ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril ou 12 avril 19 avril

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Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

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Page 1: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Ordre de passage pour les présentations

5 avril12 avril19 avril

Ou

12 avril19 avril

Page 2: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Techniques d’étude des interactions protéine-

protéine à grande échelle

Hervé PHILIPPE

BIN1002 – hiver 2013

Page 3: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?

• beaucoup de matériel à disposition

• focus sur l’étude des fonctions cellulaires

• capacité des protéines à former des complexes• ≈5 partenaires pour chaque protéine

• importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel

interactome

Page 4: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

De nombreuses techniques d’étude

Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14

in vivo

• maintien du contexte cellulaire

in vitro

• caractérisation détaillée des interactions(cinétique, stochiométrie …)

• validation des résultats in vivo

Page 5: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Co-immunoprécipitation

http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=9C471132-0F72-4F39-8DF0-455FB515718F

Page 6: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Double hybride

• utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure • domaine d’activation• domaine de liaison à l’ADN

• fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription

• expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent

Principe :

Page 7: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Double hybride

DA

DL

mARN

DA : domaine d’activation

DL : domaine de liaison à l’ADN

TF

Système rapporteur

Fusion protéines et modules du facteur de transcription

Expression du système

DA

DLprot 1

prot 2

DL

prot 3

pas d’expression

expression du gène

colonies de levures

mARN

Page 8: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Double hybride

• expérience facile à mettre en placeAvantages :

• analyse qualitative• faux positifs si les interactions préexistent chez la

levure• faux négatifs : problème d’expression des protéines

cibles chez la levure• non applicable aux protéines membranaires (30%

du protéome)

Inconvénients :

• identification des interactions• criblage de banque de protéines

Application :

Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246.

Page 9: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Interactome chez Caenorhabditis elegans

Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

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PCA : protein fragment complementation assay

a) rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente)

b) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester

c) mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent

Principe :

Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7

Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:10340-10344

Page 11: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

PCA : protein fragment complementation assay

Application :

• applicable pour les protéines membranaires• réponse très rapide• niveau d’expression naturel

Avantages :

• décalage temporel de la réponse au signal d’expression

• création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions

• nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique

Inconvénients :

• identification des interactions• étude des réseaux d’interaction

Page 12: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

FRET (fluorescence resonance energy transfer)

525

accepteur

donneur

excitation

475 nm 525 nm

• excitation d’un fluorophore donneur par un photon• émission fluorescence par le donneur• excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche• mesure du rapport de fluorescence

Principe :

R0

10-70 Å

475nm

émission

L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846

Page 13: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

FRET (fluorescence resonance energy transfer)

• étude dynamique en temps réel • applicable in vivo dans le système cellulaire originel• peut être couplé à un signal biologique• applicable dans tous les compartiments cellulaires

Avantages :

• création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions

• nécessite la surexpression des protéines testées

Inconvénients :

• signification biologique des interactions• localisation cellulaire par couplage avec des techniques

de microscopie

Application :

Page 14: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

TAP-Tag : Tandem Affinity Purification

1.

2.

3.

4.

5.Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229

Principe :tag

1. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules

2. fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants

3. clivage du tag par la protéase

4. fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase

5. élution du complexe et analyses subséquentes

peptide de fixation à la calmoduline

domaines de fixation de la ProtA aux IgG

site de clivage à la TEV protéase

Page 15: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Spectrométrie de masse

• nécessite la purification des complexes• méthode compliquée et relativement coûteuse

Inconvénients :

Application : • identification des protéines présentes dans un complexe

Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21

Page 16: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

TAP-Tag : Tandem Affinity Purification

• seules les interactions très stables peuvent être détectées

• nombreux faux positifs (protéines « colle »)

Inconvénients :

• seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe

• taux d’expression biologique des protéines• identification de complexes avec plus de 2 protéines

Avantages :

Application : • identification des complexes protéiques

Page 17: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Quelques définitions

Arbre = réseau connexe non cyclique

Réseau non connexe non

cyclique

Réseau connexe cyclique

Réseau connexe non cyclique

branche

noeud

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Jeong et al, Nature 2001

Page 19: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Qualité du réseau d’interactions

Nécessité de valider les résultats

Très nombreuses interactions protéine/protéine détectées par différentes

méthodes

Pourquoi ?

