OVOGENESE

FOLLICULOGENESE

Catherine PoirotUnité de préservation de la fertilitéCHI Poissy-St Germain, site de St Germain en LayeUniversité Pierre et Marie Curie

Indissociables

OVOGENESE

Finalité de l’ovogenèse

Obtenir un gamète féminin de qualitéOVOCYTE IIovocyte mature

OVOCYTE MATURE

� Hautement spécialisée� Porteur de la moitié du patrimoine génétique

féminin� être capable de fusionner avec un SPZ,

décondenser son noyau, d’assurer le début du développement embryonnaire

� sa croissance et sa différenciation grâce aux cellules folliculaires (jonctions perméables)

� « Une cellule souche totipotente » : reprogrammation nucléaire

Ovocyte mature

� Cellule la plus rare de l’organisme

� 350 à 400

� Devenir particulier (fécondation)

� Grande quantité d’ARN

OVOGENESE

� Phénom ène discontinu

OVOGENESE

� 3 phases� Multiplication

� Début méiose

� Croissance� Maturation

� Poursuite méiose

� Ovogonies� Ovocytes I

� Ovocytes I

� Ovocytes I ->Ovocytes II

1- Multiplication

� Division des ovogonies par mitoses� Du 4ème au 7ème mois vie foetale� 2N chromosomes

� Ovogonies : synthèse d’ADN� Entrée en méiose : ovocyte I

Fin de la phase de multiplication

� Début de la méiose réductionnelle1er BLOCAGE EN FIN DE PROPHASE I

� Constitution des follicules primordiaux

Croissance ovocytaire

Phase de croissance

� Volume augmente : 3 à 4 fois sa taille initiale

Phase de croissance

� 35 à 40 µm de diamètre

� ≈ 120 µm � vésicule germinative double

� Synthèses +++

Phase de croissance

� Débute après la naissance

� Très longue

� Se termine au moment de la maturation finale du follicule (ex : follicule tertiaire Ø 10 mm : ovocyte : 80% de sa taille finale)

Croissance ovocytaire

� Transcription intense � Accumulation d’ARN (x 300)� Synthèses spécifiques : ZP1, ZP2 et ZP3,

protéines du cycle cellulaire (compétence méiotique)….

� Modifications cytoplasmiques� mitochondries� golgi (activité)� granules corticaux� zone pellucide (glycoprotéines)

Acquisition des compétences ovocytaires

� Compétence méiotique� Compétence au développement (fin : après la décharge ovulante)

Compétence méiotique

Compétence au développement

Fin de la phase de croissance

� Réorganisation de la chromatine� Périnucléolaire

� Arrêt de la transcription

� Relocalisation de certaines protéines

Maturation ovocytaireétape finale d’une longue évolution

� Maturation nucléaire (méiose « discontinue »)

� Maturation cytoplasmique

� Maturation membranaire

MEIOSE

Toulouse

MEIOSEDiscontinue

OVOCYTE EN PROPHASE I

Ovocyte en métaphase I

OVOCYTE EN METAPHASE 2

Inhibition folliculaire de la reprise de

la méiose

� Extraovocytaire� In vitro : meilleure inhibition lors de coculture :

cellules de la thèque et CG� OMI (oocyte meiotic inhibitor)� Pas connu de façon précise

� Intraovocytaire : � concentration élevée d’AMPc empêche la reprise

de la méiose

Phase finale : maturation ovocytaire

� In vivo : décharge ovulante de LH� Rupture des jonctions perméables� Blocage transmission du signal OMI� Synthèse de stérols activateurs de méiose (MAS) par les

cellules du cumulus� libération de calcium intracellulaire

� AMPc� diminution : reprise de la méiose� cascade phosphorylations/déphosphorylations

Maturation ovocytaire

(nucléaire)� Aspects morphologiques

� Plissement de l’enveloppe nucléaire� disparition des pores nucléaires� rupture de la membrane nucléaire

EN PARALLELE� condensation des chromosomes� organisation du fuseau de division

EXPULSION DU PREMIER GLOBULE POLAIRE

Aspects moléculaires

� Reprise de la m éiose : transition G2/M

� Activité MPF (M -Phase Promoting Factor)

� MPF Hétérodim ère� p34cdc2 sérine/thréonine kinase : CDK1� p 45 : cycline B

*Cyclin B + p34cdc2 + phosphorylation en 161 (Thr) = pré MPF*Déphosphorylation (Thr14 et Tyr15) = MPFactif

ACTIVATION DU MPF

Régulation des déphosphorylations : wee 1 et cdc 25

Modes d’action du MPF : cibles

� Diversité des cibles phosphorylées par le MPF

� MPF a des affinités pour� protéines comme les histones 1� certaines protéines associées aux

microfilaments� ARN polymérase� …...

