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Nouveautés en Génétique Moléculaire des Cancers

Pr JP Merlio Service de Biologie des Tumeurs et CRB Cancer CHU BORDEAUX

INSERM U1053 Université de Bordeaux

Réunion du Réseau de Cancérologie d’Aquitaine

[email protected] 28 Novembre 2015

Why? How? What?

Liens d’intérêts: rémunération personnelle = 0 Contrats Pfizer, Abbott, Roche, Boerhinger avec CHU de Bordeaux, Université ou ADERA

Le réseau INCa des plateformes de génétique somatique des tumeurs

Plan

1. Rappel sur la génétique somatique des cancers

2. Le Séquençage Nouvelle Génération (NGS)

3. Cellules tumorales circulantes

4. ADN circulant - PCR digitale - NGS - Autres techniques

Mutation ponctuelle

Anomalie de nombre

1 chromosome Délétion Insertion Inversion Amplification

Plusieurs chr. Translocation Insertion

Cellule

Chromosome

ADN Double brin

Anomalie de structure

Anomalie de nombre

Macrolésions:

Microlésions

Anomalies épigénétiques - Méthylation - Acétylation des histones - …

Mutations oncogéniques somatiques ou acquises

Hardin J, Bertoni G, Kleinsmith LJ. Becker’s World of the Cell 8th edition. Pearson.

Protéine anormale (hyperactive)

Mutation ponctuelle

Protéine normale en excès

Amplification génique

Chromosome avec translocation

Protéine normale en excès

Néoprotéine chimérique

(hyperactive)

Translocation chromosomique

ou

ADN

Proto-oncogene

Les anomalies drivers ou pilotes de la tumeur sont des cibles phamarcologiques

Les analyses de génétique moléculaire somatique sont dans le continuum des analyses des pathologistes (microscopie) car elles se font sur le matériel tumoral

K sein/estomac : Her2 K colorectal : RAS Lymphomes, sarcomes et translocations … K poumon : EGFR, ALK… Mélanome : BRAF…

• Outils moléculaires utilisés: IHC (pathologistes): proteine FISH sur lames

Biologie moléculaire sur ADN, ARN: PCR, q-PCR, Séquençage, NGS Protéomique: à venir

Diagnostic Pronostic Traitement

La gestion d’un tissu inclus en paraffine 1-La qualité préanalytique (délai de fixation, durée)

2- Economie du matériel par pathologiste Demande d’analyse par le clinicien puis envoi par pathologiste

Recherche de mutations Recherche en IHC/FISH Sélection par un pathologiste de la zone tumorale (lame colorée) 3 ou 4 coupes au

microtome Exclusion des zones nécrosées ou non tumorale Estimation du pourcentage decellules tumorales (<5%= non réalisé <10% non contributif si wt)

Déparaffinage

Extraction

Punch de la zone Sélectionnée (macrodissection)

Lame colorée (HES)

Tissu inclus en paraffine

Coupe au microtome Sélections

Analyser un matériel assez riche en cellules tumorales

Macro-dissection

>75% <25%

Difficultés techniques

Hétérogénéité et évolution rapides des techniques ADN parfois dégradés par la fixation

Détermination du statut KRAS en pratique

Digestion tampon TNE + protéinase K

Incubation la nuit à 55°C

Lysat cellulaire

élution

Coupe Forage

ADN

J1

J2

Quantification des ADN

J-1 sélection cerclage

Extraction d’ADN à partir de tissus fixés

1ère étape : extraction de l’ADN

• À partir de quel matériel ? Congélation, blocs (coupes, punch) • Lyse des cellules et tissus

• Extraction par détergents

• Précipitation des protéines Précipitation de l’ADN

• Dissous dans un tampon

• Dosage UV

La réaction de PCR : que met-on dans la machine ?

