PASTOREXTM MENINGITIS25 tests

61607 61611 6161661608 61613 6161861610 61614 61717

DÉTECTION DES ANTIGÈNES SOLUBLES ET IDENTIFICATIONDE NEISSERIA MENINGITIDIS A, C, Y/W135, B/E. COLI K1,HAEMOPHILUS INFLUENZAE b, STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS B

1- INTERÊT CLINIQUELa méningite bactérienne est une infection des méninges dont les principauxgermes responsables sont : Neisseria meningitidis, Streptococcuspneumoniae, Haemophilus influenzae de type b et Streptococcus groupe B.Son évolution étant souvent fulgurante et gravissime, il est important dediagnostiquer rapidement cette infection afin de mettre en place un traitementapproprié. Les techniques conventionnelles d’identification par culture, bienqu’essentielles pour l’antibiogramme et la confirmation du diagnostic, sontlentes et peuvent donner des résultats faussement négatifs si le prélèvement aété transporté et stocké dans de mauvaises conditions ou si uneantibiothérapie a été instaurée avant le prélèvement.La recherche par des techniques immunologiques des antigènes solubleslibérés par le germe au cours de l’infection dans les liquides biologiques(liquide céphalorachidien (LCR), urine, sérum) permet un diagnostic plusrapide. Les antigènes solubles recherchés au moyen de cette trousse sont despolysaccharides spécifiques de sérogroupes ou de sérotypes: Streptococcuspneumoniae (83 types), Haemophilus influenzae de type b, Neisseriameningitidis groupe A, groupe B/E.coli K1, groupe C, groupes Y/W135 etStreptococcus groupe B.L’antigène polysaccharidique spécifique du groupe B du méningocoque esttrès peu antigénique et il a toujours été très difficile d’obtenir de façonreproductible des anticorps de lapin spécifiques de cet antigène. La technologie des anticorps monoclonaux, appliquée à la préparationd’anticorps spécifiques d’antigènes polysaccharidiques bactériens, a permisd’obtenir des anticorps monoclonaux de souris capables de reconnaître defaçon spécifique et reproductible l’antigène polysaccharidique du sérogroupeB du méningocoque.Cet antigène est identique à un antigène polysaccharidique retrouvé chezE.coli K1. Cette homologie antigénique entre le méningocoque B et E.coli K1permet de diagnostiquer une partie importante des méningites à E.coli chezles nouveaux-nés dont 80 % environ sont des souches K1. Il est à noter queE.coli et le streptocoque du groupe B sont les principaux germes responsablesdes méningites chez le nouveau-né et le prématuré et que, d’autre part,l’infection par le méningocoque est extrêmement rare dans cette tranched’âge.

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2- PRINCIPEL'antigène présent dans l'échantillon testé est identifié à l'aide de particules delatex recouvertes d'anticorps spécifiques. Ces particules s'agglutinentfortement en présence de l'antigène homologue alors qu'elle restent ensuspension homogène en l'absence de celui-ci.

3- PRÉSENTATION DE LA GAMME PASTOREXTM MENINGITIS

1. PASTOREXTM MENINGITIS coffret pour 25 tests, code 61607,contenant :

• Réactif 1 (R1): N. meningitidis B/E.coli K1 1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex rouge sensibilisé par unanticorps monoclonal de souris spécifique de N. meningitidis groupe B /E.coli K1.

• Réactif 2 (R2): N. meningitidis B/E.coli K1 negative control1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex rouge sensibilisé par unanticorps monoclonal de souris spécifique de l’anatoxine tétanique.

• Réactif 3 (R3): H. influenzae b1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex blanc sensibilisé par desanticorps de lapin spécifiques d’H. influenzae de type b

• Réactif 4 (R4): S. pneumoniae1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex vert sensibilisé par des anticorpsde lapin spécifiques de S. pneumoniae.

• Réactif 5 (R5): Streptococcus B1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex jaune sensibilisé par desanticorps de lapin spécifiques de Streptococcus B.