Actions du MPF

� GVBD� condensation des chromosomes� remodelages du cytosquelette : fuseau

méiotique� induction des modifications de la synthèse

protéique observées lors de la reprise de la méiose

Pas d’interphase

� Activité résiduelle du MPF � maintien de l’état de condensation des

chromosomes

� Autres kinases (MAP kinases)� maintien de la phosphorylation des substrats du

MPF INHIBITION DE L ’INTERPHASE

Niveau d’activité du MPF

VG MI AITI

MII

Activité MPF

* *

Blocage en Métaphase II

� CSF : facteur cytostatique� pas purifié à ce jour� mais produit du proto-oncogène c-mos

participe à l’activité du CSF� kinase bloquant la dégradation des cyclines� maintien d’un taux élevé de MPF� souris mos -/- : activation parthénogénétique

spontanée

Expansion du cumulus

� Présence de cellules du cumulus est importante

� Expansion +++� Production par les cellules d’une matrice

viscoélastique (acide hyaluronique)

� Production d’acide hyaluronique sous dépendance FSH par les cellules du cumulus

� Facteurs ovocytaires (produit du gène GDF 9)

LH : rupture des jonctions perméablesCascades

Phosphorylations-déphosphorylations

MPF inactif MPF actif

Reprise de la méiose VG MI

Pas d’interphase : MPFMAPK

CSF MPF M2

+

+

+

+ +

OVOCYTE MATURE

FOLLICULOGENESE

Succession des différentes étapes du développement folliculaire de la sortie de la réserve jusqu’à l’ovulation ou involution

Introduction

� Production chaque mois : un ovocyte unique� Evolution en grande partie indépendante des

GT� Evolution la plus commune : ATRESIE� Rôles FSH et LH et rétrocontrôles� Système paracrine� Pathologies : mutations

Organisation de l’ovaire

� Cortex

� Médullaire

Follicule primordial> 95%

Réserve

Follicule primaire

Follicule secondaire

Follicule tertiaire

Follicule préantral

Follicule tertiaire

Evolution du nombre de follicules

en fonction du temps

� 7 millions de cellules souches in utero� Naissance : 1 million de follicules� Puberté : 300 000 follicules � Ménopause : 1 000 follicules

� 400 ovulations

� Apoptose (croissance folliculaire de base, recrutement, sélection)

A Gougeon

APOPTOSE

� Responsable de l’épuisement de la réserve ovarienne. � Souris : gène Bax -/- multiplication par 3 du

nombre de follicules ; Bax : facteur proapoptotique

� Souris : gène Bcl2 -/- diminution le nombre de follicules primordiaux ; Bcl2 : facteur antiapoptotique

FOLLICULOGENESE

PHENOMENE CONTINU Ovaire

activité propre et régulation locale où

l’axe hypothalamo - hypophysaire contrôle et module les étapes finales de la

croissance folliculaire et l ’ovulation

Différentes étapes de la

folliculogenèse

5 phases

� Quiescence[Initiation de la croissance folliculaire]

� Croissance folliculaire de base

� Recrutement� Sélection � Dominance

Initiation de la croissance

folliculaire� Primordial ���� Primaire� Nombre sortant de la réserve par jour est

proportionnel à la réserve (� avec l’âge)

� Femme ≈ 20 à 20 ans� Evolution lente des follicules primordiaux vers

le stade primaire� � de la taille de l’ovocyte puis augmentation

du nombre des GC

Initiation de la croissance

folliculaire� Indépendante des gonadotrophines� Facteurs impliqués

� KL : synthétisé par les GC, son récepteur C-kit (au niveau de l’ovocyte)

� Souris KL : plus de transformation des follicules primordiaux

� Administration Ac anti-C-kit : plus de sortie du pool

� KL dans milieu de culture : � sortie du pool

Autres facteurs

� LIF : en culture � production de follicules primaires� anticorps anti-LIF : � nombre de primaires

� AMH, produite par les cellules de la granulosa des follicules primaires et préantraux, inhibe l’initiation de la croissance des primordiaux

5 phases

� Quiescence[Initiation de la croissance folliculaire]

� Croissance folliculaire de base

� Recrutement� Sélection � Dominance

Croissance folliculaire basale

� Indépendante des gonadotrophines� Stade terminal de cette croissance dépend

de l’espèce� Souris : début d’antrum� Brebis : follicules à antrum jusqu’à un diamètre de

2 mm� Femme : stade follicule à antrum : diamètre de 2 à

5 mm

Croissance folliculaire basale

� Facteurs impliqués (paracrine)� GDF9 : Growth Differenciation Factor 9� BMP 15 : Bone Morphogenetique Protein 15� sont nécessaires à la croissance des follicules primaire s

et à la formation des follicules secondaires

� Tous les 2 :� origine ovocytaire� détectables chez la plupart des espèces à

partir du stade primaire

5 phases

� Quiescence[Initiation de la croissance folliculaire]