L’ADN extrait (tumeur)

L’enzyme = ADN-polymérase A

T

C G

A A A

G

G C

C C

T T T

Des nucléotides Désoxy-ribo-nucléotides

Amorces spécifiques du gène à amplifier

1er cycle de PCR

N cycles de PCR → quantité ADN x eN

Dénaturation

Hybridation des amorces

Elongation : synthèse du brin complémentaire

Cycle 1 2 molécules Cycle 2

4 molécules Cycle 3 8 molécules

Cycle 4 : 16 …

Séquençage – EXEMPLE

C A T C A G C A A A G A C A A

A G C Sérine

Séquençage – EXEMPLE

KRAS, EGFR, CKIT, BRAF…

A G C

A G/C C

Sérine

Thréonine

C A T C A G C A A A G A C A A

C A T C A C C A A A G A C A A

GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA

GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA








100% NCI-H1975

EGFR exon 21 c.2573T>G

p.L858R

Réaction de séquence et d’analyse de l’ensemble des molécules

• La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR en point final

• Différence: amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel

• A chaque cycle d’amplification, la quantité d ’ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits

– Syber Green: intercalant – Sondes Taqman – FRET etc…

• Obtention d’une cinétique de la réaction • Quantification possible

qPCR : rappels

Seuil

Signal

Cycles 10 20 30 0

Bruit de fond

Phase exponentielle

Plateau Éch. 1 Éch. 2

PCR quantitative: Principe de la quantification

Cibles thérapeutiques dans le CBNPC

MSTO/IASCLC 2012 − D’après Kris M et al., Targeted therapies actualisé

1999

KRAS

Inconnu 75 %

2004

Inconnu 60 %

KRAS

EGFR

Inconnu 35 %

KRAS

EGFR

Sélumétinib Tramétinib ?

Géfitinib Erlotinib Afatinib Dacomitinib CO1686 ? Crizotinib

LDK378 CH5424802

ALK

PIK3CA MK2206 ? BKM120 ?

BRAF Vémurafénib ? GDC0879 ? Régorafénib ? Inhibiteurs de MEK ?

MET MetMAb ? ARQ197 ? HER2

Afatinib ? Dacomitinib ?

MEK Sélumétinib ?

ROS1 Crizotinib

RET Vandétanib ? L184 ? Sunitinib ?

Les stratégies moléculaires ciblées ont permis jusqu’à aujourd’hui de proposer une médecine personnalisée aux patients

Mais elles ont atteint leurs limites avec de petites quantités de tissu et un grand nombre de gènes à étudier

Nous savons que le nombre de biomarqueurs va continuer à augmenter +++

Les algorithmes d’analyses hierarchisées ne sont pas utilisés

Aujourd’hui: les techniques à haut débit

Principes généraux du NGS

• Le NGS ou séquençage nouvelle génération ADN : Whole Genome, Whole Exome ou ciblé ARN : RNAseq (transcriptome, transcrits de fusion, découverte de nouveaux transcrits…), smallRNAseq (transcriptome de microARN, découverte de petits ARN…)


Stratégie de fabrication de la Librairie: 2 approches

Capture Amplicon

Amplicon


Librairie par Amplicon


Stratégie d’amplification

Emulsion Support solide

Librairie

Séquençage Automatisation: Ion Chef PCR en émulsion, enrichissement

Equipement

Analyse Bioinformatique

Détection des variants

Fichier VCF

fastQ

SAM

Pratique au Service de Biologie des Tumeurs

Stratégie:

• Panel de gènes custom • Construction de la librairie par ampliseq (amplicons) • Amplification par PCR en émulsion • Séquençage sur PGM IonTorrent

Du prélèvement au Compte-Rendu biologique

• Extraction de l’ADN (FFPE, congélation ou plasma)

• Analyse moléculaire par NGS: synthèse librairie, amplification clonale et séquençage

• Interprétation de l’analyse: Vérification des témoins, vérification de l’absence de contamination Analyse des ADN patient (+/- technique complémentaire)

• Réalisation du Compte-Rendu biologique

Gene exon c. p. Var.freq.PIK3CA 21 c.3140A>G p.(His1047Arg) 25EGFR 18 c.2155G>A p.(Gly719Ser) 16,65EGFR 19 c.2235_2249del p.(Glu746_Ala750del) 6EGFR 20 c.2369C>T p.(Thr790Met) 6EGFR 21 c.2573T>G p.(Leu858Arg) 6EGFR 21 c.2582T>A p.(Leu861Gln) 6BRAF 15 c.1799T>A p.(Val600Glu) 34KRAS 4 c.436G>A p.(Ala146Thr) 8KRAS 2 c.38G>A p.(Gly13Asp) 8KRAS 2 c.35G>A p.(Gly12Asp) 8

