polymorphisme du gène de la glucose-6-phosphate ... · thèse de doctorat unique ouattara abdoul...

UNIVERSITE OUAGA I Pr Joseph KI-ZERBO ---------------

École Doctorale Sciences et Technologies

--------------- Laboratoire de Biologie et de Génétique

Moléculaires (LABIOGENE)

Thèse de Doctorat Unique (PhD)

Présentée par

OUATTARA Abdoul Karim

Pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Ouaga I Professeur Joseph KI-ZERBO

Option : Sciences Appliquées

Spécialité : Biologie Moléculaire/Génétique

Polymorphisme du gène de la Glucose-6-phosphate

déshydrogénase et contrôle génétique des formes

asymptomatique et symptomatique de l’infection à

Plasmodium falciparum au Burkina Faso

Soutenue le, 07 Mars 2017 devant le jury composé de :

Président : David MODIANO, Professeur Titulaire, Université de Rome I, La Sapienza

Membres :

Simon A. AKPONA, Professeur Titulaire, Université de Parakou, Bénin (Rapporteur)

Jean Didier ZONGO, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (Rapporteur)

Yves TRAORE, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO

Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (Directeur de thèse)

Simplice Damintoti KAROU, Maître de conférences, Université de Lomé, Togo

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim i

DEDICACES

Je dédie ce travail :

A mon père Souleymane OUATTARA et à ma mère Biba DOUMBIA

A mes frères et sœur Ramata, Cheick Ahmed et Sehnia Kahdyatou

A mes cousins Diakalia OUATTARA et Tchèdjan TRAORE

Madeleine TRAORE, Léa pépin GARANE, Jocelyne

OUATTARA

tous ceux ou toutes celles qui ont accepté librement et

volontairement de participer à cette étude

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim ii

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE de

l’UFR-SVT), au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) et à l’Hôpital

Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO).

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à mon Directeur de thèse, le Pr Jacques

SIMPORE, Professeur titulaire de Biologie moléculaire et de génétique (Université Ouaga

I Pr Joseph KI-ZERBO) Responsable du Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique

(LABIOGENE) labélisé Centre d’Excellence UEMOA, Directeur du Centre de Recherche

Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) érigé en Laboratoire National de Référence pour le

HPV (LNR-HPV), Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin (USTA), Officier de l’ordre

National, Officier des Palmes Académiques, Chevalier international des Palmes Académiques du

CAMES, Membre de l’Académie Africaine des sciences, des arts et des lettres du Burkina Faso,

Membre de l’Académie Africaine des Sciences (AAS); Membre du Comité d’éthique et de

déontologie du CAMES. Merci pour ce thème de recherche pertinent que vous m’avez proposé,

pour votre encadrement exceptionnel, vos précieux conseils, vos encouragements et votre

disponibilité malgré vos multiples fonctions ;

Je remercie le Pr David MODIANO (Rapporteur), Professeur titulaire de

parasitologie (Université de Rome I, La Sapienza), pour avoir accepté de lire, critiquer, instruire

et présidé le jury de cette Thèse. Merci pour votre contribution à l’amélioration de ce document.

Trouvez ici l’expression de toute ma gratitude.

Je remercie le Pr SIMON A. AKPONA (Rapporteur), Professeur titulaire de

Biochimie (Université de Parakou, Bénin), pour avoir accepté d’instruire et de faire partie du

jury de cette thèse. Vous avez accepté de suivre et de juger ce travail malgré vos multiples

occupations. Recevez toute notre profonde gratitude.

Je remercie le Pr Jean-Didier ZONGO (Rapporteur), Professeur titulaire de

génétique et amélioration des plantes (Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO), pour avoir

accepté de lire, critiquer et instruire et de faire partie du jury pour juger cette Thèse. Merci pour

votre contribution à l’amélioration de ce document. Trouvez ici l’expression de toute ma

gratitude.

Je remercie le Professeur Yves TRAORE, Professeur Titulaire en Immunologie

(Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO), pour avoir accepté de faire partie du jury. Vous avez

accepté de suivre et de juger ce travail malgré vos multiples occupations. Recevez toute notre

profonde gratitude.

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim iii

Je remercie le Dr Simplice Damintoti KAROU, Maître de Conférences en

Biochimie-Microbiologie (Université de Lomé, Togo), pour avoir accepté de faire partie du

jury. Vous avez accepté de suivre et de juger ce travail malgré vos multiples occupations. Recevez

toute notre profonde gratitude.

Je remercie les Dr Diane Djénéba OUERMI, Wenkuuni Florencia DJIGMA, Issoufou

TAO, Théodora Mahoukèdè ZOHONCON, Tegwindé Rébéca COMPAORE, Birama

DIARRA pour leurs contributions à l’amélioration de la qualité de ce document et

particulièrement le Dr Cyrille BISSEYE pour son soutien inconditionnel, sa compréhension et

ses encouragements pendant toutes ces années ;

Je remercie le Père Albert Théophane YONLI, Rémy MORET, Bapio Valérie Jean

Télesphore Elvira BAZIE, Pouiré YAMEOGO et toute l’équipe du CERBA/LABIOGENE et de

l’HOSCO, pour leur disponibilité lors de la collecte de nos échantillons.

Je remercie Ragnagnewendé Serge Théophile SOUBEIGA, Maléki ASSIH, Lassina

TRAORE, Damehan TCHELOUGOU et tous les camarades du Master de BioGeMA toute

promotion confondue pour leurs soutiens lors des manipulations et/ou pendant la rédaction

de cette thèse ainsi que pour les remarques et suggestions constructives à chaque fois que c’était

nécessaire.

La réalisation de l’ensemble des travaux de la présente thèse a été rendue possible grâce

à l’appui financier de la Bourse Nationale Burkinabè de 3ème cycle octroyée par le Centre

national de l’Information, de l’Orientation Scolaire et Professionnelle et des Bourses (CIOPB)

et des partenaires techniques et financiers du CERBA.LABIOGENE à savoir :

L’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine (UEMOA) à travers son programme

d'appui et de développement des centres d'excellence régionaux et son soutien à la formation et

la recherche de l’excellence. Que ces donateurs soient assurés de mes sincères remerciements.

La Conférence Épiscopale Italienne (C.E.I.) pour le soutien financier dans l’achat des

multiples réactifs pour les travaux de cette thèse.

A tous mes camarades, frères et amis pour vos encouragements et votre indéfectible

soutien. Merci à tous !

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim iv

TABLE DES MATIERES

DEDICACES .............................................................................................................................. i

REMERCIEMENTS .................................................................................................................. ii

TABLE DES MATIERES ........................................................................................................ iv

LISTE DES FIGURES .............................................................................................................. ix

LISTE DES TABLEAUX ......................................................................................................... xi

SIGLES ET ABREVIATIONS ................................................................................................ xii

RESUME ................................................................................................................................. xiv

ABSTRACT ............................................................................................................................ xiv

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1

OBJECTIFS DE LA THESE ..................................................................................................... 4

Objectif principal .................................................................................................................... 4

Objectifs spécifiques ............................................................................................................... 4

CHAPITRE I : GENERALITES SUR LE PALUDISME ......................................................... 5

I.1 Définition et Historique ........................................................................................................ 5

I.1.1 Définition ....................................................................................................................... 5

I.1.2 Historique ....................................................................................................................... 5

I.2 Epidémiologie du paludisme ................................................................................................. 6

I.2.1 Estimations mondiales .................................................................................................... 6

I.2.2 Répartition géographique ............................................................................................... 7

I.3 Cycle de vie de Plasmodium falciparum .............................................................................. 8

I.3.1 Le vecteur ....................................................................................................................... 8

I.3.2 L’agent pathogène .......................................................................................................... 9

I.3.3 Phase asexué chez l’homme ......................................................................................... 10

I.3.4 Phase sexuée chez le moustique ou sporogonie ........................................................... 13

I.4 Aspect génétique de Plasmodium falciparum ..................................................................... 14

I.4.1 Organisation du génome ............................................................................................... 14

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim v

I.4.2 Architecture nucléaire des gènes var ............................................................................ 14

I.5 Manifestations cliniques du paludisme ............................................................................... 16

I.5.1 Accès palustre simple ................................................................................................... 17

I.5.2 Accès palustre grave ..................................................................................................... 17

I.5.3 Physiopathologie du paludisme .................................................................................... 17

I.6 Paludisme et immunité ........................................................................................................ 21

I.7 Prise en charge thérapeutique ............................................................................................. 22

I.7.1 Les traitements antipaludiques ..................................................................................... 22

I.7.2 Résistances aux médicaments antipaludiques .............................................................. 22

I.7.2.1 Facteurs liés à la résistance aux antipaludiques ..................................................... 23

I.7.2.2 Les marqueurs moléculaires de résistance ............................................................. 24

I.8 Paludisme et vaccin ............................................................................................................. 26

I.9 Diagnostic biologique du paludisme ................................................................................... 28

I.9.1 Diagnostic microscopique direct par frottis sanguin et goutte épaisse ........................ 28

I.9.2 Détection d’Antigènes palustres par tests Rapide d’Orientation diagnostic (TROD) . 29

I.9.3 Détection des acides nucléiques par les techniques d’amplification génique .............. 29

CHAPITRE II : HEMOGLOBINOPATHIES ET DEFICIT EN G-6-PD ............................... 30

II.1 Les hémoglobinopathies .................................................................................................... 30

II.1.1 Définitions ................................................................................................................... 30

II.1.2 L’hémoglobinose S ..................................................................................................... 31

II.1.2.1 Epidémiologie ...................................................................................................... 31

II.1.2.2 Physiopathologie .................................................................................................. 32

II.1.3.3 Rapport entre l’hémoglobine S et le Paludisme ................................................... 34

II.1.4 L’hémoglobine C ........................................................................................................ 35

II.1.4.1 Epidémiologie ...................................................................................................... 35

II.1.4.2 Physiopathologie .................................................................................................. 35

II.1.4.3 Rapport entre l’hémoglobine C et le Paludisme ................................................... 36

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim vi

II.1.5 Les techniques de diagnostic des hémoglobines anormales ....................................... 37

II.1.5.1 Les techniques d’électrophorèse et de chromatographie ...................................... 37

II.1.5.2 Les techniques de biologie moléculaire ............................................................... 37

II.2 Le déficit en G-6-PD ......................................................................................................... 38

II.2.1 Définition .................................................................................................................... 38

II.2.2 Historique .................................................................................................................... 38

II.2.3 Epidémiologie ............................................................................................................. 39

II.2.4 Manifestations cliniques ............................................................................................. 41

II.2.5 Aspects génétiques ...................................................................................................... 42

II.2.6 Polymorphismes de la G-6-PD ................................................................................... 43

II.2.7 Rôle de la glucose-6-phosphate déshydrogénase ........................................................ 45

II.2.8 Déficit en G-6-PD et paludisme .................................................................................. 47

II.2.9 Techniques de diagnostic de la déficience en G-6-PD ............................................... 48

II.2.9.1 Génotypage par PCR/RFLP ................................................................................. 49

II.2.9.2 Génotypage par PCR en temps réel ...................................................................... 49

CHAPITRE III. MATERIEL ET METHODES ...................................................................... 50

III.1 Cadre d’étude ................................................................................................................... 50

III.2 Sites de collecte ................................................................................................................ 50

III.3 Méthodologie de la première étude .................................................................................. 51

III.3.1 Type et période d’étude ............................................................................................. 51

III.3.2 Population d’étude ..................................................................................................... 51

III.3.3 Echantillonnage ......................................................................................................... 52

III.3.3.1 Taille de l’échantillon ......................................................................................... 52

III.3.3.2 Prélèvements sanguins ........................................................................................ 52

III.3.4 Analyses biologiques ................................................................................................. 53

III.3.4.1 La numération formule sanguine ........................................................................ 53

III.3.4.2 L’électrophorèse de l’hémoglobine .................................................................... 53

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim vii

III.3.5 Recherche des mutations responsables de la déficience en G-6-PD ......................... 54

III.3.5.1 Extraction de l’ADN ........................................................................................... 54

III.3.5.2 Génotypage par PCR en temps réel .................................................................... 55

III.3.5.3 Génotypage par PCR-RFLP ................................................................................ 56

III.4 Méthodologie de la deuxième étude ................................................................................. 58

III.4.1 Type et période d’étude ............................................................................................. 58

III.4.2 Population d’étude ..................................................................................................... 58

III.4.3 Echantillonnage ......................................................................................................... 58

III.4.3.1 Taille de l’échantillon ......................................................................................... 58

III.4.3.2 Prélèvements ....................................................................................................... 58

II.4.4 Détection de Plasmodium falciparum ......................................................................... 59

III.4.4.1 Le TROD SD Bioline Malaria Ag P.f/Pan .......................................................... 59

III.4.4.2 La goutte épaisse ................................................................................................. 59

III.4.5 Analyses biologiques ................................................................................................. 60

III.4.5.1 La numération formule sanguine ........................................................................ 60

III.4.5.2 L’électrophorèse de l’hémoglobine .................................................................... 60

III.4.6 Recherche des mutations responsables de la déficience en G-6-PD ......................... 61

III.4.6. 1 Extraction de l’ADN ....................................................................................... 61

III.4.4.2 Le génotypage par PCR classique ....................................................................... 61

III.6 L’analyse statistique ......................................................................................................... 64

III.7 Les considérations éthiques .............................................................................................. 64

CHAPITRE IV : RESULTATS ............................................................................................... 65

IV.1 Résultats des travaux de la première étude ...................................................................... 65

IV.1.1 Contexte et but de la première étude ......................................................................... 65

IV.1.2 Objectif de l’étude ..................................................................................................... 65

IV.1.3 Marqueurs génétiques et paludisme asymptomatique ............................................... 65

IV.1.3.1 Caractéristiques socio-démographiques ............................................................. 65

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim viii

IV.1.3.2 Prévalence de la déficience en G-6-PD et des génotypes de l’hémoglobine ...... 66

IV.1.3.3 Corrélation entre les polymorphismes des gènes G-6-PD et HBB et le paludisme

asymptomatique ................................................................................................................ 68

IV.1.3.4 Conclusion partielle ............................................................................................ 71

IV.2 Résultats des travaux de la deuxième étude ..................................................................... 72

IV.2.1 Contexte et but de la deuxième étude ........................................................................ 72

IV.2.2 Objectif de la deuxième étude ................................................................................... 72

IV.2.3 Marqueurs génétiques et paludisme symptomatique ................................................. 72

IV.2.3.1 Caractéristiques sociodémographiques et cliniques ........................................... 72

IV.2.3.2 Prévalence du déficit en G-6-PD et des génotypes de l’hémoglobine ................ 73


symptomatique .................................................................................................................. 74

CHAPITRE V : DISCUSSION GENERALE .......................................................................... 76

V.1 Marqueurs génétiques et Paludisme asymptomatique ................................................... 76

V.2 Marqueurs génétiques et Paludisme symptomatique ..................................................... 80

Conclusion générale .............................................................................................................. 84

Perspectives .............................................................................................................................. 85

VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................... 86

ANNEXES ............................................................................................................................... 88

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim ix

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Fréquence des différents SNPs G-6-PDA- en Afrique ............................................. 2

Figure 2 : Différentes zones de transmission du paludisme dans le monde .............................. 6

Figure 3 : Anopheles gambiae ................................................................................................... 9

Figure 4 : Processus d’infection des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium ........... 11

Figure 5 : Processus d’invasion des érythrocytes par les mérozoïtes de Plasmodium falciparum

.................................................................................................................................................. 12

Figure 6 : Cycle de vie de Plasmodium falciparum ................................................................ 13

Figure 7 : Organisation des gènes var de Plasmodium falciparum ......................................... 15

Figure 8 : Caractéristiques des gènes var ................................................................................ 16

Figure 9 : Les bases moléculaires de la cytoadhérence ........................................................... 18

Figure 10 : Séquestration des hématies parasitées .................................................................. 19

Figure 11 : L’antigène vaccinal RTS,S. .................................................................................. 28

Figure 12 : Distribution mondiale de l’hémoglobine S ........................................................... 32

Figure 13 : Mécanisme physiopathologique de base de la drépanocytose. ............................. 33

Figure 14 : Répartition de l’hémoglobine C dans le monde .................................................... 35

Figure 15 : Prévalence du déficit en G-6-PD et distribution mondiale des différents variants

déficitaires ................................................................................................................................ 40

Figure 16 : Organisation du gène G-6-PD humain .................................................................. 42

Figure 17 : Expression de la déficience en G-6-PD chez les hommes (A) et inactivation

aléatoire du chromosome X chez les femmes (B). ................................................................... 43

Figure 18 : Répartition des mutations fréquentes le long de la séquence codante du gène G6PD

.................................................................................................................................................. 45

Figure 19 : Rôle de la G-6-PD dans la prévention du stress oxydatif ..................................... 46

Figure 20 : Relation triangulaire entre la primaquine, la G-6-PD et Plasmodium falciparum 47

Figure 21 : Situation géographique de Koubri et différents districts sanitaires de la ville de

Ouagadougou adapté de ........................................................................................................... 51

Figure 22 : Automate CELL-DYN Ruby ................................................................................ 53

Figure 23 : Appareil d’électrophorèse de type HELENA ....................................................... 54

Figure 24 : Appareil 7500 Fast Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA) ........... 55

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim x

Figure 25 : Thermocycleur GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA) ......... 57

Figure 26 : Une goutte épaisse ................................................................................................ 59

Figure 27 : Automate ABX micro 60 ...................................................................................... 60

Figure 28 : Cuve et générateur pendant la migration .............................................................. 61

Figure 29 : Dispositif d’électrophorèse des amplicons G-6-PD (BioRad, USA).................... 62

Figure 30 : GENEFLASH ....................................................................................................... 63

Figure 31 : Table d’interprétation des bandes après l’électrophorèse sur gel d’agarose ........ 64

Figure 32 : Résultats du génotypage de la mutation G202A par PCR en temps reel .............. 66

Figure 33 : Fragments G680T et T968C après amplification PCR ......................................... 67

Figure 34 : Les différentes bandes après l’électrophorèse ...................................................... 73

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim xi

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Classification OMS des variants enzymatiques de la G-6-PD ............................. 41

Tableau II : Prévalence des 4 combinaisons de mutations responsables de la déficience en G-

6-PD ......................................................................................................................................... 67

Tableau III : Répartition des génotypes de l’hémoglobine selon l’âge, le sexe et le statut G-6-

PD ............................................................................................................................................. 68

Tableau IV : Prévalence de l’infection à Plasmodium falciparum et moyenne géométrique de

la parasitémie chez les personnes infectées en fonction de la déficience en G-6-PD .............. 70

Tableau V : L’effet des génotypes de l’hémoglobine sur l’infection à Plasmodium falciparum

.................................................................................................................................................. 71

Tableau VII : Caractéristiques de la population d’étude selon les génotypes HBB et fréquence

des allèles HbS et HbC ............................................................................................................. 74

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim xii

SIGLES ET ABREVIATIONS

µL : Microlitre

ADN : Acide Désoxyribonucléotide

AM-L : Artéméther-Lumefantrine

AQ : Amodiaquine

AS : Artésunate

CCMH : Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine

CEI : Conférence Episcopale Italienne

CERBA : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni

CIDR : Cysteine-rich Interdomain Region

CIOSPB : Centre national de l’Information, de l’Orientation Scolaire et Professionnelle et des Bourses

CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance

CR : Récepteur de Complément

CS : Circumsporozoïte

CSA : Chondroïtine Sulfate

CSPS : Centre de Santé Primaire et de Promotion Sociale

DARC : Duffy Antigen Receptor for Chemokines

DBL : Duffy binding Like

DC : Domaine Cassette

dL : Décilitre

ED/ST : Ecole Doctorale/Sciences et Technologies

EPCR : Endothelial Protein C Receptor

G-6-PD : Glucose-6-phosphate déshydrogénase

GPI : Glycosylphosphatidylinositol

GR : Globule Rouge

Hb : Hémoglobine

HOSCO : Hôpital Saint Camille de Ouagadougou

HS : héparanes sulfates

HSPG : héparanes Sulfates Protéoglycanes

Ig : Immunoglobuline

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim xiii

IL : Interleukine

KAH-RP : Knob-Associated Histidine-Rich Protein

Kb : Kilobase

LABIOGENE : Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique

MAPSS : MultiAngle Polarized Scatter Separation

Mb : Mégabases

MESA : Mature P. falciparum-infected Erythrocytes Surface Antigen

mL : Millilitre

MSP : Merozoite Surface Protein

NADP : Nicotinamide Adénosine Dinucléotide Phosphate

NK : Natural Killer

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

pb : Paire de Bases

PCR : Polymerase Chain Reaction

pfEMP1 : Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein-1

pH : potentiel d'Hydrogène

pLDH : Plasmodium Lactate Déshydrogénase

RESA : Ring-infected Erythrocyte Surface Antigen

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

SDS : Sodium-Dodecyl-Sulfate

SNPs : Single Nucleotide Polymorphism

TBE : Tris-Borate-EDTA

TNF : Tumor Necrosis Factor

TRAP : Thrombospondin-Related Anonymous Protein

TROD : Test Rapide d’Orientation Diagnostic

TSP : Thrombospondine

UEMOA : Union Economique et Monétaire Ouest Africaine

UTR : UnTranslated Regions

UV : Ultra-Violet

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim xiv

RESUME

Le déficit en G-6-PD et les anomalies de l’hémoglobine ont une fréquence relativement élevée

dans les zones d’endémicité palustre. Ils conféreraient une certaine protection contre les formes

sévères du paludisme bien que les mécanismes ne soient pas complètement élucidés. Dans cette

étude nous avons réalisé le génotypage de cinq (05) SNPs du gène G-6-PD chez des personnes

présentant des formes asymptomatique ou symptomatique du paludisme au Burkina Faso.

Deux cent personnes vivant dans une communauté rurale du Burkina Faso, où le paludisme est

endémique et 182 patients souffrant de paludisme ont fait l’objet d’un génotypage par PCR en

temps réel, PCR/RFLP, ou par PCR classique à l’aide du kit GENESPARK G6PD African pour

les mutations G202A, A376G, A542T, G680T et T968C impliquées dans le déficit en G-6-PD.

Les génotypes de l’hémoglobine ont été déterminés par électrophorèse chez 325 individus.

La prévalence du déficit en G-6-PD était de 9,7% (37/382). On notait une fréquence

significativement plus élevée d’hémizygotes que d’homozygotes pour le déficit (14,8% vs 5,3%

; p = 0,002). L’électrophorèse de l’hémoglobine a révélé 75,4% (245/325) d’individus HbAA

et 21,8 % (71/325) d’individus HbAC contre 4,6% (15/325) de sujets HbAS avec 1,2% (4/325)

d’individus double hétérozygote HbSC. Bien que les variants G-6-PD A- Betica Selma

(376G/968T) et Santamaria (376G/542T) aient été détectés dans cette étude, le variant

202A/376G a été retrouvé dans 94,6% des cas de déficit. La parasitémie asymptomatique à

Plasmodium falciparum était significativement plus élevée chez les personnes non déficientes

en G-6-PD comparativement aux personnes hémizygotes/homozygotes (p < 0,001) et celles

hétérozygotes (p < 0,001). Cependant, aucune corrélation entre le déficit en G-6-PD, les

hémoglobinoses et l’infection symptomatique du paludisme n’a été observée dans cette étude.

Ces travaux montrent que le variant G-6-PDA- 202A/376G est associé à la protection contre le

paludisme asymptomatique au Burkina Faso. Ils confirment que le portage des hémoglobines S

ou C ne protège pas contre les infections palustres. Contrairement aux études antérieures de

génotypage, elle démontre pour la première fois l’existence du variant A- Betica Selma

(376G/968C) au Burkina Faso et suggère une investigation plus approfondie pour déterminer à

l’échelle nationale la fréquence de cette mutation.

Mots clés : G-6-PD, hémoglobinopathies, paludisme, SNPs, Burkina Faso

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim xv

ABSTRACT

The G-6-PD deficiency and hemoglobin abnormalities occur with relatively high frequencies

in malaria-endemic areas. They confer protection against severe forms of malaria although the

mechanisms are not completely understood. In this study we genotyped five (05) Single

Nucleotide Polymorphisms (SNPs) of the G-6-PD gene in people with asymptomatic or

symptomatic forms of malaria in Burkina Faso.

Two hundred (200) individuals living in a rural community in Burkina Faso, where malaria is

endemic and 182 malaria patients were genotyped by real-time PCR, PCR/RFLP or

conventional PCR using the kit GENESPARK G6PD African for mutations G202A, A376G,

A542T, G680T and T968C involved in the G-6-PD deficiency. Genotypes of hemoglobin have

been determined by electrophoresis in 325 individuals.

The prevalence of the G-6-PD deficiency was 9.7% (37/382). Hemizygous males were

significantly higher than homozygous females (14.8% vs. 5.3%, p = 0.002). Hemoglobin

electrophoresis revealed 75.4% (245/325) of HbAA individuals and 21.8% (71/325) of HbAC

subjects against 4.6% (15/325) of HbAS subjects and 1.2% (4/325) of double heterozygous

HbSC. Although the G-6-PD variants A- Santamaria (376G/542T) and Betica Selma

(376G/968T) were detected in this study, the 202A/376G variant was found in 94.6% of the

deficiency. Plasmodium falciparum asymptomatic parasitaemia was significantly higher in G-

6-PD non-deficients individuals compared to hemizygous/homozygous subjects (p <0.001) or

heterozygous females (p <0.001). However, there was no correlation between the G-6-PD

deficiency or haemoglobinopathies and symptomatic malaria infection in this study.

This study shows that the G-6-PDA -202A/376G variant is associated with protection against

asymptomatic malaria in Burkina Faso. As opposed to previous genotyping studies carried out

in Burkina Faso, it demonstrates for the first time the existence of the G-6-PDA- Betica Selma

(376G/968C) variant in Burkina Faso and suggests further investigation at the national level

and in specific ethnic groups to determine more accurately the frequency of that mutation.

Key words: G-6-PD, haemoglobinopathies, malaria, SNPs, Burkina Faso

INTRODUCTION

Thèse de Doctorat Unique OUATTARA Abdoul Karim 1

INTRODUCTION

Le paludisme demeure l’une des maladies parasitaires les plus mortelles dans le monde en dépit

des multiples efforts de prévention et de contrôle. Il est beaucoup plus répandu dans les pays

tropicaux et subtropicaux en développement. Les femmes enceintes notamment les primipares,

et les enfants de moins de cinq ans constituent les groupes les plus touchés par la morbidité et

la mortalité palustre. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), 198 millions de cas de

paludisme et 584 000 décès associés à la maladie ont été enregistrés au niveau mondial en 2013

(OMS, 2014b). Au Burkina Faso, le paludisme est fortement endémique avec une augmentation

de la transmission pendant la saison des pluies. On estime que plus de la moitié de tous les cas

de fièvres seraient attribuables au paludisme au cours de la saison des pluies (BISOFFI et al.,

2010). En 2013, le paludisme demeurait la principale cause de consultations (46,5%),

d’hospitalisations (61,5%) et de décès (30,5%) dans les formations sanitaires (Ministère de la

Santé/Système National d’Information Sanitaires du Burkina-Faso, 2013).

Le paludisme est également considéré comme la plus forte pression de sélection naturelle dans

l’histoire récente du génome humain. Le maintien de certaines anomalies génétiques comme le

déficit en Glucose-6-phosphate déshydrogénase (G-6-PD) et les hémoglobinopathies à des

fréquences relativement élevées, serait due à l’avantage sélectif qu’elles confèrent

généralement à l’état hétérozygote aux individus vivant en zone d’endémie palustre (HOWES

et al., 2013a).

L’hémoglobine S (HbS) responsable de la drépanocytose est sûrement l’hémoglobinopathie

grave la plus fréquente dans le monde (PIEL et al., 2015). La maladie affecterait quelques 20

à 25 millions de personnes dans le monde avec les plus fortes prévalences du trait

drépanocytaire observées en Afrique du fait de l’endémicité du paludisme (BOOTH et al.,

2010). Les individus porteurs de l’allèle HbS développent une anémie falciforme, ou

drépanocytose, dont les symptômes les plus courants sont des accidents vasculaires cérébraux,

des douleurs articulaires, des insuffisances rénales et hépatiques. Sans traitement, ce qui est

souvent le cas dans les pays à faibles revenus, la grande majorité des enfants drépanocytaires

(50 à 80%) meurent avant l’âge de 5 ans (PIEL et al., 2015). L’hémoglobine C (HbC) s’observe

essentiellement chez les populations d’ascendance noire. Le gène βc semble avoir son origine

dans la zone ouest de l'Afrique (PIEL et al., 2013b).


Contrairement à la drépanocytose, l’HbC ne provoque pas de polymérisation intracellulaire

linéaire au niveau des zones intravasculaires à faible tension d'oxygène. La distribution

géographique du déficit en G-6-PD et l’analyse haplotypique du locus G-6-PD indiquent une

sélection positive récente sous la pression du paludisme (HOWES et al., 2013b). Le gène de la

G-6-PD présente une importante hétérogénéité allélique, qui se manifeste par des expressions

biochimiques et cliniques variables. En effet plusieurs variants génétiques du déficit en G-6-

PD avec des fréquences polymorphiques sont connus dans la sous-région Ouest africaine

(Figure 1). Parmi les déficits enzymatiques touchant la lignée érythrocytaire, le déficit en G-6-

PD reste le plus significatif de par sa fréquence (plus de 400 millions de personnes dans le

monde) et ses implications cliniques. Il s’agit d’une pathologie génétique liée au chromosome

X avec des expressions cliniques variables à l’état hétérozygote et pouvant poser de graves

problèmes, notamment dans le traitement du paludisme (ALLAHVERDIYEV et al., 2012).

