rapport cnr 2013 · 2014-06-27 · 1 résumé analytique laboratoire de besançon pseudomonas...

Centre National de Référence de la Résistance aux

Antibiotiques

Rapport d’activité 2013

Pr Patrick Plésiat, CHU de Besançon (Laboratoire coordonnateur “Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii”)

Pr Vincent Cattoir, CHU de Caen (Laboratoire associé “Entérocoques et résistances particulières des bactéries à Gram-positif”)

Pr Richard Bonnet, CHU de Clermont-Ferrand (Laboratoire associé “Entérobactéries : résistance aux céphalosporines de 3-4ème

génération/BLSE et céphalosporinases”)

Pr Patrice Nordmann, Dr Laurent Dortet, CHU de Bicêtre (Laboratoire associé “Entérobactéries : résistance aux carbapénèmes et carbapénèmases”)

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Résumé analytique

Laboratoire de Besançon

Pseudomonas aeruginosa

Le nombre de souches reçues par le CNR est en constante augmentation depuis plusieurs années (+40,6% en 2013 par rapport à 2012). Cette évolution va de pair avec une augmentation du nombre de laboratoires, publics ou privés, sollicitant une expertise (160 laboratoires en 2013, +23,1% par rapport à 2012). Pour pallier la difficulté de détection des mécanismes émergents (BLSE et carbapénèmases) chez P. aeruginosa, le CNR a développé en 2013 un test de criblage des souches productrices de carbapénèmases. Sur une collection de souches caractérisées, le test IC/4000 s'est avéré très performant avec une VPN et une VPP de 100%. Sa fabrication industrielle est à l'étude et un essai multicentrique pour évaluer ses performances est prévu en 2014.

Malgré les difficultés du diagnostic, 40,3% des souches reçues par le CNR en 2013 produisaient une BLSE (17,8%) et/ou une carbapénèmase (22,5%). Ce pourcentage élevé de résultats “positifs” montre que les biologistes sont maintenant sensibilisés au problème des β-lactamases émergentes chez P. aeruginosa et connaissent les principaux phénotypes de résistance associés à ces enzymes. L'absence de gélose cloxacilline 1000 µg/mL dans le commerce explique en partie la non reconnaissance par certains laboratoires de mutants surproduisant la β-lactamase naturelle AmpC ou déficients dans la porine OprD.

L'épidémiologie des BLSE et des carbapénèmases chez P. aeruginosa en France est caractérisée par une grande diversité d'enzymes dont certaines ont une distribution internationale (BLSE : GES-1/-9, PER-1, SHV-2a, VEB-1a ; carbapénèmases GES-2/-5, IMP-1/-9/-13/-15/-19, VIM-1/-2/-4), nationale (BLSE OXA-19, carbapénèmase VIM-30), ou locale (BLSE OXA-28, carbapénèmase IMP-29).

Concernant les BLSE, l'enzyme SHV-2a est devenue aujourd'hui prédominante en France (32% des BLSE identifiées) en raison de la diffusion d'un clone (sérotype O:11) dans de nombreux établissements. Un phénomène similaire a été identifié impliquant un autre clone du même sérotype produisant GES-1 (18,4%) ou son variant carbapénèmase, GES-5. Deux autres BLSE, PER-1 (12,6%) et OXA-19 (17,5%), sont endémiques dans plusieurs établissements du Nord-Est de la France.

Sur le plan des carbapénèmases, l'épidémiologie est largement dominée par des souches différentes exprimant l'enzyme VIM-2 (44,3% ; 50 souches appartenant à 16 clones différents). Toutefois, un clone en expansion (sérotype O:6) co-produisant VIM-2 et la pénicillinase OXA-4 a été mis en évidence à partir de 2011 dans 13 villes différentes. Comme mentionné plus haut, GES-5 (12,4%) tend à devenir plus prévalente en France par le biais d'un clone diffusible (O:11). D'après l'enquête GESPAR publiée en 2013 par le CNR, la prévalence des souches de P. aeruginosa carbapénèmases positives reste encore faible dans notre pays (< 2%) mais la tendance, comme chez les entérobactéries, est à l'augmentation.

Au final, il est nécessaire de surveiller attentivement l'évolution de plusieurs clones épidémiques de P. aeruginosa dont certains pourraient constituer des réservoirs potentiels de carbapénèmases pour les entérobactéries (GES-5, VIM-2).

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Acinetobacter baumannii

L'expertise des souches de A. baumannii a progressé de 10,9% en 2013, par rapport à 2012, la résistance aux carbapénèmes restant le principal motif d'envoi au CNR. Contrairement à P. aeruginosa, la diversité des carbapénèmases produites par A. baumannii en France se résume à un petit nombre d'oxacillinases acquises (OXA-23, OXA-24/40, OXA-58) ou intrinsèques (surexpression de types OXA-51). Par ailleurs, l'épidémiologie nationale est marquée par la très forte prédominance des souches OXA-23 positives (87%) impliquées dans des épisodes épidémiques locaux. Divers gènes dont blaOXA-23, blaPER-7 (codant une carbapénèmase), blaGES-11 (BLSE) et armA (méthylase de l'ARNr16S) sont retrouvés, seuls ou en association, dans des souches génotypiquement différentes ce qui souligne l'importance des échanges génétiques chez cette espèce et l'existence de réservoirs méconnus de gènes de résistance. Par exemple, les gènes blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-58 et blaVEB-7 ont été mis en évidence chez plusieurs A. pittii. L'augmentation constante depuis 2011 du nombre d'établissements contaminés par des A. baumannii résistants à tous les aminosides, exprimant ArmA, suggère l'existence d'une épidémie de gènes en cours.

Dix souches produisant la métallo-β-lactamase NDM-1 et 1 souche exprimant un nouveau variant, NDM-9, ont été isolées dans 9 villes différentes en 2013. En 2012, 3 A. baumannii NDM-1 avaient été identifiés dans 3 villes. L'analyse génotypique de ces isolats a montré qu'ils étaient pour la plupart clonaux (8/10) et correspondaient à des cas d'importation en provenance d'Afrique du Nord, notamment d’Algérie.

Seules quelques souches productrices de BLSE ont été adressées au CNR (SHV-12, CTX-M15, variant GES-7). Le gène codant l'enzyme VEB-1a n'a pas été retrouvé parmi les souches caractérisées par le CNR.

En résumé, plusieurs foyers épidémiques intra-établissements impliquant des souches locales produisant majoritairement l'enzyme OXA-23 ont été identifiés en 2013. La présence de BLSE chez A. baumannii apparaît moins préoccupante. La diffusion du gène armA et l'émergence de souches clonales NDM-1 doivent, toutefois, faire l'objet d'une attention particulière.

Laboratoire de Caen

Le laboratoire du CHU de Caen a poursuivi son travail essentiellement centré sur les entérocoques résistants aux glycopeptides (ERG). En 2013, le laboratoire a reçu 352 souches dont 278 ERG provenant de 43 départements, ce nombre s’étant stabilisé (environ 300 souches reçues par an)depuis 2009. A noter que 48 souches étaient déclarées comme importées de pays étrangers, soulignant l’intérêt des recommandations de dépistage chez les patients rapatriés sanitaires. La grande majorité de ces souches appartenait à l’espèce E. faecium (n = 270 ; 97,1 %), suivie des espèces E. faecalis (n = 6 ; 2,1 %), E. avium (n = 1 ; 0,4 %) et E. raffinosus (n = 1 ; 0,4 %). Laforte proportion des souches ERG appartenant à l’espèce E. faeciumest une constante depuis plusieurs années (de 91,8 à 97,1 % entre 2006 et 2013). Le gène vanA reste majoritaire chez les ERG (n = 208 ; 74,8 %), suivie du gène vanB(n = 69 ; 24,8 %) et vanD (n = 1 ; 0,4 %). Toutes les souches de E. faecium testées étaient résistantes à l’ampicilline, sauf 4 qui n’ont pas provoqué d’épidémies. La résistance de haut niveau à la gentamicine était présente chez 63,5 % des souches, ce chiffre est inférieur à celui de 2012 (76 %) mais reste plus élevé que ceux des années précédentes (45 % en 2011 et autour de 20 % les années précédentes). A noter qu’une souche était résistante au linézolide (CMI >32 mg/L) tandis qu’une autre l’était à la tigécycline (CMI à 0,75 mg/L). Ces deux souches sont les premières décrites en France, et

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ce phénomène devra être étroitement surveillé dans les années à venir. Enfin, aucune souche n’avait des CMI de ladaptomycine >4 mg/L.Par détection spécifique de l’IS16, une grande majorité (258/270 ; 95,6 %) des souches de E. faecium ont pu être catégorisées comme appartenant au complexe clonal CC17, ce qui est en accord avec les études épidémiologiques précédentes. De la même façon, le gène ptsD, potentiellement impliqué dans le pouvoir épidémique des souches hospitalières de E. faecium, a été retrouvé chez de nombreuses souches (244/270, 90,4 %).Le typage moléculaire par rep-PCR (Diversilab, bioMérieux) a permis de mettre en évidence 109 clones différents d’ERG (104 chez E. faecium et 5 chez E. faecalis) dans 51 villes/établissements différents. De nombreux clones correspondaient à des cas sporadiques tandis que dans les établissements où plusieurs clones étaient rapportés, il existait généralement un clone majoritaire responsable des cas groupés. Enfin, quelques clones ont été détectés dans deux établissements/villes différents mettant en évidence une diffusion loco-régionale, phénomène déjà décrit les années précédentes.

Laboratoire de Clermont-Ferrand

Durant l’année 2013, le laboratoire associé de Clermont-Ferrand a reçu 271 souches pour expertise soit une augmentation de ce secteur d’activité de 87% par rapport à 2012. L’essentiel des demandes portait sur l’analyse des mécanismes de résistance aux céphalosporines de 3ème génération (C3G) et l’analyse de la clonalité de souches potentiellement épidémiques. Les données marquantes qui ressortent de ces travaux sont : (i) une fréquence élevée des souches Klebsiella pneumoniae productrices de BLSE de type CTX-M (25,1 % des souches reçues), en particulier CTX-M-15 (68 souches) dont certaines étaient impliquées dans des épidémies locales, et (ii) la diffusion de souches productrices de céphalosporinases plasmidiques, en particulier de type DHA et CMY dans de nombreux centres hospitaliers (56 souches identifiées), avec dans un centre, une épidémie en cours d’étude et impliquant une souche de K. pneumoniae productrice de DHA-1.

Parallèlement à ces expertises, nous avons poursuivi l’étude des 200 souches d’Entérobactéries productrices de BLSE collectées en juin/octobre 2012 avec (i) la finalisation des analyses portant sur les BLSE, (ii) l’analyse des mécanismes de résistance associées aux aminosides et quinolones et (iii) l’étude des plasmides en cause dans la diffusion des BLSE. En parallèle, une collaboration avec le CNR Escherichia coli-Shigella a été initiée afin d’explorer les facteurs de virulence des souches de E. coli isolées dans cette étude. Nous avons également mis en place une collecte de souches d’Entérobactéries multi-résistantes dans 4 Centres Hospitaliers représentatifs d’Outre-Mer (Guadeloupe, Réunion, Guyane et Nouvelle-Calédonie).

Laboratoire de Bicêtre

La diffusion des carbapénèmases chez les entérobactéries revêt actuellement une importance clinique particulière. En effet, ces β-lactamases ont un spectre d'activité très large englobant le plus souvent toutes les β-lactamines, dont les carbapénèmes. Les souches productrices (EPC), principalement des K. pneumoniae et E. coli, sont généralement résistantes aux aminosides et aux fluoroquinolones. Malgré leur diffusion croissante en milieu hospitalier et dans la communauté, leur contrôle reste encore possible notamment à l'hôpital.

L’émergence des EPC fait craindre l’apparition de réelles impasses thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle, un avis du Haut Conseil enSanté Publique a été émis afin d’identifier les patients

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infectés ou colonisés par ces bactéries. Cette détection est d’autant plus importante qu’il n’est pas rare désormais d'identifier chez un même patient des souches appartenant à deux espèces d’entérobactéries différentes et produisant une même carbapénèmase, ce qui souligne le rôle de la flore fécale dans le transfert des gènes de résistance. L’éradication spontanée du portage digestif est lente (parfois plus de 12 mois) et aucun traitement ne permet actuellement de l'améliorer.

Quatre types principaux de carbapénèmases ont été décrits chez les EPC : KPC, NDM, VIM et OXA-48. Les carbapénèmases de type KPC hydrolysent fortement toutes les β-lactamines. Les carbapénèmases de type NDM, VIM, IMP sont des métallo-enzymes dont l'activité hydrolytique inclut toutes les β-lactamines sauf l'aztréonam. Les carbapénèmases de type OXA-48 n'hydrolysent pas, ou peu, les céphalosporines et relativement faiblement les carbapénèmes. Leurs gènes sont le plus souvent (80% des cas) associés à ceux deBLSE de type CTX-M, ce qui explique pourquoi les souches produisant OXA-48 apparaissent le plus souvent résistantes à toutes lesβ-lactamines.

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1. M ISSIONS ET ORGANISATION DU CNR

(Annexes)

2. ACTIVITES D 'EXPERTISE

2.1 Evolution des techniques en 2013

2.1.1. Techniques développées ou en développement

2.1.1.1. Laboratoire de Besançon

� Test IC/4000

L'insensibilité à l’imipénème concerne près de 20 % des souches cliniques de P. aeruginosa isolées en France et s’explique le plus souvent (>90%) par une simple altération de la porine OprD, la voie de passage spécifique des carbapénèmes à travers la membrane externe. Dans ce contexte, il est difficile de définir quelles souches sont éligibles pour la réalisation de tests complémentaires ou de confirmation (biologie moléculaire).

Dans le but de faciliter la détection des souches productrices de carbapénèmase, nous avons mis au point un test basé sur l’utilisation de disques combinés imipénème-cloxacilline (IPM-CLX). La « perte » de la porine OprD n'ayant un impact que lorsque la céphalosporinase naturelle AmpC est produite de façon stable ou après induction, la sensibilité à l’imipénème est normalement restaurée par un inhibiteur tel que la cloxacilline en l’absence de carbapénèmase associée.

Evalué sur une collection de 118 souches IMPI/R (CMI>4mg/L), comprenant 56 souches productrices de carbapénèmase (31 VIM, 16 IMP, 1 NDM, 5 GES et 3 KPC) et 62 non productrices, le test a présenté une sensibilité et une spécificité de 100% (seuil fixé à 5 mm) avec des disques d’imipénème supplémentés par 4000µg de cloxacilline (IC/4000) (Figure 1).

Utilisé systématiquement en routine, le disque IC/4000 permet de suspecter la présence de carbapénèmase le jour même de l’obtention de l’antibiogramme et d'optimiser l'emploi des techniques de biologie moléculaire.

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Figure 1 : Distribution des valeurs ∆d selon la production (barres noires) ou non (barres grises) de carbapénèmase par les souches de P. aeruginosa

Ce travail a fait l’objet d’une publication : Fournier D, P. Garnier, K. Jeannot, A. Mille, AS. Gomez, P. Plésiat. A convenient method to screen for

carbapenemase-producing Pseudomonas aeruginosa.Journal of Clinical Microbiology. 2013. 51:3846-8.

� Plaques CMI/CNR Des microplaques spécialement adaptées aux souches multirésistantes de P. aeruginosa et A. baumannii, incluant des gammes étendues de concentrations et de nouveaux antibiotiques (ceftolozane/tazobactam) ont été conçues en collaboration avec la compagnie Trek-ThermoFisher ainsi que les CNR belge (dir. Youri Glupczynski) et espagnol (dir. Antonio Oliver). Ces plaques standardisées permettront de comparer plus précisément la prévalence des résistances chez ces espèces dans les différents pays européens lors d'études multicentriques.

2.1.1.2. Laboratoire de Caen

Jusqu’à fin 2012, l’identification des entérocoques au niveau de l’espèce était réalisée par biologie moléculaire. Les espèces les plus fréquentes, E. faecalis et E. faecium, étaient identifiées par détection des gènes spécifiques (ddl) codant leurs ligases respectives en utilisant une PCR classique multiplex. Les espèces plus rares étaient identifiées par PCR-séquençage du gène sodA codant la superoxyde dismutase manganèse-dépendante. Depuis début 2013, nous utilisons la spectrométrie de masse MALDI-TOF (instrument disponible au sein du laboratoire hospitalier du CHU) qui est une méthode fiable, rapide et économique pour l’identification de nombreuses espèces bactériennes, y compris celles du genre Enterococcus. Pour les très rares cas où l’identification n’est pas possible phénotypiquement, le séquençage du gène sodA est toujours réalisé.

De la même façon, la détection des principaux gènes de résistance aux glycopeptides (i.e. vanA, vanB, vanC et vanD) était faite par PCR classique multiplex tandis que les gènes exceptionnels (i.e. vanE, vanG, vanL, vanM et vanN) étaient recherchés par PCR classique simplex. Dans un souci d’uniformité et de rapidité, nous avons développé deux techniques de PCR en temps réel triplex pour les gènes les plus fréquents et une PCR classique multiplex pour les gènes exceptionnels. Dans la 1ère PCR en temps réel triplex, les gènes vanA et vanB peuvent être détectés ainsi que la séquence d’insertion IS16. Dans la 2ème PCR en temps réel triplex, les gènes moins fréquents vanD, vanC1 et vanC2/C3 sont recherchés. La PCR classique multiplex permet l’identification des gènes exceptionnels suivants :

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vanE, vanG, vanL, vanM et vanN. A noter que ces 3 techniques sont réalisées dans le laboratoire de manière séquentielle.

Pour le typage moléculaire et la comparaison des différents clones d’entérocoques résistants aux glycopeptides (ERG), deux techniques étaient classiquement utilisées au laboratoire : l’électrophorèse en champ pulsé (ECP) et la MLST (« MultiLocus Sequence Typing »). Ces deux techniques étant assez « lourdes », nous avons décidé de développer deux approches alternatives. Depuis le début 2013, la technique d’ECP a été remplacée par la technique « repetitive extragenic palindromic-PCR« (rep-PCR) à l’aide du système Diversilab de chez bioMérieux. Par rapport à l’ECP,cette technique présente notamment l’avantage d’être plus rapide et plus reproductible (notamment grâce à l’extraction automatisée de l’ADN sur le système EasyMag NucliSens, bioMérieux) et permet de comparer les profils de souches obtenus dans différentes séries (ce qui évite de repasser plusieurs fois la souche). La technique de MLST permet de définir un « Sequence Type » (ST) et de déduire l’appartenance à un complexe clonal (CC), notamment le CC17 qui comprend les souches de E. faecium adaptées à l’environnement hospitalier et multi-résistantes aux antibiotiques (ERG). Ces souches CC17 présentent une résistance de haut niveau aux pénicillines et aux fluoroquinolones tandis que la majorité d’entre elles possèdent un îlot de pathogénicité portant les gènes de virulence esp et hylEfm codant respectivement pour une protéine impliquée dans la formation de biofilm et pour une hyaluronidase. De plus, les souches CC17 présentent une séquence d’insertion spécifique appelée IS16. Depuis le début 2013, nous détectons la présence de cette IS16 par PCR en temps réel (voir ci-dessus), ce qui permet de rapidement déterminer l’appartenance ou non au CC17. Au sein des souches CC17, il existe des souches non ou peu épidémiogènes (cas sporadiques) et d’autres épidémiogènes (épidémies locales ou régionales). Il a été démontré que ces souches « plus »épidémiogènes possédaient un locus spécifique (portant le gène ptsD). Depuis début 2013, nous détectons le gène ptsD pour toutes les souches d’ERG appartenant à l’espèce E. faecium par PCR classique.

Concernant la détection des résistances particulières chez les bactéries à Gram positif (notamment celles aux macrolides-lincosamides-streptogramines, MLS), de nouvelles techniques de PCR ont aussi été développées. Les gènes de résistance aux MLS les plus courants chez les staphylocoques [i.e. erm(A), erm(C) et msr(A)] et les streptocoques-entérocoques [i.e. erm(B), erm(A) sous-classe erm(TR) et mef(A)] peuvent désormais être détectés par PCR en temps réel triplex. Les autres gènes (erm plus rares, lnu, lsa, vat, vga, vgb et cfr) sont recherchés par différentes approches de PCR classique multiplex.

2.1.1.3. Laboratoire de Clermont-Ferrand

Les techniques développées en 2013 sont les suivantes :

� Technique de typage moléculaire à moyen débit par REP-PCR et électrophorèse capillaire (Diversilab) permettant de réaliser une base de données normalisée et accessible en ligne pour les souches envoyées au CNR. La même technologie a été mise en place dans le laboratoire du Dr J.Y. Madec à l’ANSES pour les souches bactériennes résistantes issues du milieu vétérinaire. Cet outil permettra une comparaison inter-laboratoirespour croiser les données issues des milieux médical et vétérinaire.

� Technique de dépistage des souches productrices de AAC(6’)Ib-cr (enzyme bi-fonctionnelle responsable d’une résistance plasmidique croisée aux aminosides et fluoroquinolones) par étude de l’acétylation de la norfloxacine par spectrométrie de masse.

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� Technique de détection des souches productrices de carbapénèmase par mesure de l’hydrolyse de l’ertapénème par spectrométrie de masse (MALDI-TOF).

� Criblage phénotypique et moléculaire systématique des méthylases de l'ARNr 16S, un mécanisme de résistance émergent chez les entérbactéries affectant l’activité de tous les aminosides utilisés en thérapeutique humaine.

2.1.1.4. Laboratoire de Bicêtre

Le laboratoire associé de Bicêtre a développé et diversifié en 2013 les applications d'un nouveau test, le Carba NP test, permettant de détecter par méthode enzymatique la production de carbapénèmase chez les entérobactéries de sensibilité diminuée aux carbapénèmes.

Ce test constitue une aide précieuse pour décider de l'isolement précoce des patients infectés/colonisés par des EPC et pour adapter la thérapeutique antibiotique. Seule une réponse rapide, au mieux dans les 2 h après réception de la souche (si elle a été ré-isolée auparavant sur un milieu gélosé) a un impact clinique réel.

2.1.2. Travaux d'évaluation des techniques, réactifs et trousses


� Evaluation de techniques

Sur un panel de 112 souches insensibles à l’imipénème (CMI>4 mg/L), nous avons comparé les performances de 6 tests commercialisés ou non destinés à détecter les souches productrices de carbapénèmase ou plus spécifiquement de métallo-béta-lactamase (MBL). La collection était composée de 52 souches carbapénèmase positives : GES (n=4, 3 variants), KPC-2 (n=2), IMP (n=14, 8 variants), NDM-1 (n=1), SPM-1 (n=1) et VIM (n=30, 7 variants).

Les tests suivants ont été évalués : 1. test de synergie méropénème / acide dipicolinique (Rosco); 2. test de synergie imipénème / acide dipicolinique (Rosco) ; 3.disques combinés imipénème +/- EDTA (Rosco) ; 4. disques combinés méropénème +/- acide dipicolinique (Rosco) ; 5. E-test MBL (Biomérieux) ; 6.Carba NP test (Pr P. Nordmann, Bicêtre)

Résultats : La sensibilité de détection des MBL était >97% pour tous les tests, à l’exception des disques combinés imipénème +/- EDTA (Rosco). Le Carba NP test a permis la détection de toutes les souches productrices de MBL et KPC mais n'a détecté aucune carbapénèmase de type GES. En termes de spécificité, le E-testMBL et le Carba NP test ont présenté les meilleurs résultats, aucun faux positif n’ayantété constaté. Les disques combinés méropénème +/- acide dipicolinique ont également présenté une spécificité de 100% mais après modification des règles d'interprétation (nous préconisons de confronter la valeur retrouvée pour le disque combiné méropénème/acide dipicolinique à celle du disque méropénème/cloxacilline, présent dans le même kit de détection ; une différence ≥ 5 mm étant en faveur d'une MBL).

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Tableau 1 : Performances des tests de détection des carbapénèmases chez P. aeruginosa

DDST MEM- MPA

DDST IPM-DPA

CD IPM/ IPM+EDTA

CD MEM/ MEM+DPA

Etest MBL

NP- Carba

Sensibilité (%) 100 97.8 84.8 97.8 97.8 92.3b

Spécificité (%) 92.4 92.4 92.4 77.3 (100a) 100 100 aaprès modification des régles d’interprétation ; b Evalué sur l’ensemble des souches productrices de carbapénèmase


En 2013, le laboratoire a été sollicité par la société Bio-Rad pour l’évaluation d’un nouveau milieu de culture sélectif pour les ERG. Dans cette étude, ce nouveau milieu a été comparé aux autres milieux commercialisés. Différents critères d’évaluation ont été étudiés : aspect et qualité de la culture, sensibilité, pourcentage de perte et sélectivité.


Le Carba NP test mis au point dans l'Unité INSERM associée au CNR a été validé de façon prospective sur plus de 4000 souches.

2.1.3. Techniques transférées vers d'autres laboratoires


Des protocoles expérimentaux et des souches de référence ont été transférés à divers correspondants : CH Tizi-Ousou, Algérie (Amina Azzam), CH Toulon (Frédéric Janvier), CHU Bichat (Laurence Armand-Lefèvre), CHU Rouen (Sophie Boyer).

Par ailleurs, plusieurs fiches techniques ont été mises à la disposition de l'ensemble des laboratoires sur le site web du CNR (CMI colistine, technique des disques rapprochés).


Les nouvelles techniques développées dans le laboratoire, notamment celle pour la détection des gènes vanA et vanB par PCR en temps réel, ont intéressé certains laboratoires hospitaliers. Ainsi, les séquences des amorces et sondes ainsi que le mode opératoire ont été fournis aux services demandeurs (ex. CH Pontoise).


Une méthodologie simple et rapide de typage des Entérobactéries par PCR a été communiquée au laboratoire de Bactériologie du CHU de Limoges

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Le protocole du Carba NP test a été postésur le site web du CNR ce quia permis sa diffusion à de nombreux laboratoires, nationaux et étrangers.

