quantification des peptides -...

Exemple : Echantillons de feuilles de tournesol, analyses shotgun● Gamme de quantité de protéine : 200, 400, 600, 800, 1000 ng● 2 répétitions techniques

Exemple : Echantillons de feuilles de tournesol, analyses shotgun● Gamme de quantité de protéine : 200, 400, 600, 800, 1000 ng● 2 répétitions techniques

Réponse à la gamme pour les 3818 peptides corrélés avec ρ>0.78

Quantification des peptides

4771 peptides quantifiés dans les 10 échantillons1263 protéines quantifiées grâce à ces peptides

80% des peptides sont corrélés à la quantité de protéine avec r > 0.78

Quantification des peptides

Exemple : échantillons de soies de maïs, analyses shotgun● 3 génotypes, 4 traitements● 3 répétitions biologiques

Exemple : échantillons de soies de maïs, analyses shotgun● 3 génotypes, 4 traitements● 3 répétitions biologiques

Quantification des protéines

Exemple : Echantillons de levure, analyses shotgun● 3 répétitions biologiques● Corrélation entre un réplicat et la moyenne des réplicats biologiques

Exemple : Echantillons de levure, analyses shotgun● 3 répétitions biologiques● Corrélation entre un réplicat et la moyenne des réplicats biologiques


XtandemMascot

X!TandemPipeline

MassChroQ

Protein identification

Protein inference,filtering

Peptide quantification

Protein quantification

AllPSumMean

Statistics(R scripts)

Quantitative comparisons

Workflow

PROTICdb


Problèmes :

● Les peptides partagés : comment faire pour tenir compte du fait que la valeur quantitative observée sur certains peptides est le résultat de la présence de plusieurs protéines ?

● Effet peptide : tous les peptides ne répondent pas de la même façon.

● Effet MPT ou artefact : certains peptides répondent de façon non corrélé aux autres

● Données manquantes : les données manquantes ne doivent pas induire une variation importante de l'estimation de la quantité.

Comment fabriquer une valeur quantitative par protéine à partir de la quantification des peptides ?

On cherche à obtenir une valeur fiable, si possible comparable entre protéines différentes.


Solutions pour quantifier les protéines

● Utiliser des modèles statistiques sophistiqués permettant de prendre en compte les peptides partagés et d'estimer leur contribution aux différentes protéines présentes dans l'échantillon (Blein-Nicolas et al 2012)

● Quantifier les protéines uniquement à partir de peptides protéotypiques, en utilisant les méthodes de type SRM

● Ne pas tenir compte des peptides partagés dans la quantification:se servir uniquement des peptides spécifiques

Résoudre la question des peptides partagés

Résoudre la question de la réponse spécifique des peptides

● Modéliser l'effet peptide dans des analyses de variance après retrait des peptides partagés

● IBAQ : somme de tous les peptides quantifiés, normalisés par le nombre de peptides théoriquement observables

● Moyenne des intensités de tous les peptides quantifiés● Top3 : somme des 3 peptides les plus intenses

Top3 est apparemment meilleure que IBAQ et Moyenne (Ahrné et al 2013, Proteomics 13, 2567–2578)

Quantification des protéines – validation des données

Avant de quantifier les protéines, s'assurer de la validité des données quantitatives mesurées

● Eliminer les données non fiables

● Eventuellement éliminer les échantillons non fiables

● Normaliser les données quantitatives

Exemple :

Comparaison entre quatre méthodes d'extraction des protéines de feuilles de maïs

Quantification des protéines - jeu de données

Quatre méthodes d'extraction des protéines sur un échantillon de feuille de maïs

● solubilisation dans une solution urée-thiourée avec ZALS (UTZE) ● solubilisation dans une solution urée-thiourée sans ZALS (UTEt)● solubilisation dans le SDS puis élimination du SDS par ion pairing (SDSR)● précipitation TCA/acétone (TCAA)

5 réplicats par méthode (4 pour TCAA)

Méthode shotgun (pas de séparation préalable)Analyse : LC-MS sans séparation préalable, Q-Exactive Méthode « Top8 » : 8 MS2 pour une MS, cycles de 1 à 1,5 secondes.Identification X!Tandem, filtrage X!TandemPipeline, quantification MassChroQ

MassChroQ produit :

● un fichier de résultats « peptides » :1 ligne par peptide*z dans chaque échantillon

● un fichier « protéines » : liaison peptide-protéine et descripteur de la protéine

Quantification des protéines - jeu de données

Nous produisons :● les métadonnées des échantillons (méthode d'extraction, génotype, organe, traitement,...)

