pour obtenir le diplôme de docteur es sciences en...

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université d’Oran

Faculté des Sciences Département de Biologie

Pour obtenir le diplôme de Docteur ES SCIENCES en Biologie

Spécialité Microbiologie

Intitulé

Présenté par Mme : Sous direction du : MEDOUAKH Lynda Pr BENSOLTANE Ahmed . Devant le jury :

Président AOUES Abdelkader Professeur Université d’Oran Directeur de thèse BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d’Oran Examinateur LAROUS Larbi Professeur Université de Sétif Examinateur DJIBAOUI Rachid Maitre de conférence -A- Université de Mostaganem Examinateur CHOUGRANI Fadéla Maitre de conférence -A- Université de Mostaganem Examinateur BEKADA M. Ahmed Maitre de conférence -A- Université d’Oran

Année : 2010 - 2011

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Sommaire

Résumé

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des abréviations

Revue bibliographique

Introduction………………………………………………...........................................................................................1

I Généralité sur H. pylori

I-1 Historique ………………………….……………………………………………………….………………………………………………4

I-2 Anatomie et Histologie…………………………………………………………………….…………………………………………..6

I-2-1 Anatomie……………………..…………………………………………………………..........……………………………………..6 I-2-2 Histologie………………………………………………………………………..………………………………………..……………….7 I-3 Physiologie de l’estomac……………………………………..………………………………………………………………………. 9 I-3-1-Fonction mécanique………………………………..…………………………………………………………………………………9 I-3-2-Fonction chimique…………………………………………………………………………………………..………………..........9 I-4 Mécanisme de régulation…………………………………………………………………………………………………………..10 I-5 Taxonomie de H. pylori …………………………………………………………..…………………………………….……………10 I-6 Ecologie………………………………………………………………………..………………………………………………….………...12 I-7 caractères morphologiques………………………………………………………………….........................................16 I-8 Caractères culturaux…......................................................................................................................17 I-9 caractères phénotypiques .........................................................................................................…...17 I-10 Caractères génétiques…………………………………………………………………………………………………………..…..19 I-11 Transmission…………………………………………………………………………......................................................21 I-12 Prévalence…………………………………………………………………………………………………………………….………….22 I-13 Facteurs de colonisation ………………………………………………………………………………………………….……….24 I-13-1 Mobilité …………………………………………………………………………………………………………..…………………….25

I-13-2 l’Urease …………………………………………………………………………………………………………………………..…….25

I-13-3 Adhérence ………………………………………………………………………………………………………………….…..…….25

I-14 MECANISME DE PERSISTANCE………………………………………………………………………………………………………....26 I-15 REACTIONS INFLAMMATOIRES…………………………………………………………………………………………………………..26 I-16 MÉTHODES DE DIAGNOSTIC ……………………………………………………………………………………………………….…...28 I-16-1 METHODES INVASIVES……………………………………………..………………………………………………………………….28 I-16-1-1 TEST À L’URÉASE ……………………………………………………………………………………………………………………28

I-16-1-2 EXAMEN CYTOLOGIQUE…………………………………… ………………………………………………………………………31 I-16-1-3 EXAMEN ANATOMOPATHOLOGIQUE…………………………………………………………………………………………....31

I-16-1-4 CULTURE…………………………………………………………………………………………………………………................32 I-16-1-5 PCR EN TEMPS REEL………………………………………………………………..………………………..……………….......32 I-16-2 METHODES NON INVASIVES………………………………..……………………………..………………….………………………33 I-16-2-1 TESTS RESPIRATOIRES ……………………………………….………………………………..……………..…………………….33 I-16-2-2 SEROLOGIE …………......................................................................................................................34 I-17 PATHOLOGIES ASSOCIEES A HELICOBACTER PYLORI ………………………………………………..………….……………….…35 I-17-1 GASTRITES…………………………………………………….…………………………………………………..………………………35 I-17-1-1 GASTRITE AIGUE………………………………….…………………………..…………………………………..………………...37 I-17-1-2 GASTRITE CHRONIQUE ……………………………..…….…………………………………………………………..………….. 37 I-17-2 ULCÈRE DUODÉNAL……………………………………………………………………………………………………………………. 38 I-17-3 ULCÈRE GASTRIQUE ………………………………………………………………....……………………………………………..…39 I-17-4 CANCER GASTRIQUE………………………………………….……………………………..………………………………………….40 I-17-5 LYMPHOME GASTRIQUE DE MALT ………………………………………………………..………………..………………..….41 I-18 SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES…………………………..……….………………………………..………………………………..43 I-19 Traitement………………………………………………………………………………………………………………………………..43 I-20 Traitement par les probiotiques ……………………………………………………………………………………………… 46 I-21 Vaccination………………………………………………………………………………………………………………………………..47 II- Généralité sur les bactéries lactiques………………………………………………………………………….…………......48 II-1 Historique……………………………………………………………………………………………………………………….………... 48 II-2 Caractères généraux ……………………………………………………………………….............................................48

II-3 Taxonomie ………………………………………………………………………………………………………………………………...50 II-4 Habitat ……………………………………………………………………………………....................................................52 II-5 Ecosystème gastro-intestinal……………………………………………………………….........................................52 II-6 Utilisation des bactéries lactiques dans le domaine agro-alimentaire …........................................55 II-7 Intérêts des bactéries lactiques en santé humaine ………………………………………...............................59 II-8 Souches probiotiques utilisées…………………………………………………………… ………………………………….. .59 II-9 Probiotiques et les infections gastro-intestinales……………………………………………………………............60 II-10 Interaction entre les bactéries lactiques…………………………………………………………………………….…...60 II-10-1 Inhibition des bactéries lactiques…………………………………………………………………………………….…….61 II-10-1-1 Acides organiques……………………………………………………………………….…………………………………....61 II-10-1-2 peroxyde d'hydrogène ……………………………………………………………………………………………………. 64 II-10-1-3 dioxyde de carbone ………………………………………………………………………………………………….........65 II-10-1-4 Diacétyle……………………………………………………………………………………………………………………………65 II-10-1-5 Acétaldéhyde………..…………………………………………………………………………………………………………..66 II-10-1-6 Reutérine……………………………………………………………….…………………………………………………………..66 II-10-1-7 Bactériocines …………………………………………………………………………………………………………………..67 II-11 Les lactobacilles………………………………………………………………………………………………………………………..68 II-11-1 Caractères généraux……………………………………………………………………………………………….…………….68 II-11-2 Habitat………………………………………………………………………………………………………………..…………………71 II-11-3 Effets des lactobacilles sur la santé…………………………………………….……………………………………71 Matériel et méthodes

Objectif du travail………………………………………….……………………………………………………………………………….74 I-Isolement et identification de H. pylori …………………………………………………………………..…………………….75 I-1 Echantillon et origine du matériel……………………………………….……………………………………………………..75 I-2 Prélèvement ……………………………………………………………………………………………………………………………...75 I-3 Conservation des biopsies …………………………………………………………………………………………….…………76 I-4 Examen anatomopathologique …………………………………………….…………………………………………………..76 I-5 Examens microbiologiques …………………………………………………………………………………………………..….. 76 I-5-1 Examen cytologique ………………………………………………………………………………………………….……….... 76 I-5-2 Test rapide à l’Urée……………………………………………………………………………..………………………………...77 I-5-3 Culture et isolement ……………………………………………………………………………..…………………...........78 I-5-3-1 Condition de culture ……………………………………………………………………………………..………………...78 I-5-3-2 Milieux de culture ……………………………………………………………………………………………………………..78 I-5-3-3 Isolement ………………………………………………………………………………….……………………………………...79 I-5-3-4 Identification ………………………………………………………………………………..…………………………………...79 I-5-3-4-1 Examen macroscopique…………………………………………………….……………………………………………….79 I-5-3-4-2 Examen microscopique …………………………………………………..…………………………………………………80 I-5-3-4-3 Etat frais………………………………………………………………………………………………………………………….…80 I-5-3-4-4 Tests biochimiques ………………………………………………………………………………………………………… 80 I-5-4 Antibiogramme ……………………………………………………………………………………………………………………….80 I-5-5 Conservation ..………………………………………………..………..…………………………………….……………………..81 I-5-6 APPLICATION DE LA TECHNIQUE PCR EN TEMPS REEL……………………………………………………………………… 83

II- ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES LACTOBACILLES…………………………………………………………………………......85

II-1 PROVENANCES DES ECHANTILLONS DU LAIT…………………………………………………………………….…………………...85

II-2 MILIEUX DE CULTURE ……………………………………………………………………………….…………………………………….85

II-3 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES……………………………………………………………………………….85

II-3-1 ISOLEMENT……………………………………………………………………………………….……………………………………...85

II-3-2 IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES……………………………………………………………..……………………………...86

II-3-2-1 CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE……………………………………………………..…………………………………....86

II-3-2-2 DETERMINATION DES ISOLATS………………………………………………………................................................86

II-3-2-3 DETERMINATION DU GENRE………………………………………………………………………………………………....…..87

II-3-2-3-1 TEMPERATURE……………………………………………………………… ………………………………………………….. 87

II-3-2-3-2 TYPE FERMENTAIRE………………………………………………………………………………………………………………87

II-3-2-3-3 HYDROLYSE DE L’ARGININE……………………………………………………………………………………………………..87

II-3-2-3-4 UTILISATION DU CITRATE ……………………………………………………………………………………………..…………88

II-3-2-3-5 HYDROLYSE DE L’ESCULINE ………………………………………………………………….…………………………………88

II-3-2-4 DETERMINATION DE L’ESPECE……………………………………………………………………..…………………………….88

II-3-2-4-1 IDENTIFICATION PAR LE SYSTEME API 50 CHL……………………………………………………………………………89

II-3-3 CONSERVATION DES SOUCHES…………………………………………………………………….…………………………………90

III- MISE EN EVIDENCE DES INHIBITIONS ENTRE LACTOBACILLE ET H. PYLORI……………………….............................91

III-1 METHODE DIRECTE ……………………………………………………………………………………………………………………….91

III-2 METHODE INDIRECTE ……………………………………………………………………………………………………………………92

III-3 DETERMINATION DE LA NATURE DE L’AGENT INHIBITEUR……………………………………………………………………….93

III-3-1 INHIBITION DUE AU PEROXYDE D’HYDROGENE ……………………………………………………………………………….93

III-3-2 INHIBITION DUE A L’ACIDE LACTIQUE ……………………………………………………………………………………………..93

III-3-3 INHIBITION DUE AUX BACTERIOPHAGES………………………………………………………………………………………….94

III-3-4 RECHERCHES DE LA NATURE PROTEIQUE DE LA SUBSTANCE ANTIMICROBIENNE …………………………………….94

III-3-5 EFFET DE LA TEMPERATURE…………………………………………………………...................................................95

III-4 MESURE DE L’ACIDITE TITRABLE………………………………………………………………………………………………………..95

III-4-1 DOSAGE DE L’ACIDITE…………………………………………………………………………………………………………………95

III-5 MISE EN EVIDENCE DES INHIBITIONS EN MILIEU LIQUIDE…………………………………………….………………………..96

III-6 EFFET INHIBITEUR DES LACTOBACILLES SUR LES BACTERIES PATHOGENES……………………….........................97

RESULTAT

I-MISE EN EVIDENCE DE H.PYLORI………………………………….…………..…………………..……………………………………..98

I-1 EXAMEN CYTOLOGIQUE…………………………………………………………………………………………………………………….98

I-2 TEST RAPIDE A L’UREE ………………………………………………………………….…………………………………………………..98

I-3 EXAMEN ANATOMOPATHOLOGIQUE………………………………………………………..……………………………………….100

I-4 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION ………………………………………………………..……………………………………………….100

I-4-1 ASPECT MACROSCOPIQUE ……………………………………………………………..……………………………………………100

I-4-2 ASPECT MICROSCOPIQUE ……………………………………………………………………………………………..……………100

I-4-3 ETAT FRAIS ……………………………………………………………………………………………………………………………….104

I-4-4 ETUDE BIOCHIMIQUE …………………………………………………………….……………………………………………………104

I-5 ANTIBIOGRAMME…………………………………………………………………………………………………………………………105

I-6 MISE EN EVIDENCE DE H. PYLORI PAR LA PCR EN TEMPS REEL………………………………………………………….……. 109

II ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES…………………………………………………………………………………115

II-1 EXAMEN MORPHOLOGIQUE …………………………………………………………………………………………………………...115

II-2 CARACTERES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES………………………………………………………………………………..115

II-3 REPARTITION DES ESPECES DE LACTOBACILLE………………………………………………………………………..……………127

III PRODUCTION DES SUBSTANCES ANTIMICROBIENNES ………………………………………………………………………….....129 III-1 Mise en évidence des inhibitions entre les lactobacilles et H. pylori …………………………………….…129

III- 2 Acidification……………………………………………….…………………………………………………………………………..139

III-3 Détermination de l’agent inhibiteur ………………………………………..……………………………………………..143

III-3-1 Effet de la production d’acide lactique ………………………………………………………………………………..144

III-3-2 Effet du peroxyde d’hydrogène ……………………………………………………………………..……………………146

III-3-3 productions de phage lysogène: ………………………………………………………………………………………….146

III-3-4 Effet de la bactériocine…………………..……………………………………………………………………….…….…... 147

III-4 Effet de surnageant de lactobacille sur H. pylori en milieu liquide ………….…………………………....150

III-5 Inhibitions des bactéries pathogènes par les lactobacilles…………………………………………………..…..152

Discussion ……………….………………………………………………………………………………………….…………………………156

Conclusion et perspectives….………………………………............................................................................179

Références bibliographiques ….……………………………………………………………………………..………………………182

Annexe……………………………………………………………………………………………………………................................215

Activités scientifiques…………………………………………………………………………………………………………………….219

Résumé

Le but de ce présent travail est de détecter in vitro le pouvoir inhibiteur des souches de Lactobacilles isolés du lait de chèvre sur la bactérie pathogène de H. pylori isolée des biopsies gastriques et de déterminer l’agent inhibiteur. En premier temps, la recherche de H. pylori a été réalisé à partir des biopsies gastriques des patients atteints de maladies gastroduodénales (gastrite chronique, ulcére gastroduodénale), et ayant subi une endoscopie digestive haute. La présence de cette bactérie a été mise en évidence par des tests invasifs : test rapide à l’uréase, l’examen cytologique, l’examen histologique, la culture et l’amplification génique PCR en temps réel.

L’identification des souches de H. pylori isolées a été basée sur les caractères morphologiques (macroscopique et microscopique) et biochimiques (test à l’uréase, test à l’oxydase et la catalase).Nous avons pu isoler trois souches de H. pylori alors que les autres tests invasifs utilisés montrent parfois la présence de H. pylori dans les échantillons présentant une négativité de la culture (résultat faussement négatif). Ceci est probablement du à l’erreur de l’échantillonnage ou la sensibilité de la culture. .

Par ailleurs, l’étude de la sensibilité des souches de H. pylori aux antibiotiques habituellement utilisés dans le choix thérapeutique a montré l’excellente activité de la plupart des antibiotiques testés vis-à-vis de H. pylori. Aucune résistance à la clarithromycine n’a été observée chez toutes les souches de H. pylori, cette résistance constitue le facteur majeur d’échec du traitement d’éradication de H. pylori. De plus, La technique moléculaire de la PCR en temps réel a permis de détecter à la fois H. pylori et d’éventuelle mutation de résistance à la clarithromycine à partir des biopsies gastriques ou de la colonie. En effet, les souches isolées de H. pylori (HP1, HP2, HP3), traitées par cette technique ont révélé d’une part leur conformité à l’Helicobacter pylori (ADN positif). Elles sont identifiées comme des souches dites sauvages (Wite type), et d’autre part, montre que ces souches ne présentent aucune mutation de résistance à la clarithromycine En second temps, 42 souches de lactobacilles ont été isolés à partir du lait cru de chèvre, et identifiés en se basant sur des critères morpholologiques,biochimiques et physiologiques. Les souches lactiques sont rattachées aux 3 groupes (I, II, III). Par ailleurs, cette identification a révélé la présence d’une diversité en espéces dans le genre de lactobacilles répartie essentiellement entre Lb. delbrueckii (sp. bulgaricus et sp. lactis ); Lb. helveticus; Lb. salivarius ; Lb. plantarum ; Lb. casei (sp. casei et sp. rahmnosus) ; Lb. rhamnosus ; Lb. paracasei ; Lb. pentosus ; Lb. brevis et Lb. fermentum. D’autre part, nous avons testé l’activité antimicrobienne in vitro des lactobacilles isolés ainsi que la souche de référence vis-à-vis des souches isolés de H. pylori (HP1, HP2, HP3) et les souches de référence (HP4) et (HP5) par la méthode directe de diffusion (Geis et al., 1983). Les souches de Lactobacillus sp. ont présenté dans l’ensemble une activité antagoniste vis-à-

vis de H. pylori, démontrée par l'apparition de zone d’inhibition avec des diamètres variés

d’une souche à l’autre. La souche de Lb. rhamnosus (LBR1) a prouvé un pouvoir inhibiteur le plus élevé dont le diamètre d’inhibition est de 19 mm. L’évaluation du pouvoir acidifiant chez les 14 souches sélectionnés pour leur pouvoir inhibiteur élevé a été réalisée par la mesure du degré Dornic. Les espèces ayant un pouvoir acidifiant élevé sont: Lb. rhamnosus (LBR1) avec 69 D°, Lb. delbrukii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) et Lb. plantarum (LBP1) avec une acidité de 65 D°. La recherche de la nature de l’agent inhibiteur chez les 14 souches de lactobacilles par la méthode indirecte des puits a révélé que la production d’acide lactique est le facteur responsable de l’inhibition de H. pylori chez la majorité des lactobacilles testés. Tandis que chez la souche Lb. brevis, l’agent inhibiteur est l’acide lactique et une autre substance indéterminé, qui n’est pas une bactériocine, ni peroxude d’hydrogéne.

Par ailleurs, l’étude de la viabilité de H. pylori en milieu liquide en présence de surnageant de la souche Lb. rhamnosus1, selectionné pour son pouvoir inhibiteur élevé, et de l’acide lactique a confirmé l’effet inhibiteur de l’acide lactique sur la croissance de H. pylori.

Enfin, nous avons testé le pouvoir inhibiteur de nos souches lactiques vis-à-vis des bactéries pathogènes Gram positive (St aureus, B. subtilis) et bactéries gram négatives (E. coli, Kb. Pneumoniae, S.entertidis, Ps. aeruginosa). Les souches de lactobacilles testées exercent

également une activité antimicrobienne contre les bactéries pathogènes et présentent un

spectre d’activité large renfermant les bactéries Gram positive et les bactéries Gram

négative montrant ainsi la capacité des lactobacilles à inhiber des bactéries pathogène en générale et l’Helicobacter pylori en particulier.

Mots clés : H. pylori, Lactobacillus, lait de chèvre, antagonisme, acide lactique, agent antimicrobiens.

Abstract

The aim of the present work is to detect in vitro the inhibitory strains of lactobacilli isolated from goat milk on H. pylori isolated from gastric biopsies and to determine the inhibitory agent. First time, the search for H. pylori was done from gastric biopsies of patients with gastroduodenal diseases (chronic gastritis, peptic ulcer) who underwent upper gastrointestinal endoscopy. The presence of this bacterium has been detected by invasive tests: rapid urease test, cytology, histology, culture and PCR real time. The identification of strains of H. pylori isolates was based on morphological (macroscopic and microscopic) and biochemical (urease test, oxidase test and catalase). However, we have isolated three strains of H. pylori while other invasive tests used sometimes show the presence of H. pylori in the samples with negative culture (false negative). This is probably due to sampling error or the sensitivity of culture. Moreover, the study of the sensitivity of strains of H. pylori to antibiotics commonly used in the therapeutic choice showed excellent activity of most antibiotics tested vis-à-vis H. pylori. No resistance to clarithromycin was observed in all strains of H. pylori, this resistance is the major cause of treatment failure to eradicate H. pylori. In addition, the molecular technique of PCR real-time has detected both H. pylori and possible transfer of resistance to clarithromycin in gastric biopsies or from the colony. Indeed, isolates of H. pylori (HP1, HP2, HP3), treated with this technique have revealed one hand, their compliance with Helicobacter pylori DNA (positive). They are identified as so-called wild strains (Wild type), and secondly, shows that these strains show no mutation of resistance to clarithromycin.

Second time, 42 strains of lactobacilli were isolated from raw milk goat, and identified based on criteria morpholological, biochemical and physiological. Lactic strains are attached to the 3 groups (I, II, III). Moreover, this identification has revealed the presence of species diversity in the genus Lactobacillus distributed mainly between Lb. delbrueckii (sp. bulgaricus and sp. lactis), Lb. helveticus, Lb. salivarius, Lb. plantarum, Lb. casei (sp. casei et sp. rahmnosus) Lb. rhamnosus, Lb. paracasei, Lb. pentosus, Lb. brevis and Lb. fermentum. Secondly, we tested the in vitro antimicrobial activity of lactobacilli isolated and the reference strain vis-à-vis the isolated of H. pylori strains (HP1, HP2, HP3) and reference strains (HP4) and (HP5) using the direct method of dissemination (Geis et al., 1983). The strains of Lactobacillus sp. showed an overall antagonist activity vis-à-vis H. pylori, as demonstrated by the appearance of inhibition zone with various diameters from one strain to another. The strain of Lb. rhamnosus (LBR1) showed an inhibitory highest inhibition whose diameter is 19mm.

The evaluation of the acidifying power among 14 strains selected for their inhibitory rate was achieved by measuring the degree Dornic. Species with high acidifying power are: Lb. rhamnosus (LBR1) with 69 D °, Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) and Lb. plantarum (LBP1) with an acidity of 65 D°.

Research on the nature of the inhibitor in 14 strains selected of lactobacilli by the indirect method of wells revealed that the production of lactic acid is the factor responsible for the inhibition of H. pylori in the majority of the lactobacilli tested. While in strain Lb. brevis, the inhibitor is lactic acid and another substance unknown, which is not a bacteriocin or hydrogen peroxyde.

The study of the viability of H. pylori in liquid medium in the presence of supernatant of the strain Lb. rhamnosus1, selected for its high inhibitory power, and lactic acid confirmed the inhibitory effect of lactic acid on the growth of H. pylori.

Finally, we tested the inhibitory power of our lactic strains vis-à-vis the Gram positive bacteria (St. aureus, B. subtilis) and Gram negative bacteria (E. coli, Kb. pneumoniae, S.entertidis, Ps aeruginosa). The lactobacilli strains tested also exert antimicrobial activity against pathogenic bacteria and present a broad spectrum of activity containing Gram-positive and Gram-negative bacteria showing the ability of lactobacilli to inhibit pathogenic bacteria in generally Helicobacter pylori in particular.

Key words: H. pylori, Lactobacillus, goat milk, antagonism, lactic acid antimicrobial agent.

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Liste des figures

Fig. 1 : Structure de l’estomac

Fig. 2 : Schéma général de la muqueuse gastrique

Fig. 3 : Structure de la muqueuse fundique

Fig. 4 : Structure de la muqueuse pylorique

Fig. 5 : Schéma de la régulation physiologique de la sécrétion gastrique

Fig. 6: Relation phylogénétique de H.pylori

Fig. 7 : Localisation de H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique

Fig. 8: Helicobacter pylori sous microscope électronique

Fig. 9 : Milieux de culture de H. pylori

Fig. 10 : Aspect de colonies de H. pylori

Fig. 11 : Distribution géographique de l’infection à H. pylori

Fig. 12: Mécanismes de colonisation de H. pylori

Fig. 13 : Méthodes diagnostiques de H.pylori

Fig. 14 : Test à l’uréase

Fig. 15: Examen anatomophathologique d’une biopsie gastrique

Fig. 16 : Test respiratoire à l’urée marquée

Fig. 17 : Test d’ELISA

Fig. 18 : Rôle pathogène de H. pylori.

Fig. 19 : Aspects endoscopiques des gastrites

Fig. 20 : Mécanismes de l’ulcère gastrique et duodénale

Fig. 21 : Mécanisme pour la carcinogenèse gastrique

Fig. 22 : Détermination de la sensibilité de H. pylori par le E-test

Fig . 23 : Arbre phylogénique des bactéries lactiques

Fig . 24 : Principaux compartiments de l’appareil digestif

Fig. 25: Principaux effets bénéfiques des probiotiques

Fig. 26: Propriétés et critères de sélection des probiotiques

Fig . 28 : Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei

Fig. 29 : Arbre phylogénétique du genre lactobacilles

Fig. 30 : Schéma d’isolement et identification de H. pylori

Fig. 31 : Observation microscopique d’une biopsie biopsique

Fig. 32 : Test rapide à l’uréase

Fig. 33 : Test rapide à l’urée (CLO test)

Fig. 34 : Examen anatomopathologique de la biopsie

Fig. 35: Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu pylori

Fig. 36 : Aspect macroscopique de H. pylori sur gélose au sang

Fig. 37 : Aspect macroscopique de H. pylori après purification

Fig. 38 : Observation microscopique de H. pylori

Fig. 39: Sensibilité de H. pylori à la clarithromycine

Fig. 40: Sensibilité de H. pylori à l’amoxicilline

Fig. 41: Sensibilité de H. pylori au métronidazole

Fig. 42: Sensibilité de H. pylori Tétracycline, Rivampin et Levofloxacin

Fig. 43 : Témoins utilisés dans la PCR en temps réel

Fig. 44: Cas positif de la PCR à partir de la culture de H. pylori

Fig. 45: Cas négatif de la PCR à partir des biopsies gastriques

Fig. 46: Cas positif de la PCR à partir des biopsies gastriques

Fig. 47: Aspect macroscopique des colonies de lactobacilles

Fig. 48: Aspect microscopique des lactobacilles

Fig. 49: Utilisation du citrate

Fig. 50: tests biochimiques des lactobacilles

Fig. 51: Répartition des lactobacilles

Fig. 52 : Galeries API 50 CHL

Fig. 53 : Répartition des espèces de lactobacilles

Fig. 54 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori



Fig. 57: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBCR1, LBCC1, LBH1, LBH2,

Fig. 58 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBP1, LBP3, LBS1, LBS2

Fig. 59: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBR1, LBR2, LBDB1, LBDB3

Fig. 60: Effet de surnageant traité de lactobacille sur H. pylori

Fig. 61: Viabilité de H. pylori en présence de surnageant de LBR1 et de l’acide lactique

Fig. 62: Effet antimicrobien des lactobacilles sur les bactéries pathogènes

Liste des tableaux

Tab. 1: Classification d’Helicobacter pylori

Tab. 2: Quelques espèces du genre Helicobacter

Tab. 3: caractéristiques biochimiques et culturales de H. pylori

Tab. 4: Facteurs de pathogénécité bactériens

Tab. 5 : Différents types de thérapies anti-H. pylori

Tab. 6: Principales souches microbiennes probiotiques

Tab. 7 : Valeurs de pH limites de la croissance des microorganismes

Tab. 8 : Valeurs des antibiotiques

Tab. 9 : Caractérisation biochimique de H. pylori

Tab. 10 : Détermination de la CMI et du diamètre de la zone d’inhibition

Tab. 11: Sensibilité des souches de H. pylori aux antibiotiques

Tab. 12 : Code des espèces de lactobacilles isolées à partir du lait de chèvre

Tab. 13: Caractéristiques des lactobacilles

Tab. 14 : Profils fermentaires des lactobacilles

Tab. 15 : Profils fermentaires des lactobacilles par galerie API 50 CHL

Tab. 16 : Activité antimicrobienne des Lactobacille sp. sur H. pylori

Tab. 17 : Inhibition de H. pylori par lactobacilles

Tab. 18: Effet de la production d’acides et du peroxyde d’hydrogène sur H. pylori

Tab. 19: Effet de la production de la bactériocine

Tab. 20: Activité antimicrobienne des lactobacilles vis-à-vis des bactéries pathogènes.

Liste des Abréviation

H. pylori : Helicobacter pylori

C. pylori : Campylobacter pylori

C. jejuni: Campylobacter pylori

LBDL : Lactobacillus delbrueckii sp. lactis

LBDB : Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus

LBCC : Lactobacillus casei sp. casei

LBCR : Lactobacillus casei sp. rhamnosus

LBB : Lactobacillus brevis

LBR : Lactobacillus plantarum

LBP: Lactobacillus rhamnosus

LBS: Lactobacilles salivarus

LBH: Lactobacillus helveticus

Malt : tissu lymphoide associé aux muqueuse

DNU : dyspepsie non ulcéreuse

ADH : arginine dihydrolase

ADN: acide désoxyribonucléique

ARN: acide ribonucléique

ATP: Adénosine Triphosphate

Ara.: Arabinose

Cel.: Cellobiose

Fru .: Fructose

Gal.: Galactose

Lac.: Lactose

Mal.: Maltose

Man: Mannitol

Mél.: Mélibiose

Raf.: Raffinose

Rib.: Ribose

Sac.: Saccharose

Sor.: Sorbitol

Tré.: Tréhalose

HES (Hémateine-Eosine-Safran)

BHIB : Bouillon Cœur Cervelle

BHI-A : Cœur Cervelle Agar

Introduction

1

Introduction Depuis sa découverte dans l’estomac humain, Helicobacter pylori, bactérie de

la décennie, a bouleversé les concepts concernant certaines maladies

gastroduodénales (Fléjou, 1989; Fagniez, 1995 ; Chamouard, 1996; Simsek et

al., 2000).

H. pylori est un pathogène gastrique humain, spiralé à Gram négatif, qui

colonise la muqueuse de l'épithélium gastrique et survit dans l’environnement

acide (Lorca et al., 2001). Il est aujourd’hui admis que la bactérie Helicobacter

pylori est l’agent étiologique des pathologies gastro-duodénales (Missonier et

Dorval, 1994; Simsek et al., 2000 Raymond et al., 2010), elle est responsable

des gastrites chroniques, des ulcères duodénaux (Megraud et Lamouliatte,

1992), et joue un rôle important dans la genèse des cancers gastriques

(adénocarcinomes et lymphomes) (Blaser, 1993; Parsonnet et al., 1991).

Ceci conduit à réviser le traitement de la maladie ulcéreuse désormais

considérée comme une maladie infectieuse. En effet, L'infection à H. pylori

figure parmi les infections bactériennes chroniques les plus répandues et touche

plus de 50% de la population mondiale (Dun et al., 1997 ; Pinchuk et al., 2001 ;

Perez-Perez et al., 2004).

L'éradication de l'Helicobacter est indispensable lors de sa mise en évidence

pour notamment éviter les risques de cancer de l'estomac. Les indications de

l’éradication de H. pylori font l’objet de discussions. La trithérapie utilisant un

inhibiteur de la pompe à protons associée à deux antibiotiques est actuellement

le traitement de référence recommandé pour l'éradication de H. pylori

(Malfertheiner et al., 2002; Mignon, 2010). Toutefois, le traitement classique

par les antibiotiques n’est pas toujours efficace contre l'infection à H. pylori du

fait de la résistance de la bactérie aux antibiotiques, principal facteur d’échec

des traitements (Hunt, 2006; Raymond et al., 2010) .

Introduction

2

Par conséquent, le développement de méthodes alternatives serait nécessaire et

la recherche de nouveaux agents antimicrobiens est recommandée (Pinchuk et

al., 2001; Rokka et al., 2006).

De nombreuses études scientifiques ont rapporté les propriétés prophylactiques

et thérapeutiques de certaines bactéries lactiques particulièrement celles

appartenant au genre Lactobacillus (Parker, 1974; Varcoe et al., 2003; Marelli et

al., 2004 ; Lin et al., 2005). Ces microorganismes favorables pour la santé de

l’homme et de l’animal ont reçu le nom de «Probiotiques». Ce concept a été

développé tout particulièrement après l’émergence, ces dernières décennies, des

bactéries résistantes aux antibiotiques et l’intérêt suscité par les agents naturels

d’inhibition pour le contrôle des germes pathogènes (Ouewhand et al., 1999;

Kailasapathy et Chin, 2000).

Effectivement, les lactobacilles sont utilisés depuis des années contre

les maladies infectieuses et sont largement étudiées pour leur capacité à protéger

l’homme contre les bactéries pathogènes (Silva et al., 1987 ; Bernet et al.,

1994; Tsai et al., 2003 ; Corr et al., 2007; Ryan et al., 2008).

Plusieurs études ont montré que les lactobacilles présentent un pouvoir

inhibiteur contre la bactérie pathogène de H. pylori in vitro et in vivo ( Michetti

et al., 1995; Kabir et al., 1997; Coconnier et al., 1998). Ce pouvoir exercé par

les lactobacilles est généralement due à la production d'acides organiques,

le peroxyde d'hydrogène, ainsi que des bactériocines (Silva et al., 1987 ;

Vandenbergh, 1993 ; Midolo et al., 1995; Trammer, 1966).

Les lactobacilles montrent de manière évidente une meilleure tolérance à

la trithérapie classique et semblent avoir un effet de prévention.

Par conséquent, l’administration des probiotiques pourrait être exploitée comme

un agent thérapeutique potentiel pour l’éradication de Helicobacter pylori.

(Armuzzi et al., 2001; Hamilton-Miller, 2003; Midolo et al., 1995).

Une alternative de traitement pourrait donc être la consommation de

probiotiques.

Introduction

3

C’est ainsi que notre présent travail est structuré en 4 volets :

Le premier est consacré à une étude bibliographique comprenant deux parties

dont la première concerne l’étude des aspects microbiologiques, diagnostiques

et thérapeutiques de H. pylori, la deuxième partie traite les caractères des

bactéries lactiques et les lactobacilles en particulier, leur application en santé

humaine ainsi que leur activité antimicrobienne.

L’ensemble du matériel et méthodes mis en œuvre au cours de l’étude est

présenté dans un second volet.

Les résultats expérimentaux sont abordés dans le troisième volet de ce

manuscrit suivi par une discussion générale.

Helicobacter pylori Revue bibliographique

4

I- Généralité sur l’Helicobacter pylori

I-1 Historique

L’intervention d’agents infectieux dans la pathogénie de certaines affections

gastroduodénales a été suspectée en 1915 (Berstad, 1993; Vallot, 1994).

En 1938, Doengens observa des bactéries spiralées dans l’estomac de singe,

retrouvées par la suite dans des estomacs humains obtenue à l’autopsie (Veron et

Fauchère, 1989; Megraud, 1994e; Illoul et al., 1995).

En 1940, Freedberg et Baron observèrent ces bactéries dans 37% des estomacs

réséqués puis un oubli total avant qu’elle ne soit de nouveau observées dans

les années 1970 (Megraud, 1994e; 1996b).

C’est en effet en 1975 que Steer et Colin Jones, en étudiant la muqueuse

gastrique au microscope à balayage, ont noté la présence de ces bactéries

spiralées. Cependant, leur tentative de mise en culture, sur milieu standard, ne

permit de retrouver que Pseudomonas aeroginosa (Megraud, 1994e, 1996b).

En 1979, Robin Warren, un anatomopathologiste australien, après avoir observé

de très nombreuses bactéries spiralées ressemblant à des Campylobactéries sur

un prélèvement histologique de gastrite aiguë, entreprit avec succès la recherche

systématique de cette bactérie sur les biopsies qui fut alors appelée

Campylobacter Like Organisms (CLO) (Marshall et Warren, 1984; Avril, 1988;

Lee, 1992; Darra, 1994; Megraud, 1996b).

Ce n’est qu’en 1982 que son collègue B. Marshall fut le premier à cultiver à

partir de biopsies de la muqueuse gastrique cette bactérie spiralée appelée

C. pyloridis, dénomination remplacée par C. pylori et aujourd’hui Helicobacter

pylori (Marshall et Warren, 1984; Megraud, 1989b; Houdart, 1995; Megraud,

1996b).

Et depuis, 1983, de nombreux travaux ont étudié les rapports entre l’infection

antrale par H. pylori et les affections gastroduodénales (Dorval, 1992) et un

débat s’est établi entre bactériologistes, gastro-entérologues et histologistes pour

savoir si ces bactéries sont une cause, un facteur favorisant ou une conséquence


5

des maladies gastriques (Veron et Fauchère, 1989) jusqu’à apparaître en 1994

comme le principal agent responsable des maladies gastroduodénales (Cayla,

1995). En 1995, une conférence de consensus de la communauté médicale

reconnaît qu’Helicobacter pylori est bien la cause majeure des ulcères

gastroduodénaux et non le stress comme il était auparavant admis, désormais

classés dans la catégorie des maladies infectieuses. Depuis, les conférences de

consensus et les articles sur cette pathologie infectieuse se suivent et le lien entre

H. pylori et pathologie gastro-duodénale, est reconnu par tous en médecine.

La découverte de la responsabilité de Helicobacter pylori dans les ulcères et les

gastrites a été récompensée par le prix Nobel de physiologie et de médecine de

2005, attribué conjointement à Barry J. Marshall et J. Robin Warren qui leur est

décerné en 2005. La découverte de Warren et de Marshall a préparé le terrain

pour que les ulcères peptiques soient traités par l'éradication de la bactérie avec

une combinaison d’antibiotiques et d’inhibiteurs de la sécrétion acide.


6

I-2 Anatomie et Histologie

I-2-1 Anatomie

L’estomac est une vaste poche musculeuse ayant la forme d’un J majuscule et

située sous le diaphragme entre l’œsophage et l’intestin grêle (Poilleux, 1943;

Frexinos, 1983; Labayle, 1990) et présente une ouverture en haut, le cardia qui

permet la jonction avec l’œsophage. Il comprend le sphincter œsophagien

inférieur et le pylore à sa sortie vers le duodénum en bas. Il occupe la plus

grande partie de la loge phrénique gauche de la cavité abdominale (Poilleux,

1943; Frexinos et al., 1989). Sa capacité est de 1 à 1,5 litres (Frexinos, 1983;

Frexinos et al., 1989). Il est séparé de l’œsophage par le cardia et du duodénum

par le pylore (Poilleux, 1943; Labayle, 1990) et il comprend schématiquement 2

parties, une partie verticale (fundus) occupant le 2/3 de l’estomac et une partie

horizontale (l’antre) (fig. 1) (Poilleux, 1943; Frexinos, 1983; Frexinos et

al., 1989).