Compte-Rendu biologique Conclusion : Selon les recommandations en vigueur, seules les mutations pouvant avoir un impact thérapeutique sont mentionnées ci-dessous : Absence de détection de mutation des exons 11, 15 du gène BRAF, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Mise en évidence de la mutation c.2236_2250del; p.(Glu746_Ala750del) dans l'exon 19 du gène EGFR. Mutant sensible aux inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase. Mise en évidence de la mutation c.2369C>T; p.(Thr790Met) dans l'exon 20 du gène EGFR. Mutation liée, dans l'état actuel des connaissances, à la résistance aux inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase de l'EGFR. Absence de détection de mutation des exons 18, 21 du gène EGFR, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Absence de détection de mutation de l'exon 20 du gène ERBB2, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Absence de détection de mutation des exons 2, 3, 4 du gène KRAS, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Absence de détection de mutation des exons 10, 21 du gène PIK3CA, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Les essais cliniques en cours sont consultables sur le site <http://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Essais-cliniques-et-therapies-ciblees>.

Pratique au Service de Biologie des Tumeurs

Liste des cibles actionnables tumeurs solides: selon recommandation INCA

Nouvelles techniques

Séquençage nouvelle génération (NGS)

Ciblées sur un panel de cibles « actionnables »

Fragments d’exons hotspot

Analyse par PCR en pont ou en émulsion

Semi globales : Exome sequencing: régions codantes

Génome entier

Avantage par le nombre de mutations simultanément étudiées

Avantage par sensibilité en théorie

NGS et PCR digitale










Réaction d’amplification et de séquence individuelles pour chaque molécule

Plan

1. Le Séquençage Nouvelle Génération (NGS)

2. Cellules tumorales circulantes

3. ADN circulant

4. PCR digitale

• Biopsie liquide Analyse pour les CTC: sang total

Analyse plasmatique, ADN tumoral circulant

Tumeur primitive ou métastase

Eviter le relargage d’ADN d’ADN normal par les cellules nucléées sanguines

2- Cellules tumorales circulantes=CTC

Circulating Tumor Cells

Cellules circulantes : détection de réarrangements d’ALK

Ilie et al., Ann. Oncol. 2012

Rappels - Généralités

Qu’est ce qu’une CTC? • Constitue le lien entre la tumeur primitive et la métastase • Transite par le sang (cancer du poumon) ou les vaisseaux lymphatiques (cancer

du sein) • +/- Potentiel invasif et de dissémination tissulaire • Rôle dans la récidive (cellules dormantes et phénomène de « tumor-self

seeding »)

Passage dans le sang des CTC: • Évènement probablement très précoce de la carcinogénèse • Passage trans-endothélial et dans la circulation sanguine facilité par le

phénomène de transition-épithélio-mésenchymateuse (TEM), • CTC présentes en très faible quantité dans le sang : évènements très rares (1 à

10 CTC par mL de sang) Nécessité d’un niveau de sensibilité élevé

Principes généraux pour la détection des CTC:

• Immunodétection : capture des CTC grâce à l’expression de certains Ag qui

ne sont pas présents sur les cellules sanguines CellSearch® basée sur l’enrichissement de cellules exprimant l’Ag EpCAM • Isolement des CTC par leur densité (> à celle des éléments figurés du sang) Méthode OncoQuick® • Isolement des CTC par leur taille et morphologie: Enrichissement direct en

cellules épithéliales par filtration Méthode ISET® (Isolation by Size of Epithelial Tumor cell), CTC sont plus grosses que les autres cellules du sang : 25-30 µm; puis coloration cytochimique pour analyse morphologique

(GR = 7 µm, Ly non activé = 9-10 µm, PNN non activé = 15-20 µm)

