plateforme de cytogénétique cytogÉnÉtique clinique chez les animaux d’Élevage : bilan de la...

UMR1388 INRA/INPT GenPhySE

Plateforme de Cytogénétique

CYTOGÉNÉTIQUE CLINIQUE CHEZ LES ANIMAUX D’ÉLEVAGE : BILAN DE LA PLATEFORME DE L’UMR INRA/INPT GENPHYSE

ATC le 10/09/2014

Plan :

Introduction :• Présentation de l’INRA• Présentation du département de Génétique

Animale• Présentation de la plateforme

La cytogénétique clinique à l’INRA• Bref historique• Les principaux résultats• Activité cytogénétique porcine

• Historique• Motivations • Principaux résultats

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Activités de recherche : analyse des effets des anomalies sur la reproduction

• Analyse des produits méiotiques• Analyse du processus méiotique

Nouveaux projets :

• Analyse de la recombinaison and interférence• Analyse de l’infertilité mâle• Etude des points de cassure

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INTRODUCTION

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L’INRA est un organisme de recherche en agronomie fondé en 1946, placé sous le statut et sous la double tutelle des ministères de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et du ministère de l'Agriculture, de l'Agroalimentaire et de la Forêt.

L'INRA mène des recherches finalisées pour une alimentation saine et de qualité, pour une agriculture durable et compétitive, et pour un environnement préservé et valorisé.

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L’INRA :

Le département de Génétique Animale :

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CT1 - le génome : structure fine et organisation fonctionnelle

CT2 - l'animal : leviers génétiques pour un élevage innovant et durable

CT3 - les populations animales : caractérisation, gestion et optimisation

Equipe CYTOGENE :

Plasticité du génome et de l’épigénome au cours de la gamétogenèse

Architecture nucléaire 3D et expression du génome

Caractérisation de la diversité génétique de l’abeille domestique

Anne Marie LOUSTAU

Responsable Qualité AI Inra

Nathalie MOUNEY

Resp Activité Bovins, autres espèces TR Envt

Anne CALGARO

Resp Activité Porcs TR Ex Envt

Alain PINTON

Responsable Plateforme de Cytogénétique IR Inra

Nathalie PRONO

Secrétaire AJT FR Envt

Nicolas MARY

TR Inra

Alain DUCOS

Pr Envt

CONTRÔLE CHROMOSOMIQUE DES POPULATIONS ANIMALES (porcs, bovins,

chevaux, sangliers…)

PROGRAMMES SCIENTIFIQUES Anomalies chromosomiques et

reproduction

Personnes impliquées dans les deux activités

PLATEFORME DE CYTOGENETIQUE (ISO 9001)

Périmètre de certification ISO 9001

Harmonie BARASC

IE ENVT

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http://www.envt.fr/node/327

Missions

Mission 2 : Programmes scientifiques « cytogénétique et reproduction »

Développer, dans la continuité de l’activité de contrôle, des programmes de recherche originaux dans le domaine de la « biologie de la reproduction »

Mission 1 : Contrôle chromosomique des populations animales

Apporter un service au monde de l’élevage par la recherche d’anomalies chromosomiques susceptibles d’avoir des répercussions sur la « qualité des reproducteurs »

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Missions

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Recherches “finalisées ”

Objectifs : Estimer les effets potentiels des anomalies chromosomiques

Recherches “académiques”

Objectifs : Apport de nouvelles connaissances sur le processus de méiose en présence d’anomalies chromosomiques et recherche des causes d’infertilité « mâle »

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La cytogénétique clinique à l’INRA

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• Début de la cytogénétique animale dans les années 60

• 1964 : identification de la Rob 1/29 (bovin) et de la première translocation réciproque chez le porc

• Dans les années 70 développement des techniques de banding et établissement des premiers caryotypes standards

• L’association entre anomalies chromosomiques et troubles de la reproduction → développement de laboratoires de cytogénétique animale principalement en Europe

• Depuis les années 90→ déclin de la cytogénétique animale clinique

Un peu d’histoire:

ATC le 10/09/2014ATC le 10/09/2014

Un peu d’histoire:

