Physiologie Rénaleet modèles IN VITRO

GEPPRGroupe d’étude de Physiologie et de Physiopathologie Rénales

UFR Pharmacie

B. L ’AZOU / Novembre 2007

Le rein joue un rôle central dans le maintien du volume et de lacomposition ionique des fluides de l'organisme (homéostasie).Les modifications importantes de débit des urines et de leurcomposition traduisent les capacités du rein à s'adapter à unesituation physiologique ou pathologique donnée. Le rein est lavoie principale d'excrétion des déchets métaboliques nonvolatils, certains d'entre eux étant potentiellement toxiques.

Chez l'homme adulte, chaque rein pèse environ 150 g. Le reincomporte 2 régions bien distinctes : le cortex où se trouventtous les glomérules et la médullaire dont l'extrémité interne oupapille se projette dans la cavité excrétrice (petit calice).

Le néphron est l'unité fonctionnelle du rein.Chaque rein comprend environ 1.2 million de néphron par rein avec des variations importantes 0.7 à 1.5 million.

Le néphron est une unité très complexe, constitué d’un glomérule et d’un tubule. Ces différents segments ont leurs propres caractéristiques morphologiques et fonctionnelles bien définies

Le GLOMERULE est la partie du néphron

responsable de la filtration du plasma

Chaque glomérule est constitué de plusieurs types cellulaires (4) :

-Cellules mésangiales (A)-Cellules endothéliales (B)-Cellules épithéliales viscérales (C)-Cellules épithéliales pariétales (D)

Le tubule est aussi subdivisé en plusieurs segments ayant chacun leurs propres caractéristiques.De plus certains segments sont eux même composés de plusieurs types cellulaires

Le TUBULE

Modèles IN VITRO d ’évaluation de la néphrotoxicité

• Devant la complexité du rein (hétérogénéité structurale et fonctionnelle), il sera difficile in vivo, voir impossible, de cerner les mécanismes cellulaires et biochimiques impliqués dans les pathologies et les toxicités induites par les médicaments

• Il sera possible in vivo

de détecter une insuffisance

rénale ou une néphrotoxicité

induite par un dosage de la

GFR ou RPF, mais il sera

impossible d’en étudier les

mécanismes responsables

Modèles IN VITRO d ’évaluation de la néphrotoxicité

• C’est pourquoi un certain nombre de modèles in vitro ont été progressivement introduits, tels que les organes isolés, les suspensions cellulaires, les cultures cellulaires et les éléments subcellulaires

Etude des mécanismes précis parintroduction des modèles in vitro

WWW.nephrohus.org

Modèles in vitro - Avantages

• Organe isolé

• Coupes d’organes

• cellules en culture primaire

• cellules en lignées

• cellules génétiquement modifiées

• élements subcellulaires

• Fonction proche de l’organe in situ

structure tridimensionnelle conservée

Absence d ’influence des autres tissus

• Structure tissulaire conservée (interaction cellule -cellule)

Utilisation de tissu humain

Etudes de plusieurs produits à différentes concentrations

Etudes histologiques possibles

• Fonction spécifiques transitoirement conservées

congélation possible

Evaluation de plusieurs molécules à différentes concentrations

Etudes inter-espèces

• Pas de limitation de nombre

certaines fonctions exprimées

• Pas de limitation de nombre

certaines fonctions bien exprimées

Modèles in vitro - Limites

• Organe isolé

• Coupes d ’organes

• cellules en culture primaire

• cellules en lignées

• cellules génétiquement modifiées

• Durée de vie limitée à quelques heures

Etude d’un seul produit

Organe humain non possible

Nombre d’animaux utilisé proche de l’in vivo

• Durée de vie limitée < 24 heures

Viabilité cellulaire variable selon la localisation

Plusieurs types cellulaires

• Instabilité fonctionnelle et perte de fonctions spécifiques

Durée de vie variable

• Nombreuses fonctions absentes ou altérées

Instabilité au cours des passages

• Niveau d ’expression parfois limité

pas d’induction

Modèle 1 : organe isolé

• Organe isolé

• Fonction proche de l’organe in situ

structure tridimensionnelle conservée

Absence d ’influence des autres tissus

• Durée de vie limitée à quelques heures

Etude d’un seul produit

Organe humain non possible

Nombre d’animaux utilisé proche de l’in vivo

Survie d’un fragment d’organe

en conservant sont intégrité et

son architecture

Ce modèle permet de maintenir une organisation qui reflète bien la réponse de l’organe cible ; ces tranches de rein préservent bien les interactions cellule –cellule et cellule- matrice.

Utilisé dans le domaine de la physiologie pour étudier le transport des ions organiques et le métabolisme de substances diverses. On a pu montrer des perturbations métaboliques comme des modifications de la glucogénèse après administration de gentamicine.

Ce modèle est encore global pour apprécier le site exact de l’atteinte cellulaire d’un toxique.