2.2 Activités d'expertise en 2013

2.2.1. Nombre et origine des souches reçues pour expertise


� Bilan P. aeruginosa et apparentés

Cinq cent quatre-vingt-quinze souches (n=595)appartenant au genrePseudomonas ont été analysées par le CNR en 2013 dont568P. aeruginosa(95.5%), 23 P. putida, 1 P. fluorescens, 1 P. mendocina, 2 Pseudomonas spp.Une augmentation de 42% du nombre de souches adressées au CNR a été constatée en 2013, par rapport à 2012. On constate une répartition homogène des laboratoires demandeurs au niveau national.

Figure 2 : Nombre de souches de Pseudomonas spp. adressées au CNR par année (période 2006-2013)

634 40

170 179

387404

568

0

100

200

300

400

500

600

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

P. aeruginosa

P. putida

Autres Pseudomonas

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Figure 3 : Origine géographique des souches de Pseudomonas en 2013

Figure 4 : Distribution (%) des sérotypes en 2013

Le sérotype de 378 souches deP. aeruginosa (66.5 % des souches) a pu être déterminé (réactifs BioRad). Le sérotypage n’a pas été pas contributif pour près d’un tiers des isolats (souches non-agglutinables ou poly-agglutinables). La forte prédominance des sérotypes O:4, O:6, O:11 et O:12 est conforme aux années antérieures.

� Bilan A. baumannii et apparentés

Deux cent soixante-douze (n=272) souches de Acinetobacterspp. ont été reçues par le CNR en 2013 dont 255A. baumannii(93.7%) et 13 A. pittii. Ce nombre a augmenté de 14% par rapport à l’année 2012.

Figure 5 : Nombre de souches de Acinetobacterreçues par le CNR (période 2012-2013)

3,7 0,3 1,1

15,9

0,5

17,2

0,3 0,3

46,8

11,61,6 0,8

01020304050

O:1

O:2

O:3

O:4

O:5

O:6

O:9

O:1

0

O:1

1

O:1

2

O:1

5

O:1

6

233

1 4

255

13 40

100

200

300

Acinetobacter baumannii Acinetobacter pittii Autres Acinetobacter

2012

2013

Nb. souches

Figure 6 : Origine géographique des souches de

� Autres bacilles à Gram négatif

Dix-huit (n=18) souches n’appartenant pas aux genres adressées (Stenotrophomonasmaltophilia


Comme l'indique la Figure 7ci-dessous, le nombre deCaen s’est stabilisé depuis 2009, avec une moyenne d2013. En 2013, le laboratoire a reçu 352 souches dont 297 3 E. gallinarum, 1 E. avium, 1 E.

Figure 7 : Nombre de souches reçues par année de 2006 à 2013

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

2006 2007 2008

Nb. souches

Origine géographique des souches de A. baumannien 2013

Gram négatif non fermentants

=18) souches n’appartenant pas aux genres Pseudomonas et AcinetobacterStenotrophomonasmaltophilia, Achromobacter spp., entérobactéries…).


dessous, le nombre de souches reçues et analysées par le laboratoire deCaen s’est stabilisé depuis 2009, avec une moyenne d’environ 300 souches par an sur la période 20092013. En 2013, le laboratoire a reçu 352 souches dont 297 E. faecium

. casseliflavus, 1 E. raffinosus et 21 autres espèces.

Nombre de souches reçues par année de 2006 à 2013

2008 2009 2010 2011 2012 2013

Autres

E. raffinosus

E. hirae

E. gallinarum

E. faecium

E. faecalis

E. durans

E. casseliflavus

E. avium

12

en 2013

Acinetobacternous ont été entérobactéries…).

souches reçues et analysées par le laboratoire de 300 souches par an sur la période 2009-

faeciumet 28 E. faecalis, et 21 autres espèces.

Nombre de souches reçues par année de 2006 à 2013

Autres

E. raffinosus

E. hirae

E. gallinarum

E. faecium

E. faecalis

E. durans

E. casseliflavus

E. avium

Les souches étaientréceptionnéesmois.

Figure 8 : Nombre de souches reçues mensuellement en 2013

La carte ci-dessous montre la localisation géographique des laboratoires qui se sont adressés au CNR pour des demandes d'expertise en 2013.

Figure 9 : Origine

2.2.1.3. Laboratoire de Clermont

Au cours de l’année 2013, nous avons reçu pour expertise 271 sopar rapport à 2012. Ces souches provenaient de 51 laboratoires différprivés) contre 44 en 2012 (11 CHU, 24 CH et 9 CHU, 22,1% de CH (22,1% des souches) et 11,5% de Lpar les CH et les LBM privés a étéaugmentation du nombre de souches l’ensemble des régions de la métropole et de DOM

0

10

20

30

40

50

60

Nb. souches

étaientréceptionnées tout au long de l’année, avec une moyenne d’environ 30 souches par

Nombre de souches reçues mensuellement en 2013

montre la localisation géographique des laboratoires qui se sont adressés au CNR e en 2013.

Origine géographique des souches reçues au CNR en 2013


Au cours de l’année 2013, nous avons reçu pour expertise 271 souches, soit une augmentation par rapport à 2012. Ces souches provenaient de 51 laboratoires différents (19 CHU, 21 CH et 11 privés) contre 44 en 2012 (11 CHU, 24 CH et 9 LBM privés). 66,4% des souches provenaient de

2,1% des souches) et 11,5% de LBM privés. Le nombre de souches envoyées privés a été peu modifié par rapport à 2012, mais nous avons observé une forte

augmentation du nombre de souches provenant de CHU (+391%). Les souches provenaient de l’ensemble des régions de la métropole et de DOM-TOM.

13

tout au long de l’année, avec une moyenne d’environ 30 souches par

montre la localisation géographique des laboratoires qui se sont adressés au CNR

géographique des souches reçues au CNR en 2013

uches, soit une augmentation de 87% ents (19 CHU, 21 CH et 11 LBM

privés). 66,4% des souches provenaient de . Le nombre de souches envoyées

nous avons observé une forte CHU (+391%). Les souches provenaient de

Figure 10 : Origine géographique (A) et types de

Les demandes portaient essentiellement sur l’analyse du phénotype de résistance aux (~70% des demandes d’expertise), ce qui montre un bproduites par ces souches ont été caractérisées, en particulier les gènes codant les céphalosporinases plasmidiques. Le deuxième motif ayant donné lieu à une demande d’expertise est la recherche d’une clonalité au sein d’isolats bactériens susceptibles d’être impliqués dans une épidémie (~28% des demandes d’expertise). Ainsi, 72 souches ont fait l’objet d’un typage moléculaire dans un contexte épidémique putatif. Quelques demandes ont porté sur la résistance aux quinolones (~2% des demandes d’expertise).


Durant l'année 2013, 2259 souches provenant de l'ensemble du territoire métropolitain et de l'Outremer ont été analysées pour recherche de carbapénèmasepourcentage de souches reçues carbapénèmes isolées en France. trois régions ont envoyé un nombre

A

B

géographique (A) et types de laboratoires demandeurs (B) des souchesCNR pour expertise

Les demandes portaient essentiellement sur l’analyse du phénotype de résistance aux (~70% des demandes d’expertise), ce qui montre un besoin certain dans ce domaine. Les produites par ces souches ont été caractérisées, en particulier les gènes codant les céphalosporinases plasmidiques. Le deuxième motif ayant donné lieu à une demande d’expertise est la

’une clonalité au sein d’isolats bactériens susceptibles d’être impliqués dans une épidémie (~28% des demandes d’expertise). Ainsi, 72 souches ont fait l’objet d’un typage moléculaire dans un contexte épidémique putatif. Quelques demandes ont porté sur la recherche de gènes plasmidiques de résistance aux quinolones (~2% des demandes d’expertise).


Durant l'année 2013, 2259 souches provenant de l'ensemble du territoire métropolitain et de l'Outreont été analysées pour recherche de carbapénèmase. Il est difficile d'estimer quel est le

par rapport à l’ensemble des souches de sensibilité diminuée aux . A noter, 16 départements n'ont adressé aucune souche. A l’opposé,

envoyé un nombre important de souches au CNR : Ile de France,

14

des souches envoyées au

Les demandes portaient essentiellement sur l’analyse du phénotype de résistance aux β-lactamines esoin certain dans ce domaine. Les β-lactamases

produites par ces souches ont été caractérisées, en particulier les gènes codant les BLSE et les céphalosporinases plasmidiques. Le deuxième motif ayant donné lieu à une demande d’expertise est la

’une clonalité au sein d’isolats bactériens susceptibles d’être impliqués dans une épidémie (~28% des demandes d’expertise). Ainsi, 72 souches ont fait l’objet d’un typage moléculaire dans un

recherche de gènes plasmidiques de

Durant l'année 2013, 2259 souches provenant de l'ensemble du territoire métropolitain et de l'Outre-. Il est difficile d'estimer quel est le

à l’ensemble des souches de sensibilité diminuée aux aucune souche. A l’opposé,

Ile de France, PACA et Nord-Pas

de Calais. Il s'agit de trois régions où les transferts inter-hospitaliers de patients sont bien connus.

Le nombre desexpertises a augmentésouches en 2012).

Figure 11 :

Figure 12 : Origine géographique des souches adressées au CNR Bicêtre en 2013

de Calais. Il s'agit de trois régions à forte densité de population où des épidémies ont été identifiées et hospitaliers de patients sont bien connus.

augmenté de 75,5 % par rapport à 2012 (2256 souches en 2013 versus 1285

: Nombre de souches reçues – CNR Bicêtre – 2013

Origine géographique des souches adressées au CNR Bicêtre en 2013

15

forte densité de population où des épidémies ont été identifiées et

de 75,5 % par rapport à 2012 (2256 souches en 2013 versus 1285

Origine géographique des souches adressées au CNR Bicêtre en 2013

16

2.2.2. Prévalence de la résistance aux agents anti-infectieux

Non applicable

2.2.3. Nombre de souches distribuées


Plusieurs souches ont été fournies par le CNR pour des contrôles de qualité nationaux ANSEM (A. baumannii) ou des contrôles de qualité interne (CH Toulon, CHU Bichat, CHU Rouen).


Nous avons été sollicités par une dizaine de laboratoires, principalement hospitaliers, pour fournir des souches afin de réaliser des contrôles de qualité internes ou des témoins positifs dans le cadre de la mise en place de techniques moléculaires de dépistage. Ainsi, 10 souches productrices de carbapénèmase et 5 souches productrices de BLSE ont été distribuées.

17

3. ACTIVITES DE SURVEILLANCE

3.1 Surveillance de l'évolution des mécanismes de résistance

3.1.1. Laboratoire de Besançon

� Pseudomonas aeruginosa : données générales

La proportion des souches productrices de BLSE (classes A et D) et/ou de carbapénèmase parmi l'ensemble des souches analysées par le CNR est indiquée ci-dessous, par année. Une augmentation régulière du pourcentage des souches carbapénèmase positives est observée depuis 2010 (2,5 fois), concomitanted'une baisse du pourcentage de souches BLSE positives.

Figure 13 : Pourcentage de Pseudomonasproducteurs de BLSE et/ou de carbapénèmase

Figure 14 : Distribution par variant des souches de P. aeruginosaproductrices de BLSE en 2013

38,8

34,236,5

38,0 40,3

9,4 9,216,9

19,522,5

29,4

25,0

19,6

18,517,8

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

2009 2010 2011 2012 2013

Total Carbapénèmases/BLSE (%)

Carbapénèmases (%)

BLSE (%)

19

4

13

33

6

1

18

4 31 1

0

5

10

15

20

25

30

35

No

mb

re d

e so

uche

s

Au niveau national, les enzymes SHVchezP. aeruginosaen 2013. Parmi les 6 souches VEBCalédonie). Les 4 souches OXA-

Figure 15 : Distribution par variant 2006-2013. Les variants présents chez moins de 3 souches ne sont pas indiqués

Apparues en 2009, les souches productrices de SHVtandis que les souches endémiques OXAcelui des années antérieures.

Sur les 432 P. aeruginosa(76%) % se sont avérés producteurs demutants d'imperméabilité (OprD-

Figure 16 : Mécanismes de résistance

0 20

74%

es enzymes SHV-2a, GES-1, OXA-19 et PER-1 ont étéles BLSE Parmi les 6 souches VEB-1a, 3 venaient des TOM (La Réunion, Nouvelle

-28 étaient issues d'un même établissement.

par variant des souches de P. aeruginosaproductrices de BLSE Les variants présents chez moins de 3 souches ne sont pas indiqués

Apparues en 2009, les souches productrices de SHV-2a et GES-1 ont augmenté en nombretandis que les souches endémiques OXA-19 et PER-1 se sont maintenues à un niveau comparable à

de sensibilité diminuée à l’imipénème (dIPM<22mm, CMI>4mg/L)e carbapénèmase de classe A (GES) ou B (IMP et VIM)-).

de résistance des souches de P. aeruginosade sensibilité diminuée à l'imipénème (I/R)

40 60 80

Nombre cumulé de souches

3% 7%

16% GES

IMP

VIM

OprD

18

les BLSE prédominantes 1a, 3 venaient des TOM (La Réunion, Nouvelle

BLSE sur la période Les variants présents chez moins de 3 souches ne sont pas indiqués.

ont augmenté en nombre en 2013, s à un niveau comparable à

<22mm, CMI>4mg/L), 26 classe A (GES) ou B (IMP et VIM) et 74 % des

de sensibilité diminuée à l'imipénème

100

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

2013

GES

IMP

VIM

OprD

19

Figure 17 : Distribution par variant des souches de P. aeruginosa productrices de carbapénèmase en 2013

Les β-lactamases VIM-2, VIM-4 et GES-5 ont été les carbapénèmases les plus prévalentes chez P. aeruginosa en 2013 au niveau national. Les IMP-19 et IMP-29 ont été retrouvées dans un seul établissement. Les souches VIM-2 et VIM-4 ont progressé en 2013 par rapport aux années précédentes, les autres restants très minoritaires ou localisées à un établissement.

Figure 18 : Distribution par variant des souches productrices de carbapénèmase sur la période 2006-2013

Sur les 364 P. aeruginosane produisant, ni carbapénèmase, ni BLSE, 325 (89.3%) étaient des mutants déréprimés AmpCet/ou des mutants d'imperméabilité OprD-.

1

14

1 26

16

3 1 2

50

2

15

0

10

20

30

40

50

60

No

mb

re d

e so

uche

s

0 20 40 60 80 100 120 140

GES-2GES-5

GES-14IMP-1IMP-5IMP-9

IMP-10IMP-12IMP-13IMP-15IMP-18IMP-19IMP-29IMP-39NDM-1VIM-1VIM-2VIM-4VIM-5VIM-6

VIM-11VIM-28VIM-30

Nombre cumulé de souches

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

2013

20

Figure 19 : Mécanismes de résistance des souches BLSE et carbapénèmases négatives en 2013

� Persistance de P. aeruginosa GES-9

Depuis 2006, 19 souches de sérotype O:15, productrices de BLSE GES-9, ont été adressées au CNR. Ces souches étaient issues de la région Ile-de-France (n=14) et de l’île de La Réunion (n=4). L’analyse génotypique par MLVA a montré qu'elles appartenaient toutes à un même clone de Sequence Type ST357, encore peu répandu pour l'instant mais persistant.

Figure 20 : P. aeruginosa GES-9 positifs reçus par la CNR sur la période 2006-2013

� Diffusion de P. aeruginosa SHV-2a

Dans le rapport d'activité de 2011, nous avions rapporté l'existence d'une épidémie impliquant des souches clonales de P. aeruginosa O:11productrices de SHV-2a (BLSE). Ces souches provenaient de patients hospitalisés dans 14 hôpitaux français. Cette épidémie s'est poursuivie au cours de l'année 2012 puisque 23 nouvelles souches ont été isolées dans 9 hôpitaux dont 5 nouveaux (Figure 21A). Comme l'indique la Figure 21B, l'épidémie a persistéen 2013 avec 33 nouvelles souches provenant de 14 hôpitaux dont 7 nouveaux. Le Nord de la France a été plus particulièrement touché par cette

188

4031 26

18 12 10 9 6 2 2 1 117

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

No

mb

re d

e so

uche

s

2 21

7

43

0

2

4

6

8

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

No

mb

re d

e so

uche

s

épidémie. Toutefois, le phénotype de résistance des souches SHVd'une BLSE, fait craindre une diffusion plus gran

Figure 21 : Origine géographique des

� Diffusion de P. aeruginosaGES

Le nombre de P. aeruginosa GESUne majorité de ces souches provient de l'

Figure 22 : Nombre de

Leur analyse par MLVA a montré qu’elles appartenaient toutes, sauf une, à un sérotype O:11 et ST235. Pour mémoiredifférent que par 1 seul acide aminé. En l’absence de mécanismesouches GES-1 positives présententet modéré au céfépime (CMI=24ceftazidime (CMI=8µg/mL) et méropénème (CMI >128µg/mL)OprD-. Toutes les souches analysées gènes cassettesaacA4 et aphA1en aval

Nb. souches

A

le phénotype de résistance des souches SHV-2a, peu évocateur de la production d'une BLSE, fait craindre une diffusion plus grande du clone en métropole.

Origine géographique desP. aeruginosaSHV-2a selon la période 2006-2012

GES-1 ou GES-5.

GES-1et GES-5reçus par le CNR augmente régulièrementde ces souches provient de l'Ile-de-France (22%) et du Languedoc-Roussillon (51

Nombre de P. aeruginosa GES-1 et GES-5 sur la période 2006

a montré qu’elles appartenaient toutes, sauf une, à un seul et mémoire, les enzymes GES-1 (BLSE) et GES-5 (carbapénèmase) ne

différent que par 1 seul acide aminé. En l’absence de mécanisme(s) de résistance associé(s), les présentent un niveau de résistance élevé à la ceftazidime (CMI>128µ

et modéré au céfépime (CMI=24µg/mL). En revanche, les souches GES-5 positives au céfépime (CMI=6µg/mL) mais résistantes à l'imipénème et au

L), ce qui peut les faire confondre avec des mutants d'imperméabilité analysées étaient résistantes aux aminosides en raison de l

en aval du gène blaGESdans un intégron de classe 1.

Nb. souches

B

21

2a, peu évocateur de la production

2012 (A) ou 2013 (B)

s par le CNR augmente régulièrement depuis 2009. Roussillon (51%).

2006-2013

seul et même clone de 5 (carbapénèmase) ne

(s) de résistance associé(s), les élevé à la ceftazidime (CMI>128µg/mL)

5 positives sont sensibles à la L) mais résistantes à l'imipénème et au

, ce qui peut les faire confondre avec des mutants d'imperméabilité en raison de la présence des

.



� Pseudomonas aeruginosa VIM

La métallo-β-lactamase VIM-2 est la carbapénèmase la plus répandue chez C'est aussi la plus prévalente en France. depuis diffusé dans de nombreuses souchesapparentées. Ainsi, les 50 souches analyséessérotypes différents : O:1, O:2, O:4, O:5, O:6, O:11, O:12, O:15. L'analyse par MLVA de ces isolats a révélé leur grande diversité génotypiquesérotype O:6 co-exprimant VIM-

Nb. souches

Nb. souches

Origine géographique des P. aeruginosa GES-5/GES-1 sur la période 2009

Origine géographique des 33 P. aeruginosa GES-5/GES-1

seudomonas aeruginosa VIM-2 et VIM-2/OXA-4

2 est la carbapénèmase la plus répandue chez P. aeruginosaC'est aussi la plus prévalente en France. Détectée pour la première fois à Marseille en 1995, s

diffusé dans de nombreuses souches de P. aeruginosa différentes et plusieurs espèces apparentées. Ainsi, les 50 souches analysées par le CNR en 2013 se répartissaient dans au moins 8 sérotypes différents : O:1, O:2, O:4, O:5, O:6, O:11, O:12, O:15. L'analyse par MLVA de ces isolats a

grande diversité génotypique (16 clones différents), à l'exception d-2 et OXA-4 (pénicillinase).

Nb. souches

22

sur la période 2009-2013

en 2013

aeruginosa en Europe. Détectée pour la première fois à Marseille en 1995, son gène a

et plusieurs espèces r le CNR en 2013 se répartissaient dans au moins 8

sérotypes différents : O:1, O:2, O:4, O:5, O:6, O:11, O:12, O:15. L'analyse par MLVA de ces isolats a , à l'exception d'un clone (n=14) de




Nb. souches

Nb. souches

Nb. souches

Origine géographique des Pseudomonas spp. VIM-2 en 2013

Origine géographique des Pseudomonas spp. VIM-2 sur la période 2006

Origine géographique des P. aeruginosa VIM-2/OXA- 4 sur la période 201123

en 2013

sur la période 2006-2013

4 sur la période 2011-2013

24

� P. aeruginosa IMP-13 et IMP-15

Les souches produisant les métallo-β-lactamases IMP-13 et IMP-15 ont en commun (i) d'être faiblement résistantes à l'imipénème (sauf déficit associé dans la porine OprD-), (ii ) de diffuser à bas bruit dans la région Centre (IMP-13) et la région PACA (IMP-15).

Figure 28 : Antibiogrammes de souches IMP-13 et d’IMP-15 positives

Figure 29 : Nombre de P. aeruginosa IMP-13 et IMP-15 sur la période 2006-2013

IMP-13. Les rapports d’activité 2011 et 2012 mentionnaient la propagation de souches productrices d’IMP-13 dans les régions Centre et Ile-de-France. Ces souches étaient clonales et appartenaient au ST621 (sérotype O:4) circulant actuellement en Europe et en Amérique du Sud. En 2013, 2 isolats seulementde ce même clone ont été reçus par le CNR, en provenance de 2 établissements d’Eure-et-Loire. La diffusion du clone semble donc maîtrisée.

IMP-13 IMP-15

PIP CXT

TIC MEMTCC CAZ

IPM ATM

FEP PPT PIP CXT

TIC MEMTCC CAZ

IPM ATM

FEP PPT

0

2

4

6

8

10

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

IMP-13

IMP-15


IMP-15. En 2013, 6 nouvelles souches productrices d’IMPsouches qui appartiennent à un même clone (sérotype O:62012, de deux départementsvoisin


� Epidémie àP. aeruginosa IMP

Lors du précédent rapport d'activité (2012), nous avions rapporté deux épidémies simultanées de souches de P. aeruginosa produd'hématologie du CHU de Besançon. En effet, entre novembre 2009 et décemété infectés ou colonisés par des souches IMPdes chocs septiques et 4 sont décédésnouveau isolées chez des patients choc septique, l'un avec une souche IMPétaient uniquement colonisés au niveau digestif (selles). La localisation des patients au m

Nb. souches

Nb. souches

Origine géographique des P. aeruginosaIMP- 13 sur la période

En 2013, 6 nouvelles souches productrices d’IMP-15 ont été analysées par le CNR. Ces t à un même clone (sérotype O:6 ; ST233) provenaient, comme en 2011 et

voisins (Var et Bouches-du-Rhône).

Origine géographique des P. aeruginosaIMP- 15 sur la période

IMP-19 et IMP-29 en hématologie adulte

Lors du précédent rapport d'activité (2012), nous avions rapporté deux épidémies simultanées produisant les carbapénèmases IMP-19 et IMP

U de Besançon. En effet, entre novembre 2009 et décembre 2012, 15été infectés ou colonisés par des souches IMP-29 (n=10) ou IMP-19 positives (ndes chocs septiques et 4 sont décédés. En 2013, 7 souches IMP-19 et 3 souches IMP

atients hospitalisés en hématologie. Deux patients sont décédés suite à un l'un avec une souche IMP-29 et l'autre avec une souche IMP-19. Les autres patients

uniquement colonisés au niveau digestif (selles). La localisation des patients au m

25


15 ont été analysées par le CNR. Ces ST233) provenaient, comme en 2011 et


Lors du précédent rapport d'activité (2012), nous avions rapporté deux épidémies simultanées 19 et IMP-29 dans le service

bre 2012, 15 patients ont n=5), dont 5 ont subi

19 et 3 souches IMP-29 ont été à gie. Deux patients sont décédés suite à un

19. Les autres patients uniquement colonisés au niveau digestif (selles). La localisation des patients au moment de

l’isolement des souches a permis d'identifier deux chambres individuelles susceptibles d'être contaminées. Plusieurs prélèvements de l'environnement de ces deux chambres et des surfaces inertes du service se sont avérés positifs à la toilette du patient…). Le génotypage par électrophorèse en champ pulsé des souches environnementales et cliniques a confirmé l'existence B/IMP-29). Une évaluation des pratiques et des risques a été réalisée par le service d'hygiène hospitalière afin de mettre en place les mesures nécessaires pour endiguer l'épidémie.l'objet d'une communication à la 33

H. Gbaguidi-Haore, F. Larosa, D. Fournier, P. Bailly, P. Cholley, D. Hocquet, P. Plésiat, E. Deconinck, X. Bertrand. Épidémie de Pseudomonas aeruginosacontribution importante de l’environnement inerte dans la transmission de ce pathogène. RICAI, Paris. 2013

� Résistance aux polymyxines

Face à l'augmentation du nombre de souches de en plus souvent recours aux polymyxinesrésistants peuvent émerger sous 2011 et 1 en 2012. En 2013, 2fortement résistante (> 32µg/mL) le séquençage de différents gènes régulation à deux composantscontrôlant la modification du LPS (4d'identifier des substitutions d'acides aminés dans les L'émergence in vivo de tels mutants l'augmentation de l'utilisation de la colistine IVtransmissibles car altérés dans leur vitalité (fitness).communications à la 33èmeRICAI2013).

A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot. aeruginosa. RICAI, Paris. 2013. A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot. 2013. K. Jeannot. Two component regulatory systems in CO. 2013.

� Autres Pseudomonas

Parmi les 23 souches de P. putida

Figure 32 : Distribution par variant des

3

l’isolement des souches a permis d'identifier deux chambres individuelles susceptibles d'être contaminées. Plusieurs prélèvements de l'environnement de ces deux chambres et des surfaces inertes du service se sont avérés positifs à P. aeruginosa IMP-19 ou IMP-29 (siphons, toilettes, bass

…). Le génotypage par électrophorèse en champ pulsé des souches a confirmé l'existence de deux clones distincts (clone A/IMP

uation des pratiques et des risques a été réalisée par le service d'hygiène hospitalière afin de mettre en place les mesures nécessaires pour endiguer l'épidémie.l'objet d'une communication à la 33èmeRICAI (Paris 2013).