• 1968: établissement des premiers laboratoires de cytogénétique à l’INRA (Jouy en Josas : Paul Popescu et Toulouse : Roland Darré)

• 1971: identification de la Rob 1/29 en France

• 1986: décret rendant obligatoire l’analyse des taureaux avant leur utilisation en insémination artificielle

• 2009: obligation d’élever des sangliers présentant un caryotype à 36 chromosomes

• Entre 8000 et 10000 analyses chromosomiques réalisées chaque année (principalement chez le porc et le bovin)

• Ces analyses concernent généralement des individus à phénotype normal

• Les individus anormaux sont éliminés par les éleveurs• Les anomalies détectées sont généralement équilibrées

Aujourd’hui• Comme chez l’Homme, peuvent être responsables

d’anomalies congénitales, d’infertilité, de cancer…

Pertes économiques potentiellement importantes• Quelques laboratoires principalement en Europe réalisent des contrôles systématiques (Ducos et al., 2008)

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Résultats dans l’espèce bovine

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Rob 1/29Obligation de tester les taureaux avant IA

Baisse de la fertilité entre 3 and 5% (Gustavsson, 1969, 1971; Refsdal, 1976; Logue and Harvey, 1978; Dyren-dahl and Gustavsson, 1979; King et al., 1980, 1981; Popescu 1980; Schmutz et al., 1991; Wilson, 1991; Lonergan et al.,1994)

1700 analyses par an

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Freemartinisme

Le freemartin est une femelle presque toujours stérile née d’une naissance gémellaire hétérosexuée.Cette anomalie apparait dans 90% des naissances comportant au moins un mâle et une femelle. Le diagnostic de freemartinisme est réalisé par la recherche de chimérisme leucocytaire XX/XY résultant de l’anastomose placentaire entre les jumeaux hétérosexués.

• Cattle

Autres anomalies

• Rcp(8;9)• Rcp(1;15)• Rcp(7;7) mosaic 10.7%

• Inv (29)

• 2n=60,XY; 61,XXY (16%)

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Principales anomalies identifiées :±20rcp, 7inv, 50Rob±5 trisomies autosomalesAneuploïdies des chromosomes sexuels XXY, XY/XYY, XXX

Environ 400 analyses par an

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Résultats “sangliers”

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Résultats “chevaux”

2009 2010 2011 2012 20130

1

2

3

4

5

6

7

32

3

5

2

14

3

2

5

NX0

Analyse de femelles présentant des problèmes de reproduction

Principales anomalies identifiées :±10 rcp±10 trisomies autosomalesAneuploidies des chromosomes sexuels X0, XXX, XXY, XX/XY, XX sex reversal, XY sex reversal

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X

Y

Y

63, X0 / 65, XYY dans un cas de pseudohermaphrodisme mâlePaget et al. (2001)

Résultats “chevaux”

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Résultats “chiens”

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Cytogénétique dans l’espèce porcine

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Introduction: historique rapide

Initiation du contrôle chromosomique à grande échelle dès 19951997 : J. Rech. Porcine, 29, 375-382

• Présentation des objectifs, des premiers résultats

2002 : J. Rech. Porcine, 34, 269-275

• Résultats 1998-2002

2007 : J. Rech. Porcine, 39, 281-288

• Résultats 2002-2006

2012 : J. Rech. Porcine, 44, 43-44• Résultats 2007-2011

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Introduction: motivations

Anomalies chromosomiques:

• acquises (cancers …)

• constitutionnelles (malformations, problèmes de reproduction)

Anomalies déséquilibrées (ex : trisomies)

Anomalies équilibrées (structure)

Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées

Chez les hétérozygotes troubles de la reproduction

• ♂

• ♂ et ♀

Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie) Qualité de semence dégradée

Production de gamètes déséquilibrés

Baisse de la prolificité des conjointes de verrats porteurs

- 40% en moyenne (de -10% à -100%) pour les t. réciproques

Conséquences économiques importantes !


