Production de protéines recombinantes chez les plantes

« Molecular farming »

Définition

« Molecular farming » :Production de protéines d’intérêt

pharmaceutique par des organismes recombinants

Franken et al. (1997) Curr Opin Biotech.

Ne rentre pas dans cette définition : La production d’anticorps anti-pathogènes de plante chez le blé

Les protéines thérapeutiques, un marché en pleine expansion

Prévision 2010 : 60 milliards de $

Pissara (2004) Nature Biotech.

Production de protéines recombinantes

Le plus simple : Production d’insuline par une bactérie

Le plus complexe: Production de complexes à plusieurs

sous-unités (IgA) par une plante de grande culture

Actuellement : virage technologique

Abaissement drastique des coûts de production en systèmes hétérologues

Bouleversement important à venir dans les pratiques médicales

Avant tout : quelle protéine exprimer ?

Démarche Caractérisation d’une protéine d’intérêt

pharmaceutique Clonage, mise au point de la production

Exemple 1921 : l’insuline facteur anti-diabète 1951 : séquençage peptidique 1982 : expression en bactérie 1997 : première autorisation de mise sur le

marché

Fisher et Emans (2000) Transgenic Res.

Mais….

L’insuline est une protéine simple : Faible poids moléculaire non glycosylée

L’expression en bactérie fonctionne exceptionnellement bien

Production de protéines complexes

Organismes eucaryotes Levures

Cellules animales : lait, urine Cellules d’insecte : système baculovirus

Le végétal comme système d’expression

Milieux de culture simples et peu coûteux / cultures animales De l’eau, du substrat et du soleil

Possibilité de monter en échelle la production Filière des plantes protéagineuses Applications médicales très « gourmandes » en

quantité de protéines

Stabilité des protéines dans les organes de stockage

Le végétal comme système d’expression

Maturation des protéines similaire aux mammifères

Pas de pathogènes pour l’homme

Pas d’endotoxines

Premiers succès de production chez les plantes

1986-1990 Hormone de croissance humaine Interférons (antiviraux - anticancéreux) Sérum albumine humaine

1989 : production d’anticorps par des plantes

Production de sous-unités lourdes () et légères () d’une IgG dans des lignées différentes de tabac

Assemblage par croisement des lignées Obtention d’anticorps réactifs (contre la

BSA) par test ELISA

Hiatt et al . (1989) Nature

Le « boom » technologique

Depuis 1990, dans des systèmes végétaux Anticorps Vaccins Facteurs sanguins Facteurs de croissance hématopoïétiques Effecteurs biologiques : interleukines Etc…

198 autorisations d’essais au champ entre 1991 et 2002 aux USA

Production compatible avec des tests pré-cliniques

Production de vaccins

Production de peptides antigéniques

Exemples d’applications

Hépatite B Choléra Diarrhées causées par E. coli

Vaccination orale de souris (Mus musculus) contre l’hépatite B

Production d’antigènes de surface de l’HBV dans des tubercules de pomme de terre

Consommation de tubercules crus

Injection unique de vaccin commercial

Semaines

An

ti-H

Bs

(miU

/ m

l)

Richter et al. 2000 Nature Biotechnology

Problèmes liés à la vaccination orale

Pomme de terre > 100 g de tubercule cru !!

Banane Palatabilité supérieure Reste le problème de la quantité

Améliorations Niveaux d’expression Adjuvants

Production d’immunoglobulines

Immunoglobulines

Diagnostique Anti-IgG

Thérapeutique Caries dentaires (CaroRx®,

PlanetBiotechnology)

Ciblage de cellules cancéreuses pour la radiothérapie (Monsanto)

Autres biomédicaments

Exemples de biomédicaments

Lipase recombinante dans l’endosperme de maïs (=Meripase®

produite par Meristem Therapeutics à Clermont Ferrand)

Lactoferrine dans le riz (Ventria Bioscience)

Protéines pharmaceutiques pour animaux

Stimulateurs du système immunitaire pour les crevettes ImmunosphèreTM Feed Additive

Prodigene : anti-diarrhéique produit dans le maïs utilisé chez le porc

Purification des peptides

Technologie corps lipidique / oléosineExsudation racinaire des protéines

Technologie corps lipidiques / oléosine

SemBioSys Genetic inc.