• Réactif 6 (R6): N. meningitidis A1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex bleu sensibilisé par desanticorps de lapin spécifiques de N. meningitidis groupe A.

• Réactif 7 (R7): N. meningitidis C1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex rouge sensibilisé par desanticorps de lapin spécifiques de N. meningitidis groupe C.

• Réactif 8 (R8): N. meningitidis Y/W 1351 flacon de 0,40 ml de suspension de latex rose sensibilisé par desanticorps de lapin spécifiques de N. meningitidis groupes Y et W135.

• Réactif 9 (R9): Control polyvalent negative1 flacon de 0,40 ml de suspension de latex prune sensibilisé avec des IgGde lapin non immunisé.

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• Réactif 10 (R10): Control polyvalent positive Témoin positif : extrait antigénique polyvalent lyophilisé à reconstituer avec1 ml d’eau stérile. Contient les antigènes polysaccharidiques deN. meningitidis A, C, B, Y/W135 , H. influenzae b, Streptococcus B etS. pneumoniae. Volume suffisant pour 20 réactions.

Tous ces réactifs contiennent 0,02 % de merthiolate.Les réactifs R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 contiennent une quantité≤ 0,1% d’azoture de sodium.• Cartes d’agglutination jetables.• Bâtonnets mélangeurs jetables.

2. PASTOREXTM MENINGITIS LATEX INDIVIDUELS

• Flacon compte-gouttes de latex spécifique de la bactérie à identifier (pour25 tests) :- N. meningitidis A (R6) code 61608- N. meningitidis C (R7) code 61610- N. meningitidis B / E. coli K1 (R1) code 61611- Streptococcus B (R5) code 61613- Streptococcus pneumoniae ( R4) code 61614- Haemophilus influenzae type b (R3) code 61616

• PASTOREXTM MENINGITIS control Kit de réactifs de contrôle (pour 2 x 25 tests) code 61618- 2 flacons compte-gouttes de 0,40 ml de témoin négatif polyvalent (R9).- 2 flacons d’antigène témoin positif polyvalent lyophilisé (R10) à

reconstituer avec 1 ml d’eau stérile- 2 flacons compte-gouttes de 0,40 ml de témoin négatif N.m.B / E.coli K1

(R2).- cartes d’agglutination jetables- bâtonnets jetables.

3. PASTOREXTM MENINGITIS Diluent

1 flacon de 40 ml de diluant pour les sérums code 61717

4- CONSERVATIONLes réactifs conservés à +2-8°C et en l’absence de contamination sont stablesjusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette (y compris aprèsouverture).

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Après reconstitution, en l’absence de contamination, le témoin positif R10 eststable 1 mois à +2-8°C. Cette conservation peut être prolongée si le témoinpositif est aliquoté et congelé à –20°C immédiatement après reprise.Conserver les réactifs latex verticalement.NE JAMAIS CONGELER LES FLACONS DE LATEX.

5- MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI• Pipette pour distribuer 40 à 50 µl d’échantillon.• Tube à hémolyse ou Eppendorf• Incubateur sec ou bain-marie à 100°C.• Centrifugeuse pour tube à hémolyse ou Eppendorf.• Bac désinfectant.• Eau distillée stérile, eau physiologique stérile ou diluant (code 61717).

6- PRÉCAUTIONS D’UTILISATIONLa qualité des résultats dépend du strict respect des bonnes pratiques delaboratoire.• Tous les réactifs ainsi que l’échantillon doivent être utilisés à une

température ambiante comprise entre 18 et 25°C.• Ne pas passer les doigts sur les surfaces réactionnelles des cartes

d’agglutination.• Changer de pipette ou de cône de prélèvement pour chaque échantillon

testé.• Agiter les flacons de latex avant utilisation.• Essuyer l’embout compte-gouttes du réactif afin d’obtenir des gouttes bien

calibrées.• Tenir le flacon de latex vertical lors du dépôt de la goutte.• Changer de bâtonnet mélangeur pour chaque réaction. • Après usage, éliminer les pipettes de prélèvement des produits

pathologiques ainsi que les cartes d'agglutination et les bâtonnets dans unepoubelle autoclavable ou un bac désinfectant.