� Croissance folliculaire de base

� Recrutement� Sélection � Dominance

Développement folliculaire

terminal� Phase dépendante des gonadotrophines � Follicule de 2 mm de diamètre chez la femme

jusqu’à l’ovulation� 2 semaines� Activé dès la régression du corps jaune� 3 événements : * recrutement * sélection * dominance

Régulation

Entre puberté et ménopause

GnRH Hypothalamus(pulsatile)

LH FSH(pulsatile) (pulsatile)

OVAIRE : fonction cyclique

Développement folliculaire

terminal

CARACTERISTIQUES

� Multiplication très importante des cellules de la granulosa

� Phases du développement folliculaire

RECRUTEMENT

RECRUTEMENT

� Les follicules gonado-dépendants présents dans les ovaires entrent en croissance terminale

� COHORTE

� Coïncide avec l’apparition d’une activitéaromatase dans la granulosa

Sélection

SELECTION

� Coïncide avec l’apparition des récepteurs à la LH sur les cellules de la granulosa

� Forte production d’inhibine

DOMINANCE

Dominance

DOMINANCE

� Grande taille� Follicule dominant : seuil de réponse à

FSH le plus bas

� Pendant la dominance : * croissance et maturation du

follicule préovulatoire * régression par atrésie des

autres follicules de la cohorte * blocage du recrutement de

nouveaux follicules

SELECTION et DOMINANCE

Mi-phase folliculaire

R

D

S

Cohorte folliculaire est réduite au nombred’ovulation caractéristiques de l’espèce

Fin de phase folliculaire

Régulation des mécanismes de la

folliculogenèse terminale

2 niveaux

Endocrine FSH - LH et les rétrocontrôles (Stéroïdes et peptides)

Local : affine les messages endocrines (paracrine et autocrine)

OVULATION

� Expulsion de l’ovocyte hors du follicule� Phénomène rare� Réponse à une forte élévation des GT : LH� Cascades d’étapes biochimiques : inflammation� Follicule mature : quand concentration adéquate

de LHr� 35 à 36 heures après décharge ovulante

Remaniements morphologiques

� Thèque externe : oedémateuse� CG : arrêt des divisions cellulaires� Dissociation des cellules du cumulus

oophorus (sécrétion importante d’acide hyaluronique pilotée par l ’ovocyte) sous l’effet du pic de LH (GDF9 et BMP15)

� Corona radiata� Pénétration des VX dans la granulosa

� Cellules de l ’épithélium ovarien s’étirent et s’aplatissent

� Dissociation des cellules sous-jacentes, de la granulosa, des thèques et de l’albuginée.

� Le liquide folliculaire s’échappe� Rupture folliculaire� Contraction du follicule� REMANIEMENTS VASCULAIRES

� augmentation du flux sanguin� augmentation de la perméabilité vasculaire

� CORPS JAUNE

Facteurs intervenant au moment

de l’ovulation

� Stéroïdes : � E2 rétrocontrôle sur GT� Progestérone (récepteur P4)

� Facteurs intervenant sur le système vasculaire� NO (vasodilatateur puissant)� endothéline� Rénine-angiotensine….

� Facteurs intervenant sur la perméabilitédes vaisseaux et l’angiogenèse� VEGF� histamine, bradykinine, prostaglandines ……

� Activités enzymatiques� plasmine� collagénase� métalloprotéinase : ADAM TS-1 (coupe la

matrice extracellualire)

� cathepsine L….

� Facteurs intervenant dans les réactions inflammatoires� IL-1β� TNF α� Bradykinine� histamine…..

Ovulation et corps jaune

Applications cliniques

� Stimulation de l ’ovulation� Fécondation in vitro� ……

� Croissance folliculaire in vitro

� Maturation ovocytaire in vitro (MIV)

Croissance folliculaire in vitro

Croissance folliculaire in vitro

� Connaissance de la folliculogenèse

� Un des modes d ’utilisation du cortex ovarien congelé

� ……….

Croissance folliculaire in vitro

IMPERATIF

Du follicule primordial au

follicule préovulatoire

(25%)

(25%)

Résultats

Isolé CCO

Baker, 1974

Roy, 1993

Zhang, 1995 (fœtus)

Abir, 1997

Hovatta, 1997

Wu, 1998

Wright, 1999

Abir, 1999

Hovatta, 2000

Telfer, 2008

Explant

Primordial I aire II aire Antrum MIV (M2)

10 jours

Telfer E, 2008 : 2 étapes

� Culture in situ (6j) et isolement folliculaire (4j) + Activine : primordial jusqu’à antral

Xu M, 2009 (Hum Reprod)

� Résultats encourageants

Chez l’humain :

PAS encore d’ovocytes matures