Figure 1 : Fréquence des différents SNPs G-6-PDA- en Afrique (HOWES et al., 2013b)


En effet, la prise de certains médicaments (dapsone, cotrimoxazole, primaquine...), la

consommation de certains aliments (fèves), et une variété d’infections (hépatites, fièvre

typhoïde, paludisme) entraînent chez les personnes déficientes en G-6-PD une anémie (baisse

du taux de globule rouge dans le sang) dite hémolytique (destruction des globules rouges)

d’intensité et de gravité variables, nécessitant parfois des transfusions sanguines en urgence

(HOWES et al., 2013a).

Il a été observé que la sévérité et la fréquence du déficit enzymatique variait d'un groupe

ethnique à l'autre et que les propriétés biochimiques de l'enzyme présentaient des différences

selon le groupe ethnique où elles étaient étudiées (Modiano et al., 2001a). La G-6-PDA-

(202A/37G) est le variant génétique responsable du déficit en G-6-PD le plus répandu et le plus

étudié en Afrique subsaharienne (HOWES et al., 2013b). Des études menées dans la sous-

région Ouest-africaine ont rapporté d’autres variants déficitaires tels que la G-6-PD Santamaria

(376G/542T) et la G-6-PD Betica-Selma (376G/968C) avec des fréquences relativement

élevées dans certaines populations (DE ARAUJO et al., 2006; CLARK et al., 2009b). La

plupart des quelques rares études de génotypage faites sur la déficience en G-6-PD au Burkina

Faso ont recherché uniquement la mutation G202A associée à la G-6-PDA (MODIANO et al.,

2001a). Cette approche peut entrainer une sous-estimation de la prévalence réelle du déficit en

G-6-PD au Burkina Faso. Les différentes études antérieures d'association génétiques entre le

déficit en G-6-PD et le paludisme (notamment le paludisme grave) présentent également des

divergences au regard de la force et de la spécificité de l’effet protecteur. Quelle est donc la

fréquence des autres variants impliqués dans le déficit en G-6-PD au Burkina Faso ? Quel est

l’effet du déficit en G-6-PD et des hémoglobines S et C sur la parasitémie à Plasmodium

falciparum ?

Pour répondre à ces questions, les principaux variants déficitaires de la G-6-PD présentant des

fréquences polymorphiques en Afrique de l’Ouest ont été recherchées afin d’évaluer leur

prévalence réelle au Burkina Faso. La détermination de la prévalence des hémoglobines S et C

dans la population d’étude ainsi que la corrélation entre le déficit en G-6-PD ou ces anomalies

de l’hémoglobine et le paludisme ont également fait l’objet de notre étude.

OBJECTIFS

DE LA THESE


OBJECTIFS DE LA THESE

Objectif principal

Etudier le polymorphisme génétique du déficit en G-6-PD et de l’hémoglobine chez des

personnes vivant en zone endémique du paludisme au Burkina Faso.

Objectifs spécifiques

Estimer la prévalence des hémoglobines S et C et des variants génétiques impliqués

dans le déficit en G-6-PD en zone endémique du paludisme au Burkina Faso.

Déterminer la corrélation entre ces anomalies génétiques et le paludisme

asymptomatique en zone rurale au Burkina Faso.

Evaluer l’effet de ces polymorphismes génétiques sur l’infection symptomatique à

Plasmodium falciparum dans la ville de Ouagadougou au Burkina Faso.

REVUE

BIBLIOGRAPHIQUE


CHAPITRE I : GENERALITES SUR LE PALUDISME

I.1 Définition et Historique

I.1.1 Définition

Le paludisme (du latin palus, marécage) aussi appelé malaria (de l'italien mal'aria, mauvais

air) est une parasitose due à un protozoaire du genre Plasmodium transmis à l’homme par la

piqure du moustique femelle du genre Anophèle, provoquant des fièvres intermittentes

(MISBAHI, 2013). Un cas de paludisme se définit comme tout individu chez qui la présence

de parasites du paludisme a été confirmée par un diagnostic en laboratoire de qualité contrôlée,

que le sujet manifeste ou non des symptômes cliniques (OMS, 2014a).

I.1.2 Historique

L’existence de fièvres particulières, spécialement fréquentes dans les zones marécageuses, est

connue depuis la plus haute antiquité. Le parasite responsable du paludisme autrefois appelé

Laverania malariae aujourd’hui connu sous le nom de Plasmodium falciparum, a été découvert

en 1880 par le chirurgien militaire français Alphonse Laveran dans le sang de patients

présentant des fièvres intermittentes (MISBAHI, 2013). En 1897, le scientifique William

MacCallum découvre les stades sanguins sexués chez des oiseaux infectés par Haemoproteus

columbae. Dans la même année, le médecin britannique Sir Ronald Ross a montré par la suite

que la transmission du paludisme des oiseaux se fait par des moustiques. Entre 1898 et 1900,

les travaux des scientifiques italiens Giovanni Battista Grassi, Amico Bignami, Giuseppe

Bastianelli, Angelo Celli, Camillo Golgi et Ettore Marchiafava ont démontré que la

transmission du paludisme humain se fait également par des moustiques. La phase de division

dans le foie précédant la phase érythrocytaire a été décrite en 1947 par Henry Shortt et Cyril

Garnham (COX, 2010). Trente ans après ces découvertes William Trager et J.B. Jensen ont

développé une technique de culture en continue des parasites responsables du paludisme

(TRAGER et JENSEN, 1976). Depuis 2002, la séquence complète du génome de Plasmodium

falciparum est connue (GARDNER et al., 2002).


I.2 Epidémiologie du paludisme

I.2.1 Estimations mondiales

Le paludisme (malaria en anglais) est une infection parasitaire vectorielle essentiellement

présente dans les régions tropicales et subtropicales d’Amérique du Sud, d’Afrique

subsaharienne et d’Asie du Sud-Est (ARGY et HOUZE, 2014). Au niveau mondial, la

population susceptible d'être infectée par le parasite et de développer la maladie s'élève à 3,2

milliards, et le risque est élevé (plus d'une chance sur 1 000 de contracter le paludisme au cours

d'une année) pour 1,2 milliard de personnes (Figure 2). Selon les dernières estimations de

l’OMS, 198 millions [124 - 283 millions] de cas de paludisme et 584 000 [367 000 - 755 000]

décès associés à cette maladie ont été enregistrés au cours de l’année 2013. Environ 90% des

décès au niveau mondial ont été recensés dans la région africaine de l’OMS. La plupart (78%)

étant des enfants de moins de 5 ans (OMS, 2014b).

Figure 2 : Différentes zones de transmission du paludisme dans le monde (OMS, 2014b)

Les chiffres du rapport OMS 2014 montrent clairement que le paludisme demeure encore un

problème majeur de santé publique surtout dans les pays tropicaux et subtropicaux en

développement ; avec la majorité des cas en Afrique sub-saharienne. En 2015, la plupart des

cas ont été enregistrés dans la région Afrique (88 %), loin devant la région Asie du Sud-Est (10

%) et la région Méditerranée orientale (2 %).


Cependant le renforcement des mesures de lutte et de prévention a permis de réduire de façon

spectaculaire la charge palustre dans certaines régions. Au niveau mondial, la baisse du nombre

de décès dus au paludisme est estimée à 48 %, de 839 000 décès en 2000 [653 000 - 1,1 million]

à 438 000 en 2015 [236 000 – 635 000]. Cette baisse est plus prononcée chez les enfants de

moins de 5 ans dans la région africaine où le paludisme qui était la première cause de mortalité

infantile, apparaît au quatrième rang en 2015 avec 10 % des décès à l’échelle du continent

(OMS, 2015b).

I.2.2 Répartition géographique

Le paludisme sévit actuellement dans la ceinture de pauvreté tropicale et subtropicale du

monde. La répartition géographique de l’épidémiologie du paludisme est très hétérogène et

extrêmement variable d’un continent à l’autre, d’un pays à l’autre, mais également au sein d’un

même pays. Cette répartition géographique de la maladie est fortement influencée par la

distribution des anophèles vecteurs, la capacité vectorielle, les caractéristiques biologiques des

différentes espèces de Plasmodium, les conditions climatiques etc. (GETHING et al., 2011).

En zone intertropicale, chaude et humide, abondent les anophèles capables d’assurer en

permanence la transmission des hématozoaires. Le paludisme essentiellement à Plasmodium

falciparum, y est donc endémique. Selon l’intensité de l’impaludation on distingue des zones

holo-endémiques, hyper-endémiques, méso-endémiques et hypo-endémiques, mais avec une

transmission qui a lieu tous les ans. Des poussées surviennent à la saison des pluies quand

pullulent les anophèles. Le terme holoendémique est appliqué au paludisme dans les zones où

la prévalence de l'infection chez les enfants de 2 à 9 ans est supérieure à 75%. Le paludisme est

considéré comme hyper-endémique dans les zones où la prévalence de l’infection se situe entre

50% et 75%. Lorsque la prévalence de l’infection est comprise entre 11% et 50% dans une

région donnée, le paludisme est dit méso endémique, et hypo endémique pour désigner une

zone où la transmission de l’infection est inférieure à 10% (HAY et al., 2008; MENDIS et al.,

2009). En Europe, le paludisme a été éradiqué, il a disparu des anciens foyers tandis qu’en Asie

il sévit par foyers limités avec une intensité variable. L’Amérique du Nord est indemne de

paludisme, par contre on le retrouve en Amérique Centrale et du Sud. En Océanie certaines îles

comme la Nouvelle-Guinée, l’île Salomon et le Vanuatu sont atteintes. Le développement des

5 espèces de Plasmodium inféodées à l’homme est possible partout où il y a des vecteurs

compétents et où les conditions climatiques permettent l’accomplissement de leur cycle

sporogonique.


La répartition géographique des différentes espèces de Plasmodium peut se résumer ainsi (HAY

et al., 2009; BROOKER et al., 2009) :

P. falciparum est largement répandu dans toute la ceinture tropicale du globe avec une forte

prédominance en Afrique subsaharienne. En effet le développement du cycle chez le moustique

se fait à une température supérieure à 18°C, d’où l’absence de cet hématozoaire dans les

montagnes tropicales et dans les régions tempérées.

P. malariae peut se développer sous les tropiques comme en zone tempérée mais aujourd'hui

sa distribution est sporadique et surtout tropicale (Afrique).

P. ovale est essentiellement observé en Afrique tropicale mais il est aussi signalé en Asie du

sud-est (Vietnam).

P. vivax sévit en zone tropicale et subtropicale (surtout en Amérique centrale et du Sud, en Asie

du Sud-Est, en Afrique de l’Est, au Proche et Moyen – Orient). L’invasion de l’hématie par

cette espèce nécessite la présence du récepteur de l’antigène Duffy (RAHIMI et al., 2014). P.

vivax est pratiquement absent en Afrique de l’Ouest car la majorité des populations ne porte

pas le facteur Duffy. Quant à la cinquième espèce,

Plasmodium knowlesi (SINGH et al., 2004), il sévit en Asie du Sud-Est, principalement dans

les zones forestières où vivent les singes macaques et les anophèles qui piquent autant les singes

que les hommes. (SABBATANI et al., 2010).

I.3 Cycle de vie de Plasmodium falciparum

Le cycle évolutif des parasites responsables du paludisme est très complexe et se déroule chez

deux hôtes (COWMAN et al., 2012). Il peut être divisé en deux grandes phases : une phase

asexuée chez l’hôte vertébré ou hôte intermédiaire (l’homme par exemple) et une phase sexuée

chez le moustique vecteur (hôte définitif).

I.3.1 Agent vecteur

La transmission du paludisme fait intervenir des facteurs géographiques et climatiques

favorables au développement des moustiques vecteurs. Un vecteur n’est pas une simple

seringue récupérant un agent pathogène chez un vertébré pour l’injecter à un autre. C’est un

point de passage obligatoire pour la diffusion de l’agent pathogène qui va soit « simplement »

s’y multiplier (virus) ou y assurer une part de son cycle (parasites) (PAGES et al., 2007).


L’intensité de la transmission dépend de facteurs liés au parasite, au vecteur, à l’hôte humain et

à l’environnement (LYIMO et al., 2012). Les femelles de certaines espèces d’anophèles chez

qui s’effectue le cycle sexué des plasmodies assurent seules la transmission du paludisme

d’homme à homme par leur piqûre, principalement entre le crépuscule et le petit matin. En

Afrique trois principales espèces de moustiques sont responsables de la transmission du

paludisme à l’homme. Il s’agit des espèces Anopheles gambiae (Figure 3), Anopheles

arabiensis et Anopheles funestus (SINKA et al., 2012).

Figure 3 : Anopheles gambiae (PAGES et al., 2007)

I.3.2 Agent pathogène

Les parasites du paludisme sont des protozoaires unicellulaires qui se développent à la fois chez

le moustique vecteur (multiplication sexuée ou sporogonique) et chez l’homme (multiplication

asexuée ou schizogonique). Au cours de leur cycle de vie, les plasmodies changent sans cesse

d’aspect et de taille, par suite d’alternance de phases de croissance et de phases de divisons

nucléaire et cytoplasmique (MILLER et al., 2013). Ils se développent de façon indépendante

dans le globule rouge et modifie cette cellule de sorte à en tirer leurs nutriments. On distingue

cinq principales espèces de Plasmodium responsables du paludisme chez l’homme :

Plasmodium falciparum, responsable de la fièvre tierce maligne,

Plasmodium vivax, responsable de la fièvre tierce bénigne avec une distribution plus

étendue que P. falciparum, sauf en Afrique subsaharienne,


Plasmodium ovale, responsable de la fièvre tierce bénigne, Plasmodium malariae,

responsable de la fièvre quarte bénigne,

Et Plasmodium knowlesi, responsable du paludisme du singe, a été retrouvée comme

infection humaine à fièvre quarte dans quelques pays d'Asie du sud-Est.

I.3.3 Phase asexué chez l’homme

Le Plasmodium est transmis à l'homme par la piqûre de l’anophèle femelle lors de la prise de

son repas sanguin (CORNELIO et SERIANO, 2011; BOUSEMA et al., 2014). Un petit nombre

des stades infectieux sporozoïtes (10-100) contenus dans ses glandes salivaires sont alors

injectés avec la salive dans la circulation sanguine de l’homme. Les sporozoïtes migrent

activement à travers la peau, puis gagnent la circulation sanguine pour atteindre rapidement le

foie (Figure 4). Ils traversent ensuite la barrière sinusoïdale hépatique, migrent à travers

plusieurs cellules puis finalement pénètrent dans un hépatocyte en formant une vacuole

parasitophore. C’est au sein de ce compartiment membranaire particulier que les sporozoïtes se

différencient en formes exo-érythrocytaires (schizontes hépatiques).

Schizogonie hépatique ou exoérythrocytaire

Il s’agit du cycle de reproduction asexuée qui se déroule dans les hépatocytes parasités. Le

parasite se développera et se divisera dans les cellules du foie pendant 8-10 jours, pour former

une masse (le schizonte) contenant plusieurs milliers de cellules filles (les mérozoïtes). Les

mérozoïtes seront libérées à partir du foie dans la circulation sanguine, où ils envahiront

rapidement les érythrocytes (sous-phase érythrocytaire). Chaque schizonte libère environ 10

000 à 30 000 mérozoïtes chez P. falciparum (CROMPTON et al., 2010; ARUMUGAM et al.,

2014), et entre 2 000 et 15 000 pour les trois autres espèces de Plasmodium humains. La

schizogonie se déclenche immédiatement dans tous les hépatocytes parasités pour les espèces

P. malariae et P. falciparum. Par contre elle peut être retardée dans certains hépatocytes qui

restent en attente (formes dormantes ou hypnozoïtes) pendant des mois voire même des années

avant le développement de la schizogonie exoérythrocytaire pour les espèces P. vivax et P.

ovale (CORNELIO et SERIANO, 2011). A chaque phase du cycle, le parasite prend une forme

caractéristique et exprime à sa surface des produits spécifiques, adaptés à la prochaine

interaction avec l’hôte (WRIGHT et RAYNER, 2014). Dans les conditions naturelles de

transmission, le développement pré-érythrocytaire de Plasmodium est une phase initiale,

obligatoire et asymptomatique de l’infection. Il représente donc une cible idéale pour des

approches antipaludiques prophylactiques.


Le principal vaccin antipaludique en cours de développement, RTS,S, cible une protéine

majeure de la surface des sporozoïtes, la circumsporozoite protein (CSP).

Figure 4 : Processus d’infection des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium (SILVIE

et al., 2003)

Légende : Les sporozoïtes sont séquestrés dans le foie grâce à l’interaction de protéines de

surface du parasite (CSP et TRAP) avec les glycosaminoglycanes (GAG) proéminents dans les

sinusoïdes hépatiques (1). Après passage dans l’espace de Disse, qui sépare l’endothélium des

sinusoïdes des hépatocytes sous-jacents, les sporozoïtes traversent plusieurs cellules par

effraction membranaire (2), avant de finalement infecter un hépatocyte par formation d’une

vacuole (3). Ce dernier processus est dépendant de l’expression de la tétraspanine CD81 à la

surface de l’hépatocyte. Au sein de la vacuole parasitophore, les sporozoïtes se différencient

en schizontes hépatiques (4).

La tétraspanine CD81, l’un des récepteurs du virus de l’hépatite C, joue un rôle crucial lors de

l’infection du foie par les sporozoïtes de Plasmodium (RISCO-CASTILLO et al., 2013).


Schizogonie érythrocytaire ou intra-érythrocytaire

Cette phase commence par l’invasion aléatoire des hématies saines par des formes ovoïdes

d’environ 1 µm de long appelées mérozoïtes, libérées suite à la rupture des schizontes

hépatiques. Il s’agit d’un processus complexe faisant intervenir des mécanismes d’interactions

fines hôte-parasite de type récepteurs-ligands présents à la surface des cellules hôte et parasite

(WRIGHT et RAYNER, 2014). L’invasion des hématies qui se fait grâce à un processus

parasitaire actif (endocytose) peut être décomposée en plusieurs phases (Figure 5) : (i) La phase

de contact ente le manteau glycoprotéique du mérozoïte et la surface de l’hématie, (ii) Une

phase de réorientation du mérozoïte pour que son pôle apical se retrouve perpendiculaire à la

surface de l’érythrocyte ; (iii) Une phase de formation de la jonction et début de la décharge

des rhoptries ; (iv) La phase de pénétration du mérozoïte survient alors par endocytose à travers

la jonction serrée avec formation de la vacuole parasitophore.

L'ensemble du processus d'invasion est complexe, mais il est également extrêmement rapide.

Des études ont montré que ce processus est bouclé en moins de deux minutes après la libération

des mérozoïtes (WRIGHT et RAYNER, 2014). En effet pour survivre le parasite doit réduire

son temps d’exposition aux éléments du système immunitaire de l’hôte. Au sein de chaque

hématie envahie le mérozoïte se développera ensuite sous forme d’anneau (trophozoïte jeune),

de trophozoïte mature, de schizonte jeune (nombre variable de noyaux) et de schizonte mature

à nombre de noyaux définis. Le cycle érythrocytaire asexué durera 48 heures, et sera complétée

par la rupture du schizonte et la libération de nouveaux mérozoïtes qui envahiront d’autres

érythrocytes non infectés (Figure 8). La densité parasitaire au cours de cette phase peut souvent

excéder 50 000 hématies infectés/µL de sang (CROMPTON et al., 2014).

Figure 5 : Processus d’invasion des érythrocytes par les mérozoïtes de Plasmodium falciparum

(WRIGHT et RAYNER, 2014)


C’est au cours du cycle érythrocytaire asexuée que se produiront les symptômes cliniques du

paludisme (fièvre, frissons, troubles de la conscience, etc.). Au cours de l'infection les

mérozoïtes remodèlent considérablement la membrane du globule rouge pour l’expression de

plusieurs de leurs protéines de surface à savoir principalement PfEMP1 (CROMPTON et al.,

2014). Il faut noter que l’infection de l’érythrocyte humain par Plasmodium vivax nécessite

obligatoirement la présence d’un antigène à la surface des globules rouges appelé, « Duffy

Antigen Receptor for Chemokines (DARC). P. vivax et P. knowlesi pénètrent dans les hématies

uniquement par l’interaction de leur « Duffy-Binding-Like domain » (DBL) avec le récepteur

DARC (COWMAN et al., 2012).

I.3.4 Phase sexuée chez le moustique ou sporogonie

Pendant le cycle sanguin asexué, certains mérozoïtes se différencieront en formes sexuées

appelées gamétocytes qui infecteront le moustique femelle au cours de son repas sanguin

(Figure 6). Les gamétocytes seront fécondés et poursuivront leur développement chez le

moustique. Ils parviennent dans l’estomac du moustique et se transforment en gamètes. Le

gamète mâle subit un processus d’exflagellation à la suite duquel les gamètes femelles sont

fécondés. Il en résulte un zygote appelé ookinète (CROMPTON et al., 2010).

Figure 6 : Cycle de vie de Plasmodium falciparum (SILVIE et al., 2003)


Environ 24 heures après la formation du zygote, l’ookinète mature mobile traverse d’abord la

matrice péritrophique, et les cellules épithéliales de l'intestin moyen, avant de se différencier en

oocyste sous la membrane basale de l'épithélium de l'intestin. Cette phase diploïde est brève et

s’achève par une division méiotique laquelle est suivie de plusieurs mitoses aboutissant au

développement de sporoblastes, puis de sporozoïtes après une dizaine de jours. L’éclatement

de l’oocyste libère ces éléments haploïdes (5000 à 10 000 sporozoïtes) mobiles dans

l’hémolymphe. Les sporozoïtes migreront ensuite dans les glandes salivaires du moustique,

prêts à infecter un autre hôte humain.

I.4 Aspect génétique de Plasmodium falciparum

I.4.1 Organisation du génome

La séquence du génome de Plasmodium falciparum est connue depuis 2002. Les premiers

travaux ont décrit le génome nucléaire du clone 3D7 comme étant composé de 22,8 mégabases

(Mb) réparties en 14 chromosomes dont la taille varie de 0,643 à 3,29 Mb et codant pour environ

5 300 gènes d’où une densité moyenne d’environ un gène pour 4338 paires de bases (pb)

(GARDNER et al., 2002). En plus de ce génome nucléaire on distingue 6 Kb et 35 Kb d’ADN

circulaire localisé respectivement au niveau des mitochondries et des apicoplastes (WEBSTER

et MCFADDEN, 2014). Les gènes impliqués dans la variation antigénique sont concentrés dans

les régions subtélomériques des chromosomes. La composition en nucléotides présente une

forte richesse en adénines (A) et en thymines (T), en moyenne de 80,6% du génome voire plus

de 90% pour les régions intergéniques et les introns. La taille moyenne des gènes de

Plasmodium falciparum est de 2,3 kb sans les introns présents à 54% (GARDNER et al., 2002).

Après près de 9 ans d’efforts coordonnés, la séquence complète du génome a été définie comme

haploïde avec une taille de 23,26 Mb, contenant 6372 gènes et codant pour 5524 protéines

(génome version : 06-01-2010, http://plasmodb.org/plasmo/) (LE ROCH et al., 2012).

Plasmodium falciparum possède une machinerie typique des eucaryotes capable d’engendrer

les modifications et le remodelage de la chromatine pour contrôler la régulation

transcriptionnelle. Sa caractéristique majeure est d’être constamment capable de varier son

expression génique pour produire des formes phénotypiques différentes et ainsi contourner les

réponses immunitaires de l’hôte.

I.4.2 Architecture nucléaire des gènes var

La virulence de Plasmodium falciparum est principalement liée à l’adhérence de globules

rouges parasités à l’endothélium et entre eux, pour former des rosettes.

http://plasmodb.org/plasmo/


Cette adhérence est le fait de la protéine de surface Plasmodium falciparum erythrocyte

membrane protein-1 (PfEMP1) (SCHERF et al., 2008). Dans le génome de P. falciparum, la

protéine PfEMP1 est codée par une soixantaine de gènes appartenant à la famille des gènes var.

Ce groupe de gènes, principalement situé dans les régions subtélomériques du chromosome, est

caractérisé par une fréquence élevée de recombinaison génique à l’origine d’une grande

diversification du répertoire des gènes var (Figure 7). Ils sont séparés du télomère par des

séquences répétitives (rep20 ou TARE) en nombre variable (1 à 6) et il y a à leur proximité

immédiate d’autres familles multigéniques (rif, stevor, Pf60). La conséquence directe de ce

polymorphisme génique est une grande variation antigénique de PfEMP1 qui permet au parasite

d’échapper au système immunitaire de l’hôte et d’avoir un grand nombre de phénotype

d’adhésion associé à la séquestration parasitaire (LABIE, 2005; ARGY et HOUZE, 2014).

Cette variation antigénique et phénotypique de PfEMP1 est associée à la composition variable

du domaine d’adhésion de la protéine en son extrémité N-terminal. En effet cette extrémité est

composée d’une succession de domaines protéiques tels que les domaines Duffy binding-like

(DBL) et les régions inter-domaine riche en cystéine (Cysteine-Rich Interdomain Region ou

CIDR).

Figure 7 : Organisation des gènes var de Plasmodium falciparum (SCHERF et al., 2008)

Légende : Génome haploïde organisé en 14 chromosomes linéaires. Les régions

subtélomériques des 14 chromosomes linéaires ont une organisation globale commune, avec

des répétitions non codantes de taille variable appelée TARE 1-6 situé à côté de répétitions

télomériques. Cette région est suivie par un membre de la famille des gènes var, souvent en

combinaison avec un deuxième gène var transcrit dans la direction opposée (vers le télomère).

Plusieurs groupes clusters de gènes var en tandem se trouvent dans des positions

chromosomiques centrales. Les gènes Rif sont souvent entrecoupés de gènes var.


Dans différents génomes de souches de P. falciparum, des études d’alignement de 399

séquences protéiques de PfEMP1 des différents groupes cités précédemment ont mis en

évidence 23 domaines protéiques conservées appelés domaine cassette (DC) dont certains

comme DC8, DC13, DC4 et DC5 sont devenus des candidats potentiels pour l’élaboration d’un

vaccin (ARGY et HOUZE, 2014). Les caractéristiques des gènes var sont présentées dans la

figure 8 ci-dessous.

Figure 8 : Caractéristiques des gènes var (SCHERF et al., 2008)

Légende : Les caractéristiques communes entre les membres de la famille des gènes var sont

présentées. Tous les membres contiennent deux exons. Le domaine polymorphique

extracellulaire (exon 1) contient un nombre variable de Duffy-Binding-Like (DBL) domaines

adhésifs, qui peuvent être classés en cinq catégories principales (alpha à epsilon) ainsi que les

régions entre les domaines riches en cystéine. Le domaine intracellulaire (exon 2) code pour

un segment semi-terminal conservé d'acides aminés.

I.5 Manifestations cliniques du paludisme

L’accès palustre à P. falciparum se présente dans la grande majorité des cas par un tableau

infectieux non spécifique d’aspect pseudo-grippal caractérisé par de la fièvre, des frissons et

des douleurs abdominales. Néanmoins, dans certaines populations avec des facteurs de risque

associés (âge extrême, malnutrition, immunodépression) ou considérées comme non immunes

vis-à-vis du parasite (enfants < 5 ans, femme enceinte et voyageurs), l’infection par P.

falciparum peut conduire à un accès palustre grave (ARGY et HOUZE, 2014).

Les symptômes apparaissent au bout de 7 jours ou plus (généralement 10 à 15 jours) après la

piqûre infectante du moustique. De manière opérationnelle, le paludisme est aujourd’hui classifié

sous deux formes cliniques à savoir le paludisme simple et le paludisme grave.


I.5.1 Accès palustre simple

Le paludisme simple se définit par une fièvre (température axillaire supérieure ou égale à

37,5°C ou antécédent de corps chaud dans les 72 dernières heures) et la mise en évidence du

plasmodium dans le sang par un examen microscopique (goutte épaisse/frottis sanguin) ou par

un Test Rapide d’Orientation diagnostic (TROD) ; et une absence de signe de gravité.

I.5.2 Accès palustre grave

La définition du paludisme grave donnée par l’OMS a évolué de 1986 à 2010. La définition la

plus utilisée date de 2000 et sépare l’enfant de l’adulte (LAURENT et al., 2014). Le paludisme

grave est ainsi défini par un frottis/goutte épaisse positifs à des formes asexuées de P.

falciparum, associée à au moins un critère clinique ou biologique de gravité tels que l’atteinte

neurologique, l’état de choc, une détresse respiratoire aiguë, l’hypoglycémie, l’acidose

métabolique, l’anémie sévère (Hb < 5 g/dL), l’hémoglobinurie, l’insuffisance rénale (créatinine

sérique > 265 µmol/L), un saignement spontané ou la présence d’une hyperparasitémie

(LAURENT et al., 2014).

I.5.3 Physiopathologie du paludisme

La physiopathologie du paludisme est encore incomplètement comprise. Les principaux

mécanismes impliquent l’hôte et le parasite dans des interactions complexes dont l’élément

central et singulier est le globule rouge parasité (LAURENT et al., 2014). Les manifestations

cliniques du paludisme sont directement ou indirectement liées à la schizogonie érythrocytaire,

alors que la schizogonie hépatique est asymptomatique (CHAN et al., 2014). Leur gravité

dépend, de l’espèce plasmodiale, de la densité parasitaire, du degré de prémunition de l’hôte.