Fig. 1 : Structure de l’estomac (Frexinos, 1983)


7

I-2-2 Histologie

D’une épaisseur de 5mm, la paroi gastrique est formée par les quatre tuniques

caractéristiques du tube digestif : muqueuse, sous muqueuse, musculeuse, et

séreuse. La muqueuse est recouverte par un épithélium revêtu par un mucus

la protégeant contre l’acidité gastrique (fig. 2) (Frexinos, 1983; Frexinos et

al.,1989). L’épithélium reposant sur un chorion, la lamina propria, dessine à

la surface luminale des cryptes qui s’invaginent profondément dans la lamina

propria pour former des glandes dont l’aspect varie avec la région considérée au

niveau du fundus et au niveau de l’antre (Czyba et Girod, 1967; Frexinos et

al., 1989).

Au niveau du fundus

Les cryptes sont courtes et étroites. Les glandes sont tubulaires et rectilignes

(fig. 3) (Czyba et Girod, 1967; Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). Elles sont

surtout exocrines en produisant la majeure partie du suc gastrique. Deux types

cellulaires principaux sont représentés dans les glandes fundiques. Les cellules

pariétales responsables de la sécrétion d’acide chlorhydrique et Les cellules

principales sécrétant la pepsine sous forme de précurseur, le pepsinogène inactif,

qui sera activé lors de l’abaissement du pH gastrique (Frexinos, 1983; Frexinos

et al., 1989).

Au niveau de l’antre

Les cryptes sont hautes et étroites. Les glandes antrales sont courtes et

fréquemment tubulo-ramifiées (fig. 4). La plupart des cellules sont de type

muqueux (Czyba et Girod, 1969; Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989).

La caractéristique cytologique la plus remarquable est la présence d’un très

grand nombre de cellules endocrines comme la cellule G, la plus connue, qui

synthétise et sécrète la gastrine. D’autres types cellulaires endocrines sont

également présentes dans la muqueuse antrale et la muqueuse fundique comme

les cellules D sécrétant la somatostatine (Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989).


8

Fig. 2 : Schéma général de la muqueuse gastrique (Frexinos et al., 1989)

Fig. 3 : Structure de la muqueuse fundique ((Frexinos et al., 1989)

Fig. 4 : Structure de la muqueuse pylorique (Frexinos et al., 1989)


9

I-3-Physiologie de l’estomac :

L’estomac possède une double fonction : mécanique et chimique (Lambo et

al., 1990).

I-3-1 Fonction mécanique :

L’estomac permet d’assurer la digestion par sa fonction mécanique (brassage). Il

reçoit un mélange d’aliments solides et liquides provenant de la déglutition, les

évacue vers l’intestin sous une forme fluide « le chyme ».

Le brassage alimentaire est réalisé par des ondes péristaltiques mettant en cause

les couches musculaires de l’organe. Elles débutent à la partie supérieure du

corps et se dirigeant vers le pylore à raison de trois contraction par minute.

L’évacuation du chyme vers le duodénum débute lorsque le bol alimentaire est

suffisamment liquide, la vitesse de cette vidange dépend à la fois du volume et

de la composition chimique du contenue gastrique.

I-3-2 Fonction chimique :

Elle correspond à la sécrétion gastrique dont le volume atteint entre 1 à 2litres

par jour. Cette sécrétion gastrique est réalisée par les multiples glandes

gastriques dont l’activité est stimulée lors du repas. La sécrétion est

principalement composée d’eau, d’acide chloridrique et d’enzyme

protéolytiques. L’estomac sécrète également un mucus qui protège sa paroi de

l’action des sécrétions acides. La protection de la paroi gastrique contre l’acidité

(PH 1.5 à 3.5) est assurée par trois facteurs : une couche épaisse de mucus,

la présence de jonctions serrées entre les cellules empêchant la pénétration du

suc gastrique dans la paroi et le remplacement cellulaire rapide.


10

I-4 Mécanisme de régulation :

L’état de jeûne inhibe la sécrétion de la gastrine et la prise alimentaire la stimule

La cellule G antrale libère de la gastrine qui stimule la sécrétion acide. Elle est

dans l’antre en contact étroit avec les cellules D qui synthétisent et sécrètent

la somatostatine qui à son tour, inhibe la cellule G (Sobhani et al., 1994,1995).

H. pylori se trouve au contact de ces cellules (Sobhani et al., 1994).

La sécrétion gastrique acide stimulée exerce un effet de rétrocontrôle négatif sur

la production et la libération de gastrine en stimulant la sécrétion de

somatostatine par les cellules D antrales. Celles-ci inhibent la synthèse de

gastrine par la cellule G antrale. La somatostatine peut agir aussi en amont de la

gastrine en inhibant la libération du GRP appelé encore bombésine, l’un des

stimulants majeures de la cellule à gastrine. La somatostatine fundique inhibe la

sécrétion acide et module la réponse des cellules pariétales aux stimulations

gastriniques et vagales (fig. 5) (Sobhani et al., 1994, 1995).

L’infection chronique par H. pylori est directement responsable d’une

hypergastrinémie modérée (Vallot et Merrouche, 1992; Ruszniewski, 1994;

Sobhani et al., 1995) qui se traduit par un hyperfonctionnement des cellules G

antrales et ceci peut s’expliquer par la baisse de la somatostatine antrale,

secondaire à la réduction du fonctionnement des cellules à somatostatine

(cellules D antrales) (Gotz et al., 1994; Delchier, 1995; Sobhani et al., 1995).

I-5 Taxonomie

Helicobacter pylori peut être considéré comme le chef de file d’un nouveau

groupe de bactéries appelé superfamille VI de bacilles Gram négatifs.

Le genre Helicobacter a été créé en 1989. bactéries préalablement placées dans

le genre Campylobacter (Goodwin et al., 1989). H. pylori fait partie d’un grand

groupe de bactéries qui phylogénétiquement sont éloignées des autres bactéries à

Gram négatif (fig. 6) (Lamouliatte et al., 1992; Minor et Veron, 1990). Ce

groupe réunit les genres Campylobacters, Hélicobacter, Aerobacter et Wolinella


11

Campylobacter fetus

fetus

Rocchalimaea quintana

Thiovulum sp.

Escherichia coli

Agrobacterium

tumefaciens

Wolinella succinogenes

Campylobacter pylori

Campylobacter

sputorum Campylobacter laridis

Campylobacter

Campylobacter coli

Anacystis nidulans

Fig. 5: Schéma de la régulation physiologique de la sécrétion gastrique acide chez l’homme (Sobhani et al., 1995)

Fig. 6: Relation phylogénétique de H.pylori avec certaines bactéries à Gram négatives (Romaniuk et al., 1987)


12

ayant la particularité d’être adapté aux mucus du tube digestif de l’homme et des

animaux (Sobhani et al., 1995; Lamouliatte et al., 1992). Cette particularité

s’accompagne de caractéristiques morphologiques (forme spiralée, flagelles

polaires) et physiologiques (métabolisme microaérobie et absence d’utilisation

des carbohydrates) (Lamouliatte et al., 1992). Il a initialement été dénommé C.

pyloridis en raison de certaines similitudes morphologiques avec les espèces du

genre Campylobacter et de sa nature gastrique (pylore) (Chamouard, 1996,

Fennerty, 1994 ; Sobhani et al., 1991; Goodwin et al., 1989). il a ensuite été

renommé C. pylori en accordance avec le code international de la nomenclature

des bactéries puis classé au sein d’un nouveau genre appelé Helicobacter pylori

(Fennerty, 1994 ; Marshall et Goodwin, 1987 ; Goodwin et al., 1989). Le nom

pylori tire son origine du latin « pylorus », qui signifie « gardien de

l'ouverture », et qui fait référence à l'ouverture circulaire (pylore) menant de

l'estomac au duodénum.

Le genre Helicobacter appartient à la famille des Helicobacteraceae (ordre des

Campylobacterales, classe des Epsilonproteobacteria, phylum des

"Proteobacteria", domaine ou empire des "Bacteria" ou "Eubacteria"(tableau 1)

Depuis une dizaine d’années, d’autres espèces ont été découvertes ou reclassées

dans ce genre (tableau 2), la plupart colonisent l’estomac de différents animaux.

Les autres Helicobacter sont rencontrés rarement chez l’homme. H pylori est

l’espèce type la plus importante en médecine (Goodwin et al., 1989).

I-6 Ecologie

L’estomac a longtemps été considéré comme étant stérile du fait du caractère

acide du liquide gastrique (pH 2-3), qui lui confère un rôle bactéricide majeur

(Dubois, 1996; Drasar, 1989; Foliguet et al., 1989; Vincent et Leclerc, 1991).


13

Tableau 1: Classification d’Helicobacter pylori (Goodwin et al., 1989)

Tableau 2: Quelques espèces du genre Helicobacter (Goodwin et al., 1989)

Espèces Niche écologique Site d’infection

Helicobacter pylori

Helicobacter cinaedi

Helicobacter fennelliae

Helicobacter mustelae

Helicobacter felis

Helicobacter muridarum

Helicobacter nemestrinase

Helicobacter acinonyx

Helicobacter heilmanu

Helicobacter canis

Helicobacter hepaticum

Flexispira rappini

Homme

Hamster, homme

Homme

Furet

Chien, chat

Souris

Singe macaque

Léopard

Chien, chat, homme

Chien

Souris

Souris

Estomac

Intestin

Intestin

Estomac

Estomac

Intestin

Estomac

Estomac

Estomac

Intestin

Intestin, foie

Intestin

Classification classique

Règne Bacteria

Division Proteobacteria

Classe Epsilon Proteobacteria

Ordre Campylobacterales

Famille Helicobacteraceae

Genre Helicobacter

Espèce Pylori


14

Les bactéries ingérées au cours des repas ont une survie limitée à l’estomac

(Vincent et Leclerc, 1991) à l’exception de celles qui traversent rapidement

l’estomac ou qui résiste au pH gastrique (Savage, 1977).

En effet, les cas de colonisation bactérienne de l’estomac par des espèces

d’origine aérodigestive (Streptococcus, Lactobacillus, Staphylococcus,

Bactéroïdes, Bifidobactéries…) et occasionnellement les entérobactéries,

les bacilles pyocyaniques et les levures (candida) peuvent être dus à

l’hypochloridrie liée à l’âge, au traitement antisecrétoire ou à la chirurgie

(Vagotomie, gastrectomie) (Savage, 1977; Drasar, 1989; Vincent et Leclerc,

1991).

L’isolement en 1983 d’une bactérie spiralée désignée H. pylori de la muqueuse

gastrique a changé les concepts concernant la stérilité de l’estomac, pouvant être

le siège d’une croissance bactérienne (Vincent et Leclerc, 1991; Conférence de

consensus, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996a ).

H. pylori est retrouvé dans l’estomac humain essentiellement dans l’antre mais

également dans le fundus (Moris et Nicholson, 1987; Foliguet et al., 1989;

Megraud, 1996b) ainsi que dans le liquide gastrique (Vincent et Leclerc, 1991;

Lamouliatte et al., 1992).

L’adaptation à l’estomac humain, site généralement hostile aux bactéries, est

une caractéristique essentielle de H. pylori liée à la microaérophilie et à la

résistance à l’acidité gastrique en produisant une uréase permettant

l’alcalinisation de son environnement (Goodwin et al., 1986; Vincent, 1995).

De plus, cette acidité gastrique évite une alcalinisation létale pour H. pylori lors

de la dégradation de l’urée (Clyne et Dramm, 1994).

H. pylori fait partie des bactéries de mucus (Lamouliatte et al., 1992;

Missonier et Dorval, 1994 ). Il vit sous la couche de mucus de l’épithélium de

surface de la muqueuse gastrique (fig. 7) (Vallot, 1994; Vincent, 1994a) ou

occupant la lumière des cryptes gastriques (De Mascarel et Merlio, 1989;


15

Sobhani et al., 1991), et tendent à se regrouper en amas dans les espaces

intercellulaires (Hazell et al., 1986; Vallot, 1994). Cependant, il n’est pas

retrouvé en situation intracellulaire (Le Minor et Veron, 1990; Vallot et

Merrouche, 1992; Vallot, 1994).

H. pylori est également présent dans les zones métaplasiques gastriques du

duodénum, de l’œsophage voire du rectum (Missonier et Dorval, 1994 ; Vallot,

1994 ; Vincent, 1994a). Il a aussi été isolé à partir de la plaque dentaire, la salive

et les selles (Kelly et al., 1993; Missonier et Dorval, 1994; Vincent, 1995 ).

Chez les animaux, la présence de H. pylori a été démontrée dans l’estomac des

chats et du porc (Handt et al., 1994; Vincent et al., 1996; Weeb et al., 1997) et

des singes (macaques, babouins et les chimpanzés) (Marshall, 1989; Hazell

et al., 1992; Vincent, 1994 ; Dubois, 1996).

Le réservoir environnemental est controversé. L’eau semble être un milieu

mieux adapté (Vincent, 1994a; Megraud, 1996b; Vincent et al., 1996).

Des études ont montré que l’eau peut être une source possible de transmission

d’Hélicobacter pylori et que H.pylori pouvait subsister sous une forme coccoide

dans l’eau pendant une longue période. Les formes cultivables de H. pylori ne

survivent pas plus de 48 heures dans l’eau (Benallal, 2009; de Korwin, 1993).

Fig. 7: Localisation de H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique (Bigard, 1991)


16

I-7 Caractères morphologiques

C’est un bacille à Gram négatif de 3 à 5 µm de long et 0,5 à 1 µm de large

(Fléjou, 1989 ; De Mascarel et Merlio, 1989 ; Avril, 1988). Il se présente sous

forme spiralée, incurvée ou en forme de U ou O dans les jeunes cultures (fig. 8)

(Sobhani et al., 1995; Fauchère, 1994; Fauchère et Rosenau, 1991) pouvant

évoluer vers des formes coccoïdes non cultivables dans les vielles cultures et en

milieu défavorable, seraient pour certains des formes de dégénérescence, pour

d’autres des formes de résistance (Cellini et al., 1994; Sobhani et al., 1995 ;

Megraud, 1994 ; Fauchère, 1994 ; Fauchère et Rosenau, 1991). Il est non

sporulé et dépourvu de capsule. Il est mobile par un système flagellaire

composé de 4 à 6 flagelles unipolaires engainés (fig. 8) lui permettant de se

mouvoir par frétillement et par des mouvements de rotation caractéristiques

(Sobhani et al., 1995 ; Vallot, 1994). Chaque flagelle possédant un bulbe

terminal le distingue des autres campylobacters (Fléjou, 1989; De Mascarel et

Merlio, 1989).

Fig. 8: Helicobacter pylori sous microscope électronique


17

I-8 Caractères culturaux

H. pylori est une bactérie relativement fragile, sensible à la dessiccation et

exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992;

Loziniewski, 1996 c’est. Elle ne peut pousser que dans une atmosphère

microaérophile humide contenant 5% d’O2, 10% CO2, 85% d’N2, une des

particularités que l’on utilise pour la mise en culture (Avril, 1988; Cellini et al.,

1994, 1995a; Yousfi et al., 1997). De plus, sa culture exige des milieux enrichis

tels que des milieux gélosés additionnés de sang, lysé ou cuit, d’hémines, du

sérum du charbon ou d’amidon (fig. 9) (Megraud, 1989a ; Fauchère et Rosenau,

1991; Fauchère, 1994a; Sobhani et al., 1995). Ces milieux sont rendus sélectifs

par addition d’antibiotiques spécifiques visant à éliminer les contaminants (Le

Minor et Veron, 1990; Lozniewski, 1996).

La température optimale de sa croissance est de 37°C. Par contre, H. pylori perd

sa viabilité à température ambiante et à l’air (Belblidia et al., 1995; Cellini et al.,

1995b; Lamouliatte et al., 1992).

Dans ces conditions, les colonies apparaissent en 3 à 7 jours voire 10 jours pour

une primoculture, ou en 2 à 4 jours pour un repiquage (Cellini et al., 1995b)

H. pylori développe de petites colonies de 1 mm de diamètre, transparentes ou

grisâtres, luisantes, discrètement bombées, rondes et régulières (fig. 10) (Cellini

et al., 1995b; Sobhani et al., 1995).

I-9 caractères phénotypiques :

H. pylori ont un métabolisme respiratoire comme les Campylobacters et tirent

principalement leur énergie des réactions de phosphorylation oxydative.

Le caractère microaérophilique dépend de l’inhibition d’enzymes comme la

lactate déshydrogénase plutôt que celle de la chaîne de cytochrome (Sobhani

et al., 1991).


18

Fig. 9 : Milieux utilisés pour la culture de H. pylori

Fig. 10: A²spect des colonies de H. pylori sur gélose au sang et sur gélose selective


19

Le capital enzymatique de H. pylori est important puisqu’il possède

une catalase, phosphatase alcaline, phosphatase acide, cytochrome oxydase,

superoxyde dismutase, DNAse, gamma glutamyl transpeptidase, leucine

aminopeptidase, des amidases, des protéases, des lipases, des phospholipases et

surtout une uréase extracellulaire en quantité extrêmement importante, Ce qui

permet de la différencier des Campylobacters (tableau 3). Cette puissante uréase

hydrolyse l’urée du liquide gastrique, en libérant de l’ammoniaque, permettant

ainsi l’alcalinisation du milieu et la survie de la bactérie dans l’estomac acide.

H. pylori ne réduit pas les nitrates et n’hydrolyse pas l’hippurate (Megraud,

1989; Veron, 1989). Il n’utilise pas les sucres (asaccharolytiques) ni par

fermentation, ni par oxydation, c’est à dire qu’il tire son énergie d’autres

sources : les acides aminés et les acides organiques (Monterio, 1994; Megraud,

1994; Sobhani et al., 1991).

I-10 Caractères génétiques

Le génome de H. pylori est trois fois plus petit que celui de E.coli, et codé pour

environ 27000 protéines dont 500 sont reconnues spécifiques à la bactérie,

soulignant le particularisme de l’Helicobacter pylori (Lamarque, 1998).

Cependant, les découvertes faites sur le génome permettent d’élaborer des

mutants dont les facteurs pathogènes ou les voies métaboliques sont inactivés

(Lamarque, 1998). D’autre part, l’espèce de H.pylori se distingue par la valeur

plus base de (G+C) de son ADN qui varie entre 36 et 37%, valeur différente de

celle du genre Vibrio (G + C = 38-51%) et du genre Wolinella (G + C = 46-

49%) (Leclerc et al., 1989; Sobhani et al., 1991a).

De plus, H.pylori se révèle d’une grande homogénéité sur le plan

phénotypique mais d’une extrême diversité génomique par les mesures

d’hybridation ADN-ADN (Megraud et Labigne, 1998).

Les travaux d’hybridation ADN-ADN et ADN-ARN montrent également

que H.pylori a un profil éloigné des Campylobacter (C.jejuni, C.fetus),


20

Tableau 3: Caractéristiques biochimiques et culturales de H. pylori (Goodwin et al., 1989).

Caractéristiques H. pylori

NCTC

11637

Oxydase +

Catalase +

Uréase +

Hydrolyse de l’hippurate

Réduction de nitrate

-

-

Production de H2S dans TSI -

Gamma-glutmyltranspaspeptidase +

Alcaline phosphatase +

Motilité dans le bouillon cœur –cervelle +

Motilité sur les milieux gélosés -

Croissance en anaérobiose à 37°c -

Croissance sur la gélose au sang contenant 3.5% NaCl -

Croissance sur 0.5% de glycine +

Croissance sur 1% de glycine

Croissance sur 1% de bile

-

-

Sensibilité à l’acide nalidixique(30 g) R

Sensibilité à la céphalothine (30 g) S

Sensibilité au métronidazole( 5 g) S


21

ce qui explique le changement récent de dénomination (Sobhani et al., 1991a).

La présence de plasmide a été observée chez plusieurs isolats de H.pylori

(Minnis et al., 1995). En effet, des études récentes ont reporté que 58% d’isolats

de H.pylori contiennent des plasmides dont la taille varie de1,8 à 40 kbp (Tijia et

al., 1987; Penfold et al., 1988).

A ce jour, la composition génomique complète de deux souches de H.pylori est

connue : « H. pylori 26695 » isolée en Angleterre en 1987 et « H.pylori J99 »

isolée au USA en 1994 (Flejou, 2001). Leur génome consiste en une structure

chromosome circulaire dont 91% sont constitués de régions codantes

(1,7×106pb ,1590 séquences codantes). Ils ont été entièrement séquencés en

1997(Lee , 1996).

I-11 Transmission

La transmission interhumaine directe de H. pylori est la plus probable.

On peut distinguer deux modes de transmissions :

a- Oro-orale

C’est le mode prédominant de transmission de H. pylori (Fauchère et Rosenau,

1991; Vincent, 1994b; Chow et al., 1995) qui se fait par l’intermédiaire du

liquide gastrique ou par la salive (Conférence de consensus, 1995; Riachi et

Colin, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996).

La contamination par le liquide gastrique infectant (vomissement-régurgitation)

s’observe surtout chez l’enfant. L’origine salivaire (régurgitations

physiologiques) est incriminée chez l’adulte (Riachi et Colin, 1995 ; Vincent et

al., 1996). Le risque d’infection est accru chez les enfants nés de mères H. pylori

positives (Lamouliatte et al., 1992; Vincent, 1994b; Megraud, 1996b) ainsi que

chez les adolescents (Lamouliatte et al., 1992; Schultze et al., 1995; Megraud,

1996b ).


22

b- Féco-orale

La transmission d’origine fécale intervient en cas de mauvaises conditions

d’hygiène (Vincent, 1994b; Vincent et al., 1996). Les eaux de surface pourraient

jouer le rôle de vecteur (Conférence de consensus, 1995; Conclusions et

recommandations du jury, 1996; Vincent et al., 1996 ), mais le mode de

transmission à partir de l’environnement (alimentation, animaux…) est peu

vraisemblable (Riachi et Colin, 1995; Vincent et al., 1996) compte tenu de

la grande fragilité du germe (Conclusions et recommandations du jury, 1996;

Conférence de consensus, 1995).

Enfin la transmission par le matériel endoscopique contaminé est probable

(Fauchère et Rosenau, 1991; Conférence de consensus, 1995; Conclusions et

recommandations du jury, 1996; Megraud, 1996b). Les endoscopistes pourraient

être un groupe de risque en raison du contact fréquent avec les malades

(Fauchère, 1994a; Riachi et Colin, 1995; Sobhani et al., 1995). Ceci souligne

l’importance des mesures de désinfection du matériel ainsi que du port des gants

par les endoscopistes (Conférence de consensus, 1995; Conclusions et

recommandations du jury, 1996; Megraud, 1996b).

I-12 Prévalence

Environ deux tiers de la population mondiale sont infectés par cette bactérie.

Le taux d'infection varie d'un pays à l'autre. En effet, cette infection est plus

élevée dans les pays en développement que dans les pays développés, environ

25 % dans les pays occidentaux avec d'importantes disparités et de 90% dans

les pays du Tiers-Monde (Fig. 11). La distribution géographique de l’infection à

H. pylori est associée principalement à l’état de développement économique.

Le taux d’infection décroît généralement avec l’amélioration des conditions

socio-économiques (Benallal, 2009; Sobhani et al., 1991; Lamouliatte et

al., 1992 ; Vincent, 1994b; Illoul et al., 1995 ).


23

De plus, l’infection par H. pylori est souvent acquise dans l’enfance et en

particulier au cours des cinq premières années de la vie (Lamouliatte et

al., 1992; Guerre, 1996; Vincent et al., 1996). Sa prévalence augmente avec

l’âge pour atteindre 50% voire plus pour les sujets de plus de 60 ans (Vincent,

1995; Veldhuyzen van Zanten et al., 1994; Megraud, 1994 f; Sobhani et

al., 1995).

Les facteurs suivants favorisent l’infection : le niveau socio-économique,

l’ethnie (plus fréquent chez les noirs que chez les blancs), la promiscuité

(nombre d’enfant par pièce, la taille de la famille, la taille des logements…) et

les conditions d’hygiène (Nowottny et Heilman, 1989; Colin et al., 1995;

Sobhani et al., 1995).

Fig. 11 : Distribution géographique de l’infection à H. pylori dans les différentes

régions du monde .


24

I-13 Facteurs de colonisation

Helicobacter pylori, comme toutes les autres bactéries, est sensible à l’acidité

gastrique. Pour pouvoir coloniser et survivre dans la muqueuse gastrique, il va

devoir mettre en jeu un certain nombre de propriétés.

En effet, H. pylori possède 3 principales propriétés lui permettant de coloniser

l’estomac malgré la barrière constituée par le mucus visqueux et malgré l’acidité

gastrique qui tue la plupart des bactéries : la mobilité, l’uréase et l’adhérence

(fig. 12) (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et al., 1992; Fauchère,

1994b ; Monterio, 1995 ; Bretagne, 1996).

Fig. 12 : Mécanismes de colonisation de H. pylori de la muqueuse gastrique


25

I-13-1 Mobilité

Elle permet à H. pylori de se mouvoir dans le mucus mieux que d’autres

bactéries. Elle est non seulement due à sa forme spiralée mais aussi à la présence

des flagelles engainés. En effet, H. pylori possède un système flagellaire adapté

à cet environnement particulièrement visqueux. De plus, la morphologie spiralée

s’accentue quand la viscosité augmente. Ces deux particularités permettent à

la bactérie d’avoir une plus grande mobilité et de traverser ainsi les mucus avec

une vélocité plus importante (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et

al., 1994; Labigne, 1994; Monterio, 1995; Bretagne, 1996).

I-13-2 Uréase

Lors de l’infestation, H. pylori va se retrouver dans le lac gastrique extrêmement

acide. Pour se protéger de cette acidité gastrique, H. pylori produit une uréase

très active capable d’hydrolyser l’urée normalement présente dans l’estomac en

libérant de l’ammoniac . Cet ammoniac neutralise le micro-environnement de

la bactérie, ce qui rendra le milieu plus accueillant à cette bactérie (Fauchère et

Rosenau, 1991 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Labigne, 1994 ; Wadstrom, 1996 ).

I-13-3 Adhérence

H. pylori est étroitement adhérente aux membranes de cellules épithéliales

gastriques mais reste extracellulaire (Fauchère et Rosenau, 1991 ; Fauchère,

1994a, 1994b). Cette adhérence est due à la présence des antigènes bactériens

(désignés adhésines) comme l’hémagglutinine capable de se fixer sur les

récepteurs de l’épithélium comme le N-acétyl-neuraminyl lactose. Il en résulte

la formation d’une lésion d’attachement et rupture membranaire. Cette capacité

d’adhérence permet aux bactéries de résister aux mouvements péristaltismes

gastriques et à la mobilité de l’extrémité apicale des cellules épithéliales (Evans

et al., 1999; Labigne, 1994).


26

1-14 Mécanisme de persistance

Après la phase de contamination, H. pylori va coloniser la muqueuse gastrique

et persister au site d’infection pendant un temps plus au moins long, puis

le pouvoir pathogène d’Helicobacter pylori commencera. De plus, l’adhésion

cellulaire favorise et multiplie la toxicité des facteurs intrinsèquement

responsables des lésions de la muqueuse épithéliale gastrique (tableau 4).

L’agression de la muqueuse gastrique va stimuler le système immunitaire et

malgré une réponse humorale spécifique et locale, H. pylori échappe à

la phagocytose. Pour se défendre, la bactérie synthétise deux enzymes :

la catalase et la superoxide dismutase. Mais aussi grâce à l’activité uréasique et

la libération d’ammoniaque, elle est capable de neutraliser le contenu du

phagolysosome diminuant ainsi la bactéricide. De plus, la grande quantité

d’antigènes relargués par la bactérie, pourrait saturer les anticorps et rendre

inefficace la réponse immunitaire locale. Ces différents processus permettent

d’expliquer la colonisation à long terme de la muqueuse gastrique (Fauchère,

1994c; Lamouliatte et al., 1992; Monteiro, 1995; Sobhani et al., 1995).

I-15 Réactions inflammatoires

L’inflammation se définit, entre autre, par un infiltrat cellulaire, constitué de

polynucléaires neutrophiles, de lymphocytes et de macrophages.

H. pylori, qui n’a pas de caractère invasif, peut produire des facteurs de

chimiotactismes et d’activateurs des polynucléaires neutrophiles. Ces

polynucléaires sécrètent à leur tour, des enzymes protéolytiques et des radicaux

libres. Ce qui permettra à la bactérie de perpétuer l’inflammation et de

provoquer, à long terme, une lyse des cellules de la muqueuse gastrique (Beil,

1995; Labigne, 1994). Certaines souches de H. pylori, possédant le marqueur

Cag A, stimulent activement la production d’interleukine -8 (II-8). Cette

cytokine, puissant médiateur de l’inflammation, est responsable du recrutement

par chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles et de leur activation

(Fauchère, 1994c; Sobhanie et al., 1991; De Korwin, 1994a).


27

Tableau 4: Facteurs de pathogénécité bactériens (Lamouliatte et al., 1992 ; Monteiro, 1995 ; Sobhani et al., 1995)

Facteur Action

Uréase L’ammoniac produit est responsable de perturbation de la sécrétion de mucus, action cytotoxique sur les cellules épithéliales et effet toxique sur les polynucléaires.

Lipopolysaccharide sialidase

Altération du mucus gastrique.

Oxydase-catalase-superoxydedismutase (SOD)

Protection contre les défenses de l’hôte

Protéase phospholipase

Facilité de migration de la bactérie. Altération du mucus, altération de la perméabilité des membranes cellulaires Production des médiateurs pro-inflammatoires.

N-alpha methyl histamine. Inhibition de la production de somatostatine.

Cytotoxine vacuolisante Vac

Formation de vacuoles au niveau des cellules épithéliales et endommagement de la muqueuse.

Système de captation du fer.

Elaboration des systèmes pour capter le fer chez l’hôte.


28

I-16 Méthodes de recherche de H. pylori

Les méthodes diagnostiques de l’infection à H. pylori sont nombreuses mais

aucune d’entres-elle ne peut aujourd’hui être considérée comme un test de

référence (Bruley Des Varannes, 1996 ; Riachi et Colin, 1995 ; Souquet, 1995).

Leur utilisation varie en fonction des buts recherchés et des populations ou

individus étudiés (Souquet, 1995).

On distingue en pratique deux grands types de méthodes, méthodes dites

invasives nécessitant une endoscopie digestive et des biopsies (test rapide à

l’uréase, examen histologique « anatomopathologique », examen cytologique,

culture et amplification génique par PCR) et méthodes non invasives (test

respiratoire à l’urée et sérologique) (fig. 13) (Yousfi et al., 1997 ; Bruley

Des Varannes, 1996 ; Conclusions et recommandations du jury, 1996 ;

Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995 ; Sobhani et al., 1995 ;

Lamouliatte et al., 1992 ; Megraud, 1992 ; Faniez, 1995).

I-16-1 Méthodes invasives

I-16-1-1 Test à l’uréase :

Ce test est basé sur l’existence d’une uréase très intense chez H. pylori dans un

prélèvement gastrique qui va hydrolyser l’urée pour libérer de l’ammoniac et du

CO2, augmentant ainsi le pH du milieu et faire virer la couleur de l’indicateur du

pH (Megraud, 1994a, 1996a; Riachi et Colin, 1995 ; Lamouliatte et al., 1992).

Ce test a beaucoup de succès car il est simple, rapide, peu coûteux et surtout

réalisable par l’endoscopiste lui-même (Megraud, 1996a ; Sobhani et al., 1995;

Bruley Des Varannes, 1996). Actuellement différents tests sont commercialisés.

Ils varient en fonction de leurs milieux (gélosés, liquides, semi-gélosés comme

le CLO test).


29

Méthode non invasive (pas d’endoscopie)

Sérodiagnostic (sérologie)

Sur 1 mg de sang Test Elisa

délai de réponse 4h

Test respiratoire à C13 ou C14 urée sur l’air expiré mesuré

de CO2

Sujet gastralgique

Méthode invasive (endoscopie)

Biopsie

Test Uréase En salle

d’endoscopie Test

commercialisé (CLO ou CU test) délai de réponse

20 minutes

Bactériologie Au

Laboratoire

Histologie Au laboratoire,

coloration HES ou Giemsa, délai de réponse 2jours.

Amplification génique par PCR Au laboratoire.

Cytologie Coloration de Gram Délai de réponse 30

minutes

Culture Méthode de référence Milieu commercialisé

délai de réponse 5 jours

Antibiogramme

Fig. 13: Méthodes diagnostiques de H.pylori (Megraud, 1992 ; Sobhani et al., 1995)


30

La lecture s'effectuera en moins d'une heure (20 à 30 min), directement en salle

d'endoscopie (fig. 14). La sensibilité du test est augmentée en utilisant deux

biopsies pour une spécificité excellente (supérieure à 95%) (Bruley Des

Varannes, 1996; Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995 ;

Megraud, 1994a; Souquet, 1995). Car il faut en effet un nombre de bactéries

important (> 105 bactéries) pour faire virer le test, ce qui limite son utilité pour

le contrôle de l’éradication du germe. Toutefois, au-delà de 18 heures, outre

la perte de l’intérêt d’un diagnostic rapide, sa spécificité décroît en raison de

l’apparition de faux positifs, dus à la présence de bactéries contaminantes uréase

positive d’origine buccale comme Staphylococcus. sp, Streptococcus. Sp voire

Klebsiella, Proteus ou même gastrique tel que Gastrospirillum hominis, bactérie

rarement rencontrée mais pouvant être à l’origine de gastrites (Delchier, 1994 ;

Megraud, 1992 ; Megraud, 1994a; Lamouliatte et al., 1992).

Fig. 14 : Test à l’uréase sur milieu urée-indole (a), avec le kit CLO test (b)


31

I-16-1-2 Examen cytologique

L’examen cytologique d’une empreinte biopsique après simple coloration de

Gram permet de repérer les Helicobacters par leur morphologie caractéristique

(Sobhani et al., 1995 ; Megraud, 1994a , 1996a; Lozniewski, 1996).

Le prélèvement peut être coloré au Gram, au Giemsa modifiée ou à l'orange

d'acridine fluorescent. Des formes coccoïdes peuvent être présentes qui

évoquent la présence d’H.pylori mais ne permet de conclure sans l’utilisation de

tests immunologiques avec des anticorps spécifiques marqués (Megraud, 1992,

1994 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Sobhani et al., 1991). Cet examen est simple,

rapide, reproductible, relativement sensible mais spécifique (Sobhani et

al., 1991, 1995).

I-16-1-3 Examen anatomopathologique

Il s’agit du moyen de détection le plus répandu. Il permet à la fois de mettre en

évidence H. pylori à partir des coupes histologiques de la biopsie gastrique et

d'identifier les lésions de la muqueuse gastrique (fig. 15). Il n’est satisfaisant que

s’il est pratiqué par un praticien spécialisé, La sensibilité et la spécificité de cet

examen sont supérieures à 90%. La méthode doit comporter une fixation des

biopsies dans le formol et adopter des colorations facilitant la reconnaissance de

la bactérie au microscope (Giemsa modifié, HES, Warthin- Starry ou crésyl

violet) (Lozniewski , 1996; Megraud 1994a; Sobhani et al., 1995).

Fig. 15: Examen anatomopathologique d’une biopsie gastrique (Lynch, 1997).


32

I-16-1-4 Culture:

C'est la méthode de diagnostic de référence car la seule permettant d’une part

l’isolement et l’identification de H. pylori et d’autre part l’étude de la sensibilité

aux antibiotiques et le typage moléculaire des souches (Megraud, 1994a;

Fagniez, 1995 ; Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995).

Elle est d’une spécificité absolue car elle permet une identification précise de

la bactérie (Megraud, 1989; Souquet, 1995 ; Bruley Des Varannes, 1996).

Elle est aussi d’une sensibilité assez importante car il suffit, théoriquement qu’il

y’ ait une bactérie dans la biopsie pour obtenir une colonie et donc un résultat

positif. Cependant, quelques difficultés techniques peuvent influencer

la sensibilité de la culture, qui est extrêmement dépendante des performances du

laboratoire et des conditions techniques (transport, nombre de biopsies,

laboratoire…). En effet, le transport de biopsie gastrique au laboratoire dans de

bonnes conditions reste un élément très important pour la réussite de la culture.

Il est donc nécessaire de ne pas exposer les fragments biopsiques à l’air, et de

les placer dans une solution saline pour un transport de courte durée d’un

maximum de 4 h, ou au mieux dans un milieu de transport comme le Portagerm

qui permet à la culture d’être retardée de 24 h (Benallal, 2009; Lozniewski,

1996 ; Megraud, 1994g).

I-16-1-5 PCR en temps réel ou PCR quantitative :

La nouvelle technique PCR en temps réel (Real-time PCR) est une innovation

dans le diagnostic de H. pylori parce qu'elle permet non seulement une détection

rapide et précise de H. pylori mais également sa quantification ainsi que

la détection des mutations qui sont associées à la résistance aux antibiotiques.

Effectivement, la PCR en temps réel est une révolution dans l’utilisation de

la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à

chaque cycle (temps réel) (expliquant l'appellation PCR quantitative), grâce à un

marqueur fluorescent, mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers.


33

Elle utilise le principe de base de la PCR classique avec pour différence

une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction,

donc en temps réel. Plusieurs systèmes de détection sont utilisés pour

la détection ou la quantification du signal fluorescent en temps réel. Ils sont

généralement divisés en 2 groupes les agents intercalants et les sondes (Wittwer

et al., 1997; Vaira et al., 2000). De plus, la PCR en temps réel est utilisée pour

de nombreuses applications notamment à des fins diagnostiques et/ou de

recherche pour la détection et/ou la quantification rapide d’agents pathogènes.