• Reconstituer le témoin positif avec de l’eau distillée stérile et éviter toutecontamination.

CONSIGNES D’HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉObserver à tout moment les techniques et précautions en vigueur en matièrede protection contre les dangers microbiologiques.• Tous les prélèvements doivent être considérés comme potentiellement

infectieux.

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7- MODE OPÉRATOIRE : LCR, sérum et urine

Echantillons

Les échantillons doivent être traités le plus rapidement possible après leprélèvement. En cas d’impossibilité, on peut stocker le prélèvement quelquesheures entre +2 et +8°C ou plus longtemps à -20°C. (dans ce cas, centrifugerl’échantillon et conserver le surnageant à –20°C. Il est recommandé de ne fairesubir qu'un seul cycle de congélation / décongélation aux échantillons). Lesexamens bactériologiques (mise en culture) doivent être pratiqués en prioritéafin d’éviter les risques de contamination de l’échantillon. Un volume minimumde 0,5 ml d’échantillon est nécessaire pour tester l’ensemble des latex.

A) PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS CLINIQUESATTENTION : Pour le chauffage au bain-marie, utiliser des tubes hermétiquesafin que l’eau ne puisse pénétrer dans les tubes. Utiliser de préférence unincubateur sec.

a) L.C.R. (Liquide Céphalo-Rachidien)Dans le cas d’un L.C.R. très trouble ou présentant une quantité importante deglobules rouges, le centrifuger durant 5 minutes à 350 g et recueillir lesurnageant.• Chauffer l'échantillon 3 minutes à 100°C (incubateur sec ou bain-marie)

ramener à température ambiante puis centrifuger 5 minutes à 3000 g oufiltrer sur filtre de 0,45 µm.

b) SÉRUM• Additionner 3 volumes (1,5 ml) de diluant (R11) [code 61717] pour un

volume (0,5 ml) de sérum • Chauffer 3 minutes à 100°C au bain-marie ou incubateur sec.• Centrifuger 5 minutes à 3000 g.ATTENTION : Ne pas utiliser du plasma comme échantillon. Les interférencesliées à une surcharge en albumine, lipide, hémoglobine et bilirubine n'ont pasété testées. Les meilleurs résultats sont obtenus avec des sérums frais.

c) URINEPour augmenter la concentration en antigène, on peut préalablement autraitement, concentrer jusqu’à 25 fois l’échantillon sur une membrane typeAmicon B-15 (Amicon, France).• Chauffer les urines 3 minutes à 100°C au bain-marie ou incubateur sec.• Centrifuger 5 minutes à 3000 g ou filtrer sur filtre 0,45 µm.

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B) PROCÉDURE DU TEST• Déposer une goutte (40 à 50 µl) du surnageant de l’échantillon prétraité

dans chaque cercle de la carte jetable. • Bien homogénéiser les réactifs latex.• Déposer une goutte de chaque réactif latex (maintenir le flacon en position

verticale) sur la carte jetable suivant la répartition indiquée : R9, R6, R7, R1,R2 dans les cercles blancs et R8, R3, R4, R5 dans les cercles noirs.

• Mélanger les latex à l’échantillon au moyen d’un bâtonnet en changeant debâtonnet pour chaque latex.

• Donner à la carte un mouvement de rotation (~120 RPM) pendant10 minutes. Observer, dans ce délai de 10 minutes, l’apparition éventuelled’une agglutination (un agitateur de type orbital peut être utilisé à unevitesse ~120 RPM).

Lecture à l’oeil nu et sous un bon éclairage.

8- MODE OPÉRATOIRE : HEMOCULTUREVérifier la morphologie et effectuer une coloration de Gram pour uneorientation présomptive.• Prélever 1 à 2 ml d’une hémoculture positive.• Centrifuger 5 minutes à 2000g.• Déposer une goutte (40 à 50 µl) de surnageant dans les cercles de la carte

jetable, correspondants aux réactifs latex à tester en fonction de lacoloration de Gram.

