PHYSIOLOGIE ET EXPLORATION DE L’HEMOSTASE

Anny APPERT FLORYLaboratoire d’Hématologie

HEMOSTASE – GENERALITES

• Rôles physiologiques :– maintien de la masse sanguine– maintien de la fluidité du sang

• Les différents temps de l’hémostase :– hémostase primaire : formation du clou plaquettaire– coagulation : formation du caillot de fibrine– fibrinolyse : reperméabilisation du vaisseau

Le déroulement de l’hémostase 

REPERMEABILISATION DU VAISSEAU

OBLITERATION DE LA BRECHE VASCULAIRE

EFFRACTION VASCULAIRE

FIBRINOLYSE

HEMOSTASE PRIMAIRE COAGULATION

CAILLOT FIBRINO-PLAQUETTAIRE

HémostaseHémostase

1 Blessure 2 Vaso-constriction

3 Accollementdes parois

4 Formation du clouplaquettaire

5 Caillot

HEMOSTASE – GENERALITES

Le seul tissu normalement en contact avec le sang est l’endothélium (thromborésistant).

L’hémostase permet de préserver l’intégrité du système vasculaire (système clos à haute pression) et de minimiser l’extravasation de sang après une blessure vasculaire.

Elle repose sur le passage rapide de cellules sanguines et de protéines plasmatiques (enzymes), d’un état quiescent à un état activé.

HEMOSTASE – GENERALITES

Système dynamique, en équilibre permanent entre des facteurs activateurs et des facteurs inhibiteurs :

Régulation dans l’espace : formation du caillot uniquement au niveau de la lésion.

Régulation dans le temps : formation rapide du caillot, dissolution retardée dans le temps.

Une rupture d’équilibre entraîne soit :

Une pathologie hémorragique : caillot insuffisant, ou détruit trop tôt.

Une pathologie thrombotique : caillot trop important, ou mal détruit.

PHYSIOLOGIE DE L’HEMOSTASE PRIMAIRE • Phase très précoce (3 à 5 mn) formation du clou plaquettaire.→

• Deux phases après lésion de la paroi vasculaire :

Temps vasculaire :vasoconstriction réflexe diminution du flux sanguin.→

Temps plaquettaire : Adhésion des plaquettes au collagène

(GP VI ou facteur Willebrand / GP Ib).

Activation des plaquettes : auto-amplification, recrutement d’autres plaquettes, préparation de la coagulation.

Agrégation des plaquettes entre elles

(facteur Willebrand ou fibrinogène / GP IIbIIIa).

EFFRACTION VASCULAIRE

SOUS ENDOTHELIUM PLAQUETTES

FACTEUR WILLEBRAND

ADHESION

ACTIVATION

SECRETION PLAQUETTAIRE

SYNTHESE PROSTAGLANDINES

FLIP-FLOP

TX A2

AGREGATION

ADP

THROMBINE

COAGULATION

DEROULEMENT HEMOSTASE PRIMAIRE

(d ’après Boneu et Cazenave, 1997)

HEMOSTASE PRIMAIREHEMOSTASE PRIMAIREDEROULEMENTDEROULEMENT

HEMOSTASE PRIMAIRE : REGULATION

Régulation positive : Conséquence de l’activation plaquettaire renforcement du clou plaquettaire→ .

Régulation négative : Evite la diffusion à distance des phénomènes.Sous la dépendance de l’endothélium (prostacycline, monoxyde d’azote) = action anti-agrégante plaquettaire et vasodilatatrice.

EXPLORATION BIOLOGIQUE DE L’HEMOSTASE PRIMAIRE

Test global : temps de saignement : Méthode de Duke (normale = 2 à 4 mn). Méthode d’Ivy (normale < 8 mn).

Test semi global : Temps d’occlusion (PFA – Dade Behring)

Screening : maladie de Willebrand, thrombopathies, aspirine.

Etude des plaquettes : Numération plaquettaire (normale = 150 à 400 x 109 / l).

Etude des fonctions plaquettaires : agrégation fonctionnelle plaquettaire.

Etude des glycoprotéines plaquettaires par cytométrie en flux.