Haore, F. Larosa, D. Fournier, P. Bailly, P. Cholley, D. Hocquet, P. Plésiat, E. Deconinck, X. Bertrand. Pseudomonas aeruginosa producteur de carbapénèmase (IMP-19 ou IMP-29) en hématologie adulte :

contribution importante de l’environnement inerte dans la transmission de ce pathogène. RICAI, Paris. 2013

aux polymyxines chez P. aeruginosa

Face à l'augmentation du nombre de souches de P. aeruginosa MDR et XDR, les polymyxines (colistine)pour traiter les patients. Toutefois, d

sous traitement. Ainsi,3souchescolistine R ont été adressées, 2 souches faiblement résistantes (CMI= 4 et 8µL) aux polymyxines ont été caractérisées par le CNR

différents gènes (pmrB, phoQ, parRS, cprRS et colRS) codant pour des systèmes de régulation à deux composantscontrôlant la modification du LPS (4-amino-arabinose) ont d'identifier des substitutions d'acides aminés dans les senseurs PmrB et ParS

de tels mutants devrait s'amplifier dans les années à venir du fait de l'augmentation de l'utilisation de la colistine IV. Toutefois, il semble que ces mutants soient peu transmissibles car altérés dans leur vitalité (fitness).Ces résultats ont fait l'objet de deux

RICAI (Paris 2013) et d'une communication aux53

A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot. Rôle de l'opéron arn dans la résistance acquise aux polymyxines chez

A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot. Résistance adaptative aux polymyxines chez P. aeruginosa

K. Jeannot. Two component regulatory systems in P. aeruginosa involved in resistance to polymyxins.

putida reçues en 2013, 19 produisaient une carbapénèmase.

Distribution par variant des P. putidacarbapénèmase positifs en 2013

8

4

31 VIM-1

VIM-2

VIM-2 + IMP-46

VIM-4

26

l’isolement des souches a permis d'identifier deux chambres individuelles susceptibles d'être contaminées. Plusieurs prélèvements de l'environnement de ces deux chambres et des surfaces inertes

29 (siphons, toilettes, bassine pour …). Le génotypage par électrophorèse en champ pulsé des souches

(clone A/IMP-19, clone uation des pratiques et des risques a été réalisée par le service d'hygiène

hospitalière afin de mettre en place les mesures nécessaires pour endiguer l'épidémie.Ce travail a fait

Haore, F. Larosa, D. Fournier, P. Bailly, P. Cholley, D. Hocquet, P. Plésiat, E. Deconinck, X. Bertrand. 29) en hématologie adulte :

contribution importante de l’environnement inerte dans la transmission de ce pathogène. RICAI, Paris. 2013.

MDR et XDR, les cliniciens ont de plus Toutefois, des mutants

scolistine R ont été adressées au CNRen 4 et 8µg/mL) et 1 souche

par le CNR. L'amplification et codant pour des systèmes de

arabinose) ont permis chez ces 3 souches.

devrait s'amplifier dans les années à venir du fait de Toutefois, il semble que ces mutants soient peu

fait l'objet de deux 53èmeICAAC (Denver

dans la résistance acquise aux polymyxines chez P.

P. aeruginosa. RICAI, Paris.

involved in resistance to polymyxins.43th ICAAC, Denver,

mase.

positifs en 2013

Six des 8P. putida VIM- 1 provenaient dneurochirurgie (n=1) du CHU de Besançon (25)d'hématologie de Pessac (33), dont 3 coidentifiée en 2011 dans le même établissement distante pylogénétiquement des autres IMP décritesprovenaient toutes de Nancy (54)

Ces données confirment le rôle joué par métallo-β-lactamase et le risque potentiel de diffusion à

Tableau 2 : Distribution par variant et par ville des

P. putida Aulnaysous-

VIM-1 1VIM-2

VIM-2 + IMP-46 VIM-4 IMP-1

Total 1

Figure 33 : Arbre phylogénique des métallo

1 provenaient des services d’hématologie (n=4), de gdu CHU de Besançon (25). Six des 7 souches VIM-2 provenaient d

, dont 3 co-exprimaient une nouvelle carbapénèmase,dans le même établissement mais qui n’était pas alors associée à VIM

distante pylogénétiquement des autres IMP décrites (Figure 33). Enfin, les 3 soprovenaient toutes de Nancy (54).

confirment le rôle joué par P. putidaet espèces apparentées comme réservoir delactamase et le risque potentiel de diffusion à P. aeruginosa, notamment.

Distribution par variant et par ville des P. putidacarbapénèmase positifs en 2013

Aulnay--Bois

Besançon Lille Nancy Nice Pessac

1 6

1

1

3

3

3

1 6 1 3 1 6

Arbre phylogénique des métallo-β-lactamases de type IMP

27

gériatrie (n=1) et de 2 provenaient du service

exprimaient une nouvelle carbapénèmase, IMP-46, déjà alors associée à VIM-2. IMP-46 est

Enfin, les 3 souches VIM-4

et espèces apparentées comme réservoir degènes de , notamment.

positifs en 2013

Saint Denis de

la Réunion

1

1

lactamases de type IMP

28

� Acinetobacter baumannii : données générales

Figure 34 : Mécanismes de résistance identifiés chez A. baumannii en 2013 (n=255)

L'expertise en 2013 des mécanismes de résistance aux β-lactamines chezA. baumanniimontre que les souches produisent souvent simultanémentplusieursβ-lactamases intrinsèques (AmpC/ADC, type OXA-51) et/ou acquises (pénicillinase TEM ; BLSE SHV-12, CTX-M15, GES-11, PER-7 ; carbapénèmases OXA-23, OXA-24/40, OXA-58, NDM-1, NDM-9). La carbapénèmase OXA-23 peut être ainsi associée à AmpC/ADC, GES-11, PER-7 et/ou NDM-1.

Figure 35 : Distribution par variant desAcinetobacter carbapénèmase positifs 2012-2013

L'enzyme OXA-23 reste la plus fréquente des carbapénèmases retrouvées chez A. baumannii en France et précède la β-lactamase naturelle OXA-51 (et variants) dont la surexpression du gène sous l'effet de l'insertion de l'ISAba1 est responsable d'un bas niveau de résistance aux carbapénèmes.

Concernant la caractérisation des mécanismes de résistance aux aminosides, la recherche de méthylases de l'ARNr 16S (Arm, Rtm, NpmA) a été entreprise de façon systématique chez toutes les souches résistantes à la gentamicine, la tobramycine et l'amikacine. Seule l'enzyme ArmA a été détectée (cf paragraphe correspondant).

6

144

2 123

2 019

160

1 9 4 9 10

20406080

100120140160180

OXA-51 OXA-23 OXA-23 + NDM-1

OXA-24 OXA-58 NDM-1 NDM-9

2012

2013

37

125 6

1 2

87

32

1712

72 1 2 1

72 4

91

10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

� A. baumannii OXA-23


La comparaison d'une sélection de PER-7) a révélé l'existence de multiples clones en France impliqués, pour certains, dans des épidémies locales ou loco-régionales. Cette structure polyclonale de population avait déjà été remarquée lors d'un travail précédent du CNR (K. Jeannot, P. Courvalin). Par exemple, les correspondent à des souches différentes ayant acquis le gèn

En 2013, 51 souches de A. baumanniiméthylase ArmA, associée dans 100% des cas à la carbapénèmase OXAde 24 villes de la métropole et des TOM. Pour mémoire, 48 des 233 souches (20,6%) reçues par le CNR en 2012 (23 villes) renfermaient également le gène en 2011, seules 4 villes (Fort de France, adressé des souches blaOXA-23/armAdeux gènes a déjà été rapportée chez des souches épidémiques (STLettonie, Italie), en Asie (Corée, Vietnamcomparaison de 16 souches du CNR par génotypiquement différentes. Ces premiers résultats, qui doivent être confirmés sur un plus grand nombre d'isolats, semblent indiquer qu'il s'agit d'une épidémie deépidémie de souches au niveau national. Le support génétique, chromosomique ou plasmidique, du gène armA reste à préciser afin espèces Gram négatives comme les entérobactéries

Nb. souches

Origine géographique des A. baumannii OXA-23 positifs en

La comparaison d'une sélection de A. baumannii OXA-23 (± AmpC/ADC, ArmA, TEM, GES7) a révélé l'existence de multiples clones en France impliqués, pour certains, dans des épidémies

régionales. Cette structure polyclonale de population avait déjà été remarquée lors d'un travail précédent du CNR (K. Jeannot, P. Courvalin). Par exemple, les A. baumannii correspondent à des souches différentes ayant acquis le gène blaPER-7 de réservoirs encore inconnus.

baumannii sur les 255 analysées par le CNR (19,6%) produisaient la méthylase ArmA, associée dans 100% des cas à la carbapénèmase OXA-23. Ces souches provenaient

e et des TOM. Pour mémoire, 48 des 233 souches (20,6%) reçues par le CNR en 2012 (23 villes) renfermaient également le gène armA associé au gène blaen 2011, seules 4 villes (Fort de France, n=20 ; Maubeuge, n=10 ; Lyon, n=1 ; Auterive,

armA au CNR de l'Institut Pasteur (n=32/269 ; 11,9%). deux gènes a déjà été rapportée chez des souches épidémiques (ST-2) en Europe (Norvège, Bulgarie, Lettonie, Italie), en Asie (Corée, Vietnam, Chine) ou au Moyen Orient (Abu Dhabi). Toutefois, la

16 souches du CNR par MLVA (Tableau 3) a montré . Ces premiers résultats, qui doivent être confirmés sur un plus grand

nombre d'isolats, semblent indiquer qu'il s'agit d'une épidémie de gènes de résistance plus qu'une épidémie de souches au niveau national. Le support génétique, chromosomique ou plasmidique, du

afin de voir s'il existe un risque potentiel de dissémination à d'autres les entérobactéries.

29

fs en 2013

23 (± AmpC/ADC, ArmA, TEM, GES-11, 7) a révélé l'existence de multiples clones en France impliqués, pour certains, dans des épidémies

régionales. Cette structure polyclonale de population avait déjà été remarquée lors d'un baumannii OXA-23/PER-7

de réservoirs encore inconnus.

sur les 255 analysées par le CNR (19,6%) produisaient la 23. Ces souches provenaient

e et des TOM. Pour mémoire, 48 des 233 souches (20,6%) reçues par le blaOXA-23. En revanche,

; Auterive, n=1) avaient ; 11,9%). L'association des

2) en Europe (Norvège, Bulgarie, , Chine) ou au Moyen Orient (Abu Dhabi). Toutefois, la

a montré qu'elles étaient . Ces premiers résultats, qui doivent être confirmés sur un plus grand

gènes de résistance plus qu'une épidémie de souches au niveau national. Le support génétique, chromosomique ou plasmidique, du

un risque potentiel de dissémination à d'autres

30

Tableau 3 : Comparaison des souches d’A. baumannii OXA-23 positives par MLVA

Souche Mécanisme(s) de Résistance Ville Clone

12A.235 OXA-23 + ADC Aulnay-sous-bois I 13A.279 OXA-23 + ADC Aulnay-sous-bois I

13A.307 OXA-23 + ADC Compiègne J 13A.333 OXA-23 + ADC Compiègne J 13A.339 OXA-23 + ADC Compiègne J 13A.340 OXA-23 + ADC Compiègne J

13A.341 OXA-23 + ADC Paris K 13A.343 OXA-23 + ADC Paris K 13A.350 OXA-23 + ADC Paris K

13A.401 OXA-23 + ADC Metz N

13A.402 OXA-23 + ADC Suresnes O 13A.403 OXA-23 + ADC Suresnes O 13A.405 OXA-23 + ADC Suresnes O

13A.404 OXA-23 + ADC Suresnes P

13A.448 OXA-23 + ADC Paris V 13A.449 OXA-23 + ADC Paris V

13A.342 OXA-23 + ADC + ArmA Paris K 13A.344 OXA-23 + ADC + ArmA Paris K 13A.346 OXA-23 + ADC + ArmA Paris K 13A.347 OXA-23 + ADC + ArmA Paris K 13A.348 OXA-23 + ADC + ArmA Paris K 13A.351 OXA-23 + ADC + ArmA Paris K 13A.352 OXA-23 + ADC + ArmA Paris K

13A.353 OXA-23 + ADC + ArmA Armentières L 13A.358 OXA-23 + ADC + ArmA Armentières L 13A.377 OXA-23 + ADC + ArmA Armentières L 13A.378 OXA-23 + ADC + ArmA Armentières L

13A.400 OXA-23 + ADC + ArmA Metz M 13A.447 OXA-23 + ADC + TEM Paris U 12A.212 OXA-23 + GES-11 Clermont-Ferrand F 12A.249 OXA-23 + GES-11 Thionville G 13A.264 OXA-23 + PER-7 Caen H 13A.298 OXA-23 + PER-7 Cluses Q

13A.247 OXA-23 + PER-7 + ArmA Argenteuil B 13A.260 OXA-23 + PER-7 + ArmA Beaumont-sur-Oise B

13A.440 OXA-23 + PER-7 + ArmA Montbrison S 13A.445 OXA-23 + PER-7 + ArmA Montpellier T

� A. baumannii NDM-1

Dix souches (n=10) de A. baumanniiétranger a été rapporté pour 7 d'entre ellesproduisant NDM-1 se sont avérées clonales par MLVAégalement l’oxacillinase OXA-lactamines, toutes les souches étaient résistantes à la ciprofloxacine, tobramycine ; la sensibilité à l’amikacine était conservée chez 9 des 10 souches.

Tableau 4 : Caractéristiques des

Référence Dép β-lactamase(s)

13A.475 13 NDM

13A.493 13 NDM

13A.254 49 NDM

13A.291 59 NDM

13A.472 59 NDM

13A.432 69 NDM

13A.467 69 NDM-1+OXA

13A.476 69 NDM

13A.327 93 NDM

13A.304 94 NDM

Figure 37 : Origine géographique des souches de

Nb. souches

A. baumannii NDM-1 ont été adressées au CNR en 2013. Un lien avec un pays d'entre elles (notion de voyage non précisé pour 2souche

se sont avérées clonales par MLVA, excepté pour une souche qui hébergeait -23.A côté de la résistance de haut niveau à l’ensemble des

lactamines, toutes les souches étaient résistantes à la ciprofloxacine, à la gentamicine et; la sensibilité à l’amikacine était conservée chez 9 des 10 souches.

Caractéristiques des A. baumannii NDM-1 positifs en 2013

lactamase(s) Lien avec un pays étranger

Clones (MLVA)

NDM-1 Non précisé A

NDM-1 Non A

NDM-1 Egypte A

NDM-1 Algérie A

NDM-1 Algérie A

NDM-1 Algérie A

1+OXA-23 Algérie B

NDM-1 Non A

NDM-1 Algérie A

NDM-1 Syrie A

Origine géographique des souches de A.baumannii NDM-1 positives (2013)

31

1 ont été adressées au CNR en 2013. Un lien avec un pays souches).Les souches

, excepté pour une souche qui hébergeait aut niveau à l’ensemble des β-

la gentamicine et à la

1 positifs en 2013

blaOXA naturelle

Non déterminé

Non déterminé

OXA-94

OXA-94 variant

OXA-94

OXA-94

OXA-64

Non déterminé

OXA-94

OXA-94

1 positives (2013)

� A. pittii A l'instar de A. baumannii, l'espèce carbapénèmases. Ainsi, en 2013, sur les 13 souches analysées (provenant de 10 villes), 6 produisaient OXA-23 (n=2), OXA-24/40 (n=1), OXABLSE VEB-7 (variant, n=1) et GESrésistance à déjà été évoqué à plusieurs reprises.

3.1.2. Laboratoire de Caen

Sur les 352 souches reçues au laboratoire pour expertise en 2013, 278 (79,0 %) ont été confirmées comme étant des entérocoques résistants aux glycopeptides (ERG). La grande majorité de ces souches appartenait à l’espèce E. faeciumE. avium (n = 1 ; 0,4 %) et E. raffinosus

Figure 38

La proportion des souches ERG appartenant à l’espèce du temps (entre 91,8 et 97,1 %).

Figure 39 : Proportion des différentes espèces d’ERG entre 2006 et 2013

0

20

40

60

80

100

2006 2007 2008

l'espèce A. pittiipeut héberger des gènes codant pour des BLSE et des carbapénèmases. Ainsi, en 2013, sur les 13 souches analysées (provenant de 10 villes), 6 produisaient

=1), OXA-58 (n=2) et OXA-72 (n=1) seules ou en association avec les =1) et GES-7 (n=1). Le rôle potentiel de A. pittii comme réservoir de gènes de

résistance à déjà été évoqué à plusieurs reprises.


Sur les 352 souches reçues au laboratoire pour expertise en 2013, 278 (79,0 %) ont été confirmées entérocoques résistants aux glycopeptides (ERG). La grande majorité de ces souches

aecium (n = 270 ; 97,1 %), suivie des espèces E. faecalisE. raffinosus (n = 1 ; 0,4 %).

38 : Proportion des différentes espèces d’ERG

La proportion des souches ERG appartenant à l’espèce E. faecium est toujours très importante au cours

Proportion des différentes espèces d’ERG entre 2006 et 2013

E. faecium (n=270)

E. faecalis (n=6)

E. avium (n=1)

E. raffinosus (n=1)

2008 2009 2010 2011 2012 2013

E. raffinosus

E. hirae

E. gallinarum

E. durans

E. avium

E. faecium

E. faecalis

32

peut héberger des gènes codant pour des BLSE et des carbapénèmases. Ainsi, en 2013, sur les 13 souches analysées (provenant de 10 villes), 6 produisaient

=1) seules ou en association avec les comme réservoir de gènes de

Sur les 352 souches reçues au laboratoire pour expertise en 2013, 278 (79,0 %) ont été confirmées entérocoques résistants aux glycopeptides (ERG). La grande majorité de ces souches

aecalis (n = 6 ; 2,1 %),

est toujours très importante au cours

Proportion des différentes espèces d’ERG entre 2006 et 2013

E. raffinosus

E. hirae

E. gallinarum

E. durans

E. avium

E. faecium

E. faecalis

En 2013, le gène vanAest resté majoritaire chez les ERG (n = 208, 74,8 %), suivie d69, 24,8 %) et vanD (n = 1, 0,4 %)en 2008 et 2010) n’a été retrouvée en 2013.

Sur les 352 souches reçues, 49 (13,9 %)gène de résistance van acquis tandis que seulement 4 souches (1,1 %) appartenaient aux espèces E. gallinarum (n = 3) et E. casseliflavusglycopeptides (gènes vanC).

Figure 40 : Proportion des différents gènes acquis de résistance aux glycopeptides (

La répartition des espèces d’entérocoques et des gènes

Tableau 5 : Répartition des espèces d’entérocoques et des gènes

Espèce et génotypeE. f

E. f

E. avium

E. raffinosus

Concernantl’espèce majoritaire (vanA) et 16 (vanB) départements. Les souches France (départements 54, 57, 67) et départements 45 et 69. Pour les souches touchés.

0

20

40

60

80

100

2006 2007

majoritaire chez les ERG (n = 208, 74,8 %), suivie d(n = 1, 0,4 %). Aucune souche portant à la fois les gènes vanA

et 2010) n’a été retrouvée en 2013.

352 souches reçues, 49 (13,9 %) dont 27 E. faecium et 22 E. faecalis ne possédaient aucun acquis tandis que seulement 4 souches (1,1 %) appartenaient aux espèces

E. casseliflavus (n = 1), naturellement résistantes à bas

Proportion des différents gènes acquis de résistance aux glycopeptides (van

La répartition des espèces d’entérocoques et des gènes van est indiquée dans le Tableau 5

Répartition des espèces d’entérocoques et des gènes van acquis

Espèce et génotype Nombre E. faecalis

vanA vanB

5 (1, 8 %) 1 (0,4 %)

E. faecium vanA vanB vanD

201 (72,3 %) 68 (24,4 %) 1 (0,4 %)

E. avium vanA

1 (0,4 %)

raffinosus vanA

1 (0,4 %)

l’espèce majoritaire E. faecium, ces souches d’ERG provenaient respectivement ) départements. Les souches vanA provenaient majoritairement de l’Est de la

France (départements 54, 57, 67) et d’Ile-de-France (départements 75, 92, 93 départements 45 et 69. Pour les souches vanB, trois départements (19, 59 et 67)

2008 2009 2010 2011 2012 2013

33

majoritaire chez les ERG (n = 208, 74,8 %), suivie du gène vanB (n = vanA et vanB (détectées

ne possédaient aucun acquis tandis que seulement 4 souches (1,1 %) appartenaient aux espèces

naturellement résistantes à bas niveau aux

van) entre 2006 et 2013

Tableau 5ci-dessous.

acquis

respectivement de 31 t majoritairement de l’Est de la

rance (départements 75, 92, 93 et 94) et des , trois départements (19, 59 et 67) étaient les plus

vanD

vanA+B

vanB

vanA

Figure 41: Origine géographique des souches

Figure 42 : Origine géographique des souches

Enfin, 48 souches d’ERG appartenant à cette espèce étaient déclarées comme importés de pays étrangers, soulignant l’intérêt des recommandations de dépistage chez les rapatriés sanitairesprincipaux pays étaient l'Algérie,

Nb. souches

Nb. souches

Origine géographique des souches de E. faecium vanA en 2013

Origine géographique des souches de E. faecium vanB en 2013

Enfin, 48 souches d’ERG appartenant à cette espèce étaient déclarées comme importés de pays ’intérêt des recommandations de dépistage chez les rapatriés sanitaires

Algérie, le Portugal, Israël, l'Inde et la Turquie.

34

en 2013

en 2013

Enfin, 48 souches d’ERG appartenant à cette espèce étaient déclarées comme importés de pays ’intérêt des recommandations de dépistage chez les rapatriés sanitaires. Les

35

Tableau 6 : Provenance des souches d’origine étrangère (n = 48)

Pays Nombre Algérie

Arabie Saoudite Australie Egypte

Etats-Unis Grèce Inde Iran Israël Italie

Kosovo Koweït Malaisie Maroc

Pakistan Portugal

Roumanie Sénégal

Syrie/Liban Tunisie/Lybie

Turquie Tunisie

10 (20,8 %) 1 2 1 1 1

3 (6,2 %) 1

4 (8,3 %) 1 1 2 1 1 1

7 (14,6 %) 1 1 2 2

3 (6,2 %) 1

Par détection de l’IS16, une grande majorité (258/270 ; 95,6 %) des souches de E. faeciuma pu être catégorisée comme appartenant au CC17, ce qui est en accord avec les études épidémiologiques précédentes. De la même façon, le gène ptsD, potentiellement impliqué dans le pouvoir épidémique des souches hospitalières de E. faecium, a été retrouvé chez de nombreuses souches (244/270 ; 90,4 %).

Le typage moléculaire par rep-PCR (Diversilab, bioMérieux) a permis de mettre en évidence 109 clones différents d’ERG (104 chez E. faecium et 5 chez E. faecalis) dans 51 villes/établissements différents.

Tableau 7 : Clones d’ERG retrouvés en France en 2013

Clones de E. faecium

Clone Ville 1 Nb (ville 1) Ville 2 Nb (ville 2) Nb total

AmiB2 Amiens 1 1

AmiB3 Amiens 1 1

ArgA4 Argenteuil 1 Beaumont-sur-Oise 1 2

ArmB3 Armentières 10 10

BordB1 Bordeaux 1 1

CaeB6 Caen 1 1

C-FerA10 Clermont-Ferrand 1 1

ChartA1 Chartres 1 1

ClicA5 Clichy 2 2

ClicA5 Clichy 1 1

ClicA6 Clichy 1 1

ClicB2 Clichy 1 1

ColA4 Colmar 5 5

36

CorbA3 Corbeil-Essonnes 1 1



CretA10 Créteil 1 1

CretA11 Créteil 1 1

CretA5 Créteil 1 1

CretA6 Créteil 1 1

CretA7 Créteil 1 1

CretA8 Créteil 1 1

CretA9 Créteil 1 1

CretB1 Créteil 1 1

CretB2 Créteil 1 1

CretB3 Créteil 1 1

DouaiB1 Douai 1 1

GarchesB1 Garches 1 2

GreA5 Bourgoin-Jallieu 1 1

GreA6 Grenoble 1 1

GreA7 Grenoble 3 3

Hau-LomB1 Hauteville-Lompnes 1 1

KreBicA7 Le Kremlin Bicêtre 1 1

KreBicA8 Le Kremlin Bicêtre 1 1

LeMansB1 Le Mans 1 1

LyonA6 Lyon 1 1

LyonA7 Bron 1 1

LyonA8 Bron 1 1

LyonA9 Bron 4 Clermont-Ferrand 1 5

MarsA10 Marseille 1 1

MarsB6 Marseille 2 2



MetA4 Metz 2 2

MetA5 Metz 2 2

MetA6 Metz 1 1

MetA7 Metz 1 1

MetB1 Metz 1 1

NanA5 Nancy 7 7

ND-SanA1 Notre-Dame-de-Sanilhac 1 1

NeuilA2 Neuilly-Hôpital Américain 2 2

NiceA1 Nice 1 1

OrlA5 Orléans 11 11

OrlA6 Chartres 1 Orléans 1 2

OrlA7 Orléans 1 1

OrlA8 Orléans 1 1

P-AmbPA2 Paris-Ambroise Paré 2 2



P-BichA1 Paris-Bichat 3 3


P-BichA13 Clichy 1 Paris-Bichat 1 2

37


P-CochA6 Paris-Cochin 1 1

P-FouA4 Paris-Institut Fournier 1 1

P-FouB1 Paris-Institut Fournier 2 2

PoissyA1 Poissy 1 1

P-PSalD1 Paris-Pitié-Salpêtrière 1 1

P-RDebA1 Paris-Robert Debré 1 1






P-StAntA1 Paris-Saint-Antoine 12 12

P-St-AntA3 Paris-Saint-Antoine 1 1

RouA3 Rouen 4 4

RoubA1 Reims 1 Roubaix 1 2

SalouelA1 Salouel 1 1

SalouelB1 Salouel 1 1

SenlisA1 Senlis 1 1

St-EtB3 Saint-Etienne 1 1



StraA34 Strasbourg 3 3








StraB13 Strasbourg 1 1



St-SebMorA2 Saint-Sébastien de Morsent 1 1

St-SebMorA3 Saint-Sébastien de Morsent 1 1

ToursA2 Tours 1 1

ToursA3 Tours 1 1

ToursA4 Tours 1 1

ToursA5 Tours 1 1

TroyesA1 Troyes 1 1

TulleB1 Brive-la-Gaillarde 2 2

VillA1 Villejuif 1 1

Clones de E. faecalis

Barent-EFS-A1 Barentin 1 1

CastL-EFS-A1 Castelnau-le-Lez 2 2

Corb-EFS-A1 Corbeil-Essonnes 1 1

Orl-EFS-A1 Orléans 1 1

Reth-EFS-B1 Rethel 1 1

De nombreux clones étaient sporadiques tandis que dans les établissements où plusieurs clones étaient rapportés, il existait généralement un clone majoritaire (ex. ArmB3, noter que 5 clones ont été détectés dans deux établissements/villes différents mettant en évidence une diffusion loco-régionale, phénomène déjà décrit les années précédentes.