Cependant, cet examen n'est pas encore passé dans la pratique courante.

La disponibilité de ces tests est encore limitée. Il s'agit d'une technique d'avenir

qui permet le diagnostic rapide de l'infection de H. pylori avec des conditions de

prélèvement ou de transport moins contraignantes que celles de la culture.

Elle peut servir à la détection de H. pylori même en cas de dégradation

des prélèvements (Benallal, 2009 ; Ho et al., 2000).

I-16-2 Méthodes non invasives :

I-16-2-1 Test respiratoire à l’urée marquée (Urea breath test C 13 )

Comme pour le test rapide à l'urée, on utilise la propriété d'H. pylori à posséder

une activité uréasique en utilisant une solution d'urée marquée au carbone 13

(isotope naturel, stable, et non radioactif) que l'on fait ingérer au patient.

Dans l'estomac cette urée 'isotopique" est hydrolysée par l'uréase de la bactérie

provoquant ainsi la libération d'ammoniac et CO2 marqué. Ce 13CO2 passe

la barrière intestinale, se retrouve dans la circulation sanguine puis dans l'air

expiré par le poumon (Fig.16). L'analyse est effectuée à l'aide d'un spectromètre

de masse. On peut également utiliser l'urée marquée au carbone 14.

Les performances du test respiratoire sont excellentes, avec des sensibilités et

des spécificités de 90-95 %, aussi bien avant qu’après traitement d’éradication

de H. pylori. Ce test est actuellement considéré comme la meilleure méthode


34

de diagnostic et de contrôle de l’éradication de H. pylori, lorsque l’endoscopie

n’est pas nécessaire (Graham et al., 2000 ; Logan et al., 1998 ; Vincent et

al., 1999)

I-16-2-2 Sérologie:

Helicobacter pylori stimule le système immunitaire de l'hôte, provoquant ainsi

l'apparition d'anticorps sériques spécifiques de type lgG, parfois d'IgA. La

détection d’anticorps contre l’ H. pylori permet le diagnostic d’infection à H.

pylori avec une sensibilité et une spécificité de l’ordre de 85 à 95%.

La technique la plus utilisée est l’Elisa de type IgG (Fig. 17).Cet anticorps

sérique lgG diminue très lentement après éradication de la bactérie (6 à 8 mois),

ce qui limite son utilisation pour le contrôle précoce après traitement. Il trouve

cependant sa place dans les études épidémiologiques. Cette technique est

avantageuse parce qu’elle permet de diagnostiquer plusieurs personnes,

rapidement et à coûts réduits. De plus, elle a l’avantage de ne pas être trop

invasive en comparaison à la biopsie par endoscopie. Elle est la méthode la plus

recommandée pour un test initial non seulement parce qu’elle est non-invasive

Fig. 16: Etapes du test respiratoire à l’urée marquée au c13 (Logan et al., 1998)


35

mais aussi parce qu’elle est précise, moins dispendieuse et reproductible

(Kosunen et al., 1992 ; Leodolter et al., 2003).

Fig. 17: Test d’ELISA

I-17 Pathologies associées à H. pylori

L’infection à H. pylori une fois acquise persiste en l’absence d’éradication

thérapeutique. Elle provoque dans un premier temps une gastrite aiguë suivie

le plus souvent d’une gastrite chronique. Cette gastrite peut rester superficielle

ou évoluer vers un ulcère duodénal ou gastrique et à long terme un risque de

cancer gastrique ou lymphome de Malt (fig. 18) (Bretagne, 1996; Buckley et

O’Morain, 1996).

I-17-1 Gastrites

Le terme de gastrite désigne toute lésion inflammatoire de la muqueuse

gastrique en réponse à une agression de l'estomac. La muqueuse agit comme une

barrière protectrice de la paroi de l’estomac. Sans cette protection, la paroi de

l’estomac devient plus sensible et serait vite attaquée par les acides ou par

d’autres substances irritantes qui provoqueraient des ulcères, c’est ce qui se

produit dans le cas de l’ulcère gastro-duodénale, mais il arrive aussi que

la muqueuse soit elle même irritée, sans que la paroi soit touchée : on parle alors

de gastrite. La gastrite peut être aigue et se manifester soudainement ou être

chronique et évoluer lentement sur plusieurs années (Stanghellini et al., 2001).


36

Gastrite

aïgue

Gastrite

chronique

Guérison

Atrophie

muqueuse

et

métaplasie

Adénocarcinome

gastrique

Tumeurs

carcinoïdes Ulcère

Hypersécrétion acide

Métaplasie duodénal

Ulcère

duodénal

Lymphomes gastriques

Fig. 18 : Représentation schématique du rôle pathogène de Helicobacter pylori (Schilio, 1996).


37

I-17-1-1 Gastrite aigue

C’est une inflammation aiguë de la muqueuse gastrique (Burley Des Varannes

et Scarpignato, 1996). Elle est caractérisée par la présence d’un infiltrat

inflammatoire polynucléaire neutrophile venant phagocyter les bactéries (Burley

Des Varannes et Scarpignato, 1996; Chamouard, 1996).

Cette phase aiguë de l’infection est courte, symptomatique, habituellement

accompagnée d’une diminution de la sécrétion gastrique acide

(hypochlorhydrie) et une légère augmentation de la gastrine (Sobhani et

al., 1991, 1995; Buckley et O’Morain, 1996 ). La gastrite aiguë peut disparaître

si la bactérie n’est pas retenue par la muqueuse gastrique (Sobhani et al., 1995).

Elle évolue le plus souvent vers la gastrite chronique (Sobhani et al., 1995;

Buckley et O’Morain, 1996).

I-17-1-2 Gastrite chronique

L'installation de la gastrite chronique constitue alors la deuxième phase de

l'infection à H. pylori (fig.19). C’est une inflammation chronique de

la muqueuse gastrique, caractérisée par l’infiltration de plasmocytes et de

lymphocytes avec la présence de polynucléaires et de monocytes signe d’activité

constamment associée à la présence de la bactérie. Elle est souvent

asymptomatique (Chamouard, 1996; Fléjou, 1996; Riachi et al., 1995).

Le rôle de H. pylori dans son étiologie est maintenant bien admis par

la communauté scientifique. Effectivement, H. pylori est le principal agent

étiologique de la gastrite chronique antrale de type B ou bactérienne (Vallot,

1994; Sobhani et al., 1995; Chamouard, 1996 ), gastrite qui touche

principalement l’antre gastrique mais elle peut parfois s'étendre vers le fundus

(gastrite antrofundique) (Colin et al., 1995; Chamouard, 1996). Cette gastrite

peut rester superficielle ou évoluer vers un ulcère duodénal ou gastrique et à

long terme un risque de cancer gastrique ou lymphome de Malt (Bretagne, 1996;

Bommelaer, 1996; Colin, 1996). La gastrite antrale (gastrite B) augmente


38

le risque d’ulcère duodénal, la gastrite antrofundique (gastrite AB) augmente

celui de l’ulcère gastrique (Colin et al., 1995 ; Dorval, 1992).

L’éradication de l’infection entraîne la disparition de la gastrite de type B

(Kuipers, 1995; Sobhani et al., 1995; Buckley et O’Morain, 1996).

Fig. 19: Aspects endoscopiques des gastrites (Burley Des Varannes et Scarpignato, 1996).

I-17-2 Ulcère duodénal

H. pylori joue un rôle important dans le déclenchement de l’ulcère duodénal qui

est presque toujours associé à une gastrite à H. pylori. Cette association est

retrouvée chez près de 90% des patients (Fennerty, 1994; de Korwin, 1994b;

Sobhani et al., 1995).

L’infection par H. pylori apparaît comme une condition nécessaire à la survenue

d’une récidive ulcéreuse du fait de la quasi-disparition des rechutes ulcéreuses

en cas d’éradication de H. pylori (Vallot, 1994; de Korwin, 1994b; Curel et al.,

1999). L’un des mécanismes pathogènes avancés expliquant l’ulcérogénèse

duodénale par l’infection à H. pylori est l’hypersécrétion postprandiale de

la gastrine (Hypergastrinémie) responsable d’une hypersécrétion d’acide


39

(Fennerty, 1994; Missonier et Dorval, 1994; Gouyon et al., 1996). Ces deux

anomalies peuvent être liées aux effets de H. pylori sur les cellules D antrales

sécrétant la somatostatine, qui a un effet inhibiteur sur la libération de la gastrine

et donc sur la production d’acide (Fennerty, 1994; Missonier et Dorval, 1994;

Dorval , 1992,1995; Buckley et O’Morain, 1996 ) .

Dans le duodénum, cet apport excessif d’acide favorise l’apparition de zones de

métaplasie gastrique duodénale (essentiellement bulbaire). H. pylori présent au

niveau antrale colonise ces zones métaplasiques (Vallot, 1994; Bretagne, 1996;

Futami el al., 1999) et provoque localement une réponse inflammatoire

chronique active par la libération éventuelle de cytotoxine produite par des

souches dites ulcérogènes de H. pylori, qui diminue la résistance muqueuse

duodénale (de Korwin, 1994b; Dorval, 1995 ; Missonier et Dorval, 1994).

Ceci favorise l’apparition d’une duodénite (bulbite), érosion bulbaire puis d’un

ulcère (fig. 20) (de Korwin, 1994b; Missonier et Dorval, 1994 ; Sobhani et al.,

1995).

I-17-3 Ulcère gastrique

La prévalence de l’infection par H. pylori dans l’ulcère gastrique est moins

fréquente que celle observée dans l’ulcère duodénal (Lamouliatte et al., 1992).

Elle varie de 59 à 86% (Buckley et O’Morain, 1996). L’ulcère gastrique

s’accompagne souvent de gastrite chronique à H. pylori qui prédomine

nettement dans l’antre et s’étend vers le fundus en réalisant une pangastrite

antrale (Conférence de consensus, 1995; Buckley et O’Morain, 1996; Fléjou,

1996). Le schéma physiopathologique de l’ulcère gastrique ressemble à celui de

l’ulcère duodénal avec toutefois une plus grande importance des lésions

cellulaires locales (fig. 20). L’éradication de H. pylori améliore la guérison des

ulcères et diminue significativement la fréquence des rechutes ulcéreuses

gastriques (Buckley et O’Morain, 1996; Chamouard, 1996; Curel et al., 1999).


40

Fig. 20: Mécanisme de l’ulcère gastrique et duodénale (Megraud et al., 2001)

I-17-4 Cancer gastrique

Le cancer gastrique est la deuxième cause mondiale de mortalité par le cancer.

Le rôle de H. pylori dans la genèse de l’adénocarcinome gastrique, tumeur

maligne de l’estomac la plus fréquente, est bien établi (Correa, 1988, 1991 ;

Flejou, 1994 ; Munoz et Pisani, 1994 ; Uemura et al., 2001). H. pylori est en

effet mis en évidence chez plus de 90% des patients ayant un cancer gastrique

(Bretagne, 1996; Uemura et al., 2001).

Cette bactérie a été classée, en 1994, par l’O.M.S. comme facteur carcinogène

de grade I (Sobhani et al., 1995; Bretagne, 1996; Buckley et O’Morain, 1996).

L’infection chronique par H. pylori précède le développement du cancer d’une

période supérieure à 15 ans (Correa, 1988, 1991; Deltenne et al.,

1995; Bretagne, 1996) et constitue la première étape de ce processus par

l’intermédiaire de la gastrite chronique (Fuccio et al., 2007; Nomura et al.,

1991; Parsonnet et al., 1991; O’Morain et al., 1994; Sobhani et al., 1995).


41

Le cancer gastrique est donc la conséquence de transformation successive de

la muqueuse gastrique, de la gastrite chronique superficielle en gastrite

chronique atrophiante. Cette dernière aboutit à des lésions de métaplasies

intestinales puis de dysplasie et enfin de l’adénocarcinome (fig. 21) (Correa,

1988, 1991; Fléjou, 1994; Dobrilla et al., 1994; O’Morain et al., 1994; Deltenre

et al., 1995).

I-17-5 Lymphome gastrique de MALT

Les lymphomes gastriques ne constitue que 1 à 5% des tumeurs malignes dont

la presque totalité sont des lymphomes B de type Malt (Tissu Lymphoïde

Associé aux Muqueuses ou Malt) (Deltenne et al., 1995; Fléjou,1995 ; François,

1995). L’infection par H. pylori est associée à ce type de lymphome (Buckley

and O’Morain, 1996 ; Fourmestraux, 1996 ; François, 1995 ; Fléjou, 1995). Elle

est, en effet présente chez plus de 90% des patients ayant un lymphome de type

Malt (Bretagne, 1996 ; Buckley et O’Morain, 1996 ; Vallot, 1994).

H. pylori joue un rôle prolifératif dans les lymphomes gastriques par

la stimulation durable qu’il impose (François, 1995 ; Sobhani, 1994 ; Hussel,

1993). Il provoque un infiltrat lymphocytaire de la muqueuse gastrique, qui

aboutit parfois à une gastrite folliculaire. Cette gastrite folliculaire peut dans de

rares cas, aboutir à la prolifération des lymphocytes B, caractéristique du

Lymphome de MALT (tissu lymphoïde associé aux muqueuses) (Hussel, 1993 ;

Sobhani, 1994). La plupart des lymphomes de Malt sont associés à la gastrite

chronique à H. pylori en particulier la gastrite folliculaire (Fléjou, 1994, 1995;

Fourmestraux, 1996).


42

Fig. 21: Mécanisme proposé pour la carcinogenèse gastrique (Correa, 1991).

Gastrite superficielle

Métaplasie intestinale III

Dysplasie

Normal

Métaplasie intestinale I-II

Cancer

H. pylori

Gastrite atrophique


43

I-18 Sensibilité aux antibiotiques

L’étude de la sensibilité in vitro de H. pylori aux antibiotiques, utile dans

le choix thérapeutique, a montré l’excellente activité de la plupart des

antibiotiques à l’exception de la vancomycine, de la cefsulodine, du

triméthoprine, des sulfamides, du cotrimoxazole et de l’acide nalidixique (Avril,

1988 ; Fauchère et Rosenau, 1991; Sobhani et al., 1995).

Les antibiotiques les plus actifs sont des fluoroquinolones, les furanes,

les rifamycines, les tétracyclines, les β-lactamines (en particulier l’amoxicilline)

et les macrolides (en particulier la clarithromycine) et les nitroimidazolés

(metronidazole, tinidazole) (Lamouliatte, 1989, Fauchère et Rosenau, 1991;

Megraud, 1994a ; Cayla, 1996). Ces trois dernières classes d’antibiotiques sont

très utilisées dans les thérapeutiques (Burucoa, 2009 ; Conférence de consensus,

1995). Cependant, H. pylori peut développer rapidement des résistances

prédictives de l’échec thérapeutique (Burucoa, 2009 ; Fellous, 2009 ; Tankovic

et al., 2001 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Megraud, 1992, 1994c ; Colin, 1995).

Seules les β-lactamines en particulier l’amoxicilline et les tétracyclines ne

sélectionnent pas des souches résistantes (Fauchère and Rosenau, 1991;

Lamouliatte, 1992 ; Megraud, 1994c). Il faut donc étudier le métronidazole

(30% de souches résistantes), la clarithromycine (20% de souches résistantes),

les tétracyclines et l’ampicilline qui sont les antibiotiques habituellement utilisés

dans le traitement d’éradication de H. pylori. La méthode d'antibiogramme par

la technique E-test est la plus adaptée à H. pylori, donnant les résultats les plus

reproductibles (Benallal, 2009 ; Burucoa, 2009) (fig. 22).

I-19 Traitement

Le traitement d’éradication de H. pylori repose actuellement sur l’utilisation

d’associations thérapeutiques entre antisécrétoire et antibiotiques (Burucoa,

2009 ; Fellous, 2009 ; Cayla, 1995, 1996; Catalono et al., 1999).


44

La bithérapie (associant un antisécrétoire à un antibiotique ATB) donne des taux

d’éradication maximum de 60% (Colin, 1995; Conférence de consensus, 1995;

Vincent et al., 1996) mais la trithérapie (association d’un antisécrétoire et de

deux antibiotiques ATB) dont le taux d’éradication supérieur à 85% constitue le

traitement actuel le plus performant et le plus efficace en terme d’éradication

(tableau 7) (Khurana et al., 2007; Lamouliatte, 1994 a, 1994c; Vincent et al.,

1996; Chiba et al., 2000; Wong et al., 2000).

Les antibiotiques dont l’efficacité est démontrée sont :

- L’amoxicilline, pour lequel le taux de résistance est pratiquement nul, mais qui

n’a qu’une faible diffusion dans la muqueuse gastrique.

- La clarithromycine, macrolide le plus efficace sur H. pylori, mais qui peut

favoriser l’émergence de souches résistantes.

- Les nitro-imidazolés, métronidazole ou tinidazole, qui ont une excellente

diffusion, mais induisent rapidement une résistance bactérienne

Les anti-sécrétoires jouent un rôle majeur dans les trithérapies d’éradication non

seulement pour leur effet antalgique rapide et cicatrisant, mais surtout pour leur

capacité à augmenter le PH intragastrique permettant ainsi de potentialiser

l’effet des antibiotiques et leur diffusion. L’inhibiteur de pompe à protons (IPP)

utilisé est généralement l’oméprazole (tableau 5) (Colin, 1995; Conférence de

consensus, 1995; Gouyon et al., 1996).

Par ailleurs, le traitement idéal devra répondre aux critères de simplicité,

d’efficacité, de courtes durées, de faible coût et de tolérance (Lamouliatte,

1994b; Cayla, 1995; Colin, 1995; Van der Huls et al., 1997).

Cependant, H. pylori est une bactérie difficile à éradiquer (Megraud, 1994c;

Conférence de consensus, 1995), les facteurs limitant son éradication sont :

résistance aux antibiotiques, compliance du patient, durée de traitement, récidive

de l’infection et effet secondaires (Lamouliatte et al., 1992; Lamouliatte, 1994a,

1994b, 1994c; Sobhani et al., 1995; Colin, 1996 ).


45

Fig. 22 : Détermination de la résistance et la sensibilité de H. pylori par E-test

Tableau 5: Les différents types de thérapies anti-H. pylori (Cayla, 1995)

Type de Thérapie

Composition Efficacité Mode de Consommation

Trithérapie IPP + Amox + Clarit

IPP + Metro + Clarit

IPP + Metro + Amox

60 à 90%

60 à 90%

60 à 90%

Per os

Per os

Per os

Bithérapie IPP + Amox

IPP + Clarit

50 à 80%

50 à 80%

Per os

Per os


46

I-20 Traitement par les probiotiques

La colonisation de la muqueuse gastrique par H. pylori est fréquente et souvent

associée à une gastrite, un ulcère, un cancer ou un lymphome. L’introduction

des probiotiques, espèces bactériennes bénéfiques pour le tractus gastro-

intestinal pourrait être une option très intéressante pour rétablir l’équilibre

microbien et prévenir les maladies. Il a été prouvé que différentes souches de

probiotiques et, en particulier, les lactobacilles développent une activité

inhibitrice contre H. pylori. Elles agissent sur la viabilité de la bactérie et sur son

adhérence aux cellules épithéliales et stabiliser la fonction gastrique en

diminuant l’inflammation par leur action anti-oxydante et anti-inflammatoire.

Or, les probiotiques ne permettent pas l’éradication mais ils maintiennent

un taux diminué de bactéries pathogènes dans l’estomac, et combinés aux

antibiotiques, ils augmentent le taux d’éradication. Dans une revue de 13 études

cliniques, les patients de 6 d’entre elles ne prenant que des probiotiques et ceux

des 7 autres des probiotiques et une antibiothérapie, des effets des probiotiques

sur la bactérie ont été démontrés. L'administration des souches de Lactobacillus

à des souris infectées par la bactérie H. pylori a permis d'observer une réduction

de la quantité de la bactérie infectieuse de H. pylori dans l'estomac et un recul

des gastrites engendrées par cette bactérie. Ces résultats suggèrent que

l'utilisation de souches de bactéries lactiques sélectionnées avec soin permettrait

de mieux protéger l'homme contre les bactéries pathogènes. Les recherches

menées dans ce cadre se poursuivront par l'analyse de la composition chimique

des composés antimicrobiens bénéfiques et par des essais cliniques destinés à

tester l'effet des souches lactiques probiotiques les plus prometteuses sur

H. pylori (Gotteland et al., 2006).


47

I-21 Vaccination comme perspective

Le traitement actuel, basé sur l'utilisation d'un inhibiteur de pompe à protons et

les antibiotiques, pose des problèmes d’efficacité par rapport à l’observance au

traitement, la résistance aux antibiotiques, et la répétition possible de l'infection.

Le développement d’un vaccin efficace contre H. pylori offrirait ainsi plusieurs

avantages. Diverses approches ont été suivies dans le développement des

vaccins contre H. pylori. Pour la plupart, elles ont été basées sur l'utilisation des

antigènes connus pour être impliqués dans la pathogénie de l'infection, comme

l'uréase, la cytotoxine vacuolating (VacA), l’antigène cytotoxine-associé

(CagA), antigenes les plus promotteurs pour le développement d’un vaccin

humain. Plusieurs études menées sur des modèles animaux ont démontré qu'une

approche immunologique permettait de prévenir et même de traiter

l’infection à H. pylori. Les premières études cliniques ont indiqué qu'une

immunisation fondée sur l'utilisation de l'uréase de H. pylori était sûre,

immunogène, et pouvait amener à une diminution du nombre de bactéries dans

la muqueuse gastrique. Cependant, les mécanismes exacts de la protection

induite par l'immunisation sont encore mal compris. Une protection complète

contre H. pylori devra faire appel à des vaccins plus puissants.

Plusieurs essais sont prévus chez l'homme, avec l’espoir que la plupart des

questions posées actuellement sur le germe seront résolues. Les efforts actuels

s'orientent donc vers trois axes principaux : une définition des marqueurs de

l'immunité liés à la protection, la caractérisation de nouveaux antigènes

protecteurs et la recherche de la meilleure voie d'immunisation. (Corthesy-

Theulaz et Michetti, 2000 ; Giuseppe et al., 2001).

Bactéries lactiques Revue bibliographique

48

II- Généralités sur les bactéries lactiques

II-1 Historique

Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des millénaires dans l’alimentation

humaine. L’utilisation de la fermentation par l’homme remonte à des temps très

anciens. Les premiers produits fermentés ont certainement été obtenus par

acidification spontanée des jus végétaux (vins, bières…) ou par contamination

naturelle du lait (yaourts, fromages…). La fermentation est réalisée à partir de

différents types d’aliments : des végétaux (concombres, betteraves, dattes, jus de

fruits, soja, etc...), des produits animaux (viande, lait) ou du poisson. Elle permet

de conserver les aliments mais aussi de leur donner une saveur différente du

produit original. Il faudra attendre Pasteur et ses travaux sur la fermentation en

1857 (Pasteur, 1857) pour établir un lien entre la fermentation lactique et les

bactéries. Metchnikoff isole en 1904 le « bacille bulgare » (Lactobacillus

delbrueckii sp. bulgaricus) présent dans le yaourt. Il étudie les propriétés

acidifiantes des bactéries du yaourt et il développera l’idée que les bactéries

contenues dans les laits fermentés ont un effet bénéfique sur la santé

(Metchnikoff, 1907). Il plaidera en faveur de l’introduction de produits laitiers

fermentés dans le régime alimentaire et en 1905, les premières entreprises

fabricant du yaourt à partir des souches de l’Institut Pasteur voient le jour (Bibel,

1988). Depuis 1960, la production industrielle de yaourt connaît un

développement international considérable et le yaourt est devenu aujourd’hui un

produit de consommation courante.

II-2 Caractères généraux

Orla-Jensen (1919) a été le premier auteur à définir les bactéries lactiques ou

bactéries de l’acide lactique. Les bactéries lactiques ont été isolées pour

la première fois à partir du lait (Metchnikoff, 1907; Sandine et al., 1972; Carr et

al., 2002). Elles forment un groupe de bactéries relativement divers, mais reliées


49

entre elles par un certain nombre de fonctions métaboliques et physiologiques

typiques (Schleifer et Ludwig, 1995; Stiles et Holzapfel, 1997).

Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hetérotrophes et

chimioorganotrophes. Elles sont Gram positive, immobiles, asporulées, de

formes coccoide ou bâtonnet et produisent l'acide lactique comme produit final

principal pendant la fermentation des carbohydrates (Kandler, 1983).

Elles sont anaérobies mais aérotolérantes et ne possèdent ni catalase (certaines

possédent une pseudocatalase), ni nitrate réductase, ni cytochrome-oxydase.

Elles ne liquéfient pas la gélatine, ne produisant pas d’indole, ni d’hydrogène

sulfureux. De plus, elles sont caractérisées par un métabolisme fermentaire qui,

en utilisant des glucides, produisent soit exclusivement de l’acide lactique

(bactéries homolacticques), soit de l’acide lactique, de l’acide acétique, de

l’éthanol ou de CO2 (bactéries hétérolactiques). Elles ont une capacité de

biosynthèse faible. Les bactéries lactiques sont également caractérisées par des

exigences nutritionnelles nombreuses complexes en acides aminés, acides

organiques, bases nucléiques, sels, vitamines et les carbohydrates

fermentescibles pour leur croissance (Stamer, 1976 Hammes et Hertel, 1998,

2003). Les souches sont généralement faiblement protéolytiques et lipolytiques

(Law et Haandrikman, 1997; Shihata et Shah, 2000).

Les bactéries lactiques utilisées dans les fermentations laitières peuvent être

divisées en deux groupes sur la base de leur croissance optimale. Les bactéries

mésophiles avec une température optimum de croissance entre 20° C et 30°C et

les thermophiles entre 30°C et 45°C (Bissonnette et al., 2000). Elles se

développent majoritairement à des pH compris entre 4 et 6,5 majorité de

souches se développent à pH 4,0-4,5, et certaines sont encore actives à pH 9,6 et

d'autres à pH 3,2 (Hammes et Hertel, 1998, 2003).

L'acide lactique produit peut être sous deux formes stéréoisomèriques, L ou,

moins fréquemment, D ou un mélange des deux. Il convient de noter que l'acide


50

lactique (forme D) n'est pas métabolisé par des humains et n'est pas

recommandé pour les enfants à bas âge (Who, 1974).

II-3 Taxonomie

La première classification des bactéries lactiques a été établie en 1919 par Orla-

Jensen sur divers critères morphologiques et physiologiques (Stiles et Holzapfel,

1997). En effet, les bactéries lactiques est subdivisé en 11 genres différents

partagés entre les coques et les bâtonnets : Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus , Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Lactococcus,

Oenococcus,Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Stiles et Holzapfel,

1997; Klein et al., 1998; Axelsson, 2004) (Fig. 23). Les bactéries du genre

Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques typiques,

mais leur usage se répand en industrie laitière. D’autres bactéries Gram positive

non sporulées et productrices d’acide lactique appartenant à la famille des

actinobacteriacée et au genre, Aerococcus, Microbacterium, et

Propionibacterium sont aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire

(Sneath et Holt, 2001).

Cependant les méthodes phénotypiques ne rendent pas compte des relations

phylogénétiques entre les groupes. En 1977, Woese et Fox introduisent

la phylogénie moléculaire basée sur la séquence des ARN ribosomiques.

La taxonomie bactérienne moderne basée sur les caractéristiques phénotypiques

et génotypiques a eu comme conséquence la reclassification de beaucoup

d’espèces de bactéries lactiques. La composition d’ADN mesuré par

le pourcentage en base Guanine et cytosine (GC) est le premier critère de

parenté qui permet de connaitre l’homogénéité des espèces constituantes.

Les bactéries lactiques sont un groupe phylogénétique divers avec un GC de

50% (guanine et cytosine) en leur ADN.


51

Fig. 23: Arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l’ARN 16 S (Holzapfel et al., 2001).


52

Le pourcentage G+C (GC%) de leur ADN donne une composition assez proche

pour le genre Lactococcus (34,46%), Leuconostoc (36,43%), Pediococcus

(34,42%) et Bifidobacterium (67%) alors que le genre Lactobacillus est

caractérisée par une grande hétérogénéité (32, 53 %) (Novel, 1993). Les

bactéries lactiques possèdent un pourcentage (GC%) au dessous de 50%,

cependant certaines espèces de Lactobacillus ont des valeurs pouvant atteindre

55% (Axelsson, 2004). La classification est également possible avec des

méthodes génotypiques (RAPD-PCR, ribotyping) ou d’autres techniques

semblables. Les révisions taxonomiques des bactéries lactiques indiquent que

ces micro-organismes peuvent comprendre environ une quarantaine

de genres. Les révisions récentes de la taxonomie des bactéries lactiques sont

présentées dans le manuel Bergey –Trust (Garrity et al., 2008).

II-4 Habitat

Les caractéristiques métaboliques d’un microorganisme jouent un rôle important

dans le choix de son habitat. Etant donné que les bactéries lactiques sont des

bactéries exigeantes, elles colonisent des milieux riches très différents.

Elles sont trouvées dans diverses niches écologiques, telles que les végétaux,

les animaux, les produits laitiers et carnés ainsi que la cavités buccale,

les tractus gastro-intestinaux et urogénitaux des humains et des animaux

(El Shafei et al., 2000; Mathara et al., 2004 ; Dortu et Thonart, 2009 ). Elles

constituent aussi la flore microbienne dominante responsable de la fermentation

des céréales et des plantes fourragères ensilées (Carr et al., 2002; Dalié, 2010).

II-5 Ecosystème et microflore gastro-intestinaux

Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux

microorganismes exogènes. Il est généré par une alliance stable entre

l’épithélium gastro-intestinal, le système immunitaire et une importante flore

microbienne. Les interactions entre les microorganismes et l’hôte peuvent être


53

de trois types: symbiose, commensalisme et pathogénicité (Hooper et Gordon,

2001). Le tractus gastro-intestinal de l’homme et des animaux constitue

le principal habitat naturel des bactéries lactiques, du fait qu’ils fournissent

un environnement stable et un approvisionnement continu en éléments nutritifs,

sous forme d’aliments ingérés ou sécrétés par l’hôte. On y retrouve plus

communément les genres Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus et

Bifidobacterium. Généralement les espèces de Lactobacillus isolées du tube

digestif de l'homme comprennent L. acidophilus, L. salivarius, L. casei,

L. plantarum, L. fermentum, L. brevis et L. reuteri (Mikelsaar et al., 1987).

La microflore du tractus gastro-intestinal a été estimée à près de 1013-1014

cellules microbiennes représentant 400 à 500 espèces et sous espèces (Moore et

Holdeman, 1974; Bjorksten, 2004) (fig. 24).

En effet, Le tractus digestif humain est l’écosystème présentant la plus grande

densité cellulaire décrite jusqu’à aujourd’hui dont le nombre de bactéries

présentes est supérieur au nombre total de cellules humaines constituant

l’organisme. Les lactobacilles comptent parmi la flore dominante du microbiote

intestinal et sont présents tout au long du tractus gastro-intestinal en quantités

variables. Ils représentent environ 1% des micro-organismes, soit

approximativement 103 à 107 bactéries/g de contenu intestinal (Dal Bello et al.,

2003; Tannock, 2005).

L’environnement gastro-intestinal comprend trois régions principales qui offrent

des conditions très différentes pour la survie des différents microorganismes.

Dans le premier compartiment, l’estomac, la prolifération microbienne est

fortement réduite par la présence d’oxygène apporté par la déglutition et d’une

forte acidité. De ce fait, l’estomac héberge sélectivement les microorganismes

acidotolérants et anaérobies facultatifs comme les lactobacilles, streptocoques,

levures, etc. Dans le deuxième compartiment qui est le petit intestin,

la microflore est constituée essentiellement de bactéries anaérobies facultatives


54

Fig. 24 : Principaux compartiments du tractus digestif de l’homme et leurs microflores (Isolauri et al., 2004).

Œsophage : mucus, péristaltisme. Seuls les microorganismes provenant des aliments ou de la cavité orale sont présents

Estomac: pH acide (HCl), O2, enzymes (pepsines, lipases…), mucus. Microflore: 104 cfu/g Candida albicans, Helicobacter pylori Lactobacillus

Jéjunum: Secrétions pancréatiques et biliaires, mucus, péristaltisme. Microflore: 105-107 cfu/g Bacteroides, Candida albicans Lactobacillus, Streptococcus

Duodénum: Secrétions pancréatiques et biliaires, mucus, faible O2. Microflore: 103-104 cfu/g Bacteroides Candida albicans Lactobacillus Streptococcus

Colon: Anaérobiose, motricité, enzymes bactériennes, acides gras volatiles, ammoniaque Microflore: 1010-1011 cfu/g Bacteroides, Bacillus, Bifidobacterium Clostridium, Enterococcus, Eubacterium Fusobacterium, Peptostreptococcus Ruminococcus , Streptococcus

Iléon : Anaérobiose, sels biliaires, enzymes. Microflore : 107-108 cfu/g Bacteroides, Clostridium Enterobacteriacea, Enterococcus Lactobacillus, Veillonella


55

tels que les lactobacilles, les streptocoques et les entérobactéries, et anaérobies

strictes notamment les bifidobactéries, les bactéroides et les clostridies.

Dans le dernier compartiment qui est le colon (dépourvu d’oxygène), le transit

digestif est plus lent et la flore microbienne est plus abondante, représentant 35 à

50 % du volume du contenu du colon humain. La microflore du colon est très

complexe et dominée par les bactéries anaérobies strictes (Bacteroides spp.,

Clostridium spp, Bifidobacterium spp., Atopobium spp…). Tandis que

les bactéries anaérobies facultatives sont moins nombreuses et représentées par

les lactobacilles, les entérocoques, les streptocoques et les Enterobacteriaceae

(Cummings et al., 1989; Gounier-Château,1994).

Les bifidobactéries et les lactobacilles, ainsi que certains entérocoques, E. coli,

streptocoques et bactéroides, se distinguent par leurs effets bénéfiques sur

la santé de l’hôte, comme l’amélioration de la maturation et de l’intégrité de

l’intestin, l’antagonisme contre les pathogènes et la modulation de la fonction

immunitaire (Gibson et Roberfroid, 1995; Schiffrin et Blum, 2002).

Les rôles principaux de la flore digestive portent sur des aspects métaboliques,

trophiques et immunitaires (Guarner et Malagelada, 2003). Elle protègeraient

l’hôte des infections bactériennes à deux niveaux : elles stimuleraient le système

immunitaire de l’hôte et le protègeraient des pathogènes par «l’effet barrière».

La fonction protectrice de la flore sur les bactéries pathogènes porte sur deux

aspects : la compétition pour l’habitat et la production d’agents anti-microbiens.

Cette protection impliquerait notamment les bactéries lactiques commensales

particulièrement les genres Lactobacillus et Bifidobacterium (Servin, 2004).

II-6 Utilisation des bactéries lactiques dans le domaine agro-alimentaire

Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans les procédés industriels de

fabrication agro-alimentaire tels que l’industrie laitière et fromagère,

la brasserie, la boulangerie, la charcuterie, l’œnologie, la cidrerie, la vinaigrerie,

la fabrication d’alcool…..etc. L’exemple le plus connu est probablement le plus


56

stable reste la fabrication du yaourt par S.thermophilus et Lb. bulgaricus.

Les bactéries lactiques contribuent aux caractéristiques organoleptiques et

assurent une meilleure conservation des aliments elles contribuent à la saveur de

l’aliment et sa texture. Ceci est dû notamment à l’acide lactique produit au cours

de la croissance. D’autre part, les bactéries lactiques produisent des peptides et

des molécules comme l’acétoine, l’acétaldéhyde, le diacétyle ou l’éthanol qui

sont importants pour la flaveur des aliments. Les levains se composent de

microorganismes choisis sur la base de leurs caractéristiques propriétés

technologiques (acidifiante, aromatisante, texturante et antagoniste) (Bigret,

1989; Stiles, 1996). Certaines bactéries lactiques comme L. helveticus sont

utilisées pour produire industriellement de l’acide lactique employé comme

additif en alimentation et dans les produits cosmétiques ou pharmaceutiques

(Penaud, 2006).

II-7 Intérêts des bactéries lactiques en santé humaine

Si les bactéries lactiques sont importantes pour l’alimentation humaine, elles

le sont aussi pour sa santé. En effet, les bactéries lactiques sont aussi nommées « agents de la vie » vu toutes les fonctions qu’on leur attribue. Elles sont de plus

en plus utilisées sous forme de probiotiques qui sont par définition des

microorganismes vivants administrés en quantités adéquates et qui sont

bénéfiques pour la santé de l’hôte (Metchnikoff, 1907; Parker, 1974; Gibson et

Roberfroid 1995). Parmi les effets bénéfiques de ces probiotiques, nous pouvons

citer : Amélioration de la digestion du lactose, production de vitamines, effet

prophylactique et thérapeutique vis-à-vis des diarrhées, prévention des

infections gastro-intestinales (virus, H. pylori…) et urogénitales, régulation de

la motilité intestinale (constipation,syndrome d’irritation intestinale), diminution

du taux de cholestérol sanguin, stimulation du système immunitaire et activité

anticarcinogène (Mercennier et al., 2002) (fig. 25).


57

De façon plus spécifique, pour qu’un organisme soit considéré comme étant

potentiellement probiotique, il doit présenter les caractéristiques suivantes

(Salminen et al.,1996, 1998; Stanton et al., 2001)(fig. 26)

- être un habitant naturel de l’intestin.

- être capable de coloniser, persister et se multiplier dans le milieu intestinal

- adhérer aux cellules intestinales et exclue ou réduit l’adhérence des pathogènes

- avoir un métabolisme actif et produire des substances inhibant les pathogènes

(acides, H2O2, bactériocines…)

- non invasif, non carcinogène et non pathogène

- être capable de co-agréger pour former une flore normale équilibrée

- survivre aux différents procédés technologiques de production

- garder sa viabilité dans l'aliment et durant le transit intestinal


58

Fig. 25: Schéma simplifié montre les principaux effets

bénéfiques attribués aux probiotiques (Mercenier et al., 2002).