EXPLORATION BIOLOGIQUE DE L’HEMOSTASE PRIMAIRE – ETUDE DES PROTEINES PLASMATIQUES

Facteur von Willebrand (vWF) : Facteur Willebrand cofacteur de la ristocétine (vWFRCO) Normale = 50 à 150 %.

Facteur Willebrand antigène (vWFAg).Normale = 50 à 150 %.

Facteur VIII coagulant (VIIIc).Normale = 60 à 150 %.

Fibrinogène : (dosage de l’activité)Normale = 2 à 4 g / l.

COAGULATION – GENERALITES

Concomittante in vivo à l’hémostase primaire.

Cascade régulée et ordonnée de réactions enzymatiques qui surviennent à la surface de cellules activées (PL anioniques), et qui aboutissent à la génération de thrombine (= fact IIa).

Le substrat de la thrombine est le fibrinogène → fibrine, avec pour conséquence la gélification du plasma.

La génération de thrombine est strictement régulée par des inhibiteurs physiologiques.

Nomenclature :Facteur inactif = zymogène de sérine protéase, ex : Facteur XFacteur actif = sérine protéase, ex : Facteur XaCofacteurs inactifs (ex : facteur VIII) ou actifs (ex : facteur VIIIa)

COAGULATION – GENERALITES

FACTEURS PROCOAGULANTS

INHIBITEURS PHYSIOLOGIQUES

FACTEUR DECLENCHANT

(FT)

ZYMOGENES (II, VII, IX, X)

COFACTEURS (V, VIII)

TFPI

INHIBITEURS D’ENZYMES (AT)

INHIBITEURS DES COFACTEURS

(PC-PS)

THROMBINE

FIBRINOGENE FIBRINE

PHYSIOLOGIE DE LA COAGULATION Phénomène rapide (5 à 10 mn). Tous les facteurs de la coagulation circulent sous forme inactive, sauf le VII. La

majorité d’entre eux est synthétisée par le foie.

Toutes les réactions enzymatiques nécessitent la présence de calcium.

Deux voies de déclenchement de la coagulation :• Voie extrinsèque : facteur tissulaire / facteur VII (prépondérante).• Voie intrinsèque : facteurs contact.

Les différents types de protéines :• Les enzymes :

Vitamino-K dépendantes : II, VII, IX, X.Contact : Prékallicréine, XI, XII.Facteur XIII

• Les cofacteurs : V, VIII.• Les complexes : Tenase ou dixase = IX / VIII / PL / Ca.

� Prothrombinase = X / V / PL / Ca.

COAGULATION

InhibiteursPhysiologiquesAT - PC - PS

Paroi vasculaire / PlaquettesFacteurs de coagulation

Activation de la coagulation

THROMBINE = IIa

Fibrinogène FIBRINE

F Xa

Initiation de la coagulation

X Xa IX IXa

Fact tissulaire

VII / VIIa

Lésion Vasculaire

IIaPremières traces de thrombine

II

Amplification de la coagulation

Amplification : Activation des plaquettes, F XI F XIa FV FVa, formation complexe Tenase FVIII FVIIIa, formation complexe Prothrombinase

Premières traces de thrombine = IIa

Génération explosive de thrombine

X Xa IX IXa

Fact tissulaireVII / VIIa

Lésion Vasculaire

XI

XIa

IXIXa /Va

XXa/VIIIa

REGULATION DE LA GENERATION DE THROMBINE

• Régulation positive : boucle d’auto-amplification par la thrombine.

• Régulation négative :Inhibition des enzymes : antithrombine.

Inhibition des cofacteurs : protéine C et protéine S.

Inhibition de la voie extrinsèque : TFPI.

Coagulation et anticoagulationphysiologique

EXPLORATION BIOLOGIQUE DE LA COAGULATION Tests semi-globaux = tests d’orientation

• Temps de céphaline activé (TCA) :Explore la voie intrinsèque et la voie commune.Résultat rendu par rapport à un témoin.Normale : ratio temps malade / temps témoin < 1,2.

• Temps de Quick (TQ) et taux de prothrombine (TP) :Le TP est la conversion du TQ en pourcentage de la normale.Explore la voie extrinsèque et la voie commune.Résultat rendu par rapport à un témoin.Normale du TP = 70 à 100 %.