La fièvre est due à l’éclatement des schizontes qui libèrent dans le torrent circulatoire du

pigment malarique appelé hémozoïne ; celui-ci se comporte comme une substance pyrétogène

et stimule la production des cytokines pro-inflammatoires comme le Tumor Necrosis Factor

(TNF) et l’interleukine 1. Les mécanismes immunitaires s’initient rapidement avec la

mobilisation de l’immunité innée ; et l’immunité adaptative est opérationnelle dans les 10 jours.

Les principaux acteurs sont les neutrophiles, les monocytes et les cellules Natural Killer (NK)

qui à leur tour produisent des cytokines, elles-mêmes capables de recruter des monocytes et

d’activer les neutrophiles (LAURENT et al., 2014). Si l’éclatement des schizontes est

asynchrone, la fièvre est irrégulière ou apparemment continue ; s’il est synchrone, la fièvre est

intermittente, quotidienne, tierce ou quarte selon la périodicité de la schizogonie (24, 48 ou 72

heures). L’anémie résulte avant tout de la lyse des hématies (éclatement des schizontes,

érythrophagocytose).


Les hématies parasitées par P. falciparum ont une déformabilité modifiée dès le stade

trophozoïte jeune, et plus le parasite est mature, plus l’hématie devient rigide. La splénomégalie

et l’hépatomégalie, habituelles au bout d’un certain temps d’évolution, témoignent de

l’hyperactivité et de la congestion de ses organes (AUTINO et al., 2012). La rate dont le rôle

est capital, grâce à la microcirculation (avec l’existence d’une double circulation sanguine

filtrante/non filtrante) scrute pluri-quotidiennement la déformabilité érythrocytaire et retient les

hématies trop rigides, celles parasitées par P. falciparum. Le foie intervient par l’activité

phagocytaire des cellules de kupffer et par la transformation de l’hémoglobine libérée en

bilirubine libre, d’où le subictère. D’un point de vue physiopathologique, l’accès grave serait

associé à un phénomène de séquestration des hématies parasitées dans les capillaires des

organes, particulièrement le cerveau. La séquestration concerne surtout les formes matures des

hématies parasitées (trophozoïte et schizonte) et se décompose schématiquement en trois

mécanismes : la cytoadhérence, le phénomène de rosetting et l’autoagglutination.

La cytoadhérence correspond à l’adhérence des globules rouges parasités aux cellules

endothéliales de l’hôte via des structures appelées «knobs» situées à la surface du globule rouge

parasité, principalement dans les capillaires de la microcirculation viscérale (ARGY et

HOUZE, 2014). Elle implique de multiples interactions entre les ligands de l’hématie parasitée

et les récepteurs endothéliaux (Figure 9).

Figure 9 : Les bases moléculaires de la cytoadhérence (source : http://www.u-bordeaux2-

medtrop.org/doc/COURS/Cours_pdf_2014-2015/Paludisme%20grave_Pr%20Saissy.pdf)

http://www.u-bordeaux2-medtrop.org/doc/COURS/Cours_pdf_2014-2015/Paludisme%20grave_Pr%20Saissy.pdf



Au cours du cycle intra-érythrocytaire, la prolifération et la maturation des formes parasitaires

sont accompagnées par la production de protéines parasitaires (Ring-infected Erythrocyte

Surface Antigen (RESA), Knob-Associated Histidine-Rich Protein (KAH-RP), Mature P.

falciparum-infected Erythrocytes Surface Antigen (MESA)) qui interagissent avec des

structures membranaires de l’érythrocyte (actine, spectrine) pour former les knobs. Ces

complexes protéiques parasitaires permettent aux stades matures de P. falciparum d’échapper

à la clairance splénique par séquestration dans les capillaires et veinules post-capillaires de

différents organes de l’hôte mais principalement au niveau cérébral (MILLER et al., 2013). Ce

phénomène de séquestration parasitaire, lié à la cytoadhérence, a pour conséquence l’activation

d’une cascade de phénomènes biologiques à l’origine de la pathogenèse de l’atteinte cérébrale

de l’accès palustre grave (ARGY et HOUZE, 2014).

La capacité des hématies parasitées à lier des hématies non parasitées conduit à la formation de

rosettes (rosetting), et l’autoagglutination correspond à l’adhérence entre plusieurs hématies

parasitées (LAURENT et al., 2014). La cytoadhérence à l’endothélium ainsi que le rosetting

réduisent la lumière des capillaires entraînant une occlusion du flux sanguin tissulaire et une

hypoperfusion d’organes (Figure 10).

Figure 10 : Séquestration des hématies parasitées (source : http://www.u-bordeaux2-

medtrop.org/doc/COURS/Cours_pdf_2014-2015/Paludisme%20grave_Pr%20Saissy.pdf)




L’obstruction des capillaires et la production de toxines parasitaires

(glycosylphosphatidylinositol [GPI]) induisent également une réaction inflammatoire locale

liée au recrutement et à l’activation de polynucléaires neutrophiles, monocytes et plaquettes.

La production par ces cellules immunitaires de médiateurs pro-inflammatoires tels que le TNF-

α, l’interleukine-1 (IL-1) et l’IL-6 participe à la pathogenèse de l’accès grave via

l’augmentation de l’expression de récepteurs endothéliaux impliqués dans la séquestration

parasitaire et par l’altération du métabolisme du monoxyde d’azote qui joue un rôle dans

l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique. Enfin, l’activation des cellules endothéliales

après cytoadhérence parasitaire est un autre mécanisme physiopathologique de l’accès grave

(ARGY et HOUZE, 2014).

À l’heure actuelle, une douzaine de récepteurs de l’hôte ont été identifiés comme intervenant

dans la séquestration parasitaire : héparanes sulfates (HS), récepteur de complément 1 (CR1),

antigène du groupe sanguin (ABO), chondroïtine sulfate (CSA), PECAM/CD31, ICAM-1,

CD36, thrombospondine (TSP), VCAM-1, E-sélectine, immunoglobuline (Ig) non immune et

le récepteur à la protéine C (Endothelial Protein C Receptor ou EPCR) (GAY et al., 2012,

TURNER et al., 2013). Même si l’ensemble de ces récepteurs ont été décrits dans l’accès grave,

P. falciparum ne possède pas un phénotype d’adhésion pour tous ces récepteurs et, par

conséquent, ils n’ont pas tous la même importance en fonction de la présentation clinique et

biologique de l’accès palustre.

Alors que les récepteurs HS et CSA ont plus particulièrement été décrits dans le paludisme

gestationnel, ABO, CR1 et Ig semblent être plus impliqués dans le phénomène de rosetting.

CD36 est un récepteur constitutif de l’endothélium dont le rôle est controversé. ICAM-1 et

EPCR semble être des récepteurs potentiellement impliqués dans l’accès grave et plus

particulièrement dans l’atteinte cérébrale chez l’enfant de moins de 5 ans en Afrique

subsaharienne(ARGY et HOUZE, 2014). Les différents rôles de la rate sont actuellement

connus. Les globules rouges lors de leur passage dans la rate sont phagocytés par les

macrophages de la pulpe rouge si leur surface est altérée ou opsonisée. La rate a par ailleurs un

rôle mécanique de rétention d’intensité variable, notamment des formes jeunes, qui

contribueraient à réduire la biomasse parasitaire circulante. La rate joue aussi un rôle important

dans la clairance parasitaire sous traitement antipaludique, particulièrement lorsque le

traitement comporte un dérivé de l’artémisinine (artésunate, dihydroartémisinine) (LAURENT

et al., 2014).


I.6 Paludisme et immunité

La réponse immunitaire dirigée contre Plasmodium falciparum, agent responsable des cas les

plus mortels de paludisme chez l’homme, est le résultat de plusieurs milliers d’années de

coévolution entre le parasite et son hôte (CROMPTON et al., 2014). Au cours de l’infection

par le plasmodium le système immunitaire de l’hôte se déploie contre le parasite lors des

différents stades de son cycle de vie. Par convention, les réponses immunitaires au paludisme

sont regroupées en réponses pré-érythrocytaires et en réponses érythrocytaires (CROMPTON

et al., 2014). L’immunité pré-érythrocytaire est généralement constituée de réponses cellulaires

contre les hépatocytes infectés, qui inhibent le développement du parasite intracellulaire par

l'induction d'intermédiaires réactifs de l'azote (STANISIC et al., 2013). Au cours de la phase

érythrocytaire, l’invasion des hématies par le parasite induit des modifications importantes de

leur surface membranaire, qui résultent en l’exposition de multiples molécules parasitaires. Au

cours de sa maturation le parasite produit un certain nombre de molécules impliquées dans la

modulation des processus pathogéniques, en grande partie à travers leurs effets sur le système

immunitaire (LANGHORNE et al., 2008). La détection de l’infection par le système

immunitaire permet de limiter la fréquence des cellules infectées circulantes, ainsi que les

manifestations cliniques. En effet, les infections plasmodiales multiples dès la petite enfance

dans les zones d’endémies stable, induisent une immunité non stérilisante qui confère une

protection contre les manifestations cliniques du paludisme sans empêcher les réinfections et

un portage intermittent du parasite. L’acquisition de cette immunité naturelle souvent appelée

« prémunition », nécessite plusieurs années d’exposition et elle disparait après quelques années

sans infection. Cette protection contre le « paludisme maladie » est le résultat d’une immunité

cellulaire et humorale complexe liée à la fois aux stimulations par les divers stades du parasite

et au polymorphisme antigénique des populations de Plasmodium circulant entre les anophèles

et l’homme dans une zone d’endémie (CROMPTON et al., 2014). Il a été rapporté que les

adultes gambiens naturellement exposés au Plasmodium présentaient de fortes réponses

cytokiniques Th1 et Th2 contre les formes sauvages et mutantes des protéines et peptides

MSP119 ainsi que des différences interethniques sur l’incidence du paludisme (Cyrille Bisseye,

2011). Des mécanismes d’inhibition cellulaire anticorps dépendant aboutissant à la production

de cytokines et de monoxyde d’azote, inhibant la multiplication érythrocytaire du parasite, sont

également en cause (PAWAR, 2014). Cependant, une activation excessive et inappropriée du

système immunitaire peut contribuer à l’apparition des formes sévères de la maladie.


I.7 Prise en charge thérapeutique

I.7.1 Traitements antipaludiques

Les premiers traitements de synthèse, les amino-8-quinoléines, apparaissent peu après la

Première Guerre Mondiale (plasmoquine, 1926). En 1943, les Américains modifient la

composition chimique du Resochin (développé par une firme pharmaceutique allemande en

1934) et obtiennent la chloroquine (PULL et al., 2013). La production massive de chloroquine,

vers 1945, a permis de disposer d’un traitement efficace, peu toxique et très bon marché. Son

utilisation pour le traitement des accès ou en chimioprophylaxie a constitué un des deux piliers

de la campagne d’éradication du paludisme des années 1950-1970 avec la lutte antivectorielle

au moyen de dichloro-diphényltrichloroéthane (DDT) (MENARD et al., 2013). Les premiers

cas de résistance à la chloroquine ont été rapportés en plusieurs points du monde entre 1957 et

1960 (Colombie et Venezuela, Cambodge et Thaïlande, Papouasie Nouvelle Guinée,

Philippines). La résistance s’est peu à peu propagée à toutes les zones d’endémie. La marche

infernale de la sélection médicamenteuse s’est poursuivie après le déploiement des

médicaments qui ont remplacé la chloroquine : résistance à l’amodiaquine, aux antifolates, à la

méfloquine (MENARD et al., 2013; PULL et al., 2013). La montée des multirésistances a

amené l’OMS à préconiser, il y a une dizaine d’années, l’utilisation de combinaisons

comprenant un dérivé de l’artémisinine (ACT, Artemisinin Combination Therapy). Ces

combinaisons sont maintenant recommandées dans la plupart des pays d’endémie, mais leur

accès est encore loin d’être général. Aujourd’hui, une des préoccupations majeures est que l’on

assiste en Asie du Sud-Est aux premiers signes d’émergence de parasites résistants aux dérivés

des artémisinines. Aucune solution thérapeutique de remplacement n’est actuellement

disponible. La situation devient donc critique, l’urgence étant d’enrayer la dissémination des

parasites résistants (MENARD et al., 2013).

I.7.2 Résistances aux médicaments antipaludiques

L’OMS a défini en 1965 et 1973 la résistance comme la capacité du parasite à survivre et/ou à

se multiplier en dépit de l’administration et de l’absorption d’un médicament donné à doses

égales ou supérieures à celles habituellement recommandées mais dans les limites de la

tolérance du malade (PRADINES et al., 2010). Il a été ajouté en 1986 que la forme active du

médicament devait pouvoir atteindre le parasite ou accéder à l’intérieur de l’érythrocyte infecté

pendant la durée nécessaire à son action normale.


Il s’agissait de tenir compte du fait que les individus pouvaient différer par leur capacité à

métaboliser les antipaludiques comme les sulfonamides et les sulfones, que les molécules

antipaludiques pouvaient se lier fortement aux protéines plasmatiques et que des médicaments

administrés de façon simultanée pouvaient avoir un effet antagoniste sur l’efficacité de

l’antipaludique (Par exemple l’acide folique peut altérer l’effet de la sulfadoxine–

pyriméthamine). Pour des raisons historiques et pratiques, la définition de la résistance est donc

essentiellement clinique et parasitologique (PRADINES et al., 2010).

I.7.2.1 Facteurs liés à la résistance aux antipaludiques

Malgré les efforts déployés pour la découverte de nouveaux médicaments antiplasmodiaux et

la mise en place effective par les systèmes de santé de combinaisons thérapeutiques pour le

traitement antipaludique, P. falciparum s’adapte en permanence et développe des résistances,

y compris contre les ACT. Ceci s’explique d’abord par la grande diversité génétique de P.

falciparum due à un taux élevé de mutations dans son génome et par les masses très importantes

de parasites portées par les individus infectés. Même si les mutations capables de conférer une

résistance à un nouveau médicament sont extrêmement rares et peu probables, le nombre élevé

de parasites infectant les humains fait que ces mutations finissent par apparaître et par être

sélectionnées par la pression médicamenteuse (PRADINES et al., 2010). Les erreurs de

réplication de l’ADN dans les cellules introduisent des mutations au hasard dans le génome et

permettent le processus d’évolution. Ces mutations sont à l’origine de la grande variabilité

génétique de P. falciparum et lorsque celles-ci ne sont ni létales pour le parasite, ni silencieuses,

elles peuvent dans certains cas avantager sa survie en lui permettant par exemple d’échapper au

système immunitaire de son hôte, de supporter la présence de molécules toxiques dans son

environnement ou de se multiplier plus rapidement que d’autres clones (LE BRAS, 2006,

PRADINES et al., 2010). Certaines mutations permettent au parasite de survivre en présence

d’un antipaludique pour lequel il devient résistant. La mutation est ensuite transmise à ses

descendants, générant ainsi une population capable de résister à une molécule.

La fréquence des mutations et la vitesse à laquelle les résistances se développent dépendent des

caractéristiques de la molécule utilisée, du contexte épidémiologique (intensité de la

transmission) et de la façon dont les médicaments sont utilisés. Toutefois le phénotype de

résistance acquis après mutation n’est pas toujours un avantage en l’absence de pression

médicamenteuse.


Ainsi, les autres facteurs favorisant l’émergence de résistances sont i) une mauvaise utilisation

des antipaludiques par les individus infectés (automédications abusives, mauvaise observance)

conduisant à des traitements incomplets, ii) une indisponibilité des médicaments efficaces ou

le déploiement inadéquat des médicaments sous forme de monothérapies et iii) la

consommation de contrefaçons sous dosées, facteurs permettant à des parasites viables de

survivre à des concentrations sub-optimales d’antipaludiques et d’être sélectionnés pour leur

aptitude à résister (PRADINES et al., 2010).

I.7.2.2 Marqueurs moléculaires de résistance

Il s’agit d’un ensemble de marqueurs impliqués dans les mécanismes moléculaires de

résistance. Pertinents et spécifiques pour prédire le niveau de résistance d’une population

parasitaire aux antipaludiques, ils ont une place de choix dans la surveillance de l’activité de tel

ou tel antipaludique. Certains marqueurs sont associés à un défaut d’accumulation des

pharmacophores au niveau de la cible parasitaire, d’autres à une modification de la cible

parasitaire (MENARD et al., 2013).

Les principaux marqueurs moléculaires utilisés dans la surveillance de l’efficacité des

antipaludiques sont les suivants :

P. falciparum chloroquine transporter (Pfcrt) : Ce gène situé sur le chromosome 7

code pour un transporteur membranaire de la vacuole digestive. La mutation sur le

codon K76T, associée à sept autres points de mutation, permet au parasite de limiter

l’accumulation de chloroquine dans sa vacuole digestive, où elle exerce son action

inhibitrice. Pfcrt est également impliqué dans la baisse de sensibilité du parasite à

l’amodiaquine et à la quinine. Dans les zones où les allèles de résistance ne sont pas

fixés, on observe une augmentation de la fréquence de l’allèle sauvage après abandon

de la chloroquine. L’analyse de ce locus renseigne sur la pression médicamenteuse

exercée au sein des populations (MENARD et al., 2013).

P. falciparum multi-drug resistance 1 (Pfmdr-1) : Situé sur le chromosome 5, ce gène

code pour un transporteur de type ABC (ATP binding cassette). La protéine PfMDR-1

est impliquée dans la modulation de la sensibilité à de multiples antipaludiques et, plus

particulièrement, dans l’efflux des antipaludiques hydrophobes (MENARD et al.,

2013).


Les mécanismes de résistance sont liés : (1) soit à des phénomènes de duplication,

entraînant une augmentation de l’expression de la protéine et la résistance aux aryl-

amino-alcool (comme la méfloquine ou la luméfantrine) et une baisse de sensibilité aux

dérivés de l’artémisinine (mais sans lien statistiquement établi avec l’efficacité clinique

des ACT) ; (2) soit à l’apparition de mutations au niveau des codons N86Y, Y184F,

S1034C, N1042D et D1246Y, entraînant une altération de sensibilité des parasites à

certains antipaludiques comme les amino-4-quinoléines. Il existe un effet antagoniste

entre la sensibilité à la chloroquine et à la méfloquine : la mutation 86Y diminue la

sensibilité des parasites à la chloroquine, mais augmente celle de la méfloquine. De

même, l’augmentation du nombre de copies du gène (86N) augmente la résistance à la

méfloquine et à l’inverse, elle accroît la sensibilité à la chloroquine.

P. falciparum dihydrofolate reductase (Pfdhfr) : Ce gène, situé sur chromosome 4,

code pour une enzyme intervenant dans la voie de synthèse des folates. Elle est la cible

des médicaments anti-folates (pyriméthamine, par exemple) qui, en inhibant son activité

enzymatique, entraînent le blocage de la synthèse des pyrimidines et la réplication de

l’ADN parasitaire. L’accumulation de plusieurs mutations spécifiques au sein de cette

protéine (codons N50R, C51I, S108N et I164L) entraînent la résistance clinique des

parasites à l’action des anti-folates (MENARD et al., 2013).

P. falciparum dihydropteroate synthase (Pfdhps) : La dihydroptéroate synthase

(DHPS) est une autre enzyme intervenant dans la synthèse des folates (le gène

correspondant est situé sur le chromosome 8). Elle est inhibée par les sulfamides. Les

mutations se situant au niveau des codons S436A/F, K437G, K540E, A581G, A613S/T

confèrent une résistance à la sulfadoxine. L’analyse groupée des mutations au niveau

des gènes Pfdhfr et Pfdhps permet de prévoir l’efficacité clinique de l’association

sulfadoxine-pyriméthamine, largement utilisée en Afrique chez la femme enceinte en

Traitement Préventif Intermittent (TPI) ou en association avec l’artésunate en traitement

curatif (MENARD et al., 2013).

P. falciparum cytochrome b (Pfcytb) : Porté par le génome mitochondrial, le gène cytb

code pour le complexe cytochrome bc1 intervenant dans le transport des électrons et la

synthèse de l’ATP. Il est la cible de l’atovaquone. Les mutations au niveau du codon

Y268N/S/C diminuent l’efficacité théorique de l’association atovaquone/proguanil

actuellement largement utilisée en chimioprophylaxie par les voyageurs.


Aucune mutation n’a pu être mise en évidence sur des isolats sauvages. Les mutants

retrouvés ont tous été identifiés chez des patients au décours d’un traitement par

l’atovaquone (sélection intra-hôte), et entraînent une diminution importante de la

sensibilité du parasite à l’atovaquone (MENARD et al., 2013).

P. falciparum sodium/hydrogen exchanger gene (Pfnhe-1) : Le gène Pfnhe-1

(chromosome 13) code pour une protéine impliquée dans les mécanismes d’homéostasie

parasitaire comme la régulation du pH, le volume et la composition ionique du

cytoplasme. Il a été en particulier montré que le niveau d’expression de la protéine

PfNHE influençait la sensibilité des parasites à la quinine en liaison avec d’autres

facteurs, et que certains allèles du microsatellite intragénique ms4760 étaient associés à

des diminutions de sensibilité in vitro d’isolats ou de clones de P. falciparum adaptés

en culture (MENARD et al., 2013).

I.8 Paludisme et vaccin

La mise au point d’un vaccin efficace contre le paludisme a connu une avancée remarquable au

cours de ces dix dernières années. Cependant, de nos jours aucun vaccin présentant une

efficacité suffisante et durable n’est disponible. Cela est dû aux nombreuses difficultés

rencontrées, notamment la grande variabilité génétique avec des antigènes de surface variables

du parasite, la complexité de son cycle de vie avec plusieurs étapes et des antigènes multiples

et différents à chaque étape et un taux de réplication élevé avec une évolution rapide de la

stratégie d’échappement au système immunitaire par le parasite (MECHAIN, 2015). Les

antigènes exprimés sont souvent polymorphes d’un clone parasitaire à l’autre et certains

antigènes comme ceux codés par des gènes var sont polymorphes au sein d’un même clone

parasitaire. Par ailleurs, un essai vaccinal a montré que les réponses immunes induites pouvaient

sélectionner des parasites exprimant un variant antigénique différent de celui utilisé pour

immuniser (ROGIER et al., 2006). Les candidats vaccins se distinguent d’abord par les stades

parasitaires au niveau desquels les antigènes sont exprimés. De ces stades dépendent l’effet

attendu du vaccin et le type de réponse immune susceptible d’être protectrice. On distingue :

Les Vaccins contre les stades pré-érythrocytaires qui doivent induire des réponses

immunes visant les sporozoïtes ou les schizontes hépatiques dans le but d’empêcher

toute libération de mérozoïtes dans le sang. Pour induire une immunité chez des

individus non-immuns, l’efficacité de ce type de vaccin doit être de 100 % (ROGIER et

al., 2006).


Les vaccins contre les stades érythrocytaires asexués visant soient à empêcher

l’invasion des hématies et donc à contrôler les densités plasmodiales circulantes, soit à

empêcher l’évolution des infections vers les formes cliniques et potentiellement graves

de la maladie. La mise au point d’un tel vaccin se heurte à différents obstacles : les

difficultés d’évaluation expérimentale chez l’homme, l’absence de modèle animal

pertinent et l’absence de corrélation immunologique de la protection.

Les Vaccins bloquant la transmission ou altruiste ne visant pas à protéger l’individu

vacciné mais à limiter la transmission des parasites de l’homme au vecteur, et

secondairement du vecteur à l’homme. Si la couverture ou l’efficacité vaccinale ne sont

pas totales, un petit nombre d’individus infectés suffirait à assurer la transmission du

paludisme (ROGIER et al., 2006).

Dans sa stratégie mondiale de lutte contre le paludisme 2016-2030, l’OMS vise désormais à

réduire les taux de mortalité et l’incidence du paludisme d’au moins 90 % d’ici à 2030. Dans

cette nouvelle stratégie, la place des vaccins antipaludiques devrait être importante, non pas de

façon exclusive mais bien de façon complémentaire aux autres moyens de lutte disponibles,

préventifs, diagnostiques et thérapeutiques(OMS, 2015a). Actuellement, plusieurs candidats

vaccins préventifs contre les infections à P. falciparum et à P. vivax sont en développement. En

2015, 18 candidats vaccins, avec des modes d’action différents, sont au stade d’essais cliniques

(MORENO et JOYNER, 2015). Deux d’entre eux ciblent P. vivax en tenant compte du stade

hypnozoïte. Les 16 autres visent P. falciparum seul. Le plus avancé d’entre eux, est le vaccin

MosquirixTM ou RTS, S/AS01 (Figure 11). Il s’agit d’un vaccin antigénique recombinant, sous

forme de particules de type virus non infectieux produites par des cellules de levure

(Saccharomyces cerevisiae) par génie génétique (technologie de l’ADN recombinant). Le nom

de ce vaccin inactivé renvoie à sa composition (COHEN et al., 2010; MECHAIN, 2015) :

R : région centrale répétée de la protéine de surface du sporozoïte de P. falciparum

(circumsporozoite protein) ;

T : et sa région carboxy-terminale complète qui contient plusieurs épitopes de cellule T ;

S, fusionnées avec l’antigène de surface de l’hépatite B ;

S/ : combinée (Co-expression dans les cellules de levure et auto-assemblage) avec l’antigène

de surface de l’hépatite B (libre) ;

AS01 : formulée avec un adjuvant contenant des liposomes, un lipide A mono-phosphorylé

(MPL) et une saponine (la QS21).


Le candidat vaccin contre le paludisme RTS, S/AS01 de la société GlaxoSmithKline (GSK) est

le premier à avoir atteint une phase 3 d’essai clinique. Quelque 16 000 enfants issus de sept

pays d’Afrique subsaharienne ont participé à cette phase 3 de l’étude clinique du RTS, S/AS01,

dirigé contre Plasmodium falciparum. Son efficacité apparaît cependant limitée et diminue avec

le temps (GREENWOOD, 2015). En effet on notait un taux de protection de 46% après 18 mois

chez les enfants vaccinés entre leur 5e et leur 17e mois. L’efficacité n’était en revanche que de

27% pour les bébés immunisés plus tôt, à l’âge auquel sont effectuées les vaccinations infantiles

de routine.

Figure 11 : L’antigène vaccinal RTS,S (COHEN et al., 2010).

I.9 Diagnostic biologique du paludisme

Différentes méthodes diagnostiques du paludisme sont actuellement disponibles. Cependant

l’examen microscopique d’un frottis sanguin et d’une goutte épaisse demeure la méthode de

référence (BERRY et al., 2009).

I.9.1 Diagnostic microscopique direct par frottis sanguin et goutte épaisse

L’examen microscopique certifie le diagnostic du paludisme en mettant en évidence le parasite

dans le sang circulant. Le sang est recueilli par ponction veineuse sur tube contenant un

anticoagulant (EDTA) ce qui permet de multiplier les techniques diagnostiques avec le même

prélèvement.


Les étalements peuvent également être réalisés à partir d’un prélèvement capillaire par piqûre

au bout du doigt ou du talon pour les bébés. Quelques gouttes de sang sont déposées sur une

lame porte-objet pour confectionner une goutte épaisse, et un frottis mince. La lame est ensuite

séchée pendant 30 minutes, colorée au Giemsa à 10 % et lue au microscope optique à la lumière

électrique. C’est une technique de concentration, car la quantité de sang examinée est 20 à 30

fois plus élevée que lors du frottis sanguin. Sa sensibilité va de 10 à 20 parasites/µL (BERRY

et al., 2009). Le Frottis sanguin permet d’identifier l’espèce plasmodiale en cause à partir des

critères morphologiques des parasites et des hématies parasitées et de calculer la parasitémie,

exprimée en pourcentage d’hématies parasitées, très utile en cas d’infection par P. falciparum.

Sa sensibilité se situe entre 100-300 parasites/μL mais nécessite une lecture attentive pendant

au moins 20 minutes.

I.9.2 Détection d’Antigènes palustres par tests Rapide d’Orientation diagnostic (TROD)

Les TROD reposent sur le principe de l’immuno-chromatographie en utilisant des bandelettes

sensibilisées par des anticorps monoclonaux spécifiques détectant des antigènes plasmodiaux.

Ils sont réalisés avec une goutte de sang déposée sur une bandelette et ne nécessitent aucun

appareillage. La plupart de ces tests permettent la mise en évidence de l’Histidin-Rich Protein

2 (HRP2) spécifique de P. falciparum ; mais certains permettent la mise en évidence de la

Plasmodium Lactate Déshydrogénase (pLDH) commune aux quatre espèces plasmodiales. La

sensibilité et la spécificité revendiquées par les fabricants de ces tests sont comparables. Les

tests associent souvent sur une même bandelette plusieurs systèmes de détection, ajoutant alors

à la recherche de P. falciparum celle de P. vivax et/ou des trois autres espèces (BERRY et al.,

2009).

I.9.3 Détection des acides nucléiques par les techniques d’amplification génique

L’amplification génique par PCR est la technique la plus utilisée. C’est la technique la plus

sensible qui permet de détecter de très faibles parasitémies de l’ordre de 0.3 parasite/μL de sang

avec une possibilité de quantification de l’ADN plasmodial en utilisant la PCR quantitative. La

PCR a également une excellente valeur prédictive négative avec une spécificité absolue si elle

est réalisée dans de bonnes conditions. L’amplification du gène codant pour la petite sous unité

18S de l’ARN ribosomal permet aussi l’identification des espèces plasmodiales en cause en

utilisant une PCR nichée (BERRY et al., 2009).