• Oléosines :

• Protéines organisatrices des gouttelettes lipidiques

• Fusion de protéine :: oléosine

Gene oléosine Fusion oleosin + gène X

Adressage

Adressage

Traduction

http://www.goodmedia.com/equicom/sembiosys/Main.aspx?id=24

Purification des protéines

Corps lipidiques

Extraits cytoplasmiques

Homogénéisation Séparation

Graines broyées

Protéases

Homogénéisation de la phase lipidique avec du

tampon d’extraction

Corps lipidiques

Protéines recombinantes

Une oléagineuse alternative pour la production de protéines

Carthamus tinctorius

Problèmes de propriété pour les plantes de grande culture

Pas de mauvaise herbe apparentée dans l’hémisphère nord

Exsudats racinaires

Purification des protéines : Jusqu’à 90% du coût de production

Système d’exsudation racinaire

Exsudation de substances carbonées (dont protéines)

Rhizosphère : racine + microflore

Exsudats racinaires

xylanase bactérienne Motif d’adressage RE sécrétion dans

le milieu extracellulaire Digestion d’un substrat (RBB xylane)

Témoin 35S:xylanase

Borisjuk 1999 Nature Biotechnology

Le problème de la glycosylation

Les plantes ont le même « cœur » que les mammifères

Chez les bactéries : pas de glycosylation

Chez les levures : Polymannose glycanes

Chez les mammifères et végétaux Le « cœur» est formé de deux résidus N-

acetylglucosamine

N-glycosylation des protéines

http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/cells/sf5x10.jpg

Gomord et al. 2005 Trends in Biotechnology

•Dans certains cas, protéines recombinantes non-fonctionnelles

•Résidus potentiellement immunogéniques

•Allergie aux pollens : IgE spécifiques des N-glycanes de plantes

Des différences qui posent problème…

Les planticorps sont plutôt déconseillés pour une administration parentérale

Usage ectopique ou oral

Impact sur le choix du système d’expression

Profils de glycosylation différents D’une espèce à l’autre Age des tissus

Choisir une espèce / tissu / stade physiologique le plus favorable

Le plus de % mannose possible

Gomord et al. 2005 Trends in Biotechnology

Enrichissement en résidus riches en mannose

Humanisation des protéines recombinantes

Chez les végétaux : pas de β1,4- galactosyl-transférase

Peut on modifier le système de glycosylation des plantes ?

Coexpression d’une GalT

Anticorps Galactosyl transférase

Anticorps + GalT

Anticorps

Anticorps + GalT

Bakker et al. (2001) PNAS

GlcNacß1-2Man1-3/6

GlcNacß1-2Man1-3/6

Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAc

Galß1-4GlcNAcß1-2Man1-6

Galß1-4GlcNAcß1-2Man1-3

Fuc 1-3

Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAc

Problème résiduel

Cependant…

Les humains sont exposés constamment aux glycoprotéines de plantes

Même des protéines complètement humanisées peuvent se révéler immunogènes

Pas de prédictibilité pour le caractère allergénique des protéines recombinantes

Gomord et al. 2005 Trends in Plant Science

Le suivi post-marketing des patients est un impératif dans le domaine des biomédicaments

Culture en plein champ

http://www.eeb.uconn.edu

Cultures en plein champ

Avantages Faible investissement en technologie agricole Fort potentiel de changement d’échelle de

production (« scalability ») Inconvénients

Mise au point des itinéraires techniques Variabilité climatique Difficulté d’appliquer des normes de bonnes

pratiques de fabrication courante (BPFc) Problèmes de dissémination

Quelques scandales ayant marqué les esprits

Affaire Prodigene : En 2003, une contamination dans le Nebraska d’une récolte de soja par des rejets de maïs produisant une protéine thérapeutique utilisée contre la diarrhée chez le porc provoque une révision des conditions de sécurité appliquées aux USA. La même année des maïs conventionnels avaient été contaminés dans l’Iowa par du maïs prodigene Greenpeace s’empare du sujet

Amende 250 000 $

Affaire Starlink : Maïs contenant un insecticide Cry9C interdit pour la consommation humaine mais autorisé pour la consommation animale. Pendant l’année 2000, on en retrouve dans plus de 300 produits amende historique

Stratégies de confinement

Exemple de Meristem Therapeutics Isolement géographique Isolement temporel Stérilité mâle Matériel de récolte dédié

Exemple de Biolex Therapeutics Lentille d’eau (Lemna minor)

Production confinée Pas de pollen, pas de consommation Productivité très importante

Conclusion

Expression hétérologue dans un système végétal : Nombreuses applications au stade pré-

industriel

Un système d’expression qui peut s’avérer tout à fait concurrentiel dans certains cas

Très gros potentiel de développement