• Temps de thrombine (TT) :Explore la fibrinoformation.Résultat rendu par rapport à un témoin.Normale : < temps témoin + 6 secondes

Tests semi-globaux

TCATCA

TPTP

EXPLORATION BIOLOGIQUE DE LA COAGULATION Dosages analytiques  = dosages spécifiques

Dosage des facteurs et inhibiteurs de la coagulation, soit par :• Dosage de l’activité de la protéine : tests de routine.• Dosage de la protéine antigène.

Exploration en fonction des tests d’orientation : • Anomalie du TP : cofacteurs du TP (II, VII, X, V) • Anomalie du TCA : facteurs endogènes (VIII, IX, XI, XII)

PHYSIOLOGIE DE LA FIBRINOLYSE

Système enzymatique, responsable de la dissolution du caillot de fibrine, et dont le plein effet est décalé dans le temps (48 à 72 h).

Basé sur la génération régulée de plasmine (à partir du plasminogène), dont l’action est de dégrader la fibrine.

L’activation du plasminogène en plasmine :déclenchée par la présence de fibrinelocalisée au niveau du caillotretardée par le TAFI

La dégradation de la fibrine :

digestion progressive du caillot de fibrine, aboutissant à des produits de dégradation de plus en plus petits (PDF). Les produits ultimes sont les D-Dimères.

FIBRINOLYSE – DEROULEMENT

PLASMINOGENE PLASMINE

tPA

PAI-1

FIBRINEPDF

D-DIMERES

α2 ANTIPLASMINE

REGULATION DE LA FIBRINOLYSE

• Régulation dans l’espace : génération de plasmine limitée au caillot Fixation du plasminogène et de son activateur (tPA) sur la fibrine.

Neutralisation de la plasmine libre (α2 antiplasmine).

Neutralisation du tPA libre (PAI).

Régulation dans le temps : protection du caillot contre une dégradation précoce : TAFI (thrombin activated fibrinolysis inhbitor)

→ destruction des sites de liaison du plasminogène et de son activateur à la fibrine du caillot. α2 antiplasmine → neutralisation limitée de la plasmine liée.

EXPLORATION BIOLOGIQUE DE LA FIBRINOLYSE

Test global = Test de von Kaulla (temps de lyse des euglobulines).• Temps nécessaire à la lyse d’un caillot de fibrine, après neutralisation des inhibiteurs de la fibrinolyse.• Normale > 3 heures.

Tests spécifiques :• Dosages des marqueurs de la fibrinolyse :

Fibrinogène.Produits de dégradation de la fibrine et du fibrinogène (PDF).D-dimères

• Dosage des protéines de la fibrinolyse :Plasminogène tPA (tissu plasminogen activator).PAI (Plasminogen activator inhibitor).a2 antiplasmine.

PHYSIOPATHOLOGIE DE L’HEMOSTASE

• Système dynamique, en équilibre permanent entre des facteurs activateurs et des facteurs inhibiteurs :

•• Régulation dans l’espace : formation du caillot uniquement au

niveau de la lésion.•• Régulation dans le temps : formation rapide du caillot,

dissolution retardée dans le temps.

• Une rupture d’équilibre entraîne soit :

• Une pathologie hémorragique : caillot insuffisant, ou détruit trop tôt.•• Une pathologie thrombotique : caillot trop important, ou mal détruit. •

PATHOLOGIES HEMORRAGIQUES

Anomalie constitutionnelle Anomalie acquise

Hémostase primaire

* Plaquettes

* vWF

* fibrinogène

Thrombopathies

Thrombopénies

Maladie de Willebrand

Hypo ou afibrinogénémie

Thrombopathies médicamenteuses (aspirine)Défaut de synthèse (insuffisance médullaire)Excès de destruction (PTI)Syndrome de Willebrand

$ de consommation (CIVD)

Coagulation

VIIXIXI - VIIIX – VIIFibrinogèneXIII

Déficit (ex : hémophilie)

* Défaut de synthèse : insuffisance hépatique, hypovitaminose K

* Excès de destruction : CIVD

* Inhibiteur anti facteur (allo ou auto AC) : ex : AC anti VIII

Fibrinolyse

∗ α2 antiplasmine

* plasmine

* Déficit constitutionnel

* Excès de génération : fibrinogénolyse primitive

PATHOLOGIES THROMBOTIQUES

Anomalie constitutionnelle Anomalie acquise

Hémostase primaire

* Plaquettes

* vWF

* fibrinogène * dysfibrinogénémie

* $ myeloprolifératif

* $ inflammatoire

Coagulation

* AT, * PC / PS

* II* VIII

Déficit

* Mutation G20210A* Augmentation permanente

* $ néphrotique* Hypovitaminose K* AC anti PC ou PS

* $ inflammatoireFibrinolyse

? ?