Fig. 26: Propriétés et critères de sélection des probiotiques (Salminen et al., 1998).


59

II-8 Souches microbiennes probiotiques utilisées

En générale, les souches probiotiques sont sélectionnées prioritairement pour

leurs effets bénéfiques et leur innocuité. Les souches ou espèces probiotiques

sont des composants normaux de la flore intestinale (Dunne et al., 2001). En

alimentation humaine, les microorganismes probiotiques sélectionnés sont

représentés essentiellement par les bactéries lactiques, particulièrement celles

appartenant au genre Lactobacillus et Bifidobacterium (Borriello et al., 2003;

Saito, 2004). Aujourd’hui, ces deux genres bactériens sont largement utilisés

dans la fabrication de produits laitiers fermentés. Par contre, en alimentation

animale de nombreux genres bactériens et fongiques sont utilisés, comme

Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus,

Enterococcus, Propionibacterium, Saccharomyces, Aspergillus et Torulopsis

(tableau 6) (Gournier-château et al., 1994; Tannock, 1997; Holzapfel et al.,

2001).

Tableau 6: Principales souches microbiennes probiotiques (Holzapfel et al., 2001)


60

II-9 Probiotiques et les infections gastro-intestinales

Plusieurs études cliniques ont évalué l'efficacité des probiotiques dans

la prévention et le traitement des maladies gastro-intestinales.

En effet, il a été démontré que certaines infections gastro-intestinales telles que

l’infection à H. pylori, les diarrhées et les allergies alimentaires peuvent être

contrecarrées avec succès par l’utilisation de probiotiques (Mercenier et al.,

2002, Turchet et al., 2003; Rosenfeldt et al., 2004). A titre d’exemple, Wang et

al. (2004) ont rapporté que la consommation régulière de yogourt additionné de

Lactobacillus acidophilus La5 ou de Bifidobacterium lactis Bb12 induit une

suppression effective de l’infection due à H. pylori. D’autre part, Michetti et al.

(1999) ont démontré une efficacité partielle liée à l’administration de

surnageants de culture de L. acidophilus La1 à des volontaires.

Tandis que Rosenfeldt et al. (2002) ont mentionné que des souches de

L. rhamnosus et L. reuteri ont permis de traiter des gastro-entérites à rotavirus

chez des enfants hospitalisés. Dans une autre étude menée, Hickson et al.,

(2007) signalent que la consommation d'une boisson contenant les souches

probiotiques L. casei, L. bulgaricus et S. thermophilus peut réduire l'incidence

de la diarrhée associée aux antibiotiques et de la diarrhée associée à C. difficile.

De plus, des entérites induites par Campylobacter peuvent être traitées par

Bifidobacterium longum.

II-10 Interaction entre les bactéries lactiques

Les interactions entre deux populations microbiennes constituent un ensemble

complexe de phénomène biologique hétérogène. Elles sont définies selon leurs

effets avantageux ou désavantageux. Des bactéries appartenant au même

système taxonomique peuvent montrer des attitudes différentes. Qui dit

association de souches, dit possibilité d’interaction. Si ces interactions sont

bénéfiques pour une ou pour plusieurs souches, on parlera de coopération, si

elles sont néfastes pour une ou plusieurs souches, on parlera d’inhibition.


61

II-10-1 Inhibition des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont connues pour leur aptitude à produire des composés

antibactériens leur permettant de se développer préférentiellement dans divers

écosystèmes. La découverte des substances inhibitrices actives contre les germes

pathogènes est devenue d’un grand intérêt au cours des dernières années et ceci

à cause de la propagation des maladies véhiculées généralement par les aliments

(Bibek et Daeschel, 1992; Jack et al., 1995).

Les milieux permettant le développement des bactéries lactiques sont complexes

du point de vue nutritionnel. Ils présentent soit des substrats de fermentation,

soit des écosystèmes digestifs comme c’est le cas pour les bactéries lactiques

séjournant dans le tractus intestinal de l’homme ou des animaux. Ces

écosystèmes sont également peuplés par de nombreux autres microorganismes

comprenant des espèces pathogènes ou d’altération.

La capacité de survie des bactéries lactiques dans de tels environnement résulte

de leur activité fermentaire associé à la production de divers composés anti-

microbiens tels que les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, des

bactériocines (Lewus et al., 1991; Van De Guchte et al., 2001).

.

II-10-1-1 Acides organiques

L'acide lactique est le métabolite principal des bactéries lactiques causant

la réduction du pH qui inhibe la plupart de microorganismes (Eklund, 1989;

Schnürer et Magnusson, 2005). Les bactéries lactiques hétérofermentaires

produisent des quantités d'acide organique autre que l'acide lactique tel que

l’acide acétique et l’acide propionique. Ces acides organiques traversent

passivement la membrane cytoplasmique et se dissocie à l'intérieur de la cellule,

libérant les ions H+ qui acidifient le cytoplasme à un point tel que les fonctions

cellulaires sont inhibées (Kashet, 1987; Piard et Desmazeaud, 1991).

En plus, l'acide fait chuter le gradient électrochimique de proton entraînant

la bactériolyse et finalement la mort des bactéries sensibles (Eklund, 1989).


62

L’accumulation d’acide organique est directement inhibitrice pour

les microorganismes nuisibles qui présentent un seuil bas de résistance aux

changements de pH intracellulaire tels que Salmonella, E. coli, Pseudomonas et

Clostridium. L’acide lactique est toxique pour beaucoup de bactéries (Tableau

7) mais aussi pour des champignons et moisissures (Geis, 1989 ; Piard et

Desmazeaud, 1991). Adams et Hall (1988) ont démontré que les acides lactique

et acétique peuvent avoir des effets synergiques sur certaines espèces tel que

E. coli et Salmonella enteritidis. L’acide lactique diminue le pH du milieu,

augmentant ainsi la toxicité de l’acide acétique.

L'effet inhibiteur spécifique des acides organiques est généralement attribué à

leur forme dissociée et non dissociée. L’ampleur de la dissociation dépend du

pH. A pH bas, une grande quantité d'acide est sous la forme non dissociée, et

elle est toxique à beaucoup de bactéries, champignons et levures (Podolak et al.,

1996). En général, la forme moléculaire (non dissociée) de l’acide lactique est

le facteur inhibiteur pour les bactéries lactiques. Les concentrations en acide

lactique non dissocié nécessaire pour provoquer une inhibition sont pour

les levures, les Enterobacteriaceae et les Microccocaceae de l'ordre 1 mM; pour

les moisissures de 3 mM; et pour les Bacillaceae de 4 Mm (Baird-Parker, 1980;

Adams et Hall, 1988). Cependant, le comportement des différents micro-

organismes vis-à-vis de l'acide lactique varient considérablement. L’acide

lactique à pH 5,0 a un effet inhibiteur contre les bactéries sporulantes mais il est

inefficace contre les levures et les champignons (Woolford,1975).

Les stéréoisomères de l'acide lactique diffèrent également dans l'activité

antimicrobienne, l’acide lactique (L) étant plus inhibiteur que l’isomère D

(Benthin et Villadsen, 1995).

Les acides acétiques et propioniques produits par les bactéries lactiques par

les voies hétérofermentaires peuvent agir sur les membranes, et causent

l'acidification intracellulaire et la dénaturation des protéines (Huang et

al., 1986).


63

Tableau 7: Valeurs de pH limites permettant l’initiation de la croissance de divers microorganismes (Piard et Desmazeaud, 1991)

Bactéries à Gram négatif Valeurs de pH limite

Escherichia coli 4,4

Klebsiella pneumoniae 4,4

Proteus vulgaris 4,4

Pseudomonas aeruginosa 5,6

Salmonella paratyphi 4,5

Salmonella typhi 4,0 – 4,5

Vibrio parahaemolyticus 4,8

Bactéries à Gram positif Valeurs de pH limite

Bacillus cereus 4,9

Clostridium botulinum 4,7

Enterococcus sp 4,8

Lactobacillus sp 3,8 – 4,4

Micrococcus sp 5,6

Staphylococcus aureus 4

Lactococcus lactis 4,3 – 4,8

Brevibacterium linens 5,6

Listeria monocytogenes 5,5


64

Ils ont un effet antimicrobien plus fort que l'acide lactique dus à leurs valeurs

plus élevées de pKa (acide lactique 3,08, acide acétique 4,75, et acide

propionique 4,87), et un pourcentage plus élevé d'acides non dissociés à un pH

donné (Earnshaw, 1992).

II-10-1-2 Peroxyde d'hydrogène

En présence d’oxygène, les bactéries lactiques peuvent produire du peroxyde

d’hydrogène, toxique pour d’autres bactéries. Il est formé par des peroxydases

ou par la superoxyde-dismutase ou encore quand la concentration intracellulaire

en ions manganèse est élevée (Piard et Desmazeaud, 1991). Les lactocoques

lactiques produisent suffisamment de peroxyde d’hydrogène pour entraîner une

auto-inhibition (Subramanian et Olson., 1968).

Le peroxyde d’hydrogène est capable d’endommager les membranes

bactériennes par la peroxydation des lipides entrainant ainsi l'augmentation de

la perméabilité membranaire, mais il peut aussi inhiber les enzymes de la

glycolyse, perturber les systèmes de transport des sucres et des acides aminés

ainsi que la synthèse des protéines et des acides nucléiques (Kong et Davison,

1980). Il peut également agir comme précurseur pour la production de radicaux

libres bactéricides tels que les radicaux du superoxyde (O2-) et de l’hydroxyle

OH- qui peuvent endommager l’ADN des bactéries (Byczkowski et Gessner,

1998).

En plus de son effet bactéricide, le peroxyde d’hydrogène active le système

lactoperoxydase présent dans le lait en produisant deux puissants inhibiteurs

microbiens à savoir l’hypothiocyanate (OSCN) et l’acide hypothiocyaneux

(HOSCN). Ce système agit contre les germes psychrotrophes en permettant

un report appréciable de la date limite de vente du lait cru (Condon, 1987 ;

Adams et Nicolaides, 1997).


65

La catalase constitue le système le plus efficace contre ce produit, cependant

les bactéries lactiques en sont dépourvues et à la place elles sont dotées

d’une peroxydase qui est moins efficace (Doleyres, 2003).

La production de H2O2 par Lactobacillus et Lactococcus inhibe la croissance

de Staphylococcus aureus, de Pseudomonas sp. Et divers microorganismes

psychrotrophes (Davidson et al., 1983). L'inhibition est négociée par l'effet

d'oxydation fort sur des lipides de membrane et des protéines cellulaires

(Morris, 1976; Lindgren et Dobrogosz, 1990). La quantité de peroxyde

d'hydrogène produite par les bactéries lactiques dépend en grande partie de

la souche et la disponibilité de l'oxygène (Helander et al., 1997).

II-10-1-3 Dioxyde de carbone

Il est produit par les bactéries lactiques hétérofermentaires. Le mécanisme précis

de son action antimicrobienne reste indéterminé. Cependant, le CO2 peut jouer

un rôle antimicrobien en créant un environnement anaérobique qui inhibe

la décarboxylation enzymatique et l'accumulation de CO2 dans la bicouche

lipidique de la membrane peut aussi causer un dysfonctionnement de

la perméabilité membranaire (Eklund, 1984).

Le CO2 inhibe la croissance de beaucoup de microorganismes d’altération,

particulièrement les bactéries psychrotrophes à Gram négatif (Farber, 1991;

Hotchkiss et al., 1999). Le degré d'inhibition varie considérablement selon

les espèces (Ammor et al., 2005).

II-10-1-4 Diacétyle

Il est généralement produit par des souches de Lc. lactis subsp. lactis biovar.

diacetylactis par la fermentation du citrate (Lindgren et Dobrogosz, 1990;

Cogan et Hill, 1993). Il est responsable de L’arome et de la saveur du beurre et

de quelques autres produits laitiers fermentés (Earnshaw, 1992).

Beaucoup de bactéries lactiques comprenant des souches de Leuconostoc,


66

de Lactococcus, de Pediococcus et de Lactobacillus peuvent produire

le diacétyle (Cogan, 1986 ; Budde et al., 2003). Son utilisation pratique comme

conservateur est limitée.

Cependant, le diacétyle peut agir synergiquement avec d'autres facteurs

antimicrobiens et contribuer aux systèmes combinés de conservation en

nourritures fermentées. Les bactéries Gram négatives, les levures et

les champignons sont plus sensibles au diacétyle que les bactéries Gram

positives (Jay, 1982).

1I-10-1-5 Acétaldéhyde

Chez Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, l'action d'une thréonine aldolase, clive

la thréonine en acétaldéhyde et en glycine. L'acétaldéhyde à une concentration

de 10 à 100 ppm empêche la croissance de Staphylococcus aureus, de

Salmonella typhimurium et d’E. coli dans les produits laitiers (Piard et

Desmazeaud, 1991). La contribution de l'acétaldéhyde à la biopréservation est

mineure puisque le seuil de saveur est beaucoup inférieur aux niveaux qui sont

considérés nécessaires à l'inhibition des microorganismes (Kulshrestha et Marth,

1974).

II-10-1-6 Reutérine

La reutérine est produite par Lactobacillus reuteri, une espèce hétérofermentaire

qui niche dans l'appareil gastro-intestinal des humains et des animaux (Axelsson

et al., 1989). La reutérine est formée pendant la croissance anaérobique de Lb.

reuteri par l'action du glycérol déhydratase qui catalyse la conversion du

glycérol en reutérine. Elle est produite pendant la phase stationnaire de

Lactobacillus reuteri dans un milieu contenant du glucose et du glycérol ou du

glycéraldéhyde (Talarico et al.,1988, 1989). La reutérine montre un large spectre

d'activité antimicrobienne contre certaines bactéries à Gram+ et à Gram-.

Les microorganismes de détérioration sensibles à la reutérine comprennent


67

Salmonella, Shigella, Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Candida, et

Trypanosoma (Axelsson et al., 1989).

II-10-1-7 Bactériocines

La découverte de la première bactériocine remonte à 1925. Cette dernière, isolée

de E. coli, possédait une activité bactéricide envers une autre souche de E. coli.

Elle fut nommée colicine V (Gratia, 1925). À cette époque, le concept de

compétition entre diverses bactéries était instauré et bien accepté.

Les bactériocines produites par les bactéries sont généralement définies en tant

que parties protéiques biologiquement actives, possédant une activité bactéricide

contre des espèces proches de la souche productrice (Tagg et al., 1976;

Klaenhammer, 1988; James et al., 1991).

Les bactériocines sont synthétisées par les ribosomes, se composent de 51 à 113

acides aminés, avec une structure hélicoïdale (van Belkum et al., 1991, 1992).

La classification actuelle des bactériocines est fondée sur leur taille, leur

résistance à la chaleur, certaines propriétés physicochimiques, leur spectre

d'activité et la présence ou non d'acides aminés modifiés. Quatre classes

distinctes de bactériocines ont été définies (Cenatiempo et al., 1996 ;

Klaenhammer, 1988 ; Dortu et Thonart, 2009). Elles ont en général des spectres

d’activités étroits mais ils sont surtout spécifiques aux bactéries à Gram positive.

En effet, toutes les bactériocines produites par des bactéries lactiques décrites

jusqu’à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram+, la membrane

externe des bactéries Gram- ne permettant pas aux bactériocines d’atteindre

la membrane interne, siège de leur activité. En plus, les bactériocines sont

produites pendant ou à la fin de la phase exponentielle de croissance, puis

exportées à l’extérieur des cellules productrices (Tagg et al., 1976; Van De

Guchte et al., 2001; Dortu et Thonart, 2009). La production d’une bactériocine

peut être considérée comme un moyen pour éliminer des bactéries envahissantes

concurrentes (Lachance, 2000).


68

En effet, les bactériocines sont caractérisées et sélectionnées pour être utilisées

en tant qu’antagoniste vis-à-vis des bactéries de contaminations et pathogènes

Elles sont largement répandues chez les bactéries alimentaires telles que

les bactéries lactiques ayant pour cible des bactéries du genre Listeria,

Clostridium, Staphylococcus aureus et d’autres bactéries à Gram positif comme

les bactéries lactiques (Cintas et al., 2001).

Une attention particulière, ces dernières années est accordée aux bactériocines

produites par les bactéries lactiques et ceci est due en grande partie à leur

éventuelle application dans l'industrie alimentaire en tant que biopréservateurs

(Rodriguez et al., 2002). Les bactériocines occupent un rôle prometteur dans

la conservation naturel des produits fermentés, ce qui est un atout

supplémentaire pour les industriels (Daeschel, 1993; Ray et Daeschel, 1994).

II-11 Les lactobacilles

Les lactobacilles représentent le groupe le plus important des bactéries lactiques

tant au niveau industriel qu’au niveau de la flore commensale (Penaud, 2006).

Ils contiennent plus de 120 espèces et 20 sous espèces. Ce nombre évolue

régulièrement, 13 nouvelles espèces ont été proposées en 2005, 9 en 2006 et

7 autres en 2007 (Lee et Salminen, 2009). Cependant, ce genre est très

hétérogène, aussi bien sur le plan génétique que sur le plan de la distribution des

habitats (Penaud, 2006).

II-11-1 Caractères généraux

Le genre Lactobacillus a été décrit par Beijerinck en 1901 pour regrouper des

bactéries à Gram positif isolées de produits laitiers et à métabolisme fermentaire.

Les lactobacilles appartiennent au groupe des Firmicutes, à la classe des Bacilli,

à l’ordre des Lactobacillales et à la famille des Lactobacilliaceae (Schleifer et

Ludwig, 1995). Il s’agit de bacilles souvent allongés parfois isolés ou groupé en

paires ou en chaînes (fig. 28), non sporulés généralement immobiles avec


69

un pourcentage G+C inferieur à 50%. Ils sont dépourvus de catalase (certains

ont une pseudo-catalase) et d’oxydase. Ils sont micro-aérophiles ou anaérobies.

Ces bactéries peuvent se développer à des températures basses ou extrêmes

comprises entre 2 et 50°C, avec un optimum compris entre 30 et 40°C

(Kandler et Weiss, 1986).

Fig. 28: Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei observés au microscope électronique (G x 10 000)

Les lactobacilles sont acidophiles, avec un optimum de pH entre 5,5 et 6,2.

Ils se montrent généralement plus résistants au stress acide que les lactocoques .

De plus, ces microorganismes sont auxotrophes avec de fortes exigences en

facteurs de croissance (Morishita et al., 1981). Les critères phénotypiques

restent encore très importants aujourd’hui pour la classification des lactobacilles.

D’autre part, Les études basées sur les ARN 16S ont permis de mettre en

évidence l’existence de différents groupes phylogénétiques au sein des

lactobacilles (Schleifer et Ludwig, 1995) (fig. 29).


70

Fig. 29: Arbre phylogénétique des groupes principaux du genre Lactobacillus basé sur les ARNr 16S (Schleifer et Ludwig, 1995)

Les lactobacilles ont un métabolisme fermentaire produisant de l’acide lactique

Certaines espèces sont homolactiques, d’autres hétérolactiques produisant des

acides volatils, de l’éthanol et du CO2 en plus de l’acide lactique.

Stiles et Holzapfel (1997) rapportent que les lactobacilles peuvent être classés en

trois groupes selon leur métabolisme fermentaire

Le groupe 1 représente les lactobacilles homofermentaires, ou

“Thermobacterium” qui produise exclusivement de l’acide lactique à partir de

la fermentation du glucose alors que le groupe 2 représentant les lactobacilles

hétérofermentaires facultatives ou “Streptobacterium” produisent en plus de

l’acide lactique, de l’éthanol, du CO2, de l’acide acétique à partir de

la fermentation des hexoses tandis que le groupe 3 représenté par

les lactobacilles hétérofermentaires strictes ou “Betabacterium” fermentent

les hexoses et les pentoses en acide lactique, acide acétique et/ou éthanol et

CO2.


71

II-11-2 Habitat

Les lactobacilles colonisent un nombre important de niches écologiques et

représentent le groupe de bactéries lactiques le plus ubiquitaire dans

l’environnement (de Roissart et Luquet, 1994). Ils appartiennent à la flore

normale de la cavité buccale, urogénitale et du tractus gastro-intestinal de

l’homme et de l’animal. Ces bactéries sont importantes pour le maintien de

l’équilibre de la flore commensale et donc pour la santé de l’hôte (Saad, 2010).

Les lactobacilles sont également isolés d’autres niches telles que les plantes,

le sol, l’eau, les produits laitiers, carnés ou végétaux fermentés ou en

décomposition. Les lactobacilles sont très utilisés dans l’industrie

agroalimentaire (en laiterie, fromagerie, charcuterie, dans la fabrication de

la choucroute, ...). Ils sont notamment utilisés pour les fermentations lactiques

du lait (L. bulgaricus), de la viande (L. sakei) ou de produits végétaux

(L. plantarum). Cependant, les lactobacilles peuvent aussi être des contaminants

indésirables de produits alimentaires. Ils sont notamment à l’origine de

la détérioration de produits tels que la bière (L. casei, L. plantarum), le lait

(L. maltaromicus), la viande et les produits carnés (L. sakei, L. curvatus) (Stiles

et Holzapfel, 1997 ; de Roissart et Luquet, 1994).

Ils sont utilisés industriellement dans trois domaines en tant que probiotiques

dans l’alimentation animale, dans les préparations pharmaceutiques destinées à

l’homme, et en tant que ferments lactiques pour les produits fermentés (dans

les domaines laitiers et carnés) (Saad, 2010).

II-11-3 Effets des lactobacilles sur la santé

L’effet probiotique des lactobacilles a été et est encore largement étudié.

Les lactobacilles font partie de la flore digestive et participent aux effets

bénéfiques de la microflore sur l’hôte, que ce soit au niveau métabolique,

trophique ou immunitaire. Un des effets majeurs des lactobacilles sur la santé

humaine décrits dans la littérature est leur rôle antagoniste vis à vis des bactéries


72

pathogènes (Silva et al., 1987 ; Dambélé et al., 1998 ; Servin, 2004; Saad,

2010). Les effets des lactobacilles sur les bactéries pathogènes reposent sur

différentes propriétés telles que la capacité à adhérer aux cellules en inhibant

ainsi l’adhésion des pathogènes, l’inhibition de la croissance des pathogènes, la

capacité d’entrer en compétition avec les pathogènes pour les ressources

nutritives et la modulation de la réponse immunitaire de l’hôte (Reid et Burton,

2002).

Effectivement, certains lactobacilles sont capables d’induire la réponse

immunitaire de l’hôte. Cet effet a été observé par plusieurs souches de

lactobacilles comme L. johnsonii La1, L. casei rhamnosus GG ou L. casei

Shirota. L’adhésion des lactobacilles aux cellules humaines permettrait d’une

part aux lactobacilles de se maintenir dans l’hôte et d’autre part, d’inhiber

l’adhésion des pathogènes (Grangette et al., 2005).

En outre, La capacité des lactobacilles à inhiber la croissance de bactéries

pathogènes repose sur plusieurs propriétés (Silva et al., 1987). La production de

peroxyde d’hydrogène (H2O2), facteur inhibiteur de la croissance des

pathogènes a surtout été étudiée pour les lactobacilles commensaux du tractus

urogénital (Marelli et al., 2004). La microflore vaginale des femmes souffrant

d’infections vaginales bactériennes est constituée en majorité de lactobacilles

commensaux ne produisant pas d’H2O2 (seuls 14% des lactobacilles en

produisent) alors que pour les femmes « saines », les lactobacilles producteurs

d’H2O2 représentent 75% de la flore (Al-Mushrif et Jones, 1998).

Un autre facteur permettant l’inhibition de la croissance des pathogènes est

la production d’acides organiques (lactique ou acétique), et par là-même

l’acidification du milieu. Ces effets ont été étudiés in vitro pour plusieurs

lactobacilles probiotiques. L. casei rhamnosus GG inhibe l’adhésion de

Salmonella typhimurium par un effet dépendant du pH, l’inhibition étant levée à

pH neutre (Lehto et Salminen, 1997). L. casei Shirota et L. acidophilus YIT0070

inhibent la croissance de E. coli O157:H7 par la production d’acide lactique


73

(Ogawa et al., 2001). Fayol-Messaoudi et al. (2005) ont montré que l’activité

antagoniste de L.johnsonii La1, L. casei rhamnosus GG, L. rhamnosus GR1,

L. casei Shirota et L. casei DN-114 sur S. enterica est principalement due à

l’effet de l’acide. Cependant, il semble que l’acide lactique joue un rôle dans

l’inhibition de la croissance des bactéries à Gram négatif (auxquelles

appartiennent un grand nombre de pathogènes) par perméabilisation de

la membrane externe, ce qui faciliterait l’entrée de molécules antibactériennes

dans les cellules et augmenterait ainsi leur efficacité (Alakomi et al., 2000).

De plus, l’accumulation de lactate dans la cellule induit aussi des effets délétères

pour la cellule (Presser et al., 1997).

D’autre part, Certains lactobacilles produisent des molécules protéiques

bactéricides appelées bactériocines dont le rôle dans l’inhibition de pathogènes

en conditions technologiques a été largement étudié. Les bactériocines ont

un spectre d’action variable, plus souvent limité à certaines espèces à Gram

positif. Certaines bactériocines peuvent éventuellement être utiles pour limiter

les contaminations alimentaires par des pathogènes comme Listeria

monocytogenes ou Clostridium botulinum (Ross et al., 2002). L’usage des

bactériocines pour le traitement de troubles intestinaux est limité car elles sont

peu ou pas actives sur des bactéries à Gram négatif, principaux agents de ces

troubles. Cependant, quelques bactériocines de lactobacilles sont actives sur des

bactéries à Gram négatif comme l’acidophiline 801 active contre E. coli Raw et

S. panama. (Zamfir et al., 1999).

Différentes espèces de lactobacilles sont largement étudiées pour leurs effets

bénéfiques sur la santé. Cependant, certaines de ces bactéries ont été impliquées

dans des cas de bactériémies, d’endocardites ou d’infections localisées (Cannon

et al., 2005). Les infections dues aux lactobacilles sont rares mais, comme tout

micro-organisme, les lactobacilles peuvent être associés à des infections, dans

certaines conditions, notamment dans le cas de sujets immunodéprimés ou déjà

malades (Salminen et Arvilommi, 2002).

74

Objectif du travail

Les lactobacilles sont connus pour leur pouvoir inhibiteur contre les bactéries

pathogènes y compris Helicobacter pylori. C’est dans ce contexte que s’inscrit

notre étude qui consiste à :

Mettre en évidence H. pylori à partir des biopsies gastriques.

Isoler et identifier H. pylori des biopsies gastriques

Isoler et caractériser les lactobacilles du lait cru de chèvre.

Mettre en évidence l’inhibition des lactobacilles vis-à-vis de H. pylori, et

d’autres bactéries pathogènes.

Enfin, déterminer la nature de l’agent inhibiteur impliqué dans cet antagonisme.

Matériels et Méthodes

75

I- Isolement et identification de Helicobacter pylori

I-1 Echantillon et origine du matériel

La recherche de H. pylori a été basée sur des méthodes directes invasives,

nécessitant une fibroscopie. En effet, l’étude a été réalisée sur des biopsies

antrales gastriques, prélevées chez des patients atteints de maladies gastro-

duodénales (gastrite chronique, ulcère duodénal ou ulcère gastrique).

Ces patients se présentaient à jeun et ayant subit une endoscopie

gastroduodénale au niveau du service gastro-entérologie à l’hôpital militaire

d’Oran.

Deux souches de H. pylori de référence ont aimablement été fournies par le Pr.

F. Megraud du Laboratoire de Bactériologie (Bordeaux, France). Les souches

sont H. pylori J 99, H. pylori 26695.

I-2 Prélèvement

Les prélèvements biopsiques doivent être effectués à distance d’un traitement

par des antibiotiques ou des antisecrétoires (Lamouliatte et al., 1992; Megraud,

1992; Megraud,1994a). Les conditions de stérilité doivent être respectées au

moment du prélèvement (Megraud, 1989).

Les prélèvements ont été effectués sous endoscopie dans la région antrale à

environ de 2 cm du pylore à l’aide d’un endoscope type (Olympus GIFXQ 10) et

d’une pince à biopsie, préalablement désinfectés au glutaraldhyde et bien rincés

en raison du pouvoir inhibiteur de ce produit sur H. pylori (Lozniewski, 1996;

Lamouliatte et al., 1992; Megraud,1992). Le port des gants lors de la fibroscopie

est recommandé pour éviter une éventuelle contamination (Megraud, 1994a).

L’endoscopiste prélève 4 biopsies antrales qui serviront à pratiquer

respectivement un test rapide à l’urée, un examen cytologique, un examen

anatomopathologique et une culture (Lamouliatte et al.,1992; Megraud,

1994b).


76

I-3 Conservation des biopsies

La biopsie destinée à l’examen anatomopathologique est déposée dans

un fixateur, le liquide de Bouin (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992).

Pour la bactériologie, les trois autres biopsies sont placées, dans un pot stérile

contenant 1 ml du sérum ou eau physiologique stérile où la biopsie sera

protégée de l’oxygène de l’air et de la dessiccation (Megraud, 1994a, 1994g),

puis acheminées au laboratoire à 4 °C et ceci pour un délai de transport

n’excédant pas les 4 heures de temps (Lamouliatte et al,1992; Megraud, 1992,

1994g). Le milieu de transport « Portagem pylori » est utilisé pour le transport

des biopsies durant 24h.

Il est à noter que le test rapide à l’urée peut être pratiqué directement dans

la salle d’endoscopie en utilisant le CLO test (Megraud, 1994b).

I-4 Examen anatomopathologique

Cet examen est réalisé par l’anatomopathologiste (Megraud, 1996a). Il permet

d’une part, d’étudier la muqueuse gastrique et ses modifications histologiques, et

d’autre part de visualiser les bactéries spiralées (Lamouliatte et al,1992; Sobhani

et al, 1995). Il s’effectue sur des coupes histologiques préparées à partir des

biopsies gastriques, colorées à la coloration de Giemsa modifiée, puis observées

au fort grossissement (Megraud, 1994a).

I-5 Examens microbiologiques

I-5-1 Examen cytologique

Cet examen consiste en la mise en évidence de bactéries spiralées par une

coloration de Gram de l’empreinte biopsique (Megraud, 1994a; Sobhani et

al., 1995). Pour cela, une biopsie est déposée sur une lame porte-objet, puis

écrasée à l’aide d’une seconde lame afin d’obtenir un frottis fin et régulier

(Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1994a, 1994b). Le frottis préparé est ensuite


77

séché, fixé, puis coloré à la coloration de Gram (Sobhani et al., 1991; Megraud,

1994b; Cellini et al., 1995b). L’ensemble de la préparation est observé

attentivement au microscope optique au faible grossissement, pour repérer

les zones plus riches en cellules puis au fort grossissement pour bien observer

les bactéries spiralés à Gram négative (Megraud, 1994b). Il est nécessaire

d’observer un grand nombre de champs microscopiques du fait de la répartition

parfois non homogène des bactéries dans la biopsie gastrique (Megraud, 1989;

Lamouliatte et al, 1992).

I-5-2 Test rapide à l’Urée

Helicobacter pylori a la particularité de posséder une uréase très active. Cette

propriété est utilisée pour le diagnostic de l’infection à H. pylori par un test

rapide à l’urée (Delchier, 1994). Ce dernier est basé sur la recherche directement

au niveau de la biopsie gastrique, de l’activité uréasique chez H. pylori, qui va

alcaliniser un milieu riche en urée et faire virer l’indicateur du pH par

la libération de l’ammoniac (Lamouliatte et al, 1992 ; Megraud, 1994a ;

Lozniewski, 1996 ; Megraud, 1996a). Pour cela, nous avons effectué cette

recherche en salle d’endoscopie et au laboratoire (Megraud, 1989, 1994a).

En salle d’endoscopie, nous avons utilisé le CLO test: c’est un dispositif en

plastique, constitué d’un gel d’agar contenant de l’urée, d’un indicateur de pH

coloré (rouge de phénol), de tampon et d’un agent bactériostatique n’ayant pas

d’effet sur H. pylori. La biopsie gastrique est déposée à la surface du gel aussitôt

que le prélèvement est effectué. Ensuite, le dispositif est incubé à 37°C

(Delchier, 1994; Riachi et Colin, 1995; Delchier, 1996b).

La lecture des résultats (virage de l’indicateur de sa couleur jaune initiale à une

couleur rouge) s’effectue au bout de 30 min. et 3h, voire au maximum 24h

(Megraud, 1989).

Au laboratoire, nous n’avons qu’a déposé un fragment biopsique à l’aide d’une

anse stérile dans un tube contenant 0,5 ml de milieu urée-indole (annexe).


78

L’incubation se fait à 37°C. La lecture des résultats (virage de l’indicateur vers

le rouge) s’effectue au bout de 20 min et 24 h (Megraud, 1989a; Sobhani et al,

1991; Megraud, 1994b).

I-5-3 Culture et isolement

I-5-3-1 Condition de culture

Helicobacter pylori est une bactérie fragile et microaérophile. La composition

gazeuse idéale pour sa croissance est de 5 % d’O2, 10 % de CO2 et 85% de N2

(Leclerc et al., 1989; Cellini et al., 1994). Il est donc essentiel d’utiliser

un générateur d’atmosphère microaérophile placé dans une jarre d’anaérobiose.

Dans notre présent travail, l’atmosphère microaérophile est obtenue en utilisant

le système de Campy pack (BioMerieux) (Sobhani et al, 1991).

I-5-3-2 Milieux de culture

Helicobacter pylori est une bactérie exigeante sur le plan métabolique

(Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992). Sa culture exige des milieux de

cultures enrichis additionné de sang ou de sérum (Fauchère et Rosenau,

1991; Sobhani et al., 1995).

Pour son isolement, nous avons utilisé un milieu au sang non sélectif à base de

la gélose Columbia (annexe) et un milieu sélectif à base de Wilkins Chalgren

(annexe ) (Megraud, 1994a , 1994b). Ce dernier contient un mélange spécifique

d’antibiotique destiné à inhiber la croissance d’éventuel contaminants (Fauchère

et Rosenau, 1991; Lozniewski, 1996). Le milieu sélectif « la gélose pylo

bioMerieux » prêt à l’emploi et présenté en boites de Petri a également été

utilisé dans certains cas selon sa disponibilité.


79

I-5-3-3 Isolement

La biopsie est broyée dans 1 ml de bouillon cœur- cervelle (BHIB) (annexe) ou

bouillon Brucella (annexe) à l’aide d’un mortier stérile ou d’un disperseur-

homogénéiseur type Ultra-TURRAX (à l’aide d’un micro-pilon) pendant

quelques secondes de manière à libérer les bactéries. Le broyage ne doit pas

durer trop longtemps, sous peine de détruire les bactéries, mais la suspension

doit tout de même être homogène. Ensuite, le broyat est ensemencée sur 2 boites

Pétri contenant respectivement milieu non sélectif la gélose au chocolat et

milieu sélectif le milieu pylori (bioMerieux) ou le milieu à base de Wilkins

Chalgren. Les boites sont incubées aussitôt ensemencées dans une jarre en

atmosphère microaérobie à 37°C pendant 3 à 7 jours, voire 10 jours

(Lamouliatte et al, 1992; Megraud, 1994a, 1994b, 1996a). L’atmosphère est

renouvelée au moins tous les deux jours pour avoir une croissance optimale

(Megraud, 19890; Fauchère et Rosenau, 1991; Megraud, 1994b).

Les primocultures doivent être examinées à partir du 3 ème jour.

Toutefois, certaines cultures dégénèrent rapidement, il convient donc de

démarrer les subcultures des que les colonies sont visibles. La croissance est

plus rapide en subculture (2 à 4 jours).

Il est à signaler que l’on peut conserver le reste du broyat dans un microtube à

congélation et le stocker à – 20 °C pour la PCR.

I-5-3-4 Identification

L’identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques et

biochimiques (Megraud, 1994a; Lamouliatte et al, 1992; Megraud, 1996a).

I-5-3-4-1 Examen macroscopique

L’aspect des colonies et leur dimensions sont étudiées à partir des cultures

bactériennes obtenues sur les milieux de culture (Lamouliatte et al, 1992;

Fauchère et Rosenau, 1991).


80

I-5-3-4-2 Examen microscopique

Il a été effectué sur un frottis bactérien, préparé à partir des colonies suspectes

en cultures pures, puis fixé et coloré par la méthode de Gram (Megraud, 1994b).

I-5-3-4-3 Etat frais

Il consiste à déposer sur une lame, une goutte de la suspension bactérienne,

préalablement préparée, qui sera par la suite recouverte par une lamelle.

La préparation est observée au grossissement (x 40) (Marchal et al., 1991)

I-5-3-4-4 Tests Biochimiques

L’étude des caractères biochimiques est basée essentiellement sur la recherche

de l’oxydase, de la catalase et de l’uréase. Car leurs positivités confirment qu’il

s’agit bien de H. pylori (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et

al., 1992 ; Sobhani et al., 1995).

Les trois tests biochimiques (oxydase, catalase, uréase) s’effectuent sur une lame

porte-objet à partir des colonies suspectes apparues sur les milieux en utilisant

respectivement le disque d’oxydase, eau oxygénée (H2O2) et le milieu

Urée-indole (annexe). La lecture des résultats se fait immédiatement.

Toutes les souches de H. pylori ainsi isolées et identifiées seront

antibiogrammées et conservées à long terme à – 80°C.

I-5-4 Antibiogramme

La sensibilité des souches de H. pylori isolées aux antibiotiques habituellement

utilisés dans la thérapie a été testée par deux techniques, la méthode de disques

en utilisant les antibiotiques suivants : (tétracycline TE, Rivampin RA,

Levofloxacin LVX) et le E-test en utilisant la clarithromycine (CH),

le métronidazole (MZ) et l’amoxicilline (AMX).