Ce modèle a une courte période d’intégrité fonctionnelle, évaluée en quelques heures ce qui interdit de longues périodes d’intoxications

Modèle 2 : Tranches de rein (slices)

Modèle 3 : Glomérules Isolés

La dispersion enzymatique consiste à faireincuber un homogénat cortical en présence decollagénase sous agitation.La séparation peut éventuellement êtreaffinée par centrifugation en gradient dedensité.

La dispersion mécanique au travers desmailles d’un tamis de l’homogénat corticalprésente l’avantage d’isoler les glomérulesdes tubules proximaux et distaux.

Modèle 4 : Tubules Isolés

L ’isolement des tubules peut se faire par microdissection par dissociation enzymatique ou après un action mécanique

Modèle 5 :Culture cellulaire

- Primoculture de cellules- Lignées cellulaires- Cellules génétiquement modifiées- Cellules souches

Les cultures cellulaires, selon la définition du comité de terminologie de l’association américaine de culture de cellules,correspondent au maintien en dehors de l’organisme de cellules non-organisées en tissus mais capables de se diviseret d’exprimer in vitro des métabolismes spécifiques.

“Maintenir in vitro des cellules possédant tout ou une partiedes caractéristiques qu’elles manifestent in vivo et pouvantaboutir dans certaines conditions de culture à une véritableorganisation tissulaire”.

Définition des cultures cellulaires

• Les cellules primaires sont obtenues directement à partir de tissus ou d’organes, et mises en culture pour la première fois sur un support qu’il s’agisse de verre ou de plastique.

– Cellules dissociées à partir d’un tissu avant d’être cultivées

– Peuvent se diviser mais il peut s’agir aussi d’un maintien en survie

Modèle 5.1 : culture cellules primaires

Vérifier la stabilité des caractères définiscar nombre de passages limités

Au-delà les cellules entrent en phase de sénescence réplicatives (arrêt en phase G1)

Nombre de passages limités car les cellules se dedifférencient en culture

C.a.d. s’assurer les caractères exprimés le sont au fur et à mesure des repiquages

Les cellules se multiplient Passage par repiquages (décollement des cellules et dilution de

la suspension cellulaire et remise sur support)Trypsine/EDTA, grattoir

Modèle 5.1.b cellules primaires A VERFIER

Modèle 5.2 : Les lignées cellulaires

Populations cellulaires possédant la capacité de se diviser indéfiniment in vitro : 3 catégories

- Lignées établies spontanément en culture à partir de cellules normales ayant échappé à la sénescence

- Lignées établies à partir de tissus tumoraux

- Lignées immortalisées ou transformées à partir de cellules normales à partir de divers agents physiques ou chimiques ou surtout par l’expression ou la surexpression d’oncogènes viraux ou cellulaires

• LLC-PK1:• Lignée rénale tubulaire

Proximale

• Porc

• Modèle d’étude des fonctions des cellules tubulaires(transport, enzymes caractéristiques de la mb apicale, fortes activités enzymatiques d ’origine lysosomiales, jonctions membranaires)

• MDCK• Lignée rénale tubulaire Distale

• Chien

• Modèle d’étude des fonctions des cellules tubulaires (expression des récepteurs aux hormones, régulation du pH)

Modèle culture lignées cellulaires

Technique de culture cellulaire

Transforme la boîte de culture en petite usine de fabricationde cellules

Matériels et Méthodes

“Maintenir in vitro des cellules possédant tout ou une partie des caractéristiques qu’elles manifestent in vivo et pouvantaboutir dans certaines conditions de culture à une véritable organisation tissulaire”.

Méthodologie : Quel Environnement?

Milieux de culture

Supports

“Maintenir in vitro des cellules possédant tout ou une partie des caractéristiques qu’elles manifestent in vivo et pouvant aboutir dans certaines conditions de culture à une véritable organisation tissulaire”.

Chacun interviendra sur la survie, la prolifération,La différenciation, la migration cellulaire

Les besoins

- Besoins physicochimiques

- pH, Osmolarité

- T°, humidité

- Stérilité

Approche méthodologiques -STRATEGIES

Validation et interprétation des résultats

Quelle est leur valeur en terme de reproductibilité ?Quelle est leur valeur en terme de sensibilité ? Quelle est leur valeur en terme de spécificité ?

(inter et intra labo)

Corrélation in vivo / in vitro

Reconnaissance de ces tests in vitro

Limites des cultures cellulaires

Limites

• Seules les molécules qui ont une toxicité directe sont détectées

• Ne met pas en évidence les interactions entre plusieurs organes ou entre plusieurs types cellulaires du même organe

• Absence d’élimination des métabolites

• Stase du milieu

• Modèles en 2 D

Limites des cultures cellulaires

Complexification et améliorations

Conclusions

• La culture de cellules présente le moyen le plus performant

– pour connaître l ’impact d ’une substance sur sa cible potentielle décrire les mécanismes impliqués de tester les nouvelles molécules

– Les situations in vitro permettent d’établir des hypothèses concernant la réalité in vivo