CHAPITRE II : HEMOGLOBINOPATHIES ET DEFICIT EN G-6-PD

Le paludisme est considéré comme la plus forte pression de sélection naturelle dans l’histoire

récente du génome humain. Il est supposé que le paludisme se soit réellement installé lors des

changements d’habitude de vie correspondant au passage de la chasse et de la cueillette vers les

pratiques agricoles et la sédentarisation il y a environ 10000 ans (KWIATKOWSKI, 2005;

HEDRICK, 2011). Des études micro et macroépidemiologiques ont montré l’existence d’un

chevauchement entre les distributions géographiques du paludisme à Plasmodium falciparum

et celles de certaines anomalies génétiques du globule rouge tels que les thalassémies, les

hémoglobinopathies (HbS, HbC et HbE), des perturbations métaboliques (en particulier le

déficit en G-6-PD) ou des anomalies de protéines membranaires.

Les mutations responsables de ces maladies n’entrainent généralement pas de manifestations

cliniques majeures à l’état homozygote, mais leur maintien au sein des populations témoigne

de l’avantage sélectif qu’elles confèrent à l’état hétérozygote aux individus vivant en zone

d’endémie palustre (BAUDUER, 2012). Dans ce chapitre nous insisterons sur les

hémoglobinoses S et C et la déficience en G-6-PD.

II.1 Hémoglobinopathies

Haldane a été le premier à proposer en 1949, d’une part, l’influence du paludisme sur le génome

humain, et, d’autre part, l’effet protecteur contre le paludisme de variants génétiques

provoquant la réduction ou l’absence d’une ou plusieurs sous-unité(s) de l’hémoglobine,

causant ainsi les thalassémies (HEDRICK, 2011).

De la même manière, des variants génétiques causant d’autres hémoglobinopathies ont été

ensuite associés à la résistance au paludisme (ALLISON, 1964) et des analyses récentes

indiquent une sélection balancée de ces variants, sous la pression positive du paludisme et celle

négative de l’hémoglobinopathie (HEDRICK, 2012).

II.1.1 Définition

Les hémoglobinopathies sont des maladies génétiques liées à un trouble qualitatif

(hémoglobinoses) ou quantitatif (thalassémies) de l’hémoglobine avec remplacement des sous-

unités protéiques composant l’hémoglobine par des protéines mutantes (LABIE et ELION,

2005).


II.1.2 Hémoglobinose S (HbS)

Les hémoglobines anormales ont été les variants protéiques les mieux décrits depuis la mise en

évidence en 1949 du premier d’entre eux, l’HbS, responsable de la drépanocytose. On en

compte actuellement plusieurs centaines, variants d’une ou de l’autre des chaînes α ou β de

l’hémoglobine. Certains sont silencieux, d’autres s’accompagnent d’anomalies fonctionnelles

rendant compte de la pathologie observée (LABIE et ELION, 2005). La forme βs de

l’hémoglobine est provoquée par une mutation génétique unique de « transversion » du sixième

codon du premier exon du gène de la globine β6 (GAG GTG) donnant comme conséquence

la substitution de l’acide glutamique par la valine (β6Glu->Val) (HEDRICK, 2011).

II.1.2.1 Epidémiologie

La drépanocytose est sûrement l’hémoglobinopathie grave la plus fréquente (DELICAT-

LOEMBET et al., 2014, PIEL et al., 2015). Son épidémiologie est bien connue, chez les

populations d’origine africaine, mais aussi au Moyen-Orient, en Inde ainsi qu’au niveau des

pays du pourtour méditerranéen (Figure 12). La maladie affecterait quelques 12 500 personnes

au Royaume-Uni et 20 à 25 millions de personnes dans le monde (BOOTH et al., 2010). Elle

touche principalement l’Afrique où les plus fortes prévalences du trait drépanocytaire (10% à

40% de la population) surviennent entre les latitudes 15° Nord et 20° Sud (AGASA et al., 2010).

On estime qu’environ 275 000 enfants naissent chaque année en Afrique (approximativement

85% du taux mondial) avec une anomalie majeure de l’hémoglobine dont la plus fréquente est

celle de la drépanocytose (LIN et al., 2015). La prévalence de ses anomalies augmente chaque

année du fait de la croissance de la population et pourrait toucher plus de 400 000 enfants dans

le monde d’ici à 2050 (PIEL et al., 2015). Sans traitement, qui est rarement disponible dans les

pays à faibles revenus, la grande majorité des enfants drépanocytaires (50 à 80%) meurent avant

l’âge de 5 ans (PIEL et al., 2013a; MULUMBA et WILSON, 2015). Cette maladie génétique

du sang prédomine en Afrique centrale, où 30% de la population est drépanocytaire. Dans

certaines parties de l’Afrique subsaharienne, la drépanocytose touche jusqu’à 2 % des nouveau-

nés (SIMPORE et al., 2002b). La fréquence du trait drépanocytaire, c'est-à-dire le pourcentage

de porteurs sains qui n’ont hérité du gène mutant que d’un seul des parents, atteint 10 à 40 %

en Afrique équatoriale, 1 à 2 % sur la côte de l’Afrique du Nord et moins de 1 % en Afrique du

Sud. Dans les pays d’Afrique de l’Ouest (Ghana, Burkina Faso et Nigéria), la fréquence du trait

drépanocytaire atteint 15 à 30 %.


Dans les pays où la prévalence du trait drépanocytaire est supérieure à 20%, la maladie affecte

environ 2% de la population (AIDOO et al., 2002). Au Burkina Faso, la drépanocytose sous ses

diverses formes graves (HbSS ou HbSC) touche 8,4% des enfants qui vont pour les

consultations médicales dans les structures sanitaires (SIMPORE et al., 2002b) et 1,2% des

enfants qui vont à l’école (SIMPORE et al., 2002a).

Figure 12 : Distribution mondiale de l’hémoglobine S (PIEL et al., 2010)

II.1.2.2 Physiopathologie

Le mécanisme physiopathologique de base de la drépanocytose a été très précisément décrit,

centré sur la polymérisation de l’HbS désoxygénée et les déformations cellulaires subséquentes

observées chez les homozygotes SS (Figure 13). Les molécules d’hémoglobine drépanocytaire

(HbS) ont la propriété, sous leur forme désoxygénée, de polymériser pour former des fibres qui

déforment l’érythrocyte en lui donnant une forme caractéristique en faucille, le drépanocyte.

La polymérisation des molécules d’HbS déforme la cellule, la fragilise et la rigidifie. Le

drépanocyte a comme particularité d’avoir perdu ses propriétés rhéologiques de déformabilité

et d’élasticité nécessaires pour passer à l’intérieur des petits vaisseaux de l’organisme, et d’être

plus rapidement détruit qu’un globule rouge normal, ce qui rend compte de l’anémie

hémolytique (KOSSOROTOFF et al., 2014). Les individus porteurs de l’allèle HbS

développent une anémie falciforme, ou drépanocytose, dont les symptômes les plus courants

sont des accidents vasculaires cérébraux, des douleurs articulaires, des insuffisances rénales et

hépatiques.


Si les symptômes restent limités chez les individus hétérozygotes HbAS, qui portent l’allèle

mutant HbS et l’allèle sain HbA, l’homozygotie est fortement délétère. Les syndromes

drépanocytaires majeurs recouvrent différents génotypes selon que l’HbS est la seule

hémoglobine anormale présente (patients homozygotes SS et hétérozygotes composites S/β0),

ou associée à d’autres hémoglobines pathologiques (patients SC et S/β+). Les formes SS et S/β0

sont les plus sévères. Il existe en effet une production résiduelle d’hémoglobine normale chez

les patients S/β+ qui limite la polymérisation de l’HbS. Les complications observées chez les

patients atteints de syndromes drépanocytaires majeurs font intervenir plusieurs mécanismes :

d’une part, des phénomènes « viscosité-vaso-occlusion » (Crises Vaso-Occlusives [CVO]

osseuses ou d’organes avec occlusion des micro-vaisseaux) et, d’autre part, des phénomènes «

hémolyse-dysfonction endothéliale » (hyper-tension artérielle pulmonaire, priapisme).

L’atteinte vasculaire au niveau cérébral est aussi fréquente chez les enfants drépanocytaires

homozygotes. Elle peut par ses conséquences être source d’handicap sévère, d’où l’importance

de son dépistage et de sa prise en charge (KOSSOROTOFF et al., 2014).

Figure 13 : Mécanisme physiopathologique de base de la drépanocytose (LABIE et ELION,

2005).

Légende : La mutation au 6e codon du gène b-globine conduit à la substitution d’un acide

glutamique par une valine et à une hémoglobine anormale : l’HbS. À basse pression en

oxygène, la désoxy-HbS polymérise et entraîne une déformation, une rigidification et une

fragilisation cellulaires, responsables de l’anémie hémolytique et de la vaso-occlusion.


II.1.3.3 Rapport entre l’hémoglobine S et le Paludisme

La superposition, en Afrique, des zones de paludisme sévère et de celles où la mutation

drépanocytaire est endémique est connue depuis longtemps (LABIE et ELION, 2010). Le rôle

sélectif du Plasmodium a été évoqué, procurant un avantage de survie aux hétérozygotes AS

alors que les malades SS mouraient le plus souvent de façon prématurée. Ce phénomène de

« polymorphisme équilibré » a été formalisé par Allison en 1964. En effet, les individus

porteurs de l’hémoglobine normale (AA) qui avaient le paludisme, étaient plus malades et

mouraient davantage que les porteurs de la mutation (AS). Donc, au fil des siècles et des

générations, cette mutation, qui était très rare au départ, est devenue plus fréquente.

C’est d’ailleurs parce que le paludisme est très présent en Afrique, que la drépanocytose touche

beaucoup les Africains. La drépanocytose est ainsi répandue parce qu'à l'état hétérozygote, la

présence du gène drépanocytaire contribue à protéger son porteur du paludisme, et lui procure

donc un avantage sélectif par rapport aux porteurs des gènes normaux AA, qui eux sont

vulnérables au Plasmodium.

L’hémoglobine S à l’état hétérozygote ne prévient pas l’infection à Plasmodium mais réduit

plutôt le risque de développer les formes graves de la maladie (MANGANO et al., 2015). En

effet les individus HbAS ont généralement une densité parasitaire significativement plus faible

par rapport aux individus de génotype HbAA (TRAVASSOS et al., 2015). Plusieurs études se

sont intéressées aux mécanismes de protection de l’hémoglobine S contre le paludisme.

L’implication de deux facteurs semble cependant dominer à savoir l’élimination précoce des

globules rouges falciformes infectés par le plasmodium et l’entrave à la croissance du parasite

dans l’hématie falciforme (LELLIOTT et al., 2015).

In vitro, il a été démontré qu’à pression d’oxygène réduite le développement du parasite se fait

mal dans le globule rouge (GR) AS, où s’observe une diminution de la densité parasitaire. Ces

GR AS seraient captés préférentiellement par la rate. De plus dans les GR AS il y aurait

interférence dans le remodelage des filaments d’actine de l’hôte par le parasite pour la formation

du sillon de Maurer nécessaire à ses trafics protéiques entre le milieu intra et extracellulaire

(CYRKLAFF et al., 2011 ; KILIAN et al., 2015).

Les sujets HbS exprimeraient également des titres élevés d’anticorps IgG contre les protéines

de surface de P. falciparum que les sujets HbAA d’où leur élimination précoce par le système

immunitaire (VERRA et al., 2007).


II.1.4 Hémoglobine C

L'hémoglobine C (Hb C) est l'une des variantes les plus courantes d'hémoglobine structurelles

dans la population humaine. La forme βc de l’hémoglobine est induite par la mutation génétique

de « transition » du sixième codon du premier exon du gène de la globine β6 (GAG

AAG) donnant comme conséquence la substitution de l’acide glutamique par la lysine (β6Glu-

>Lys).

II.1.4.1 Epidémiologie

L’hémoglobine C s’observe essentiellement chez les sujets d’ascendance noire. Le gène βc

semble avoir son origine dans la zone ouest de l'Afrique. L’hémoglobine C se trouve dans

diverses populations d'Afrique, d'Europe du Sud et en Amérique centrale (Figure 14), bien que

sa distribution allélique exacte à travers ces diverses populations reste encore à préciser (PIEL

et al., 2013b). Aux États-Unis, 2-3% des américains d’origine africaine sont hétérozygotes pour

l'Hb C, et environ 1 sur 5000 sont homozygotes. Les plus hautes fréquences de l’hémoglobine

C ont été rapporté en Afrique de l’Ouest principalement au Burkina Fao, au Ghana et au Togo

avec des fréquences alléliques supérieures à 15% (PIEL et al., 2013b).

Figure 14 : Répartition de l’hémoglobine C dans le monde (PIEL et al., 2013b)

II.1.4.2 Physiopathologie

L'hémoglobine C est moins soluble que l'hémoglobine A dans les globules rouges. En effet

l’hémoglobine C est susceptible d’interactions électrostatiques entre les groupes de ß6-lysyl

chargés positivement et les groupes chargés négativement des molécules adjacentes.


Il en résulte la formation de cristaux, pouvant conduire à une augmentation de la viscosité

sanguine et une rigidité cellulaire avec une diminution de la longévité des globules rouges.

Contrairement à la drépanocytose, l’HbC ne provoque pas de polymérisation intracellulaire

linéaire au niveau des zones intravasculaires de faible tension d'oxygène. Ainsi, bien qu'on

observe une légère déformabilité des globules rouges associée à la variante Hb C, cela

n’entraine pas de vaso-occlusion. Les états hétérozygotes aussi bien qu’homozygotes peuvent

induire une déshydratation des érythrocytes, et une Concentration Corpusculaire Moyenne en

Hémoglobine élevée (CCMH) peut être notée sur un hémogramme complet. Les individus

homozygotes porteurs de l’HbC développent une splénomégalie, des calculs biliaires et une

anémie modérée, tandis que les hétérozygotes sont asymptomatiques. Les patients atteints du

trait de l'hémoglobine C (HbAC) sont phénotypiquement normale sans symptômes

cliniquement évidents. Bien que les complications cliniques de la maladie de l'hémoglobine C

ne soient pas graves, l’association avec d'autres hémoglobinopathies telles que l'hémoglobine

S peut avoir des conséquences importantes.

II.1.4.3 Rapport entre l’hémoglobine C et le Paludisme

L’hémoglobine C aurait été sélectionnée sous la pression positive du paludisme à travers

l’Afrique de l’Ouest, principalement au Burkina Faso, au Ghana et au Togo où on observe des

fréquences élevées de cette mutation (PIEL et al., 2015). En effet un certain nombre d'études

suggèrent que l'hémoglobine C à l’instar de l’hémoglobine S, protège contre le paludisme en

fournissant un avantage évolutif sélectif à des gens qui expriment cette variante de

l'hémoglobine dans les régions où cette maladie est endémique (MODIANO et al., 2008).

Des études in vitro ont montré la baisse des taux de multiplication des parasites dans les HbCC

en comparaison aux globules rouges HbAA. Ainsi l'effet inhibiteur de l'Hb C sur la parasitémie

serait dû à une faible expression de PfEMP1 impliqué dans les phénomènes de cytoadhérence

et de rosetting et à une stimulation des réponses immunitaires dès les premiers stades de

l’infection (VERRA et al., 2007). Plusieurs études ont démontré la protection de l’HbC contre

le paludisme au Mali (TRAVASSOS et al., 2015), au Burkina Faso (MODIANO et al., 2001b;

MODIANO et al., 2008), et au Ghana (GHANSAH et al., 2012). Modiano et collaborateurs

dans leur étude cas-témoins au Burkina Faso ont trouvé une forte association entre la résistance

au paludisme clinique et de la présence de la variante Hb C à la fois à l’état hétérozygote (29%

de réduction du risque) qu’à l'état homozygote (93% de réduction du risque). Quelques études

cas-témoins et des études transversales n’ont rapporté aucune association entre Hb C et une

incidence réduite de la parasitémie (AMOAKO et al., 2014).


Les fréquences élevées de l’allèle C observées en Afrique de l’Ouest ainsi que l’absence de

pathologies majeures chez les sujets HbAC et HbCC en comparaison aux sujets HbSS et HbSC,

suggère qu’à long terme sous la pression du paludisme on assistera à un remplacement de

l’allèle S par l’allèle C dans cette zone (MODIANO et al., 2001b).

II.1.5 Techniques de diagnostic des hémoglobines anormales

II.1.5.1 Techniques d’électrophorèse et de chromatographie

La plupart des hémoglobines anormales (mais non toutes) ont une charge électrique différente

de celle de l’hémoglobine adulte normale. En soumettant une hémoglobine suspecte à une

migration électrophorétique, on peut reconnaître sa migration anormale et découvrir ainsi la

cause d’une anémie. La technique utilisée pour le dépistage est l’électrophorèse sur acétate de

cellulose à pH alcalin dans laquelle les hémoglobines migrent vers l’anode. Elle tend à être

remplacée par l’électrophorèse capillaire, rapide et automatisable (CAQUET, 2010). L’HbS

migre sur acétate de cellulose en pH alcalin, entre l’hémoglobine A et l’hémoglobineA2 de la

même manière que de nombreux autres mutants (comme D ou G, voir figure ci-dessous). Il est

donc nécessaire, pour bien l’identifier, d’avoir recours à un second critère comme

l’électrophorèse sur gel d’agar à pH acide. L’HbC migre plus lentement que la S en gel d’agar

à pH acide. De l’anode vers la cathode on trouve donc les HbA, S et C. Dans ce système, HbS

se détache nettement. Ces deux méthodes sont complétées par un test de solubilité (ou test

d’Itano) mettant en évidence la polymérisation de l’hémoglobine S qui précipite en présence de

dithionite de sodium alors que les autres hémoglobines restent en solution. La Chromatographie

Liquide Haute Performance (CLHP) permet d’identifier avec précision l’homozygotie pour

l’HbS, l’hétérozygotie composite pour l’HbS et l’HbC (HbSC), l’hétérozygotie composite pour

l’HbS et la β-thalassémie.

II.1.5.2 Techniques de biologie moléculaire

Une variété de techniques basées sur l’amplification de l’ADN génomique par PCR ont été

développées pour le diagnostic des mutations du gène de la beta globine. Le matériel de base

utilisé pour l’extraction d’ADN est le plus souvent du sang total prélevé sur tube EDTA. La

recherche d’une mutation connue peut être réalisée, en alternative au séquençage, par une PCR-

RFLP, par PCR en temps réel avec révélation par sondes fluorescentes spécifiques ou encore

par la technique de reverse dot-blot (OLD, 2003).


II.2 Déficit en G-6-PD

La Glucose-6-phosphate déshydrogénase est une enzyme ubiquitaire présente dans le

cytoplasme de toutes les cellules. Elle catalyse la première étape de la voie des pentoses

phosphates qui génère le Nicotinamide Adénosine Dinucléotide Phosphate réduit (NADPH),

coenzyme de la glutathion-réductase (HOWES et al., 2013a).

Le déficit en G-6PD touche principalement la lignée érythrocytaire. Tout au long de sa vie, le

globule rouge est soumis à des agents oxydants menaçant l’intégrité de sa membrane et de

l’hémoglobine. La lutte contre ces agressions oxydantes se fait grâce à l’action de la glutathion-

réductase en présence de NADPH (MEGARBANE, 2008). Cependant, contrairement aux

cellules des autres tissus qui possèdent de nombreuses voies de régénération de la NADPH,

pour les globules rouges qui manquent de noyau, de mitochondrie et d’autres organites, la G-

6-PD est particulièrement importante dans la lutte contre le stress oxydatif (CAPPELLINI et

FIORELLI, 2008). En effet dans les érythrocytes, la voie des pentoses phosphates avec pour

enzyme clé la G-6-PD, demeure la seule source de production de NADPH, coenzyme essentiel

à la lutte contre les agressions oxydantes.

II.2.1 Définition

Le déficit en G-6-PD est une pathologie génétique liée au chromosome X due à un déficit en

G-6-PD, une enzyme indispensable à la survie des globules rouges (FUZIER, 2015).

II.2.2 Historique

Les premiers éléments rapportés sur cette anomalie génétique datent de l’antiquité avec

Pythagore interdisant à ses élèves de manger les fèves (Vicia faba), probablement pour leur

effet potentiellement pathogène (HOWES et al., 2013a).

À partir de la fin du XIXe siècle, des cas de plus en plus nombreux d’accidents liés à leur

ingestion, voire à l’inhalation de leurs pollens, sont rapportés dans la littérature (WAJCMAN

et GALACTEROS, 2004).

En 1952, lors de campagnes militaires américaines en Asie, des études au chrome-51 avaient

permis de démontrer qu’une hémolyse corpusculaire se produisait lorsque des globules rouges

provenant de sujets sensibles étaient injectés à des sujets normaux recevant de la primaquine, à

la différence des globules rouges normaux injectés à des sujets sensibles à la primaquine


En 1956, Carson découvre que les globules rouges pathologiques présentaient un faible taux

d’activité de la G-6-PD (CARSON, 1956).


En 1958, Childs détecte l’anomalie génétique responsable sur le chromosome X, expliquant

pourquoi la transmission de ce déficit touche principalement les hommes (CHILDS, 1958).

En 1959, Beutler décrit le mécanisme biochimique de l’anémie hémolytique après la prise de

médicaments oxydants (BEUTLER, 1959).

En 1986, le gène du déficit en G6PD est cloné et séquencé (MARTINI et al., 1986)

En 1989, l’OMS publie dans son bulletin la première étude synthétique de ce déficit, réalisée

avec le concours de biochimistes, d’hématologues et de pédiatres.

Depuis, les travaux sur cette enzymopathie se sont multipliés afin de mieux comprendre les

aspects génétiques, moléculaires et physiopathologiques en cause.

II.2.3 Epidémiologie

Le déficit en G-6-PD est l’enzymopathie héréditaire la plus fréquente dans le monde. On estime

à environ 470 millions de personnes affectées par la maladie soit près de 5% de la population

mondiale (HO et JOHN, 2015). Sa répartition mondiale n’est pas le fait du hasard. Elle reflète

le seul avantage conféré par la maladie aux patients atteints : une résistance accrue au

paludisme. Cette hypothèse, désormais communément admise, a longtemps été suggérée par

la remarquable concordance de répartition géographique entre les zones d’endémie du

paludisme et du déficit en G-6-PD (HOWES et al., 2013a). La fréquence des mutations varie

considérablement entre les différentes populations (Figure 15). Sa prévalence est surtout élevée

dans les régions tropicales, environ 25% de la population. Parmi les nombreux variants

moléculaires connus du déficit en G-6-PD, le plus répandu est la G-6-PDA‐ avec une prévalence

de 11% à 13% chez les afro-américains (HO et JOHN, 2015). Il concerne 90 % des patients

déficitaires en Afrique tropicale.


Figure 15 : Prévalence du déficit en G-6-PD et distribution mondiale des différents variants

déficitaires (LUZZATTO et al., 2016)

Du fait des migrations de populations, la prévalence du déficit en G-6-PD est en nette

augmentation dans certains pays d’Europe du Nord, en Amérique du Nord et du Sud. Il est

également fréquent là où l’on trouve des personnes originaires d’Afrique tropicale : en

Amérique du Nord, du Sud et dans les Antilles. Mais on le rencontre aussi en Italie, aux Îles

Canaries, en Espagne, au Portugal, dans le Moyen‐Orient et le Proche‐Orient

(ALLAHVERDIYEV et al., 2012).

Le deuxième variant le plus répandu est la G-6-PD Méditerranéen (G-6-PDMed) avec une

prévalence de l’ordre de 2 à 20% dans différentes populations, exception faite des Juifs kurdes

où sa prévalence est estimée à 70% (PETERS et VAN NOORDEN, 2009). Il est présent dans

tous les pays du pourtour de la Méditerranée. Il est également répandu au Moyen‐Orient. C’est

quasiment le seul variant présent chez les Juifs kurdes ainsi qu’en Inde et en Indonésie. Dans

de nombreuses populations, on note la coexistence des variant G-6-PDA‐ et G-6-PDMed : c’est

le cas des pays du Golfe Persique (HOWES et al., 2013a).


II.2.4 Manifestations cliniques

L’apparition des symptômes chez un patient présentant un déficit en G-6-PD dépend de deux

facteurs principaux à savoir le niveau du déficit en G-6-PD chez l’hôte et l’intensité du stress

oxydatif au sein des érythrocytes (HO et JOHN, 2015). La principale manifestation clinique du

déficit en G-6-PD est l’hémolyse qui peut se traduire selon trois tableaux à savoir :

L’anémie hémolytique aiguë, induite par l’ingestion de certains médicaments ou

aliments, ou au cours d’une infection ;

L’anémie hémolytique chronique ;

L’ictère néonatal, avec dans les cas les plus sévères et non traités des séquelles

neurologiques.

Le plus souvent, en dehors des formes d’anémie hémolytique chronique qui sont rares, le patient

déficitaire ne présente aucun symptôme particulier. Une grande hétérogénéité clinique est

observée selon la nature moléculaire du déficit et l’activité résiduelle de l’enzyme dans le

globule rouge (Tableau I). La classification de l’OMS du déficit en G-6-PD se fonde sur le

niveau d’activité érythrocytaire de l’enzyme et l’importance des manifestations cliniques.

Tableau i : Classification OMS des variants enzymatiques de la G-6-PD

Classification actuelle Proposition de classification

Classe

Activité

enzymatique

Expression

clinique

Exemple de

Variants Génétique

Classe

Activité

enzymatique

I

<10%

Hémolyse

chronique

(Ictère néonatal)

Guadalajara, Nara,

Sunderland

I

<10%

II

<10%

Hémolyse

intermittente

Méditerranéen,

Union, Canton

II + III

<30%

III 10 à 60% Hémolyse suite

à un stress

oxydatif

G-6-PDA-, Mahidol,

Seattle

IV 100% Aucune G-6-PDB ;

G-6-PDA IV >85%

V

>100%

Aucune

-

-

-

Adapté de (LUZZATTO et al., 2016)


II.2.5 Aspects génétiques

Le gène codant pour la G-6-PD est situé sur la partie télomérique du bras long du chromosome

X, en position q28. Il est localisé à proximité du gène responsable de l’hémophilie A. Il s’étend

sur environ 18 kb et comporte 13 exons et 12 introns (Figure 16). L’exon 13 a une taille

d'environ 800 nucléotides de long et contient le codon d'arrêt de traduction. La région codante

est divisée en 12 segments dont la taille varie entre 12 pb et 236 pb. Le premier exon ne contient

aucune séquence codante connue et l'intron 2 situé entre les exons 2 et 3 est extraordinairement

long, avec une taille d’environ 9857 pb (ALLAHVERDIYEV et al., 2012). Le rôle de cet intron

demeure encore inconnu bien qu’on le retrouve chez d’autres espèces animales autres que

l’homme.

Figure 16 : Organisation du gène G-6-PD humain (CAPPELLINI et FIORELLI, 2008)

Les bases génétiques et la grande variabilité de l’enzyme ont été établies. La séquence complète

du gène est connue. En effet il s’agit de l’un des gènes les plus polymorphiques du génome

humain avec au moins 186 mutations décrites (MINUCCI et al., 2012). L’analogie de séquence

du gène entre l’homme et la souris est de 87%. La plupart des dissemblances de séquence se

retrouve dans la région 3' UTR (UnTranslated Régions), constitué de 600 nucléotides en

moyenne et contient un seul site polyA (ALLAHVERDIYEV et al., 2012).

La maladie est liée au chromosome X avec une transmission récessive. Les garçons

hémizygotes et les filles homozygotes expriment totalement le déficit. La maladie touche donc

essentiellement les individus de sexe masculin (90 %) (Figure 17a) et sa transmission se fait

par les personnes de sexe féminin en général « porteuses saines ». Les filles hétérozygotes

présentent une forme variable, en général très modeste, du déficit du fait de l’inactivation

(Figure 17b) par lyonisation du chromosome X déficitaire (HO et JOHN, 2015).

La plupart des mutations du gène de la G-6-PD sont des mutations ponctuelles et de petites

délétions altérant la structure enzymatique. L’absence de mutations sévères indique qu’un

déficit absolu en G-6-PD pourrait être létal (LONGO et al., 2002).


Dans la plupart des cas, les mutations entrainent une instabilité de l’enzyme ou une altération

de son activité, par diminution de son affinité vis-à-vis de ses substrats, NADP+ ou glucose-6-

phosphate (LUZZATTO, 2006).

Figure 17 : Expression de la déficience en G-6-PD chez les hommes (A) et inactivation

aléatoire du chromosome X chez les femmes (B) (LYON, 1961).

II.2.6 Polymorphismes de la G-6-PD

Le déficit en G-6-PD présente un grand polymorphisme avec plus de 400 variants génotypiques

décrits selon plusieurs paramètres. La G-6-PDB est l’allèle sauvage, son activité enzymatique

et sa mobilité électrophorétique constituent la référence (ALLAHVERDIYEV et al., 2012).


Le variant G-6-PDA est observé avec une grande fréquence dans les populations d’ascendance

noire avec une prévalence de l’ordre de 20% à 40% chez les hommes africains et environ 20%

des hommes africains-américains sont touchés par cette anomalie génétique

(ALLAHVERDIYEV et al., 2012). Elle diffère du variant G-6-PDB par sa mobilité

électrophorétique plus anodique, par une substitution de nucléotide de l’adénine par la guanine

en position 376 ; ce qui résulte en une substitution de l’asparagine par l’acide aspartique au

niveau de la chaîne peptidique en position 126. Le variant G-6-PDA présente 90% de l’activité

enzymatique de la forme normale G-6-PDB.

Le variant G-6-PDA- retrouvé chez environ 11% des africains-américains, résulte d’une

seconde mutation sur un gène G-6-PDA. Il présente entre 10-20% de l’activité de la G-6-PDB

avec une mobilité électrophorétique similaire à la G-6-PDA (CARTER et al., 2011). La seconde

mutation couramment détectée sur le gène G-6-PDA est une substitution au niveau de l’exon 4

ou l’adénine remplace la guanine en position 202 sur la chaîne de nucléotides. Cela conduit au

remplacement de la valine par la méthionine en position 68 sur la séquence des acides aminés.