81

A partir d’une culture de 48 h sur les milieux d’isolement, une suspension

bactérienne dense contenant (109 CFU/ml) est préparée en bouillon Brucella

(4 ml). Ensuite, le milieu Muller-Hinton additionné de 10% de sang de mouton

(annexe) est ensemencé par inondation de la suspension bactérienne. L’excès de

la suspension est ensuite éliminé en respectant les mesures de sécurité

nécessaires et les boites sont mises à sécher environ 10 mn. Puis, on dépose sur

chaque boite les disques ou les bandelettes E-test correspondants aux

antibiotiques à tester. Après 72 h d’incubation à 37° C en microaérobiose.

La lecture des résultats s’effectue par la mesure des diamètres de zone

d’inhibition autour des disques d’antibiotiques ou par la détermination de

la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) (Amhis et al., 2001).

En cas de E-test, on observe une ellipse d'inhibition. Au point d'intersection

entre la zone d'inhibition et la bandelette, la concentration en antibiotique

correspond à la CMI de la souche étudiée.

Les antibiotiques testés ainsi que leurs valeurs de sensibilité et résistance sont

illustrés dans le tableau 8.

I-5-5 Conservation

La conservation à long terme se fait dans 0.5 ml de milieu glycérol peptonée

(annexe) dans des microtubes. A l’aide d’un écouvillon, on prépare

une suspension bactérienne très riche de la souche de H. pylori dans 0.5 ml de

milieu glycérol peptonée. Les microtubes ou les eppendorfs ainsi préparés sont

conservés dans des boites à congélation dans le congélateur à – 80 °C.


82

Tableau 8 : Valeurs des antibiotiques utilisés (Institut Pasteur)

Antibiotiques E-Test (mg/l) Disque (mm)

Clarithromycine CH ≥ 1 Résistant

0,5 et 1 Intermédiaire

< 0,5 Sensible

Résistant < 17

Sensible ≥ 19

Amoxicilline AMX ≥ 1 Résistant

0,25 et 0,5 Intermédiaire

< 1 Sensible

Résistant < 17

Sensible ≥ 20

Métroridazole MZ > 8 Résistant

≤ 8 Sensible

Résistant < 17

Sensible ≥ 19

Tétracycline TE > 8 Résistant

≤ 4 Sensible

Résistant < 17

Sensible ≥ 19

Levofloxacin LVX > 2 Résistant

≤ 1 Sensible

Résistant < 17

Sensible ≥ 20

Rivampin RA > 16 Résistant

≤ 4 Sensible

Résistant < 14

Sensible ≥ 19


83

I-5-6 Application de la technique PCR en temps réel

La PCR en temps réel sur biopsies gastriques ou sur les colonies permettrait de

façon fiable de détecter à la fois Helicobacter pylori et d’éventuelles mutations

de résistance à la clarithromycine (Raymond et al., 2010).

Effectivement, la mise en évidence de H. pylori à partir des biopsies gastriques a

été confirmée par la technique moléculaire « PCR en temps réel ».

D’autre part, cette technique a été utilisée pour identifier les souches de H.

pylori isolées et détecter d’éventuelle mutation à la clarithromycine.

Cette technique a été pratiquée au niveau de la faculté de Bordeaux (France).

Pour réaliser cette technique, l’ADN bactérien est extrait soit de la culture

bactérienne, soit directement des biopsies gastriques.

La biopsie gastrique doit alors passer par deux étapes importantes: la digestion

et l’extraction de l’ADN.

a- Digestion

La digestion se fait à partir de broyat de la biopsie gastrique congelée à -20°C de

la manière suivante :

Transférer dans un tube conique à bouchon les ¾ de broyat de la biopsie

décongelée. Centrifuger 30 min à 14000 rpm. Enlever le surnageant et traiter le

culot avec le kit Qiagen 180ul de tampon de lyse ATL et 20ul de protéinase K.

Votrexer. Incuber 3h ou Overnight à 56°C, sous agitation dans un appareil

thermomixer compact.

Quant il s’agit d’une culture bactérienne, récupérer les bactéries de H.pylori

cultivées à l’aide d’un écouvillon stérile et les déposer dans un tube de 1.5ml

contenant 1ml d’eau physiologique stérile.

Centrifuger 5 min à 6000 rpm afin de culotter les bactéries. Enlever

le surnageant et traiter le culot avec 180ul de tampon ATL et vortexer.

Ajouter 20ul de protéinase K et vortexer. Incuber 3h ou overnight à 56°C, sous

agitation. Après l’incubation, faire un pulse de centrifugation de 10 secondes.


84

b- Extraction d’ADN

Ajouter 200 ul de tampon AL (DNA stool) et vortexer 15 secondes. Incuber 10

min à 70°C. Faire un pulse de centrifugation de 10 sec.

Ajouter 200 ul d’éthanol absolu au lysat. Vortexer 15. Faire un pulse de

centrifugation.

Marquer la colonne (+bouchon) et la placer dans un tube de 2ml.

Transférer la solution dans la colonne du kit. Centrifuger 1min à 14 000 rpm.

Conserver la colonne et la placer dans un nouveau tube collecteur du kit et jeter

le filtrat.

-Ajouter 500 ul de tampon AW1 sur la colonne et centrifuger 1min à 14000 rpm.

-Conserver la colonne et la mettre dans un nouveau tube collecteur.

-Ajouter 500 ul de tampon AW2 et centrifuger 3min à 14000 rpm.

-Placer la colonne dans un tube de 1.5ml.

-Ajouter 100 ul d’eau chauffée à 70°C. Laisser 5min à température ambiante.

-Centrifuger 2min à 14000 rpm. Récupérer l’ADN dans le tube de 1.5 ml

étiqueté.

c- Technique de la PCR en temps réel

Une fois l’ADN de H. pylori est extrait, nous passons à la réalisation de la

technique PCR en temps réel.

Les différentes étapes de la PCR sont : la dénaturation de l’ADN, l’hybridation

et l’élongation. Ces étapes se font simultanément de la manière suivante :

-Pré-PCR

Préparation du mélange réactionnel qui contient les amorces 23S, les sondes

fluorescentes et l’enzyme polymérase (annexe). Cette opération se fait sous

l’hôte.


85

Pré-PCR- Dépôt

La répartition du mélange préparé dans des capillaires (7.2 µl dans chaque

capillaire) (annexe).

L’addition de 0.8 µl d’ADN (test ou témoin) dans chaque capillaire (annexe)

puis vortexer.

Les capillaires sont ensuite bouchés, placé dans un centrifuge appelé Carousel

puis centrifugé à 3000 rpm pendant 1 mn.

Enfin, Les capillaires sont placés dans un appareil appelé LightCycler, combiné

à un système optique de précision et un ordinateur puis analysés.

d- Expression des résultats

Après validation technique, les résultats sont enregistrés dans la base de données

du système informatique et interprété par un thermocycleur

L’utilisation de l’appareil de PCR quantitative le LightCycler permet de

développer un test où la présence de H. pylori et sa sensibilité à

la clarithromycine peuvent être détectées en 3-4 heures.


86

II- Isolement et caractérisation des lactobacilles

II-1 Provenances des échantillons du lait

Les échantillons de lait cru de chèvre ont été collectés auprès d’une ferme

d’élevage privé localisé dans la région d’Es-Senia à ORAN. Les prélèvements

ont été effectués dans des conditions d’hygiène parfaites. Après lavage du pis de

la chèvre à l’eau savonneuse, rinçage à l’eau javellisée puis séchage avec une

lingette stérile, le lait a été recueilli dans des flacons stériles (100 ml / flacon)

dés les premiers jets puis placés dans une glacière (+ 4°C), ensuite transportés

immédiatement au laboratoire pour analyse microbiologique.

La souche de référence Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449

(LBDB CNRZ) est fourni par l’INRA (France).

II-2 Milieux de culture

Les bactéries lactiques sont relativement exigeantes sur le plan nutritionnel et

ces exigences varient d’une souche à l’autre. Pour la culture des lactobacilles,

nous avons utilisé le milieu de culture MRS acidifié (pH 5,4) liquide ou solide

présentés en annexe.

II-3 Isolement et identification des lactobacilles

II- 3-1 Isolement

Les analyses microbiologiques sont faites après enrichissement des échantillons

du lait par incubation à 30°C et à 45°C, jusqu’à coagulation pour activer la flore

endogène mésophile et thermophile.

L’isolement sélectif des lactobacilles par culture sur MRS gélosé acidifié (pH

5.4) (De Man et al., 1960) a été réalisé selon les méthodes décrites par la

Fédération Internationale du Lait (FIL, 1996). Après dilution décimales (10-1 à

10-9) des échantillons dans une solution de Ringer au ¼ stérile, 100 µl de


87

la dilution est ensemencé en profondeur dans le milieu. Les boites de Petrie sont

ensuite incubées en microaérobiose dans une jarre d’anaérobiose à 30 et à 45°C

pendant 48h pour l'isolement des lactobacilles mésophiles et thermophiles

respectivement.

II-3-2 Identification des lactobacilles

II-3-2-1 Caractérisation morphologique

Des colonies typiques de lactobacilles à savoir leur apparence macroscopique

(aspect de la colonie: forme, taille, couleur, contour) sont prises au hasard, à

partir de boites de MRS contenant entre 30 et 300 colonies et sont ensuite

repiquées dans le bouillon MRS acidifié et incubées à 30+ °C. Après incubation,

les colonies sont réensemencées et purifiées dans du MRS solide. Les souches

seront examinées pour leur coloration de Gram et le test de catalase.

Les bactéries Gram positives et catalase négatives, de forme bacillaire sont

présumées des lactobacilles et seront conservées sur MRS incliné à 4°C pour

une identification ultérieure. La conservation à long terme est effectuée à -20°C

dans du lait écrémé à l’extrait de levure (LEY) supplémenté de 30% de glycérol

(Schillinger et Lucke, 1987; Samelis et al., 1994).

II-3-2-2 Détermination des isolats

Les isolats sont identifiés en genres par des tests préliminaires morphologiques

(macroscopique et microscopique) et physiologiques en se basant sur les tests

décrits par Harrigan et McCance (1976), Sharpe (1979), Kandler et Weiss

(1986), Falsen et al., (1999) et Klein (2001).

Pour une identification au niveau de l’espèce et sous espèces, l’étude du profile

fermentaire des souches s’avère nécessaire.


88

II-3-2-3 Détermination du genre

II-3-2-3-1 Température

Ce test permet de distinguer les bactéries lactiques (lactobacilles) mésophiles

des bactéries lactiques (lactobacilles) thermophiles. Après inoculation de

la souche bactérienne isolée en bouillon MRS, les tubes sont incubés pendant

sept à dix jours à 15 °C et pendant 24 à 48 heures à 45 °C. La croissance

bactérienne est évaluée par une turbidité dans le bouillon MRS.

Les bactéries pouvant croître à 45°C et non pas à 15°C, sont considérées comme

étant des lactobacilles thermophiles, celles ne pouvant pas pousser à 45°C mais

croitre à 15°C sont considérées comme étant des lactobacilles mésophiles

(Bourgeois et Larpent, 1996).

II-3-2-3-2 Type fermentaire

Ce test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné

est transformé, il consiste à mettre en évidence la production du CO2 et de

savoir ainsi le type fermentaire des souches isolées (hétéro ou homolactiques).

L’ensemencement des souches s’effectue dans le bouillon MRSG (Bouillon

MRS +glucose) contenant au préalable une cloche de Durham, suivi par une

incubation à 30°C pendant 24 à 48 h, La production du gaz dans la cloche

indique que la souche est hétérofermentaire, dans le cas contraire elle est

homofermentaire (Harrigan et Mc Cance, 1976).

II-3-2-3-3 Hydrolyse de l’arginine

La recherche de l’arginine dihydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu Moeller,

qui renferme l’arginine, le glucose et un indicateur de pH (pourpre de

Bromocresol) (annexe). L’ensemencement de la suspension bactérienne dans

le milieu est réalisé en anaérobiose en recouvrant la surface du milieu d’huile de

paraffine stérile. Le milieu Moeller sans arginine sert comme témoin.

L’incubation se fait à 37°C pendant 48h. Les lactobacilles fermente le glucose et


89

les milieux s’acidifient provoquant ainsi le virage de l’indicateur au jaune

(réaction négative). Dans le deuxième cas, la production éventuelle de l’enzyme

(ADH) conduit à l’alcalinisation du milieu, ce qui provoque le virage de

l’indicateur du jaune au violet (réaction positive) (Moeller, 1955).

II-3-2-3-4 Utilisation du citrate

L’utilisation du citrate en présence de glucose est étudiée sur milieu KMK

(annexe) (Kempler et Mc Kay, 1980). Ce milieu contient une solution de

ferricyanide de potassium et une solution de citrate ferrique. La présence du

citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique et le potassium

ferricyanide. Après 18 h à 72 h d’incubation, Les colonies qui fermentent

le citrate permettent la réaction entre ces ions il en résulte la formation de

colonies bleues ou ayant un centre bleu (cit+). Les colonies incapables de

fermenter le citrate restent blanches (cit-).

II-3-2-3-5 Hydrolyse de l’esculine

L’hydrolyse de l’esculine a été effectuée selon la méthode de Milliere et al.,

(1989). Elle se traduit par le noircissement du milieu MRS gélosé modifié

contenant 0,5 % d’esculine et 0,05 % de citrate ferrique ammoniacal (annexe).

Après une incubation à 30°C pendant 24 h à 48 h, La lecture se fait, par rapport

à un témoin non ensemencé. Les tubes sont examinés jusqu’a une semaine.

L’hydrolyse de l’esculine libère du glucose et l’esculétine. La fonction phénol

de cette dernière réagit avec les sels de fer donnant une coloration noire dans

le milieu due à la formation d’un complexe métallique.

II-3-2-4 Détermination de l’espèce

Afin de déterminer les espèces, nous avons recours à l’étude du profil

fermentaire des souches isolées. Ce test est basé sur la fermentation des sucres

en utilisant le bouillon MRS (sans le glucose et l’extrait de viande) additionné


90

de 40 mg/l de pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH (MRS-BCP) et

supplémenté de 1% des sucres suivants : arabinose, cellobiose, gluconate,

lactose, mannitol, mélézitose, mélibiose, raffinose, rhamnose, ribose, sucrose,

tréhalose, sorbitol, xylose (Samelis et al., 1994).

La culture bactérienne de 18 heures de la souche à tester est centrifugée à 4000

tr/mn pendant 10 min. Le culot ainsi récupéré est additionné de 2 ml de tampon

phosphate puis recentrifugé aux mêmes conditions pour obtenir un culot

cellulaire, qui est ensuite additionné au milieu MRS-BCP. Les conditions

d’anaérobiose sont assurées par l’addition d’une couche mince d’huile de

paraffine stérile à la surface du milieu de culture.

La fermentation des sucres est appréciée après 24 à 48h d’incubation à 30°C par

le virage du milieu du pourpre au jaune au jaune.

II-3-2-4-1 Identification des espèces en utilisant le système API 50 CHL

Les profils biochimiques ont également été étudiés en utilisant le système API

50 CHL (Ref 50410, BioMérieux, France).

API 50 CHL est un système standardisé associant 50 tests biochimiques

permettant l’étude du métabolisme des hydrates de carbone des lactobacilles.

La galerie est formée de 50 microtubes, permettant l’étude de la fermentation

des substrats correspondant à la famille des glucides et leurs dérivés

(hétérosides, polyalcools, acides uroniques). Le premier tube sans principe actif

sert de témoin négatif. La fermentation des 49 sucres se traduit par un virage de

la couleur du milieu au jaune.

L’utilisation de cette galerie API 50 CHL consiste à la préparation de

l’inoculum, la préparation et l’inoculation des galeries puis l’incubation à 30 C°.


91

a- Préparation de l’inoculum

Le culot obtenu de la culture bactérienne de 18 h (expliqué précédemment) est

suspendu dans 1 ml d’eau physiologique stérile. Un nombre de gouttes (n) de

cette suspension est introduit dans 5 ml d’eau physiologique stérile de façon à

obtenir une opacité de 2 sur l’échelle de Mc Farland. On prélève alors à l’aide

d’une pipette Pasteur 2n gouttes de la suspension initiale (1ml) dans 10 ml de

milieu API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux).

b- Préparation des galeries

10 ml d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond de la boîte de

la galerie formée de 5 bandes comprenant chacune 10 tubes numérotés (0-9, 10-

19, 20-29, 30-39, 40-49). La galerie est inoculée par la suspension bactérienne à

l’aide d’une pipette Pasteur. Les cupules sont remplies avec de l’huile de

paraffine stérile, puis, la galerie est incubée à 30 C°.

c- Lecture et interprétation

La lecture des résultats des galeries est réalisée après 24 et 48 h en les

comparant aux profiles standards en utilisant le logiciel PIBWIN. La

fermentation des sucres se traduit par le virage de l’indicateur du pH au jaune.

II-3-3 Conservation des souches :

La conservation des souches des lactobacilles est faite à court et à long terme.

La conservation à court terme est effectuée sur milieu MRS incliné à +4°C et

leur renouvellement se fait par repiquage toute les 4 semaines.

Par ailleurs, La conservation à long terme des souches est réalisée à -20°C ou à -

80°C dans une solution contenant 70% de lait écrémé (enrichie par 0.5g/l

d'extrait de levure et 0.5g/l de glucose) et 30% de glycérol (Samelis et al., 1994).

A partir d’une culture jeune (18-24h) sur bouillon MRS, les cellules sont

récupérées par centrifugation à 4000 t / min pendant 10 min, ensuite le milieu de


92

conservation est rajouté sur le culot obtenu. Avant leur utilisation, les bactéries

sont revivifiées par une ou deux subcultures dans des bouillons MRS à 30 °C

pendant 18 à 24 h.

III- Mise en évidence des inhibitions des lactobacilles et H. pylori

La mise en évidence d’éventuel antagonisme, existant entre les lactobacilles vis

à vis de H. pylori est réalisée selon deux méthodes directes et indirectes.

Les souches de lactobacilles isolées du lait de chèvre ainsi que la souche de

référence Lb. delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449 (LBDB CNRZ) ont été

testées pour leur activité antimicrobienne vis à vis des souches pathogènes de

H. pylori isolés des biopsies gastriques ainsi que et les souches de références H.

pylori J99 (HP4) et H.pylori 26695 (HP5).

La culture des souches de lactobacilles est faite sur milieu MRS acidifié

(annexe) alors que la culture des souches de H. pylori est préparée dans le milieu

cœur cervelle que ce soit liquide (bouillon BHIB) (annexe) additionné de 10%

sérum de cheval ou solide BHI-agar (annexe) (Sgouras et al., 2004).

III-1 Méthode directe

L’inhibition de la croissance de H. pylori par les lactobacilles est déterminée

suivant la méthode décrite par Geis et al. (1983), qui consiste à ensemencer

les souches de lactobacilles testées (culture de 16 h) (supposées être inhibitrices)

en touches (5µl) sur milieu MRS gélosé. Après séchage à température ambiante,

les boites de Pétri ainsi ensemencées sont incubées pendant 18h à 37°C en

microaérobiose. Ensuite, les souches pathogènes de H. pylori (indicatrices) sont

ensemencées en masse en couvrant la culture des lactobacilles avec 7 ml de la

gélose cœur cervelle BHI-agar molle (0,7 % agar) préalablement ensemencé par

0.1 ml d’une culture jeune de la souche de H. pylori (10 7 ufc.ml-1) .

Après solidification du milieu, les boites de Pétri sont réincubées en

microaérobiose (sachet Campy pak) pendant 72 h à 37°C. L’inhibition se


93

révèlera par la présence d’un halo clair autour des souches ensemencées en

touche. La lecture des résultats est faite par la mesure du diamètre des zones

d’inhibitions apparues autour des colonies exprimées en mm (ayant un diamètre

égale ou supérieure à 2 mm sont considérées comme positive) (Gonzalez et al.,

2007; Pulsani et al., 1979).

III-2 Méthode indirecte

L’inhibition de la croissance de H. pylori par le surnageant des lactobacilles a

été testée par la méthode dite la méthode de puits, décrite par Wendakoon et al.

(1998), qui permet de mettre en contacte le surnageant de la souche lactique

productrice de substance antimicrobienne avec la souche test (H. pylori).

Le choix des souches indicatrices et inhibitrices est basé sur les résultats du test

de la mise en évidence des inhibitions en milieu solide par la méthode directe.

Les souches de lactobacilles testées sont cultivées dans le bouillon MRS et

incubées à 30°C pendant 18h. Après incubation, le milieu est centrifugé (4000

tr/mn pendant 10 min) à 4 °C. Le surnageant est récupéré, puis filtré avec des

filtres Millipore 0,45µm. Dans une boite de Pétri contenant le milieu gélosé

BHI-agar et préalablement ensemencé en masse par la suspension bactérienne de

la souche test de H. pylori (108 cfu /ml), des puits sont réalisés à l’aide d’une

cloche de Durham stérile, remplis par la suite avec 70 µl du surnageant de

la souche lactique. Les boites de Pétri ainsi préparées sont pré-incubées pendant

2 à 4 heures à + 4 °C, afin de permettre la diffusion radiale de l’agent inhibiteur

(Simova et al., 2008 ; Allouche et al., 2010), suivit par une incubation à 37°C

pendant 72 h en microaérobiose (sachet de Campy pak). La lecture de l’activité

inhibitrice se fait par la mesure du diamètre des zones d’inhibitions apparues

autour des puits.

Le milieu MRS est utilisé comme témoin négatif. L’amoxicilline (1mg/ml) est

utilisé comme témoin positif.


94

III-3 Détermination de la nature de l’agent inhibiteur.

Les lactobacilles sont connus par leur capacité à produire des substances

antibactériennes particulièrement l’acide lactique et les bactériocines.

Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite, Un certain

nombre de tests doit donc être réalisé pour les souches bactériennes lactiques

présentant les plus grands halos d’inhibition.

La recherche de la nature de l’agent inhibiteur a été réalisée en milieu solide en

se basant sur l’élimination d’un constituant au profit de l’autre par la méthode

indirecte des puits expliqué précédemment. La lecture des résultats consiste à

mesurer le diamètre des halos d’inhibition apparue autour des puits.

III-3-1 Inhibition due au peroxyde d’hydrogène

Certaines bactéries lactiques produisent du peroxyde d’hydrogène (H2O

2) au

cours de leur métabolisme, qui est considéré comme un inhibiteur de

la croissance bactérienne. Cet agent peut être dégradé par la catalase, présente

chez certaines bactéries (Cogan et al., 1981 ; Juillard et al., 1987).

Pour détecter l’effet éventuel du peroxyde d’hydrogène sur l’inhibition de H.

pylori, les surnageants de Lactobacillus sp. obtenus sont traités par 1mg/ml de

catalase (Sigma) (0.2 M tampon phosphate, pH 6.5), filtrés, puis incubée à 37°C

pendant 2 heure. Le filtrat est ensuite testé sur H. pylori par la méthode des

puits. Les filtrats non traités à la catalase ont été utilisés comme témoin (Simova

et al., 2008).

III- 3-2 Inhibition due à l’acide lactique

L’acide lactique produit par les bactéries lactiques est un facteur majeur dans

les inhibitions bactériennes. Ce test a pour but d’étudier l’effet de l’abaissement

du pH sur le développement des souches indicatrices (H. pylori). Cette méthode

a été réalisée en neutralisant le surnageant des lactobacilles par la soude NaOH

1N de façon à obtenir un pH de 6,5. Le surnageant est ensuite filtré, puis testé

vis-à-vis des souches de H. pylori par la méthode de puits (Noonpakdee et

al., 2009 ; Allouche et al., 2010).


95

III-3-3 Inhibition due aux bactériophages

Les phages peuvent être l'origine des inhibitions de la croissance bactérienne.

Pour détecter une éventuelle activité inhibitrice due à la présence de

bactériophages virulents, une portion de la gélose prise dans la zone d'inhibition

est découpée avec une pipette Pasteur, puis suspendu dans 1 ml du bouillon

MRS contenant 20 µl de chloroforme. Après agitation, on laisse décanter 5 min,

puis 0,5 ml du milieu est prélevé, ensuite centrifugé à 6000 trs/mn (pour

éliminer les débris cellulaires ou la gélose). 300 µl de surnageant est ajouté à

7 ml de gélose molle de BHI-agar contenant la souche indicatrice (H. pylori).

Le mélange est coulé dans une boite de Pétri puis incubé à 48 h à 37°C sous les

conditions de la microaérobiose. La présence de plages de lyse indique

la présence de phages (Lewis et al., 1991).

III- 3-4 Inhibition due aux bactériocines

La recherche des bactériocines comme étant substance inhibitrice nécessitent

la détermination de la nature protéique de ces substances éventuellement

élaborées par les lactobacilles. La sensibilité aux enzymes protéolytiques est un

critère principal dans leur caractérisation.

Pour ce faire, nous avons utilisé les enzymes protéolytiques suivantes: la pepsine

(Sigma), l’alpha-chymotrypsine (Sigma ) et la trypsine (Sigma). Chaque enzyme

est dissoute dans du tampon phosphate (0,2 M/L, pH 7.0) et stérilisée par

filtration sur filtre millipore de 0,45 µm. Ainsi, 200 ul de filtrat obtenu des

lactobacilles est traité par 20 ul d’enzyme à une concentration finale de 1 mg/ml,

puis incubé à 37°C pendant 2 heure (Coventry et al., 1997 ; Noonpakdee et

al., 2003, Ten brink et al., 1994).. L’action de ce filtrat est testée par la méthode

des puits sur le milieu BHI-agar préalablement ensemencé par H. pylori et

incubé à 37°C pour 48 h à 72h en microaérobiose (sachet Campy pak).


96

III-3-5 Effet de la température

Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à

la température et la conservation de leur activité vis-à-vis de H. pylori après

le traitement thermique. Les filtrats de culture des souches lactiques sont traités

par différentes températures à 100°C pendant 10 mn et 120°C pendant 20 mn,

Après refroidissement, l’activité des filtrats est vérifiée vis-à-vis de H. pylori

par la méthode des puits. Des filtrats non traités sont utilisés comme contrôle

(Casla et al., 1996 ; Coventry et al., 1997, Noonpakdee et al., 2003).

La levée de l’inhibition désigne la sensibilité de l’agent inhibiteur au traitement

thermique effectué.

III-4 Mesure de l’acidité titrable

L’évaluation de l’acidité produite par les souches de lactobacilles sélectionnées

pour leur pouvoir inhibiteur élevé est réalisée par titrimétrie et pH-métrie.

Le pH est mesuré à l’aide d’un pH mètre type Orion Research à électrode

combinée. Le titrage de l’acidité est effectué selon la méthode Dornic, à l'aide

d'une solution de soude NaOH à N/9 et de phénolphtaléine en solution

alcoolique à 1% employée comme indicateur. Les souches de lactobacille sont

ensemencées dans 10ml de lait écrémé stérile (10% p/v). Après incubation à

30°C pendant 24 h, 1% d’inoculum est transvasé stérilement dans des tubes

contenant 10 ml de lait écrémé stérile. La cinétique d’acidification et du pH sont

réalisées simultanément aux intervalles de temps réguliers suivants : 0h, 1h, 2,

3h, 4h, 5h, 6h, 7h et 24h.

III-4-1 Dosage de l’acidité

On prélève 10 ml de lait en le transférant dans une fiole conique de100 ml.

On y ajoute cinq gouttes de phénolphtaléine et on verse la soude goutte à goutte

jusqu'à obtenir une couleur rose pale persistante. On note alors le volume de

la soude en ml utilisé en dixièmes de millilitres, correspondant au degré Dornic.


97

(Acidité en degré Dornic = n x 10) c'est-à-dire 1 °D correspond à 0,1 g d’acide

lactique par litre de lait (0,1 g/l) n est le volume de la solution sodique utilisée

pour titrer 10 ml de lait (Guiraud, 1998).

III-5 Mise en évidence des inhibitions en milieu liquide

Ce test permet d’étudier le comportement des souches indicatrices (H. pylori)

en présence de filtrat de la souche lactique inhibitrice (lactobacille) en milieu

liquide, et de déterminer également l’effet inhibiteur de l’acide lactique sur

la croissance de H. pylori.

Dans cette partie expérimentale, nous nous sommes basés sur les résultats

obtenus par les tests de la mise en évidence des inhibitions en milieu solide,

c'est-à-dire que nous avons retenus dans les cas où l’inhibition a été nettement

observée en milieu solide raison pour laquelle la souche Lb. rhamnosus (LBR1)

a été sélectionnée et testée vis-à-vis de la souche H. pylori1 (HP1) et H. pylori2

(HP2).

En premier temps, la culture de H. pylori suspendue dans le bouillon BHIB est

ensemencée avec un volume de 50% de filtrat de Lb. rhamnosus à son pH

native (4.5) (Sgouras et al., 2004), et en deuxième temps, la croissance de H.

pylori est suivie en présence de l’acide lactique (60 mM) dans le tampon

phosphate (PBS) à un pH 3.5 (Midolo et al., 1995 ; Tsai et al., 2004).

Les cultures de H. pylori en milieu BHIB ont été utilisées comme contrôle.

Après incubation à 37°C sous les conditions de la microaérobiose, la viabilité de

H. pylori est évaluée toute les 12 heures pendant 72h par la détermination des

cellules viables de H. pylori (CFU) sur le milieu BHI-agar (Sgouras et al.,

2004).


98

III-6 Effet inhibiteur des lactobacilles sur les bactéries pathogènes

Les souches lactiques sont également testées pour leur pouvoir inhibiteur à

l’égard de certaines bactéries pathogènes, permettant ainsi de déterminer leur

spectre d’activité en utilisant la méthode directe précédemment expliquée (Geis

et al., 1983). En effet, nous avons testé l’effet inhibiteur des Lactobacillus sp.

sélectionnés vis-à-vis des bactéries Gram positive et Gram négative, qui sont

représentées dans les espèces suivantes : Staphylococcus aureus (ATCC 25923),

Escherichia coli ATCC 25921, Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785,

Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, provenant du laboratoire médical

du CHU Oran et Bacillus subtilis obtenu du laboratoire de recherche Mascara.

Pour cette étude, nous avons suivi les mêmes étapes que celles utilisées dans

le cas de la mise en évidence des inhibitions entre les lactobacilles et H. pylori,

sauf que les souches pathogènes sont incubées en aérobiose à 37°C pendant 24h.

L’inhibition se traduit par la formation d’une zone autour de la souche de

lactobacille ensemencée en touche (considérée inhibitrice), témoignant

la présence d’une activité antagoniste vis-à-vis des bactéries pathogènes testées

(considérées indicatrices). La lecture des résultats consiste à mesurer le diamètre

de la zone d’inhibition apparue autour de la colonie de lactobacille.

Résultats

98

I-Mise en évidence de H.pylori

La démonstration du rôle pathogène de H.pylori dans les maladies

gastroduodénales rend la recherche de cette bactérie nécessaire (Bruley des

Varannes, 1996). Cette recherche a été réalisée par des tests invasifs, en

identifiant la bactérie par un examen anotomopathologique, un examen

cytologique et une culture, en exploitant sa production importante de l’uréase

par un test rapide à l’urée , ou par la tecchnique moléculaire PCR en temps réel

(Lozniewski, 1996; Megraud, 1996a).

I-1 Examen cytologique

La coloration de Gram du frottis gastrique montre la présence des formes de

bacilles souvent incurvées ou spiralées. Elles apparaissent Gram négatif et ont

tendance à se trouver nombreuses dans certaines zones du frottis (fig. 31).

I-2 Test rapide à l’urée

La recherche, directement au niveau de la biopsie, d’une activité uréasique

rapide et intense est un argument majeur en faveur de la présence de H. pylori.

Le test a l’urée, réalisé à partir de la biopsie gastrique, utilisant le milieu urée-

indole donne une réaction positive qui est traduite par un virage de l’indicateur

du pH vers le rose (fig. 32). Le virage survient le plus souvent au moins de 20

minutes.

Pour le CLO test, il se révèle positif par virage de l’indicateur de sa couleur

jaune initiale a une couleur rouge (fig. 33). Le changement de la couleur du

milieu est dû à l’alcalinisation du milieu par la transformation de l’urée en

ammoniac sous l’influence de l’uréase.

Le test à l’urée donne parfois une réaction négative car le nombre de bactéries

est trop faible dans le fragment biopsique (il faut un nombre supérieur a 105

dans la biopsie pour faire virer l’indicateur).

Résultats

99

Fig. 31: Observation microscopique d’une empreinte biopsique après coloration de Gram (x 1000)

Fig. 32: Test rapide à l’uréase

Fig. 33: Test rapide à l’urée en utilisant le CLO test

1 2

H. pylori

Résultats

100

I-3 Examen anatomopathologique

L’observation microscopique des coupes histologiques des biopsies gastriques

par l’anatomopathologiste , a montré la présence de bacilles incurvés ou en S

dans les cryptes et à la surface de la muqueuse gastrique. Cette observation

renseigne également sur l’état de la muqueuse gastrique (fig. 34).

I-4 Isolement et identification

L’isolement de H. pylori à partir des biopsies gastriques a permis d’obtenir des

colonies. Leur identification est basée sur la détermination des caractères

morphologiques (macroscopique et microscopique) et biochimiques.

I-4-1 Aspect macroscopique

La culture de la biopsie gastrique sur les milieux d’isolement a révélé

l’apparition de petites colonies, de 1 mm de diamètre. Elles sont grisâtres ou

transparentes, luisantes, discrètement bombées, rondes et de contour régulier

(fig. 35, 36,37). Cet aspect est rencontré chez H. pylori.

I-4-2 Aspect microscopique

La coloration de Gram, réalisée a partir des colonies apparues, montre

la présence de bactéries Gram négatif. Elles se présentent sous la forme de

bacille qui peut être droit, incurvé, en virgule, en forme de C, de V ou de S, aux

contours réguliers (fig. 38). Cette morphologie est différente de celle observée

sur le frottis de la biopsie. Les bactéries apparaissent plus grosses et moins

spiralées. Les bactéries évoluent rapidement au cours des repiquages vers des

formes d’aspect coccoïde .

Résultats

101

Fig. 34 : Examen anatomopathologique de la biopsie gastrique (x 1000)

Fig. 35 : Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu pylori

H. pylori

Colonies H. pylori

Résultats

102

Fig. 36: Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu au sang non sélectif

Fig. 37 : Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu au sang après purification

colonies H. pylori

contaminant

Résultats

103

Fig. 38 : Observation microscopique de H.pylori après coloration

de Gram (x 1000)

Résultats

104

I-4-3 Etat frais

Les bactéries examinées à l’état frais apparaissent très mobiles par des

mouvements spiralés et de rotation.

I-4-4 Etude biochimique

L’identification est complétée par la recherche des caractères biochimiques

(catalase, oxydase et uréase). Nous avons noté la présence d’une oxydase, d’une

catalase et d’une uréase très puissantes (fortement positive). Les résultats sont

représentés dans le tableau 9. La positivité de ces trois tests confirme qu’il s’agit

bien de H. pylori. Sur la base des résultats obtenus, nous avons pu isoler et

identifier trois souches de H. pylori (Hp1, Hp2, Hp3).

Tableau 9 : Caractérisation biochimique des différentes souches de H.pylori isolées des biopsies gastriques (Hp1, Hp2, Hp3)

Souches Uréase Catalase Oxydase

Hp1

Hp2

Hp3

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Résultats

105

I-5 Antibiogramme

L’étude de la sensibilité des souches de H.pylori testés aux antibiotiques

habituellement utilisés dans le choix thérapeutique, par la technique du E-test et

la méthode de diffusion (disque) a montré l’excellente activité de la plupart des

antibiotiques utilisés vis-à-vis de H. pylori.

En effet, toute les souches de H.pylori (HP1, HP2, HP3) sont sensible à

la clarithromycine (fig. 39) et l’amoxicilline (fig. 40) dont la concentration

Minimale Inhibitrice CMI est inférieure à 0.5 mg/et 1 mg/l respectivement,

De même, les souches testées ont montré une sensibilité à la tétracyline, à

la rifampicine et levofloxacine dont le diamètre de la zone d’inhibition est

supérieur ou égale à 19 mm (fig. 42). La résistance à la levofloxacine n’a été

observée que chez la souche HP1 (DI inférieur à 17 mm).

Toutefois, les souches de H. pylori (HP1, HP3) ont montré une résistance

remarquable au métronidazole ou la CMI est supérieur à 8mg/l alors que

la souche HP2 est sensible à l’antibiotique (fig. 41).

Les résultats cités sont illustrés dans les tableaux 10 et 11

Résultats

106

Fig. 39: Sensibilité de H. pylori à la clarithromycine

Fig. 40: Sensibilité de H. pylori à l’amoxicilline

Résultats

107

Fig. 41: Sensibilité de H. pylori au métronidazole

Fig. 42: Sensibilité de H. pylori à la Tétracycline, Rivampin et Levofloxacin par la méthode de diffusion

2

1

3

1 : Tétracycline 2 : Rivampin 3 : Levofloxacin

Résultats

108

Tableau 10: Détermination de la CMI (E-test), et du diamètre de la zone d’inhibition (méthode de disques) des souches de H. pylori

Tableau 11: Sensibilité et résistance des souches de H. pylori vis à vis des antibiotiques

S : sensible; R : resistant

Souches

Antibiotiques

Abréviation HP1 HP2 HP3

Clarithromycine (mg/l) CH 0,016 0,19 0,023

Amoxicilline (mg/l) AMX 0,25 0,125 0,047

Metronidazole (mg/l) MZ 32 4 64

Tétracycline (mm) TE 38 46 32

Rivampin (mm) RA 22 26 32

Levofloxacin(mm) LVX 06 26 32

Souches

Antibiotiques

Abréviation HP1 HP2 HP3

Clarithromycine (mg/l) CH S S S

Amoxicilline (mg/l) AMX S S S

Metronidazole (mg/l) MZ R S R

Tétracycline (mm) TE S S S

Rivampin (mm) RA S S S

Levofloxacin(mm) LVX R S S

Résultats

109

I-6 Mise en évidence de H. pylori par la PCR en temps réel

La technique moléculaire de la PCR en temps réel permet de façon fiable de

détecter à la fois H. pylori et d’éventuelle mutation de résistance à

la clarithromycine à partir des biopsies gastriques ou de la colonie (PCR-

colonie). Le système de la PCR en temps réel est basé sur l’émission de

la fluorescence à partir des sondes (marqueur) fluorescentes spécifiques.