Scripts R pour la validation des données, la construction de la valeur quantitative des protéines et les traitements statistiques

12697 peptides*z quantifiés

1859 protéines différentes (sous-groupes) identifiées

Quantification des protéines – Validation des données

Critère : largeur des pics chromatographiques

On peut décider d'éliminer les pics trop larges (peptides traînants)


Critère : Ecart-type du temps de rétention

Les LC ont été alignées, donc dans le cas idéal le temps de rétention d'un peptide devrait être constant. On s'attend donc à un écart type proche de 0.

On peut décider d'éliminer les peptides dont le temps de rétention est trop variable : c'est le signe d'un problème (mauvais appariement, mauvaise détection).

Ici on a pris un seuil à 15 sec, 71 peptides*z éliminés. Reste 12626 peptides*z


Critère : Répétabilité

On peut décider d'éliminer les peptides quantifiés trop rarement.● Critère de reproductibilité intra-goupe : combien de fois le peptide doit-il être présent pour être considéré comme répétable dans ce groupe (dans cette méthode d'extraction) ?

● Critère de reproductibilité inter-groupe : dans combien de groupes au moins le critère de reproductibilité intra-groupe doit-il être rempli ?

Attention à ne pas éliminer les variants qualitatifs.

Ici, au moins 4 fois quantifié par groupe, au moins dans 2 groupes. Reste 11497 peptides*z

Quantification des protéines – Normalisation

Vérification de la distribution des intensités dans chaque échantillons

Remarque : transformation log des intensités : log10(area)


Visualisation des différences entre échantillons

log1

0(area

)

Echantillons

Un effet global affecte de la même façon tous les peptide*z de chaque échantillon.Nécessité de normaliser pour que les données se rapportent à une quantité constante.La normalisation affectera tous les peptides*z d'un échantillon de la même façon.


On choisit un échantillon de référence puis

Dans chaque échantillon

● Pour chaque peptide présent dans la référence et dans l'échantillon

Calcul du rapport intensité échantillon/intensité référence (soit calcul de la différence log(Iéchantillon)-log(Iréférence))

● Calcul de la valeur médiane du rapport (de la différence)● Normalisation per se : multiplication de chaque intensité par l'inverse du rapport

(soustraction de la différence de log)

Méthode de normalisation utilisée

0.0000000000 0.0892062234 -0.1517961202 -0.0076519826 0.0355483579-0.0532138647 0.0346179697 0.0018421322 0.0055344169 0.1784791405-0.1758227232 0.0190976121 -0.0046634622 0.0597356655 -0.1217228606 0.0008669232 0.0721730464 -0.0546791840 -0.1710141057

Facteurs de normalisation


Effet de la normalisation

Quantification – réduction à une valeur par protéine

Méthode utilisée : somme des peptides normalisés, répétables et spécifiques

Ici, réduction à 9363 peptides*z, 1823 protéines

Critère additionnel : élimination des protéines quantifiées avec un seul peptide+ critère de répétabilité sur les protéines

Ici, réduction à 1362 protéines

On a maintenant une valeur par protéine dans chaque échantillon :Possibilité de réaliser des analyses statistiques « classiques » :ACP, analyses de variance,...

Quantification des protéines – ACP

ACP : bonne séparation des échantillons en fonction de la méthodeLes 2 méthodes à base d'urée sont confondues

Langella et al, Proteomics 2013

ACP sur les protéines présentes dans tous les échantillons



Cercle de corrélations :Pas d'effet des méthodes sur les compartiments cellulaires (termes GO)






Les protéines intrinsèques aux membranes sont mieux extraites avec la méthode basée sur une extraction SDS







Les protéines ribosomales sont moins bien extraites avec la méthode TCA/Acétone







Les protéines ribosomales sont moins bien extraites avec la méthode TCA/Acétone

Tonoplast monosaccharide transporter




Utilisation de MeV (http://www.tm4.org/mev.html)

Importation dans MeV des données protéines sous forme de ficher .csv

Ex : classification hiérarchique à partir des protéines significatives dans une ANOVA à 1 facteur



Utilisation de MeV (http://www.tm4.org/mev.html)

Ex : Clustering, méthode de SOTA


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