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Universit du Littoral-Cte d'Opale IUT Calais-Boulogne Dpartement Gnie Biologique BP 120-62327 Boulogne/mer

EXTRACTION DES LIPIDES TOTAUX ET TRYGLYCERIDES DE CHLORELLA VULGARIS

TIERSOONE Laura DEBESQUE Julien BREFORT Alexandre DIEUSAERT Jonathan

2me anne Option IAB/GE 2010/2011 M. Tavernier, Mme. Bonne

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Sommaire

I. II.III.

Introduction ................................................................................... 1 Synopsis .......................................................................................... 1 Matriels et protocoles............................................................... 1A. B. 1. Prparation de la micro algue ............................................... 1 Extraction des triglycrides ................................................ 1

Soxhlet .................................................................................................. 1

2. Evaporation rotatif ............................................................................ 1 3. Saponification ...................................................................................... 1 C. 1. Sparation des molcules...................................................... 1

Chromatographie phage gaz ............................................................. 1 D. Dtermination du pourcentage de triglycrides ............. 1

IV. V. VI.

Planning prvisionnel de la semaine dexprimentation........ 1 Matriel, produits, cot .............................................................. 1 Bibliographie et rseau graphie ................................................ 1

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IntroductionUn projet de cration dun nouveau carburant, appele le biothanol fus mis en place pour une dure de 5 ans pour esprer obtenir du biocarburant partir de la micro algue Chlorella vulgaris.

Chlorella vulgaris est une espce dalgue verte unicellulaire microscopique depuis2 milliards dannes. Grace la photosynthse, elle se reproduit trs rapidement en eau tempre dans des rgions o lensoleillement est important et les tempratures assez douces. Une cellule mre se divise en 4 cellules fille de 16 20 heures. Avec un diamtre cellulaire denviron 5micrometre, cette micro algues sphriques aux dimensions est comparable aux globules rouges. La Chlorella contient de grandes quantits de chlorophylles, dacides amins, dacides nucliques, denzymes, de lipides, de vitamines, de fibres et de minraux. Les lipides synthtiss par Chlorella vulgaris (10 15 % de matire sche) se composent de plus de 80 % dacides gras insaturs avec en majorit lacide alphalinolnique, jusquas plus de 30 %. Dans un premier temps, il faut dterminer les conditions optimales de la culture en quantit de lumire, la quantit de CO2, ainsi que lon ajuste la concentration en nitrates de potassium qui provoquera un stress et apporteras aller la formation de lipides. Des que ses conditions optimales seront atteintes, on pourra alors commencer une extraction optimales. La dtermination de la teneur en triglycrides peut tre effectue par diffrentes mthodes qui sont : Extraction de Soxhlet : elle se fait en plusieurs cycles qui se rptent indfiniment, elle permet de faire lextraction par solvant continue dune espce chimique contenue dans une poudre solide. (dichloromethanemethanol extraction) Mthode de Folch : consiste transfrer les acides gras de la micro algue dans une phase organique. Extraction Goldfisch : (hexane extraction) Hot extraction : mme que soxhlet mais plus rapides 3

Aprs diverses recherches, les mthodes les plus utilises sont soxhlet et la mthode de folch. Nous allons alors utilise dans notre dmarche la mthode de soxhlet pour alors extraire les lipides de notre micro algue. On passe notre chantillon obtenu aprs lextraction lvaporation rotative pour liminer lhexane. Par la suite, pour vrifier si lextraction se ralisa totalement, cest--dire que notre chantillon ne contient que des triglycrides, on fait une analyse des acides gras par chromatographie en phase gazeuse aprs saponification des glycrides et conversion des savons en esters mthyliques volatils. Les rsultats sont, par convention, exprims en % des acides gras totaux. Ils peuvent aussi tre exprims en % de lchantillon moyennant lutilisation dun talonnage interne. Une quantification sera effectue lorsque les rendements seront alors corrects. Notre projet se porte sur la dtermination en triglycrides dans Chlorella vulgaris, do notre problmatique : Extraction et dtermination du taux des TAG parmi tous les lipides compris dans les micros algues.