Des thermocycleurs particulier sont nécessaires pour la lecture continue de

la fluorescence émise.

Les résultats obtenus de la détection de H. pylori par ce type de PCR sont

représentés graphiquement sous formes de courbes. Chaque courbe correspond à

un échantillon. La lecture de la PCR en temps réel correspond à la variation de

la fluorescence en fonction de la température. Cette température appelée

température de fusion (Tm) est représenté par un pic unique sur la dérivé.

Les courbes de fusion obtenues sont comparées par celles du témoin négatif

(absence d’ADN) et des témoins positifs comprenant ADN sauvage, ADN muté

en position A21422C (dite position C) et ADN muté en position A2412/2143G

(dite position G) qui correspond à la résistance à la clarithromycine (fig. 43).

En effet, les souches isolées de H. pylori (HP1, HP2, HP3), traitées par

la technique de la PCR en temps réel ont révélé une conformité à l’Helicobacter

pylori (ADN positif) où la température de fusion (Tm) correspond à celle

d’ADN sauvage (témoin positif) (fig. 44). Il s’agit donc de souche de H. pylori

dite sauvage. Ces souches de H. pylori testées ne présentent donc aucune

mutation de résistance à la clarithromycine (position G), ni mutation en position

C. Alors que la souche de référence possède un ADN muté resistant à la

clarithromycine (séquence d’ADN muté en position A2412/2143G ou dite en

position G) où la Tm est moins faible par rapport à celle de l’ADN sauvage (fig.

44)

Résultats

110

. Témoin négatif (T. NEG) G (sequence mutée en position A 2412/2143G) C (sequence mutée en position 2142C) WT (séquence d’ADN sauvage)

Fig. 43 : Témoins (négatif et positifs) utilisés dans la PCR en temps réel

Résultats

111

souche de reference muté en position G (resistance à la clarithromycine) souche HP1 sauvage (WT) : souche HP2 sauvage (WT) souche HP3 sauvage (WT) Fig. 44 : Cas positif de la PCR à partir des culture de H. pylori testés et la souche

de référence

Résultats

112

Quant aux échantillons des biopsies gastriques (cinq choisis), ayant montré

une absence de H. pylori par la culture, la PCR en temps réel a également révélé

l’absence de H. pylori dans les trois biopsies gastriques (fig. 45), conformémant

au résultats de la culture (négatif).

Tandis que cette technique moléculaire a detecté la presence des souches

de H. pylori dite sauvage (ADN positif sauvage) dans les deux autres biopsies

gastriques testées ayant montré une negativité de H. pylori par la culture

(fig. 46).

On peut donc constater que la culture peut parfois donner des resultats

faussenent négatif en raison de sa extreme sensibilité et que la PCR reste

la technique la plus fiable pour la mise en evidence de H. pylori à partir

des biopsies gastriques.

Résultats

113

Fig. 45: Cas négatif de la PCR des 3 biopsies gastriques

Résultats

114

biopsie 4 (HP sauvage WT) biopsie 5 (HP sauvage WT)

Fig. 46 : Cas positif de la PCR à partir de deux biopsies gastriques

Résultats

115

II Isolement et identification des lactobacilles

L’isolement des lactobacilles à partir du lait cru de chèvre nous a permis d’isoler

42 souches de lactobacilles. Ces isolats ont été identifiés au stade du genre et

espèce voire sous espèce dans certains cas en se basant sur leur morphologie

cellulaire, et leur caractères biochimiques et physiologiques (tableau12).

En effet, nous avons procédé en premier lieu à une pré-identification des

colonies apparues sur le milieu MRS sur la base de leur caractère macrospique,

microscopique, ainsi que le test de la catalase.

Tous les isolats Gram positif, de forme bacillaire, ne possédant pas de catalase

sont retenues et présumées de lactobacilles.

II.1 Examen morphologique

L’étude macroscopique des cultures permet de décrire l'aspect des colonies

obtenues sur milieu MRS (forme, taille, couleur) et de retrouver les critères

relatifs aux colonies de lactobacilles. Ces dernières sont de petite taille d'environ

1mm de diamètre, de couleur blanchâtre à crémeuse, de forme circulaire et

régulière avec une surface lisse (Fig. 47).

L’observation microscopique après la coloration de Gram révèle la présence de

bactéries Gram positive, de forme bacillaire, plus ou moins longue, isolées, en

paires, ou en chaînettes typiques des lactobacilles (Fig. 48).

II.2 Caractères physiologiques et biochimiques

Les résultats des tests physiologiques et biochimiques permettent de classer

les isolats dans le genre de lactobacille.

Résultats

116

Tableau 12: Code des espèces de lactobacilles isolées à partir du lait de chèvre

Code des

espèces

Nom des espèces

LBDB

LBDL

LBH

LBS

LBP

LBR

LBCC

LBCR

LBPP

LBPS

LBB

LBF

Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus

Lactobacillus delbrueckii sp. lactis

Lactobacillus helveticus

Lactobacillus salivarius

Lactobacillus plantarum

Lactobacillus rhamnosus

Lactobacillus casei sp. casei

Lactobacillus casei sp. rhamnosus

Lactobacillus paracasei sp. paracasei

Lactobacillus pentosus

Lactobacillus brevis

Lactobacillus fermentum

Résultats

117

Fig. 47: Aspect macroscopique des colonies de lactobacilles sur milieu MRS

Fig. 48 : Aspects microscopiques des lactobacilles après coloration de Gram (x 1000)

Résultats

118

Le premier test biochimique effectué chez les lactobacilles permettant son

appartenance au groupe de bactéries lactiques est celui de la catalase.

Tous les isolats de lactobacilles sont dépourvus de catalase, caractère connu

chez les bactéries lactiques mais ils peuvent produire une pseudocatalase quand

le milieu contient une concentration élevée de glucose (Carr et al., 2002).

Le test du type fermentaire nous a également permis de différencier les souches

homofermentaires des souches hétérofermentaires. Or, nous avons pu isoler 06

lactobacilles hétérofermentaires et 36 lactobacilles homofermentaires.

La présence de gaz dans la cloche de Durham indique un métabolisme

hétérofermentaire, alors que le test de croissance à différentes températures a

classé les souches de lactobacilles isolées en bactéries thermophiles pouvant

croître à 45°C et non pas à 15°C, et des bactéries mésophiles ne pouvant pas

pousser à 45°C mais croitre à 15°C.

De plus, l’hydrolyse de l’arginine est un caractère connu chez les lactobacilles.

Certaines espèces de Lactobacillus sp. possèdent l’enzyme arginine dihydrolase

(ADH) qui en dégradant l’arginine produisent l’ammoniac (Hugenholtz

et al., 1993, Mannu et al., 2000).

D’autre part, l’hydrolyse de l’esculine par les lactobacilles se traduit par

le noircissement du milieu gélosé à l’esculine, indiquant la libération de

l’esculétine.

Le métabolisme du citrate, sucre fermentescible par les lactobacilles est en

relation étroite avec l’activité aromatique. La détection de cette propriété sur

milieu KMK (Kemper et Mckay., 1980) a montré la capacité de certaines

souches de Lactobacillus sp. à utiliser le citrate (fig. 49).

La figure 50 rassemble certains tests biochimiques préliminaires pour

l’identification des lactobacilles.

Résultats

119

Citrate -

Citrate +

1 : Lb. helveticus; 2 : Lb. brevis; 3 : Lb. plantarum; 4: Lb. rhamnosus

Fig. 49: Utilisation du citrate sur milieu Kempler et Mc Kay (KMK)

A

B

1

2 4

3

Fig. 50: tests biochimiques préliminaires des lactobacilles (type fermentaire, test ADH, test esculine) A : lactobacilles hétérofermentaire (Lb. brevis) B : lactobacilles homofermentaire (Lb. plantarum)

2 2 2 1 1 2 1

2 1 2 1 2 1

1 : témoin

2 : test

1 : témoin

2 : test

Résultats

120

Sur la base de différentes températures de croissance, de l’hydrolyse de

l’arginine et du type fermentaire, les lactobacilles isolés sont classés selon

Carr et al. (2002) en trois groupes (I, II et III) qui représentent respectivement

les bactéries homofermentaires thermophiles, homofermentaires mésophiles et

hétérofermentaires mésophiles. Ces dernières font partie du groupe

Betabacterium, les homofermentaires thermophiles celui de Thermobacterium

alors que le groupe Streptobacterium renferme les homofermentaires mésophiles

(Tableau. 13). Or, nous avons révélé la prédominance des lactobacilles du

groupe II (19 souches) ayant un taux de 45.23% parmi les lactobacilles isolées

suivi par les lactobacilles du groupe I (17 souches) avec un taux de 40.47 %, et

enfin les lactobacilles du groupe III (6 souches) avec un taux de 14.28 %

(fig. 51).

L’emploi des tests cités ci-dessus nous a permis de faire une préidentification

des lactobacilles, qui sont ensuite identifiés au stade de l’espèce par l’étude de

leur profil fermentaire en utilisant 14 sucres (tableau 14). Cette identification est

faite en confrontant les profils obtenus des isolats avec ceux des souches de

référence trouvés dans la clé d'identification de Bergey (Lopez et Mayo, 1994;

Mathara et al., 2004; Lee et al., 2006).

La détermination des propriétés fermentaires a été confirmée par l’emploi de

la galerie API 50 CHL notamment chez les souches de lactobacilles (tableau 15)

(fig. 52) sélectionnés pour leur activité antimicrobienne vis-à-vis de

H. pylori comme on le verra ultérieurement.

Résultats

121

Souches Co2 du glucose

15°C 45 °C Hydrolyse Arginine

Hydrolyse esculine

Hydrolyse citrate

Pré-identification

LBDB1 - - + - - - Lactobacillus (groupe I) LBDB2 - - + - - - LBDB3 - - + - - - LBDB4 - - + - - - LBDB5 - - + - - - THERMOBACTERIUM LBDB6 - - + - - - LBDB7 - - + - - - LBDL1 - - + - + - LBDL2 - - + - + - LBDL3 - - + + + - LBDL4 - - + - + - LBH1 - - + - - - LBH2 - - + - - - LBH3 - - + - - - LBH4 - - + - - - LBS1 - - + - - - LBS2 - - + - + - LBP1 - + - - + + LBP2 - + - - + + LBP3 - + - - + + Lactobacillus (groupe II) LBP4 - + + - + + LBP5 - + - - + + LBR1 - + + - + + STREPTOBACTERIUM LBR2 - + + - + + LBR3 - + + - + +

LBCC1 - + - - + - LBCC2 - + - - + - LBCC3 - + - - + - LBCC4 - + - - + - LBCR1 - + + - + - LBCR2 - + + - + - LBCR3 - + + - + - LBPP1 - + - - + - LBPP2 - + + - + - LBPS1 - + - - - - LBPS2 - + - - - -

LBB1 + + - + + + Lactobacillus (groupe III) LBB2 + + - + - + LBB3 + + - + + + LBB4 + + - + - + BETABACTERIUM LBF1 + + + + - - LBF2 + + + + - -

Tableau 13 : Caractéristiques des lactobacilles isolées

Résultats

122

Résultats

123

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

LBDB1 - - - + - - - - - + - - - - LBDB2 - - - + - - - - - + - - - - LBDB3 - - - + - - - - - + - - - - LBDB4 - - - + - - - - - + - - - - LBDB5 - - - + - - - - - + - - - - LBDB6 - - - + - - - - - + - - - - LBDB7 - - - + - - - - - + - - - - LBDL1 - - - + - - - - - - + + - - LBDL2 - + - + - - - - - - + + - - LBDL3 - - - + - - - - - - + + - - LBDL4 - - - + - - - - - - + + - - LBH1 - - - + - - - - - - - - - - LBH2 - - - + - - - - - - - + - - LBH3 - - - + - - - - - - - + - - LBH4 - - - + - - - - - - - + - - LBS1 - - - + + + + + - - + + + - LBS2 - - - + + - + + - - + + + - LBP1 - + + + + + + + - + + + + - LBP2 - + + - + + + + - + + + + - LBP3 - + + + + + + + - + + + + - LBP4 - + + + + + + + - + + + + - LBP5 - + + - + + + + - + + + + - LBR1 - + + + + - + - + + + + + - LBR2 - + + + + - + - + + + + + - LBR3 - + + + + - + - + + + + + -

LBCC1 - + + + + + - - - - - + - - LBCC2 - + - + + + - - - - - + - - LBCC3 - + + + + + - - - - - + - - LBCC4 - + + + + + - - - - - + - - LBCR1 - + + + + - - - + + - + + - LBCR2 - + + + + - - - + + - + + - LBCR3 - + + + + - - - + + - + + - LBPP1 - + + - + + - - - + + + + - LBPP2 - + - - + + - - - + + + + - LBPS1 - + + + + - + + - + + - + - LBPS2 - + + + + + + + - + + - + - LBB1 - - + - - - + + - + - - - - LBB2 - - + - - - + + - + + - - - LBB3 - - + + - - + - - + + - - - LBB4 - - + - - - + + - + - - - -

LBF1 - - + + - - + + - + + + - - LBF2 - - + + - - + + - + + - - -

Tableau 14: Profils fermentaires des lactobacilles isolés

sucre souche

Résultats

124

LBDB LBH LBS LBP LBR LBCC LBCR LBB

0 - - - - - - - - 1 - - - - + - - + 2 - - - - - - - - 3 - - - - - - - - 4 + - - + + - - + 5 - - - + + - - + 6 - - - - - - - - 7 - - - - - - - - 8 - - - - - - - - 9 - - - - - - - - 10 - + - + + + + + 11 + + + + + + + + 12 + + + + + + + + 13 + - - + + + + - 14 - - - - - - - - 15 - - - - + - + - 16 - - - - - - - - 17 - - - - - - - - 18 - - + + + + + - 19 - - + + + - + - 20 - - - + - - - - 21 - - - - - - - - 22 - - - + + + + + 23 - - - + + + + - 24 - - + + + + + + 25 - - v + + + + - 26 - - - + + + + - 27 - - - + + + + - 28 - v + + + - + + 29 + + + V + + + - 30 - - + + + - + - 31 + - + + + - - + 32 - v + + + + + - 33 - - - - - - - + 34 - - v + - + - - 35 v - + + + - - + 36 - - - - - - - -

Tableau 15: Profils fermentaires des lactobacilles isolés par galerie API 50 CHL 1: Arabinose, 2: Cellobiose, 3: Gluconate; 4: Lactose, 5: Mannitol, 6: Mélezitose, 7: Mélibiose, 8: Raffinose, 9 : Rhamnose, 10: Ribose, 11: Sucrose, 12 : Tréhalose, , 13: Sorbitol, 14: Xylose. ; +: réaction positive, -: réaction négative,

sucre souche

Résultats

125

Sucres: 0: CONTROL; 1: GLYcerol; 2: ERYthritol; 3: D ARAbinose; 4: L ARAbinose; 5: RIBose; 6: D XYLose; 7 L XYLose; 8 ADOnitol; 9 �Methyl-D-Xyloside; 10 GALactose; 11 GLUcose; 12 FRUctose ; 13 MaNnosE ; 14 SorBosE; 15 RHAmnose; 16 DULcitol; 17 INOsitol; 18 MANnitol; 19 SORbitol; 20 �-Methyl-D-Mannoside; 21 �-Methyl-D-Glucoside; 22 N-Acetyl-Glucosamine; 23 AMYgdalin; 24 ARButin; 25 ESCulin; 26 SALicin; 27 CELlobiose; 28 MALtose; 29 LACtose; 30 MELibiose; 31 Sucrose; 32 TREhalose; 33 INUlin; 34 MeLeZitose; 35 RAFfinose; 36 Starch; 37 GLYcoGen; 38 XyLiTol; 39 GENtiobiose; 40: D TURanose; 41: D LYXose ; 42: D TAGatose ; 43 D FUCose ; 44 L FUCose; 45 D ARabitoL; 46: L ARabitoL; 47: GlucoNaTe ; 48: 2-Keto-Gluconate; 49: 5-Keto-Gluconate. Souches: LBDB : Lb. delbrueckii sp. bulgaricus ; LBH : Lb. helveticus ; LBS : Lb. salivarius ; LBP: Lb. plantarum ; LBR : Lb. rhamnosus ; LBCC : Lb. casei sp. casei ; LBCR : Lb. casei sp. rhamnosus ; LBB : Lb. brevis.

37 - - - - - - - - 38 - - - - - - - - 39 - - - + + + + + 40 - - - + + - - - 41 - - - - - - - -

42 - - - - - + + - 43 - - - - - - - - 44 - - - - - - - - 45 - - - - - - - - 46 - - - - - - - - 47 - - - + + + + + 48 - - - - - - - - 49 - - - - - - - -

Résultats

126

A B

Fig. 52 : Profil fermentaire par le système API 50 CHL chez Lb. rhamnosus (A), Lb. plantarum (B) II-3 Répartition des espèces de lactobacille

Résultats

127

Les résultats obtenus lors de la fermentation des carbohydrates des lactobacilles

permettent de les répartir en 10 espèces (fig. ). Le groupe 1 (groupe des

lactobacilles thermophiles homofermentaires) est constitué de 11 isolats de

Lactobacillus delbrueckii dont 07 isolats de Lactobacillus delbrueckii sp.

bulgaricus, espèce prédominante dans ce groupe avec un taux de 17%, et 04

isolats de Lactobacillus delbrueckii sp. lactis (9.5%), suivie par Lactobacillus

helveticus représentés par 04 isolats (9.5%) et Lactobacillus salivarius avec

deux isolats (5%). Ces espèces sont caractérisées par la transformation des

hexoses exclusivement par voie homofermentaire en produisant du lactate, ils ne

fermentent ni les pentose ni les gluconate. Ce sont des thermophiles, qui se

développent à 45° C mais pas à 15°C. Leur température de croissance optimale

est de 42°C. Les lactobacilles du groupe II (groupe des lactobacilles mésophiles

hétérofermentaires facultatifs) sont représentés en majorité par Lactobacillus

plantarum (05 souches) (12%), puis Lactobacillus casei dont 04 isolats de

Lactobacillus casei sp. casei (9.5%) et 03 isolats de Lactobacillus casei sp.

rahmnosus (7%), suivi par Lactobacillus rhamnosus (03 souches) (7%).

Ces bactéries métabolisent le rhamnose. Les Lactobacillus paracasei subsp.

paracasei (02 isolats) et Lb. pentosus (02 isolats) sont également rattachés dans

ce groupe avec un taux de 5% respectivement. Ces espèces fermentent les

hexoses en produisant du lactate par voie homofermentaire et les pentoses par

voie hétérofermentaire. Ce sont des mésophiles, qui se développent à 15 °C.

Leur température optimale de croissance se situe entre 30°C et 37°C.

Quant aux Lactobacillus brevis (04 isolats) (9.5 %) et Lactobacillus

fermentum, (2 isolats) (5%), ils font partie du groupe III (groupe des

lactobacilles hétérofermentaires stricts). Les bactéries appartenant à ce groupe

fermentent les pentoses et les hexoses par voie hétérofermentaire en lactate,

en acétate et/ou en éthanol et CO2. Leur température de croissance diffère selon

les espèces, elle varie de 30 à 45°C.

Résultats

128

Fig. 53 : Répartition des espèces de lactobacilles isolées du lait de chèvre

Résultats

129

III Production des substances antimicrobiennes

L'interaction entre les Lactobacilles sp. et H. pylori constitue un critère

important de sélection des souches lactiques, utilisées comme probiotique pour

le traitement de l’infection de H. pylori. Cette partie concerne les méthodes

permettant de mettre en évidence l’antagonisme sur milieu solide et liquide qui

pourrait exister entre les souches de Lactobacillus sp. isolées du lait cru de

chèvre et les souches pathogènes de H. pylori isolées des biopsies gastriques.

La détermination de la nature de l’agent inhibiteur a également été recherchée.

III-1 Mise en évidence des inhibitions entre les Lactobacillus sp. et H. pylori

L’étude de l’activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. sur la croissance de

H. pylori a été effectuée par la méthode directe de diffusion sur milieu solide

(Geis et al., 1983). Les souches de lactobacilles ont été testées vis-à-vis de

H. pylori où une souche est considérée comme inhibitrice (lactobacille) et l’autre

indicatrice (H. pylori). L’inhibition se traduit par la formation d’une zone autour

de la souche ensemencée en touche (lactobacille), témoignant ainsi la présence

d’une activité antagoniste vis-à-vis de H. pylori. La lecture des résultats consiste

à mesurer le diamètre de cette zone d’inhibition apparue autour de la colonie de

lactobacille. Les 42 souches de lactobacilles isolées ainsi que la souche de

référence Lb. delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449 (LBDB CNRZ) ont été

testées pour leur activité antimicrobienne vis à vis de H. pylori isolés (HP1,

HP2, HP3) et les souches de références H. pylori J99 (HP4) et H. pylori 26695

(HP5). Les lactobacilles isolés testés sont représentés par les espèces suivantes:

Lb. plantarum; Lb. rhamnosus; Lb. casei; Lb. paracasei; Lb. pentosus;

Lb. salivarius; Lb. delbrueckii; Lb. helveticus; Lb brevis et Lb. fermentum.

Résultats

130

L’ensemble des inhibitions est illustré dans les tableaux (16, 17) et dans

les figures 54, 55, 56 montrant des spectres d’activité variable des lactobacilles.

En effet, d’après les résultats obtenus, il en ressort que la plupart des souches de

lactobacilles prouvent une activité antimicrobienne contre H. pylori testés,

démontrée par l'apparition de zone d’inhibition avec des diamètres variés.

Or, nous avons constaté que les espèces Lb. delbrueckii sp. bulgaricus,

Lb. plantarum, Lb.rhamnosus, Lb brevis, Lb. helveticus, Lb salivarius, Lb casei

(Lb. casei sp. casei et Lb casei sp. rhamnosus) ont montré un effet inhibiteur

élevé avec une zone d’inhibition importante dont le diamètre varie d’une souche

à l’autre. C’est le cas par exemple de l’espèce Lb. delbrucekii sp. bulgaricus ou

les souches (LBDB1, LBDB3, LBDB5) ont révélé une activité antagoniste

remarquable vis-à-vis de la souche H. pylori2 (HP2) dont le diamètre

d’inhibition dépasse 14 mm (fig. 54) et des diamètres de 10 mm et 12 mm pour

les souches LBDB3, et LBDB5 vis-à-vis de H. pylori1 (HP1).

En revanche, les souches de Lb. plantarum (LBP1, LBP3) présentent

une activité inhibitrice contre la souche H. pylori2 (HP2) avec un diamètre

d’inhibition de 12mm et 9mm respectivement (fig. 54) et un diamètre de 8 mm

et 10 mm pour la souche LBP3 et LBP4 vis-à-vis de HP1.

De même, les souches de Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2) ont prouvé une

inhibition importante contre H. pylori2 avec des diamètres de 19,83 et 10 mm

respectivement (fig. 54).

De plus, les souches de Lb. salivarius (LBS1, LBS2) (fig. 55) et les souches de

Lb. helveticus (LBH1, LBH2) (fig. 55) ainsi que Lb. brevis (fig. 55) ont

également révélé une activité antagoniste contre HP2 ou les diamètres des zones

d’inhibition oscillent entre 7 et 11 mm.

Résultats

131

1

2

3

3

4

1 : LBP1

2 : LBP3

3 : LBP4

4 : LBP5

1 : LBR1

2 : LBR2

3 : LBR3

4 : LBP2

3

1

4

2

1

2

5 4

3

1: LBDB1

2: LBDB3

3: LBDB5

4: LBDB6

5: LBDB7

Fig. 54: Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur la croissance de H. pylori (HP2) ensemencé dans la masse

Résultats

132

1 : LBB1

2 : LBB2

3 : LBB3

4 : LBB4

1 : LBPP1

2 : LBPP2

3 : LBS1

4 : LBS2

1

2

3

4

1 : LBH1

2 : LBH2

3 : LBH3

4 : LBH4

1

4

3

2

1

2

3 4

Fig. 55 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur H. pylori (suite)

Résultats

133

De plus, l’espèce Lb. delbruekii sp. lactis (LBDL) montre certaine inhibition

mais qui varie d’une souche à l’autre (fig. 56).

Cependant, certaines souches n’ont présenté qu’un faible pouvoir inhibiteur,

voire nul vis-à-vis des souches de H. pylori. En effet, nous avons enregistré

des zones d’inhibition avec des diamètres ne dépassant pas 3 mm, parfois nul

expliquant ainsi une absence totale de cette inhibition. C’est le cas Lb. pentosus

(LBPS) et Lb. fermentum (LBF) (fig. 56).

Le tableau 7 rassemble les résultats de l’activité antimicrobienne des souches de

lactobacilles vis-à-vis de H. pylori.

D’après les résultats obtenus, nous avons remarqué que la souche Lb. rhamnosus

(LBR1) a prouvé un pouvoir inhibiteur le plus élevé, et représente l’espèce

la plus inhibitrice pour la majorité des souches de H. pylori testés.

Quant aux souches de H. pylori testées, nous avons constaté que la souche

H. pylori 2 (HP2) est la souche la plus inhibée et la plus sensible au pouvoir

inhibiteur des lactobacilles testés.

Les résultats obtenus ont parfois montré des différences de comportement des

souches lactiques d’une même espèce vis-à-vis des souches pathogènes de

H. pylori comme par exemple le cas de la souche LBP4 qui présente un pouvoir

inhibiteur contre la souche HP1, alors que la souche LBP5 ne montre aucune

inhibition vis-à-vis de HP1 ou le diamètre d’inhibition est nul.

Le tableau 16 et 17 récapitulent les résultats de l’activité antimicrobienne

des lactobacilles sur H. pylori.

Résultats

134

1 : LBPS1

2 : LBPS2

3 : LBF1

4 : LBF2

2 1

3

4

1 : LBDL1

2 : LBDL2

3 : LBDL3

4 : LBDL4

1: LBDB CNRZ

2: LBCC2

3: LBCC3

4: LBCC4

1

2

3

4

1

2

3

4

Fig. 56 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur H. pylori

Résultats

135

Tableau 16: Activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. sur H. pylori

Souches code pH HP1 HP2 HP3 HP4 HP5

LBDB1 4.04 5 14.5 7 10 6

LBDB2 4.75 2.1 2.5 3 1.5 2

LBDB3 4.95 10 15.9 2.5 1.9 6

LBDB4 5.20 0 5 4.1 5 4.5

LBDB5 5.45 12 12 3.4 7 4

LBDB6 4.57 4 10 0 5 0

Lb. delbrueckii

sp. bulgaricus

LBDB7 4.18 4.2 10 5 3.5 5.5

LBDL1 4.27 3 3 0 4.5 2.1

LBDL2 3.97 0 0 0 5 3.1

LBDL3 5.36 0 0 2.4 0 0

Lb. delbrukuii

sp. lactis

LBDL4 4.94 2.5 3 1.5 3 2.8

LBH1 4.24 5 7.1 6 2.3 0

LBH2 4.03 3.2 8 7 3 4

LBH3 4.9 3 2.9 2.5 0 3

Lb. helveticus

LBH4 4.5 0 0 3 0 0

LBS1 5.21 4.1 11 4.2 4.5 3.2 Lb. salivarius

LBS2 4.83 5,8 10.3 3.1 4.4 4.1

LBP1 4.99 4.5 12 5 6 5.1

LBP2 5.98 3 2.8 6.4 3 2.5

LBP3 4.69 8.1 9 1.5 5 4.3

LBP4 4.50 1.2 3 0 3.5 0

Lb. plantarum

LBP5 5.90 0 4 2.4 0 0

Résultats

136

LBR1 4.95 12 19.2 5 10 9.1

LBR2 5.90 2.1 10 2.8 3 4.1

Lb. rhamnosus

LBR3 4.50 1.9 2.8 2.5 0 3

LBCC1 4.76 2.1 8 3.5 5 4.2

LBCC2 5.88 0 4 7.5 2 5

LBCC3 6.62 3.5 0 2.4 2 1.9

Lb. casei sp. casei

LBCC4 6.13 0 3 2.6 0 0

LBCR1 3.73 5.5 10 3 6 4.5

LBCR2 4.27 2.9 9 2.4 2 3

Lb. casei sp. rhamnosus

LBCR3 4.50 0 3 6.5 0 2.4

LBB1 4.99 3 5.2 2.9 3 3

LBB2 5.98 6 4 0 2 4.5

LBB3 4.91 3 2.5 0 0 0

Lb. brevis

LBB4 5.88 0 3 3.8 3.5 0

LBF1 6.53 0 0 0 0 0 Lb. fermentum

LBF2 4.12 1.5 0 0 0 0

LBPS1 6.23 0 0 0 1.5 2 Lb. pentosus

LBPS2 6.53 0 0 0 0 0

Lb. paracasei sp. paracasei

LBPP1 3.86 2 3 2.4 2.5 0

LBPP2 4.1 1.2 2 0 0 0

Lb. delbruekii sp. bulgaricus CNRZ 449

LBDB 449

4.04 4.5 6.2 2.5 6 4.1

Résultats

137

Tableau 17: Inhibition de H. pylori par les souches de lactobacilles

H. pylori

Lactobacilles

HP1 HP2 HP3 HP4 HP5

LBDB1 ++ ++ ++ ++ ++

LBDB2 ++ ++ ++ + +

LBDB3 ++ ++ ++ + ++

LBDB4 - ++ ++ ++ ++

LBDB5 ++ ++ ++ ++ ++

LBDB6 ++ ++ - ++ -

LBDB7 ++ ++ ++ ++ ++

LBDL1 ++ ++ - ++ ++

LBDL2 - - - ++ ++

LBDL3 - - ++ - -

LBDL4 ++ ++ + ++ ++

LBH1 ++ ++ ++ ++ -

LBH2 ++ ++ ++ ++ ++

LBH3 ++ ++ ++ - ++

LBH4 - ++ ++ ++ -

LBP1 ++ ++ ++ ++ ++

LBP2 ++ ++ ++ ++ ++

LBP3 ++ ++ + ++ ++

LBP4 + ++ - ++ -

LBP5 - ++ ++ - -

LBR1 ++ ++ ++ ++ ++

LBR2 ++ ++ ++ ++ ++

LBR3 + ++ ++ - ++

LBCC1 ++ ++ ++ ++ ++

LBCC2 - ++ ++ + ++

LBCC3 ++ - ++ + +

LBCC4 - ++ ++ ++ -

LBCR1 ++ ++ ++ ++ ++

LBCR2 + ++ ++ ++ ++

LBCR3 - ++ ++ - ++

LBB1 ++ ++ ++ ++ ++

LBB2 ++ ++ - + ++

LBB3 ++ ++ - - -

LBB4 - ++ ++ ++ -

LBF1 - - - - -

LBF2 + - - - -

LBS1 ++ ++ ++ ++ ++

LBS2 ++ ++ ++ ++ ++

LBPS1 - - - + +

LBPS2 - - - - -

LBDB CNRZ ++ ++ ++ ++ ++

+ : Halo inférieur 2mm; ++: Halo supérieur 2mm; -: pas d’inhibition

Résultats

138

Ce pouvoir inhibiteur, exercés par les lactobacilles, qui diffère d’une souche à

l’autre reflète la capacité de ses souches lactiques de produire des substances

antimicrobiennes inhibant la croissance de la souche pathogène H. pylori.

En effet, L’effet inhibiteur des lactobacilles peut avoir plusieurs origines parmi

lesquelles, nous pouvons mentionner la production d’acides organiques, de

peroxyde d’hydrogène, de bactériocines et les phages (Moreno et al., 1999;

Navarro et al., 2000; Rodriguez et al., 2002; Maldonado et al., 2003; Todorov

et Dicks, 2005).

Afin de déterminer la nature de l'agent inhibiteur, nous avons sélectionné

les souches lactiques fortement inhibitrices (ayant une zone d’inhibition élevée)

parmi les 43 souches de lactobacilles étudiées, et testées leur pouvoir acidifiant.

Le choix et la sélection de 14 souches de lactobacilles a donc été réparti comme

suit : Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3, LBDB5), Lb. plantarum

(LBP1, LBP3), Lb.rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus

(LBH1, LBH2), Lb salivarius (LBS1, LBS2), Lb casei sp. casei (LBCC1),

Lb casei sp. rhamnosus (LBCR1).

Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al., (1977) qui établit que le tri

doit se faire à partir des souches qui présentent le plus grand effet inhibiteur.

Résultats

139

III-2 Pouvoir acidifiant

L’évaluation du pouvoir acidifiant des lactobacilles a été réalisée par la mesure

du degré Dornic, qui correspond à la quantité d’acide lactique produite.

Les résultats obtenus ont révélé que la majorité des 14 souches de lactobacilles

étudiées ont un pouvoir acidifiant important, qui diffère selon l’espèce et même

au sein de la même espèce. Effectivement, La souche Lb. rhamnosus (LBR1) a

montré une activité acidifiante plus élevée, qui atteint 69°D en 24h, suivi par les

souches Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) et Lb. plantarum

(LBP1) dont le taux d’acidité est de 65°D. De même, les souches LBR2, LBP3,

LBS1, LBS2, LBDB5 ont présenté un pouvoir acidifiant important, qui varie

entre 60 et 64°D après 24 d’incubation. Quant aux souches de Lb. helveticus

(LBH1, LBH2), Lb. brevis (LBB1), ainsi que l’espèce Lb. casei (LBCR1,

LBCC1) ont montré des taux d’acidification moyen qui varient entre 52 et

59 °D en 24 h. Les résultats de l’acidité sont illustrés dans les figures 57, 58, 59.

En parallèle, le suivit de la variation du pH montre que La souche Lb.

rhamnosus 1 (LBR1) a baissé le pH jusqu'à 4.2 en 24h, suivi par la souche Lb.

delbruecki subsp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) ainsi que Lb. plantarum (LBP1)

dont le pH a atteint 4.4. Quant aux souches LBR2, LBP3, LBDB5, LBS1, LBS2,

les valeurs du pH varient de 4,5 à 4,8 alors que les valeurs du pH obtenues par

les souches LBH1, LBH2, LBB1, LBCR1, LBCC1 sont plus élevées par rapport

à celles des autres souches, compris entre 5.4 et 5.8 après 24 h d’incubation

(fig. 57,58,59). Par conséquent, nous avons remarqué que la baisse du pH dans

le milieu est en relation étroite avec le pouvoir acidifiant exercé par les souches

de lactobacilles. D’après les résultats obtenus, nous avons constaté que

les souches de lactobacilles retenues pour leur pouvoir inhibiteur face au H.

pylori, possèdent dans l’ensemble un pouvoir acidifiant important.

De plus, la souche Lb. rhamnosus (LBR1) s’est avérée la plus performante non

seulement pour son pouvoir antibactérien, mais également pour son pouvoir

acidifiant.

Résultats

140

Fig. 57 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBCR1, LBCC1, LBH1, LBH2, LBB1.

Résultats

82

Résultats

141

Fig. 58: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBP1, LBP3, LBS1, LBS2.

Résultats

142

Fig. 59 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBR1, LBR2, LBDB1, LBDB3, LBDB5.

Résultats

143

III-3 Détermination de l’agent inhibiteur :

L’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori pourrait être

principalement dû à deux facteurs. Le premier est la production des acides

organiques essentiellement l’acide lactique, un des caractéristiques connu chez

les lactobacilles, alors que le deuxième facteur est la production de substance

protéique inhibitrice appelée bactériocine (Larsen et al., 1993; Anderssen et

al., 1998; Oyetayo et al., 2003; Avila et al., 2005). De plus, d’autres facteurs tels

que la production de peroxyde d’hydrogène et les phages pourraient également

être responsables de cette inhibition. Pour cela, certains tests s’avèrent

nécessaires, permettant de déterminer le ou les facteurs impliqués dans cet

antagonisme.

Pour la recherche de la nature de l’agent inhibiteur sur milieu solide, nous avons

testé les 14 souches de lactobacilles sélectionné pour leur pouvoir inhibiteur

élevé précedemment mentionnés (Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB 1,

LBD3, LBD5), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2),

Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus (LBH1, LBH2), Lb. salivarius (LBS1, LBS2),

Lb casei sp. casei (LBCC1), Lb casei sp. rhamnosus (LBCR1).

Quant aux H. pylori testés, la souche H. pylori 2 (HP2) s’avère la souche la plus

sensible au pouvoir inhibiteur des lactobacilles, raison pour laquelle HP2 est

choisie comme souche indicatrice.

Dans ce contexte, nous avons procédé à la méthode indirecte dite méthode des

puits (Wendakoon et al., 1998), qui consiste à mettre au contact la souche

pathogène de H. pylori (HP 2) ensemencé en masse avec les surnageants

obtenus des lactobacilles testés et par la suite visualiser l’apparition des zones

d’inhibition autour des puits.

Résultats

144

III-3-1 Effet de la production d’acide lactique :

L’acide lactique est, depuis longtemps, reconnu comme un agent majeur de

l'activité antimicrobienne des bactéries lactiques en particulier celle des

lactobacilles. Pour détecter l’effet de l’acide sur H. pylori, nous avons neutralisé

le surnageant des souches de lactobacilles test avec le tampon phosphate à pH 7

afin de minimiser sa production. L’évaluation des résultats obtenus avec

un surnageant non traité (témoin) nous permettra de déterminer si la production

d’acides est un facteur actif des inhibitions observées.