• Bien homogénéiser les réactifs latex sélectionnés pour le test.• Déposer une goutte de chaque réactif latex sélectionné (maintenir le flacon

en position verticale) en périphérie des gouttes de surnageant.• Mélanger les latex à l’échantillon au moyen d’un bâtonnet en changeant de

bâtonnet pour chaque latex.• Donner à la carte un mouvement de rotation (~120 RPM) pendant

5 minutes. Observer, dans ce délai de 5 minutes, l’apparition éventuelled’une agglutination (un agitateur de type orbital peut être utilisé à unevitesse ~120 RPM).

Lecture à l’oeil nu et sous un bon éclairage.Certains milieux d’hémoculture peuvent entraîner des réactions nonspécifiques ou des problèmes de lisibilité. En cas de doute tester en parallèleun bouillon d’hémoculture inoculée avec du sang stérile ou contaminé par ungerme différent de ceux détectés par la trousse Pastorex™ Meningitis.

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9- INTERPRÉTATION DES RESULTATS

RÉACTION POSITIVEUne réaction positive se traduit par la formation d'une agglutination fine, visibleà l’oeil nu en comparaison avec les témoins négatifs.L'intensité d'agglutination et le temps d'apparition sont fonction de laconcentration en antigène de l'échantillon testé.L’observation d’une discordance, entre une détection positive d’antigène etune culture négative peut s’expliquer par l’absence de bactéries viables dansl’échantillon mis en culture (antibiothérapie instaurée avant le prélèvement ouconditions de transport non adaptées à la survie des bactéries fragiles).Une réaction positive avec le latex anti N. meningitidis B/E.coli K1, chez unnouveau-né ou un prématuré indique, dans la majorité des cas, une infectionpar E.coli K1. Chez une personne plus âgée, le méningocoque B est plusprobable. La culture de l’échantillon doit permettre une confirmation dudiagnostic.

RÉACTION NÉGATIVESuspension homogène, absence d'agglutinats.

RÉSULTATS NON INTERPRÉTABLESUne réaction est non interprétable si l’échantillon agglutine avec les latextémoins négatifs (R2 ou R9) et/ou avec plusieurs réactifs latex spécifiques. Ilest conseillé dans ce cas de retraiter un échantillon et d'attendre les résultatsde la culture (dans quelques cas exceptionnels, une infection peut être due àdeux espèces bactériennes différentes).

10- MODE OPÉRATOIRE SEROGROUPAGE DES SOUCHESBACTÉRIENNES ISOLÉES SUR GÉLOSE (Colonies de culturepure et fraîche)Le latex Y/W135 ne peut être utilisé pour ce test. Pour la détermination deces groupes, il est recommandé d’utiliser les immunserums conventionnels(coffret Y, W135, 29E : code 58704, 3x1mL).Pour une orientation présomptive, préalablement à la réalisation du test :• Vérifier la morphologie ainsi que la coloration de Gram.• Pour les Gram négatif, réaliser une recherche d’oxydase (positive pour

N. meningitidis, négative pour E.coli K1). • Pour les cocci Gram positif, réaliser une recherche de catalase (ne pas

tester les souches catalase positive). Les souches de S. pneumoniae et de H. influenzae non capsulées ne peuventpas être identifiées par cette technique.

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a) Serogroupage : N. meningitidis (A, B, C uniquement), H. influenzae, E. coliet S. pneumoniae• Déposer dans un cercle de carte jetable une goutte de 30µL d’eau

physiologique stérile.• Prélever :

- Pour Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzea et Escherichia coli,l’équivalent d’une öse de 1µl soit 2 à 3 colonies maximum.

- Pour Streptococcus pneumoniae, l’équivalent d’une öse de 5µl soit 10 à12 colonies minimum.

• Emulsionner soigneusement les colonies prélevées de façon à obtenir unesuspension homogène.

