres dans la circulation sanguine et l’accumulation de lipides dans des organes
non spécialisés, tel que le foie. L’augmentation de l’expression et de l’activité de PPAR par la régulation de
Shp1 pourrait imiter l’effet des TZD sans les effets secondaires en régulant de façon spécifique l’activité de
PPAR. Par contre, nos résultats dans les cellules 3T3-L1 ont plutôt montré l’effet contraire, soit une diminution
de l’expression et l’activité de PPAR.
Les cellules infectées par différents lentivirus ont généré des populations hétérogènes de cellules différenciées.
Certaines cellules ont accumulé plus de lipides que d’autres. Secco et al. ont décrit l’effet clonal des populations
hétérogènes d’adipocytes suite à la différenciation de cellules isolées. Ils ont démontré que certains clones
présentaient une capacité faible, moyenne ou élevée pour accumuler des lipides (Secco et al., 2017). En utilisant
une population de fibroblastes pour l’infection avec des lentivirus, nous avons voulu éviter cet effet clonal mais
une partie des cellules peut avoir présenté un phénotype différent au début conservant ainsi une capacité
adipogénique différente, ce qui pourrait expliquer en partie les différences entre le shShp1. La technique de tri
cellulaire par cytométrie de flux aurait pu séparer les adipocytes aux fibroblastes non-différenciés et comparer
la population selon les niveaux d’expression de Shp1. Les analyses effectuées avec ses cellules ont considéré
la population dans son ensemble, ce qui a sans doute dilué certains effets engendrés par la variation
d’expression de Shp1.
Les résultats obtenus de la sous-expression et l’expression constitutive de Shp1 dans les cellules 3T3-L1
suggèrent que Shp1 est impliqué dans la signalisation de l’insuline et la régulation de la différenciation des
adipocytes probablement en régulant l’expression et l’activité de PPAR. Shp1 et PPAR sont co-exprimées
lors de la différenciation précoce des cellules 3T3-L1, ce qui implique une co-régulation. Shp1 semble être
impliqué dans plusieurs voies mais les données préliminaires, montrant que l’expression constitutive de Shp1
60
dans les 3T3-L1 bloque totalement la différenciation des adipocytes, indiquent une fonction inhibitrice pour Shp1.
Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour analyser la régulation fine entre Shp1 et PPAR. Est-
ce que PPAR pourrait être un substrat de Shp1 ou est-ce que Shp1 pourrait être un inhibiteur en se liant à
PPAR? D’ailleurs, nous avons observé que l’activité de PPAR mesurée par essai luciférase, dans les cellules
HEK293T transfectées de manière stable avec la surexpression d’un WT-Shp1 ou d’un DN-Shp1, inductible et
co-transfectées avec les plasmides PPRE-luc et PPAR, est diminuée, et ce même en présence de l’agoniste
de PPAR, la rosiglitazone (données non présentées). Le DN-Shp1 contient une mutation dans le site actif, ce
qui inhibe l’activité de Shp1 tout en permettant la liaison à ses substrats et aux protéines phosphorylées sur
tyrosine. Ce résultat suggère que Shp1 pourrait être un répresseur physique au lieu d’agir en tant que
phosphatase. Par contre, il pourrait s’agir d’une interaction plus complexe, puisque le dosage de la luciférase
est un système plutôt artificiel dans les cellules HEK293T. Étant donné que Shp1 est une protéine tyrosine
phosphatase, il est intéressant de se demander si PPAR peut être phosphorylé sur ses résidus de tyrosine.
Pour la première fois, on a observé la phosphorylation sur tyrosine de PPAR endogène grâce à une
immunoprécipitation de PPAR dans les cellules adipeuses 3T3-L1 traitées avec du bpV(HOpic) (20 µM)
pendant 30 minutes, qui est un inhibiteur général des protéines tyrosine phosphatases, en cours de
différenciation (figure 3.4).
Figure 3.4 PPAR endogène peut être phosphorylé sur ses résidus de tyrosine.
Immunoprécipitation (IP) de PPAR dans les cellules 3T3-L1, en utilisant un inhibiteur général des protéines tyrosine
phosphatases, le bpV(Hopic) (20μM) pendant 30 minutes. PPAR et les protéines p-tyrosine ont été détectés par
immunobuvardage (IB). Flèche : Réaction non spécifique de l’anticorps.
- + - + - +
Lysat total
PPAR1
PPAR2
p-tyr
20μM, 30min bpV(HOpic)
IP
PPAR mock IgG
←
61
La phosphorylation de PPAR sur ses divers résidus est une modification post-traductionnelle bien connue. La
phosphorylation sur la sérine 112 par MAPK inhibe son activité transcriptionnelle (Hu et al., 1996) tandis que la
phosphorylation du même site par Cdk7 et Cdk9 augmente l’activité de PPAR (van Beekum et al., 2009). Un
autre site bien connu est la sérine 273, ciblé par Cdk5 (Choi. et al., 2011), Toutefois, de nouvelles études portent
sur la phosphorylation sur tyrosine de PPAR. Parmi ces études, un groupe de recherche a démontré que la
nonreceptor tyrosine kinase Abelson murine leukemia viral oncogene (c-Abl), activée pendant la phase précoce
de la différenciation des préadipocytes 3T3-L1, favorise la différenciation des adipocytes en ciblant PPAR2.
L’activité de la protéine tyrosine kinase c-Abl est essentielle et son inhibition bloque la différenciation des
adipocytes matures. C-Abl contrôle l’expression et l’activité de PPAR en phosphorylant deux résidus de
tyrosine (Y78 et Y102), ce qui augmente la stabilité de PPAR2 (Keshet et al., 2014). Au contraire, la
phosphorylation du résidu Y74 de PPAR par le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) mène
à la dégradation de ce dernier (Xu. et al., 2016). Selon une autre récente étude, la kinase c-Src phosphoryle le
résidu Y78, ce qui supprime l’inflammation et améliore la sensibilité à l’insuline dans les adipocytes. Ce
processus est d’ailleurs inversé par la protéine tyrosine phosphatase PTP-1B (Choi et al., 2015). Dans un
système à l’équilibre, les phosphatases, telles que Shp1, viennent contre balancer les effets des kinases. Il est
important de noter que PPAR est régulé par la phosphorylation sur ses résidus de tyrosine. Ainsi, la découverte
du rôle précis de Shp1 dans ce contexte serait un défi intéressant. Ces résultats suggèrent une nouvelle cible
thérapeutique pour l’obésité et ses complications. Ce contexte in vitro, donne une idée de l’effet de Shp1 au
niveau de l’obésité mais pour avoir une meilleure vue d’ensemble, des études in vivo utilisant un KO spécifique
pour Shp1 dans les adipocytes sont nécessaires.
62
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