Cependant d’autres mutations autres que la mutation G202A sur l’exon 4 du gène conférant la

déficience en G-6-PD ont été identifiées en Afrique de l’Ouest. Ce sont les mutations A542T

sur l’exon 6, G680T sur l’exon 7 et T968C sur l’exon 9 du gène de la G-6-PD


Le variant G-6-PD Méditerranéen : Ce variant répandu dans la région méditerranéenne et au

Moyen-Orient, a une même mobilité électrophorétique que la G-6-PDB. Sa demi-vie est de 8

jours et on assiste également à un déficit de synthèse. Il possède moins de 10% de l’activité de

la G-6-PDB. Il résulte de deux mutations : la cytosine (C) remplace la thymine (T) en position

563 sur la chaîne de nucléotides ce qui conduit au remplacement de la sérine par la

phénylalanine en position 188 sur la séquence des acides aminés. La seconde mutation est

silencieuse et se traduit par un remplacement de la cytosine par la thymine en position 1311.

D’autres variants A- tels les variants Canton, Mahidol, Seattle et Union existent dans le Sud-

Est asiatique et dans d’autres parties du monde (Figure 18).


Figure 18 : Répartition des mutations fréquentes le long de la séquence codante du gène G6PD


Légende : Les exons sont présentés sous forme de cases numérotées de 2 à 13 de la gauche

vers la droite. Les cercles vides représentent des mutations qui causent des variants de classe

II ou III tandis que les cercles pleins indiquent des variants de classe I. Les carrés pleins sont

de petites délétions et la croix représente une mutation non-sens tandis que la lettre "F" désigne

une mutation du site d'épissage.

II.2.7 Rôle de la glucose-6-phosphate déshydrogénase

L’activité de la G-6-PD est nécessaire à la survie des hématies étant donné qu’elle catalyse la

première étape de la voie des pentoses phosphate, seule voie métabolique capable de générer

du pouvoir réducteur pour ces cellules dépourvues de mitochondries (HOWES et al., 2013a).

Elle transforme le glucose-6-phosphate en 6-phosphoglucono-δ-lactone, qui s’hydrolyse

classiquement en 6-phosphogluconate. Lors de cette réaction, une molécule de NADP+ est

réduite en NADPH, H+ (Figure 19). La seconde réaction de cette voie, transformation du 6-

phosphoglucono-δ-lactone en ribulose-5-phosphate, produit également du NADPH, mais, chez

les sujets déficitaires en G-6-PD, elle est totalement perturbée par le ralentissement de la

première étape. Le NADPH joue un rôle essentiel dans la réduction des agents oxydants, en

permettant dans le globule rouge en particulier, de maintenir le pool de glutathion réduit à un

niveau normal (HOWES et al., 2013a). Lorsque l’hématie possède une enzyme G-6-PD

efficace, elle résiste donc contre le stress oxydatif tandis qu’un déficit de l’enzyme G-6-PD

rend l’hématie vulnérable aux agressions oxydatives (molécules oxydantes, infections) avec

pour conséquences des anémies hémolytiques nécessitant parfois des transfusions sanguines.


Figure 19 : Rôle de la G-6-PD dans la prévention du stress oxydatif (LUZZATTO et al., 2016)

Légende : (A) Dans les hématies G-6-PD normale, la G-6-PD et la 6-phosphogluconate

déshydrogénase, génèrent suffisamment de NADPH permettant la régénération du GSH quand

celui-ci est oxydé par les espèces réactives de l'oxygène (par exemple, O2- et H2O2). O2

- est

l’une des formes les plus réactives de l’oxygène pouvant être générée à partir du métabolisme

de composés pro-oxydants, tels que la primaquine ; l’uricase, ou entrainer directement la

production du peroxyde d'hydrogène en quantité équimolaire à l'acide urique dégradé. (B)

Dans les globules rouges G6PD déficientes, où l'activité enzymatique est réduite, la production

de NADPH est limitée et il peut ne pas être suffisante pour faire face à l'excès de réactif des

espèces d'oxygène généré en présence de composés pro-oxydants.


II.2.8 Déficit en G-6-PD et paludisme

Il existe une forte relation entre le paludisme et le déficit en G6PD. L’hypothèse a été admise

que le déficit en G-6-PD confère une protection contre le paludisme sévère. Elle a longtemps

été suggérée par la remarquable concordance de la répartition géographique entre les zones

d’endémie du paludisme et celles du déficit en G-6-PD (HOWES et al., 2013a).Ces

observations révèlent deux faits importants. D’une part, les déficits en G-6-PD de classe II ou

III de l’OMS assurent une relative protection contre le paludisme, principalement contre les

infections à Plasmodium falciparum. En effet, les zones de déficit en G-6-PD de classe II et III

se superposent avec la zone d’infestation par Plasmodium falciparum (WAJCMAN et

GALACTEROS, 2004). D’autre part, l’utilisation des antipaludiques peut entrainer une anémie

hémolytique chez les patients présentant un déficit en G-6-PD (Figure 20).

Figure 20 : Relation triangulaire entre la primaquine, la G-6-PD et Plasmodium falciparum

(LUZZATTO et SENECA, 2014)

Dans diverses études épidémiologiques, il a été démontré que plus de 85% des variantes

génétiques ayant atteints des fréquences polymorphiques, sont enregistrées dans les populations

tropicales et subtropicales où le paludisme est endémique (ALLAHVERDIYEV et al., 2012).

En Afrique et Asie du sud-est, où l’infection à Plasmodium falciparum est endémique,

l’incidence du déficit en G-6-PD est estimée à plus de 10 % de la population.


Au contraire, au Japon, au Nord de la Chine et en Europe du Nord, zones géographiques

historiquement indemnes de paludisme, l’incidence du déficit en G-6-PD est inférieure à 0,1

(MURA et al., 2009). Il existe également des incidences très variables entre les ethnies d’une

même région (Vietnam du Nord) selon qu’elles vivaient traditionnellement en dehors ou au sein

des zones d’endémie palustre (MATSUOKA et al., 2005). Les hommes hémizygotes déficients

développent moins la maladie que les individus porteurs de l’allèle sauvages du gène de la G-

6-PD. Généralement l’infection à Plasmodium falciparum n’est pas létale pour les personnes

exprimant le déficit en G-6-PD, probablement parce que le parasite prolifère moins dans leurs

érythrocytes (HOWES et al., 2013a).

Des expériences in vitro ont également montré que les hématies présentant une activité normale

en G-6-PD sont 2 à 80 fois plus susceptibles d’être infectées par Plasmodium falciparum.

Cependant les femmes hétérozygotes représentent un défi particulier en raison du phénomène

de la lyonisation. En conséquence, l'activité enzymatique de la G-6-PD peut varier en fonction

des proportions de cellules normales et déficientes qui sont inactivées chez chaque individu


Les mécanismes de protection dans les études d’association du déficit en G-6-PD et le

paludisme demeurent controversés (JOHNSON et al., 2009). En effet les études sur

l’association, déficit en G-6-PD et paludisme grave, ont montré, soit une diminution du risque

de paludisme grave chez les hommes hémizygotes (GUINDO et al., 2007), soit une réduction

de ce risque (SIRUGO et al., 2014; UYOGA et al., 2015) ou sans association avec ce risque

chez les femmes hétérozygotes (GUINDO et al., 2007). D’autres études d’association ont

également rapporté des effets de protection du déficit en G-6-PD contre le paludisme cérébral

et une augmentation du risque du paludisme avec anémie sévère (SHAH et al., 2016). Les

études d’associations avec le paludisme simple ont été plus contradictoires, certaines montrant

un déficit en G-6-PD ayant un effet protecteur chez les femmes hétérozygotes (BIENZLE et

al., 1979; RUWENDE et al., 1995; CLARK et al., 2008), ou sans effet sur l'incidence du

paludisme simple chez les hommes hémizygotes ou les femmes hétérozygotes (ENEVOLD et

al., 2005). En revanche, d'autres études ont montré une augmentation de l'incidence du

paludisme simple chez les femmes hétérozygotes pour le déficit en G-6-PD (PARIKH et al.,

2004).

II.2.9 Techniques de diagnostic de la déficience en G-6-PD

Il existe plusieurs méthodes de diagnostic du déficit en G-6-PD telles que le Fluorescent spot

test aussi appelé « spot test de Beutler », le dosage spectrophotométrique de l’activité

enzymatique qui est le test de référence permettant la mise en évidence du déficit en G-6-PD.


On distingue également la détection cytochimique des femmes hétérozygotes et les techniques

de biologie moléculaire que nous avons utilisées dans notre étude, qui décèlent la ou les

mutation(s) génétique(s) sur l'ADN et permettent ainsi de déterminer le variant en cause.

L’intérêt de cette technique est surtout de diagnostiquer le déficit en G-6-PD chez une femme

susceptible d’être porteuse hétérozygote mais chez qui le dosage spectrophotométrique de

l’activité enzymatique de la G-6-PD est négatif.

II.2.9.1 Génotypage par PCR/RFLP

Principe

La PCR-RFLP est basée sur la digestion enzymatique de l’ADN amplifié par PCR. Des

endonucléases de restriction spécifiques, reconnaissent et coupent l’ADN dans la région de la

mutation ponctuelle des produits PCR. Le type de SNP est facilement identifié en fonction de

la taille des fragments générés par la digestion enzymatique après migration sur gel

d’électrophorèse (OTA et al., 2007). En pratique, les régions contenant les sites de restriction

des mutations recherchées sont amplifiées par PCR à partir de l‘ADN génomique du patient à

tester grâce à des amorces spécifiques. Les produits PCR sont ensuite mis en présence des

enzymes de restriction appropriées.

II.2.9.2 Génotypage par PCR en temps réel

Principe

La particularité du système TaqManTM est d’exploiter l’activité 5’-3’ nucléase de l’ADN

polymérase qui permet d’hydrolyser la sonde hybridée à sa cible spécifique lors de l’étape

d’élongation des amorces (TSE et CAPEAU, 2003). Le principe est de construire deux sondes

TaqMan marquées avec deux fluorochromes différents, complémentaires respectivement de

l'allèle normal et de l'allèle muté, et de réaliser une PCR en présence de ces deux sondes. On va

donc détecter deux signaux différents correspondant aux produits de PCR de l'allèle normal et

de l'allèle muté, visibles par deux courbes d'amplification distinctes.

La sonde TaqMan est marquée de chaque côté par un fluorochrome (rapporteur et quencher),

de sorte que le rapporteur n'est fluorescent que lorsqu'il est séparé physiquement du quencher.

Lors de sa progression le long de la matrice pendant la phase d'élongation de la PCR, la Taq

polymérase dégrade l'extrémité 5' de la sonde lorsqu'elle la rencontre. Cela libère le rapporteur,

qui devient alors fluorescent.

MATERIEL

ET

METHODES


CHAPITRE III. MATERIEL ET METHODES

III.1 Cadre d’étude

Nos travaux de recherches ont été menés au Burkina Faso au Centre de Recherche

Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) et au Laboratoire de Biologie Moléculaire et de

Génétique (LABIOGENE) qui ont servi de cadre d’étude. Le Burkina Faso est un pays sahélien

enclavé situé au cœur de l’Afrique Occidentale. Il fait frontière avec le Mali, le Niger, le Bénin,

le Togo, le Ghana, et la Côte d’Ivoire. Il s’étend sur une superficie de 274 222 Km2 pour une

population de 17 880 386 habitants en 2014 (INSD, 2015). Ouagadougou sa capitale

administrative concentrait près de 1 915 102 habitants en 2012 (INSD, 2015). Au Burkina Faso

le paludisme est holoendémique avec la plupart des transmissions survenant pendant ou peu de

temps après la saison des pluies, de Juillet à Décembre (DIBOULO et al., 2016). En 2014 la

proportion du paludisme grave dans les principales causes de décès s’élevait à 26,2% (INSD,

2015).

Le LABIOGENE est un laboratoire de recherche de l’Ecole Doctorale Science et

Technologies (ED/ST) de l’Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO ayant reçu le label

de Centre d’Excellence de l’UEMOA.

Le CERBA est situé au secteur 51 de la ville de Ouagadougou. Il a été érigé en

Laboratoire National de Référence du HPV (LNR-HPV) depuis février 2015. Tout comme

l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO), il est dans le district sanitaire de

l’arrondissement 11. La capitale burkinabè compte 4 districts sanitaires (districts sanitaires de

Pissy, de l’ex secteur 30, de Kossodo et de Paul VI) (Figure 21). Dans le cadre d’un partenariat

solide, ces structures œuvrent à la promotion du développement de la santé au Burkina Faso et

en Afrique par la formation de jeunes médecins, pharmaciens et biologistes.

III.2 Sites de collecte

Les échantillons de la première étude ont été collectés de manière aléatoire dans la commune

rurale de Koubri au Burkina Faso. Koubri est un village du Burkina Faso située à 25 km au Sud

de la Capitale, dans la province du Kadiogo et dans la région du Centre. En ce qui concerne les

échantillons de la deuxième étude, la collecte a été réalisée dans trois centres de la ville de

Ouagadougou. Il s’est agi du centre médical de Samandin situé dans l’arrondissement N°1, de

l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou situé dans l’arrondissement N°5 et du CERBA situé

dans l’arrondissement N°11.

http://fr.wikipedia.org/wiki/D%C3%A9partements_du_Burkina_Faso

http://fr.wikipedia.org/wiki/Burkina_Faso

http://fr.wikipedia.org/wiki/Provinces_du_Burkina_Faso

http://fr.wikipedia.org/wiki/Kadiogo

http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9gions_du_Burkina_Faso

http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9gion_Centre_(Burkina_Faso)


Figure 21 : Situation géographique de Koubri et différents districts sanitaires de la ville de

Ouagadougou adapté de (RICHARD et al., 2007)

III.3 Méthodologie de l’étude portant sur le polymorphisme génétique du

déficit en G-6-PD chez des personnes vivant en zone endémique du paludisme

au Burkina Faso

III.3.1 Type et période d’étude

Il s’est agi d’une étude transversale avec une collecte rétrospective des données visant à

rechercher les mutations responsables du déficit en G-6-PD. L’étude s’est déroulée sur une

période d’environ un an allant du 25 Avril 2013 au 15 Mars 2014.

III.3.2 Population d’étude

La population de cette étude était constituée d’individus bien portant sans distinction d’âge, de

sexe ou d’ethnies, recrutés de manière aléatoire dans le village de Koubri en collaboration avec

le Centre de Santé et de Promotion Sociale (CSPS) de Koubri/District Sanitaire de Bogodogo.

Il s’agit d’une communauté rurale où les retenues artificielles d’eau sont propices au

développement du vecteur du paludisme toute l’année.


Pour être inclus dans l’étude les sujets majeurs devaient avoir pris connaissance de la fiche

d’information, l’avoir lu et compris puis approuver librement et volontairement la fiche

individuelle de consentement éclairé. Pour les sujets mineurs, le consentement éclairé des

parents ou tuteur légal étaient requis. Toute personne porteuse de toute forme de paludisme

grave selon les critères de l’OMS ou de toutes autres pathologies ou encore présentant une

allergie aux antipaludiques utilisés (Artésunate-Amodiaquine (AS+AQ) et Artéméther-

Lumefantrine (AM-L)) n’était pas inclus dans l’étude.

III.3.3 Echantillonnage

III.3.3.1 Taille de l’échantillon

Au total 200 échantillons ont été analysés par PCR en temps réel et PCR/RFLP pour la

recherche des mutations responsables du déficit en G-6-PD. La taille d'échantillon a été

déterminée par la formule de SWARTZ :

n = z² * p * (1-p) / m² = (1,96)² x 0,092 x (1- 0,092)/(0,05)² = 128 + 72 = 200

n : Taille d'échantillon minimale pour l'obtention de résultats significatifs pour un

événement et un niveau de risque fixé

z : Niveau de confiance (la valeur type du niveau de confiance de 95 % sera 1,96)

p : Fréquence du déficit en G-6-PD au Burkina Faso (0,09) (CARTER et al., 2011)

m : Marge d'erreur (généralement fixée à 5 %)

III.3.3.2 Prélèvements sanguins

Les échantillons sanguins veineux (environ 5 mL de sang par sujet adulte et 3 mL de sang par

enfant de moins de 5 ans) ont été prélevés sur des tubes imprégnés d’EDTA. Une partie du

prélèvement a été utilisée pour la recherche et la quantification des parasites du paludisme au

microscope optique et la réalisation des analyses hématologiques. L’autre partie a subi une

centrifugation à 15 000 rpm pendant 5mn pour séparer le plasma et le culot. Des aliquotes de

ces derniers ont été réalisés et conservés à -20°C. Le culot a été utilisé pour extraire l’ADN afin

de faire le génotypage de la déficience en G-6-PD.


III.3.4 Analyses biologiques

III.3.4.1 Numération formule sanguine

Les paramètres hématologiques ont été déterminés à partir des prélèvements sanguins dans des

tubes EDTA, à l’aide d’un automate d’hématologie CELL-DYN Ruby (Abbott Laboratories,

Abbott Park, IL, USA) (Figure 22). L’hémogramme était réalisé dans le plus bref délai soit au

maximum 1 heure après le prélèvement. Pour le dosage de l'hémoglobine, l’automate CELL-

DYN Ruby utilise le principe de la spectrophotométrie. Après lyse des globules rouges,

l'hémoglobine est convertie en un chromogène stable. L'absorbance lue est directement

proportionnelle à la concentration en hémoglobine. La numération plaquettaire repose sur le

principe de l'analyse par diffraction-polarisation multi-angulaire (Multi-Angle Polarized Scatter

Separation ou MAPSS) en cytométrie de flux.

Figure 22 : Automate CELL-DYN Ruby

III.3.4.2 Electrophorèse de l’hémoglobine

La détermination du type d’hémoglobine a été faite sur la chaîne d’électrophorèse HELENA

(Helena Biosciences Europe, Queensway South, Gateshead Tyne and Wear NE II OSD)

(Figure 23) selon le protocole décrit par le fabriquant. L’hémolysât a été préparé en mélangeant

1 volume de sang total à 3 volumes du réactif d’hémolyse Helena (0,005 M d’EDTA et 0,01%

de cyanure de potassium). L'électrophorèse a été réalisée à 350 V pendant 25 minutes dans un

tampon Acide borique/Tris-EDTA (pH 8,4, force ionique = 0,035).


Figure 23 : Appareil d’électrophorèse de type HELENA

III.3.5 Recherche des mutations responsables de la déficience en G-6-PD

III.3.5.1 Extraction de l’ADN

L’ADN génomique a été extrait à partir du culot de sang par la méthode du salting-out qui

comporte plusieurs étapes décrit dans le protocole à l’annexe I.

Cinq cent microlitres de culot de sang ont été mélangé à un tampon de lyse (annexe II) pour

faire éclater les hématies. Les débris cellulaires sont ensuite éliminés par centrifugation. A la

fin de la série de lavage à l’eau distillée, le culot cellulaire contenant les leucocytes est traité

par un mix contenant le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) et la protéinase K.

Le SDS permet l’élimination ou la séparation des lipides membranaires tandis que la protéinase

K entraine l’élimination des protéines de l’extrait cellulaire. Ces dernières seront par la suite

relarguées par l'intermédiaire de la force ionique du NaCl (5M).

La précipitation de l'ADN génomique est effectuée en utilisant une solution d'éthanol absolu

suivie deux lavages à l’éthanol 70% à froid. Les tubes sont ensuite séchés à bouchon ouvert

pour faire évaporé toute l’éthanol et l’ADN est enfin dissout dans un tampon d’élution et

conservé à -20°C.


III.3.5.2 Génotypage par PCR en temps réel

Tous les échantillons ont d’abord fait l’objet d’un génotypage pour la mutation A376G et ceux

qui étaient hémizygotes, homozygotes ou hétérozygotes pour cette mutation ont ensuite subi un

génotypage pour les autres mutations G202A, A542T, G680T et T968C. En effet, les

échantillons ayant l’allèle sauvage (A) pour la mutation A376G sont du génotype B, et seuls

ceux ayant l’allèle mutant (G), de génotype A, peuvent être A- par accumulation d’une seconde

mutation.

Protocole de la PCR en temps réel

Préparation des échantillons pour l’amplification

La PCR en temps réel a été réalisée dans un volume réactionnel total de 25 µL comprenant 5

µL d’ADN (4ng/µL), 12,5 µL de TaqMan Universal PCR Master Mix (2X), 6,25 µL d’eau

stérile et 1,25 µL de SNP mix (40X). Les mutations A376G, G202A et A542T ont fait l’objet

d’un génotypage selon la méthode décrite par CLARK et collaborateurs en 2009 en utilisant les

sondes TaqMan (Applied Biosystem, Foster City, California, USA) suivantes : rs1050828 (G-

6-PD G202A), rs1050829 (G-6-PD A376G) et rs5030872 (G-6-PD A542T).

Programme d’amplification sur le 7500 Fast Real-Time PCR System

95° C pendant 10 minutes (Activation de la Taq polymérase)

92° C pendant 15 secondes (Dénaturation)

60° C pendant 1 minute (Hybridation)

Figure 24 : Appareil 7500 Fast Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA)

40 cycles


III.3.5.3 Génotypage par PCR-RFLP

Protocole de la PCR-RFLP

Préparation des échantillons pour l’amplification

La PCR-RFLP a concerné les mutations G680T et T968C sur les échantillons

homo/hémizygotes ou hétérozygotes pour le SNP A376G. Elle a été réalisée selon la méthode

décrite par BEUTLER et al. (1989) dans un volume réactionnel de 25 µL composé de 12,5 µL

de AmpliTaq Gold® 360 Master Mix (2x), 1 µL d’enhancer, 3,125 µL d’amorces sens et anti-

sens (10µM) et 3,25 µL d’eau stérile et 2 µL d’ADN (50 - 100 ng/µL) de chaque échantillon.

Les couples d’amorces utilisées étaient les suivantes : 5’-ACATGTGGCCCCTGCACCAC-3’

(sens) ; 5’GTGACTGGCTCTGCCACCCTG-3’ (anti-sens) pour la G-6-PD (G680T) et 5’-

TCCCTGCACCCCAACTCAAC-3’ (sens) ; 5’-CCAGTTCTGCCTTGCTGGGC-3’ (anti-

sens) pour la G-6-PD (T968C).

Programme d’amplification sur le GeneAmp PCR system 9700

Pour la mutation G680T



69° C pendant 45 secondes (Hybridation) 30 Cycles Mutation G680T

72° C pendant 45 secondes (Elongation)

72° C pendant 7 minutes (Extension finale)

Pour la mutation T968C



65° C pendant 45 secondes (Hybridation) 30 Cycles Mutation T968C

72° C pendant 45 secondes (Elongation)



Figure 25 : Thermocycleur GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)

Digestion enzymatique et migration su gel d’agarose

Les produits PCR des mutations G680T et T968C ont été digérés en utilisant les enzymes de

restriction BstOI (source : Bacillus stearothermophilus O22, séquence reconnue : CCWGG) et

NciI (source : Neisseriacinerea ; séquence reconnue : CCSGG) respectivement (Promega no.

R6931, 10 U/µL (BstOI) ; no. R7061, 12 U/µL (NciI) ; Promega Corp., Madison, USA). La

digestion enzymatique a été effectuée pendant 16 heures à la température optimale (60° C pour

BstOI et 37° C pour NciI) dans un volume réactionnel total de 20 µL constitué dans l’ordre de :

16,3 µL d’eau stérile, 2 µL de RE 10X Buffer, 0,2 µL de BSA acétylé (10 µg/µL), 0,5 µL

d’enzyme et 1 µL de produit PCR. Les génotypes ont été déterminés après migration sur gel

d’agarose 2% à 120 Volt pendant 45 minutes et révélation sous UV en faisant un spectre

d’absorption d’environ 320 nm.

Pour la préparation du gel d’agarose 2%, un mélange de 4g d'agarose et 200 mL de Tris-Borate-

EDTA (TBE) 1X est mis à cuire à la micro-onde (2mn, 460W). On y ajoute ensuite 16 μL de

Bromure d’Ethidium (BET) après un léger refroidissement (10 mg/mL). Le gel d’agarose est

coulé délicatement dans le moule. Après la solidification du gel d’agarose à température

ambiante, le moule contenant le gel d’agarose solide est enfin placé dans la cuve à

électrophorèse contenant le tampon de migration. Pour la migration, 3 µL de bleu de charge est

ajouté aux amplicons d’ADN de chaque échantillon. Le dépôt des échantillons (5 µL du

mélange bleu de charge + amplicons d’ADN) sur le gel d’agarose est effectué en s’assurant que

le tampon de migration couvre entièrement le gel d’agarose de quelques millimètres.

http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_stearothermophilus

http://en.wikipedia.org/wiki/Neisseria_cinerea


III.4 Méthodologie de l’étude portant sur l’hétérogénéité allélique du déficit

en G-6-PD chez des personnes malades du paludisme dans la ville de

Ouagadougou au Burkina Faso

III.4.1 Type et période d’étude

Il s’est agi d’une étude transversale visant à déterminer les variants génotypiques de

l’hémoglobine et du déficit en G-6-PD chez des personnes malades du paludisme. Elle s’est

déroulée sur une période allant du 27 Septembre 2014 au 05 Mars 2016.

III.4.2 Population d’étude

La population de la seconde étude était composée d’individus de plus d’un an, venant en

consultation de médecine générale dans les trois centres de santé retenus pour la collecte des

échantillons. Après suspicion du paludisme chez ces patients et leur orientation au laboratoire

pour les examens, ceux dont les Tests Rapides d’Orientation Diagnostic (TROD) du paludisme

étaient positifs ont été retenus pour l’étude avec leur consentement libre et éclairé sous réserve

d’une goutte épaisse positive. Les patients dont la goutte épaisse était négative ainsi que ceux

de moins d’un an n’ont pas été inclus dans l’étude. En effet la méthode d’électrophorèse à pH

alcalin utilisée au cours de l’étude est peu performante avant la première année de vie de

l’enfant car les Hb S, F, et A sont trop rapprochées.

III.4.3 Echantillonnage

III.4.3.1 Taille de l’échantillon

Pour cette seconde étude, un ensemble de 182 échantillons ont été analysés par PCR classique

et PCR en temps réel pour la détermination des mutations impliquées dans le déficit en G-6-

PD. La taille d'échantillon a été déterminée par la formule de SWARTZ : n = z² * p * (1-p) / m²

= (1,96) ² x 0,095 x (1- 0,095) / (0,05) ² = 132 + 50 avec p = fréquence du déficit en G-6-PD au

Burkina Faso (0,095) (OUATTARA et al., 2014).

III.4.3.2 Prélèvements

Nos échantillons étaient constitués de prélèvements sanguins veineux (5 mL de sang par sujet

adulte et 3 mL de sang par enfant) dans des tubes EDTA. Le prélèvement a été utilisé pour la

réalisation d’une Numération Formule Sanguine (NFS), d’une électrophorèse de l’hémoglobine

et d’une goutte épaisse. Par la suite, l’échantillon a été centrifugé à 15000 rpm pendant 5

minutes. Le plasma et le culot ont été séparés et conservés à -80°C. C’est le culot qui a été

utilisé pour extraire l’ADN afin de déterminer les mutations impliquées dans le déficit en G-6-

PD.


II.4.4 Détection de Plasmodium falciparum

III.4.4.1 TROD SD Bioline Malaria Ag P.f/Pan

Les TROD ont été réalisés par piqûre du bout de doigt des patients orientés au laboratoire pour

suspicion du paludisme. Le Test Rapide d’Orientation Diagnostic SD BIOLINE Malaria Ag

P.f/Pan est un test immunologique, qualitatif et différentiel permettant la détection de l’antigène

HRP2 (Histidine-Rich Protein 2) spécifique à Plasmodium falciparum et de l’antigène pLDH

(Plasmodium Lactate Déshydrogénase) commune aux espèces de Plasmodium dans le sang

total humain. Le test détecte ces différents antigènes plasmodiaux par chromatographie de sang

total sur une membrane de nitrocellulose sur laquelle ont été fixés des anticorps monoclonaux

spécifiques des antigènes recherchés. La capture éventuelle est révélée simultanément par

d’autres anticorps monoclonaux couplés à de l’or colloïdal et présents dans le tampon de

migration. En cas de positivité, un sandwich « Ac monoclonal - Ag plasmodial- Ac monoclonal

marqué » est donc réalisé.

III.4.4.2 Goutte épaisse

Les lames de goutte épaisse (Figure 26), obtenu en déposant une goutte de sang au milieu d'une

lame de microscope et en l’étalant à l'aide du coin d'une autre lame jusqu'à l’obtention d’un

diamètre d’environ 10 à 15 mm, ont été colorées pendant 10 minutes dans une solution de

Giemsa à 10%. La lecture des lames séchées a été réalisée à l’aide d’un microscope optique à

l’objectif 100 avec l’huile à immersion. Les trophozoïtes ont été décomptés concomitamment

à 200 leucocytes et la densité parasitaire a été calculée suivant la formule :

Nombre de parasites relevés x 8000

Nombre de parasites/µL de sang =

Nombre de leucocytes comptés

Figure 26 : Une goutte épaisse


III.4.5 Analyses biologiques

III.4.5.1 Numération formule sanguine

Les paramètres hématologiques ont été déterminés à partir des prélèvements sanguins dans des

tubes EDTA, à l’aide d’un compteur hématologique ABX micros 60 (ABX Diagnostics,

Montpellier, France) (Figure 27). La numération formule sanguine était réalisée dans le plus

bref délai soit au maximum 1 heure après le prélèvement. Pour le dosage de l'hémoglobine,

l’automate ABX micros 60 utilise également la spectrophotométrie tandis que pour la

numération plaquettaire la mesure est réalisée par la méthode impédentielle (variation

d'impédence engendrée par le passage des plaquettes).