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Animal normal Animal transloqué hétérozygote

Quadrivalent méïotique(stade diacinèse- métaphase I)

ségrégation alterne ségrégation adjacente- 1

équilibré déséquilibré déséquilibrénormal

X

Zygote normal

normal

zygote transloquééquilibré

zygotes déséquilibrés

gamètes

mortalité embryonnaire

Animal normal Animal transloqué hétérozygote

Quadrivalent méïotique(stade diacinèse- métaphase I)

ségrégation alterne ségrégation adjacente- 1

équilibré déséquilibré déséquilibrénormal

X

Zygote normal

normal

zygote transloquééquilibré

zygotes déséquilibrés

gamètes

mortalité embryonnaire


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• 1 verrat / 200 porteur d’anomalie

• Coût de la détection d’une anomalie :

200 x 60 € = 12 000 €

Coût du contrôle Coût de l’absence de contrôle

1. Coût direct : perte de porcelets (- 4 porcelets par portée)

LW / LF

• 90 doses / mois ( 110)• 40 portées / mois

P

• 190 doses / mois ( 220)• 80 portées / mois

Utilisation des verrats pendant 4 mois(le temps de constater l’hypoprolificité)

• 160 portées produites• manque 640 porcelets

~ 20 000 €

• 320 portées produites• manque 1280 porcelets

~ 40 000 €

2. Coût indirect : diffusion de l’anomalie

• 50% des descendants d’un porteur d’anomalie sont eux-mêmes porteurs de l’anomalie !

• La diffusion est potentiellement massive !


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Organisation de la filière porcine

• Très large utilisation de l’ Insémination Artificielle (IA)

Potentielle dissémination des anomalies chromosomiques Mise en place d’un contrôle chromosomique

Sélection

Multiplication

Production

Races pures et lignées

Fabrication d’individus croisés : - cochettes parentales- verrats terminaux croisés

Porcs charcutiers croisés

95 élevages13 400 truies

330 élevages56 750 truies

9 000 élevages1 202 600 truies

IFIP, 2008

Matériels et méthodes:

Matériels et méthodes:

90% • jeunes verrats de race pure (6-10 mois)

3% • verrats hypoprolifiques

7% • analyses familiales

• 90% de ces animaux: 3 organismes de sélection

Cytogénétique classique (GTG) and FISH

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Leica GSL120

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Résultats

• Plus de 31000 individus analysés à ce jour (1700/an)

169 anomalies de structure 29 anomalies des chromosomes sexuels

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Résultats

Le plus important…

La fréquence des anomalies de structure équilibrées:

0,47%

Plus de 86% sont des translocations réciproques (baisse de prolificité de 40% en

moyenne)

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Recherche : analyse des effets des anomalies sur la

reproduction



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• ♂

• ♂ et ♀



Introduction:

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Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques• 0,5% chez le porc

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Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques

Ségrégation alterne

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Facteurs influençant le comportement méiotique :

• Chromosomes impliqués

• Taille des fragments transloqués…

• Sexe

• Fond génétique


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• rcp (12;14)(q13;q21)

• rcp (3;15)(q27;q13)

SSC12

SSC14

der14 der12

SSC 3SSC 15

der 15

der 3


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• Mâles :

alternate/ adjacent 1 adjacent 2 3:1 diploïd/4:0

adjacent-1 alternate/adjacent-1 adjacent-2 3:1alternate

• Femelles :


• Effet du sexe sur la ségrégation méiotique


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• Pas de variabilité inter- ou intra-individuelle


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N der(3)

N der(16)

N der(3)

N der(16)

N der(3)

N der(16)

N

N der(16)

NN

N der(16)

N

Porcelet avec un caryotype déséquilibré2n=38, XX (ou XY), der16 t(3;16)(q23;q22)

Verrat transloqué

t(3;16)(q23;q22) and palatoschisis (fentes palatines)

Ducos et al., 2004

Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes

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déséquilibréséquilibrés

der(13;17)

13 17

Alterne Adjacente 3:0

• 0,013% chez le porc

Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes

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Production de gamètes déséquilibrés: inversions