Pour les ERG, il n’est pas possible de déterminer d’infections, soit de colonisations du fait du recueil non exhaustif dessouches. De plus, la notion d’infection ou non est laissée à l’appréciation du correspondantqui adresse les souches. Parmi les souches de E. faecium résistantes aux glycopeptidespour lesquelles le renseignement avait été fourni, 28 (10,8 %) ont été considérées commeassociées à une infection par les correspondants qui nous les ont transmis (dont 7 bactériémies, diverses,notamment intra-abdominales). Les autres souches d’écouvillonnages rectaux ou de selles

Sur 158 souches ERG de l'espèceété isolées de services de réanimationet 10,8% de médecine interne/maladies infectieuses

Figure 43 : Services dans lesquels des souches ERG d

3.1.3. Laboratoire de Clermont

Nos analyses ont identifié 122 souches productrices de BLSE et 57 souches productrices de céphalosporinases plasmidiques, soit une augme2012. La répartition en termes d’espèces est présentée dans la principalement des souches appartenant aux espèces de la moitié des souches de K. pneumoniae d’épidémie.

De nombreux clones étaient sporadiques tandis que dans les établissements où plusieurs clones étaient rapportés, il existait généralement un clone majoritaire (ex. ArmB3, OrlA5, P-BichA3, Pnoter que 5 clones ont été détectés dans deux établissements/villes différents mettant en évidence une

régionale, phénomène déjà décrit les années précédentes.

Pour les ERG, il n’est pas possible de déterminer le pourcentage exact de souches responsablesd’infections, soit de colonisations du fait du recueil non exhaustif dessouches. De plus, la notion d’infection ou non est laissée à l’appréciation du correspondantqui adresse les souches. Parmi les

résistantes aux glycopeptidespour lesquelles le renseignement avait été fourni, %) ont été considérées commeassociées à une infection par les correspondants qui nous les

bactériémies, 14 infections urinaires – possibles colonisations abdominales). Les autres souches (n = 232 ; 89,2 %) ou de selles prélevés lors d’enquêtes épidémiologiques.

l'espèceE. faeciumpour lesquelles le renseignement était fourni, services de réanimation, 15,2% de néphrologie-dialyse, 10,8% d'oncologie/hématologie

médecine interne/maladies infectieuses.

: Services dans lesquels des souches ERG de E. faecium ont été isolées en 2013

3.1.3. Laboratoire de Clermont-Ferrand

122 souches productrices de BLSE et 57 souches productrices de céphalosporinases plasmidiques, soit une augmentation respective de 69% et 124%, 2012. La répartition en termes d’espèces est présentée dans la Figure 44

nt des souches appartenant aux espèces K. pneumoniae (43.5%) et K. pneumoniae (21,8%) nous a été envoyée dans un contexte de suspicion

Réanimation

Néphrologie-Dialyse

Onco-hématologie

Médecine interne-Maladies infectieuses

SSR

Gériatrie

Chirurgie orthopédique

Hépato-gastro-entérologie

Cardiologie

Chirurgie vasculaire

Pneumologie

Neurologie

Chirurgie cardiaque

38

De nombreux clones étaient sporadiques tandis que dans les établissements où plusieurs clones étaient BichA3, P-SantA1). A

noter que 5 clones ont été détectés dans deux établissements/villes différents mettant en évidence une

e exact de souches responsables, soit d’infections, soit de colonisations du fait du recueil non exhaustif dessouches. De plus, la notion d’infection ou non est laissée à l’appréciation du correspondantqui adresse les souches. Parmi les 260

résistantes aux glycopeptidespour lesquelles le renseignement avait été fourni, %) ont été considérées commeassociées à une infection par les correspondants qui nous les

possibles colonisations – et 7 suppurations ; 89,2 %) étaient isolées

prélevés lors d’enquêtes épidémiologiques.

pour lesquelles le renseignement était fourni, 32,9 % ont oncologie/hématologie

ont été isolées en 2013

122 souches productrices de BLSE et 57 souches productrices de ation respective de 69% et 124%, par rapport à

44. Nous avons reçu E. coli (28,4%). Près

dans un contexte de suspicion

Maladies infectieuses

entérologie

Figure 44 : Bilan des souches expertisées (n=271) : répartition par espèce. Les demandes d’expertise ont principalement concerné les espèces

Les principales enzymes identifiées étaient des BLSE de type CTXproduisant la BLSE CTX-M-15) et des céphalosporinases plasmidiques de type DHA (29 souches) et CMY (28 souches).

Des BLSE de type CTX-M ont été identifiées dans 37% des souches reçues. Avec une prévalence de 20%, les céphalosporinases plasmidiques de type DHA et CMYrésistance plasmidique aux CG3

Figure 45 : Répartition des

Bilan des souches expertisées (n=271) : répartition par espèce. Les demandes d’expertise ont principalement concerné les espèces K. pneumoniae et E. coli

Les principales enzymes identifiées étaient des BLSE de type CTX-M (103 souches dont 86 15) et des céphalosporinases plasmidiques de type DHA (29 souches) et

M ont été identifiées dans 37% des souches reçues. Avec une prévalence de céphalosporinases plasmidiques de type DHA et CMY-2 ont représenté

(DHA, 10% et CMY, 10%).

Répartition des β-lactamases identifiées par famille

39

Bilan des souches expertisées (n=271) : répartition par espèce. Les demandes d’expertise ont

M (103 souches dont 86 15) et des céphalosporinases plasmidiques de type DHA (29 souches) et

M ont été identifiées dans 37% des souches reçues. Avec une prévalence de ont représenté le 2ème mécanisme de

tamases identifiées par famille

Les BLSE CTX-M-15 ont étéreprésentaient 82% des enzymes identifiées

Figure 46 : Distribution par groupetype CTX-M reçues en 2013

Soixante-huit souches de K. pneumoniae Trente-trois souches de E. coli données sont cohérentes avec la entérobactéries.

Vingt-cinq souches de K. pneumoniae souches de E. coli produisaient une céphalosporinase plasmidique72% des souches de P. mirabilisprincipalement CMY-2 (92%). Il est à noter que les données préliminaires de typage pas permis de montrer une clonalité des souches productrices de céphalosporinases plasmidiques. Ceci suggère une diffusion de plasmides, qui ser

Au total, nous avons observé la diffusion de souches de M-15, et dans une moindre mesure, de souches parfois responsables d’épidémies (CHU de Toulouse et de Nice notamment). Les résultats mettent également en lumière l’émergencchez E. coli et P. mirabilis P. mirabilissont capables d’acquérir le même mécanisme plamidique), mais de nature différente.plasmidique sont des BMR qui dépistage, de déclaration ou de mesure d’hygiène.

ont été largement majoritaires en 2013 (83 %).représentaient 82% des enzymes identifiées chez E. coli.

Distribution par groupe des BLSE de reçues en 2013

Figure 47 : Répartition des chezE. coli

K. pneumoniae produisaient une BLSE dont CTX-M-15 produisaient une BLSE dont CTX-M-15 dans

avec la forte prévalencedes BLSE de type CTX

K. pneumoniae produisaient la céphalosporinase plasmidique DHAoduisaient une céphalosporinase plasmidique dont 85% de type P. mirabilis envoyées produisaient également une céphalosporinase plasmidique, 2 (92%). Il est à noter que les données préliminaires de typage

pas permis de montrer une clonalité des souches productrices de céphalosporinases plasmidiques. Ceci suggère une diffusion de plasmides, qui sera explorée de façon spécifique.

Au total, nous avons observé la diffusion de souches de K. pneumoniae productrices de la BLSE CTXdans une moindre mesure, de souches exprimant la céphalosporinase plasmidique DHA

parfois responsables d’épidémies (CHU de Toulouse et de Nice notamment). Les résultats mettent également en lumière l’émergence préoccupante de céphalosporinases plasmidiques

P. mirabilis (27 souches reçues).Ainsi, les espèces K.pneumoniaesont capables d’acquérir le même mécanisme enzymatique (céphalosporinase mais de nature différente. Il est à noter que les bactéries productrices de céphalossont des BMR qui ne font l’objet d’aucune recommandation spécifique en

dépistage, de déclaration ou de mesure d’hygiène.

40

Les BLSE CTX-M

: Répartition des BLSE identifiées E. coli

15 dans 93% des cas. 39.3% des cas. Ces

de type CTX-M-15 chez les

produisaient la céphalosporinase plasmidique DHA-1. Quatorze de type CMY-2. Enfin,

envoyées produisaient également une céphalosporinase plasmidique, 2 (92%). Il est à noter que les données préliminaires de typage moléculaire n’ont

pas permis de montrer une clonalité des souches productrices de céphalosporinases plasmidiques. Ceci

productrices de la BLSE CTX-la céphalosporinase plasmidique DHA-1,

parfois responsables d’épidémies (CHU de Toulouse et de Nice notamment). Les résultats mettent e préoccupante de céphalosporinases plasmidiques de typeCMY-2

K.pneumoniae, E. coli et enzymatique (céphalosporinase

ctéries productrices de céphalosporinase font l’objet d’aucune recommandation spécifique en termes de

Figure 48 : Répartition des souches de

3.1.4. Laboratoire de Bicêtre

� Identification de l’activité carbapénèmase

Une proportion relativement faible49). Ce pourcentage, en augmentation par rapport à 2012 (23,1%)des EPC en France et/ou résulter d'notamment dans les régions de plus forte prévalence Calais)(Figure 50). Les souches reçu(40,5%), K. pneumoniae (34,6%) et

Figure 49 : Nombre d

Nb. souches

Répartition des souches de K. pneumoniae productrices de CTX-M-


Identification de l’activité carbapénèmase

relativement faible (28,2%) des souches reçues exprimait une carbapénèmase en augmentation par rapport à 2012 (23,1%), pourrait traduire une

et/ou résulter d'une meilleure détection des EPC par les laboratoires expéditeurs gions de plus forte prévalence (PACA, lle-de-France, et le Nord

. Les souches reçues appartenaient principalement aux espèces (34,6%) et E. coli (14,4%) (Figure 51).

Nombre d'EPCreçues mensuellement au CNR Bicêtreen

Nb. souches

41

-15 et de DHA-1

carbapénèmase (Figure , pourrait traduire une progression

une meilleure détection des EPC par les laboratoires expéditeurs France, et le Nord-Pas-de-

aux espèces Enterobacter sp.

en2013

Figure 50 : Répartition du nombre de

Figure 51 : Distribution des s

� Nature des espèces d’entérobactéries exprimant une carbapénèmase

La majorité des EPC appartenait aux espèces (18,2%soit 116 souches). La proportion de souches exprimant une carbapénèmase était radicalement différente en fonction de l’espèce. En effet, plus de la moitié des souches de un tiers des souches de E. coli (35,5%) reçue

Répartition du nombre des EPC par départementen2013

Distribution des souches d’entérobactéries reçues au CNR Bicêtre

Nature des espèces d’entérobactéries exprimant une carbapénèmase

La majorité des EPC appartenait aux espèces K. pneumoniae (64,5%soit 410 souches). La proportion de souches exprimant une carbapénèmase était radicalement

différente en fonction de l’espèce. En effet, plus de la moitié des souches de K. pneumoniae(35,5%) reçues produisaient une carbapénèmase, tandis que seuls

42

2013

CNR Bicêtreen2013

soit 410 souches)et E. coli ). La proportion de souches exprimant une carbapénèmase était radicalement

K. pneumoniae (52,4%) et tandis que seuls 6,4%

desE. cloacae étaient des EPC. Enterobacter spp. etCitrobacter associée à une diminution de la perméabcarbapénèmasechez ces espèces justifie leur recherche systématique.

De façon similaire, l’association d’une BLSE et d’uneun mécanisme fréquent de résistance aux carbapénèmes chez

Dans la mesure oùK. pneumoniaeproductrices de carbapénèmase nosocomiale n’étant pas systématiquement établie

Figure

� Type de carbapénèmases

Comme en 2012, les carbapénèmases les plus souvent identifiées(Figure 53). La prédominance en France du Maghreb et en Turquie, avec lesquels nous avons d'importants échanges (immigration, voyages..). Six variants ponctuels d’OXA-48 ont été identifiés

Figure 53 :

. Le principalmécanisme de résistance aux carbapénèmes chez les spp. correspondait à la surexpression de la céphalosporinase naturelle

une diminution de la perméabilité membranaire. Cependant, la présenceces espèces justifie leur recherche systématique.

’association d’une BLSE et d’une diminution de la perméabilité un mécanisme fréquent de résistance aux carbapénèmes chez E coli et K. pneumoniae

K. pneumoniaeest essentiellement nosocomiale, la circulation des souche est essentiellement hospitalière. Dans le cas

nosocomiale n’étant pas systématiquement établie, une circulation communautaire

Figure 52 : Distribution par espèces des EPC en2013

es carbapénèmases les plus souvent identifiées en 2013étaienten France des souches OXA-48 est associée à un réservoir dans les pays

avec lesquels nous avons d'importants échanges (immigration, voyages..). 48 ont été identifiés (Tableau 8).

: Distribution par typesdes carbapénèmases en2013 43

e principalmécanisme de résistance aux carbapénèmes chez les surexpression de la céphalosporinase naturelle

ilité membranaire. Cependant, la présence de

perméabilité membranaire est K. pneumoniae.

essentiellement nosocomiale, la circulation des souches Dans le cas de E. coli,l’origine

circulation communautaire est envisageable.

étaient de type OXA-48 réservoir dans les pays

avec lesquels nous avons d'importants échanges (immigration, voyages..).

44

Tableau 8 : Nature des carbapénèmases produites par les souches reçues au CNR Bicêtre - 2013

Carbapénèmase Nombre de souches

OXA-48 490

OXA162 1

OXA-181 11

OXA-204 7

OXA-232 1

OXA-244 2

512

KPC-2 14

KPC-3 15

29

NDM-1 54

NDM-4 1

NDM-5 3

NDM-6 1

NDM-7 2

61

VIM-1 16

VIM-2 2

VIM-4 2

20

IMI-2 2

IMP-4 3

NDM-1 + OXA-48 2

NDM-1 + OXA-181 2

NDM-1 + OXA-232 3

NDM-5 + OXA-48 1

NDM-5 + OXA-232 1

9

TOTAL 636

NDM est le second type de carbapénèmases le plus fréquemment identifié en 2013 (Figure 53)avec 5 variants(Tableau 8). Le réservoir des souches de type NDM est essentiellement le sous-continent indien. Le nombre de souches productrices de NDM a été multiplié par plus de 2par rapport à 2012 (27 souches en 2012 vs 70 souches en 2013), ainsi NDM passe du 3ème au 2ème rang des carbapénèmases identifiées en France.

Enfin, les souches produisant la carbapénèmase de type KPC sont en diminution par rapport à l’année 2012 (39 souches en 2012 vs 29 souches en 2013) malgré leur expansion en Italie et en Grèce où elles échappent à tout contrôle en milieu hospitalier.

Seul un petit nombre de souches exprimant d’autres carbapénèmases a été caractérisé en 2013 : VIM, IMI et IMP (Tableau 8).

La répartition des différents types de noter que pour quelques patients, la carbapénèmase de type OXAespèces d’entérobactéries, soulignant ainsi l’extrême mobilité des gènes plasmide hautement autotransférable.

Figure 54 : Répartition par types

A

B

C

La répartition des différents types de carbapénèmases par espèces est représenténoter que pour quelques patients, la carbapénèmase de type OXA-48 a été identifiée dans plusieurs espèces d’entérobactéries, soulignant ainsi l’extrême mobilité des gènes blaOXA-48dont le vecteur estplasmide hautement autotransférable.

types descarbapénèmases chez K. pneumoniae (A), E. coli

45

carbapénèmases par espèces est représentéeFigure 54.Il faut 48 a été identifiée dans plusieurs

dont le vecteur est un

E. coli(B) et E. cloacae (C)

Figure 55 : Distribution des différentes entérobactéries

� Origine géographique des souches

Bien que cet élément d’information ne soit pas systématiquement renseigné, uncontamination à l’étranger a pu être Tableau 9).

Figure 56 : Pays de provenance des souches pour lesquel

des différentes entérobactéries selon le type de carbapénèmase

Origine géographique des souches

Bien que cet élément d’information ne soit pas systématiquement renseigné, uncontamination à l’étranger a pu être évoquée avec certitude dans 25% des cas (145/636

Pays de provenance des souches pour lesquelles un lien avec l’étranger a été rapporté (145 souches)

46

carbapénèmase identifié

Bien que cet élément d’information ne soit pas systématiquement renseigné, une probable avec certitude dans 25% des cas (145/636) (Figure 56,

s un lien avec l’étranger a été rapporté

47

Tableau 9 : Origine géographique des souches productrices de carbapénèmases

Pays

OXA-48-like NDM KPC VIM IMP IMI NDM + OXA-48-like

OX

A-4

8

OX

A-1

62

OX

A-1

81

OX

A-2

04

OX

A-2

32

OX

A-2

44

ND

M-1

ND

M-4

ND

M-5

ND

M-6

ND

M-7

KP

C-2

KP

C-3

VIM

-1

VIM

-2

VIM

-4

IMP

-4

IMI-

2

ND

M-1

+

OX

A-4

8

ND

M-1

+

OX

A-1

81

ND

M-1

+

OX

A-2

32

ND

M-5

+

OX

A-4

8

ND

M-5

+

OX

A-2

32

Algérie 5

1

Antilles

1

Arabie Saoudite

1

Canada

1

Congo 1

Crète

2

Djibouti 3

Egypte 4

Espagne 1

1

Grèce

1 2

Ile Maurice

1

Inde

4

1 11 1 1 1 1

2 1

1

Israel

2 1

Italie 1

1 4

Liban 3

Libye 2

Madagascar

1

Maroc 37

1

1

Népal

1

Niger

1

Nouvelle calédonie

3

Réunion

4

Roumanie 1 1

1

1

Russie 1

Serbie

2

Sri Lanka

1

St Martin 1

Syrie

2

Tailande

1

Tchad

2

Togo 1

Tunisie 10

2

Turquie 5

Yemen 1

Lien avec l'étranger avéré 76 1 10 0 1 0 26 1 1 1 1 7 6 6 0 0 3 0 1 2 1 0 1 % 15,5 100 90,9 0 100 0 48,1 100 33,3 100 50 50 40 37,5 0 0 100 0 50 100 33,3 0 100

Pas de lien avec l'étranger connu 414 1 7 2 28 2 1 7 9 10 2 2 2 1 2 1 % 84,5 0 9,1 100 0 100 51,9 0 66,7 0 50 50 60 62,5 100 100 0 100 50 0 66,7 100 0

Total 490 1 11 7 1 2 54 1 3 1 2 14 15 16 2 2 3 2 2 2 3 1 1

De nombreuses souches de type NDM provenadans le sous-continent indien (Inde, Sri Lanka, Népal, été identifiées à la Réunion et à Madagascar.

Les souches KPC provenaient souventGrèce, en Crète ou en Israël, pays dont l’endémicité très importante identifiée.

Dans le cas des souches OXA-48,les pays du Maghreb où cette enzyme est endémique. essentiellement liée à un plasmide que nous av

� Comparaison de souches épidémiques d’entérobactéries exprimant une carbapénèmase

Cent trente et une souches, correspondant à 20 épisodescomparaison génomique. Il s'agiDeux souches exprimaient une carbapénèmase de type NDM, Quatorze souches de E. cloacaecomparées. L’analyse de ces souches épidémiques, bien que représentant certainement une vue très partielle de la situation nationale, suggère queE. cloacae) sont responsables de phénomènes épidémiquesOXA-48 et KPC.

Figure 57 : Nombre d

� Conclusion

Le nombre de souches d'entérobactCeci est le reflet, à la fois, d'une meilleure sensibilisation des l'installation progressive d'un phénomène

De nombreuses souches de type NDM provenaient de patients ayant séjourné ou ayant été hospitalisés continent indien (Inde, Sri Lanka, Népal, Thaïlande) (Tableau 9). Plusieurs

Madagascar.

souches KPC provenaient souvent de patients ayant séjourné ou ayant été hospitalisés en Israël, pays dont l’endémicité très importante de KPC est désormais bien

48, il s’agissait de patients ayant séjourné ou ayant été hospitalisésles pays du Maghreb où cette enzyme est endémique. La diffusion rapide de OXA

plasmide que nous avons précédemment caractérisé (IncL/M de 61,8 kb).

Comparaison de souches épidémiques d’entérobactéries exprimant une carbapénèmase

souches, correspondant à 20 épisodes épidémiques, nous ont été adressées pour . Il s'agissait essentiellement de souches nosocomiales de

Deux souches exprimaient une carbapénèmase de type NDM, 14 souches KPC et 103 OXAE. cloacae exprimant une carbapénèmase de type OXA-48 ont également été

L’analyse de ces souches épidémiques, bien que représentant certainement une vue très ation nationale, suggère que seules les espèces nosocomiales (

sont responsables de phénomènes épidémiques, par le biais des carbapénèmases de

Nombre d’épisodes épidémiques et nombre de souches comparées

d'entérobactéries reçues pour recherche de carbapénèmased'une meilleure sensibilisation des biologistes au problème des EPC

phénomèneépidémique. La seule manière, actuellement, de tenter

48

ou ayant été hospitalisés ). Plusieurs souches ont

de patients ayant séjourné ou ayant été hospitalisés en Italie, en KPC est désormais bien

ayant séjourné ou ayant été hospitalisés dans on rapide de OXA-48 est

caractérisé (IncL/M de 61,8 kb).

Comparaison de souches épidémiques d’entérobactéries exprimant une carbapénèmase

, nous ont été adressées pour t essentiellement de souches nosocomiales de K. pneumoniae.

souches KPC et 103 OXA-48. 48 ont également été

L’analyse de ces souches épidémiques, bien que représentant certainement une vue très seules les espèces nosocomiales (K. pneumonie,

par le biais des carbapénèmases de type

de souches comparées

recherche de carbapénèmases'est accruen 2013. biologistes au problème des EPCet de

. La seule manière, actuellement, de tenter

d'enrayer cette diffusion, notamment en milieu hospitalierles souches carbapénèmase positivesobjectif, le Carba NP test apparaît comme une techniquesensibilité) qui, diffusée largement

La diffusion de souches de E. coliserait liée à des cas de colonisation méditerranéens. Seul un antibiogramme systématiquepeut permettre d'identifier les patients infectés par de telles souches et d'adapter au mieux l

En 2013, nous avons observéune forte augmentationde nombreuses comparaisons génotypiquesdiscussion pour pouvoir répondre à cette mission d'investigation épidémiologique.

3.2 Surveillance de la résistance des agents pathogènes aux anti


A la demande de l'EUCAST, le CNR a été amené à préciser la distribution des CMI de la fosfomycineP. aeruginosa sauvages (environnementa

Figure 58 : Distribution de la CMI de la fosfomycine de 80 souches de


La sensibilité des ERG a été testée par la méthode de diffusion en milieu gélosé selon les recommandations du CA-SFM pour les 16 antibiotiques suivantskanamycine, gentamicine, érythromycine, lincomycine, pristinamycine, lévofloxacine, chloramphénicol, doxycycline, tigécycline, vancomycine, teicoplanine, cotrimoxazole, rifampicine et linézolide. Les CMI de la vancomcyine, de la tepar la méthode du E-test (bioMérieux). Les résultats pour les souches les Tableau 10et Tableau 11ci-dessous

notamment en milieu hospitalier, est de détecter le plus rapidement possible carbapénèmase positives et d'isoler les patients infectés ou colonisés. Afin d'atteindre cet

apparaît comme une technique simple et fiable (+/- 100% de spécificité et largement, peut contribuer à mieux maîtriserl'épidémie en cours

coli OXA-48 à point de départ communautaire colonisation (surtout intestinale) liées à des réservoirsSud

méditerranéens. Seul un antibiogramme systématiquepeut permettre d'identifier les patients infectés er au mieux la prise en charge.

éune forte augmentation du nombre d'épidémies hospitalières, impliquant de nombreuses comparaisons génotypiques. La répartition des moyens au sein du CNR est en cours de

ondre à cette mission d'investigation épidémiologique.

3.2 Surveillance de la résistance des agents pathogènes aux anti


A la demande de l'EUCAST, le CNR a été amené à réaliser de nouvelles analyses de population préciser la distribution des CMI de la fosfomycine (ci-dessous) et de l'aztréonam chez des

sauvages (environnementaux) et résistants (cliniques).

Distribution de la CMI de la fosfomycine de 80 souches de P. aeruginosa


La sensibilité des ERG a été testée par la méthode de diffusion en milieu gélosé selon les SFM pour les 16 antibiotiques suivants : ampicilline, streptomycine,

kanamycine, gentamicine, érythromycine, lincomycine, pristinamycine, lévofloxacine, chloramphénicol, doxycycline, tigécycline, vancomycine, teicoplanine, cotrimoxazole, rifampicine et linézolide. Les CMI de la vancomcyine, de la teicoplanine et de la daptomycine ont été déterminées

test (bioMérieux). Les résultats pour les souches de E. faeciumdessous.

49

er le plus rapidement possible et d'isoler les patients infectés ou colonisés. Afin d'atteindre cet

100% de spécificité et en cours.

est inquiétante. Elle (surtout intestinale) liées à des réservoirsSud- et Est-

méditerranéens. Seul un antibiogramme systématiquepeut permettre d'identifier les patients infectés

ombre d'épidémies hospitalières, impliquant La répartition des moyens au sein du CNR est en cours de

ondre à cette mission d'investigation épidémiologique.