Figure 27 : Automate ABX micro 60

III.4.5.2 Electrophorèse de l’hémoglobine

La détermination du type d’hémoglobine a été faite à l’aide d’une électrophorèse à pH alcalin

sur une bande d’acétate de cellulose : CELLOGEL (5,7×14 cm) (Figure 28). Le tampon utilisé

était du tris-glycine pH 9,5. Pour le lavage, 4 mL de solution physiologique (NaCl à 0,9 %) ont

été ajoutés à 250 µL de culot globulaire de chaque échantillon. Le mélange a ensuite été

homogénéisé par retournements successifs puis centrifuger à environ 3000 rpm pendant 5

minutes. L'élimination du surnageant a été effectué à l’aide d’une pipette Pasteur en veillant à

aspirer la couche cellulaire supérieure pour éliminer les globules blancs. Les cellules ont enfin

été lysées avec 500 µL de saponine 1%. A l’aide de tubes capillaires, des spots d’échantillons

ont été déposés sur le CELLOGEL. La migration s’est effectuée en 60 minutes à 150 V en

moyenne.


Figure 28 : Cuve et générateur pendant la migration

III.4.6 Recherche des mutations responsables de la déficience en G-6-PD

III.4.6. 1 Extraction de l’ADN

L’ADN génomique a été extrait à partir du culot de sang par la méthode du salting-out comme

précédemment décrit.

III.4.4.2 Génotypage par PCR classique

La PCR classique a été réalisée avec le kit GENESPARK G6PD African. La PCR a lieu dans

un volume réactionnel de 25 μL composé de 12,5 μL de PCR Multiplex Smart Mix (2x), 2 μL

de Primer Mixture (G-6-PD-African), 8,5 µL d’eau stérile et 2 μL d’ADN (50 - 100 ng/μL) de

chaque échantillon. Le mix, les amorces, l’eau stérile, et les contrôles sont fournis par le

fabricant. Les individus de sexe féminin présentant des mutations en position 202 et/ou 376 ont

été repris par PCR en temps réel pour les classer en homozygotes et hétérozygotes.


Le programme d’amplification

L’amplification a été réalisée à l’aide du thermocycleur GeneAmp® PCR system 9700 suivant

le programme d’amplification présenté ci-dessous.

95° C pendant 15 minutes (Activation de l’ADN polymérase)


60° C pendant 40 secondes (Hybridation) 30 Cycles

72° C pendant 1 minute (Elongation)


La migration sur gel d’agarose

Le produit PCR a subi une électrophorèse, sur gel d’agarose 2 % (4g d’agarose dans 200 µL de

Tris-Borate-EDTA (TBE 1X)) contenant 8 µL de BET, à 120 volts pendant 45 minutes.

L’électrophorèse a été réalisée dans un tampon TBE 1X ; le tampon étant légèrement basique

(pH = 8,2), l’ADN s’ionise sur ses groupements phosphates et migre vers l’anode (borne rouge

sur la figure 29 ci-dessous).

Figure 29 : Dispositif d’électrophorèse des amplicons G-6-PD (BioRad, USA)

G202A, A376G, A542T,

G680T, C563T et T968C


La révélation des bandes

Les bandes obtenues ont été révélées sous UV à 320 nm au moyen de l’appareil GENE FLASH

(Figure 30). Le BET fluorescent aux UV s’intercale entre les bases de l’ADN et permet la

visualisation des fragments dans le gel placé sous UV.

Figure 30 : GENEFLASH

Interprétation des résultats

Les bandes obtenues après migration sur gel d’agarose ont été interprétées au moyen d’une

table fournie par le fabriquant (Figure 31).


Figure 31 : Table d’interprétation des bandes après l’électrophorèse sur gel d’agarose

III.6 Analyse statistique

Les données ont été ordonnées et enregistrées sur Microsoft Excel 2013 d’un micro-ordinateur.

Les analyses ont été effectuées à l’aide des logiciels Statistical Package for Social Sciences

(SPSS) 21.0 et Epi Info version 7. Le test de chi carré a été utilisé pour les comparaisons. La

différence a été considérée significative pour p < 0,05.

III.7 Considérations éthiques

La réalisation de la présente étude a été approuvée par le Comité d’éthique de Recherche en

Santé (CERS) du Burkina Faso (Délibération n° 2014-9-128). Les personnes adultes ont signé

les fiches de consentement de manière volontaire et anonyme (annexe III), et les consentements

éclairés des enfants ou mineurs ont été obtenus de leurs parents ou tuteurs légaux (annexe IV).

Tous les examens ont été pris en charge par l’étude. Les résultats de l’électrophorèse et de la

Numération Formule Sanguine ont été remis aux patients ou à leur médecin traitant pour leur

suivi médical. A la fin de la collecte après numérisation anonyme des données, les fiches de

consentement éclairé et de collectes ont été déposées dans les archives du

CERBA/LABIOGENE à l’abri de toute utilisation pouvant enfreindre les règles éthiques. Seuls

les investigateurs de l’étude ont accès à ces dossiers.

RESULTATS


CHAPITRE IV : RESULTATS

IV.1 Résultats des travaux portant sur le polymorphisme génétique du déficit

en G-6-PD chez des personnes vivant en zone endémique du paludisme au

Burkina Faso

IV.1.1 Bref rappel du contexte et but de l’étude

La revue de la littérature indique que le variant G-6-PDA- (202A/376G) est l’allèle déficient le

plus fréquent en Afrique subsaharienne. Des études récentes réalisées dans la sous-région ont

également montré la présence d’autres mutations ponctuelles telles que la G-6-PD Santamaria

(376G/542T), et la G-6-PD Betica-Selma (376G/968C) associées à la déficience avec des

fréquences relativement élevées. Au Burkina Faso, les rares études de génotypage se sont

intéressées uniquement au variant G-6-PDA- (202A/376G). Cette approche est restrictive et

pourrait donc entraîner une sous-estimation de la prévalence réelle du déficit en G-6-PD dans

nos populations. De plus plusieurs travaux ont démontré le rôle protecteur du déficit en G-6-

PD contre les formes sévères du paludisme. Quant à son rôle au niveau des formes

asymptomatiques très peu d’études s’y sont intéressées.

IV.1.2 Rappel de l’objectif de l’étude

L’objectif de l’étude était de déterminer par PCR en temps réel et par PCR/RFLP les génotypes

de quatre combinaisons de mutations impliquées dans le déficit en G-6-PD en corrélation avec

le paludisme asymptomatique en zone rurale au Burkina Faso.

IV.1.3 Marqueurs génétiques et paludisme asymptomatique

IV.1.3.1 Caractéristiques socio-démographiques de la population d’étude 1

Deux cents (200) personnes recrutées de façon aléatoire au CSPS de Koubri ont été inclus dans

cette étude. La population d’étude était constituée de 42,0% (84/200) d’hommes et de 58,0%

(116/200) de femmes. L’âge était compris entre 1 et 79 ans avec une moyenne de 19,7 ± 20,1

ans. Les enfants dont l’âge était inférieur à 5 ans représentaient 43,0% de la population d’étude

contre 57,0% d’individus qui avaient un âge supérieur ou égal à 5 ans.


IV.1.3.2 Prévalence de la déficience en G-6-PD et des génotypes de l’hémoglobine

La prévalence du déficit en G-6-PD a été évaluée par PCR en temps réel (Figure 32) et par

PCR/RFLP (Figure 33) dans notre population d’étude. Environ trois quarts des sujets (74,5%)

étaient porteurs de l’allèle normal G-6-PDB, les femmes hétérozygotes représentaient 16,0%

(32/200) tandis que 9,5% (19/200) étaient porteurs du génotype déficient G-6-PDA-

(376G/202A). Tous les autres génotypes déficients Santamaria (376G/542T), 376G/680T et

Betica Selma (376G/968C) n’ont pas été retrouvés chez les individus de ce groupe (Tableau II).

La prévalence des hommes hémizygotes pour le déficit en G-6-PD était significativement plus

élevée comparativement aux femmes homozygotes (14,3% vs 6,0% ; p = 0,049).

Le génotypage de l’hémoglobine a été effectué chez 143 personnes parmi lesquelles les femmes

représentaient 60,1 % (86/143) contre 39,9 % (57/143) d’hommes. Les génotypes de

l’hémoglobine AA, AC, AS, CC et SC avaient respectivement une prévalence de 72,0 %,

17,5%, 7,7%, 0,7% et 2,1%. La fréquence de HbS était de 0,049 contre 0,105 pour HbC dans

notre population d’étude. Nous n’avons pas observé de différence statistiquement significative

en comparant la répartition des génotypes de l’hémoglobine en fonction du sexe, de l’âge ou du

statut G-6-PD (Tableau III).

Figure 32 : Résultats du génotypage de la mutation G202A par PCR en temps réel


Figure 33 : Fragments G680T et T968C après amplification PCR

On distingue les marqueurs de poids moléculaire (M) dans la première colonne à gauche. Les

colonnes 2 à 11 de la gauche vers la droite, montrent des fragments de 242 paires de bases

(pb) correspondant aux amplicons de l’exon 7 du gène G-6-PD (des échantillons E1 à E10) qui

comporte la mutation G680T, tandis que les colonnes 13 à 22 montrent des fragments de 282

paires de bases correspondant aux amplicons de l’exons 9 du gène G-6-PD qui comporte la

mutation T968C.

Tableau ii : Prévalence des 4 combinaisons de mutations responsables de la déficience en G-

6-PD

Genotypes G-6-PD N %

Hommes

84

-

202A/376G hémizygotes 12 14,3

376G/542T 0 0

376G/680T 0 0

376G/968C 0 0

G-6-PD normal 72 85,7

Femmes

116

-

202A/376G homozygotes 7 6,0

202A/376G hétérozygotes 32 27,6

376G/542T 0 0

376G/680T 0 0

376G/968C 0 0

G-6-PD normal 77 66,4


Tableau iii : Répartition des génotypes de l’hémoglobine selon l’âge, le sexe et le statut G-6-

PD

Caractéristiques AA AC AS CC SC Total

N (%)

Sexe

F 61 (42,6) 16 (11,2) 7 (4,9) 1 (0,7) 1 (0,7) 86 (60,1)

M 42 (29,4) 9 (6,3) 4 (2,8) 0 (0,0) 2 (1,4) 57 (39,9)

Total 103 (72,0) 25 (17,5) 11 (7,7) 1 (0,7) 3 (2,1) 143 (100)

Tranche

d’âge

5 ans 40 (28,0) 7 (4,9) 5 (3,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 52 (36,4)

5 – 15 ans 5 (3,5) 4 (2,8) 0 (0,0) 1 (0,7) 0 (0,0) 10 (7,0)

15 ans 58 (40,5) 14 (9,8) 6 (4,2) 0 (0,0) 3 (2,1) 81 (56,6)

Total 103 (72,0) 25 (17,5) 11 (7,7) 1 (0,7) 3 (2,1) 143 (100)

Statut

G-6-PD

Non déficients 65 (45,4) 13 (9,1) 7 (4,9) 0 (0,7) 1 (0,7) 86 (60,1)

Déficients 9 (6,3) 3 (2,1) 1 (0,7) 0 (0,7) 1 (0,7) 14 (9,8)

Hétérozygotes 29 (20,3) 9 (6,3) 3 (2,1) 1 (0,7) 1 (0,7) 43 (30,0)

Total 103 (72,0) 25 (17,5) 11 (7,7) 1 (0,7) 3 (2,1) 143 (100)


asymptomatique

La présence de Plasmodium falciparum a été recherchée chez 15/19 personnes déficientes.

L’absence de parasites a été notée chez 8/15 (53,3%) individus. Chez les personnes non

déficientes, l’absence de parasitémie a été retrouvée chez 57,0% (69/121) d’individus. La

présence de Plasmodium falciparum a également été évaluée chez les femmes hétérozygotes

pour la G-6-PD.


Aucune différence statistiquement significative n’a été trouvée en comparant la prévalence de

l’infection à Plasmodium falciparum entre les personnes déficientes et non déficientes d’une

part, et d’autre part entre les personnes non déficientes et les hétérozygotes. Cependant la

moyenne géométrique des parasites chez les personnes infectées des trois groupes était

significativement plus élevée chez les personnes non déficientes comparativement aux

personnes déficientes et chez les personnes non déficientes comparativement aux hétérozygotes

(Tableau IV).

La corrélation entre les génotypes de l’hémoglobine et la parasitémie est résumée dans le

tableau V. La prévalence de l’infection à Plasmodium falciparum était de 37,9% (39/103) chez

les personnes de génotype AA pour l’hémoglobine contre 55,0% (22/40) chez les personnes

porteuses d’allèles S et/ou C (AC, AS, CC, SC). La différence de l’infection n’était pas

statistiquement significative entre les individus de génotypes AA et les porteurs d’allèles S et/ou

C (p = 0,06).

L’analyse du taux de la parasitémie a concerné les 61 personnes de l’étude ayant subi le

génotypage pour l’hémoglobine et positives à l’infection à Plasmodium falciparum. Le degré

de parasitémie était similaire chez les personnes de génotypes AA comparativement aux

personnes porteuses de l’allèle S et/ou C (p 0,05).

Cependant bien que limité dans nos analyses statistiques par cette faible taille d’échantillon, on

notait une moyenne géométrique de la parasitémie relativement plus élevée chez les individus

HbAA par rapport aux personnes HbAC (965,301 vs 653,987 parasites/µL) et HbAS (965,301

vs 583,788 parasites/µL). Comparativement à ces trois groupes on notait également une

parasitémie plus basse chez les trois (03) individus doubles hétérozygotes SC de notre étude

(145,370 parasites par/µL) même si l’unique individu de génotype CC présentait une forte

parasitémie (16630,000).


Tableau iv : Prévalence de l’infection à Plasmodium falciparum et moyenne géométrique de

la parasitémie chez les personnes infectées en fonction de la déficience en G-6-PD

Présence de parasites dans l’ensemble de la population

Absence N (%)

Présence N (%)

Total

p

Déficients 8 (53,3) 7 (46,7) 15 (100)

0,78

Non déficients 69 (57,0) 52 (43,0) 121 (100)

Non déficients 69 (57,0) 52 (43,0) 121 (100)

0,62

Hétérozygotes 14 (51,9) 13 (48,1) 27 (100)

Nombre de parasites chez les personnes infectées

[Minimum-Maximum] Moyenne géométrique

(Nb de trophozoïtes/µL)

P

Déficients [40 – 2400] 204

<0,001

Non déficients [40 – 180300] 1104

Non déficients [40 – 180300] 1104

<0,001

Hétérozygotes [80 – 6520] 628


Tableau v : Génotypes de l’hémoglobine et infection à Plasmodium falciparum

Caractéristiques AA P-value AC AS CC SC Total

N = 143

Négatifs 64

0,06a

14 4 0 0 82

Infection Positifs 39 11 7 1 3 61

Total 103 25 11 1 3 143

N = 61

1000 23 0,72a 6 5 0 3 37

Parasitémie

1000 – 10 000 11 0,64a 4 1 0 0 16

10 000 5 0,96a 1 1 1 0 8

Total 39 11 7 1 3 61

Moyenne

géométrique

965,301

0,052b

0,062c

653,987

583,788

16630,000

145,370

810,845

a AA vs (AC + AS +CC + SC) b AA vs AC c AA vs AS

IV.1.3.4 Conclusion partielle

Les résultats de ces travaux montrent que seul le variant 202A/376G est impliqué dans les cas

de déficit en G-6-PD dans notre population d’étude. De plus la déficience en G-6-PD joue un

rôle dans la protection contre les formes asymptomatiques du paludisme à Plasmodium

falciparum. L’étude démontre également qu’il n’y a pas de corrélation entre le statut G-6-PD

et les génotypes de l’hémoglobine et que les variants S et C de l’hémoglobine ne confèrent

aucune protection contre l’infection asymptomatique à Plasmodium falciparum.


IV.2 Résultats des travaux portant sur l’hétérogénéité allélique du déficit en

G-6-PD chez des personnes malades du paludisme dans la ville de

Ouagadougou au Burkina Faso

IV.2.1 Bref rappel du contexte et but de l’étude

Le gène responsable du déficit en G-6-PD est un gène très polymorphique avec les variants A-

202A/376G, Santamaria (376G/542T) et Betica Selma (376G/968T) connus dans les

populations d’Afrique de l’Ouest. Il conférerait une protection contre les formes sévères du

paludisme bien qu’il existe des divergences de point de vue quant aux mécanismes de la

protection entre les différentes études d’associations. Bien que les résultats de notre première

étude aient également démontré que seul le variant G-6-PD A- 202A/376 est impliqué dans les

cas de déficit en G-6-PD au Burkina Faso, une confirmation de l’absence des autres variants G-

6-PD A- dans nos populations demeure nécessaire.

IV.2.2 Rappel de l’objectif de l’étude

L’objectif de cette étude était de rechercher par PCR classique et PCR en temps réel six (06)

SNPs du gène G-6-PD en corrélation avec le paludisme symptomatique en zone urbaine au

Burkina Faso.

IV.2.3 Marqueurs génétiques et paludisme symptomatique

IV.2.3.1 Caractéristiques sociodémographiques et cliniques

Cette deuxième population d’étude était constituée de 50,5% (92/182) d’hommes et de 49,5%

(90/182) de femmes, âgés de 1 à 72 ans avec un âge moyen de 17,1 ± 13,9 ans. Les enfants de

moins de 5 ans représentaient 19,2% (35/182) de la population d’étude tandis qu’on notait

46,7% (85/182) d’individus de plus de 15 ans. L’analyse sociodémographique a montré que

les 182 patients inclus dans cette étude étaient de différents groupes ethniques. Les Mossis

représentaient l’ethnie majoritaire avec une proportion de 76,4% (139/182) d’individus dont les

deux parents étaient de ce groupe ethnique (Tableau VI). Il faut noter que la moitié du groupe

« Autres » (10/20) était constituée de groupes ethniques des pays de la sous-région avec une

prédominance des nigérians (6/10). Plus de 43% des patients de notre étude avaient commencé

un traitement avant la réalisation de la goutte épaisse. La population d’étude était en conformité

avec l’équilibre d’Hardy-Weinberg (p = 0,464).


IV.2.3.2 Prévalence du déficit en G-6-PD et des génotypes de l’hémoglobine

L’analyse des résultats de la PCR classique a donné plus de 64% (58/90) de femmes porteuses

des mutations en position 202 et/ou 376. Vingt-cinq (25) d’entre elles ont été classées en

homozygotes et hétérozygotes par la PCR en temps réel. Le génotypage du déficit en G-6-PD

a révélé une prévalence de 78,6% d’individus G-6-PD normal (29,7% de génotype B, 13,2% de

génotype A, 20,9% BB, 12,1% BA et 2,7% AA) contre 9,9% de personnes

hémizygotes/homozygotes pour le déficit en G-6-PD (8,8% 202A/376G et 0,5% 376G/968C).

Il faut noter que les deux parents de l’individu G-6-PDA- (376G/968C) étaient Mossi tandis

que les parents de l’individu de sexe féminin porteur du variant G-6-PDA- Santamaria

(376G/542T) étaient du groupe ethnique Gouro de la Côte d’Ivoire. La figure 34 présente les

bandes des différentes variantes observées après électrophorèse. Les femmes hétérozygotes

représentaient 11,5% (6,6% BA- et 4,9% AA-) de la population d’étude. La prévalence des

hommes hémizygotes était significativement plus élevée que les femmes homozygotes pour le

déficit en G-6-PD (15,5% vs 4,4% avec p = 0,015). La prévalence des génotypes de

l’hémoglobine était estimée à 73,6%, 22,5% et 2,2% respectivement pour les génotypes AA,

AC et AS. La fréquence de l’allèle HbS était de 0,014 contre 0,126 pour l’allèle HbC. La

répartition de ces génotypes était similaire selon le sexe et le statut G-6-PD (Tableau VII).

Figure 34 : Les différentes bandes après l’électrophorèse (A) l’échantillon n°17 porte les

mutations 376G/968C (B) l’échantillon n°30 porte les mutations 202A/376G/542T. SM =

Standard Marker, MTC = Mutant Type Control, IC = Internal Control


Tableau vi : Caractéristiques de la population d’étude selon les génotypes HBB et fréquence

des allèles HbS et HbC

Répartition des sujets selon les génotypes HBB, No. Fréquence

Facteurs AA AC AS CC SC Total HbS HbC

Sexe

Homme 68 20 3 1 0 92 0,016 0,120

Femme 66 21 1 1 1 90 0,011 0,133

Statut G-6-PD

Non déficients 106 32 3 1 1 143 0,014 0,122

Hétérozygotes 18 3 0 0 0 21 0,000 0,071

Homo/hémizygotes 10 6 1 1 0 18 0,028 0,222

Groupe d’âge

< 5 ans 25 9 1 0 0 35 0,014 0,129

5 – 15 ans 47 10 3 2 0 62 0,024 0,113

> 15 ans 62 22 0 0 1 85 0,006 0,135

Total 134 41 4 2 1 182 0,014 0,126


symptomatique

La moyenne du taux de l’hémoglobine de la population d’étude était de 11,7 g/dL ± 1,9. Environ

66,0% (120/182) des patients avaient un taux d’hémoglobine supérieur à 11g/dL. La majorité

(89,9% soit 29/35) des enfants de moins de 5 ans présentait un taux d’hémoglobine inférieur à

11g/dL. Cependant la répartition du taux d’hémoglobine et de l’hématocrite était similaire selon

le statut G-6PD et le génotype de l’hémoglobine. Dans le groupe des personnes n’ayant pas

commencé le traitement avant la réalisation de la goutte épaisse, la moyenne géométrique de la

parasitémie était relativement plus faible chez les personnes hémizygotes/homozygotes par

rapport aux personnes non déficientes (3101,494 parasites/µL vs 6879,702 parasites/µL). Les

femmes hétérozygotes de ce groupe présentaient une densité parasitaire similaire à celle des

personnes non déficientes (7796,907 parasites/µL vs 6879,702 parasites/µL). La corrélation

entre la moyenne géométrique de la densité parasitaire et le statut G-6-PD n’a cependant pas

donné de résultat statistiquement significatif (Tableau VIII). Chez les individus porteurs de

l’allèle S et/ou C (AS, AC, CC et SC) de l’hémoglobine on notait une densité parasitaire

moyenne de 2823,703 parasites/µL contre 4454,8813 parasites/µL pour les individus de

génotypes HbAA sans aucune différence statistiquement significative (p = 0,362).


Tableau vii : Caractéristiques sociodémographiques et cliniques selon du statut G-6-PD

Caractéristiques Homo et

hémizygotes

(N = 18)

Hétérozygotes

(N = 21)

Normaux

(N = 143)

Total

(N = 182)

P

Age (ans)

5, n (%) 4 (22,2) 0 (0,0) 31 (21,7) 35 (19,2)

5 à 15, n (%) 4 (22,2) 6 (28,6) 52 (36,3) 62 (34,1) 0,051

15, n (%) 10 (55,6) 15 (71,4) 60 (42,0) 85 (46,7)

Moyenne, [intervalle] 17,1 [1 - 34] 26,8 [7 - 60] 15,6 [1 - 72] 17.1 [1 - 72] 0,002

Parasitémie (parasites /µL)

1 000, n (%) 4 (22,2) 5 (23,8) 40 (28,0) 49 (26,9)

1 000 – 10 000, n (%) 6 (33,3) 5 (23,8) 40 (28,0) 51 (28,0) 0,927

10 000, n (%) 8 (44,4) 11 (52,4) 63 (44,0) 82 (45,1)

Moyenne géométrique µL-1

[Intervalle]

4235,470

[100 - 81300,0]

3750,758

[40 - 96000,0]

3945,445

[40 - 177778,0]

3950,090

[40 - 177778,0]

0,763

Génotypes de l’hémoglobine

HbAA, parasites moyenne/µL 6541.271 4511.546 4748.802 4454.813

0,362 HbS/C, parasites moyenne/µL 2211.760 1238.458 2320.111 2823.703

Hémoglobine, moyenne, g/dL 11,8961 11,9586 11,6349 11,6981 0,704

Hématocrite, moyenne % 37,0913 38,1373 35,1266 35,6529 0,368

Traitement

Non, n (%)

[Parasitémie moyenne/µL]

13 (72,2)

[9552,729]

12 (57,1)

[7796,907]

78 (54,5)

[6879,702]

103 (56,6)

[6312,948]

0,357

Oui, n (%)

[Parasitémie moyenne/µL]

5 (27,8)

[3101,494]

9 (42,9)

[1413,779]

65 (45,5)

[2024,546]

79 (42,9)

[2143,487]

0,500

Ethnies*

Mossi n (%) 13 (72,2) 14 (66,7) 112 (78,3) 139 (76,4)

Mixtes n (%) 4 (22,2%) 2 (9,5%) 17 (11,9%) 23 (12,6) 0,221

Autres n (%) 1 (5,6) 5 (23,8%) 14 (9,8) 20 (11,0)

*Mossi = individu dont les deux parents sont Mossi, Mixtes = Un des deux parents est Mossi,

Autres = Aucun des deux parents n’est Mossi

IV.2.4 Conclusion partielle

Les résultats de cette étude démontrent pour la première fois l’existence du variant A-

(376G/968C) au Burkina Faso. L’étude confirme également que, ni le déficit en G-6-PD ni les

variants S et C de l’hémoglobine ne confèrent une protection contre l’infection symptomatique

à Plasmodium falciparum.

DISCUSSION


CHAPITRE V : DISCUSSION GENERALE

La population générale de notre étude était constituée de 382 échantillons répartis en deux

groupes. Le premier groupe comptait 200 individus vivant dans une zone rurale où leur

exposition répétée au paludisme, ne prévient pas nécessairement l'infection, mais peut limiter

la densité et les symptômes du paludisme. Dans ce groupe, un génotypage par PCR en temps

réel pour les SNPs G202A, A376G, A542T et par PCR/RFLP pour les mutations G680T et

T968C impliquées dans le déficit en G-6-PD a été réalisé. Le second groupe était constitué de

182 patients malades du paludisme qui ont subi un génotypage par PCR classique et par PCR

en temps réel pour six mutations du gène G-6-PD.

V.1 Marqueurs génétiques et Paludisme asymptomatique

Les objectifs de cette étude étaient d’une part d’estimer la prévalence des génotypes de

l’hémoglobine et le polymorphisme génétique du déficit en G-6-PD au sein de notre population

d’étude et d’autre part de déterminer la corrélation entre ces anomalies génétiques et le

paludisme asymptomatique. En effet le paludisme asymptomatique reste un défi pour les

programmes de lutte contre le paludisme, car il influence de manière significative la dynamique

de la transmission de la maladie. Une compréhension approfondie de l'interaction entre hôte et

parasites dans le développement de différents tableaux cliniques est donc nécessaire. La

prévalence de la déficience en G-6-PD a été estimée chez 200 personnes recrutées dans une

communauté rurale (KOUBRI), en zone endémique du paludisme au Burkina Faso en

recherchant tous les génotypes déficients avec des fréquences polymorphiques connus dans la

sous-région. Il s’agit du variant déficient 202A/376G considéré comme le plus fréquent en

Afrique subsaharienne (BEUTLER et DUPARC, 2007), le variant Santamaria (376G/542T)

observé avec une fréquence élevée dans la population Sérère au Sénégal (DE ARAUJO et al.,

2006), le variant Betica Selma (376G/968C) considéré comme le variant déficient le plus

fréquent en Gambie (CLARK et al., 2009b) et le variant 376G/680T (BEUTLER et al., 1989).

Toutes les personnes déficientes de ce groupe étaient porteuses du variant G-6-PDA-

(202A/376G). Les résultats de notre étude sont similaires à ceux obtenus par Carter et al.,

(2011) dans six pays africains incluant le Burkina Faso, et confirme les résultats d’études

antérieures ayant montré que la G-6-PDA- (202A/376G) est le variant déficient le plus fréquent

en Afrique subsaharienne (HIRONO et BEUTLER, 1988, BEUTLER et DUPARC, 2007).


Le test de l’équilibre de Hardy-Weinberg déterminé chez les femmes selon la méthode de

CARTER et al., (2011); a donné une valeur de p = 0,698, qui montre qu’il n’y a pas de

différence significative entre la distribution observée et la distribution théorique. Par

conséquent notre population d’étude était en équilibre de Hardy-Weinberg.

La prévalence de la déficience en G-6-PD de 9,5% observée dans notre étude est comparable à

celle de 9,0% rapportée par CARTER et al., (2011) dans six pays africains dont le Burkina

Faso. Cependant, elle est inférieure aux prévalences de 19,6% et 16,3% rapportées

respectivement par MODIANO et al., (2001a) chez les mossi et les Rimaibé et par SIMPORE

et al., (2007) dans la population générale au Burkina Faso. Ces variations pourraient s’expliquer

par la taille de la population d’étude et la méthode de diagnostic utilisée (PCR en temps réel,

PCR/RFLP ou mesure de l’activité enzymatique), mais aussi par la difficulté de distinguer les

femmes hétérozygotes déficientes et non déficientes (PETERS et VAN NOORDEN, 2009). Le

génotypage seul ne permettant pas de déterminer le statut déficient ou non déficient des femmes

hétérozygotes. Par conséquent la prévalence du déficit de 9,5% observée dans cette étude

pourrait être plus élevée, si l’on déterminait par le test enzymatique le statut des femmes

hétérozygotes, car elles présentent une variété d’expression phénotypique à cause de la

lyonisation. En effet, au Nigéria une étude a montré que sur 81 femmes hétérozygotes 53%

avaient une activité G-6-PD normal, 33% étaient intermédiaire et 14% étaient biochimiquement

déficient (MAY et al., 2000).