LES PRELEVEMENTS EN HEMOSTASE

La qualité des prélèvements conditionne la fiabilité des résultats. Les conditions du prélèvement :

• Garrot modérément serré et maintenu peu de temps.• Ponction veineuse franche.

• Remplissage des tubes (citrate de sodium 0,105-0,109M) :1 vol citrate / 9 vol sang total (++++).

• Position des tubes au cours du prélèvement : Le tube citrate ne peut passer qu'après un tube sec sans séparateur (pour

tous les autres : risque de souillure).Penser à purger la tubulure du dispositif de prélèvement si le tube citrate

est en première position.

• Mélange par retournements lents.

LES PRELEVEMENTS EN HEMOSTASE Les sources d’erreurs

• Liées au prélèvement :Garrot trop serré ou maintenu trop longtemps

Activation de la coagulation ( TCA).Aspiration à la seringue

Activation de la coagulation ou prélèvement coagulé.Souillure par l’héparine :

Incoagulabilité ou résultats ininterprétables.

• Liées au transport et à la conservation :Lenteur d’acheminement (délai maximum = 4 heures)

Diminution des facteurs V et VIII.Neutralisation de l’héparine.

Conservation à +4°CActivation du VII.Modification des fonctions plaquettaire.

LES PRELEVEMENTS EN HEMOSTASE Les sources d’erreurs

• Liées au patient :Anémie ou polyglobulie

Mauvais rapport sang / anticoagulantRésultats faussés.

HémolyseActivation de la coagulation et résultats faussés.

Plasma lactescent ou ictérique ou hémolyséTests colorimétriques non réalisables.

• Prises médicamenteuses : préciser tous les traitements anticoagulants et antiagrégants sur les feuilles de demandes d’examen.

SURVEILLANCE BIOLOGIQUE DES TRAITEMENTS ANTITHROMBOTIQUES : HEPARINES

• Les différentes héparines : Héparine non fractionnée (HNF) :

Héparine, Calciparine. Héparine de bas poids moléculaire (HBPM) :

Lovenox, Fragmine, Fraxiparine, Fraxodi, Innohep.

• Surveillance des HNFRésultats à interpréter en fonction du moment du prélèvement / injection.Tests : TCA et activité anti-Xa HNF.

• Surveillance des HBPM :Délai entre injection et prélèvement à respecter impérativement (+++).Test : activité anti-Xa HBPM.

• Surveillance de la numération plaquettaire (2 fois par semaine pendant 3 semaines). Dépistage des thrombopénies induites par l’héparine de type II.

SURVEILLANCE BIOLOGIQUE DES TRAITEMENTS ANTITHROMBOTIQUES

Traitement par ANTIVITAMINE K  (Sintron, Préviscan, Coumadine) :Surveillance par l’INR (International Normalized Ratio) : calcul dérivé du temps de Quick du patient, affecté d’un coefficient propre au réactif utilisé pour l’analyse.

Traitement par ANTIAGREGANTS PLAQUETTAIRES :• Aspirine, Clopidogrel, Prasugrel, Ticagrelor.• Aucun impact sur les tests de coagulation de routine.• Eventuellement, surveillance par l’étude des fonctions plaquettaires.

SURVEILLANCE BIOLOGIQUE DES NOUVEAUX ANTITHROMBOTIQUES

• Fondaparinux sodique (Arixtra ®) :– Action anti Xa indirecte– Pas de surveillance biologique de l’efficacité– Pas d’impact sur les tests de coagulation

• Rivaroxaban (Xarelto ®)– Action anti Xa directe– Pas de surveillance biologique de l’efficacité– Impact sur les tests de coagulation : TP et TCA

• Dabigatran (Pradaxa ®)– Action anti IIa directe– Pas de surveillance biologique de l’efficacité– Impact sur les tests de coagulation : TCA essentiellement