3.2 Surveillance de la résistance des agents pathogènes aux anti-infectieux

r de nouvelles analyses de population pour et de l'aztréonam chez des

P. aeruginosa

La sensibilité des ERG a été testée par la méthode de diffusion en milieu gélosé selon les icilline, streptomycine,

kanamycine, gentamicine, érythromycine, lincomycine, pristinamycine, lévofloxacine, chloramphénicol, doxycycline, tigécycline, vancomycine, teicoplanine, cotrimoxazole, rifampicine et

icoplanine et de la daptomycine ont été déterminées aecium sont indiqués dans

50

Tableau 10 : Prévalence de la résistance parmi les souches d’ERG appartenant à l’espèce E. faecium

Antibiotique Souches catégorisées de sensibilité intermédiaire ou résistantes (%)

E. faecium vanA (n = 198) E. faecium vanB (n = 68) Ampicilline

Streptomycine Kanamycine Gentamicine

Erythromycine Lincomycine

Pristinamycine Chloramphénicol

Doxycycline Tigécycline Rifampicine Linézolide

98,0 76,3 91,9 57,1 98,5 97,0 6,6 9,6 57,6 0,5 71,7 0,5

100 51,5 97,1 82,4 100 77,9 1,5 4,4 79,4

0 58,8

0

Tableau 11 : CMI des glycopeptides et de la daptomycine des souches d’ERG appartenant à l’espèce E. faecium

Antibiotique CMI (mg/L) E. faecium vanA (n = 201) E. faecium vanB (n = 68)

Vancomycine CMI 50 CMI 90

Intervalle Teicoplanine

CMI 50 CMI 90

Intervalle Daptomycine

CMI 50 CMI 90

Intervalle

≥256 ≥256

1 - ≥256

32 64

0,5 - ≥256 2 4

0,094 - 4

12 96

1 - ≥256

0,75 1

0,12 - 1,5 2 4

0,25 - 4

Parmi les souches de E. faecium résistantes aux glycopeptides testées, toutes étaient résistantes à l’ampicilline sauf quatre. Il est à noter que ces souches sensibles étaient des isolats sporadiques de dépistage et n’ont pas été associées à des épidémies. Ceci confirme l’observation faite les années précédentes que seules les souches résistantes à l’ampicilline sont impliquées dans des épidémies à ERG.

La résistance de haut niveau à la gentamicine était présente chez 63,5 % des souches, avec une différence entre les souches vanA (57,1 %) et vanB (82,4 %). Ce chiffre est inférieur à celui de 2012 (76 %) mais reste plus élevé que ceux des années précédentes (45 % en 2011 et autour de 20 % les années précédentes). Cette prévalence élevée sera à surveiller ultérieurement.

A noter qu’une souche était résistante au linézolide (CMI >32 mg/L) par mutations de l’ARNr 23S tandis qu’une autre l’était à la tigécycline (CMI à 0,75 mg/L). Ces deux souches sont les premières décrites en France, et ce phénomène devra être étroitement surveillé dans les années à venir. Enfin, aucune souche n’avait des CMI de ladaptomycine >4 mg/L.

51


Au cours de l’année 2012 nous avons mis en place un réseau de 18 laboratoires hospitaliers (16 CHU, 2 CH) répartis sur l’ensemble du territoire métropolitain [3 à 5 laboratoires par zone géographique : Ile de France (CHU Kremlin Bicêtre, Georges Pompidou et Antoine Béclère), Nord Est (CHU Nancy, Strasbourg, Besançon et Dijon), Ouest (CHU Tours et Caen, CH Orléans), Rhône-Alpes-Auvergne-Sud (CHU Nice, Grenoble, Saint-Etienne et Clermont-Ferrand, CH Aix-en-Provence), et Sud-Ouest (CHU Bordeaux et Limoges, CH Bayonne)] en vue de réaliser des études prospectives. Parallèlement à ce réseau métropolitain, nous avons organisé un réseau Outre-Mer composé de 5 laboratoires situés à la Réunion (CH Félix Guyon et Groupe Hospitalier Sud Réunion), à la Guadeloupe (CHU Pointe à Pitre), en Guyane (CH de l’Ouest Guyanais Franck Foly) et en Nouvelle Calédonie (Institut Pasteur de Nouvelle Calédonie).

A. B.

Figure 59 : Un réseau représentatif du secteur hospitalier en France métropolitaine (A) et Outre-Mer (B) a été élaboré et mis en place avec le concours de l’InVS

Au sein du réseau métropolitain, nous avons collecté de juin à octobre 2012, 200 souches productrices de BLSE isolées de prélèvements à visée diagnostique (40 par zone géographique). Le but de cette étude est d’avoir une vision nationale de la diffusion des différentes BLSE dans les établissements de Santé et d’identifier d’éventuels clones ou plasmides favorisant la dissémination. Les autres objectifs de l’étude sont (i) l’analyse de la diffusion d’autres mécanismes plasmidiques de résistance aux antibiotiques, en particulier aux aminosides et aux fluoroquinolones, ainsi que (ii) l’étude des facteurs de virulence des souches productrices de BLSE.

A ce jour, les BLSE ont été caractérisées dans l’ensemble des souches ainsi que les mécanismes de résistance plasmidique aux aminosides et aux fluoroquinolones. L’étude du support génétique des principales BLSE est actuellement en cours. Des données préliminaires sont disponibles pour le support plasmidique de CTX-M-15 chez K. pneumoniae et E. cloacae. En parallèle, une étude des facteurs de pathogénicité est réalisée pour les souches E. coli et K. pneumoniae en collaboration avec nos collègues du CNR des E. coli entéropathogènes (Lab. associé, Pr Bonacorsi, CHU Robert Debré).

Cette étude est actuellement complétée par une collecte de souches productrices de BLSE isolées de prélèvements à visée diagnostique dans 4 zonesd'Outre-Mer (Guadeloupe, Guyane, Nouvelle-Calédonie et Réunion). Dans chacune d’entre elles, nos collègues collectent les 100 premières souches

Guadeloupe

Guyane

La Réunion

Nouvelle-Calédonie

isolées entre le 1er septembre 2013 et le 31 aet guadeloupéennes.

Sur les 200 souches étudiées et selon les sensibles à la ceftazidime et seulement 3 % au céfotaxime ou amoxicilline-clavulanate était active sur 28 % des souches et l’association pipéracilline76,5 % d’entre elles. Quatre-vingtce pourcentage atteignant 97,2 à 99,2 % chez très actifs avec des taux de sensibilité variant entre 96 et 99,5 % pour Parmi les aminosides, l’amikacine était lala gentamicine (53,5 %) et la tobramycine (40 %). Seules 20,5 % des souches étaient complètement sensibles aux quinolones et la ciprofloxacine n’était active que reste très active avec seulement 7 % de souches résistantes (2,4 % chez

La majorité des 200 souches collectées en Métropole d’hémocultures (10%). Dix-septelles, les enzymes CTX-M-15 (47,5%), CTXles plus fréquentes, 3% des souches produisaient 2 BLSE. Les espècesE. cloacae représentaient plus de 90 % des isolats. La BLSE CTXespèces (39, 81 et 47% respectivement).

Figure 60 : Distribution des BLSE identifiées au cours de l’enquête nationale BLSE

Figure 62 : Répartition des espèces productrices de BLSE

septembre 2013 et le 31 août 2014. Nous avons déjà reçu des souches réunionnaises

Sur les 200 souches étudiées et selon les critères du CA-SFM et de l’EUCAST, 24,5 % étaient sensibles à la ceftazidime et seulement 3 % au céfotaxime ou à la ceftriaxone. L’association

clavulanate était active sur 28 % des souches et l’association pipéracillinevingt-trois pourcent (83%) des souches étaient sensibles à la céfoxitine,

ce pourcentage atteignant 97,2 à 99,2 % chez K. pneumoniae et E. coli. Les carbapénèmes restaient très actifs avec des taux de sensibilité variant entre 96 et 99,5 % pour l’ertapénème et l’imipénème. Parmi les aminosides, l’amikacine était la molécule la plus fréquemment active (79,5 %) par rapport à, la gentamicine (53,5 %) et la tobramycine (40 %). Seules 20,5 % des souches étaient complètement

la ciprofloxacine n’était active que sur 31,5 % des isolats. La fosfomycine reste très active avec seulement 7 % de souches résistantes (2,4 % chez E. coli).

La majorité des 200 souches collectées en Métropole a été isolée de prélèvements urinaires (66%)sept BLSE ont été identifiées, dont 90% étant de type CTX

15 (47,5%), CTX-M-1 (15 %), CTX-M-14 (15%) et SHV3% des souches produisaient 2 BLSE. Les espèces E. coli

représentaient plus de 90 % des isolats. La BLSE CTX-M-15 était majoritaire dans ces 3 81 et 47% respectivement).

Distribution des BLSE identifiées au BLSE (n=200)

Figure 61 : Répartition des différents types de CTX-M identifiées dans le

nationale BLSE

Répartition des espèces productrices de BLSE dans le cadre de l’enquête nationale (n=200)

52

es souches réunionnaises

SFM et de l’EUCAST, 24,5 % étaient ceftriaxone. L’association

clavulanate était active sur 28 % des souches et l’association pipéracilline-tazobactam sur des souches étaient sensibles à la céfoxitine,

. Les carbapénèmes restaient l’ertapénème et l’imipénème.

plus fréquemment active (79,5 %) par rapport à, la gentamicine (53,5 %) et la tobramycine (40 %). Seules 20,5 % des souches étaient complètement

31,5 % des isolats. La fosfomycine

de prélèvements urinaires (66%) et , dont 90% étant de type CTX-M. Parmi

14 (15%) et SHV-12 (8%) étaient E. coli, K. pneumoniae et

15 était majoritaire dans ces 3

Répartition des différents types de M identifiées dans le cadre de l’enquête

nationale BLSE

dans le cadre de l’enquête nationale BLSE

Figure 63 : Distribution des BLSE dans les trois principales espèces bactériennes isolées au cours d

Nous avons analysé les gènes plasmiAucun gène codant une méthylase n’a été détecté dans ces souches (ni dans les souches envoyées pour expertise). Les enzymes de résistance aux aminosides à large spectre AAC(6’)résistance : Kanamycine, Tobramycine, Amikacine, Netilmicine) et AAC(3’)résistance : Kanamycine, Tobramycine, Gentamicine, Netilmicine) étaient retrouvées chez 45 et 37,5% des souches,respectivement le gène codant l’enzyme bi-fonctionnelle affectant les aminosides et les quinolones AAC(6’)très fréquent (38,5%), tout comme les gènes de type la pompe qepA étaient plus rares (3,5%, 5,5% et 0,5%)

Figure 64 : Distribution des gènes aac(6’)

Distribution des BLSE dans les trois principales espèces bactériennes isolées au cours dl’enquête nationale BLSE

Nous avons analysé les gènes plasmidiques de résistance aux aminosides et aux fluoroquinolones. méthylase n’a été détecté dans ces souches (ni dans les souches envoyées pour

expertise). Les enzymes de résistance aux aminosides à large spectre AAC(6’): Kanamycine, Tobramycine, Amikacine, Netilmicine) et AAC(3’): Kanamycine, Tobramycine, Gentamicine, Netilmicine) étaient retrouvées chez 45 et

respectivement (Figure 64). Concernant la résistance plasmidique aux quinolones, fonctionnelle affectant les aminosides et les quinolones AAC(6’)

très fréquent (38,5%), tout comme les gènes de type qnrB (19,5%). Les gènes codant lus rares (3,5%, 5,5% et 0,5%) (Figure 65).

Distribution des gènes aac(6’)-Ib et aac(3)-II dans le cadre de l’enquête nationale

53

Distribution des BLSE dans les trois principales espèces bactériennes isolées au cours de

ques de résistance aux aminosides et aux fluoroquinolones. méthylase n’a été détecté dans ces souches (ni dans les souches envoyées pour

expertise). Les enzymes de résistance aux aminosides à large spectre AAC(6’)-Ib (phénotype de : Kanamycine, Tobramycine, Amikacine, Netilmicine) et AAC(3’)-II (phénotype de : Kanamycine, Tobramycine, Gentamicine, Netilmicine) étaient retrouvées chez 45 et

cernant la résistance plasmidique aux quinolones, fonctionnelle affectant les aminosides et les quinolones AAC(6’)-Ibcr était

(19,5%). Les gènes codant qnrA et qnrS et

II dans le cadre de l’enquête nationale BLSE

Les gènes aac(6’)-Ibcr et qnr étaient les plus fréquents.les plus fréquents.

Figure 65 : Distribution des mécanismes plasmidiques de résistance aux fluoroquinolones

Les données préliminaires portant sur le support génétique des BLSE montrent la présence de deux familles de plasmides codant CTXd’incompatibilité différents et présentant un haut poids molécmoléculaire (~50kb). Chez E. cloacaedifférents de haut poids moléculaire (>150 kb) et appartenant à un groupe d’incompatibilité réputé adapté au fond génétique de cette diffusion de CTX-M-15 non envisagée jusqu’alors.

3.3 Participation aux réseaux de surveillance, nationaux et internationaux


Le CNR participe à l’étude EuSCAPE (Enterobacteriaceae in Europe) en collaboration avec l’InVS et l’ECDC. Cette étude a pour objectifs- Etablir un réseau européen de laboratoires experts pour la détection des EPC- Récolter des données européennes- Mettre en place les techniques les pLe laboratoire de Bicêtre a été désigné centreréférent national dans cette enquête.

étaient les plus fréquents.Parmi les gènes qnr, ceux de type

Distribution des mécanismes plasmidiques de résistance aux fluoroquinolones

Les données préliminaires portant sur le support génétique des BLSE montrent la présence de deux familles de plasmides codant CTX-M-15 chez K. pneumoniae ; des plasmides appartenant à 2 groupes d’incompatibilité différents et présentant un haut poids moléculaire (~160Kb)

E. cloacae, le gène de cette même BLSE diffuse via des plasmides différents de haut poids moléculaire (>150 kb) et appartenant à un groupe d’incompatibilité réputé adapté au fond génétique de cette espèce. Ces données révèlent une complexité des mécanismes de

15 non envisagée jusqu’alors.


. Laboratoire de Bicêtre

participe à l’étude EuSCAPE (European Survey on Carbapenemaseen collaboration avec l’InVS et l’ECDC. Cette étude a pour objectifs

Etablir un réseau européen de laboratoires experts pour la détection des EPC ; Récolter des données européennes de prévalence des EPC dans les 40 pays participantsMettre en place les techniques les plus adaptées pour le diagnostic rapide.

Le laboratoire de Bicêtre a été désigné centreréférent national dans cette enquête.

54

, ceux de type qnrB étaient

Distribution des mécanismes plasmidiques de résistance aux fluoroquinolones

Les données préliminaires portant sur le support génétique des BLSE montrent la présence de deux ; des plasmides appartenant à 2 groupes

ulaire (~160Kb) et un bas poids , le gène de cette même BLSE diffuse via des plasmides

différents de haut poids moléculaire (>150 kb) et appartenant à un groupe d’incompatibilité réputé espèce. Ces données révèlent une complexité des mécanismes de


opean Survey on Carbapenemase-Producing en collaboration avec l’InVS et l’ECDC. Cette étude a pour objectifs :

de prévalence des EPC dans les 40 pays participants ;

55

3.4 Enquêtes ou études ponctuelles concourant à la surveillance


Le CNR a été sollicité par différents laboratoires pour établir la clonalité d'isolats de P. aeruginosa et de A. baumannii. Une étude par MLVA a été réalisée pour 47 souches de P. aeruginosa et 58 souches de A. baumanniiau cours d’épidémies locales ainsi que dans le cadrede la surveillance par le CNR de la diffusion de certaines enzymes au niveau national.


Nous avons collaboré à une étude menée par l’InVS sur les souches d’Entérobactéries isolées de prélèvements urinaires dans un contexte d’infection communautaire stricte. Dans le cadre de cette étude, nous avons analysé 7 souches de E. coli productrices de BLSE. Les analyses réalisées portaient sur l’identification des BLSE produites, la comparaison des souches par MLST, la détermination du phylogroupe, et la détection des résistances plasmidiques aux fluoroquinolones. Deux d’entre elles produisaient une CTX-M-15, 3 une CTX-M-1 et 2 une CTX-M-14. Elles appartenaient toutes à des ST (sequencetype ) différents et aucune n’appartenait au ST131 qui a été associé à des souches épidémiques productrices de BLSE CTX-M-15. Deux produisaient l’AAC(6’)-Ib-cr et aucune ne possédait de gène codant une protéine de type Qnr.


Des analyses génotypiques ont été réalisées à la demande de l’InVS pour explorer des phénomènes épidémiques.

56

4. ALERTE

4.1 Procédure d'alerte de l'InVS et de la DGS devant un phénomène

anormal


Toutes les carbapénèmases détectées chez P. aeruginosa ou A. baumannii sont signalées à l’InVS par mail, parallèlement à l’envoi du compte-rendu d'analyse au laboratoire demandeur. A cette occasion, des renseignements cliniques (âge et sexe du patient, service d’hospitalisation, site d’isolement de la souche et notion de voyage éventuelle) sont communiqués à l’InVS.


Une procédure d’alerte en temps réel a été mise en place entre le CNR et l’InVS. En effet, le CNR établit un rapport hebdomadaire des nouveaux cas d’EPC. Ce rapport permet à l’InVS d'avoir un recueil plus exhaustif des déclarations.

4.2 Evénements détectés et investigués


Dans le cadre de la diffusion épidémique de souches de P. aeruginosa produisant une carbapénèmase de type GES-5 dans le Sud-Ouest de la France (6 souches reçues entre juin et septembre 2013), un signalement au CCLIN Sud-Ouest a été effectué.


La procédure en place d’alerte en temps réel a permis à plusieurs reprises au cours de l’année 2013 d’identifier des épidémies débutantes dans divers établissements de Santé et, ainsi, de contribuer à leur contrôle et à leur résolution.

57

5. ACTIVITES D ' INFORMATION , DE FORMATION ET DE CONSEIL

5.1 Enseignements, formations aux professionnels de santé, stagiaires


Le CNR a reçu en stage pendant 1 mois le docteur Amina Azzam (maître de conférence) pour l'aider à analyser des souches de A. baumanniiisolées au CH de Tizi Ouzou (Algérie)


- Participation aux travaux du CA-SFM (recommandations sur les tests de sensibilité aux antibiotiques et leur interprétation). - Formation Bio-Rad « Evolution des résistances chez les coques à Gram positif », Marnes-la-Coquette, 19 Mars 2013. - Accueil de 7 stagiaires d’école professionnelle (4 BTS et 3 IUT).


R. Beyrouthy : doctorante libanaise en thèse de Sciences (thèse en cotutelle) étudiant la diffusion de souches productrices de BLSE et de carbapénèmases dans le Nord Liban.


- ECDC Stockholm; comité de direction et scientifique d'une étude sur la prévalence de la diffusion des souches productrices de carbapénèmases et multirésistantes. Rôle central d'expert dans l'indication et le choix des techniques diagnostiques. Participation à un Workshop pratique (Grèce, septembre 2013) qui a permis, notamment, de proposer aux collègues européens les techniques les plus adaptées pour ce diagnostic rapide. - Diffusion épidémique des souches productrices de carbapénèmases à l'AP-HP de Paris; étude de prévalence.

5.2 Guides élaborés


Participation à l’élaboration de recommandations nationales concernant les BHRe (Bactéries hautement résistantes émergentes) sous la direction de l’HAS.


Elaboration d'une note technique concernant les modalités de diagnostic et de dépistage des EPC destinée aux laboratoires de microbiologie mise en ligne sur le site web du CNR. Plusieurs articles

58

publiés ont souligné notre stratégie de détection des patients infectés ou porteurs de souches carbapénèmase positives.

5.3 Modalités de diffusion des données de surveillance

5.3.1. Conférences


P. Plésiat : Multirésistance chez Pseudomonas aeruginosa : une diffusion clonale internationale. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot. Résistance adaptative aux polymyxines chez Pseudomonas aeruginosa. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot. Rôle de l'opéron arn dans la résistance acquise aux polymyxines chez P. aeruginosa. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.


Actualités épidémiologiques de la résistance aux antibiotiques chez les staphylocoques. Conférence AstraZeneca, Caen, 7 Novembre 2013.

Vingt-cinq ans de vie commune avec les ERV : est-il temps de divorcer ? Conférence au CHRU de Lille, 19 Février 2013.

"Evolution de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram positif : Entérocoques". 9e Congrès de la SFM, Lille, 7-8 Février 2013.

5.3.2. Site web

En 2013, plus de 7000 visiteurs (2/3 de nouveaux visiteurs) ont consulté le site internet du CNR (cnr-resistance-antibiotiques.fr) (1663 visiteurs en 2012).

Figure 66 : Statistiques de fréquentation du site internet du CNR (google analytics)

59

A côté des 80 % de visiteurs français, 20 % de visiteurs étrangers ont consulté le site internet, avec une représentation aussi bien européenne qu’internationale.

Figure 67 : Origine géographique des visiteurs du site internet du CNR

Une photothèque réunissant les principaux phénotypes de résistance observés chez les entérobactéries, P. aeruginosa, A. baumannii et les espèces du genre Enterococcussera disponible courant de l’année 2014.

5.4 Activités de conseil aux professionnels


Patrick Plésiat a participé à la ré-actualisation des recommandations du CA-SFM pour la réalisation et l'interprétation de l'antibiogramme de P. aeruginosa et A. baumannii.Une dizaine d'appels téléphoniques sont reçus chaque semaine pour des demandes de renseignements pratiques et conseils thérpeutiques.


Conseils aux professionnels, qui s’effectuent essentiellement par contact téléphonique (numéro d’appel disponible du lundi au vendredi). Environ 3 à 6 appels téléphoniques par semaine.


Nous recevons 5 à 10 appels téléphoniques par semaine (0473754920, n° du secrétariat CNR) ou par mail ([email protected]) pour des avis ou des conseils concernant la résistance aux antibiotiques. Les différents contacts sont listés et gérés conformément à notre système de management de la qualité.

60


Le laboratoire répond à des demandes quotidiennes de conseil diagnostique voire thérapeutiquepour la prise en charge des patients infectés ou colonisés.

5.5 Expertises auprès des instances sanitaires


Patrick Plésiat a participé au comité de suivi du plan d'alerte sur les antibiotiques lancé par la DGS ainsi qu'un groupe de travail dans le cadre de l'ANSM.

61

6. TRAVAUX DE RECHERCHE ET PUBLICATIONS EN LIEN DIRECT AVEC

L 'ACTIVITE DU CNR

6.1 Activités de recherche en cours ou récemment publiées


� Développement de la résistance à la colistine chez P. aeruginosa

L'utilisation croissante des polymyxines dans le traitement des infections à Pseudomonas aeruginosaMDR et XDR a favorisé l’émergence de souches résistantes renfermant des mutations dans des systèmes de régulation à deux composants (PmrAB, ParRS, PhoPQ et CprRS). Ces mutations conduisent à la surexpression d'un opéron,appelé arn, dont la fonction est de neutraliser les charges négatives portées par les résidus phosphates des LPS afin de rendre la membrane externe imperméable aux peptides cationiques. Ce travail ré-évalue le rôle de l'opéron arn dans l'émergence de la résistance acquise à la colistine. La totalité de l'opéron arn a été retiré de la souche de référence PAO1 par une PCR chevauchante suivie d'une recombinaison homologue. La souche parentale et son mutant (PAO1∆arn) ont été cultivés en présencede concentrations croissantes de colistine (3 à 32 µg/mL) afin de sélectionner des mutants stables. Après détermination de la CMI de la colistine, les gènes parR, parS, pmrB et phoQ ont été amplifiés et séquencés. Alors que des mutants résistants ont été sélectionnés facilement (3.10-7 à 4 µg/mL et 6.10-8 à 16 µg/mL) chez la souche PAO1 jusqu’à une concentration de 16 µg/mL (soit 8 fois la CMI), aucun clone n'a été obtenuavec PAO1∆arn. Nous avons pu observer que les mutants issus de PAO1 présentaient une résistance modérée (16 µg/mL) à forte (64 µg/mL) à la colistine indépendante de la concentration utilisée pour la sélection. Des altérations dans les protéines PhoQ (délétions) et PmrB (substitutions) ont été identifiées chez 10 mutants ainsi que deux isolats cliniques. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que des mutations localisées dans le domaine HAMP de la protéine PmrB étaient associées à une augmentation de la sensibilité aux β-lactamines. En effet, la complémentation du mutant PAO1∆pmrAB par l'opéron pmrAB muté aboutit à une augmentation de la sensibilité de 2 à 4 fois à la pipéracilline/tazobactam, à la ceftazidime et aux carbapénèmes. Le mécanisme associé reste à élucider. Toutefois, ces altérations présentent un coût physiologique important pour la cellule.

La modification enzymatique des LPS par l'opéron arn joue un rôle majeur dans l'émergence de la résistance aux polymyxines chez P. aeruginosa aussi bien in vitro que in vivo. L'altération d'un seul système à deux composants suffit à engendrer un haut niveau de résistance à ces antibiotiques ainsi qu'aux peptides antimicrobiens. L'utilisation d'inhibiteurs bloquant la modification des LPS pourrait en théorie prévenir ce phénomène et éviter l'apparition de souches toto-résistantes (PDR).

� Variants AmpC chez P. aeruginosa

La surexpression stable, sous l'effet de mutations, du gène codant la β-lactamase naturelle AmpC constitue le principal mécanisme de résistance de P. aeruginosa aux β-lactamines, à l'exception des carbapénèmes. L'activité des pénicillines, des céphalosporines et des monobactams est affectée de façon sensiblement égale par la dérégulation de l'enzyme. Cependant, l'analyse systématique du profil

62

de résistance des mutants “déréprimés” reçus par le CNR a révélé des différences d'activité parfois importantes entre les β-lactamines chez des certaines souches, ne pouvant s'expliquer par des différences de niveau de production de la β-lactamase. Des mutations (variations d'acide aminé, délétions) dans 5 régions de la protéine AmpC ont été identifiées par séquençage du gène blaAmpC chez 39 de ces souches. La surexpression après re-clonage de 5 variants blaAmpC chez des souches de référence sensibles, E. coli et P. aeruginosa PAO1, a démontré que certaines mutations augmentent l'activité hydrolytique de l'enzyme vis-à-vis des céphalosporines et permettent à P. aeruginosa d'atteindre des hauts niveaux de résistance à la ceftazidime. Une fois le clonage des autres gènes terminé, les caractéristiques enzymatiques de l'ensemble des variants AmpC seront établies et comparées. L'analyse structurale de certaines de ces protéines est envisagée en collaboration avec l'équipe CNRS “Laboratoire de cristallograpie et RMN biologiques” (UMR 8015) de Paris V (dir. Isabelle Broutin). Il s'agit donc d'un nouveau mécanisme par lequel P. aeruginosa parvient à s'adapter à des molécules fréquemment utilisées en thérapeutique.