Dans notre étude la prévalence des hommes hémizygotes pour le déficit en G-6-PD était

significativement plus élevée comparée aux femmes homozygotes (14,3%). Ces résultats sont

comparables à ceux rapportés par SIMPORE et al., (2007) qui avaient observé 20,5% de

déficience chez les hommes et 12,3% chez les femmes. En effet, la déficience en G-6-PD étant

une enzymopathie liée au chromosome X, elle se manifeste chez les hommes hémizygotes et

les femmes homozygotes. La probabilité qu’une femme hérite de deux chromosomes X malades

est faible. Par conséquent les hommes sont beaucoup plus touchés par la maladie que les

femmes qui sont généralement des porteuses saines. Dans ce groupe la prévalence des

génotypes HbAA, HbAC et HbAS était respectivement de 72,0%, 17,5% et 7,7%. Ces

prévalences sont similaires aux 73.2%; 15.0%; et 8.2% rapportées respectivement pour les

sujets HbAA, HbAC et HbAS par BOUGOUMA et al., (2012) au Burkina Faso ainsi qu’aux

prévalences rapportées par de nombreuses études menées en Afrique de l’Ouest et notamment

au Burkina Faso où l’hémoglobine C a une prévalence relativement élevée (MODIANO et al.,

2001b; DIALLO et al., 2004).


Cela pourrait s’expliquer par le fait que le gène βc trouve son origine dans la zone Ouest de

l’Afrique. La prévalence de l’infection était similaire chez les individus HbAA

comparativement aux individus porteurs d’allèles S et/ou C. Dans leur étude menée en 2008 au

Sénégal, VAFA et ses collaborateurs n’ont pas observé d’association entre le trait

drépanocytaire et l’infection asymptomatique à Plasmodium falciparum (VAFA et al., 2008).

En effet de nombreuses études d’associations ont montré que les allèles S et C de l’hémoglobine

ne conféraient pas une protection contre l’infection à Plasmodium mais plutôt contre la

progression de la maladie vers des formes sévères (AMOAKO et al., 2014; MANGANO et al.,

2015). En dépit de la faible taille de notre population qui a limitée certaines de nos analyses

statistiques nous avons pu observer une réduction de la charge parasitaire chez les sujets

porteurs d’allèles S et/ou C par rapport aux personnes HbAA. Ces résultats sont similaires aux

travaux de AKANBI, (2015) au Nigeria, TRAVASSOS et al., (2015) au Mali et MANGANO

et al., (2015) au Burkina Faso. MANGANO et collaborateurs ont observé que HbS à l’état

hétérozygote était associé à une réduction de 70% de la parasitémie à Plasmodium falciparum.

Les auteurs ont également noté une forte protection conférée par HbC à l’état homozygote.

Nous avons également étudié la corrélation entre le déficit en G-6-PD et le paludisme

asymptomatique. Dans ce groupe nous n’avons pas observé d’effet significatif du génotype de

la G-6-PD sur la prévalence de l’infection à Plasmodium falciparum. Cependant parmi les

personnes infectées, la parasitémie était significativement plus élevée chez les personnes non

déficientes par rapport aux personnes hémizygotes/homozygotes (p < 0,001) et les femmes

hétérozygotes (p < 0,001). Nos résultats sont comparables à ceux d’une étude faite au Gabon

ayant montré l’association entre déficience en G-6-PD et protection contre le paludisme

asymptomatique (MOMBO et al., 2003). Dans la même année au Gabon, MISSINOU et ses

collaborateurs ont démontré que les individus porteurs des mutations G-6-PD sont plus

susceptibles de faire une infection asymptomatique que les individus dépourvus de ces

polymorphismes (MISSINOU et al., 2003). En 2008 au Sénégal, VAFA et collaborateurs ont

également observé une densité parasitaire significativement plus faible chez les filles porteuses

de mutations G-6-PD comparativement à celles qui étaient G-6-PD normal (VAFA et al., 2008).

Ces résultats s’expliqueraient par le fait que la déficience en G-6-PD inhibe le développement

de Plasmodium falciparum. La quantité de G-6-PD décroit durant la vie de l’hématie rendant

les vielles hématies chez qui l’activité de la G-6-PD est en baisse, vulnérables au stress oxydatif

(RUWENDE et HILL, 1998).


En effet, Plasmodium falciparum très sensible aux agressions oxydatives, préfère envahir les

jeunes hématies avec une haute activité en G-6-PD plutôt que les vielles hématies où l’activité

de l’enzyme est faible, d’où la protection de la déficience en G-6-PD contre le Plasmodium

(ALLISON et CLYDE, 1961).

A l’échelle cellulaire, cela a été confirmé par les données relatives aux femmes hétérozygotes

parasitées par le Plasmodium. LUZZATTO et ses collaborateurs ont montré en 1969, que chez

ces femmes, la fréquence des hématies G-6-PD déficientes parasitées était, suivant les

individus, 2 à 80 fois plus faible que celle des hématies parasitées possédant l’enzyme G-6-

PD efficace (LUZZATTO et al., 1969).

En effet les allèles des gènes portés par un des chromosomes X s’expriment dans certaines

cellules tandis que les allèles de l’autre chromosome X s’expriment dans d’autres cellules, d’où

la présence de deux populations d’hématies chez les femmes hétérozygotes pour le gène de la

G-6-PD. Le variant G-6-PDA- (202A/376G) entraine une diminution de l’activité de la G-6-PD

de 10 à 20% par rapport à l’enzyme normale G-6-PDB (BEUTLER, 1991). D’une part cette

déficience créée un environnement défavorable à la survie de Plasmodium falciparum qui est

très sensible au stress oxydatif (CLARK et al., 1989). D’autre part, lorsqu’elles sont parasitées,

elles sont plus phagocytées à un stade où le parasite n’a pas encore réalisé sa multiplication. Il

en résulte une inhibition de la prolifération de Plasmodium et donc un paludisme moins sévère.

Avec l’agglutination précoce des hématies parasitées, le déficit en G-6-PD protège contre le

paludisme (CAPPADORO et al., 1998).

Des études ont montré que la déficience en G-6-PD protège contre le paludisme (ALLISON et

CLYDE, 1961; LUZZATTO et al., 1969), mais aussi qu’elle peut poser de graves problèmes,

notamment lors du traitement de cette maladie. En effet certains médicaments contre le

paludisme comme la primaquine, peuvent induire des crises hémolytiques chez les personnes

déficientes en G-6-PD (HOWES et al., 2013a).Cependant nous n’avons pas observés de

différence significative en comparant la moyenne du taux d’hémoglobine et celle l’hématocrite

d’une part, chez les personnes hémizygotes/homozygotes pour le déficit en G-6-PD et non

déficientes en G-6-PD et d’autre part, par rapport aux personnes non déficientes et les

hétérozygotes. Ces résultats sont comparables aux travaux antérieurs qui n’ont pas observé

d’effet significatif du génotype de la G-6-PD sur le taux d’hémoglobine (ENEVOLD et al.,

2008; CARTER et al., 2011).


Cela s’expliquerait par le fait que la déficience en G-6-PD est en général asymptomatique et

l’anémie hémolytique ne survient qu’en cas d’accident suite à l’ingestion de certains aliments

ou médicaments contre-indiqués pour les personnes déficientes en G-6-PD. Aussi la taille de

l’échantillon a également constitué une limite dans cette étude. Elle ne nous a pas permis de

faire la relation entre l’anémie et la déficience en G-6-PD chez les enfants et les adultes vivants

dans une zone d’endémie palustre.

Dans cette étude la relation entre la déficience en G-6-PD et le type d’hémoglobine n’a donné

aucune différence significative. Cependant dans une étude prospective transversale menée au

Sénégal en 2005, sur 319 personnes porteuses de l’hémoglobine S et 318 cas témoins appariés

selon l’âge et le sexe, DIOP et al. ont observé un déficit en G-6-PD significativement plus

élevé chez les drépanocytaires (21,6 %) que chez les témoins (12,3 %) (DIOP et al., 2005).

V.2 Marqueurs génétiques et Paludisme symptomatique

Les objectifs de notre deuxième étude étaient d’une part d’estimer la prévalence des génotypes

de l’hémoglobine afin de confirmer ou d’infirmer l’absence d’autres variants impliqués dans le

déficit en G-6-PD au Burkina Faso et d’autre part de déterminer la corrélation entre ces

anomalies génétiques et le paludisme symptomatique.

Il s’est agi de rechercher six (06) variants G-6-PDA- ainsi que la corrélation entre le déficit en

G-6-PD ou les génotypes de l’hémoglobine et le paludisme symptomatique chez 182 patients

souffrant de paludisme, recrutés dans la ville de Ouagadougou. Le déficit en G-6-PD présente

un grand polymorphisme avec de nombreux variants génotypiques connus en Afrique de

l’Ouest (MINUCCI et al., 2012). Ainsi le génotypage de six (06) SNPs impliqués dans cette

maladie génétique nous a permis d’évaluer la fréquence des différents variants déficients chez

des patients atteints de paludisme symptomatique. Il faut noter que le Kit GENESPARK G6PD

African (Immunospark, Rome, Italy) à travers une PCR classique suivie d’une électrophorèse

sans digestion enzymatique est commode et présente l’avantage de permettre le génotypage

simultané de six SNPs pour chaque échantillon. Cependant il présente une limite au niveau des

femmes car il indique la présence de la mutation sans permettre la distinction entre

homozygotes et hétérozygotes. La prévalence des homozygotes et hémizygotes pour le déficit

en G-6-PD était estimée à 9,9% (dans ce groupe. Cette prévalence est similaire à celles

rapportées par les études de génotypage au Burkina Faso et dans la sous-région (CARTER et

al., 2011, OUATTARA et al., 2014).


Selon le genre, on observait une prévalence des hommes hémizygotes pour le déficit en G-6-

PD (15,2%) significativement plus élevée que les femmes homozygotes (4,4%) du fait que la

maladie soit liée au chromosome X (OUATTARA et al., 2014). Parmi les personnes atteintes

du déficit en G-6-PD dans cette étude, le variant G-6-PDA- (202A/376G) était le variant le plus

fréquent. En effet, il a été observé dans 88,9% des cas de déficit. Ces observations sont

conformes aux études antérieures de génotypage menées dans la sous-région montrant que ce

variant est le plus fréquent dans la plupart des populations africaines (LUZZATTO, 2012,

OUATTARA et al., 2014). Dans cette étude, le variant G-6-PD Betica Selma (376G/968C) a

été retrouvé chez un individu du groupe ethnique Mossi. Ce variant observé avec des fréquences

relativement élevées dans la population gambienne (CLARK et al., 2009b), est identifié pour

la première fois au Burkina Faso. Une étude au Mali a rapporté en 2014, une fréquence élevée

de ce variant chez les Fulani (6,1%) comparativement aux Dogons (0,0%) (MAIGA et al.,

2014). Bien que ce variant présente donc une faible prévalence au sein du groupe ethnique

Mossi, sa fréquence pourrait être bien plus élevée au Nord du pays où prédomine le groupe

ethnique Fulani qui est moins susceptible au paludisme avec une faible prévalence du variant

G-6-PDA- (202A/376G) comparativement aux autres groupes ethniques (MODIANO et al.,

2001a) . Une des femmes déficientes de l’ethnie Gouro (Côte d’Ivoire) de notre étude portait le

variant A- (202A/376G) sur l’un de ses chromosomes X et le variant Santamaria (376G/542T)

sur le second chromosome X avec une très faible parasitémie. Toutes ces observations

suggèrent que ces variants existent dans nos populations même s’ils surviennent avec des

fréquences relativement faibles dans certaines zones. Les plus hautes fréquences de la G-6-PD

Santamaria ont été rapportées dans la population Sérère au Sénégal (DE ARAUJO et al., 2006).

Les observations de la présente étude indiquent une sous-estimation de la prévalence réelle du

déficit en G-6-PD dans la plupart des études de génotypage et pourraient expliquer en partie les

différences de fréquences du déficit entre ces études de génotypage et les études de mesure de

l’activité enzymatique (MODIANO et al., 2001a, SIMPORE et al., 2007). Nos résultats

suggèrent l’existence du variant G-6-PD Santamaria (376G/542T) en Côte d’Ivoire avec une

fréquence relativement élevée au sein du groupe ethnique Gouro. Les Gouro sont une

population Mandingue d’Afrique de l’Ouest principalement établie au Centre-Ouest de la Côte

d’Ivoire. Ce groupe ethnique partage probablement une histoire commune avec certaines

populations mandingues du Burkina Faso. Nous émettons donc l’hypothèse d’une fréquence

relativement élevée du variant G-6-PD Santamaria au sein de certains groupes ethniques du

Sud-Ouest du Burkina Faso.


Dans le cadre de cette étude, les patients ont subi une électrophorèse de l’hémoglobine. Un

syndrome drépanocytaire majeur (SC) a pu être mis en évidence chez 0,5% (1/182) des patients

et 2,2% (4/182) avaient le trait drépanocytaire AS. Les individus HbAC représentaient 22,5%

(41/182) de la population d’étude avec 1,1% (2/182) de sujets HbCC. La prévalence de

l’hémoglobine AC trouvée dans notre étude est comparable à celle (19,1%) trouvée par

SIMPORE et al. en 2007 et est supérieure à celle rapportée par KAFANDO et al. en 2005 chez

des nouveaux nés (15,4%) au Burkina Faso (KAFANDO et al., 2005). Des prévalences de

14,7% et de 13,0% d’hémoglobine AC ont été rapportées respectivement par AMOAKO et

collaborateurs au Ghana et TRAVASSOS et collaborateurs au Mali (AMOAKO et al., 2014;

TRAVASSOS et al., 2015). Toutes ces études montrent une fréquence élevée de l’hémoglobine

C dans la sous-région. En effet, l’Afrique de l’Ouest est située dans l’épicentre de

l’hémoglobine C (MODIANO et al., 2008).

Bien que des parasitémies réduites aient été observée dans certains cas (déficients vs Non

déficients en G-6-PD sans traitement ou sujets HbAA vs sujets HbS/HbC), l’ensemble des

analyses d’association entre le statut G-6-PD, les génotypes de l’hémoglobine et la densité

parasitaire, le taux d’hémoglobine ou l’hématocrite n’a pas donné de différences statistiquement

significatives. Nos résultats sont similaires à ceux rapportés par Carter et collaborateurs en 2011

dans six pays africains incluant le Burkina Faso (CARTER et al., 2011). Les auteurs n’avaient

pas observé d’effet significatif du génotype de la G-6-PD sur le taux d’hémoglobine et la

parasitémie. L’assortiment indépendant entre les génotypes de l’hémoglobine et le statut G-6-

PD est prévisible, du fait que les gènes respectifs soient sur différents chromosomes, et cela a

été rapporté dans une étude antérieure (LUZZATTO et ALLAN, 1968). Nos résultats

confirment également qu’il n’y a pas de protection contre l’infection palustre. En effet le déficit

en G-6-PD et les hémoglobinopathies S et C ne confèrent pas de protection contre l’infection à

Plasmodium falciparum mais pourraient plutôt permettre une évolution du paludisme vers la

guérison du malade. La protection par le déficit en G-6-PD contre les formes sévères ou contre

la mortalité palustre est connue, cependant le mécanisme de protection n’est pas complètement

élucidé (LUZZATTO, 2015). En 2009 dans une étude menée en Gambie, CLARK et al. n’ont

pas trouvé d’association entre le paludisme sévère et le seul variant 202A/376G (CLARK et al.,

2009a). Mais ce variant en pool avec d’autres allèles déficitaires révélait des signaux de

protection. En 2014 au Mali, MAIGA et ses collaborateurs n’ont pas trouvé de résultats

concluant sur l’effet protecteur des différents génotypes G-6-PD en corrélation avec le

paludisme simple (MAIGA et al., 2014).


Les auteurs ont même suggéré des signaux de risque accru de paludisme modéré chez les dogon

porteurs de la mutation 202A, notamment au niveau des femmes. Des effets de protection par

le déficit en G-6-PD contre le paludisme cérébral et une augmentation du risque du paludisme

avec anémie sévère ont été rapporté dans certains travaux sur la corrélation entre cette maladie

génétique et le paludisme sévère (MALARIA GENOMIC EPIDEMIOLOGY, 2014; SHAH et

al., 2016). L’hétérogénéité allélique de la G-6-PD, la complexité phénotypique et les difficultés

de classement des formes cliniques du paludisme sont autant de facteurs pouvant expliquer les

divergences entre les différentes études.

Cependant, la corrélation entre le déficit en G-6-PD et la protection contre le paludisme

asymptomatique a été rapportée par certains auteurs (MOMBO et al., 2003; OUATTARA et

al., 2014). L’avantage sélectif contre le paludisme des femmes hétérozygotes pour la G-6-PD a

été rapporté très tôt par BIENZYLE et al. (BIENZLE et al., 1972). Dans une étude cas témoins

menée en Tanzanie, il a été établi à travers un certain nombre de SNPs G-6-PD, que seules les

femmes hétérozygotes étaient protégées contre les formes sévères du paludisme

(MANJURANO et al., 2015). Une autre étude en Gambie avait abouti à la même conclusion

avec le variant G-6-PDA- (376G/968C) (SIRUGO et al., 2014).

Dans une autre récente étude de cohorte cas-témoins au Kenya, UYOGA et ses collaborateurs

ont montré que la clé de la protection contre les formes sévères du paludisme étaient les femmes

hétérozygotes pour le déficit en G-6-PD (UYOGA et al., 2015). Des paramètres comme le

traitement avant la réalisation de la goutte épaisse sont des facteurs qui peuvent également

influencer la densité parasitaire et biaiser les analyses d’associations.

En 2015 au Nigeria, IGBENEGHU et al. ont rapporté une forte protection des génotypes HbAS

et HbAC de l’hémoglobine contre le paludisme asymptomatique à Plasmodium falciparum

(IGBENEGHU et al., 2015). La protection des sujets HbAC contre les formes cliniques du

paludisme à Plasmodium falciparum a également été rapportée au Mali (TRAVASSOS et al.,

2015). Au cours de la même année, MANGANO et collaborateurs ont rapporté au Burkina Faso

que le génotype HbAS était associé à une réduction de 70% de la parasitémie à Plasmodium

falciparum contrairement aux sujets HbAC, bien qu’une forte protection fût également

observée chez les sujets HbCC et HbSC (MANGANO et al., 2015). Nos résultats suggèrent

que même si les hémoglobinopathies S et C protègent contre le paludisme grave comme le

déficit en G-6-PD, ils ne confèrent pas de protection contre les infections palustres.

CONCLUSION


Conclusion générale

Le déficit en G-6-PD est une pathologie génétique liée au chromosome X dont la sévérité

dépend du variant en cause. Les différents variants génétiques de cette anomalie sont

principalement le résultat d’une combinaison de mutations sur le gène G-6-PD. Cette étude

apporte la confirmation que la prévalence de la déficience en G-6-PD et des hémoglobines S et

C est relativement élevée au Burkina Faso du fait de l’endémicité du paludisme. Au cours de

nos travaux, aucune corrélation n’a été observée entre ces deux anomalies génétiques. Cet

assortiment indépendant entre les génotypes de l’hémoglobine et le statut G-6-PD serait

probablement dû au fait que leurs gènes respectifs sont sur des chromosomes différents. Le

déficit en G-6-PD étant lié au chromosome X, il touche beaucoup plus les hommes que les

femmes. Il faut noter cependant que les femmes hétérozygotes présentent des expressions

cliniques variables du fait de l’inactivation aléatoire du chromosome X. Les résultats de ces

travaux indiquent également que le portage d’hémoglobine S et/ou C ne confère aucun effet

protecteur contre l’infection palustre aussi bien symptomatique qu’asymptomatique. Ces

anomalies de l’hémoglobine protégeraient plutôt contre les formes sévères du paludisme.

L’étude a cependant démontré que le déficit en G-6-PD conférait une protection contre le

paludisme asymptomatique, probablement à travers une réduction du taux de parasites chez les

personnes hémizygotes/homozygotes et les femmes hétérozygotes. Tandis que la protection

contre l’infection symptomatique à Plasmodium falciparum (avec une complexité de

classification phénotypique) n’a pas été mise en évidence au cours de ses travaux.

Nos résultats confirment que le variant G-6-PDA- (202A/376G) est bien le variant déficitaire

le plus fréquent au Burkina Faso. Cependant contrairement aux études antérieures de

génotypage menées au Burkina Faso, cette étude a démontré pour la première fois l’existence

du variant G-6-PDA- (376G/968C). La G-6-PD Santamaria a également été mis en évidence

chez une femme de l’ethnie Gouro (Côte d’Ivoire). Le variant G-6-PD Santamaria (rs5030872 ;

G6PD c.542A>T) est un variant de classe II de l’OMS responsable d’une hémolyse

intermittente avec une activité enzymatique inférieure à 10%. Nos travaux suggèrent donc que

des variants comme la G-6-PD Betica Selma et peut être la G-6-PD Santamaria existent dans

nos populations. La faible taille de notre échantillon d’étude a limité certaines de nos analyses.

Une investigation plus poussée à grande échelle et dans les groupes ethniques spécifiques est

donc nécessaire pour une estimation réelle des variants impliqués dans le déficit en G-6-PD au

Burkina Faso et leur prise en compte dans les études d’associations.

PERSPECTIVES


Perspectives

Au regard de ce travail nous pouvons envisager les perspectives suivantes :

Etude de génotypage du même ordre sur une grande population afin de déterminer avec

plus de précision la prévalence réelle des variants G-6-PD Betica Selma et Santamaria

dans la population générale et les groupes ethniques spécifiques. Cette étude permettra

la mise en place d’une politique nationale du dépistage systématique du déficit en G-6-

PD au moins au sein des groupes les plus vulnérables en l’occurrence les femmes

enceintes et les enfants de moins de 5 ans.

Associer le phénotypage au génotypage pour déterminer le statut G-6-PD des femmes

hétérozygotes.

Faire un génotypage prenant en compte plusieurs SNPs G-6-PD avec des fréquences

polymorphiques tout en distinguant les formes cliniques du paludisme symptomatique

dans une étude d’association.

Elargir la taille de la population d’étude dans une étude d’association entre les

hémoglobinopathies et le paludisme pour une analyse plus approfondie.

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ANNEXES

ANNEXES

I. Protocole d’extraction par la méthode du Salting out

1. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des hématies à 500 µL de culot de sang total (frais ou congelés).

Mélanger délicatement à l’aide de la micropipette pendant 15 secondes.

Passer au vortex, puis centrifugé à 13000 rpm pendant 1 min. Jeter le surnageant.

2. Répéter l’étape 1. Laver trois fois en ajoutant 1 mL H2O distillée (Passer au vortex et centrifuger à

13000 rpm pendant 1 minutes puis jeter le surnageant).

3. Reprendre le culot dans 370 μL du Mix (80μl de protéinase K-5X tampon, 30μl de protéinase K, 20

µL de SDS 20% et 240μl H2O et cela par échantillon), puis passer au vortex.

4. Incuber à 55 ° C pendant 15 min.

5. Ajouter 200 µL de NaCl 5M, passer au vortex pendant 15 secondes. Isoler les protéines précipitées

par centrifugation à 13000 rpm pendant 5 min.

6. Transférer 500 μL du surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Ajouter 1 mL d'éthanol absolu

(T° ambiante). Laissez précipiter l'ADN en agitant les tubes délicatement à la main. Isoler l'ADN

par centrifugation à 13000 rpm pendant 1 minute ; puis jeter le surnageant.

7. Laver deux fois avec 800 µL d'éthanol 70% frais (préalablement conservé à -20°C). Passer au

vortex, et centrifuger à 13000 rpm pendant 1 min puis jeter le surnageant.

8. Eliminer le reste d'éthanol en égouttant les tubes sur du papier absorbant, puis les sécher à bouchon

ouvert sur incubateur.

9. Dissoudre l'ADN dans 100 µL de Tampon d’élution (TE) et passer au vortex pendant 30

secondes puis incuber. Utilisez 2 µL d'ADN pour la quantification au Nanodrop. Conserver l’ADN

à -20°C. La pureté de l’ADN utilisé pour le génotypage était comprise entre 1,8 et 1,9.

Tampon de lyse pour l’extraction : Quantités et concentrations pour 1L

0.32 M Sucrose 109,5 g sucrose

5 mM MgCl2 10 mL 5M MgCl2

12 mM Tris-HCl 12 mL 1M Tris-HCl

1% Triton X-100 10 mL Triton X-100

Tampon 5X Protéinase K (0.375 M NaCl/ 0.12 M EDTA) [En liquide dans les bouteilles].

II. Certification De Consentement

J’ai été invité à participer à la recherche de Abdoul Karim OUATTARA du

…………………………………………………. J’ai appris qu’il impliquera une prise en charge des

examens biologiques à la prise de sang. J’ai été informé que les risques sont minimes et peuvent inclure

seulement, les malaises ou inconforts liés aux prélèvements sanguins. Je me rends compte qu’il ne puisse

y avoir aucun avantage pour moi personnellement et qu’aucune récompense ne me sera donnée. Il m’a

donné les noms, les adresses et les numéros de téléphone des chercheurs qui peuvent être facilement

contactés au besoin.

Je soussigné……………………………………………………………………………………...

Certifie avoir lu la notice d’information de l’étude « Paludisme au Burkina Faso : Prévalence, marqueurs

génétiques de résistance et polymorphismes des gènes MSP1 et MSP2 de Plasmodium falciparum »

J’ai eu l’opportunité de poser toutes les questions que je souhaitais et toutes les questions que j’ai posées

ont reçu des réponses satisfaisantes.

J’ai reçu une copie du document d’information aux donneurs de sang et de Certificat de consentement.

Je soussigne certifie d’accepter de participer à cette étude.

Nom et prénom(s) du patient :

Signature du patient :

Date (JJ/MM/AAAA) :

(Le patient doit signer, dater et écrire lui-même son propre nom)

Personne obtenant le consentement (Investigateur ou personne désigné par l’investigateur principal) :

Nom et prénom de l’Investigateur :

Signature de l’Investigateur

Date (JJ/MM/AAAA) :

Si le répondant ne sait pas lire

Témoin

Je suis témoin de la lecture de la notice d’Information de l’étude « Paludisme au Burkina Faso :

« Prévalence, marqueurs génétiques de résistance et polymorphismes des gènes MSP1 et MSP2 de

Plasmodium falciparum ». L’intéressé a eu l’opportunité de poser toutes les questions qu’il souhaitait et

toutes les questions qu’il a posées ont reçu des réponses satisfaisantes. J’atteste par ce document que je n’ai

aucune relation avec l’équipe de recherche, qu’elle soit contractuelle, professionnelle ou de toute autre

nature susceptible de réduire mon indépendance.

Je confirme que le répondant consent à participer volontairement à cette étude.

Nom et prénom(s) du témoin Nom et prénom(s) du patient

Signature du témoin : Application de l’index du patient :

Date (JJ/MM/AAAA) :

(Le témoin doit signer, dater et écrire lui-même son nom et le nom du donneur. Le donneur doit appliquer

lui-même son index à la place prévue à cet effet)

III. Liste des publications de cette Thèse

OUATTARA A. K, BISSEYE C, BAZIE B.V.J.T.E, DIARRA B, COMPAORE T. R, DJIGMA F. W,

PIETRA V, MORET R, SIMPORE J. (2014) Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is

associated with asymptomatic malaria in a rural community in Burkina Faso. Asian Pacific Journal

of Tropical Biomedicine. Volume 4, Issue 8, August 2014, Pages 655–658.

OUATTARA A. K, YAMEOGO P, DIARRA B, OBIRI-YEBOAH D, YONLI A. T, COMPAORE T. R,

SOUBEIGA R. S. T, DJIGMA F. W, SIMPORE J. (2016) Molecular heterogeneity of glucose-6-

phosphate dehydrogenase deficiency in Burkina Faso: G-6-PD Betica Selma and Santamaria in

people with symptomatic malaria in Ouagadougou. Mediterr J Hematol Infect Dis. Volume 8, Issue 1,

June 2016, e2016029.

Autres publications

ZOURE A. A, BAMBARA A. H, SAWADOGO A. Y, OUATTARA A. K, OUEDRAOGO M, TRAORE

S. S, BAKRI Y, SIMPORE J. (2017) Multiparity and Breast Cancer Risk Factor among Women in

Burkina Faso. Asian Pac J Cancer Prev. 17 (12), 5095-5099.

ZONGO A. W, DIAGBOUGA S, OUERMI D, T. COMPOARE T. R, OBIRI-YEBOAH D, OUATTARA

A. K, KIENTEGA T, SOUBEIGA S. T, YONLI A. T, DJIGMA F. W, ILBOUDO D. AND SIMPORE J.

(2016) Real Time PCR Assay in differentiating Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar

infections in patients fecal samples attending St Camille hospital in Ouagadougou, Burkina Faso.

Curr Res Microbiol Biotechnol. 4(6): 938-943.

COMPAORE T. R, DIARRA B, ASSIH M, SOUBEIGA R. S. T, OUATTARA A. K, TCHELOUGOU

D, BISSEYE C, BAKOUAN D, COMPAORE IP. DEMBELE A, OBIRI-YEBOAH D, DJIGMA WF,

SIMPORE J. (2016) HBV/HIV co-infection and APOBEC3G polymorphisms in a population from

Burkina Faso. BMC Infectious Diseases. Volume 16, Issue 1, July 2016, Pages 1-7.