Or, nous avons remarqué que l’inhibition est levée chez 13 souches parmi les 14

souches choisies. C’est le cas de Lb. delbrucekii sp. bulgaricus (LBDB 1,

LBD3, LBD5), Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb. helveticus (LBH1, LBH2),

Lb. salivarius (LBS1, LBS2), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb. Casei

sp. rhamnosus (LBCR1), Lb. casei sp. casei (LBCC1) (tableau 18). Ces souches

lactiques testées sont capable d’inhibé H. pylori à leur pH natif, mais cette effet

disparait une fois le surnagent est ajusté à la neutralité, indiquant ainsi l’effet des

acides organiques produits. Ceci est expliqué par l’absence totale des zones

d’inhibition autour des puits contenu le surnageant traité comparativement avec

le témoin non traité. Par contre, l’intensité de l’inhibition pour la souche restante

Lb. brevis (LBB1), est diminuée comparativement au témoin. Ce résultat montre

qu’en plus de l’acidité, un autre facteur est impliqué dans cette inhibition.

Le milieu MRS utilisé comme contrôle négatif n’a pas été inhibé par

les lactobacilles. Par contre, une zone d’inhibition a été observée autour de

l’amoxicilline, comme étant un contrôle positif avec un diamètre de 9 mm.

Ce test réalisé nous a permis de montrer que les inhibitions sont en majorité dues

à l’acidité puisqu’elles ont été soit partiellement soit totalement levées.

Nous pouvons également dire que les souches lactiques inhibent les souches

cibles qu’elle rencontre de façon différentes. Pour le cas où l’inhibition a été

partiellement levée, nous pouvons donc dire que l’acidité n’est pas la cause

majeure de l’inhibition chez Lb. brevis testé.

Résultats

145

SR : surnageant à pH natif ; SRN: surnageant neutralisé à pH 7; SRC: surnageant traité à la catalase; zone d’inhibition exprimée en mm.

Souches code pH SR SR N SRC

LBDB1 4.04 11 0 11

LBDB3 3.95 14 0 14

Lb. delbrueckii

sp. bulgaricus

LBDB5 4.75 10 0 10

LBR1 3.76 15 0 15 Lb. rhamnosus

LBR2 3.73 8 0 8

LBH1 4.24 5 0 5 Lb. helveticus

LBH2 4.03 6 0 6

LBS1 3.71 7 0 7 Lb. salivarius

LBS2 3.50 8 0 8

LBP1 3.27 10 0 10 Lb. plantarum

LBP3 3.69 7 0 7

LBCC1 4.02 5 0 5 Lb. casei

LBCR1 4.5 7 0 7

Lb. brevis LBB1 4.9 5 3 5

Tableau 18: Effet de la production d’acides et du peroxyde d’hydrogène sur H. pylori

Résultats

146

III-3-2 Effet du peroxyde d’hydrogène

Le peroxyde d'hydrogène produit par les lactobacilles est parmi les facteurs

majeurs dans l’inhibition des espèces bactériennes.

Les bactéries lactiques sont généralement dépourvues de catalase mais certaines

souches peuvent accumuler le peroxyde d'hydrogène lorsqu’elles sont cultivées

en aérobiose. Pour cette raison, nous avons testé un autre facteur antimicrobien

qui est le peroxyde d’hydrogène, impliqué probablement dans cette inhibition.

Pour ce faire, Le surnageant des lactobacilles est traité par la catalase pour

éliminer l’effet éventuel du peroxyde d’hydrogène. Cependant, l’inhibition n’a

pas été levée chez toutes les souches lactiques testées, au contraire elle persiste

avec l’apparition d’un halo d’inhibition dont le diamètre est similaire à celui du

témoin (tableau 18), Ce qui exclut donc l’effet inhibiteur du peroxyde

d’hydrogène sur la croissance de H. pylori.

III-3-3 productions de phage lysogène

Une des caractéristiques de l'effet antibactérien des phages virulents est que

chaque cellule bactérienne infectée et lysée donne naissance à des dizaines ou

des centaines de nouveaux phages qui sont libérés dans le milieu et pourront

déclencher de nouveaux cycles lytiques. Par conséquent, l'effet antibactérien se

propage d'une bactérie à l'autre en s'amplifiant.

Afin d'éliminer la possibilité de la présence de phages, nous avons utilisé

la méthode de Hardy ou le résultat s’est révélé négatif pour l’ensemble des

souches lactiques testées, aucune plage de lyse n’est apparue après incubation.

L’obtention d’un tapis bactérien signifie que l'effet inhibiteur ne peut pas se

propager d'une bactérie à l'autre et donc qu'il n'est pas dû à la présence de

bactériophages.

Résultats

147

III-3-4 Effet de la bactériocine

Puisque les bactériocines sont par définition des substances protéiniques, elles

doivent être sensibles au moins à une protéase. La sensibilité aux enzymes

protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation

En effet, les réponses obtenues après l’action des enzymes protéolytiques

(pepsine, trypsine et α-chymotrypsine) nous permettra d’identifier les substances

antibactériennes comme étant des bactériocines. Si l’halo d’inhibition disparait

en présence de l’action d’une enzyme protéolytique, l’agent inhibiteur est de

nature protéique mais, s’il persiste après l’action des trois enzymes utilisées, il y

a une forte probabilité pour que l’agent ne soit pas de nature protéique c'est-à-

dire qu’il ne s’agit pas d’une bactériocine (Callewaert et de Vuyst, 2000; Aslim

et al., 2005).

Or, nous avons remarqué qu’après le traitement des surnageant des lactobacilles

par les trois enzymes protéolytiques, aucune inactivation n’est constaté chez

les 13 souches testées (LBDB 1, LBD3, LBD5, LBR1, LBR2, LBH1, LBH2,

LBS1, LBS2, LBP1, LBP3, LBCR1, LBCC1) (tableau 19). Ceci se traduit par

la persistance de la zone d’inhibition autour des puits, indiquant ainsi que

la substance antimicrobienne n’est pas de nature protéique et confirmant l’effet

inhibiteur de l’acide lactique.

Cependant, chez la souche Lb. brevis (LBB1), l’inhibition est partiellement

levée comparativement au témoin avec une diminution de l’halo d’inhibition

après le traitement de surnageant bactérien par la pepsine. Alors, aucune

inactivation n’est constatée chez la souche LBB1en présence de trypsine et

alpha-chymotrypsine (tableau 19). Des zones d’inhibitions sont détectées après

mise en présence de ces enzymes dont le diamètre est identique à celui du

témoin (surnageant non traité). Puisque les bactériocines sont sensible à au

moins à une protéase, critère principal dans leur caractérisation, il y a

une probabilité pour que l’agent inhibiteur soit de nature protéique.

Résultats

148

Tableau 19: Effet de la production de la bactériocine

SR : surnageant non traité ; SRAC : surnageant traité par alpha chymotrypsine; SRT: surnageant traité par la trypsine ; SRP : surnageant traité par la pepsine ;

+ : présence de la zone d’inhibition ; - : diminution de la zone d’inhibition

Souches code SR SRAC SRT SRP

LBDB1 11 + + +

LBDB3 14 + + +

Lb. delbrueckii

sp. bulgaricus

LBDB5 10 + + +

LBR1 15 + + + Lb. rhamnosus

LBR2 8 + + +

LBH1 5 + + + Lb. helveticus

LBH2 6 + + +

LBS1 7 + + + Lb. salivarius

LBS2 8 + + +

LBP1 10 + + + Lb. plantarum

LBP3 7 + + +

LBCC1 5 + + + Lb. casei

LBCR1 7 + + +

Lb. brevis LBB1 5.5 + + -

Résultats

149

La substance antibactérienne contenu dans le surnageant de la souche LBB1 est

sensible à la pepsine mais l’inactivation n’est pas totale et résistante

complètement aux deux autres enzymes protéolytiques testées. Sa structure

chimique pourrait donc être probablement complexe, contenant en plus du

groupement protéique ou peptidique des entités de nature lipidique ou

polysaccharidique, ou autre structure. D’autre part, le traitement thermique de

surnageant de la souche LBB1 a révélé la sensibilité de surnageant de la souche

LBB1 à la chaleur (filtrat chauffé à 100°C et 120°C). L’activité anti-H. pylori

n’est donc pas retenue après un traitement thermique. Ceci est expliqué par

l’absence de zone d’inhibition autour des puits, montrant ainsi que la substance

contenu dans le surnageant n’est pas thermostable. Sachant que les bactériocines

éventuellement produites par Lb. brevis sont généralement connu par leur

sensibilité aux enzymes protéolytiques et par leur résistance au traitement

thermique. La figure 60 montre l’effet des surnageants traités de Lb.brevis et

Lb. rhamnosus sur la croissance de H. pylori.

A B

1 : filtrat+trypsine 1 : filtrat non traité 2 : filtrat+pepsine 2 : filtrat + catalase 3 : filtrat+chymotrypsine 3 : filtrat tamponné 4 : MRS (témoin négatif) 4 : MRS (témoin négatif)

2

3

4

1 1

2 3

4

Fig. 60: l’effet de surnageant de Lb. brevis (A) traité par les enzymes, et le surnageant tamponné de Lb. rhamnosus (B) sur la croissance de H. pylori ensemencé en mase

Résultats

150

III-4 Effet de surnageant de lactobacille sur H. pylori en milieu liquide

La recherche des inhibitions a également été entamée en milieu liquide.

Le but de cette expérience est de voir d’une part si la souche de lactobacille a

également un pouvoir inhibiteur en milieu liquide, comme celui démontré en

milieu solide, et d’autre part, de montrer si la substance antimicrobienne

éventuellement produite a un effet bactéricide ou bactériostatique sur

la croissance de H. pylori testé.

Pour ce faire, il suffit de suivre l’évolution de la concentration en bactérie

indicatrice viable de H. pylori dans le milieu de culture. La viabilité de la souche

H. pylori incubée à 37°C en présence de surnageant de lactobacille à son pH

natif et de l’acide lactique est mesurée en fonction du temps.

Une stabilité de la concentration en bactérie viable est indicatrice d’un effet

bactériostatique alors qu’une baisse de cette concentration indique un effet

bactéricide.

Dans cette expérience, la souche Lb. rhamnosus (LBR1) est choisie comme

souche inhibitrice pour son pouvoir inhibiteur élevé vis-à-vis de H. pylori

Quant aux souches indicatrices, H. pylori1 (HP1) et H. pylori2 (HP2) ont été

retenus pour leur grande sensibilité à l’effet inhibiteur de Lb. rhamnosus.

En effet, dans le cas ou les souches de H. pylori (HP1, HP2) sont inoculées à

une concentration initiale de 105 CFU/ml dans le surnageant de Lb. rhamnosus ,

la population bactérienne de H. pylori dans les deux cultures restent stables

durant les 12 h d’incubation comparativement au témoin (culture de H. pylori).

Cependant, après cette période, une diminution progressive en concentration des

cellules viables de H. pylori est observée après 24 d’incubation qui atteint à la

moyenne de 103 CFU/ml. Cette baisse de la population bactérienne se poursuit

jusqu' une absence totale en cellules viables à 72h chez H. pylori1 (HP1), et à

60h chez H. pylori2 (HP2) (fig. 61).

De même, l’inoculation des souches de H. pylori (HP1, HP2) dans l’acide

lactique entraine une baisse rapide en cellule de H. pylori dans les deux cultures

Résultats

151

Fig. 61 : Viabilité de H. pylori (HP1, HP2) en présence de surnageant de Lb. rhamnosus (LBR1) et de l’acide lactique

Résultats

152

dans les 12 d’incubation ou le taux de H. pylori a diminué de 105 à 103 CFU/ml,

ensuite un déclin dramatique est observé dans le nombre cellulaire de H. pylori à

24h notamment chez la souche H. pylori2 , suivi par une absence de croissance à

48 h chez H. pylori1 et à 36 h d’incubation chez H. pylori2 (fig. 61).

Les résultats obtenus montrent d’une part que l’inhibition provoquée par Lb.

rhamnosus est maintenue en milieu liquide additionnée de surnageant et d’autre

part, que le surnageant de Lb. rhamnosus1 contient une substance

antibactérienne ayant une action bactéricide active vis-à-vis de H. pylori qui est

bien l’acide lactique, confirmant ainsi le pouvoir inhibiteur que peut exercer Lb.

rhamnosus contre les souches pathogènes de H. pylori.

De plus, nous avons remarqué que La souche (HP2) montre une sensibilité

élevée par rapport à la souche H. pylori (HP 1) vis-à-vis du surnageant de Lb.

rhamnosus1 (LBR1) et de l’acide lactique.

III-5 Inhibitions des bactéries pathogènes par les Lactobacillus sp.

Les souches lactiques sont testées pour leur pouvoir inhibiteur à l’égard de

différentes bactéries pathogènes, permettant ainsi de déterminer leur spectre

d’activité en utilisant la méthode directe expliquée précédemment (Geis et

al., 1983). En effet, nous avons testé l’effet inhibiteur des Lactobacilus sp.

sélectionnés vis-à-vis des espèces bactériennes Gram positive (Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis), et Gram négative (E. coli, Klebsiella pneumoninae,

Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa).

Sur la base des résultats obtenus, il en ressort que les souches de lactobacilles

testées exercent également une activité antagoniste contre les bactéries

pathogènes et présentent un spectre d’activité large renfermant les bactéries

Gram positive et les bactéries Gram négative. Cet effet antagoniste est variable,

dépend d’une part de la souche indicatrice cible et d’autre part de la souche

lactique inhibitrice.

Résultats

153

En effet, toutes les souches lactiques montrent une activité importante vis à vis

de E. coli et de St. aureus (fig. 62) dont les diamètres des zones d’inhibition

varient entre 9 et 30 mm. De même, les lactobacilles présentent une activité

inhibitrice remarquable sur la souche B. subtilis avec une zone d’inhibition

allant de 8 et 24 mm (tableau 20).

De plus, On a remarqué que les espèces de Ps. aeruginosa et S. enteritidis,

Kl. pneumoninae ont également été inhibées par la majorité des souches de

lactobacilles testées. De plus, nous avons constaté que les bactéries pathogènes

n’ont pas le même comportement face aux lactobacilles. Ceci renseigne sur les

capacités de résistance de ces bactéries aux agents produits par les souches

lactiques.

D’autre part, certaines souches lactiques montrent une différence dans leur

comportement face aux bactéries pathogènes, au niveau d’une même espèce.

C’est l’exemple de la souche LBH1 et LBH2 vis-à-vis de Ps. aeruginosa

(tableau 20). Alors que les souches de Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2) inhibent

toutes les souches pathogènes testées, qu’elles soient Gram positive ou Gram

négative. Ces bactéries lactiques ont donc une forte potentialité d’inhibition vis-

à-vis des bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori.

En revanche, nous avons également constaté que l’inhibition des bactéries

pathogènes Gram positive par les lactobacilles est plus importante à celle des

bactéries Gram négative dont la zone d’inhibition est plus grande.

L’inhibition des bactéries pathogènes s’explique par la capacité des lactobacilles

de produire de substances antibactériennes, responsable de cet effet antagoniste

tel que l’acide lactique, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines.

Les bactériocines sont surtout active sur les pathogènes gram+.

Le tableau 20 récapitule les résultats des inhibitions des bactéries pathogènes par

les lactobacilles.

Résultats

154

A B

1 : LBS1; 2 : LBS2; 3 : LBDB1; 4 : LBDB3

Fig. 62: Effet antimicrobien des lactobacilles sur les bactéries pathogènes (A : E. coli ; B : St. aureus)

4 1

2

3

1

2

3

4

Résultats

155

ST: souches ensemencées en touches; SC: souches ensemencées en masse; Zone d’inhibition exprimée en mm

Souches cibles

Souches test

E. coli Kl. pneumoniae

St. aureus S. enteritidis

Ps. aeruginosa

B. subtilis

LBDB1 17 9.5 14 14 15 22

LBDB3 15 10 8 12 12 14.5

LBDB5 15 0 12 9.5 8.4 10

LBR1 29 20 25 12 10.5 24

LBR2 18 17 19 20.3 8.3 15

LBH1 10 0 23.5 15.6 15 17.5

LBH2 8 0 15.5 0 0 10

LBS1 9.5 19 9 0 22.5 21

LBS2 10 0 10 10 19 14

LBP1 19.4 20 19 13 15 20

LBP3 10 0 20 14.5 2 8.5

LBCR1 11 14 26 11 0 23

LBCC1 9 0 21 0 14 20

LBB1 16 14 10 6 0 8.2

Tableau 20 : Activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. vis-à-vis des bactéries pathogènes.

Discussion

156

Discussion

Récemment, l’attention est portée sur l’interaction entre H. pylori et les bactéries

lactiques essentiellement les lactobacilles (Sgouras et al., 2004). H. pylori,

bactérie pathogène chez l’homme est impliqué dans les affections

gastroduodénales (Megraud, 2007). Cette infection est répandue dans le monde

entier et affecte plus de 50% de la population (Dunn et al., 1997; Perez-Perez et

al., 2004). La trithérapie est le traitement actuel le plus recommandé et le plus

efficace (Malfertheiner et al., 2002). Cependant, l’échec de l’éradication de

H. pylori constitue un problème majeur dans la santé (Borody et al., 1996 ;

Megraud, 2007 ;). Par conséquent, la recherche des méthodes alternatives serait

indispensable (Rokka et al., 2006 ; Pinchuk et al., 2001;).

Les lactobacilles, hôte naturel des intestins de l’homme ont des propriétés

nutritionnelles et thérapeutiques aujourd’hui reconnu (Tannok, 1999). Ils sont

considérés comme des probiotiques en raison de leur innocuité chez l’homme et

leur propriétés antagonistes contre les bactéries pathogènes y compris H. pylori

(Sgouras et al., 2004).

Dans ce présent travail, nous avons procédé, en premier temps, à mettre en

évidence H. pylori chez des patients atteints de maladies gastro-duodénales par

des méthodes invasives nécessitant la réalisation des biopsies gastriques lors de

la fibroscopie. Ces méthodes incluent le test rapide à l’uréase, l’examen

cytologique, l’examen histologique, la culture et l’amplification génique (PCR).

La mise en évidence de l’uréase dans les biopsies gastriques par les tests rapides

à l'urée (C.L.O test ou Urée-indole), constitue un point important indiquant la

présence de la bactérie (Dorval, 1992). Cette enzyme, caractéristique essentielle

de H. pylori hydrolyse l'urée normalement présente dans l'estomac en ammoniac

et gaz carbonique. L'ammoniac Libéré neutralise le micro-environnement de

la bactérie en la protégeant de l'acidité gastrique (Leclerc et Vincent, 1991 ;

Lamouliatte et al., 1992; Bretagne, 1996 ).

Discussion

157

Selon plusieurs auteurs, la rapidité et l’intensité de la réaction sont en fonction

du temps du virement et de la densité bactérienne (Sobhani et al, 1991; Souquet,

1995; Megraud, 1996a).

D’après nos résultats, le temps de virement obtenu varie selon les cas de 20 mn,

30 mn voire 1h. Delchier (1996b) observe un virage sur des biopsies infectées

dans la première demi-heure sur environ 80% des cas étudiés. De même,

(Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992; Fennerty, 1994) ont obtenus des

réactions positives en 20 minutes chez des patients souffrants d’une affection

gastroduodénale et d’après ces chercheurs, la rapidité de la réaction rend ce test

d’une spécificité excellente. Tout résultat positif est donc présumé en rapport

avec l’infection à H. pylori en raison de la forte activité uréasique de cette

bactérie mais à condition de proscrire la lecture tardive du test à 24h, à ce

moment il ne s’agit plus d’un diagnostic rapide car certaines bactéries

uréasiques contaminantes provenant notamment de la bouche comme

Staphylococcus, Streptococcus, voire Klebsiella, Proteus peuvent être à l'origine

des faux positifs (Sobhani et al., 1991; Lamouliatte et al., 1992; Lozniewski,

1996; Megraud, 1996a ; de Korwin, 2003).

De plus, la positivité du test dépend aussi du nombre des bactéries présent dans

la biopsie qui est de l'ordre de 105 bactéries (Lamouliatte et al., 1992; Megraud,

1992; Missonier et Dorval, 1994 ; de Korwin, 2003 ). Ceci explique les faux

négatifs de ce test, qui pourraient être du à un inoculum de départ trop faible, ou

à la répartition hétérogène de H. pylori à la surface de la muqueuse gastrique

(Riachi et Colin, 1995; Lozniewski, 1996 ). Il parait donc préférable de placer 2

biopsies dans le milieu pour augmenter la densité microbienne (de Korwin,

2003).

D’après des données littéraires, l'uréase chez H. pylori est un facteur

d’adaptation partiel lui permettant la colonisation et la survie dans un

environnement acide particulièrement hostile aux autres bactéries (Lamouliatte

et al., 1992 ; Vincent et Leclerc, 1991). Ce rôle a été démontré par Eaton et

Discussion

158

al., (1991) en utilisant des mutants uréase négatif de H. pylori qui ne peuvent

coloniser l'estomac du porcelet, meilleur modèle d’infection à H. pylori.

D’autre part, Marshall et al. (1988) rapporte que H. pylori est également

sensible à l'acidité gastrique que Campylobacter jejuni , mais en présence de

l'urée, H. pylori reste viable à un pH < 3,5.

Cependant, nous ne pouvons pas nous contenter du test à l'uréase pour établir

formellement la recherche de l'infection à H. pylori. Cette recherche doit être

donc complétée par d’autres tests (Delchier, 1994).

L'examen cytologique d’un frottis biopsique, nous a permis de repérer

les Helicobacter par leur morphologie caractéristique (Fauchére et Rosenau,

1991). Il s’agit de bacilles gram négatif incurvés ou légèrement spiralés. La

présence de ces formes dans les empreintes biopsiques a déjà été signalée par

(Cassel-Béraud et al., 1996; Megraud, 1992; Lamouliatte et al, 1992; Megraud,

1996a). Ces auteurs confirment l'intérêt de ce test puis qu’il informe sur

la présence ou l'absence de la bactérie dans l’échantillon.

Par ailleurs, l'examen histologique effectué par l'anatomopathologiste a révélé

dans la plupart des cas la présence des formes incurvées ou spiralées de

H. pylori dans les cryptes et l’épithélium de surface. Cet examen détecte

la présence de H. pylori selon sa morphologie caractéristique et sa localisation

particulière (Megraud, 1994a; De Mascarel et Merlio, 1989). L’intérêt de cette

technique a été confirmé par (de Korwin, 2003; Megraud, 1994a; De Mascarel et

Merlio, 1989). De plus, La présence de H. pylori au niveau de l’épithélium

gastrique met en évidence les rapports de contact entre cette bactérie et les

cellules épithéliales gastriques, site préférentiel de H. pylori et confirme son

appartenance aux bactéries du mucus digestif (Fauchére, 1994a; Lamouliatte et

al., 1992; Missonier et Dorval, 1991).

Toutefois, cette méthode est parfois prise en défaut notamment du fait de

la distribution irrégulière de la bactérie dans l'antre (Bruley Des Varannes, 1996;

Souquet, 1995). Pour cela, la réalisation de biopsies multiples (au moins deux)

Discussion

159

diminue le risque de résultats faussement négatifs sur les biopsies (de Korwin,

2003).

Les méthode morphologiques laissent parfois un doute contrairement à la culture

qui seule permet une identification certaine de la bactérie (Lamouliatte et

al., 1992; Souquet, 1995; Bruley Des Vanannes, 1996). La culture est donc une

méthode diagnostic la plus spécifique et constitue le test de référence le plus

fiable pour affirmer la présence de H. pylori et tester la sensibilité aux

antibiotiques, mais elle nécessite une attention particulière (de Korwin, 2003).

Dans ce contexte, nous avons procédé à l’isolement de H. pylori. Cependant, H.

pylori est une bactérie fragile, difficile à cultiver. Elle est microaérophile,

sensible à la dessiccation et exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et

al., 1992; Megraud, 1992; Lozniewski, 1996). Son isolement exige une

atmosphére microaerobie (système de Campy-pack) et un milieu de culture

enrichi par le sang, le sérum ou l'amidon (Sobhani et al., 1991 ; Fennerty, 1994 ;

Sobhani et al., 1995). La croissance de H. pylori est favorisée en particulier par

l'apport du sang dans le milieu. Ceci a été démontré par l'équipe de Graham en

utilisant un milieu gélosé, enrichi avec 7% de sang de cheval pour traiter

les biopsies gastriques (Hachem et al., 1994). Pour cela, nous avons utilisé des

milieux d’isolement additionnés de sang comme celui de la gélose au chocolat.

De plus, l'utilisation d’un milieu sélectif (milieu pylori) nous a également permis

un isolement sélectif de la bactérie (Megraud, 1989, 1994a).

Une fois la bactérie isolée, nous avons procédé à l’'identification des souches,

qui est fondée sur des caractères morphologiques (macroscopique,

microscopique) et biochimiques (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992 ;

1994a, 1996a). L’aspect particulier de H. pylori facilite son identification

(Megraud, 1992) et ces caractères spécifient l’espèce de H. pylori (Megraud,

1989, 1994a, 1996a, 1996b). Effectivement, les souches de H. pylori isolées

forment de petites colonies grisâtres ou transparentes, luisantes et bombées

rondes et régulières.

Discussion

160

Ces caractères macroscopiques spécifie l’espèce de H. pylori (Medouakh et

Bensoltane, 2010; Medouakh et al., 2010 ; 2006, 2008 ; Megraud, 1989, 1994a,

1996a). De plus, les souches de H. pylori ont montré une mobilité par l’examen

direct à l’état frais. Il s’agit donc de bactéries mobiles et d’après certains auteurs

(Lamouliatte et al., 1992; Monteiro, 1995) cette mobilité est due d’une part à sa

forme spiralée, d’autre part à la présence des flagelles polaires. Cette propriété

permet à H .pylori de se mouvoir dans le mucus gastrique (Lamouliatte et

al., 1992; Fauchére et Roseneau, 1991; Fauchére, 1994a).

D’autre part, le caractère Gram négatif des souches obtenues permet de les

classer parmi les bactéries Gram négative (Megraud, 1994a). De plus, les

souches isolées possèdent des formes cellulaires variables (incurvés, en virgules,

en forme de C, de V ou de S), morphologie particulière de H. pylori (Fauchére,

1994a; Megraud, 1994b).

Quant à l'identification biochimique, les souches de H. pylori isolées possèdent

une oxydase, une catalase et une uréase extrêmement intense. La positivité de

ces trois caractères biochimiques confirment qu’il s’agit bien de H. pylori

(Fauchére, 1994a; Medouakh et Bensoltane, 2010; Medouakh et al, 2010, 2006,

2008; Megraud, 1989; Megraud, 1994a; Sobhani et al., 1991; Yousfi et

al., 1997).

D’après les tests effectués et les résultats obtenus, nous avons pu isoler trois

souches de H. pylori (HP1, HP2, HP3) alors qu’il y’ a des cas où de nombreuses

bactéries sont vues sur frottis coloré au Gram ou sur coupes histologiques, mais

qu’aucune colonie ne pousse sur la gélose. C’est le cas d’une étude qui a été

réalisée à Madagascar où Quinze souches (10,7 %) seulement de H. pylori ont

pu être isolées parmi 140 biopsies malgré la positivité des autres tests de

diagnostic (l’examen cytologique, l’examen cytologique, test à l’uréase)

(Cassel-Béraud, 1996).

L'échec de la culture dans ces conditions peut être traduit selon (Lozniewski,

1996 ; Megraud, 1996a; Yousfi et al., 1997) par la sensibilité de la technique

Discussion

161

extrêmement dépendante des conditions de transport, de stockage et de culture

fournies au laboratoire (mode de culture des prélèvement, milieux spéciaux,

atmosphére microaérobie). En effet, la croissance de H. pylori semble limiter par

la température, le contact avec l'oxygène, la dessiccation, le milieu de transport

et le laps de temps avant de traiter les biopsies (Megraud, 1994g, 1996a; Yousfi

et al., 1997). De plus, la distribution irrégulière de la bactérie dans la muqueuse

gastrique peut influencer l'apparition des colonies dans les milieux de culture et

peut donc contribuer à des résultats faussement négatifs (Yousfi et al., 1997).

Pour cela, certains auteurs ont recommandés la réalisation de plusieurs biopsies

à des sites différents de la muqueuse gastrique, améliorant ainsi le rendement de

la culture (Megraud, 1994a; Yousfi et al., 1997).

En outre, la culture permet de tester la sensibilité de H. pylori aux antibiotiques

(de korwin, 2003 ; Megraud, 2007). Effetivement, les résultats obtenus de

l’antibiogramme des souches de H. pylori isolées vis-à-vis des antibiotiques

habituellement utilisé en thérapie ont révélé la sensibilité de la majorité des

souches aux antibiotiques notamment l’amoxicilline, la tétracycline,

la clarithromycine et la résistance au métronidazole a été observée chez la

plupart des souches étudiées. La sensibilité et la résistance de H. pylori à ces

antibiotiques ont été signalées par plusieurs auteurs (Adeyemi et al., 1999;

Cayla, 1996 ; Fellous, 2009 ; Megraud, 1994c ; 2007; Raymond et al., 2010).

L’étude réalisée en Tunisie chez des enfants infectés par H. pylori a montré une

absence de résistance de H. pylori à l’amoxicilline, un taux de résistance moyen

à la clarithromycine et un taux de résistance élevé au métronidazole (Mazigh et

al., 2005). En Algérie, la résistance de H. pylori à la clarithromycine et au

métronidazole a été évaluée de 12% et 37% respectivement (Burucoa, 2009).

De même, l’étude de la sensibilité de 530 souches de H. pylori collectées à Paris

et à Poitiers a révélé une absence totale de résistance à l’amoxicilline et à la

tétracycline, 26% (138 cas) de résistance à la clarithromycine et 61% (324 cas),

de résistance au métronidazole (Raymond et al., 2010).

Discussion

162

Le chercheur Mégraud a également présenté des résultats similaires au cours

d’une étude européenne sur la résistance de H. pylori aux antibiotiques

(Burucoa, 2009).

La résistance au métronidazole et parfois à la clarithromycine pose de nombreux

problèmes à l’inverse de l’amoxicilline et de la tétracycline, ces antibiotiques ne

donnant qu’exceptionnellement des résistances (de Korwin, 2003).

Cette résistance aux antibiotiques généralement recommandés en thérapie

constitue le principal facteur d’échec des traitement d’éradication, elle doit donc

inciter les gastrologues à ne traiter les malades infectés par H. pylori qu’en

fonction des résultats de test de sensibilité classique (antibiogramme) ou

moléculaire (PCR) et ceci pour un traitement d’éradication efficace de

l’ Helicobacter pylori (Burucoa, 2009 ; Fellous, 2009 ; Raymon et al., 2010).

C’est dans le même contexte que s’est développé la recherche de H. pylori par

la PCR en temps réel. Cette technique moléculaire est une innovation dans

le diagnostic de H. pylori car elle permet non seulement une détection rapide et

précise de H. pylori mais également la détection d’éventuelles mutations de

résistance à la clarithromycine (Megraud, 2007).

Effectivement, l’application de cette technique nous a permis d’une part de

confirmer l’identité des souches de H. pylori isolées par la culture et montrer

d’autre part son appartenance à des souches sauvages (Hp sauvage) sans aucune

mutation de résistance à la clarithromycine conformément au résultat de

l’antibiogramme qui ont montré la sensibilité des souches isolée à

la clarithromycine.

Par ailleurs, cette technique a détecté la présence de H. pylori à partir de

biopsies gastriques ayant montré une absence de H. pylori par la culture.

Cette discordance entre les résultats a également été signalée par Tankovic et

al. (2007) entre les deux Techiques utilisés l’histologie et la PCR en temps

réel. Ces auteurs ont mis en lumière l’intérêt d’utiliser en routine la PCR en

temps réel qui permet de tester facilement la sensibilité à la clarithromycine ou

Discussion

163

ils ont trouvé une prévalence très élevé à la résistance à la clarithromycine

(30%).

De même, l’application de la technique PCR en temps réel par une équipe

espagnole sur 63 biopsies d’enfants, a permis une meilleure détection de

la présence de H. pylori et des mutations qui lui confère la résistance à

la clarithromycine (Burucoa, 2009).

Le test moléculaire PCR en temps réel rend désormais accessible

une détermination rapide et facile de la sensibilité à H. pylori aux antibiotiques.

Il représente une alternative fiable de l’antibiogramme (Buruora, 2009).

Toutefois, l’amplification génique en temps réel n'est pas utilisée en pratique

courante pour l'instant en raison de son coût et de sa complexité, mais elle sera

sans aucun doute la méthode diagnostic du futur (Megraud, 2007 ; Buruora,

2009).

Les discordances constatées, au cours de notre étude entre les résultats des

méthodes de recherches utilisées ont également été observées par Lage et

al. (1995); Cassel-Béraud (1996) ; Cellini et al. (1996); Tonkovic et al. (2007).

Ceci peut être expliqué par l'existence des faux négatifs (absence de

visualisation du germe alors que l'infection est présente), car les méthodes

applicables sur des prélèvements biopsiques sont toutes soumises à l'erreur de

l'échantillonnage du fait de la répartition inégale de H.pylori dans la muqueuse

gastrique (Megraud, 1996c; Altman et al., 1995; Yousfi et al., 1997). Pour cette

raison, il est recommandé de faire plusieurs biopsies à des sites différents de

la muqueuse gastrique (Megraud, 1996c; Yousfi et al., 1997). Certains auteurs

ont proposé de faire un brossage plutôt qu’une biopsie afin d’étudier une plus

grande surface gastrique (Megraud, 1994a). La sensibilité de la technique

utilisée comme celle de la culture peut également fausser les résultats (exliqué

précédemment). De plus, il peut exister des faux positifs (la positivité du test

alors que l'infection est absente) due probablement à une contamination

extérieure.

Discussion

164

La deuxième partie de ce présent travail concerne l’isolement et

la caractérisation des lactobacilles à partir du lait cru de chèvre collecté.

Le lait cru constitue une source intéressante des souches de bactéries lactiques,

dotées de potentialités fermentaire intéressant les industries alimentaires et

pharmaceutiques. Les lactobacilles représentent une part importante dans ce

groupe lactique (Poisson, 2000; Saidi, 2002).

L’isolement de bactéries lactiques essentiellement les lactobacilles du lait cru de

vache, de chèvre et de brebis collectés dans la région de l’Ouest algérien a fait

l’objet de plusieurs travaux de recherche (Cheriguene, 2008; Cheriguene et

al., 2006; 2007 ; Chograni, 2008 ; Kacem et al., 2002, Saidi, 2002, 2007).

A travers cette étude, nous nous sommes intéressés à isoler des lactobacilles du

lait de chèvre. Il est donc important de développer des conditions adéquates qui

permettront d’isoler les lactobacilles. Il s’agit de bactéries exigeantes sur le plan

nutritionnelle et métabolique, leur isolement nécessite des milieux de culture

spécifiques et une atmosphère anaérobie (Deguchi et al., 1992).

En pratique, les techniques d’identification des lactobacilles basées sur

les caractères phénotypiques restent d’une grande utilité (Badis et al., 2005 ;

Khedid et al., 2006). Les résultats obtenus de l’identification des souches de

lactobacilles, basé sur les analyses morphologiques, biochimiques et

physiologiques nous ont permis de caractériser 42 souches de lactobacilles

isolées du lait de chèvre. Ces isolats ont été identifiés au stade du genre et

espèces conformément aux méthodes décrites par (Kandler et Weiss, 1986;

Sharpe, 1979). En outre, cette identification a révélé la présence d’une diversité

en espèces dans le genre de lactobacilles répartie essentiellement entre

Lactobacillus delbrueckii (sp. bulgaricus et sp. lactis ); Lactobacillus

helveticus; Lactobacillus salivarius ; Lactobacillus plantarum ; Lactobacillus

casei (sp. casei et sp. rahmnosus) ; Lactobacillus rhamnosus ; Lactobacillus

paracasei ; Lb. pentosus ; Lactobacillus brevis et Lactobacillus fermentum.

Discussion

165

Ces espèces sont fréquemment isolées des animaux tels que les bovins, les ovins

et les caprins. L’environnement et le climat où vivent ces animaux peuvent jouer

un très grand rôle dans cette diversité (Badis et al., 2005 ; Cheriguene, 2008 ;

Cheriguene et al., 2007; Picque et al., 1992).

Plusieurs auteurs décrivent l’isolement et la caractérisation des lactobacilles à

partir du lait cru et des produits laitiers. En effet, Cheriguene et al. (2007) ont

révélé la présence de lactobacilles (29,40%) parmi 153 souches de bactéries

lactiques isolées du lait de chèvre algérien, renfermant des espèces variés telles

que Lb. delbrueckii sp. bulgaricus, Lb helveticus, Lb. salivarius, Lb.

rhamnosus, Lb paracasei, Lb plantarum, Lb pentosus, Lb. fermentum et Lb

brevis, espèces rencontrées également dans notre présente étude.

Les mêmes chercheurs (2006) ont pu caractériser 28 souches de lactobacilles

parmi 120 bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre collecté dans l’ouest

algérien, et montrer également une diversité en espèces des lactobacilles.

En outre, Badis et al., (2005) ont montré une variétés d’espèces appartenant au

genre Lactobacillus , isolées du lait cru de chèvre de deux population caprines

algériennes . Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans notre

recherche.

D’autre part, des études menées ont montré que les espèces que nous avons

identifiées sont fréquemment isolées du lait cru de vache (Bekhouche et

Boulahraf, 2005), du lait cru de brebis (Chograni, 2008) et du lait cru de

chamelle (Khedid et al., 2006). Ces espèces sont adapté à croitre dans le lait et

les produits laitiers et elles sont généralement importantes dans la production du

lait fermenté et du fromage (Khedid et al., 2006; Kandler and Weiss, 1986).