� Global transcriptomic analysis (RNA-seq) of Enterococcus faecium in response to antibiotics

Introduction: E. faecium strains multi-resistant to antibiotics is become a serious problem in clinical practice. Sub-inhibitory concentrations (SICs) of antibiotics do not visually influence the bacterial growth kinetics but they can alter expression of major genes. Such concentrations may be observed in vivo, e.g. when the antibiotic weakly diffuse at the infection site or during the antibiotic exposure on bacterial flora of the gastrointestinal tract. The study’s aim was to determine the impact of SICs of antibiotics on the expression of genes of Enterococcus faecium.

Methods: A VREF member of the CC17, the vanB-positive E. faecium Aus0004 entirely sequenced and annotated, was used. Daptomycin and ciprofloxacin were tested at a concentration of 0.5mg/L and 0.38mg/L, respectively and separately. Transcriptomic analysis was performed by strand-specific RNA-seq (HiSeq 2500, Illumina) in the absence or presence of antibiotics. The reliability of RNA-seq was further validated by qRT-PCR experiments.

Results: 15.83% and 5.8% of the E. faecium genome were dysregulated by ciprofloxacin and daptomycin, respectively. In presence of ciprofloxacin, EFAU004_02294 encoded a protein that was a homologue of Qnr proteins involved in quinolone resistance in Gram-negative bacilli. A common effect of these antibiotics was observed with the induction of the EFAU004_00691 gene coding for a transcriptional regulator of the MerR family, suspected to be involved in the stress antibiotic response, and the EFAU004_02292 gene coding for the collagen adhesin Acm, a well-known virulence factor in E. faecium responsible for higher adhesion capabilities. Down-regulated genes were mainly genes involved in intermediary energy metabolism.

Conclusion: Further investigations are in progress: study of the EFAU004_02294 gene (regulation mechanisms), confirmation of the antibiotic-mediated acm induction and full characterization of the MerR-family transcriptional regulator (RNA-seq/ChIP-seq). The results of this study will provide elements for a better understanding of the mechanisms of adaptation and resistance to daptomycin and ciprofloxacin.

63

� FepA, a novel MATE efflux pump responsible for fluoroquinolone resistance in Listeria monocytogenes

Introduction: Listeria monocytogenes is intrinsically susceptible to fluoroquinolones (FQs). However, FQ resistance has been rarely reported, primarily due to active efflux through overexpression of the lde gene coding for a MFS transporter.

Methods: Isogenic Listeria monocytogenes clinical isolates BM4715 and BM4716, respectively susceptible and resistant to fluoroquinolones, were studied. MICs of norfloxacin (NOR) and ciprofloxacin (CIP) were determined in the presence or in the absence of reserpine (10 µg/ml). Whole-genome sequencing (WGS) of the strains followed by comparative genomic analysis was performed using using an Illumina MiSeq Benchtop sequencer. Gene expression was quantified by qRT-PCR while trans-complementation was done using the shuttle vector pAT18.

Results: Strain BM4715 was susceptible to NOR (MIC, 4 µg/ml) and CIP (MIC, 0.5 µg/ml) whereas BM4716 was highly resistant to both drugs (MICs 128 and 32 µg/ml, respectively). Reserpine was responsible for a 16-fold decrease in both NOR and CIP MICs against BM4716 suggesting efflux associated resistance. WGS revealed a single point mutation in the gene for a transcriptional regulator, designated fepR (for fluoroquinolone efflux protein regulator) belonging to the TetR family. The frame-shift mutation was responsible for the introduction of a premature stop codon resulting in an inactive truncated protein. Just downstream from fepR, the structural gene for an efflux pump of the MATE family (named FepA) was identified. qRT-PCR demonstrated that fepA expression was more than 50-fold higher in BM4716 than in BM4715. The wild-type fepR gene from BM4715 was cloned in pAT18 and electrotransformed into L. monocytogenes BM4716; this trans-complementation restored a susceptible phenotype to the host.

Conclusion: We demonstrated that overexpression of the new MATE efflux pump FepA is responsible for FQ resistance in L. monocytogenes and secondary to inactivation of the FepR repressor.


Nous étudions actuellement le support génétique et l’activité de nouvelles β-lactamases, notamment une nouvelle enzyme type OXY et une nouvelle BLSE de la famille TEM. L’étude enzymatique de ces 2 nouvelles enzymes est actuellement en cours.

Des travaux portent également sur les relations structure-fonction au sein des oxacillinases à large spectre. La détermination de la structure tridimensionnelle, la modélisation moléculaire et des travaux de mutagenèse dirigée ont permis d’expliquer le comportement des enzymes étudiées et notamment d’observer une hydrolyse de la ceftazidime liée à une modification du processus catalytique.

L’étude des souches de K. pneumoniae productrices de céphalosporinase plasmidique est actuellement en cours, notamment au travers de l’étude de souches épidémiques isolées en 2013 au CHU de Toulouse, en association avec le Dr Grare. Des premiers résultats ont été présentés à l’ICAAC sous format affiché en septembre 2013. Des travaux concernant la virulence des souches sont également en cours en collaboration avec le Dr Hennequin, appartenant à l’équipe UMR CNRS 6023 LMGE (Université Blaise Pascal).

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L’étude des 200 souches de l’étude nationale est en cours (voir précédemment), l’étude de la virulence des souches d’E. coli est actuellement poursuivie par nos collègues du CNR des E. coli (laboratoire associé du Pr Bonacorsi). Ce travail a fait l’objet d’un poster à la RICAI 2013.

Dans le cadre d’une collaboration franco-libanaise, nous travaillons également sur des souches productrices de carbapénèmase isolées au Liban. Le travail est in press dans la revue « Journal of Antimicrobial and Chemothrapy » (résumé ci-dessous) :

Objectives: To investigate the resistance to carbapenems in enterobacteria and the underlying resistance mechanisms in North Lebanon between 2008 and 2012.

Methods: 2767 clinical isolates collected at hospital and 183 faecal samples collected in the community were screened. Bacteria were assigned to clonal lineages and pathovars by PFGE, MLST and PCR for virulence determinants. Carbapenemase genes, the genetic environment, and associated resistance genes were characterized by molecular approaches and sequencing.

Results: The prevalence of carbapenem resistance increased from 0.4% in 2008-10 to 1.6% in 2012. 88% of the carbapenems resistant isolates produced OXA-48 carbapenemase, which was scattered among seven enterobacteria species. E. coli producer prevalence increased up to 73% in clinical resistant isolates in 2012 and was the only species identified during the faecal carriage screening among non-hospitalized subjects (prevalence in community: 1.5%). The analysis of isolates did not reveal a significant clonal diffusion of OXA-48-producing Klebsiella pneumonia and Escherichia coli. blaOXA-48was mainly located within Tn1999.2 transposons , which were insertedin E. colichromosome or in ~50kb, ~62kb or ~85kb plasmids. The plasmids and the chromosomal inserts were related to pOXA-48a. While most plasmids lacked other resistance genes, E. coli isolates frequently harboured plasmid-mediated resistance genes to quinolones and/or aminoglycosides.

Conclusions: Horizontal transfer of related plasmids has facilitated the spread of OXA-48 into multiple strains of several Enterobacteriaceae species including multi-resistant E. coli isolates. Their clonal diversity and the presence of faecal carriers in the community suggest an endemic spread of OXA-48.

6.2 Publications et communications

6.2.1. Publications nationales


Fournier D, C. Chirouze, J. Leroy, P. Cholley, D. Talon, P. Plésiat, X. Bertrand. Alternatives to carbapenems in ESBL-producing Escherichia coli infections. Médecine Maladies Infectieuses. 2013. 43:62-6.


Cattoir V. Infections à bacilles à Gram négatif résistants : nouvelles molécules, nouvelles associations. J. Anti-Infectieux. 2013; In press.

65

Margat E, Dargère S, Daurel C, Fines-Guyon M, Michon J, Verdon R, Cattoir V. Endocardite à Staphylococcus aureus communautaire résistant à la méticilline appartenant au clone émergent Géraldine: un diagnostic microbiologique difficile. Med Mal Infect. 2013; 43:299-301.

6.2.2. Publications internationales


Jeannot K, D. Fournier, E. Müller, P. Cholley, P. Plésiat. Clonal dissemination of Pseudomonas aeruginosa isolates producing extended-spectrum β-lactamase SHV-2a. Journal of Clinical Microbiology. 2013.51:673-5.

Llanes C, C. Pourcel, C. Richardot, P. Plésiat, G. Fichant, JD. Cavallo, A. Mérens; GERPA Study Group.Diversity of β-lactam resistance mechanisms in cystic fibrosis isolates of Pseudomonas aeruginosa: a French multicentre study. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2013. 68:1763-71.

Milan O, L. Debroize, X. Bertrand,P. Plésiat, AS.Valentin, R. Quentin, N. Van der Mee-Marquet. Difficult-to-detect carbapenem-resistant IMP13-producing P. aeruginosa: experience feedback concerning a cluster of urinary tract infections at a surgical clinic in France. Antimicrobial Resistance Infection Control.2013. 2:12.

Armand-Lefèvre L, C. Angebault, F. Barbier, E. Hamelet, G. Defrance, E. Ruppé, R. Bronchard, R. Lepeule, JC. Lucet, A El Mniai, M. Wolff, P. Montravers, P. Plésiat, A. Andremont. Emergence of

imipenem-resistant gram-negative bacilli in intestinal flora of intensive care patients.Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2013. 57:1488-95.

Fournier D, C. Richardot, E. Müller, M. Robert-Nicoud, C. Llanes, P. Plésiat, K. Jeannot. Complexity of resistance mechanisms to imipenem in intensive care unit strains of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2013. 68: 1772-80.

Janvier F, K. Jeannot, S. Tessé, M. Robert-Nicoud, H. Delacour, C. Rapp, A. Mérens. Molecular characterization of blaNDM-1 in a sequence type 235 Pseudomonas aeruginosa isolate

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Jeannot K, N. Guessennd, D. Fournier, E. Müller, V. Gbonon, P. Plésiat.Outbreak ofmetallo-ß-lactamase VIM-2 positive strains of Pseudomonas aeruginosa in Ivory Coast Journal of Antimicrobial Chemotherapy.2013. 68:2952-8

Fournier D, P. Garnier, K. Jeannot, A. Mille, AS. Gomez, P. Plésiat. A convenient method to screen

for carbapenemase-producing Pseudomonas aeruginosa.Journal of Clinical Microbiology. 2013. 51:3846-8.

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Schlusselhuber M, Torelli R, Martini C, Leippe M,Cattoir V, Leclercq R, Laugier C, Grotzinger J, Sanguinetti M, Cauchard J. 2013. The equine antimicrobial peptide eCATH1 is effective against the facultative intracellular pathogen Rhodococcus equi in mice. Antimicrob Agents Chemother.57:4615-4621.

Gravey F, Galopin S, Grall N, Auzou M, Andremont A, Leclercq R, Cattoir V. 2013. Lincosamide resistance mediated by lnu(C) (L phenotype) in a Streptococcus anginosus clinical isolate. J Antimicrob Chemother 68:2464-2467.

Parienti JJ, Cattoir V. 2013. Daily chlorhexidine bathing and hospital-acquired infection. N Engl J Med 368:2331.

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Cattoir V, Leclercq R. 2013. Twenty-five years of shared life with vancomycin-resistant enterococci: is it time to divorce? J Antimicrob Chemother 68:731-742.


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6.2.3. Communication nationales


D. Fournier, K. Jeannot, E. Müller, P. Plésiat. Diffusion en France d'un clone de Pseudomonas aeruginosa (PA) produisant la β-lactamase à spectre élargi (BLSE) GES-1 ou son variant, la carbapénèmase GES-5. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

68

D. Fournier, P. Garnier, A. Mille, K. Jeannot, P. Plésiat. Imipénème-cloxacilline : un tandem efficace pour la détection des carbapénèmases chez Pseudomonas aeruginosa (PA). 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

H. Gbaguidi-Haore, F. Larosa, D. Fournier,P. Bailly,P. Cholley, D. Hocquet,P. Plésiat, E. Deconinck,X. Bertrand. Épidémie de Pseudomonas aeruginosa producteur de carbapénémase (IMP-19 ou IMP-29) en hématologie adulte : contribution importante de l’environnement inerte dans la transmission de ce pathogène. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

C. Bréchet, C. Muller, D. Fournier, P. Plésiat. Polymorphisme de la protéine PcrV chez Pseudomonas aeruginosa : implications épidémiologiques et thérapeutiques. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

F. Janvier, K. Jeannot, S. Tessé, M. Robert-Nicoud, H. Delacour, C. Flateau, C. Rapp, A. Mérens. Première description de Pseudomonas aeruginosa producteur de metallo-βlactamase NDM-1 en France et caractérisation de son environnement génétique. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

D. Fournier, K. Jeannot, E. Müller, P. Plésiat. Diffusion en France d'un clone de Pseudomonas aeruginosa (PA) produisant la β-lactamase à spectre élargi (BLSE) GES-1 ou son variant, la carbapénèmase GES-5. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot. Résistance adaptative aux polymyxines chez Pseudomonas aeruginosa. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

A. Noguès, T. Dutruel, P. Plésiat, K. Jeannot.Rôle de l'opéron arn dans la résistance acquise aux polymyxines chez Pseudomonas aeruginosa. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013, Paris.

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C. Richardot, A. Mérens, L. Monluzen, I. Broutin, P. Plésiat, C. Llanes. Pseudomonas aeruginosa contre carbapénèmes : implication de la porine OprD. 9ème Congrès de la Société Française de Microbiologie. 7-8 Fev. 2013, Lille.


Sinel C, Cattoir V. Étude transcriptomique de la réponse d'Enterococcus faecium à des concentrations sub-inhibitrices d'antibiotiques. 33e RICAI, Paris-La Défense, France, 21-22 Novembre 2013.

Isnard C, Guérin F, Lienhard R, Auzou M, Cattoir V. Alloscardovia omnicolens, uropathogène émergent : méthodes d’identification et sensibilité aux antibiotiques. 33e RICAI, Paris-La Défense, France, 21-22 Novembre 2013.

Lesteven C, Manouri M, Devere N, Guillois B, Cattoir V, Le Coutour X, Borgey F, Thibon P. Utilisation des graphiques CUSUM pour la détection précoce des épidémies d’infections

69

à Staphylococcus aureus sensible à la méticilline en néonatologie. 33e RICAI, Paris-La Défense, France, 21-22 Novembre 2013.

Lesteven C, Devere N, Le Neindre B, Guillois B, Fines M, Cattoir V, Borgey F, Thibon P, Le Coutour X. Gestion d’une épidémie de Staphylococcus aureus sensible à la méticilline en néonatologie : Intérêt du dépistage des enfants, des parents et des soignants. 33ème RICAI, Paris-La Défense, France, 21-22 Novembre 2013.

Fines-Guyon M, Galopin S, Cattoir V. Etude comparative in vitro de 3 géloses sélectives chromogènes pour la détection des entérocoques résistants aux glycopeptides. 33ème RICAI, Paris-La Défense, France, 21-22 Novembre 2013.

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Baud O, Aumeran C, Badrikian L, Robin F, Gourdon F, Lesens O, Traore O. Description et traitement probabiliste des bactériémies à BMR dans un CHU. JNI2013 D03.

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6.2.4. Communication internationales


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71

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Guérin F, Galimand M, Courvalin P, Cattoir V. Identification of novel MATE efflux pump FepA responsible for fluoroquinolone resistance in Listeria monocytogenes. 53th ICAAC, Denver, CO, 10-13 September 2013.

Gravey F, Galopin S, Grall N, Auzou M, Andremont A, Leclercq R, Cattoir V. Characterization of lincosamide resistance (L phenotype) in a Streptococcus anginosus clinical isolate. 23th ECCMID, Berlin, Germany, 27-30 April 2013.

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Bonnin R.A., Poirel L., Cuzon G., Nordmann P. (P) Transfer of a single NDM-1-producing A. baumanniii clone from North Africa to France. 23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

Bonnin R.A., Naas T., Bonomo R.A., Nordmann P. (P) Insight into the resistance of a carbapenem-resistant K. pneumoniae harbouring the carbapenemase gene, blaKPC-2, by high-throughtput genome sequencing. 23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

Jamal W., Rotimi V.O., Albert M.J., Khodakhast F., Poirel L. (O) High prevalence of VIM-4 metallo-ßlactamase encoding gene amoung carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in Kuwait. (O) 23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

Valverde A., Gijon S., Morosini M.I., Ruiz-Garbajosa P., Tato M., Porrero M.C., Nordmann P. (O) Supercarba medium and Carba NP test: the perfect couple for the assessment of carbapenemase-procucing Enterobacteriaceae?23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

Van de Sand-Bruinsma N., Poirel L. (O) The worldwide spread of metallo-ß-lactamases in Enterobacteriaceae.23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

Roger-Dalbert C., Labourdette R., Brochu V., Lapointe S., Roy S., Galarmeau H., Bouchy P., Nordmann P., Fortineau N., Girlich D. (P) First clinical evaluation of the BD MAXTM CRE RUO assay on rectal swabs from intensive care unit patients. 23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

Poirel L., Bernabeu S., Nordmann P. (P) High rate of 16s rRNA methylase gene among NDM-1-producing enterobacterial isolates, and the emergence of the new RmtF enzyme.53th ICAAC, Denver, USA, 2013.

73

Poirel P., Potron A., Nordmann P. (P) Deciphering the genetic bases sustaining the successful spread of the blaOXA-48 carbapenemase gene.53th ICAAC, Denver, USA, 2013.

Naas T., Cuzon G., Levy M., Nordmann P. (P) IMI-1 producing Enterobactercloacae clinical isolate from Tahiti, French Polynesia. 53th ICAAC, Denver, USA, 2013.

Dortet L., Poirel L., Nordmann P. Identification in ProteusMirabilis of a Salmonella genomic island containing the blaNDM-1 carbapenemase gene together with the ESBL-encoding gene blaVEB-6.53th ICAAC, Denver, USA, 2013.

Dortet L., Poirel L., Nordmann P. (P) Rapid detection of carbapenemase-producing Acinetobacter spp. 53th ICAAC, Denver, USA, 2013.

Dortet L., Bréchard L., Poirel L., Nordmann P. (P) Rapid Detection of KPC-Producing Enterobacteriaceae from Spiked Blood Cultures.53th ICAAC, Denver, USA, 2013.

Wiskirchen D.E., Nordmann P., Crandon J.L., Nicolau D.P. (P) Efficacy of Humanized Antibiotic Exposures Against Enterobacteriaceae producing the OXA-48 carbapenemase in a murine infection model. 53th ICAAC, Denver, USA, 2013.

Wiskirchen D.E., Nordmann P., Crandon J.L., Nicolau D.P. (P) In vivo efficacy of humanized regimens of carbapenems and comparators against NDM-1 producing Enterobacteriaceae. 53th

ICAAC, Denver, USA, 2013.

Dortet L, Poirel L, Nordmann P. Rapid detection of ESBL producers from blood cultures; a prospective study.17th International Congress of Infetious Disease, Le Cap, Afrique du Sud , 2014

6.2.5. Conférences sur invitation


D.Fournier Actualisation des connaissances sur l’antibiogramme. Journée ProBioQual. 24 Oct 2013. Lyon

P. Plésiat Multirésistance chez Pseudomonas aeruginosa : une diffusion clonale internationale. 33ème Congrès de Chimiothérapie Anti-infectieuse (RICAI). 27-28 Nov. 2013. Paris.

K. Jeannot Two component regulatory systems in P. aeruginosa involved in resistance to polymyxins 53rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 10-13rd Sept. 2013. Denver, USA.

P. Plésiat The time of XDR Pseudomonas 14th International Conference on Pseudomonas.07-11th Sept 2013. Lausanne, Suisse.

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D.Fournier Journée Col.Bvh. Mise en évidence des résistances chez Pseudomonas et Acinetobacter 31 jan 2013. Lyon.


Cattoir V. "Prévalence et épidémiologie des entérocoques résistants aux glycopeptides en France". 10e Congrès de la SFM, Paris, France, 31 mars-1er avril 2014.

Cattoir V. "Infections à Actinobaculum spp. : un pathogène urinaire sous-estimé". 33e RICAI, Paris-La Défense, France, 21-22 Novembre 2013.

Cattoir V. "L’antibiogramme". 33e RICAI, Paris-La Défense, France, 21-22 Novembre 2013.

Cattoir V. Infections à bacilles à Gram négatif résistants : nouvelles molécules, nouvelles associations. 56e Journée de l’hôpital Claude Bernard, Paris, France, 14 Novembre 2013.

Cattoir V. "Actinobaculum schaalii: an emerging uropathogen". Actinobaculum schaalii symposium, Copenhagen, Denmark, 22 Feb 2013.

Cattoir V. "Evolution de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram positif : Entérocoques". 9e Congrès de la SFM, Lille, France, 7-8 Février 2013.


Dortet L. Epidémiologie et méthodes de détection des entérobactéries productrices de carbapénémases et screening des patients porteurs. 2013. 9ème symposium d’infectiologie liègeois. Liège, Belgique.

Nordmann P. Worldwide spread of carbapenemase in enterobacteriaeceae and their control. 23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

Nordmann P. Emerging Resistance to Antibiotics. FEMS Congress Microbiology, Dresden Allemagne, 2013.

Nordmann P. Carbapenemase in Enterobacteriaeceae, the worldwide issue.17th International Congress of Infetious Disease, Le Cap, Afrique du Sud, 2014.

Poirel L. Up-to-date: where are we going with novel ß-lactamase inhibitors? 23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Allemagne, 2013.

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7. COOPERATION AVEC LES LABORATOIRES DE SANTE ANIMALE , D'HYGIENE

ALIMENTAIRE , ENVIRONNEMENTAUX

7.1 Coopérations


Le laboratoire travaille étroitement avec le laboratoire Labéo, regroupement des trois laboratoires départementaux spécialisés dans la santé animale, l’environnement et l’alimentation. Nous travaillons notamment avec le Dr. Albetine Léon-Seck, chef de Service du pôle Recherche en Microbiologie et Biologie Moléculaire Vétérinaire, qui est aussi rattachée à notre équipe de recherche EA4655. Des travaux sont notamment menés conjointement sur la résistance aux antibiotiques chez l’animal, notamment dans la filière équine.


Des souches d'entérobactériesd'origine animale ont été analysées ponctuellement pour recherche de carbapénèmase.

7.2 Echanges techniques


Le CNR a participé à une réunion du groupement technique vétérinaire de Bourgogne sur les problèmes de résistance aux antibiotiques en médecine humaine et vétérinaire : conférence « Regards croisés sur l’antibio-résistance : focus en santé humaine », Autun, 4 Septembre 2013.


Les protocoles permettant de mettre en évidence les patients infectés ou porteurs sains d'EPC ont été largement diffusés en France et à l'Etranger.

7.3 Projets partagés


Des projets de coopération sont menés avec le groupement Labéo (Dr. Albertine Léon-Seck) sur l’antibio-résistance chez le cheval (notamment au sein de la fondation Hippolia) et avec le laboratoire ANSES de pathologie équine à Dozulé (Dr. Claire Laugier). A noter que ce laboratoire ANSES est laboratoire national de référence (LNR) pour les pathologies suivantes : la métrite contagieuse équine,la dourine,l'anémie infectieuse des équidés,l'artérite virale équine et les herpès-viroses équines.

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7.4 Perspectives


Le bilan de l'évaluation du rapport d'activité 2012 conseillait au CNR de se rapprocher des laboratoires de santé animale pour la réalisation de travaux communs. Une collaboration entre le CNR et l'unité d'Antibiorésistance et de Virulence Bactériennes de l'ANSES localisé à Lyon (Dr Marisa Haenni et Dr Jean-Yves Madec) est en cours pour déterminer les mécanismes de résistance aux carbapénèmes (imipénème et méropénème) chez les isolats de P. aeruginosa d'origine animale. Bien que l'utilisation des carbapénèmes est formellement interdite en médecine vétérinaire, nous avons identifié à partir d'une large collection de souches de P. aeruginosacollectéesentre janvier 2009 et décembre 2011, des isolats de sensibilité diminuée à l'imipénème (diamètre ≤ 23 mm) et ou au méropénème (diamètre ≤ 23 mm). Ces souches provenaient pour la plupart de pus d'otites de chien et de prélèvements pulmonaires du chat. L'identification des mécanismes en cause sera réalisée au CNR avec l'aide d'un technicien du laboratoire de l'ANSES qui sera formé aux techniques de séquençage et de RT-qPCR permettant d'identifier la surproduction des systèmes d'efflux actif MexAB-OprM et MexXY-OprM, l'altération de la porine OprD et la production éventuelle de carbapénèmase.A ce jour, aucune publication ne décrit les mécanismes de résistance aux β-lactamines chez des souches vétérinaires de P. aeruginosa .


Nous avons mis en place une technique de typage moléculaire à moyen débit par REP-PCR et électrophorèse capillaire (Diversilab) permettant de réaliser une base de données normalisée et accessible en ligne. La même technologie a été mise en place dans le laboratoire de JY Madec à l’ANSES pour les souches bactériennes résistantes issues du milieu vétérinaire. Cet outil permettra une comparaison des souches inter-laboratoires pour croiser les données issues du milieu médical et vétérinaire. Cette première approche sera complétée pour la comparaison des supports génétiques, afin de voir si les mêmes plasmides de résistance diffusent dans le monde animal et chez l’Homme.