Méthode de détection des CTC

Hofman V et al, Anatomie et cytologie pathologiques, revue francophone des laboratoires 2013

Intérêt des CTC en cancérologie

Intérêt des CTC en cancérologie : • Diagnostic : diagnostic précoce, résidu tumoral microscopique • Pronostic : existe t-il une corrélation avec le risque métastatique et la survie ? • Prévention : détection dans des populations à risque (dépistage)

Caractérisations moléculaires des CTC : • Biopsie en « temps réel » • Théranostic : thérapeutique ciblée et détection de résistance au traitement • Compréhension des mécanismes tumoraux et recherche de nouvelles cibles

thérapeutiques (gènes) • Greffe de CTC pour évaluation préclinique (ex mélanome)

3- ADN tumoral circulant

Libération d’ADN dans le sang

ADN provenant de la destruction des cellules normales circule librement dans le sang. Chez un patient ayant un cancer, on retrouve en plus de l’ADN provenant de la tumeur.

Taux d’ADN circulant : • Individus sains : dizaines de ng/ml • Si progression tumorale : centaines de ng/ml Corrélation entre le taux d’ADN circulant et la progression tumorale dans la plupart des cancers.

Crowley, E. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2013

Libération d’ADN dans le sang

Origine, plusieurs hypothèses : • Dégradation naturelle des cellules normales

ou tumorales • Apoptose ou nécrose des cellules de la

tumeur primitive • Relargage actif d’ADN par les cellules

tumorales ou leur passage dans le système vasculaire suivi d’une mort cellulaire

• Lyse des cellules cancéreuses en circulation dans le plasma ou micrométastases

Présence d’ADN tumoral circulant = conséquence d’une circulation des cellules tumorales dans un processus métastatique

Pourquoi détecter les altérations de la tumeur au niveau de l’ADN circulant ?

Recherche altération sans prélèvement tumoral • Prélèvement en suivi tissulaire non réalisable • Matériel épuisé • Mauvaise qualité ADN (métastases osseuses) • Prélèvements disponibles pauvres en cellules tumorales • Reflet global des différents sites métastatiques

Suivi efficacité traitement • Rémission moléculaire de la mutation EGFR cible (ex : disparition mutation activatrice

EGFR)

Détection rechute • Réapparition mutation cible • Apparition mutation résistance

Facteur pronostique ?

Gestion des échantillons

Centrifuger tube de sang <4h après le prélèvement Conservation du plasma entre -20°C à -80°C Conservation des ADN circulants extraits à -20°C Eviter les cycles de décongélation-recongélation répétés

Echantillons prélevés stables jusqu’à 10 jours à TA Pas de centri/congelation au niveau du site préleveur, mais coût

Tube EDTA

2x Tube CELL-FREE DNA BCT

2x

10 mL

Extraction et Amplification

• Extraction du plasma: • Kits d’extraction spécifiques:

ex. Extraction kit Qiagen QIAAMP circulating nucleic acid

• Analyse de l’échantillon : Technique suffisamment sensible!

Connecting system

Système d’aspiration: extraction sur colonne

Altérations génétiques détectables dans l’ADN tumoral libre circulant

• Libération de petits fragments d’ADN libre dans la circulation (par différents mécanismes) par les cellules tumorales

• Mutations ponctuelles (EGFR et KRAS) • Variation du nombre de copies,

amplifications (HER2 et MET) • Réarrangements chromosomiques

(EML4-ALK) • Profils de méthylation

Vallée et Denis, 2014

Valeurs diagnostique et pronostique des concentrations en ADN circulants?

Biopsie liquide : CTC ou ADN circulant?

Ilie et al, Ann Transl Med 2014;2(11):107

Perspectives et Conclusion

Nouvelles perspectives en oncologie: • Classification morphologique et génétique somatique (ADN) de la tumeur

• Génomique: Exome, miROme, methylome

Apport de la biopsie liquide (CTC, ADN circulant): • Dépistage, diagnostic moléculaire sans tissu • « Monitoring » de la maladie et résistance • Evaluation / imagerie, marqueurs tumoraux, re-biopsie site progression

Merci de votre attention !

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