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Séparation magnétique des plasmocytes

dans le cadre des myélomes multiplesElodie DAVIDEquipe Onco-hématologie en cytogénétique


Sommaire

1. Le Myélome Multiple : Définition

4. Les outils de séparation : Différents appareils

3. La séparation magnétique : Principe

2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ?


1. Le Myélome Multiple Définition :prolifération maligne d’un clone plasmocytaire produisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou l’un de ses fragments

3 stades (classification de Durie et Salmon) :

Plasmocytes matures

Stade I

Plasmocytes immatures

Cytoplasme important

Stade II

PlasmoblastesFormation d’agrégats

Stade III


Incidence:-Augmente avec l’âge-Légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme-Moyenne d’âge de 64 ans

Diagnostic :-Mise en évidence d’une gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire-Mise en évidence d’une prolifération plasmocytaire médullaire

Signes cliniques:-Lésions osseuses-Hypercalcémie-Anémie-Insuffisance rénale…

1. Le Myélome Multiple


Anomalies cytogénétiques :

- Hyperdiploïdie : 48-74 chromosomes : +3, +9, +15, +19…

- Hypodiploïdie

- t(4;14)

- Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et 17

1. Le Myélome Multiple

Valeur pronostique permettant un traitement adapté

sans anomalies de structure associées

Cytogénétique conventionnelle : vue d’ensemble du caryotype hyperdiploïdie

Diagnostic et suivi :

Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible anomalies fines comme t(4;14), del(13),

del(17)

ET


2. Pourquoi une purification des plasmocytes?

Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 14, 13 et 17

Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes

Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire


3. Séparation magnétique des plasmocytesPlasmocytes = CD138+

1. Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique2. Tri sur colonne magnétique

3. Création d’un champ magnétique4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique

Principe :

3 appareils (Miltenyi) : - VarioMACS- AutoMACS- AutoMACS Pro


3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS

Réalisation d’un ficoll

Récupération des globules blancs au niveau de l’anneau

Filtration de la moelle totale

Lavage

Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique

Passage de l’échantillon dans une colonne de billes magnétiquesCréation d’un champ magnétiqueRécupération de la fraction négativeCassure du champ magnétiqueRécupération fraction positive

1

34

6

7

5

PlasmaCellules mononucléesFicollPolynucléaires et globules rouges

2

Lavage


3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS Perte cellulaire dans le ficoll :

Utilisation de l’AutoMACS Pro

Colonnes et valves souvent saturées Technique lourde (temps)

- agrégations protéique et plasmocytaire

- cellules de tailles différentesI II III


AutoMACS Pro3. Séparation magnétique des plasmocytes

Sélection du programme

Tri magnétique sur AutoMacs Pro3 tubes : échantillon, fraction négative et positive

Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive

Après technique, 3 lames étalées :t(4;14),13 et 17

Filtration de la moelle totale

Lavage

Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique

1

3

4

2 Lavage

5

6

7

8


AutoMACS Pro3. Séparation magnétique des plasmocytes

Adaptation du programme de séparation

Travail sur moelle totale : Ac anti-CD138 plus concentrésrendement augmenté (>86% : panel FISH complet)

automate moins saturé, maintenance adaptée Tampons plus agressifs et filtres 40 µm

pureté augmentée (<5% d’échec de purification)

AutomatisationGain de temps


CONCLUSION

routine dans les bilans de myélome multiple

si nécessaire préférée à la mise en culture

support pour les études pangénomiques

Séparation magnétique :


Remerciements

L’équipe d’onco-hématologie en cytogénétique, CERBA

L’équipe de FISH, CERBA

Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA

MILTENYI


Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon

http://med2.pagesperso-orange.fr/import/CANCERO/CLASSIFICATION/MYELOME.htm


4p13 : fluorochrome rouge 14q32 : fluorochrome vert

t(4;14)(p13;q32)

del(17)(p11)

Bandes R

del(13)(q14q21)Bandes G

Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques


1er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL d’Ac anti-CD138

PatientBone

Marrow (ml)

Total WBC

% Plasma

cells slide

Theoric Total

plasma cells

MicroBea

ds

Control Purity by flow cytometry

Obtened Total

Labeled P cell

Performance

07D0570753 4.8 mL 3.3*10^

6 c/mL36% 50 µL 94,60% 5.3*10^5 60% 6.5*10^6 8,15%

07D0572733 6.2 mL 5.8*10^

6 c/mL8% 50 µL 93,4 5.6*10^5

72.7% 2.6*10^7 2,15%07D0566

314 4.3 mL 4.1*10^6 c/mL

5% 50 µL 68,40% 10.9*10^4

59.3% 1*10^7 1,10%

07D0577164 5.8 mL 5.6*10^

6 c/mL4% 50 µL 72,80% 1.7*10^5 1% 3.2*10^5 53,13%

07D0583892 3 mL 4*10^6

c/mL22% 50 µL 88,40% 2.5*10^5 15% 1.8*10^6 13,90%

07D0583530 5.3 mL 8.4*10^

6 c/mL0% 50 µL 65,50% 5.2*10^4 5% 2.2*10^6 2,36%

07D0587071 2.7 mL 3*10^6

c/mL15% 50 µL 88,70% 1.8*10^5 12% 9.7*10^5 19%

07D0606916 6.1 mL 7.7*10^

6 c/mL3% 50 µL 31% 7.4*10^4 1% 4.7*10^5 15,70%

07D0609147 6.8 mL 1.1*10^

6 c/mL60% 50 µL 54,10% 1.5*10^5 5% 3.7*10^5 40,50%

07D0609191 6.3 mL 1.6*10^

7 c/mL8% 50 µL 65,50% 1.8*10^5 1% 10^6 18,00%

% of plasma cells reported by cytologist

% and total plasma cells number determined by flow cytometry labelled by CD138/CD38

Annexe 3 : mise en place d’un nouveau protocole

Mauvais rendement : adaptation

de la quantité d’Ac

: 50µL Ac pour 107 cellules


Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation

Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH

PosselWB+Clean=

Meilleur rendement

Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean

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