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8. PROGRAMME D 'ACTIVITE POUR 2014 ET 2015

8.1. Laboratoire de Besançon

� Prévalence des carbapénèmases chez P. aeruginosa en France

La production de β-lactamases transférables peut être confondue assez facilement chez P. aeruginosa avec des mécanismes intrinsèques (tels que la surexpression de la céphalosporinase AmpC, l'altération de la porine OprD, la surexpression des pompes d'efflux MexAB-OprM et MexXY-OprM) d'où une sous-estimation certaine de la prévalence des souches produisant des enzymes émergentes. Par ailleurs, la diversité importante des β-lactamases pouvant être acquises par P. aeruginosa rend difficile la mise au point d'une méthode de dépistage “universelle”.

L'étude multicentrique GESPAR (26 hôpitaux) organisée par le CNR en 2010 avait montré que 6,4% des souches de P. aeruginosa I ou R à l'imipénème en réanimation produisaient des carbapénèmases, ce qui correspond à une prévalence moyenne d'environ 1,8% de l'ensemble des souches (S/I/R). Ces données ont besoin d'être ré-actualisées en 2014 par une nouvelle enquête s'appuyant sur le même réseau. Programmée pour 2013, GESPAR-2 a dû être repoussée dans l'attente de la fabrication d'un nouveau test par BioRad. Outre l'objectif principal visant à mieux connaître l'épidémiologie des carbapénèmases en France, l'étude aura, en effet, pour objectif de valider en routine les performances d'un test de dépistage mis au point par le CNR (IC/4000). Les résultats obtenus par les laboratoires participants seront confrontés à ceux du CNR et vérifiés par des méthodes génétiques (PCR-séquençage) afin de préciser les limites d'utilisation du test IC/4000 et son utilité dans un schéma de dépistage systématique. L'étude GESPAR avait permis d'identifier des souches clonales multi-résistantes ayant diffusé dans plusieurs villes en France (ST111, n=3 ; ST175, n=9, ST235, n=9 ; ST298, n=6 ; ST308, n=4 ; ST395, n=6). Un nouveau bilan des souches épidémiques sera effectué dans le cadre de cette étude en utilisant à la fois le MLST et la MLVA comme méthodes de génotypage.

� Méthylases de l'ARNr 16S et résistance aux aminosides chez P. aeruginosa

Bien que la production de méthylase de l'ARNr 16S soit maintenant assez répandue chez les souches de A. baumannii isolées en France, elle s'avère beaucoup plus rare chez les entérobactéries et exceptionnelle chez P. aeruginosa. Grâce à un test de dépistage (disque d'arbékacine) réalisé sur toutes les souches résistant à haut niveau à la gentamicine, la tobramycine et l'amikacine, une souche de P. aeruginosa produisant une méthylase a pu être identifiée en 2013 chez un patient rapatrié sanitaire de Chine, pays où ces enzymes sont relativement répandues. La caractérisation du support et de l'environnement génétique du gène codant l'enzyme est en cours actuellement au CNR.

Par ailleurs, plusieurs souches clonales isolées dans un établissement de la banlieue parisienne ont montré une résistance élevée à l'arbékacine. Seules quelques rares enzymes modificatrices sont connues pour inactiver cette molécule telles que l'AAC(6')/APH(2") chez les staphylocoques (Japon), les AAC(6')-Iag et AAC(6')-Iaj chez P. aeruginosa (Japon) et l'AAC(6')-Iad chez A. baumannii (Japon). Les PCR ciblant les méthylases connues (RtmA-H, ArmA, NpmA) s'étant révélées négatives pour les souches françaises, le ou les gène(s) à l'origine de la résistance feront l'objet d'un clonage afin

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d'être caractérisés. Le cas échéant, les souches seront soumises à un séqençage génomique total dans le but d'identifier leurs gènes de résistance et préciser leur origine phylogénétique. Une collaboration est en cours avec la plateforme Integrall (Thomas Jové, Umr Inserm 1092) pour recenser tous les gènes contribuant à la résistance aux aminosides chez P. aeruginosa.

� Méthode de dépistage des carbapénèmases par spectrométrie de masse (MALDI-TOF)

La plupart des laboratoires hospitaliers et privés disposent aujourd’hui, ou vont faire l’acquisition dans un avenir proche, d’un appareil de spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. Cette technologie permet d’obtenir une identification rapide et précise des principaux micro-organismes isolés en routine, directement à partir de colonies ou de certains prélèvements (hémocultures, urines). D’autres applications sont actuellement en cours de développement. L’une d’entre elles permet la détection des carbapénèmases ; le principe étant de suivre la dégradation d’un carbapénème (d’un poids moléculaire donné) introduit dans une suspension bactérienne. A ce jour, une dizaine de publications rapportent les performances de cette technique chez les entérobactéries et Acinetobacter. En revanche, cette technique n’a été évaluée que sur un très petit nombre de souches de P. aeruginosa. Ainsi, notre laboratoire se propose de collaborer avec la société Bruker afin d’évaluer le nouveau logiciel MSBL (présenté à l’ECCMID 2014) sur une large collection de P. aeruginosa bien caractérisés d’un point de vue moléculaire. Cette technique pourrait représenter un moyen efficace et rapide pour discerner les souches productrices de carbapénèmase de celles présentant une simple imperméabilité membranaire par altération de la porine OprD.

� Assurance qualité

Une démarche visant à mettre en place un programme d'assurance qualité a été instaurée à la suite du 6ème séminaire des CNR à Paris (28 Nov 2013). La formalisation des modes opératoires, l'établissement de fiches de postes, de fiches de fonction et la définition des critères d'habilitation du personnel sont en cours actuellement et devraient être achevés courant 2014. Une évaluation externe de la qualité a été mise en place en 2013 avec l'échange de souches entre le CNR français, le CNR belge (dir. Youri Glupczynski, Bruxelles) et le CNR espagnole (dir. Antonio Oliver, Palma de Majorque). Cette évaluation sera re-conduite en 2014. Par ailleurs, la fabrication de microplaques CMI “P. aeruginosa” et “A. baumannii” adaptées aux trois CNR est programmée pour la fin du premier semestre de l'année. Ces plaques permettront de mieux comparer la prévalence des résistances dans chacun des pays concernés lors d'études multicentriques.

8.2. Laboratoire de Caen

� Poursuite de l’activité quotidienne d’expertise et de conseil. � Séquençage des génomes entiers des clones majoritaires et épidémiques pour une analyse

épidémiologique fine (séquenceur à haut débit disponible au CHU mi-2014). � Analyse et confrontation des données de l’InVS (Sophie Vaux) pour publication des tendances

épidémiologiques des cas d’ERG en France entre 2008 et 2013, faisant suite à la 1ère analyse publiée dans le « Journal of Antimicrobial Chemotherapy » en 2011.

� Mise en route de la démarche qualité ISO15189 au sein du CNR, en parallèle de celle menée dans le laboratoire du CHU de Caen (plusieurs fiches techniques ont déjà été rédigées).

� Surveillance des résistances exceptionnelles chez les bactéries à Gram positif

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Tableau 12 : Résistances exceptionnelles chez les bactéries à Gram positif

Espèce ou famille bactérienne Résistance à Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae

Streptococcus dysgalactiae

Pénicilline G

Streptocoques Vancomycine Staphylococcus aureus

Staphylocoques à coagulase négative Vancomycine (haut niveau)

Staphylococcus aureus Staphylocoques à coagulase négative

Linézolide

Staphylococcus aureus Daptomycine Entérocoques Daptomycine Entérocoques Linézolide

Le laboratoire de Microbiologie du CHU de Caen est en cours d’accréditation ISO 15189, avec notamment la rédaction des fiches d’habilitation et des fiches techniques. Dans ce cadre, des fiches techniques pour les analyses effectuées au sein du CNR ont déjà été rédigées pour les analyses les plus courantes (ex. identification des bactéries par spectrométrie de masse MALDI-TOF, détection des gènes de résistance aux glycopeptides par PCR en temps réel). Outre le contrôle national de qualité de l’ANSM, le laboratoire est inscrit au programme d’évaluation externe de la qualité (EEQ) du Centre Toulousain pour le Contrôle de qualité en Biologie clinique (CTCB). Enfin, le laboratoire du CHU déposera au COFRAC deux analyses microbiologiques importantes (ECBU, sérologie toxoplasmose) fin 2014 pour un audit et une accréditation début 2015.

8.3. Laboratoire de Clermont-Ferrand

� Finaliser l’analyse des souches collectées en France métropolitaine au sein du réseau en 2012 ; � Initier l’étude des souches isolées Outre-Mer à l’image de l’étude réalisée en Métropole ; � Etudier la clonalité des souches de K. pneumoniae productrices de céphalosporinase plasmidique

et explorer le support génétique de ces enzymes pour comprendre leur diffusion ; � Séquencer des plasmides représentatifs codant les BLSE ou des céphalosporinases plasmidiques

isolées en France afin d’obtenir des données pour la mise au point de techniques moléculaires de typage des plasmides adaptés ;

� Initier la comparaison des souches puis de plasmides isolés chez l’Homme et l’animal en collaboration avec le laboratoire dirigé par J.-Y. Madec (Anses, Lyon) ;

� Un autre axe de travail est de poursuivre notre démarche vers l’accréditation COFRAC. Le laboratoire hébergeant le CNR doit bénéficier courant 2013 d’une visite d’évaluation COFRAC, qui portera notamment sur des processus communs (pré- et post-analytiques).

8.4. Laboratoire de Bicêtre

L’augmentation importante du nombre de souches reçues par le CNR impliquera la formation de nouveaux acteurs notamment médicaux pour le rendu rapide des expertises. En effet, l’analyse biologique quotidienne et le rendu des résultats d’expertise repose actuellement sur des microbiologistes impliqués, par ailleurs, dans des activités hospitalières et hospitalo-universitaires.

80

Comme depuis sa création, le laboratoire associé de Bicêtre assurera l'identification des carbapénèmases dans les souches d'entérobactéries provenant du territoire national.

La grande majorité des souches d’EPC responsables d’épidémies en 2013 correspondaient à des souches de K. pneumoniae productrices d’OXA-48. Afin de mieux comprendre ce phénomène, une étude relative à ces souches épidémiques sera réalisée par le CNR en collaboration avec l’InVS.

Dans un souci de qualité et de traçabilité des expertises réalisées par le CNR, l’ensemble des résultats d’expertise sera intégré dans le serveur sécurisé de résultats du CNR accessible à l'adresse http://www.cnr-resistance-antibiotiques.fr.

Centre National de Référence de la Résistance aux

Antibiotiques

Annexes 2013

Pr Patrick Plésiat, CHU de Besançon (Laboratoire coordonnateur “Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii”)

Pr Vincent Cattoir, CHU de Caen (Laboratoire associé “Entérocoques et résistances particulières des bactéries à Gram-positif”)

Pr Richard Bonnet, CHU de Clermont-Ferrand (Laboratoire associé “Entérobactéries : résistance aux céphalosporines de 3-4ème

génération/BLSE et céphalosporinases”)

Pr Patrice Nordmann, Dr Laurent Dortet, CHU de Bicêtre (Laboratoire associé “Entérobactéries : résistance aux carbapénèmes et carbapénèmases”)

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Annexe 1.1. Missions et objectifs majeurs du CNR et des Laboratoires associés

La résistance bactérienne aux antibiotiques a atteint une ampleur sans précédent dans de nombreuses régions du monde. En France, la situation est devenue alarmante dans certains centres hospitaliers, mais reste encore maîtrisable. Devant un tel enjeu de Santé Publique, la mobilisation la plus large possible des différents acteurs du monde hospitalier s’avère nécessaire, notamment pour faire face aux situations épidémiques impliquant des bactéries multi- voire pan-résistantes.

Les missions du CNR de la Résistance aux Antibiotiques sont celles fixées par l'InVS dans le cadre de son appel à candidature 2011. Pour atteindre ces objectifs, le CNR s'appuie sur une double logique d’organisation et de collaboration.

Il est constitué de quatre laboratoires hospitalo-universitaires ayant une expérience quotidienne des problèmes cliniques posés par la résistance bactérienne aux antibiotiques, des compétences reconnues internationalement dans la caractérisation des mécanismes de résistance émergents et le génotypage des souches, des collaborations régulières avec les réseaux de surveillance existants fédérés au sein de l’ONERBA, et représentés au Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM).

La coordination du CNR est assurée par le professeur Patrick Plésiat, chef du service de Bactériologie du CHU de Besançon, qui avec son équipe prend à sa charge l’analyse des bacilles à Gram négatif nosocomiaux non fermentants (P. aeruginosa et A. baumannii, essentiellement).

Les entérocoques et certains aspects de la résistance des staphylocoques sont couverts par le laboratoire de Bactériologie du CHU de Caen, dirigé depuis 2012 par le professeur Vincent Cattoir.

Quant aux entérobactéries, elles sont expertisées par le laboratoire du professeur Patrice Nordmann au CHU de Bicêtre sous la supervision du docteur Laurent Dortet (carbapénèmases) et par le laboratoire du professeur Richard Bonnet au CHU de Clermont-Ferrand (BLSE et autres mécanismes à caractère épidémique).

L’objectif du CNR est de répondre au cahier des charges de l’InVS et aux attentes des microbiologistes hospitaliers par une organisation efficace, un fonctionnement transparent, une bonne réactivité ainsi qu’une concertation avec les collègues ayant des domaines d’expertise complémentaires à ceux du CNR.

Dans le contexte épidémique actuel où la diffusion des carbapénèmases et des β-lactamases à spectre élargi (BLSE) s’accélère, il ne nous a pas semblé réaliste de concentrer, sans un tri préalable, toute l’activité d’analyse des entérobactéries sur un, voire deux laboratoires experts. L’expérience montre qu’il est indispensable, par des recommandations claires et des actions de communication-formation, de renforcer les compétences des biologistes hospitaliers afin d'optimiser les demandes d'expertise, vis-à-vis notamment des souches suspectes de produire des carbapénèmases dont on sait que seule une minorité sont réellement positives. En revanche, le laboratoire de référence doit pouvoir collecter l’information sur les mécanismes identifiés par les laboratoires hospitaliers, afin d’avoir une vision la plus exhaustive possible des problèmes de résistance et de croiser les données avec celles du signalement à l’InVS, ceci dans les meilleurs délais.

2

Pour des raisons évidentes, le CNR concentre actuellement ses efforts sur les problèmes de résistance les plus critiques (carbapénèmes, céphalosporines de 3ème génération, glycopeptides, linézolide, daptomycine, colistine...) tout en restant attentif aux autres phénomènes émergents affectant, notamment, l'activité des aminosides (méthylase de l'ARN16S).

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Annexe 1.2. Description détaillée du CNR

1.2.1. Laboratoire coordinateur “Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii”

Laboratoire de Bactériologie CHRU de Besançon 3, boulevard Fleming 25030 Besançon cedex tel. 03 81 66 82 86 - fax. 03 81 66 89 14 responsable scientifique : Pr. Patrick Plésiat tel. 03 81 66 81 85 - fax. 03 81 66 89 14 mail. [email protected] responsable administratif : Mr Patrice Barberousse, Directeur Général

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ETP

Patrick Plésiat (PU-PH), directeur CNR

0,1 Katy Jeannot (MCU-PH), directeur adjoint

0,15

Damien Fournier (PH)

0,15 Caroline Bréchet (AHU)

0,10

Xavier Bertrand (PU-PH), épidémiologiste

0,05

Marjorie Robert-Nicoud (ingénieur recherche)* 80 %

80 %

80 %

80 %

80 %

80 %

80 %

80 %

80

%

0,81

Emeline Gilliot (technicienne)*

1 Pauline Chatelain (technicienne)*

0,42

Amélie Mille (technicienne CHRU)

0,84 Présence * personnel rémunéré par la subvention InVS

1.2.2. Laboratoire associé “Entérocoques et résistances particulières des bactéries à Gram-positif”

Laboratoire de Microbiologie CHU de Caen Avenue de la Côte de Nacre 14033 Caen Cedex 9 Tel. 02 31 06 45 72 (ou 45 70) - Fax. 02 31 06 45 73 Responsable scientifique : Pr. Vincent Cattoir Tel. 02 31 06 48 95 - Fax. 02 31 06 45 72 Mail. [email protected] Responsable administratif : Mr Angel Piquemal, Directeur Général

4

Vincent Cattoir (PU-PH), directeur laboratoire……….. 0,10 ETP Marguerite Fines-Guyon (PH)………………………. ... 0,15 ETP Michel Auzou (technicien)……………………….....…. 1,00 ETP Géraldine Delente (technicienne)……………………… 1,00 ETP* Julie Hoorelbeke (secrétaire)………………….……….. 0,20 ETP

* personnel rémunéré par la subvention InVS

1.2.3. Laboratoire associé “Entérobactéries : Résistance aux céphalosporines de 3-4ème génération/BLSE et céphalosporinases”

Laboratoire de Bactériologie CHU de Clermont-Ferrand 58 rue Montalembert 63000 Clermont-Ferrand Cedex Tel. 04 73 75 49 20 - Fax. 04 73 75 49 22 Responsable scientifique : Pr. Richard BONNET Tel. 04 73 75 17 93 - Fax. 03 73 75 49 22 Mail. [email protected] Responsable administratif : Alain Meunier, Directeur Général

Richard Bonnet (PU-PH), directeur laboratoire .............. 0,25 ETP Frédéric Robin (MCU-PH) ............................................. 0,50 ETP Ousmane Traoré (PU-PH), épidémiologiste ................... 0,20 ETP Laurent Guillouard (technicien) ...................................... 1,00 ETP Racha Beyrouthy (ingénieur) .......................................... 0,80 ETP Claudine Morge (secrétariat) ......................................... 0,20 ETP

1.2.4. Laboratoire associé “Entérobactéries : Résistance aux carbapénèmes et carbapénèmases”

Service de Bactériologie -Virologie CHU de Bicêtre Unité INSERM U914 “Résistance aux Antibiotiques” 78 rue du Gl Leclerc 94275 Le Kremlin Bicêtre tel. 01 45 21 36 32 - fax. 01 45 21 63 40 responsable scientifique : Pr. Patrice NORDMANN tel. 01 45 21 36 32 - fax. 01 45 21 63 40 mail : [email protected] responsable administratif : Christine WELTY, Directeur du GHU

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Patrice Nordmann (PU-PH), chef de service Directeur d’Unité INSERM .............................................. 0,1ETP Thierry Naas (MCU-PH) ................................................... 0,1 ETP Nicolas Fortineau (PH) ...................................................... 0,2 ETP Gaëlle Cuzon (PH) ............................................................ 0,2 ETP Laurent Dortet (AHU) ....................................................... 0,1 ETP Laurent Poirel (CR 1 INSERM) ........................................ 0,1 ETP Sandrine Bernabeu (Technicienne INSERM) ................... 0,5 ETP Remy Bonnin (Technicien InVS) ...................................... 1,0 ETP* * personnel rémunéré par la subvention InVS

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Annexe 1.3. Equipements et logistique


• Une pièce type L2 de 59 m2 (local hospitalier dédié au CNR) : isolement, culture, souchiers, plasmides, PCR

• Laverie-stérilisation du pôle de Biologie du CHU : 127 m2 • Secrétariat du pôle du Biologie du CHU : 21 m2 • Chambre noire : 12 m2 • Chambre froide à 4oC : 21 m2 • Une pièce de 22 m2 attribuée au centre de ressources biologiques (local hospitalier) :

centrifugation, stockage à -80oC, PSM • Locaux universitaires de 45 m2 en partage avec l’équipe de recherche : puces ADN, RT-qPCR,

clonage • 1 désintégrateur Genie Distruptor (Scientific Industries) • 1 étuve Stabilitherm (Thermo Electro Corporation) • 1 hotplate stirrer (LMS) • 2 générateurs électrophorèse PS304II (Apelex) • 4 cuves à électrophorèse (Apelex) • 1 gel casting system (GIBCO) • 1 microcentrifugeuse réfrigérée 5417R (Eppendorf) • 1 biophotomètre (Eppendorf) • 1 thermocycler T3000 (Biometra) • 1 thermocycler T Professional TRIO (Biometra) • 1 thermocycler à gradiant Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) • 1 centrifugeuse de paillasse Mini Spin (Eppendorf) • 1 centrifugeuse de paillasse (LMS) • 1 microcentrifugeuse 5810R (Eppendorf) • 1 shaker de paillasse (NewBrunswick Sientific Classic Series) • 1 spectrophotomètre Uvikon Secomam (Serlabo technologie) • 1 spectrophotomètre Multiscan Go (Thermo Scientific) • 1 cuve électrophorèse IEF 2117 Multiphor II (LKB) • 1 générateur électrophorèse IEF 2197 (LKB) • 1 cooling module (Bio-Rad) • 1 générateur CHEF DRII Drive module (Bio-Rad) • 1 sonicateur Sonifier 450 (Branson) • 2 appareils de PCR en temps réel Rotor-Gene Q (Qiagen) • 1 lecteur automatique d’antibiogrammes SirScan 2000 (I2A) CHRU • 1 scanner (EPSON) • 2 imprimantes (Lexmark) et (HP) • 1 pH mètre Microprocessor pH Meter (Hanna instruments) • 1 transilluminateur GelDoc-ChemiDoc (Bio-Rad) CHRU • 2 congélateurs -80°C • 1 congélateur -20°C (Liebherr) • 2 réfrigérateurs (Liebherr)

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• 1 bain- marie (GFL) • 1 bain- marie (Julabo) • 1 lot de Pipette (Gilson) • 2 lots de Pipette (Thermo Scientific) • 1 lot de Pipette (Eppendorf Research) • 2 Pipettes Multicanaux (Eppendorf) • 2 Vortex Genie 2 (Scientific Industries) • 1 Vortex (BioBlock Scientific) • 1 Vortex (Fisher Scientific) • 1 hotte à flux laminaire PCR Cabinet (ESCO) • 1 presse de French (Bioritech) • 1 ensemenceur en spirale Spiral Plater (AES Laboratoire) • 1 ultracentrifugeuse Kontron CHRU • 1 centrifugeuse grande capacité Beckman J2.21 CHRU • 1 lecteur puces Clondiag ATR03 2.0 (Alere) • 1 séquenceur Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (plateforme SFR4234) • 1 séquenceur Illumina High Scan et module de génotypage (plateforme SFR4234) • 3 ordinateurs


• 1 pièce de laverie-stérilisation de 60 m² CHU • 1 pièce de secrétariat de 40 m² CHU • 1 pièce de 25 m² (local hospitalier dédié au CNR) : isolement, culture et souchiers • 1 pièce de 25 m² (local hospitalier en partage avec d’autres activités) : extraction d’acides

nucléiques, PCR • Locaux universitaires de 30 m² en partage avec l’équipe de recherche EA4655: PCR, clonage,

hybridation ADN/ADN • chambre froide à +4°C de 8 m² CHU • 1 chambre froide à -20°C de 5 m² CHU • Equipement de base pour cultures de bactéries CHU • 1 PSM CHU • 1 spectromètre de masse MALDI-TOF pour identification bactérienne Microflex avec le logiciel

Biotyper (Bruker Daltonics) CHU • 1 ensemenceur en spirale Spiral Plater® (AES Laboratoires) • 1 ensemenceur pour CMI en milieu gélosé de Steers • 1 équipement pour antibiogramme automatisé Vitek 2 (bioMérieux) CHU • 1 appareil pour comparaison de souches Diversilab (bioMérieux) • 1 appareil d’électrophorèse en champ pulsé CHEF DRII® (Bio-Rad) CNR • 1 logiciel d’analyse des images d’électrophorèse FingerPrinting II (Bio-Rad) EA4655 • 1 logiciel d’analyse bioinformatique BioNumerics (Applied Maths) EA4655) • 1 logiciel d’analyse de séquences issues du séquençage à haut débit CLC Genomics Workbench

(CLC bio) • 1 congélateur -80°C et 1 autre à -20°C, 1 réfrigérateur CHU • 1 ordinateur PC CHU

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• 2 hottes dédiées à la préparation de l’ADN CHU • 1 extracteur automatique d’acides nucléiques NucliSens EasyMag (bioMérieux) CHU • 1 spectrophotomètre pour acides nucléiques BioSpec-nano (Shimadzu) EA4655 • 1 spectrofluorimètre pour acides nucléiques Quantus (Promega) EA4655 • 1 station d’électrophorèse capillaire Agilent 2100 Bioanalyzer • 5 thermocycleurs pour PCR classique CHU-EA4655 • 2 appareils PCR temps réel : RotorGene Q (Qiagen) et CFX Connect (Bio-Rad) CHU-EA4655 • 1 station de travail visualisation et analyse des gels d’agarose EA4655 • Matériel pour hybridation ADN-ADN EA4655 • 1 station d’électrophorèse capillaire Agilent 2100 Bioanalyzer


• Une pièce de 70 m2 (local hospitalier dédié au CNR) : isolement et culture • Une pièce stockage de 10 m2 (partage avec d’autres activités) : biothèque, fourniture • 5 pièces à pression contrôlée de 14 m2 chacun (partage avec d’autres activités) : biologie

moléculaire, PCR, hybridation • 2 chambres froides de 8 m2 chacune (partage avec d’autres activités) : stockage 5oC • 3 pièces au total de 40 m2 (partage avec d’autres activités) : préparation et autoclavage • Locaux universitaires de 75 m2 en partage avec l’équipe de recherche : analyses biochimiques et

structurales • Equipement de base pour cultures de bactéries CHU • Equipement pour antibiogramme automatisé CHU • 2 congélateurs à -80oC, -20oC (un de chaque) • 1 hotte à flux laminaire CHU • 1 appareil d’électrophorèse en champ pulsé CHU • 2 ordinateurs CHU • 1 hotte dédiée à la préparation de l’ADN (CHU) • 5 thermocycleurs pour PCR (CHU-équipe de recherche) • 2 appareils pour PCR en temps réel (CHU-équipe de recherche) • Matériel pour électrophorèse d’ADN et hybridation ADN-ADN (CHU) • Matériel pour purification des protéines (2 chaines FPLC) • Spectrophotomètre, spectrométrie de masse MALT-TOF, microacidimétrie • Transilluminateur et logicielles d’analyse de gel • Lecteur Agilent pour typage moléculaire Diverslab • Laboratoire de biologie cellulaire (20 m2) • Animalerie

1.3.4. Laboratoire de Bicêtre en commun avec l’Unité INSERM 914

• Une pièce de 40 m2 : isolement culture • 3 pièces, total 40 m2 : biologie moléculaire • 2 chambres froides de 12 m2 chacune (partagées avec d’autres activités : stockage 4°C)

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• 4 pièces, total 50 m2 regroupant diverses activités (préparation de milieux de culture, autoclavage, analyses biochimiques…)

• Equipement de base pour culture de bactéries • Equipement pour antibiogramme automatisé • 1 congélateur à -80oC • 1 congélateur -20oC • 1 appareil de champ pulsé • 1 appareil pour comparaison de souches Diversilab • 5 ordinateurs disponibles (partagés avec l’Unité INSERM 914) • 4 appareils PCR classique • 2 appareils PCR champs pulsé • 1 extracteur d’ADN • 1 appareil de séquençage 4 canaux • Matériels pour appareil électrophorèse d’ADN et de protéines • 1 appareil de purification de protéines Akta Purifier 100 • 1 station de travail visualisation et analyse des gels d’agarose • 1 pyroséquenceur partagé • 1 appareil de séquençage 16 capillaires (plateforme commune hospitalière)

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Annexe 2.1.Capacités techniques du CNR

2.1.1. Techniques de référence


La procédure et les techniques d’analyse des souches de P.aeruginosa et de A. baumannii sont indiquées Figure 68 et Figure 69. Outre ces méthodes générales, le laboratoire possède depuis 2008 une compétence spécifique en génomique bactérienne. La SFR4234 “Ingéniérie, Biologie Cellulaire et Tissulaire” (Pr D. Fellmann) auquelle l’équipe de recherche EA4266 est rattachée s’est dotée en 2012 d’une plateforme de séquençage à haut débit Ion Torrent (life Technologies). Cette acquisition accélère l’obtention des séquences nucléotidiques en vue de caractériser les mutations associées à la résistance aux antibiotiques dans certains loci génétiques. Par ailleurs, afin de diminuer le délai de rendu des résultats de génotyage des souches de P. aeruginosa et de A. baumannii, la méthode Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis (MLVA) a été mise en place au laboratoire avec l'aide du Dr Christine Pourcel (UMR8621, Génomes et Polymorphismes, Institut de Génétique et Microbiologie, Orsay) au cours de l'année 2012.