D’autre part, nous avons noté une présence majoritaire des lactobacilles

mésophiles homofermentaires avec un taux de 45,23% dans les échantillons du

lait traité, Cette constatation a également été faite par Cheriguen et al. (2007)

dans le lait de chèvre étudié. Ceci pourrait être expliqué par le faite que

les animaux à partir desquelles ces bactéries ont été isolées sont plus adaptées au

Discussion

166

condition climatique de ces régions (Khedid et al., 2006 ; Cheriguen et

al., 2007 ; Cheriguene, 2008).

Toutefois, la présence de lactobacilles hétérofermentaire obligatoire représenté

par Lb. brevis et Lb. fermentum dans le lait de chèvre est faible avec un taux de

14,28%. Tornadijo et al., (1995) ont reporté des résultats similaires dans le lait

de chèvre. De même, cette faible présence de ces lactobacilles a été constaté par

Khedid et al., (2006) dans le lait de chamelle collecté au Maroc.

En résumé, Les résultats obtenus lors de cette étude montrent que la majorité des

espèces des lactobacilles isolées sont présentes dans le lait cru de chèvre bien

qu’il pourrait exister des différences au niveau quantitatif et qualitatif, très

probablement en relation avec la différence de la composition physico-

chimiques du lait traité (Jenness, 1982 ; Remeuf et al., 1991 ; Badis et al.,

2005).

Les bactéries lactiques essentiellement les lactobacilles sont connues pour leur

rôles bénéfiques pour la santé humaine en raison de leur propriétés antagonistes

contre les bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori.

L’effet antagoniste constitue une des propriétés majeures des microorganismes

probiotiques (Bouzaine, 2004). Les lactobacilles sont donc capables de produire

lors de leur croissance des substances antimicrobiennes, pouvant ainsi inhiber

le développement des bactéries nuisibles (Piard et Desmazeaud, 1992 ;

Daeschel, 1993). La production d’acide lactique est le caractère le plus exploité

dans ce domaine, mais d’autres produits de métabolisme tels que le peroxyde

d’hydrogène sont également des agents antimicrobiens. Certaines bactéries

lactiques sont par ailleurs susceptibles de synthétiser des substances de natures

protéiques appelées bactériocine (Tagg et al., 1976 ; Dortu et Thonart, 2009

Castro et al., 2010).

Récemment, il est rapporté que les lactobacilles peuvent inhiber la croissance de

H. pylori in vitro et in vivo. Dans cette optique, Nous avons testé in vitro

le pouvoir antimicrobien des souches de lactobacilles isolées du lait de chèvre

Discussion

167

vis-à-vis des souches pathogènes de H. pylori isolées des biopsies gastriques en

utilisant la méthode de la diffusion sur gélose.

En effet, sur la base des résultats obtenus, nous avons remarqué que la majorité

des 42 isolats de lactobacilles ainsi que la souche de référence présentent

une activité antagoniste vis-à-vis des souches pathogènes cliniques de H. pylori,

(H. pylori 1, H. pylori 2, H. pylori 3) et des souches de références HP4 et HP5.

Ceci est expliqué par l’apparition de zones d’inhibition plus ou moins

importante sur le milieu MRS solide. Cependant, le comportement des

lactobacilles testés vis-à-vis de H. pylori varie en fonction des souches.

Des résultats similaires obtenus par Allem et al. (2007) au cours d’une étude

portant sur l’effet antibactérien des souches lactiques sur H. pylori in vitro, ont

montré qu’il existe parfois des différences dans l’activité inhibitrice des souches

lactiques de la même espèce vis-à-vis de H. pylori, ceci peut être du à une faible

homologie de leur acide nucléique.

De même, Ryan et al. (2008) ont montré que parmi 28 souches de Lb. salivarius

testés vis-à-vis de H. pylori, 9 souches seulement ont exprimé leur pouvoir

inhibiteur. D’autre part, les mêmes auteurs ont testé l’activité antibactérienne de

la souche probiotique Lb. salivarius UCC119 contre 6 souches cliniques de

H. pylori et montré que UCC119 capable d’inhiber la croissance toutes

les souches de H. pylori testées (6/6 H. pylori), mais le degré de cette inhibition

varie d’une souche à l’autre.

Bhatia et al. (1989) ont été les premiers à observer l’effet antagoniste des

souches de Lactobacillus contre H. pylori. Depuis, plusieurs études ont été

menées sur le pouvoir inhibiteur des souches de Lactobacillus face aux H. pylori

c’est le cas de Lb. acidophilus (Lorca et al, 2001.), Lb. salivarius (Ryan et al.,

2008); Lb. plantarum (Rokka et al., 2006), Lb. casei (Sgouras et al., 2004.);

Lb. rhamnosus GG (Goldin et al., 1992) et Lb. gasseri (Armuzzi et al., 2001).

Les lactobacilles sont largement utilisés dans la fabrication des produits

fermentés et sont présents en grande quantité dans la flore normale

Discussion

168

gastro-intestinale humaine et animale (Tsai et al., 2004). Ils sont connus, depuis

longtemps pour leurs rôles probiotiques sur la santé humaine et animale parmi

lesquels l’interaction avec le microbiote (flore intestinale) et notamment

l’inhibition de nombreux pathogènes Gram positif et Gram négatif. H. pylori fait

parti de ce groupe de bactéries (Fuller, 1991 ; Sgouras, 2004).

Sgouras et al. (2004) ont montré, in vitro l’effet inhibiteur de la souche

probiotique Lb. casei Shirota, isolée du lait fermenté Yakult (Japan) sur

la souche H. pylori SS1 (Sydney Strain1) et neuf autres souches cliniques de

H. pylori où les diamétres d’inhibition varient de 12,7 à 15,7 mm .

De même, Midolo et al. (1995) ont trouvé 6 souches de Lb. acidophilus ayant

une activité inhibitrice vis-à-vis de H. pylori.

Plusieurs études ont montré l’effet inhibiteur de certaines souches lactiques sur

H. pylori. En effet, des inhibitions ont été constatées par la méthode de diffusion

sur gélose avec les souches de Streptococcus thermophilus, Lb. bulgaricus et Lb.

acidophilus et Bifidobacterium longum ou les diamètres de zone d’inhibition

varie entre 5 mm et 14 mm (Allem et al., 2007).

En outre, l’étude de l’activité antibactérienne de 17 souches de Lactobacillus

appartenant aux différentes espèces contre 10 souches de H. pylori a montré la

capacité de toutes les souches lactiques à inhiber la croissance de H. pylori in

vitro. Rokka et al. (2006) ont également montré in vitro le pouvoir

anti-Helicobacter des souches de Lb. plantarum testées.

Le pouvoir inhibiteur, exercés par les lactobacilles reflète la capacité de ses

souches lactiques de produire des substances antimicrobiennes inhibant la

croissance du pathogène H. pylori. L’effet inhibiteur des lactobacilles pourrait

être principalement dû à deux facteurs. Le premier est la production des acides

organiques essentiellement l’acide lactique, qui est le caractère le plus exploité

dans ce domaine, alors que le deuxième facteur est la production de substance

protéique inhibitrice appelée bactériocine (Larsen et al. 1993; Anderssen et

al., 1998; Avila et al., 2005). De plus, d’autres facteurs tels que la production

Discussion

169

de peroxyde d’hydrogène et les phages pourraient également être responsables

de cette inhibition.

Afin de déterminer la nature de l'agent inhibiteur, nous avons sélectionné

les souches fortement inhibitrices (ayant une zone d’inhibition élevée) parmi

les 43 lactobacilles étudiés, et testé leur pouvoir acidifiant. Ce n’est qu’à partir

des résultats obtenus de la mise en évidence des inhibitions, que nous avons

pu sélectionner les souches inhibitrices. Le choix et la sélection de 14 souches

de lactobacilles a donc été répartit comme suit : Lb. delbrueckii sp.

bulgaricus (LBDB1, LBDB3, LBDB5), Lb. plantarum (LBP1, LBP3),

Lb.rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus (LBH1, LBH2),

Lb salivarius (LBS1, LBS2), Lb casei sp. casei (LBCC1), Lb casei sp.

rhamnosus (LBCR1). Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al. (1977)

qui établit que le tri doit se faire à partir des souches qui présentent le plus

grand effet inhibiteur. D’autre part, la souche de H. pylori2 (HP2) s’est révélé

la souche la plus sensible au pouvoir inhibiteur des lactobacilles, raison pour

laquelle HP2 est choisie comme souche indicatrice.

Le pouvoir acidifiant des souches sélectionnées de lactobacilles est évalué par

la mesure du degré Dornic, qui correspond à la quantité d’acide lactique

produite.

En effet, Les résultats obtenus ont révélé que la majorité des 14 souches de

lactobacilles ont un pouvoir acidifiant important, mais qui varie selon les

espèces et parfois au sein de la même espèce. Le taux d’acidité est légèrement

variable d’une souche à l’autre appartenant à la même espèce. Nos résultats

concordent avec ceux obtenus par Accolas et al. (1980), Cheriguene (2008) et

(Chograni, 2008). Durlu-Ozkaya et al. (2001) ont également montré que

les souches de Lactobacillus diffèrent dans leur capacité à réduire le pH initial

du lait. Il existe une relation étroite entre le pH et le degré Dornic, le pH diminue

Discussion

170

au fur et à mesure que la quantité d’acide lactique augmente, ce qui a été

constaté dans nos résultats.

En revanche, la souche Lb. rhamnosus1 (LBR1) a montré une activité

acidifiante plus élevée, par rapport aux autres espèces de Lactobacillus testées.

Cette constatation a également été signalée par Cheriguene (2008) montrant

ainsi que la souche Lactobacillus rhamnosus 9S3, est parmi les lactobacilles isolée

du lait de chèvre ayant un taux d’acidité le plus élevé. En outre, les résultats obtenus

par Bouzaine (2004) ont montré que les souches appartenant à l’espèce Lb. rhamnosus,

isolées de la microflore intestinale de poulet représentent les souches les plus

acidifiantes produisant une quantité d’acide lactique qui atteint 19g/100 ml.

Ceci nous a mené à penser que le pouvoir acidifiant important exprimé par Lb.

rhamnosus1 (LBR1) pourrait être corrélé à son pouvoir inhibiteur élevé

vis-à-vis de H. pylori.

Les lactobacilles ont généralement un pouvoir d’acidification important

comparativement aux autres genres lactiques tels que les lactocoques (Ayad et

al., 2004; Cogan et al., 1997; Cheriguene, 2008). Cette activité constitue d’une

part un critère technologique essentiel pour la coagulation du lait et donc

la fabrication des produits laitier et d’autre part provoque l’inhibition de

la croissance des germes indésirables.

Dans ce contexte, nous avons déterminé la nature de l’effet inhibiteur des

souches de lactobacilles sélectionné vis-à-vis du pathogène H. pylori. Or, nous

avons remarqué que l’effet antagonique est du dans la majorité des cas à l’acide

lactique produit, facteur responsable de l’inhibition de H. pylori.

En effet, le pouvoir inhibiteur de la plupart des souches de Lactobacillus. sp

testés contre la souche H. pylori a disparu après la neutralisation des surnageants

obtenus des cultures des lactobacilles, ceci a été démontré par la levée totale des

zones d’inhibition, indiquant ainsi l’effet de l’acide produit par cette bactérie.

Cependant, la souche Lb. brevis (LBB1) a montré une diminution de la zone

d’inhibition comparativement au surnageant non traité (témoin). Ceci indique

Discussion

171

qu’un autre facteur autre que l’acide lactique pourrait être impliqué dans cette

inhibition.

Les bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire, principale

caractéristique commune qui sont capables, en métabolisant le lactose de

produire des quantités importantes d’acide lactique, abaissant ainsi le pH et

créant un environnement défavorable au développement des bactéries

pathogènes.

La capacité de produire de l’acide lactique par les bactéries lactiques qui agirait

comme inhibiteur et empêcherait la croissance d’autres bactéries indésirables a

été mis en évidence par plusieurs auteurs (Budde et al., 2003; Cabo et al., 2002).

De même plusieurs travaux ont lié cet effet inhibiteur des bactéries lactiques

vis-à-vis de H. pylori à la production d'acide lactique (Allem et al, 2001, Lorca

et al., 2001; Kabir et al., 1997., Tabak et al., 2007). Ces résultats sont en accord

avec ceux obtenus dans notre étude.

Par ailleurs, d’autres mécanismes d’antagonisme, telles que la production de

bactériocines et le peroxyde d’hydrogène pourrait être impliqué dans l’inhibition

de H. pylori (Vandenbergh, 1993; Coconnier et al., 1998; Hamilton-Miller,

2003). En effet, l’addition de la catalase au surnageant bactérien n’élimine pas

l’inhibition exercée par les lactobacilles. Le peroxyde d’hydrogène n’est donc

pas responsable de l’antagonisme. D’après des auteurs, le peroxyde d’hydrogène

est partiellement responsable de l’antagonisme (Saidi, 2002). En plus, il est

probable que la possession de la catalase chez H. pylori, élimine l’effet de

peroxyde d’hydrogène produit (Allem et al., 2007).

D’autre part, l’effet inhibiteur des lactobacilles n’est pas du à la présence de

bactériophages. Par ailleurs, certains lactobacilles produisent une substance

antimicrobienne de nature protéique appelée bactériocine. il est donc probable

que l’activité antimicrobienne soit une conséquence de la production de

bactériocines (Jack et al., 1995; Piard et Desmazeaud, 1992). La sensibilité aux

Discussion

172

enzymes protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation

(Barefoot et Klaenhammer, 1983; Mehta et al., 1984; Klaenhammer, 1988).

Dans notre cas, l’action des enzymes protéolytique sur les surnageants

bactériens de 13 lactobacilles testés (LBDB1, LBDB3, LBDB5, LBR1, LBR2,

LBH1, LBH2, LBS1, LBS2, LBP1, LBP3, LBCR1, LBCC1) ne lève pas

l’inhibition mais au contraire elle persiste. Ce résultat montre d’une part que

la substance antimicrobienne n’est pas de nature protéique, donc il ne s’agit pas

de bactériocine, d’autre part il confirme que l’acide lactique est le seul facteur

responsable de l’inhibition de H. pylori.

Cependant, chez la souche Lb. brevis (LBB1), l’inhibition est partiellement

levée après le traitement de surnageant bactérien par la pepsine, alors qu’elle

persiste en présence de trypsine et alpha-chymotrypsine.

Puisque les bactériocines sont sensible à au moins à une protéase, il y a une

probabilité pour que l’agent inhibiteur soit de nature protéique, c'est-à-dire une

bactériocine. La substance antibactérienne contenu dans le surnageant de

la souche LBB1 est sensible à la pepsine mais l’inactivation n’est pas totale et

résistante aux deux autres enzymes protéolytiques testées (trypsine et

chymotrypsine). En outre, le deuxième critère qui caractérise généralement

les bactériocines est la thermorésistante. Cependant, le traitement thermique de

surnageant de la souche LBB a révélé la sensibilité de la substance contenu dans

le surnageant entrainant ainsi la perte de l’activité antimicrobienne.

Les bactériocines produites par l’espèce Lb. brevis sont généralement connu

pour leur sensibilité à la majorité des enzymes protéolytiques et leur résistance

au traitement thermique et présente un spectre d’activité centré sur les espèces

phylogénetiquement proche du microorganisme producteur. C’est le cas par

exemple de la brévicine 9296, qui est inactivée par toutes les enzymes

protéolytiques, elle est thermostable et son spectre d’activité est limité sur

les bactéries Gram positive y compris Listeria monocytogenes, par contre

les germes Gram négatif ne sont pas affecté par cette substance inhibitrice.

Discussion

173

Les caractéristiques de la bactériocine produite par Lb. brevis ne correspondent

pas à celles de la substance produite par la souche LBB1. Ceci nous permettra

de conclure qu’il ne s’agit pas de bactériocine. Il est donc possible que

la structure chimique de cette substance pourrait être probablement complexe,

contenant en plus du groupement protéique des entités de nature

polysaccharidique ou lipidique ou, ou autre structure. Cette substance est

produite au cours de la fermentation par Lb. brevis, bactérie hetérofermentaire.

D’après Tagg et al., (1976), le spectre d'activité des bactériocines des bactéries à

Gram+, bien qu'il puisse être variable suivant les souches, ne touche pas

les bactéries à Gram-. La résistance des bactéries Gram- est attribuée à

la barrière que représenterait leur membrane externe (Kalchayanand et al., 1992;

Dortu et Thonart, 2009). Dans le cas où la membrane externe est rendue

perméable, soit par un traitement physique (Kalchayanand et al., 1992), soit par

un traitement chimique (Stevens et al., 1992), les bactéries Gram négatives

deviennent sensibles aux bactériocines. Cette incapacité des bactériocines

d'inhiber les bactéries à Gram négatives a déjà été rapportée

(Broadbent et al., 1989; Chung et al., 1989). D’après Castro et al., (2010),

Coventry et al., (1997) et Noonpakdee et al., (2003), les bactériocines sont

surtout active sur les pathogènes Gram positif alors qu’ils ne sont

pas efficaces contre les bactéries Gram négatives.

H. pylori fait partie des bactéries à Gram négatif raison pour laquelle il n’est pas

affecté par les bactériocines. Ceci a été démontré par plusieurs études montrant

que les bactériocines produites par Lb. plantarum sont active contre plusieurs

bactéries qui lui sont rapproché comme Lactobacillus, Pediococcus,

Leuconostoc, et certains pathogènes tels que Bacillus, Stapphylocoque,

Enterococcus et Listeria, mais elles ne sont actives contre les bactéries Gram

négative comme exemple E. coli et Salmonella. De même, Roka et al., (2006)

ont montré que l’activité anti-Helicobacter de la souche de Lb. plantarum

(MLBPL1) n’est pas due à une bactériocine, mais à une substance active dont

Discussion

174

le poids moléculaire varie entre 3 et 10 KDa. Michetti et al. (1999) qui ont

étudié Lb. acidophilus La1 ont remarqué qu'une autre substance sécrétée non

déterminée, en plus de l'acide lactique a contribué à l'effet inhibiteur observé

chez H. pylori.

D’autre part, une étude réalisé sur l’effet de Lb. salivarius sur H. pylori a révélé

que H. pylori n’est pas sensible aux bactériocine ou bactériocine-like peptides

produites par Lb. salivarius mais à d’autre composé sécrété en petites quantité

(Ryan et al., 2008). Ces résultats rejoignent ceux obtenus dans notre présent.

Sur la base des résultats obtenus, il en ressort que l’inhibition de H. pylori par

les souches de lactobacilles testées sur milieu solide est majoritairement due à

la production de l’acide lactique. Cet effet inhibiteur a également été testé en

milieu liquide sur la souche Lb. rhamnosus1(LBR1), choisie pour son pouvoir

inhibiteur élevé. Effectivement, le surnageant de la souche LBR1 s’est avéré

actif sur H. pylori, ceci s’explique par l’action de la substance inhibitrice

produite par LBR1, contenu dans le surnageant, qui est à l’origine de

la diminution de la viabilité cellulaire de H. pylori. Pour s’assurer que l’agent

inhibiteur soit l’acide lactique, comme il a été démontré en milieu solide,

l’addition de L- acide lactique dans la culture bactérienne de H. pylori a eu

conséquence d’une diminution rapide de la viabilité de H. pylori jusqu'à

l’absence totale de cellules viables. Ceci confirme l’effet inhibiteur de l’acide

lactique, principal composé de surnageant de Lb. rhamnosus. Cette espèce

possède une activité antibactérienne contre des germes pathogènes et non

pathogènes et elle est parmi les souches acidifiantes, produisant une quantité

d’acide lactique de type L (+), qui atteint 19/100ml (Bouzaine, 2004; Narayanan

et al., 20004). Ceci peut expliquer l’effet inhibiteur de Lb. rhamonosus sur

les bactéries pathogènes. Le pouvoir acidifiant important de Lb. rhamnosus

démontré dans notre présente étude pourrait ainsi être lié à l’effet inhibiteur

remarquable de cette souche vis-à-vis de H. pylori.

Discussion

175

Plusieurs études ont attribuées l’activité anti-Helicobacter des lactobacilles à

la production de l’acide lactique (Aiba et al., 1998; Alakomi et al., 2000; Kabir

et al., 1997). En effet, Sgouras et al. (2004) ont montré que le surnageant de la

souche Lb. casei Shirota est capable d’inhiber la viabilité de H. pylori et que

l’acide lactique contenu dans le surnageant est un composé majeur déterminé

par HPLC, et est la cause de cette inhibition. En outre, les mêmes auteurs ont

démontré que l’acide lactique contenu dans le surnageant est capable d’inhiber

l’activité uréasique de H. pylori mais le mécanisme d’inhibition n’est pas encore

clair. Bhatia et al. (1989) ont proposé que l'acide lactique produit sécrété

extracellulairement par Lb. acidophilus soit responsable de l'inhibition de H.

pylori. Des résultats similaires ont rapporté l’inhibition de H. pylori par 17

souches de lactobacilles et montré également que cette inhibition est liée à la

production de l’acide lactique et que 60 mM est suffisante pour inhiber la

croissance de H. pylori (Lorca et al., 2001), ces résultats sont comparables avec

ceux obtenus dans notre présente étude.

De même, Michetti et al. (1999) ont trouvé qu’un surnageant de culture de Lb.

acidophilus est aussi actif que les lactobacilles vivants, un des composé

importants de surnageant est l’acide lactique qui inhibe fortement la croissance

de H. pylori.

Midolo et al. (1995) ont également rapporté l’inhibition de la croissance de H.

pylori par des acides organiques et inorganiques (Acide lactique, acétique et

hydrochlorique) et que l'acide lactique a prouvé la plus grande inhibition. Cette

inhibition est due au pH et la concentration qui sont importants dans l’inhibition

de H. pylori par l’acide lactique in vitro.

En générale, Le degré d’inhibition de H. pylori par le surnageant des

lactobacilles est généralement corrélé à la concentration de L-acide lactique.

Cette concentration de L-acide lactique produit par 12 probiotiques testés

compris les lactobacilles varie de 50 à 156 mmol l-1. (Midolo et al., 1995).

Discussion

176

L'acide lactique est produit en grande quantité au cours du métabolisme des

glucides des lactobacilles inhibe le métabolisme oxydatif et entraine la

diminution du pH intracellulaire, lié aux ions H + important dans l'inhibition de

H. pylori in vitro (Piard et Desmazeaud, 1991).

Par ailleurs, Midolo et al. (1995) ont suggérer qu’il peut exister d’autres

composés extracellulaires produits par ces microorganismes ayant un pouvoir

inhibiteur contre H. pylori. Coconnier et al. (1998) ont montré qu’une substance

thermostable sécrétée par Lb. acidophilus est active contre H. pylori.

Cependant, l’effet de l’acide lactique ou autre agent inhibiteur produit par les

probiotiques dans la muqueuse gastrique reste à élucider.

De plus, il a été démontré que d’autre bactéries probiotiques telles que

Enterococcus faecium (Tsai et al., 2004), Cl. butyricum (Takahashi et al., 2000)

et Bacillus subtilis (Pinchuk, 2001) ont également un pouvoir inhibiteur vis-à-

vis de H. pylori in vitro et in vivo.

Les souches de lactobacilles testées exercent également une activité antagoniste

contre les bactéries pathogènes et présentent un spectre d’activité large

renfermant les bactéries Gram positive telles que St. aureus et B. subtilis et les

bactéries Gram négative comme E. coli, Klebsiella pneumoninae, Salmonella

enteritidis, Pseudomonas aeruginosa. Ce phénomène a déjà été démontré par de

nombreuses études signalant que les bactéries lactiques en générale, et les

lactobacilles en particulier présentent une activité antagoniste intéressante

(Bouzaine, 2004; Dalache, 2006; Bey, 2009 ; Allouche et al., 2010; Anes et al.,

2010; Hwanhlem et al., 2011; Belarbi, 2011). L’inhibition des bactéries

pathogènes s’explique par la capacité des lactobacilles de produire de substances

antibactériennes, responsable de cet effet antagoniste tel que les acides

organiques, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines (Bareffot et

Klahenmmer, 1983; Vandenbergh, 1993; Dambélé et al., 1998).

Les bactéries pathogènes présentent une grande sensibilité pour l’acide lactique

et le peroxyde d’hydrogène. En effet, L’effet antagoniste des lactobacilles contre

Discussion

177

les bactéries pathogènes est attribué d’après plusieurs auteurs à la production de

H2O2 et les acides organiques (Eschenbach et al., 1989; Brashears et al., 1998 ;

Ouwehand, 1998 ; Brashears et Durre, 1999; Malakar et al., 1999).

D’autre part, cette inhibition est due à la forte acidité produite par les

lactobacilles comme observé par Adams et Nicolaides (1997) ; Byaruhanga et

al. (1999) et Hwanhlem et al. (2011), alors que l’effet inhibiteur par les

bactériocines s’exerce surtout sur les bactéries Gram positive (Castro et al.,

2010; Coventry et al., 1997; Piard et Desmazeaud, 1999; Noonpakdee et

al., 2003). Le pouvoir inhibiteur des lactobacilles vis-à-vis des bactéries

pathogènes constitue une des propriétés importantes des probiotiques.

Les lactobacilles sont connus pour leur grande résistance aux pH acides (jusqu’a

un pH voisin de 3.5). Contrairement aux autres genres bactériens qui sont plus

sensibles (Adams et Hall, 1988; Wong et Chen, 1988). Ils peuvent résister à des

concentrations élevées de l’acide et sont parmi certaines bactéries qui peuvent

adhérer et survivre dans l’estomac humain (Goldin et al., 1992).

Les lactobacilles sont alors considérer comme des probiotiques, non seulement

parce qu’ils ont un effet antagoniste vis-à-vis des bactéries pathogènes, une des

propriétés majeures des microorganismes probiotiques, mais également parce

qu’ils sont résistants au stress causé par les sucs gastrique et biliaire lors de leur

passage dans le tractus gastrointestinal. En outre, les lactobacilles présentent

certaine propriété d’adhésion, qui en rentrant en compétition avec

les pathogènes in vivo par la production des composés inhibiteurs, colonisent

la surface de la muqueuse épithéliale, raison pour laquelle leur application

fréquente dans la prévention et le traitement des infections bactériennes

(Tannock, 1999 ; Armuzzi et al., 2001; Lorca et al., 2001 ; Bouzaine, 2004;

Tsai, 2004). Plusieurs études ont montré que l’administration d’un lait fermenté

contenant de lactobacilles (Lb. acidophilus) entraine une diminution du taux de

H. pylori et exerce à long terme un effet partiel sur l’éradication de l’infection

à H. pylori (MRDA et al., 1998 ; Michetti et al., 1999; Sgouras et al., 2004).

Discussion

178

L’activité anti-Helicobacter des souches de lactobacille, utilisées dans

les produits laitiers a été rapporté dans plusieurs études in vitro et les résultats

cliniques sont encourageants in vivo (Hamilton-Miller, 2003).

Par conséquent, les lactobacilles pourraient être exploités et utilisés comme un

potentiel agent adjuvant thérapeutique pour l’éradication de l'infection à

H. pylori après l’échec du traitement par les antibiotiques. La consommation des

probiotiques pourrait donc être une alternative thérapeutique au traitement de

l’infection à H. pylori dans le futur proche.

Conclusion

179

Conclusion

Récemment, l’attention est portée sur l’interaction entre H. pylori et les bactéries

lactiques, particulièrement les lactobacilles, qui sont reconnus pour leur rôle

probiotique en raison de leur innocuité chez l’homme et leur propriété

antagoniste contre les bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori.

Le but de ce présent travail est de tester in vitro le pouvoir inhibiteur des

lactobacilles isolés de lait cru de chèvre vis-à-vis de H. pylori isolés des biopsies

gastriques.

La mise en évidence de H. pylori a été effectuée par des méthodes invasives

nécessitant la réalisation des biopsies gastriques humaines, parmi lesquelles,

nous citons le test rapide à l’uréase, l’examen cytologique, l’examen

histologique, la culture et l’amplification génique PCR en temps réel.

Quoique, nous avons parfois remarqué une discordance entre les résultats.

Ceci est éventuellement du à l’erreur de l’échantillonnage ou à la sensibilité de

la technique utilisée.

La culture reste la méthode diagnostic de référence car elle permet d’une part un

isolement de H. pylori et une identification précise et certaine de la bactérie, et

d’autre part l’étude de la sensibilité aux antibiotiques pour un traitement efficace

permettant l’éradication de H. pylori. Cependant, la sensibilité de cette

technique est extrêmement dépendante des conditions de transport des biopsies

et de culture fournis au laboratoire.

La PCR en temps réel est une innovation dans le diagnostic de H. pylori

parce qu'elle permet non seulement une détection rapide et précise de H. pylori

mais également la détection des mutations qui sont associées à la résistance aux

antibiotiques sans demander des conditions strictes de transport. Elle représente

une alternative fiable de l’antibiogramme et reste une méthode d’avenir.

En revanche, l’identification des lactobacilles isolés du lait de chèvre a été faite

sur la base de leurs caractères morphologiques, biochimiques, et physiologiques.

Conclusion

180

Les critères phénotypiques restent encore importants aujourd’hui pour la

classification des lactobacilles.

Les lactobacilles sont connus depuis des décennies pour leur capacité à protéger

l’homme contre les bactéries pathogènes. Ce pouvoir antimicrobien exercé par

les lactobacilles est généralement due à la production des substances

antimicrobiennes telles que les 'acides organiques, le peroxyde d'hydrogène, et

les bactériocines.

Il a été démontré in vitro, que la majorité des Lactobacilles testés ont un pouvoir

antimicrobien vis à vis de la bactérie pathogène H. pylori et que l’agent impliqué

dans cette inhibition est majoritairement du l’acide lactique.

En effet, les lactobacilles peuvent résister à des concentrations élevées de l’acide

et sont parmi peu de bactéries qui peuvent adhérer et survivre dans l’estomac

humain, site généralement hostile aux bactéries et préférentiel aux Helicobacter,

et exercer ainsi leur pouvoir inhibiteur sur H. pylori, raison pour laquelle leur

utilisation comme probiotique est recommandée dans la prévention de

l’infection à H. pylori.

Les lactobacilles pourraient donc être exploité et utilisé comme un agent

adjuvant thérapeutique pour éradiquer l'infection à H. pylori après l’échec du

traitement par les antibiotiques.

Perspectives

181

Perspectives

Les résultats de notre recherche permettent d’ouvrir de nouvelles perspectives notamment :

-Développement des moyens diagnostiques non invasifs comme le test respiratoire pour le dépistage de l’infection à H. pylori et le contrôle de l’éradication de H. pylori après la thérapie. -Développement de la biologie moléculaire (PCR) qui représente un examen d’appoint important en infectiologie moderne sans recours à la fibroscopie et qui permettrait la détection des souches résistantes de H. pylori. -Identification moléculaire des souches de lactobacilles isolées. -Mise en évidence de l’acide lactique par chromatographie HPLC. -Etude du potentiel probiotique des souches de lactobacilles isolées, particulièrement la souche Lb. rhamnosus. -Application des essais cliniques par l’administration des lactobacilles à des sujets infectés par H. pylori.

Références bibligraphiques

182

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Milieu MRS (MAN, ROGOSA et SHARPE, 1962) Peptone 10 g Extrait de viande 10 g Extrait de levure 5 g Acétate de sodium 5 g K2HPO4 2 g Citrate d’ammonium 2 g MgSO4 7H2O 0,2 g MnSO4, 4H2O 0,05 g Glucose 20 g Tween 80 1 ml Eau distillée 1000 ml (+15g agar si le milieu gélosé).

pH = 6,2 Solution de Ringer (g/l) NaCl 2.25 g CaCl2 0.12 g KCl 0.105 g NaCO3 0.5 g pH= 7 Lait écrémé (Milieu de conservation) Lait en poudre 12.5 g Eau distillée 100 ml Glycérol 15 ml Répartir dans des tubes a raison de à.10 ml et autoclaver à 121°C pendant 10 min. Eau physiologique Chlorure de sodium 9 g Eau distillée 1000 ml Autoclavage à 120°C pendant 20 mn. Milieu de Kempler et Mc.Kay (1980) Extrait de levure 3 g Peptone 10 g Glucose 5 g Agar 15 g Eau distillée 1000 ml pH = 6,6

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Le milieu est repartit à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 20 mn à 120° C, au moment de l’emploi en ajoute : 1 ml d’une solution aqueuse de ferrocyanure de potassium à 10%. 1 ml d’une solution aqueuse à 2,5 % de citrate ferrique et citrate de sodium. Ces deux solutions stérilisées par filtration sont conservées à l’obscurité à 4° C. Gélose à l’esculine (g/l) (Guiraud, 1998) Peptone trypsique de caséine 10 Extrait de levure 5 Acétate de sodium 5 Tween 80 1 Sulfate de manganèse 0.05 Sulfate de magnésium 0.2 Esculine 5g Citrate de fer ammoniacal 0.5g Agar 15g Eau pH 6.5 Moeller (décarboxylases-bouillon) (Guiraud, 1998) Peptone 5g Extrait de viande de bœuf 5g Pourpre de bromocrésol 0.1g Rouge de crésol 5mg Pyridoxal 5mg Glucose 0.5 pH 6.0 Mettre en suspension 10.5 g de poudre dans 1L d’eau distillée. Ajouter 1 ml à 1% de L-arginine. Si nécessaire, réajuster le ph après l’addition des acides aminés. Préparer des tubes sans amino-acide qui serviront de contrôle. 1- Milieu Urée-indole : milieu commercialisé, prêt à l’emploi (Marchal et al., 1991). L-tryptophane 3g Phosphate monopotassique 1g Phosphate bipotassique 1g NaCl 5 Urée 20g Rouge de phénol à 1% 0.025g Alcool à 95% 10ml Eau distillée 1000ml pH 6,7

Campylobacter microaerophilic system : DIFCO (Marchal et al., 1991). Ce système est utilisé pour la génération de H2 et CO2 dans une jarre d’anaérobiose standard Chaque enveloppe de Campy pack contient des comprimés de borohydride de sodium, acide

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tartarique et bicarbonate de sodium, produisant une atmosphère contenant approximativement 5% d’oxygène et 10% de CO2. Couper l’angle du sachet générateur d’H2 et CO2. Le placer en position verticale à l’intérieur de la jarre. Introduire 10 ml d’eau dans l’enveloppe. Mettre le couvercle en place et placer la jarre à l’étuve.

Milieu gélose au sang (gélose chocolat) (Marchal et al., 1991) Le milieu Columbia de base pour gélose au sang est commercialisé déshydraté ou prêt à l’emploi (bioMerieux). Il convient à la culture des germes exigeants. Sa formule est la suivante : Infusion de cœur et de muscle 375g Bio-Thione 10g Chlorure de sodium 5g Grélose 15g Eau distillée 1000ml pH 7.3 Mettre le milieu de base à fondre au bain-marie bouillant jusqu’à la liquéfaction complète du milieu. Refroidir le milieu à 45-50°C. Additionner 10% de sang de cheval ou de mouton défribriné stérile à la gélose fondue. Après homogénéisation par rotation, les flacons sont portés à 10min au bain-marie à 75-80°C, tout en agitant, jusqu’à l’obtention d’une teinte chocolat. Couler en boite de Pétri.

Milieu sélectif à base de Wilkins Chalgren (Marchal et al., 1991). La gélose de Wilkins Chalgren, commercialisée sous forme déshydratée (Oxoid), permet la croissance de bactéries exigeantes. Sa formule (en g/l) est la suivante : Tryptone 10 Peptone de gélatine 10 Extrait de levure 5 Glucose 1 Chlorure de sodium 5 L-arginine 1 Pyruvate de sodium 1 Ménadione 0.0005 Hémine 0.0005 Gélose 10 pH 7.1 Mettre en suspension 43g de poudre dans un litre d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète puis autoclaver 15min à 120°C, puis additionner les antibiotiques (10mg/l de Vancomycine, 5mg/l de cefsulodine, 100mg/l de cycloheximide ) et 10% de sang de

cheval ou de mouton stérile ou. Le milieu est homogénéisé avant d’être coulé dans les boites de

Pétri stériles.

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Bouillon cœur-cervelle (BHIB) (Marchal et al., 1991) Ce milieu est particulièrement adapté à la croissance des germes exigeants. Sa composition (en g/l) est la suivante : Infusion de cervelle de veau 12.5 Infusion de cœur de bœuf 5 Peptone trypsique 10 Chlorure de sodium 5 Phosphate disodique 2.5 Glucose 2.0 pH 7.4 cœur-cervelle gélosé (BHI-agar) Il s’agit du milieu précédent (BHIB) contenant 15 g/l d’agar. Bouillon Brucella Tryptone 10 Peptone pepsique de viande 10 Extrait de viande 2 Glucose 1 Chlorure de sodium 5 Bisulfite de sodium 0.1 pH 7 Mueller-Hinton (pour l’antibiogramme) (Marchal et al., 1991). Extrait de viande 2 Hydrolysat acide de caséine 17,5 Amidon 1.5 Gélose 10 PH 7.4 Bouillon glycérol peptone (conservation de H. pylori) Glycérol 50 ml Peptone 2 g NaCl 1 g Eau distillée 150 ml pH 7.2

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Détection AND 23S Helicobacter pylori par PCR en temps réel Mélange réactionnel

HpyA et HpyS: Amorces 23S HpyRED et Anchor FL : Sondes fluorescentes Enzyme : Taq polymérase ADN : échantillon de l’ADN de H. pylori (test) ou échantillon de l’ADN témoin (positif ou négatif) 2 témoins positifs : séquence ADN sauvage et séquence d’ADN muté (résistant à la clarithromycine) Témoin négatif : absence d’ADN

Eau MgCl2 HpyA (20µM HpyS (20 µM) HpyRED (20µM) Anchor FL (20µM) Enzyme

5.28 0.64 0.16 0.16 0.08 0.08 0.80

Volume final 7.2 µl

ADN 0.8 µl

pour obtenir le diplôme de docteur es sciences en...

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