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• 0.03%-0,06% chez le porc

Inversion Péricentrique Inversion

Paracentrique

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SSC2 normal SSC2 inversé

région inversée : 36 %

p1.1

q2.1





p1.1q1.1

inv(2)(q1.3;q2.5)

inv(2)(p1.1;q2.1)

inv(2)(p1.1;q1.1)

inv(1)(q1.2;q2.4)

inv(1)(p2.1;q2.10)

inv(1)(p2.4;q2.9)

* * *

SSC1 inverséSSC1 normal SSC1 normalSSC1 normal SSC1 inverséSSC1 inversé



région inversée : 85,5 %

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Taux de gamètes recombinés <5%


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Troubles de la spermatogenèse



• ♂

• ♂ et ♀



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• Des anomalies du spermogramme sont observées dans 50% des couples infertiles (Huynch et al., 2002)

• La prevalence des anomalies chromosomiques est plus élevée chez les hommes presentant des spermogrammes anormaux (21X, azoospermies ; 7X oligospermies) (Mau-Holzmann, 2005)


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• Les remaniements peuvent conduire à des anomalies de la méiose responsables de troubles de la spermatogenèse (Van Assche 1996; Martin, 2008)

1) Association des chromosomes remaniés avec le bivalent XY:

propagation de l’inactivation du chromosome X aux segments autosomiques associés (Jaafar et al., 1993)

transcription de gènes du chromosome X (Lifschytz and Lindsley, 1972)

2) Présence des protéines BRCA1, ATR and H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012)


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rcp(7p+;13q-)

(Gustavsson et al., 1988)

(Oliver-Bonet et al., 2004)

• anomalies d’appariement des chromosomes en particulier dans les régions des points de cassure (Luciani and Guichaoua, 1990)

• association des régions non appariées avec le bivalent sexuel apparié uniquement par les régions pseudo-autosomale

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Présence des protéines BRCA1, ATR and H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012)

Turner et al. 2005

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Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc

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RNA/DNA FISH

Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc

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Troubles de la spermatogenèse : verrat 38,XY/39,XXY

- cellules XXY dans le testicule mais seulement les cellules XY entrent en division de méiose-Méiose perturbée: spermatogenèse anormale environnement testiculaire inapproprié

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Oligo-, Astheno-, Térato-spermique (19.106/ml)

Spermatogenèse fortement perturbée

Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc

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SCP1+SCP3SCP3γH2AXCentro

Q + NO T + A

SSC1

SSC14der1

der14

Poster H. Barasc

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SSC1: 293,925,712

der14

SSC1

der1

SSC1, BAC CH242- 298E5

SSC14: 148,080

der14

der1

SSC14

SSC14 , BAC SBAB-234D5

Poster H. Barasc

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1 2

3 4

• der 1: PCR entre les primers 1 4

• der 14: PCR entre les primers 3 2

PERSPECTIVES

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Identification de remaniements chromosomiques et étude de leurs effets sur la reproduction

Analyse de nouveaux cas identifiés lors du contrôle sur la plateforme

donner un conseil plus documenté aux éleveurs

Analyse des effets des anomalies

Analyse de la recombinaison et de l’interférence chez le porcs(N. Mary)

• Acquisition de données de référence, étude de l’effet de la race, de l’âge…

• A partir de ces données, analyser les effets des anomalies chromosomiques sur la recombinaison

Analyse de la recombinaison méiotique

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Analyse de la recombinaison méiotique

MLH1

SCP3

Centromeres

Analyse de l’infertilité mâle (génétique et épigénétique)

• Analyse CGH de verrats présentant des qualités de semence dégradées

1895 CNVs detectés plus de délétions que de duplicationsCorrélation nombre de délétions/concentration

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 X Y0

20

40

Distribution of the CNVs

del

dup

Chromosomes

CN

Vs

nu

mb

ers

200 210 220 230 240 250 260 270 2800

0.5

1

1.5

2

2.5

3

R² = 0.767626596526906

correlation sperm concentration/deletions numbers

deletions numbers

log

(co

nce

ntr

atio

n)

Caractérisation des points de cassure séquençage verrats transloqués

Analyse des intéractions des régions de points de cassure au cours de la méiose

Analyse des points de cassure

Merci de votre attention

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http://www.envt.fr/node/327http://www.envt.fr/node/541







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