L’analyse par MLST des souches de Pseudomonas aeruginosa analysées par le CNR est réalisée selon le protocole de Curran et al. (J. Clin. Microbiol. 2004,42: 5644–5649), modifié par van Mansfeld et al. (J. Clin. Microbiol. 2009, 47: 4096–4101). La partie interne des gènes acsA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA et trpE est amplifiée puis séquencée dans les deux sens. Les séquences sont ensuite comparées à la base de données accessible via internet (http://pubmlst.org/paeruginosa/) afin d’obtenir un numéro d’allèle et un numéro de sequence type (ST).

Au sein du CNR (tous les laboratoires), la sensibilité aux antibiotiques est déterminée en routine par la méthode des disques selon les recommandations du CA-SFM et/ou à l’aide du système automatisé VITEK II (3 cartes d’antibiotiques disponibles). Les CMI sont mesurées selon les recommandations du CA-SFM par dilution en gélose, par microdilution en milieu liquide le plus souvent, ou à l’aide des bandelettes E-tests. Pour des études multicentriques, des microplaques Sensititre® sont fabriquées à façon par la société TREK (RU).

� Identification des souches et analyse des gènes de résistance :

• Techniques de bactériologie - Détection des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des métalloβ-lactamases par la

technique de rapprochement de disques d’antibiotiques sur gélose ; - Détection des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) par étude de la synergie entre

antibiotiques par technique de E-test ; - Etude du caractère transférable des gènes de résistance par conjugaison.

• Techniques de biologie moléculaire

- Identification de P. aeruginosa par MALDI-TOF ; - Identification des gènes de β-lactamases présentes dans les souches cliniques de

P. aeruginosa et A. baumannii par PCR (68 couples d’amorces disponibles permettant la détection et le séquençage des gènes des β-lactamases de type AIM, BEL, CTX, DIM, FIM, GES, GIM, IBC, IMI, IMP, KPC, NDM, NMC, OXA, PER, PME, PSE, RTG, SIM,

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SHV, SME, SPM, TEM, VEB, VIM) ; - Identification de gènes de nouvelles β-lactamases par clonage par banque d’ADN

génomique ; - Etude du niveau de transcrits des gènes impliqués dans la résistance chez

P. aeruginosa par RT-PCR en temps réel ; - Extraction des plasmides par méthode de Kieser.

• Techniques enzymatiques

- Détermination du point isoélectrique des β-lactamases de P. aeruginosa par isoélectrofocalisation ; - Détection des β-lactamases par le test de Hodge modifié (extraits enzymatiques) ;

- Etude de l’activité enzymatique des β-lactamases par spectrophotométrie.

� Evaluation de la sensibilité aux agents anti-infectieux :

• Détermination de la CMI de la colistine en milieu liquide ;

• Détermination des CMI des β-lactamines par E-tests ;

• Détermination des CMI des β-lactamines par méthode classique sur milieu gélosé ;

• Détermination des CMI des β-lactamines en microplaques (Sensititre® – Trek Diagnostic Systems).

� Typage des souches de P. aeruginosa et A. baumannii :

• Technique d’électrophorèse en champ pulsé (PFGE) ; • Puces CLONDIAG (Alere Technologies) ; • MLVA ; • MLST.

� Etude du caractère de virulence des souches cliniques de P. aeruginosa (analyses exceptionnelles) :

• Identification des gènes d’exotoxines (exoU, exoS) par PCR ; • Tests de virulence (protéases totales, pyocyanine, pyoverdine, hémolysines, rhamnolipides,

élastase).

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Figure 68. Démarche d’analyse des souches de P. aeruginosa par le CNR

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Figure 69. Démarche d’analyse des souches de A. baumannii par le CNR

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La procédure et les techniques d’analyse des souches d’entérocoques sont indiquéesdans la Figure 70 ci-dessous, tout en sachant que la plus grande partie du travail du laboratoire est consacrée à l’étude des souches résistantes aux glycopeptides (ERG). Pour les souches dont le mécanisme de résistance n’est pas caractérisé par l’approche générale, le laboratoire met à profit des techniques qui sont maîtrisées dans l’équipe de recherche EA4655, en s’appuyant sur la technologie disponible sur le plateau de l’IFR146 ICORE (clonage, séquençage à haut débit, électrophorèse 2D, spectrométrie de masse MS/MS, microscopie électronique). De plus, le laboratoire possède une expertise dans la caractérisation des résistances chez les bactéries à Gram positif, plus particulièrement concernant les résistances aux macrolides et apparentés, aux glycopeptides et aux aminosides, ce qui est utile pour les collaborations avec les CNR spécifiques des pathogènes à Gram positif (staphylocoques, streptocoques et pneumocoques). Les techniques utilisées sont essentiellement basées sur la PCR et qRT-PCR, le clonage et le séquençage à haut débit.

Figure 70 : Démarche d’analyse des souches d'entérocoques par le CNR

� Identification des souches et analyse des gènes de résistance :

Identification des espèces bactériennes par spectrométrie de masse MALDI-TOF Identification moléculaire (si nécessaire) par séquençage des gènes sodA ou rrs (ARNr 16S) ; Identification des gènes de résistance aux glycopeptides par PCR en temps réel multiplex (vanA, vanB, vanC1, vanC2/C3 et vanD) et PCR classique multiplex (vanE, vanG, vanL, vanM et vanN) ; Identification des gènes de résistance aux macrolides et apparentés par PCR en temps réel multiplex [erm(A), erm(TR), erm(B), erm(C), msr(A) et mef(A)] et par PCR classique multiplex (gènes erm, lnu, lsa, vat, vga, vgb et cfr) ;

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Identification des gènes de résistance aux aminoside, notamment le gène aac(6’)-Ie-aph(2 ")-Ia conférant la résistance à la gentamicine chez les entérocoques ; Identification de nouveaux gènes de de résistance aux glycopeptides ou macrolides et apparentés par clonage aléatoire d’ADN génomique ou séquençage à haut débit ; Extraction des plasmides par la méthode de Kieser et analyse par Southern blot.

� Evaluation de la sensibilité aux agents anti-infectieux :

Détermination de la sensibilité aux antibiotiques des souches d’entérocoques par la méthode des disques sur milieu gélosé (selon les recommandations du CA-SFM) : ampicilline, kanamycine, streptomycine, gentamicine, érythromycine, lincomycine, pristinamycine, lévofloxacine, vancomycine, teicoplanine, chloramphénicol, doxycycline, tigécycline, cotrimoxazole, rifampicine et linézolide ; Détermination de la CMI de la vancomycine, de la téicoplanine et de la daptomycine par la méthode du E-test.

� Typage des souches d’ERG :

Technique d’électrophorèse en champ pulsé (ECP) ; Technique de rep-PCR (Diversilab, bioMérieux) ; Technique de MLST Détection de la séquence d’insertion IS16, spécifique du complexe clonal 17.

� Etude des gènes de virulence chez E. faecium (analyses exceptionnelles) :

Identification des gènes esp et hylEfm codant respectivement pour une protéine impliquée dans la formation du biofilm et une hyaluronidase ; Détection du gène ptsD, potentiellement impliqué dans le pouvoir de diffusion des souches de E. faecium.


La caractérisation de nouvelles β-lactamases pourra être complétée par des études enzymatiques du spectre d’activité. Elles reposent sur la purification de l’enzyme et la mesure des constantes cinétiques par spectrophotométrie et/ou par microacidimétrie. Ces données permettent de révéler une activité hydrolytique de l’enzyme pouvant passer inaperçue avec les tests microbiologiques (CMI ou antibiogramme) du fait, par exemple, d’une expression faible du gène. Ces données enzymatiques permettent de prévoir les profils de résistance susceptibles d’émerger chez des isolats bactériens surexprimant le gène et aussi de comprendre ou prévoir d’éventuels échecs thérapeutiques. Si l’enzyme présente un intérêt particulier sur le plan structure-activité, ces études enzymatiques peuvent être complétées par des travaux de mutagenèse dirigée et une analyse structurale de l’enzyme par cristallographie et/ou modélisation moléculaire. Par ailleurs, nous disposons de techniques permettant de simuler l’évolution des β-lactamases sous l’action de la pression de sélection des antibiotiques. Ces techniques reposent sur une stratégie d’évolution orientée

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in vitro basée sur la mutagenèse aléatoire. Ces données permettent de prédire les évolutions à venir des β-lactamases et potentiellement d’identifier des stratégies thérapeutiques limitant ces évolutions.

Le laboratoire dispose également de techniques moléculaires de détection de gènes de résistance plasmidiques aux quinolones (qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, aac(6')-Ib-cr, et qepA). Nous sommes à même de détecter par PCR les principaux facteurs de virulence de E. coli et K. pneumoniae. Enfin, le laboratoire maîtrise les outils informatiques nécessaires à l’exploration des données génomiques (assemblage, annotation, visualisation et comparaison des génomes). Il a notamment participé à l’annotation de la souche de référence E. coli LF82. Ces compétences peuvent être mises à profit pour l’exploration approfondie de souches représentant un risque sanitaire important comme une souche toto-résistante épidémique.

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Figure 71. Démarche d’analyse des souches d'entérobactéries par le CNR

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� Techniques disponibles :

• Identification bactérienne phénotypique classique et par spectrométrie de masse ; • Identification bactérienne par méthode moléculaire (séquençage des gènes codant l’ARN 16S,

rpoB, sodA ou gyrB) ; • Technique d’isoélectrofocalisation pour analyse du contenu en β-lactamases ; • Détection des gènes codant les principales β-lactamases acquises à l’aide de puces à ADN

(checkpoint) ; • Détection par PCR et séquençage des gènes codant les BLSE (TEM, SHV, CTX-M, GES,

VEB, PER, BES, …) ; • Détection par PCR et séquençage des gènes codant les principales carbapénèmases (KPC,

VIM, IMP, NDM, OXA-48) ; • Détection par PCR et séquençage des gènes codant les principaux mécanismes plasmidiques

de résistance aux aminosides (AAC(6’)-Ib, AAC(3)-II, méthylases RmtA à D, ArmA et NmpA) ;

• Détection par PCR et séquençage des gènes codant les principaux mécanismes plasmidiques de résistance aux fluoroquinolones (qnr, qepA, aac(6’)-Ibcr) ;

• Analyse qualitative et quantitative de données de séquençage de masse (Illumunia, 454…) ; • Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé (Mueller-Hinton avec ou sans cloxacilline) ; • Antibiogramme automatisé Vitek 2 ; • CMI par microdilution en milieu liquide ; • Enzymologie des β-lactamases (microacidimétrie, spectrophotométrie) ; • Modèle murin de sepsis ; • Détection par PCR des îlots de pathogénicité et des principaux gènes codant les facteurs de

virulence de E. coli et de K. pneumoniae (ilots de pathogénicité, principales adhésines, chélateurs du Fer, typage capsulaire, phylogroupe de virulence,…).

� Techniques en développement :

• Evaluation de techniques de détection et d’identification de β-lactamases par spectrométrie de masse MALDI TOF ;

• Evaluation des performances de la spectrométrie de masse MALDI TOF pour l’identification et le suivi de clones épidémiques ;

• Liste des marqueurs épidémiologiques disponibles ; • Analyse des Sequence Types par MLST (E. coli et K. pneumoniae) ; • Phylogroupage des E. coli par MLST et PCR ; • Electrophorèse en Champ pulsé ; • RAPD, ERIC2 PCR, REP PCR; • Contribution à l’élaboration des recommandations éditées par le CA-SFM et l’EUCAST ; • Evaluation d’une technique phénotypique simple de dépistage des souches productrices de

AAC(6’)Ib-cr (responsable d’une résistance plasmidique croisée aux aminosides et fluroquinolones) par étude de l’activité de la norfloxacine sur la souche sensible E. coli ATCC25922 après incubation avec la souche testée ;

• Evaluation de la technique phénotypique Mast D68C permettant la détection des BLSE et des céphalosporinases hyperproduites ;

• Comparaison des performances de la méthodologie recommandée par l’EUCAST et le CA-SFM pour la réalisation de l’’antibiogramme par diffusion en gélose sur des Entérobactéries résistantes aux céphalosporines de 3ème génération.


L’analyse des souches suspectes d’exprimer une carbapénémase doit être rapide afin d’adapter la thérapeutique et isoler les patients porteurs. Le test de diagnostic Carba NP, mis au point dans l’Unité INSERM 914, est utilisé en routine depuis le 1er janvier 2012 directement sur colonies (72). Ce test dont la sensibilité et la spécificité sont voisines de 100% permet l’obtention d’un résultat en moins de 2 h. En cas de positivité, la nature précise de la carbapénémase est détertechniques de PCR etde séquençage, éventuellement par clonage de gène (

Figure 72. Démarche d’analyse des souches d’entérobactéries productrices de carbapénémases par le


L’analyse des souches suspectes d’exprimer une carbapénémase doit être rapide afin d’adapter la thérapeutique et isoler les patients porteurs. Le test de diagnostic Carba NP, mis au point dans

RM 914, est utilisé en routine depuis le 1er janvier 2012 directement sur colonies (). Ce test dont la sensibilité et la spécificité sont voisines de 100% permet l’obtention d’un résultat

en moins de 2 h. En cas de positivité, la nature précise de la carbapénémase est détertechniques de PCR etde séquençage, éventuellement par clonage de gène (Figure 72

analyse des souches d’entérobactéries productrices de carbapénémases par le CNR

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L’analyse des souches suspectes d’exprimer une carbapénémase doit être rapide afin d’adapter la thérapeutique et isoler les patients porteurs. Le test de diagnostic Carba NP, mis au point dans

RM 914, est utilisé en routine depuis le 1er janvier 2012 directement sur colonies (Figure ). Ce test dont la sensibilité et la spécificité sont voisines de 100% permet l’obtention d’un résultat

en moins de 2 h. En cas de positivité, la nature précise de la carbapénémase est déterminée à l’aide de 72).

analyse des souches d’entérobactéries productrices de carbapénémases par le

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2.1.2. Marqueurs épidémiologiques


Plusieurs techniques sont utilisées pour le génotypage des souches de bacille pyocyanique. La technique de référence (électrophorèse en champ pulsé après macro-restriction de l’ADN total par l’endonucléase DraI ou SpeI, ECP) est couramment utilisée par le service d’hygiène (Pr. Xavier Bertrand) du CHU de Besançon qui collabore avec le CNR. En parallèle, la technique MLST (Multi Locus Sequence Typing) a été développée pour le suivi des clones épidémiques. La capacité de typage est actuellement de 20 souches par semaine. Pour faire face à un accroissement important du nombre des demandes de génotypage des souches de P. aeruginosa et plus particulièrement de A. baumannii, nous avons mis en place la méthode du MLVA (Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis) au laboratoire. Cette dernière présente l'avantage d'être plus rapide et plus simple à réaliser que la PFGE tout en conservant le même pouvoir discriminant. Celle-ci est basée sur l'amplification respectivement de 10 et 8 VNTR par PCR chez P. aeruginosa et A. baumannii, suivie d’une analyse en électrophorèse capillaire (Bioanalyseur Agilent, disponible sur la plateforme de microdissection laser de l'Université de Franche-Comté). Ainsi, les données obtenues sont stockées et facilement comparées aux bases de données MLVA actuellement disponibles.


L’électrophorèse en champs pulsé (ECP) après macrorestriction de l’ADN total par l’endonucléase SmaI a été systématiquement utilisée pour le typage des souches d’ERG car il s’agit de la technique de référence jusqu’à fin 2012. Cependant, dans un souci de praticabilité, de faisabilité et de possibilité d’analyse inter-séries, la technique de rep-PCR (Diversilab, bioMérieux) est utilisée depuis le 1er janvier 2013. A noter que l’ECP est toujours utilisée en cas de problème technique ou de difficulté d’interprétation des données obtenuesopar rep-PCR. La technique de MLST (« MultiLocus Sequence Typing ») a aussi été développée pour le suivi des clones épidémiques d’ERG. Chez l’espèce, ce sont notamment les souches adaptées à l’environnement hospitalier qui appartiennent au complexe clonal 17 (CC17). A noter que la technique de MLST est assez lourde et coûteuse et que l’appartenance au CC17 est réalisée à ce jour par détection d’une séquence d’insertion spécifique, l’IS16. Une cartographie par PCR des opérons de résistance aux glycopeptides est parfois utilisée.


Le laboratoire de Clermont-Ferrand a deux types d’approche pour le typage des souches bactériennes. La première repose sur des techniques à haut débit basées sur une réaction de PCR : “Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR” (ERIC-PCR), “Repetitive Extragenic Palindromic PCR” (REP-PCR), la RAPD et la technique multiplex décrite par Clermont qui permet de classer rapidement les souches de E. coli dans les principaux groupes phylogénétiques de cette espèce. La deuxième approche est le typage moléculaire par ECP. Les capacités de typage par ECP sont actuellement de 96 souches par mois. Nous envisageons de remplacer l’ECP par une stratégie de typage par REP-PCR suivi d’une analyse en électrophorèse capillaire (Bioanalyseur Agilent disponible à l’Université) à l’aide du système Diversilab. Ce système est arrivé à maturité ; il permet un typage des souches comparable à l’ECP pour un coût équivalent avec une rapidité (quelques heures) et une facilité de mise

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en œuvre bien supérieures. Le système permet une standardisation optimum des comparaisons et la création d’une base de données étendue. Par ailleurs, nous avons l’expérience du typage par MLST avec notamment les systèmes utilisés à l’Institut Pasteur pour les souches de E. coli et de K. pneumoniae. Ce type d’approche sera réservé à des études de macro-épidémiologie inter-centres après sélection de souches représentatives par ECP.


Le laboratoire de Bicêtre a l’expérience et les techniques permettant la comparaison des souches d’entérobactéries selon la technique de référence dite de “champ pulsé”, la technique de MLST basée sur la comparaison de gènes dits résidents ou conservés au sein de chaque espèce et la technique Diversilab (bioMérieux) basée sur une technique d’amplification et de comparaison de fragments d’ADN. Cette technique permet une comparaison rapide des souches d’entérobactéries avec une bonne spécificité. Ces techniques ont été appliquées à l’analyse de très nombreuses épidémies de souches d’EPC.

2.1.3. Collections de souches


Le laboratoire de Besançon dispose d’un Centre de Ressources Biologiques (CRB) en cours d’accréditation pour les bactéries et les virus, rattaché au CRB “Ferdinand Cabanne” de Dijon (collection de cellules eucaryotes) par des accords de coopération entre les CHRU de Besançon et de Dijon. Une charte a été signée entre les établissements en 2011. Les procédures de stockage, de contrôle de qualité et de traçabilité informatique sont opérationnelles depuis 2012 à Besançon pour conserver les échantillons microbiologiques. Le stockage principal des souches du CNR est réalisé à -80oC dans des congélateurs sous report d’alarme et contrôle de température. Les échantillons précieux sont stockés en doubles exemplaires.

Actuellement, le CNR de Besançon dispose d’une collection de 68 souches de référence appartenant principalement à l’espèce P. aeruginosa. Ces bactéries sont à la disposition de la communauté hospitalière pour satisfaire des demandes individuelles (formulaire à remplir) ou dans le cadre de contrôles inter-laboratoires. Le coût du transport est supporté par le CNR uniquement dans cette dernière situation. La collection s'est enrichie en 2013 de souches de référence de A. baumannii présentant divers mécanismes de résistance.


Le laboratoire associé de Caen possède une collection d’environ 200 souches de référence, soit d’espèces (entérocoques), soit de résistances (glycopeptides, macrolides,β-lactamines, aminosides…). Ces bactéries sont à la disposition de la communauté hospitalière pour satisfaire des demandes individuelles (formulaire à remplir) ou dans le cadre de contrôles inter-laboratoires. Le coût du transport sera supporté par le CNR uniquement dans cette dernière situation. Le stockage principal est réalisé à -80°C dans des congélateurs sous forme de doublons. Un projet de regroupement des collections de microorganismes de l’Université de Caen dans des locaux spécifiques (300 m²) avec une

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gestion par un ingénieur au sein de l’IFR146 ICORE est en préparation afin d’améliorer la sécurité et la traçabilité.


Le laboratoire associé de Clermont-Ferrand possède une collection de souches regroupant 208 entérobactéries caractérisées pour leurs gènes de résistance (souches publiées et/ou séquencées). Ces gènes codent essentiellement pour des β-lactamases - pénicillinases (TEM, SHV, PC…), pénicillinases résistantes aux inhibiteurs (IRT), BLSE (TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES, BES…), mutants complexes de type TEM (CMT), céphalosporinases plasmidiques (CMY, FOX, MOX, ACC, DHA, MIR, ACT) et carbapénèmases (NMCA, SME, KPC, VIM, IMP, OXA, NDM), mais aussi d’autres gènes comme les gènes plasmidiques de résistance aux quinolones ou aux aminosides. Les souches sont stockées à -80°C dans deux congélateurs différents (CHU et Université). Un des congélateurs (CHU) fait l’objet d’une surveillance 24/24h, 7/7 j par une astreinte technique spécifique, qui peut mettre en œuvre des actions correctives ou assurer le transfert du contenu dans un congélateur de secours après avis du biologiste responsable. Les données correspondant aux souches sont conservées dans une base informatisée qui est sauvegardée toutes les fins de journée. Nous envisageons de transférer ces données sur le module « souchier/sérothèque » du logiciel Labo Serveur afin de bénéficier d’une meilleure sécurité (modification, confidentialité) et d’une sauvegarde automatisée. Dans le cadre du CNR, le laboratoire s’engage à enrichir la collection actuelle par une démarche active d’acquisition de souches. L’objectif est de développer un souchier exhaustif sur les mécanismes de résistance pouvant être rencontrés chez les entérobactéries. Cette collection servira à évaluer des outils diagnostiques, à organiser des contrôles inter-laboratoires et à satisfaire des demandes individuelles.

Le laboratoire possède d’autres collections dont ECOR qui est constituée de souches de pathogènes digestifs parmi lesquels se trouvent plus de 70 EHEC. Les souches non exigeantes sont conservées en tube à température ambiante. Les espèces exigeantes et/ou fragiles sont congelées à -20°C. Elles sont étiquetées, rangées par date d’isolement et référencées dans le logiciel Labo Serveur (Inlog) du laboratoire à l’aide du numéro de dossier patient.

• Conditions de stockage : -80°C et -20°C • Conditions de mise à disposition de ces collections : Accès libre et gratuit sur demande


Le laboratoire associé de Bicêtre possède la plus importante collection européenne de souches de bacilles à Gram négatif, notamment d’entérobactéries, dont les mécanismes ont été identifiés précisément, d’un point de vue moléculaire et biochimique. Cette collection comprend notamment de nombreuses souches de sensibilité diminuée ou résistantes aux carbapénèmes, correspondant à l’expression de carbapénémases variées (KPC, OXA-48, OXA-181, NDM-1, IMI-1, Nmc-A, Sme-1/2, GES…) ou à des mécanismes combinés (imperméabilité associée à la surexpression de céphalosporinases ou à la production d’une BLSE). Le laboratoire dispose également d’une collection importante de souches cliniques d’entérobactéries résistantes, notamment par production de carbapénémases, à l’origine de la plupart des épidémies identifiées en France. Le laboratoire poursuivra sa politique active de développement de cette collection en incluant les clones les plus prévalents d’un point de vue international.

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2.1.4. Techniques recommandées par le CNR

Les techniques suivantes sont mises en ligne sur le site web du CNR (http://www.cnr-resistance-antibiotiques.fr) :

• Détermination de la CMI de la colistine des souches de P. aeruginosa • Réalisation d’un antibiogramme de P. aeruginosa sur milieu gélosé de MH+cloxacilline

1000µg/mL • Réalisation d’un antibiogramme de A. baumanniisur milieu gélosé de MH + cloxacilline

250µg/mL • Réalisation des tests de synergie par la méthode de rapprochement de disques chez

P. aeruginosa • Réalisation des tests de synergie par la méthode de rapprochement de disques chez

A. baumannii • Technique de mise en évidence rapide de l’activité carbapénèmasechez les entérobactéries :

Carba NP test

rapport cnr 2013 · 2014-06-27 · 1 résumé analytique laboratoire de besançon pseudomonas...

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