• Bien homogénéiser le réactif latex choisi pour l’identification et déposer unegoutte de ce latex en périphérie de la goutte de suspension bactérienne.

• Mélanger le latex à la suspension au moyen d’un bâtonnet.• Donner à la carte un mouvement de rotation (~120 RPM)• Observer l’apparition éventuelle d’une agglutination franche dans un délai

de 2 minutes.• Confirmer l’identification d’espèce par des tests biochimiques

conventionnels.b) Serogroupage : Streptocoques B (colonies ß-hémolytiques)• Mettre en suspension 5 colonies dans 2 ml de bouillon Todd Hewitt. • Incuber au bain-marie à 37°C pendant 2 à 3 H.• Centrifuger l’échantillon 5 minutes à 3000 g.• Déposer une goutte (40 à 50 µl) de surnageant dans un cercle de la carte

jetable. • Bien homogénéiser le réactif latex et déposer une goutte de ce latex en

périphérie de la goutte de surnageant• Mélanger le latex à l’échantillon au moyen d’un bâtonnet.• Donner à la carte un mouvement de rotation (~120 RPM)• Observer l’apparition éventuelle d’une agglutination franche dans un délai

de 1 minute.• Confirmer l’identification d’espèce par les tests biochimiques

conventionnels.Pour une extraction directe à partir des colonies, utiliser la trousse Pastorex™STREP (code 61721)

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11- CONTRÔLE QUALITÉ DU TEST• Après agitation, les solutions de latex doivent être parfaitement homogènes.• Le témoin positif polyvalent (R10) permet de vérifier l’immunoréactivité de

chaque latex. - Pour effectuer ce contrôle, déposer une goutte (40 µl) de témoin positif

(R10) dans chaque cercle de la carte jetable. - Bien homogénéiser les réactifs latex.- Déposer une goutte de chaque réactif latex (maintenir le flacon en

position verticale) sur la carte jetable suivant la répartition indiquée : R9,R6, R7, R1, R2 dans les cercles blancs et R8, R3, R4, R5 dans les cerclesnoirs.

- Mélanger les latex au témoin positif au moyen d’un bâtonnet enchangeant de bâtonnet pour chaque latex.

- Donner à la carte un mouvement de rotation (~120 RPM) pendant10 minutes. Observer à l’oeil nu et sous un bon éclairage, dans ce délaide 10 minutes, l’apparition des agglutinations (comparer les réactionsdes latex tests avec celles des latex témoins négatifs).

La vitesse d’apparition et l’intensité d’agglutination dépendent de l’aviditéantigène / anticorps. De ce fait les réactions observées avec chaque latex sontvariables. Celle du latex NmB / Coli K1 apparaît plus fine comparativement auxautres.• Une solution d’eau physiologique ou le diluant R11 (code 61717) permettent

de vérifier l'absence d'auto-agglutination de chaque latex. Pour effectuer ce contrôle, l’eau physiologique ou le diluant R11 (code61717) doivent être utilisés selon le protocole du témoin positif polyvalent(Cf. procédure précédente)

• Les réactifs latex ne doivent pas être utilisés lorsqu’ils ne réagissent pasavec le témoin positif R10 ou lorsqu’ ils présentent une auto-agglutinationavec l’eau physiologique ou le diluant R11 (celle-ci peut être due à unmauvais stockage de la trousse ou à une contamination d’un réactif latex).

12- CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANTTous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sontplacés sous un système d'assurance qualité de la réception des matièrespremières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produitfini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il estconforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la productionet au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

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13- PERFORMANCES

SENSIBILITÉLa sensibilité de chaque réactif du kit a été déterminée par analyse:• d’antigènes purifiés dilués dans de l’eau physiologique• d’échantillons cliniques de liquides céphalo-rachidiens documentés par les

technique d’analyse conventionnelles (examen microscopique, culture).• de souches obtenues par culture sur gélose Mueller-Hinton, gélose

chocolat + SPV ou Columbia + 5% sang de mouton.