COMPAORE T. R, SOUBEIGA R. S. T, OUATTARA A. K, OBIRI-YEBOAH D, TCHELOUGOU D,

MAIGA M, ASSIH M, BISSEYE C, BAKOUAN D, COMPAORE IP, DEMBELE A, MARTINSON J,

SIMPORE J. (2016) APOBEC3G Variants and Protection against HIV-1 Infection in Burkina Faso.

PLoS ONE. Volume 11, January 2016.

Manuscrits soumis

Serge Théophile SOUBEIGA, Bapio Valéry Jean Télesphore Elvira BAZI, Tegwindé Rebeca

COMPAORE, Abdoul Karim OUATTARA, Albert Théophane YONLI, Arsène ZONGO, Lassina

TRAORE, Serge DIAGBOUGA, Jacques SIMPORE. Transmitted HIV-1 drug resistance in HAART-

treated pregnant women and their infants during PMCT in Ouagadougou, Burkina Faso (soumis

dans Mediterr J Hematol Infect Dis).

COMPAORE T. R, SOUBEIGA R. S. T, OUATTARA A. K, TCHELOUGOU D, BISSEYE C,

BAKOUAN D, COMPAORE IP, DEMBELE A, YONLI AT, OBIRI-YEBOAH D, DJIGMA WF,

SIMPORE J. (2016) Expression d’APOBEC 3G et infection au VIH-1 au Burkina Faso. (Soumis dans

Journal of Medical Virology).

IV. Communications Orales

Abdoul Karim OUATTARA, Cyrille BISSEYE, Bapio Valéry Jean Télesphore Elvira BAZIE, Birama

DIARRA, Tegwindé Rebeca COMPAORE, Florencia W. DJIGMA, Rémy MORET, Jacques SIMPORE.

Fréquence des mutations responsables de la déficience en glucose-6-phosphate-déshydrogénase et le

paludisme asymptomatique dans une communauté rurale au Burkina Faso. XVI ème Journées Portes

Ouvertes de l’Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (JPO) du 25 au 30 Novembre 2013.

Abdoul Karim OUATTARA, Cyrille BISSEYE, Bapio, Valérie Jean Télesphore Elvira BAZIE, Birama

DIARRA, Rébéca COMPAORE, Florencia DJIGMA, Djeneba OUERMI ; Virginio PIETRA, Jacques

SIMPORE. Mutations responsables de la déficience en glucose-6-phosphate-déshydrogénase dans une

communauté rurale au Burkina Faso. XVII ème Journées des Sciences de la Santé de Bobo-Dioulasso

(JSSB) du 06 au 09 Mai 2014.

Abdoul Karim OUATTARA, Bapio Valéry Jean Télesphore Elvira BAZIE, Cyrille BISSEYE, Birama

DIARRA, Tegwindé Rebeca COMPAORE, Florencia W. DJIGMA, Rémy MORET, Jacques SIMPORE.

La déficience en Glucose-6-phosphate déshydrogénase (G-6-PD) est associée au paludisme

asymptomatique dans une communauté rurale au Burkina Faso. Colloque Scientifique International

de l’Université de Kara, Togo 12-16 Mai 2014.

Abdoul Karim OUATTARA, Pouiré YAMEOGO, Birama DIARRA, Dorcas OBIRI-YEBOAH, Albert

Théophane YONLI, Tegwindé Rebeca COMPAORE, Serge Théophile SOUBEIGA, Florencia Wenkuuni

DJIGMA, Jacques SIMPORE. Hétérogénéité allélique du déficit en Glucose-6-phosphate

déshydrogénase au Burkina Faso : La G-6-PD Betica Selma et Santamaria chez des personnes

atteintes de paludisme symptomatique à Ouagadougou. XVIIe édition des Journées Scientifiques

Internationales de Lomé (JSIL), Togo du 03 – 08 Octobre 2016.

Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases

Original Article

Molecular Heterogeneity of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency in

Burkina Faso: G-6-PD Betica Selma and Santamaria in People with Symptomatic

Malaria in Ouagadougou

Abdoul Karim Ouattara1, Pouiré Yameogo1, Birama Diarra1, Dorcas Obiri-Yeboah2, Albert Yonli1, Tegwindé Rebeca

Compaore1, Serge Théophile Soubeiga1, Florencia Wenkuuni Djigma1 and Jacques Simpore1

1Biomolecular Research Center Pietro Annigoni (CERBA) LABIOGENE UFR/SVT, University of Ouagadougou BP 364

Ouagadougou, Burkina Faso. 2Department of Microbiology and Immunology, University of Cape Coast, Ghana.

Competing interests: The authors have declared that no competing interests exist.

Abstract. The G-6-PD deficiency has an important polymorphism with genotypic variants such as

202A/376G, 376G/542T and 376G/968T known in West African populations. It would confer

protection against severe forms of malaria although there are differences between the various

associations in different studies. In this study we genotyped six (06) variants of the G-6-PD gene

in people with symptomatic malaria in urban areas in Burkina Faso.

One hundred and eighty-two (182) patients who tested positive using rapid detection test and

microscopy were included in this study. A regular PCR with the GENESPARK G6PD African kit

was run followed by electrophoresis, allowing initially to genotype six SNPs (G202A, A376G,

A542T, G680T, C563T and T968C). Women carrying the mutations 202A and/or 376G were

further typed by real-time PCR using TaqMan probes rs1050828 and rs1050829.

In the study population the G-6-PD deficiency prevalence was 9.9%. In addition of G-6-PD A-

(202A/376G) variant, 376G/542T and 376G/968T variants were also detected. Hemoglobin

electrophoresis revealed that 22.5% (41/182) of the individuals had HbAC compared with2.2%

with HbAS and one individual had double heterozygous HbSC. There was no correlation between

the G-6-PD deficiency or haemoglobinopathies and symptomatic malaria infections in this study.

Our study confirms that the G-6-PD deficiency does not confer protection against Plasmodium

falciparum infections. As opposed to previous genotyping studies carried out in Burkina Faso, this

study shows for the first time the presence of the variant A- (376G/968C)and warrants further

investigation at the national level and in specific ethnic groups.

Citation: Ouattara A.K., Yameogo P., Diarra B., Obiri-Yeboah D., Yonli A., Compaore T.R., Soubeiga S.T., Djigma F.W., Simpore J.

Molecular heterogeneity of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in Burkina Faso: g-6-pd betica selma and santamaria in people with

symptomatic malaria in ouagadougou. Mediterr J Hematol Infect Dis 2016, 8(1): e2016029, DOI: http://dx.doi.org/10.4084/MJHID.2016.029

Published: June 15, 2016 Received: April 11, 2016 Accepted: May 25, 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which

permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Correspondence to: Prof. Jacques SIMPORE. Biomolecular Research Center Pietro Annigoni (CERBA) LABIOGENE

UFR/SVT, University of Ouagadougou BP 364 Ouagadougou, Burkina Faso, West Africa. Tel: +226 50361232 / + 226

70230792. E-mail: [email protected]

Introduction. The G-6-PD deficiency and

haemoglobinopathies occur with high frequency in

sub-Saharan Africa due to the malaria endemicity.1

Indeed, the maintenance of these genetic

abnormalities usually asymptomatic in the

homozygous state, within populations,

demonstrates the selective advantage that they

confer in the heterozygous state to carriers against

http://dx.doi.org/10.4084/MJHID.2016.029

http://creativecommons.org/licenses/by/2.0

mailto:[email protected]

severe malaria.2 S hemoglobin responsible for

sickle cell disease is probably the most common

serious of haemoglobinopathies in the world.

Hemoglobin C is found only in parts of West Africa

with the highest frequencies observed in Burkina

Faso.3 The beta S (βs) form of hemoglobin is caused

by a single gene mutation: a "transversion" of the β6

globin gene (GAG to GTG) sixth codon of the first

exon that result in the substitution of glutamic acid

with valine (β6Glu Val). As to the βc form, it is

induced by gene mutation "transition" of the β6

globin gene (GAG to AAG) sixth codon of the first

exon that resulted in the substitution of glutamic

acid for lysine (β6GluLys). Since the Haldane

hypothesis, several studies have demonstrated the

protective effect of hemoglobin S and C against

severe malaria although certain mechanisms remain

controversial.4-6

The G-6-PD deficiency is the most common

inherited enzymopathy, with over 400 million

carriers worldwide.7 It is a genetic X-linked

abnormality with various clinical expressions in

heterozygous female.8 In humans, the G-6-PD gene

is located in the telomeric region of the long arm of

the X chromosome in position q28. It spans about

18 kb and contains 13 exons and 12 introns, ranging

in size between 12 bp and 236 bp.9

The G-6-PD gene is highly polymorphic with

over 180 mutations described and at least 35 mutant

alleles with polymorphic frequencies. These

polymorphisms are relatively common in different

parts of the world.10,11 Over 85% of these mutations

are single nucleotide substitutions. The enzyme

deficiency is asymptomatic except in cases of

infections, ingestion of certain foods or oxidizing

molecules.11 The severity of the disease depends on

the genetic variant involved. G-6-PDB is the wild

allele. The G-6-PDA, a non-deficient variant, is the

result of a substitution of adenine for guanine in

position 376 of G-6-PD gene exon 5. It is faster than

G6PDB electrophoretically and it does not cause

hemolysis.

Most deficient variants G-6-PDA- are usually

due to a second mutation on the G-6-PDA gene.12

The most prevalent G-6-PDA- variant in sub-

Saharan Africa and the most studied is the G-6-

PDA-202A/376G. However, other variants like the

G-6-PDA-376G/542T, 376G/680T, 376G/968C

have been reported in some African populations,

including West African populations with relatively

high frequencies.13-15 Also in their study in Mali,

Maiga et al.15 observed an association of other G-6-

PD SNPs, including rs915942 and rs915941 with

asymptomatic malaria in Dogon women. The allelic

heterogeneity of the G-6-PD gene suggests the need

to consider a broad range of G-6-PD variants in

association studies. In this study we sought for six

(06) single nucleotide polymorphisms substitution

involved in the G-6-PD deficiency in patients with

symptomatic malaria consulting in three health

centers in the city of Ouagadougou in Burkina Faso.

Materials and Methods.

Setting and type of study: This is a prospective

study in which patients regardless of gender or

ethnic group were recruited in three health centers

in Ouagadougou, the capital of Burkina Faso, from

September 27 to November 10, 2014. Malaria

transmission is hyper-endemic and seasonal during

the rainy season from June to October.

Study Population: The study involved 182 patients

aged 1 to 72 years, attending Saint Camille Hospital

of Ouagadougou (HOSCO), the Medical Center of

Samandin and the Biomolecular Research Center

Pietro ANNIGONI (CERBA) of Ouagadougou.

Patients were sent to the laboratory when malaria

was suspected, and underwent a Rapid Diagnostic

Test using SD Bioline Malaria Ag Pf/Pan, after

which positive individuals were included with their

free and informed consent on condition that they are

also positive microscopy.

Sampling: The samples consisted of venous blood

samples (5 mL of blood per subject adult and child

by blood 3 mL) in EDTA tubes. Part of the sample

has been used for the realization of the Complete

Blood Count (CBC), hemoglobin electrophoresis

and thick blood. After that, the remainder of the

sample was centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes

to separate the plasma from the pellet, aliquoted and

stored at -80 ° C for molecular analysis.

Hematologic and thick smear: Hematological

parameters were determined from blood samples

with EDTA, using a blood counter ABX Micros 60

(ABX Diagnostics, Montpellier, France).

Hemoglobin Genotyping was made by

electrophoresis in alkaline pH on a cellulose acetate

tape. Tris-glycine at pH 9.5 was used as a buffer.

The cells were washed and then lysed using 1%

saponin. The migration was carried out for 60

minutes at 200 V on average.

The blades of thick films were stained for 10

minutes in a solution of 10% Giemsa. The reading

was performed using an optical microscope

objective 100 under oil immersion and parasite

density positive slides was calculated and expressed

as the number of parasites/µL. In preparing the final

parasite density, trophozoites were counted

simultaneously with 200 leukocytes. Two

independent microscopists did quality control by a

repeated examination of the blades. In the case of

difference of more than 5% between the results of

three readings, the average of the two closest results

was then retained.

DNA extraction and genotyping of G-6-PD

deficient variants: Genomic DNA was extracted

from blood pellet by the standard salting-out

method.11 The purity and the final concentration of

DNA extracts were determined using the Biodrop

μLITE (Isogen Life Science N.V./S.A, Temse,

Belgium). All samples were initially genotyped by

standard PCR. The amplification was done using

the kit GENESPARK G6PD African

(Immunospark, Rome, Italy) followed by

electrophoresis on agarose gel 2% for six SNPs

(G202A, A376G, A542T, G680T, T968C and

C563T) involved in the G-6-PD deficiency.

PCR was performed in a reaction volume of 25

µL composed of 12.5 µL of Multiplex PCR smart

mix (2x), 2 µL Primer Mixture (G6PD African), 8.5

µL of sterile water and 2 µL of 'DNA fragment (50-

100 ng) of each sample. Electrophoresis was

performed at 100 V for 1 hour.

Female individuals with mutations in position

202 and/or 376 were further analyzed by real-time

PCR using TaqMan probes respectively (Applied

Biosystems, Foster City, California, USA) include:

rs1050829, rs1050828.12

Statistical Analyses: Data were analyzed using the

software Statistical Package for Social Sciences

(SPSS) 21.0 (IBM, Armonk, NY, USA) and

EpiInfoTM 7. Hardy-Weinberg equilibrium was

determined in women according to the method

described by Carter et al.16 Pearson's chi-square test

was used for categorical variables such as age

groups, parasite density groups. ANOVA was

employed in the comparison of hemoglobin and

hematocrit means between groups. Non-parametric

tests were used to compare the geometric mean of

the parasite density. The difference was significant

at p <0.05.

Ethical Considerations: The present study was

approved by the Ethics Committee on Health

Research of Burkina Faso (Deliberation No. 2014-

9-128). Written informed consent was obtained

from the adults and guardians of children.

Results. Demographics and Clinical Characteristics: Our

study population consisted of 50.5% (92/182) of

men and 49.5% (90/182) of women aged 1 to 72

years with a mean age of 17.1 ± 13.9 years.

Children under 5 years old accounted for 19.2%

(35/182) of the study population noted that while

46.7% (85/182) of individuals over 15 years. Socio-

demographic analysis showed that 182 patients

included in this study were derived from several

different ethnic groups. Mossi represented the

majority ethnic group with a proportion of 76.4%

(139/182) of individuals whose parents were of this

ethnic group (Table 1). Note that half of the group

"Others" (10/20) was made up of ethnic groups

from countries in the sub-region with a

predominance of Nigerians (6/10). Over 43% of

patients in our study had started treatment before

the completion of the thick smear test. The study

population was in following with Hardy-Weinberg

equilibrium (p = 0.464).

Prevalence of deficiency G-6-PD and genotypes of

hemoglobin: Conventional PCR analysis gave more

than 64% (58/90) of females carrying mutations at

position 202 and/or 376. Twenty-five of them were

classified as homozygous and heterozygous by real-

time PCR (Figure 1). The G-6-PD deficiency

genotyping showed a prevalence of 78.6% of

individuals with a normal G-6-PD (29.7% genotype

B, 13.2% of genotype A, 20.9% B/B, 12.1% B/A

and 2.7% A/A) against 9.9%

hemizygous/homozygous subjects (8.8%

202A/376G and 0.5% 376G/968C) (Table 2). Note

that both parents of the individual carrier of G-6-

PDA- (376G/968C) were Mossi while the parents

of the female carrying the G-6-PDA- (376G/542T)

variant were of the Gouro ethnic group of Ivory

Coast.

She had the particularity of bearing G-6-PDA-

(202A/376G) on one of the X chromosome and G-

6-PDA- (376G/542T) on the other X chromosome

with a parasite density of 40 parasites/µL. Figure

Table 1. Socio-demographic and clinical Characteristics according to G-6-PD status

Characteristics Hemizygous &

homozygous

(N = 18)

Heterezygous

(N = 21)

Normal

(N = 143)

Total

(N = 182)

p

Age (years)

5, n (%) 4 (22.2) 0 (0.0) 31 (21.7) 35 (19.2)

5 à 15, n (%) 4 (22.2) 6 (28.6) 52 (36.3) 62 (34.1) 0.051

15, n (%) 10 (55.6) 15 (71.4) 60 (42.0) 85 (46.7)

Mean, [interval] 17.1 [1 - 34] 26.8 [7 - 60] 15,6 [1 - 72] 17.1 [1 - 72] 0.002

Parasitaemia (parasites/µL)

1 000, n (%) 4 (22.2) 5 (23.8) 40 (28.0) 49 (26.9)

1 000 – 10 000, n (%) 6 (33.3) 5 (23.8) 40 (28.0) 51 (28.0) 0.927

10 000, n (%) 8 (44.4) 11 (52.4) 63 (44.0) 82 (45.1)

geometric mean µL-1

[interval]

4235.470

[100 - 81300,0]

3750.758

[40 - 96000,0]

3945.445

[40 - 177778,0]

3950.090

[40 - 177778,0]

0.763

Hemoglobin,mean g.dL-1 11.8961 11.9586 11.6349 11.6981 0.704

Hematocrit,mean % 37.0913 38.1373 35.1266 35.6529 0.368

Hemoglobin genotypes

HbAA, parasites mean/µL 6541.271 4511.546 4748.802 4454.813

0.362 HbS/C, parasites mean/µL 2211.760 1238.458 2320.111 2823.703

Treatment

No, n (%)

[Parasitaemia mean/µL]

13 (72.2)

[9522.729]

12 (57.1)

[7796.907]

78 (54.5)

[6879.702]

103 (56.6)

[6312.948]

0.357

Yes, n (%)

[Parasitaemia mean/µL]

5 (27.8)

[3101.494]

9 (42.9)

[1413.779]

65 (45.5)

[2024.546]

79 (42.9)

[2143.487]

0.500

Ethnic groups*

Mossi n (%) 13 (72.2) 14 (66.7) 112 (78.3) 139 (76.4)

Mix n (%) 4 (22.2%) 2 (9.5%) 17 (11.9%) 23 (12.6) 0.221

Others n (%) 1 (5.6) 5 (23.8%) 14 (9.8) 20 (11.0)

*Mossi= individuals whose two parents are Mossi, Mix = One of the parent is Mossi, Others = None of the parent is Mossi.

Table 2. G-6-PD deficiency and its variants prevalence according to sex

G-6-PD Status Males, n (%) Females, n (%) Total, N (%)

Normal 78 (84.8) 65 (72.2) 143 (78.6)

Heterozygous 0 (0.0) 21 (23.3) 21 (11.5)

Hemi & homozygous 14 (15.2) 4 (4.4) 18 (9.9)

Total 92 (100.0) 90 (100.0) 182 (100.0)

Variants A-

202A/376G 13 (92.9) 3 (75.0) 16 (88.9)

202A/968C 1 (7.1) 0 (0.0) 1 (5.5)

202A/376G/542T 0 (0.0) 1 (0.25) 1 (5.5)

Total 14 (100.0) 4 (100.0) 18 (100.0)

2 shows the bands of the different variants observed

after electrophoresis.

Heterozygous females accounted for 11.5%

(6.6% B/A- and 4.9% A/A-) of the study

Figure 1. G6PD genotypes in female by real time PCR. Female

homozygous = A-/A-; Female heterozygous = A/A- or B/A-; and

Female normal = B/B, B/A or A/A.

population. The prevalence of the hemizygous

males was significantly higher than homozygous

females (15.5% vs. 4.4% p = 0.015). The

prevalence of hemoglobin genotypes was estimated

to be 73.6%, 22.5% and 2.2% respectively for the

genotypes AA, AC and AS. The allele frequency of

HbS was 0.014 against 0.126 for HbC allele. The

distribution of these genotypes was similar by sex

and G-6-PD status (Table 3).

Correlation between polymorphisms of G-6-PD

genes and HBB and symptomatic malaria: The

mean hemoglobin level in the study population was

11.7 g/dL ± 1.9. Approximately 66.0% (120/182) of

patients had a hemoglobin level greater than

11g/dL. The majority (89.9% or

Figure 2. Different bands after electrophoresis(A) Sample number 17 carries 376G/968T mutations (B) Sample number 30 carries

202A/376G/542T mutations. SM = Standard Marker, MTC = Mutant Type Control, IC = Internal Control

Table 3. Study population characteristics according to HBB genotypes and HbS, HbC allele frequencies

Individuals in functions of their hemoglobin genotypes Frequency

Factors AA AC AS CC SC Total HbS HbC

Sex

Male 68 20 3 1 0 92 0.016 0. 120

Female 66 21 1 1 1 90 0.011 0.133

G-6-PD Status

Normal 106 32 3 1 1 143 0.014 0.122

Heterozygous 18 3 0 0 0 21 0.000 0.071

Hemi & homozygous 10 6 1 1 0 18 0.028 0.222

Age Groups

< 5 years 25 9 1 0 0 35 0.014 0.129

5 – 15 years 47 10 3 2 0 62 0.024 0.113

> 15 years 62 22 0 0 1 85 0.006 0.135

Total 134 41 4 2 1 182 0.014 0.126

29/35) of children under the age of 5 had a

hemoglobin below the level of 11 g/dL. However

the distribution of hemoglobin and hematocrit was

similar regardless of the G-6PD status and the

hemoglobin genotype.

In the group of persons who have not started

treatment prior to completion of thick smear,

parasitaemia geometric mean was relatively lower

in G-6PD hemizygous/homozygous individuals

compared to non-deficient (3101.494 parasites/µL

vs. 6879, 702 parasites/µL). Heterozygous females

in this group had a similar parasite density than

non-deficient individuals (7796.907 parasites/µL

vs. 6879.702 parasites/µL). However, the

correlation between the geometric mean of parasite

density and G-6-PD status gave no statistically

significant result (Table 1).

Among individuals carrying the S and/or C

alleles (AS, AC, CC and SC) of hemoglobin were

noted a mean parasite density of 2823.703

parasites/µL against 4454.813 parasites/µL for

HbAA subjects with no statistically significant

difference (p = 0.362).

Discussion. G-6-PD has a considerable

polymorphism with many genotypic variants

known.10The Genotyping of six (06) SNPs involved

in this genetic disease has allowed us to evaluate the

frequency of different deficient variants in

symptomatic malaria patients. The GENESPARK

G6PD African Kit (Immunospark, Rome, Italy)

through a conventional PCR followed by

electrophoresis without enzymatic digestion is

convenient and has the advantage of having an

overview of six SNPs for each sample. However,

the kit is limited when it comes to genotyping

women because it indicates the presence of the

mutation without allowing the distinction between

homozygous and heterozygous. The prevalence of

hemizygous/homozygous subjects was estimated at

9.9% in our study population. This prevalence is

similar to those reported by the genotyping studies

in Burkina Faso and the sub-region.12,16 With

respect to gender, there was a significantly higher

prevalence of hemizygous male (15.5%) than

homozygous female (4.4%) since the disease is X-

linked.11Among people with G-6-PD deficiency in

this study, the G-6-PDA- (202A/376G) was the

most common variant observed in 88.9% of

deficiency cases. These observations are consistent

with previous genotyping studies.12,16 The G-6-PD

Betica Selma (376G/968C) was found in an

individual of the Mossi ethnic group. This variant

was observed in relatively high frequencies in the

Gambian population14, and in this study it is

identified for the first time in Burkina Faso. A study

in Mali reported a high frequency of this variant in

the Fulani (6.1%) compared to the Dogon (0.0%).15

A deficient woman of ethnic Gouro (Ivory

Coast) in our study shows the A- variants

(202A/376G) and Santamaria (376G/542T) on both

X chromosomes with very low parasitaemia. All

these observations suggest that these variants exist

in our populations even if they occur with relatively

low frequency in some areas. The highest

frequencies of the G-6-PD Santamaria were

reported in Sere population in Senegal.13

Our present results show that there is an

underestimation of genotypes real prevalence

causing the G-6-PD deficiency in Burkina Faso.

The latter could explain the different frequencies of

the deficit between genotyping studies and

enzymatic quantification studies in our

populations.1,17

As part of this study, patients underwent a

hemoglobin electrophoresis. A major sickle cell

syndrome (SC) was demonstrated in 0.5% (1/182)

of patients and 2.2% (4/182) had sickle cell trait

AS. The most detected hemoglobin genotype was

heterozygous AC present in 22.5% (41/182) of

patients with 1.1% (2/182) of CC homozygosity.

The prevalence of HbAC found in our study is

comparable to that (19.1%) found by Simporeetal.1

in 2007 and is higher than that found by Kafando et

al.18 in 2005 among newborns (15.4%). Prevalence

of 14.7% and 13.0% of the AC hemoglobin were

reported respectively by Amoako et al.19 in Ghana

and Travassos et al.20 in Mali. All these studies

show a higher rate of hemoglobin C in the sub-

region. Indeed, West Africa is the epicenter of

hemoglobin C.3

Although a reduced parasitaemia was observed

in some cases (G-6-PD deficient vs.G-6-PD non-

deficient individuals without treatment or HbAA

subjects vs. HbS/HbC subjects), all analyses of the

association between the G-6-PD status, hemoglobin

genotypes, parasite density, and rate of hemoglobin

or hematocrit gave no statistically significant

differences. Our results are similar to those reported

by Carter et al.16 in 2011 in six African countries

including Burkina Faso. The authors did not

observe significant effects of G-6-PD genotypes on

the hemoglobin and parasitaemia. The lack of

correlation between haemoglobins and G-6-PD

genotypes is expected, since respective genes are on

different chromosomes; and it has been reported by

a previous study.21 The latter results also confirm

that there is no protection against malaria

infections. Indeed, the G-6-PD deficiency or

haemoglobinopathies S and C did not offer

protection against Plasmodium falciparum

infections but may allow a favorable evolution of

malaria.

The protection of the G-6-PD deficiency against

severe form of malaria or malaria mortality is

known, but the mechanism of protection is not

entirely elucidated.22

In 2009 in a study in Gambia, Clark et al.14did

not find an association between severe malaria and

the 202A/376Gvariant only. However, pooling this

variant with other deficiency alleles revealed the

signal of protection. In 2014 in Mali, Maiga et

al.15found no conclusive results on the protective

effect of different G-6-PD genotypes correlated

with uncomplicated malaria. The authors also

suggest a higher risk of moderate malaria signs in

Dogon 202A mutation carriers, especially in

women. G-6-PD deficiency protective effects

against cerebral malaria and an increased risk of

severe malaria anemia have been reported in some

studies investigating the correlation between this

genetic disease and severe malaria.23,24 The allelic

heterogeneity of the G-6-PD, phenotypic

complexity and the difficulties of classification of

clinical forms of malaria are all factors that can

explain the differences between the different

studies. The correlation between G-6-PD

deficiency and protection against asymptomatic

malaria has been reported in the literature.12,25The

selective advantage against malaria of G-6-PD

heterozygous females has been early reported by

Bienzle et al.26 In a case-control study carried out in

Tanzania, it was established through the number of

G-6-PD SNPs, that only heterozygous women were

protected against severe forms of malaria.27

Another study in the Gambia had led to the same

conclusion with variant G-6-PDA- (376G/968C).28

In a case-control and cohort study in Kenya, Uyoga

et al. showed, comparing boys and girls a

significant protection from severe malaria among

G6PD c.202T heterozygous girls but no evidence

for protection among G6PD c.202T hemizygous

boys and homozygous girls (OR 1·18, 0·99-1·40;

p=0·056), thus the key to protection from severe

malaria could be the girls heterozygous for G6PD

deficiency.29

Our study population size was limited in

deepening the analysis. Parameters such as

treatment before completion of thick smears are

factors that may influence parasite density and bias

the association analyses.

In 2015 in Nigeria Igbeneghu et al.30 reported a

strong protection of HbAS and HbAC genotypes

against asymptomatic Plasmodium falciparum.

Protection of HbAC carriers against clinical forms

of Plasmodium falciparum malaria has also been

reported in Mali.20

During the same year, Mangano et al.5 reported

in Burkina Faso that HbAS genotype was

associated with a 70% reduction of parasite

Plasmodium falciparum unlike HbAC carriers,

although a strong protection was also observed in

HbCC and HbSC subjects. Our results suggest that

even if haemoglobinopathies S or C protect against

severe forms of malaria like G-6-PD deficiency,

they do not confer protection against Plasmodium

falciparum infections.

Conclusion. Our study confirms that the G-6-PDA-

variant (202A/376G), the most common in Burkina

Faso, does not confer protection against

Plasmodium falciparum malaria infections.

However, it shows that other variants such as

T968C and probably A542T exist in our population.

Further investigations are required in a larger

population with well certain ethnic groups for a real

estimate of the prevalence of Glucose-6-phosphate

dehydrogenase variants involved in a possible

association with the resistance to various kinds of

malaria.

Acknowledgment. Our sincere thanks to the entire

team of CERBA/LABIOGENE and the participants

of this study. Our gratitude also goes to the Italian

Episcopal Conference (CEI) and the West African

Economic and Monetary Union (WAEMU)

(through the PACER2 program) for their financial

support.

Project Foundation. This project was supported

by the West African Economic and Monetary

Union (WAEMU) through «le programme d'appui

et de développement des centres d'excellence

régionaux » and « soutien à la formation et la

recherche de l’excellence ».

Grant No. PACER II

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polymorphisme du gène de la glucose-6-phosphate ... · thèse de doctorat unique ouattara abdoul...

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