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SynopsisCentrifugation Elimination surnageant

Schage ou humidification de la micro algue

Soxhlet sur micro algue sche

Solvant d'extraction: hexane

Extraction Cyclohexane

Saponification KOH/Ethanol

Lavage l'eau

Chromatographie phase gazeuse

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Materiel et protocolesSes manipulations devront se faire plusieurs fois pour confirmer les rsultats avec plusieurs peses diffrentes A. Principe Prparation de la micro algue

Chlorella vulgaris est une micro algue exigeante. Pourobtenir une teneur en lipide maximale de cette algue, elle doit tre cultive dans de meilleures conditions telles que le pH, la teneur en azote, la temprature Doit tre telle que la micro algue pousse la mieux. Le schage de la micro algues est important car il faut liminer tout leau contenu dans cette algue pour quelle ne se mlange pas avec lhexane qui sera par la suite ajout. Matriel et ractifs Etuve Membrane humide Solution mre de Chlorella vulgaris Verrerie : pipette, bcher Eau distille Mode opratoire Dans un premier temps, il faut cultiver lalgue pour quelle donne une teneur en lipide maximal avec un rendement lev. Et, pour finir, nous allons procder deux diffrentes mthodes : Algues humides : schage ltuve 105 C 30 min puis la temprature ambiante Algues humides : filtration sur membrane humide puis schage temprature ambiante 1 nuit 6

B.

Extraction des triglycrides

1.

Soxhlet

Principe La mthode de soxhlet est la mthode la plus utilise pour la dtermination de la teneur en matires grasses. Cest une mthode gravimtrique, puisquon pse lchantillon au dbut et la matire grasse la fin de lextraction.

Matriel et ractifs Extracteur Soxhlet Cartouche de cellulose Hexane (Gants et lunettes) Pinces Micro algues Balance Filtres Mode opratoire On cherche dans un premier temps extraire les lipides des micros algues. Il faut alors : On pse la masse de micro algues schs ou humides On ajoute ses micros algues la cartouche de cellulose On met la cartouche de cellulose dans lextracteur de soxhlet, on las coince dans le contour mtallique du support On recouvre dhexane la cartouche de cellulose On effectue lextraction suivant un programme dfinis Lextraction est faite chaud ou lchantillon est immerg dans le solvant chaud et les matires grasses sont libres de lchantillon. Un quilibre se forme entre lextrait en solution et celui la surface de lchantillon. La cartouche est rince par le solvant, vapor et recondens

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Programmation de soxhlet :

Trempage : Lchantillon est immerg dans le solvant qui chauffe et les matires grasses sont extraites de lchantillon vers le solvant en bullition. Cette tape dure 40 min.

Extraction : La cartouche est rince par le solvant vapore et recondens. Cette tape dure 1heure.

Rcupration : La majeure partie du solvant

est remonte dans lacartouche de cellulose. Les triglycrides sont alors dans la cartouche et les autres lipides sont aux font de la capsule. 8

2. Evaporation rotative

Principe L'vaporateur rotatif utilise une technique rapide et efficace de sparation : elle permet l'extraction d'un solvant dont la temprature d'bullition est abaisse en travaillant sous pression rduite.

Matriel et ractifs Evaporateur rotative Solution dhexane prcdemment extrait contenant les lipides extraits Tuyaux en caoutchouc Ballon deau

Mode opratoire Mettre lchantillon dans le ballon Ajouter de leau dans le chauffe-ballon Chauffer la temprature dbullition de lhexane (69 C) Faire aller la pompe membrane pour fournir de la pression Mis en marche de lappareil On rcupre lhexane dans le ballon de rcupration Pese de la masse de lipides obtenus Arrt de lappareil : o Casser le vide o Couper laspiration o Arrter la rotation. Reprendre les lipides dans 1mL dhexane Extraction de solvants volatils qui peuvent tre toxiques, travail sous Sorbonne Risque d'implosion car le systme est sous pression rduite 9

3. Saponification

Principe La saponification est une mthode de sparation, aux cours de celle-ci les triglycrides sont hydrolyss en milieu alcalin par une base, gnralement de la potasse (KOH) ou de la soude (NaOH), une temprature comprise entre 80 C et 100 C. La temprature leve sert acclrer la raction de saponification. Puis une mthylation est alors ncessaire pour mthyls les acides gras obtenus au parant qui pourront alors tre pass la CPG.

Matriel et ractifs Bain-marie Colonne distiller KOH Bcher de 250mL Soude Mthanol

Mode opratoire

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C.

Sparation des molcules

1.

Chromatographie phase gazeuse

Principe La chromatographie phase gazeuse est une technique qui permet didentifier ou sparer les molcules dun mlange. Le mlange analyser est vaporis l'entre d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appele phase stationnaire, puis il est transport travers celle-ci l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les diffrentes molcules du mlange vont se sparer et sortir de la colonne les unes aprs les autres aprs un certain laps de temps qui est fonction de l'affinit de la phase stationnaire avec ces molcules. Matriel et ractifs Appareil de chromatographie

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