SPÉCIFICITÉLa spécificité de chaque réactif a été déterminée par analyse • de liquides céphalo-rachidiens stériles (a) ou contaminés par des germes

responsables de méningites et différents de ceux détectés par le latextesté (b)

• de souches appartenant aux genres Neisseria, Branhamella, Acinetobacter,Streptococcus, Klebsiella , Haemophilus, Escherichia coli non K1,Pseudomonas et testées vis à vis de latex hétérologues.

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Antigène ou bactérie présent dansl’échantillon

Antigènedilué (NaCl,

9 ‰)LCR Souches

concentrationlimite détectée

nombreanalysé

nombre depositifs en

latex

nombreanalysé

nombre depositifs en

latex

N. meningitidis A 2,5 ng/mL 12 12 22 22

N. meningitidis B

E. coli K1

62,5 ng/mLND

9

1

9

1

N. meningitidis C 2,5 ng/mL 3 3 16 16

N. meningitidis Y 5 ng/mL ND - -

N. meningitidis W 2,5 µg/mL ND - -

S. pneumoniae 95 ng/mL 24 22 15 15

Streptococcus B 20 ng/mL 1 1 15 15

H. influenzae type b 0,1 ng/mL 34 33 17 17

*1/1 souche de Neisseria flavescens, 2/4 souches de Klebsiella pneumoniae et2/5 souches d’Acinetobacter ont donné des réactions non spécifiques.

HÉMOCULTURESUne évaluation effectuée sur des hémocultures a donné les résultats suivants :• Sensibilité : 100% ( 4/4 dont 2 souches S. pneumoniae et 2 souches

Streptococcus B)• Spécificité : 100% (37/37) pour les réactifs R3, R4, R5, R6, R7 et R8. • Spécificité : 97,5% (39/40) pour le réactif R1. Parmi les 3 hémocultures à Klebsiella pneumoniae analysées, 1 a donné uneréaction non spécifique.

14- LIMITES D’UTILISATION• La technique immunologique au latex permet dans de nombreux cas un

diagnostic présomptif du germe en cause. Cependant, la concentration enantigène de l’échantillon peut être inférieure au seuil de détection de ceslatex et donner un résultat négatif. Il est utile, dans ce cas, de répéter leprélèvement ultérieurement.

• Cette technique ne saurait remplacer la culture qui seule permet laréalisation d'un antibiogramme.

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Latex test LCR stériles (a) LCR contaminés (b) Souches (c)

nombreanalysé

nombre denégatifs en

latex

nombreanalysé

nombre denégatifs en

latex

nombreanalysé

nombre denégatifs en

latex

N. meningitidis A 52 52 50 50 122 122

N. m. B / E. coli K1 12 12 ND 53 48*

N. meningitidis C 52 52 56 56 127 127

S. pneumoniae 60 60 39 39 33 33

Streptococcus B 49 49 58 58 17 17

H. influenzae type b 61 61 32 32 31 31

LCR «tout venant»

nombre analysénombre de négatifs

en latex

N. meningitidis Y/W 135 40 40 - -

• Etant donné la diversité des milieux d’hémoculture, les performances nepeuvent pas être garanties sur tous les milieux (Cf.7-C).

• Les données cliniques et bibliographiques sur la détection de l’antigèneavec les réactifs latex sont pour l’instant limitées pour les sérums et lesurines.

• Quelques exemples de germes non apparentés possédant des antigènessimilaires ont été décrits. On ne doit pas écarter la possibilité de réactionscroisées. (1, 4 et 5).

• Le diagnostic final, comme pour tout diagnostic biologique, ne peut êtreétabli sur le résultat d’un seul test mais par un ensemble de donnéescliniques et de résultats de tests biochimiques, cytologiques etimmunologiques.

• La détection d’antigènes solubles dans les bouillons d’hémoculture ainsique le sérogroupage de colonies isolées doivent être complétés par uneidentification d’espèce de la souche bactérienne.

15- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. BRADSHAW M.W., CHNEERSON R., PARKE J.C. Jr., ROBBINS J.B.

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