1. Les méthodes sont prévues pour détecter des interactions différentes (binaire pour le double hybride, interactions fortes pour la protéomique, etc.)

2. Les méthodes se trompent (faux positifs, faux négatifs)

Page 20: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Qualité du réseau d’interactions

Construction d’un ensemble d’interactions validées manuellement

10 907 interactions impliquant 1308 protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae (http://mips.gsf.de/proj/yeast/catalogues/complexes/index.html)

1. Coverage (couverture) : fraction des interactions de référence analysées par une méthode donnée

2. Accuracy (précision) : fraction des interactions de référence retrouvées par une méthode donnée

Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Page 21: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Qualité du réseau d’interactions

Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Page 22: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Qualité du réseau d’interactions

Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Page 23: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Qualité du réseau d’interactions

Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Page 24: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Qualité du réseau d’interactions

Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

Filtrage : interactions détectées trois fois pour le double-hybride, par exemple

Page 25: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Von Mering et al. (2005) Nucleic Acids Research, 33:D433–D437http://string.embl.de/

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Distance et Distance caractéristique d’un réseau

http://mathworld.wolfram.com/GraphDistance.html

la distance d(u,v) est la longueur du plus court chemin connectant deux noeuds, c-à-d le nombre minimal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v

la distance caractéristique L = meanu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur moyenne du plus court chemin connectant deux noeuds

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Diamètre d’un réseau

http://mathworld.wolfram.com/GraphDiameter.html

le diamètre D = maxu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur du plus long des plus courts chemins connectant deux noeuds, c’est-à-dire le nombre maximal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v lorsque les retours, détours et boucles sont interdits

3 4 5 7

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Réseaux « Small-World »

dans un réseau Small-World, la plupart des noeuds sont voisins les uns des autres, c-à-d qu’il faut traverser un petit nombre de noeuds pour se rendre d’un noeud u à un noeud vex : WWW ; liens sociaux entre les êtres humains formellement, on dit que son diamètre est petit (D ≤ 6)

ces réseaux ont des distances caractéristiques faibles

http://en.wikipedia.org/wiki/Small-world_network

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Connectivité d’un réseau

http://web.hamline.edu/~lcopes/SciMathMN/concepts/cevcon.html

la connectivité K d’un réseau est le nombre minimal de liens connectant deux noeuds u et v

formellement, c’est le nombre minimal de noeuds qu’il faut supprimer pour déconnecter le réseau

Page 30: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Connectivité d’un noeud

Jeong et al, Nature 2000

ExponentialExponential Scale-freeScale-free

la connectivité K d’un noeud (protéine i) est le nombre de liens émanant du noeud i

HUBHUB

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Une autre représentation du réseau

1

9

2

3

4

6

7

8

5

1 2 3 4 5 6 7 8 91 X X2 X X3 X4 X X X5 X X X6 X7 X X8 X X X X9 X X

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3 6 7 4 8 2 5 1 93 X6 X7 X X4 X X X8 X X X X2 X X5 X X X1 X X9 X X

Après un algorithme de clustering

1

9

2

3

4

6

7

8

5

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PP - polarity - polarityRR - Ras related pathway - Ras related pathwayHH - Highly osmotic conditions - Highly osmotic conditionsMM - Mating/filamentation - Mating/filamentation

Modular organization of cellular networksModular organization of cellular networks

Rives AW et al. PNAS, 2003

DD00 11

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Modular organization of cellular networksModular organization of cellular networks

Rives AW et al. PNAS, 2003

- - ModulesModules

-- Intermodular connections Intermodular connections

Page 35: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Recherche de modules

Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

Page 36: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Recherche de modules

Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

A(i,j) : indice de socio-affinité

ni;j|i=bait : nombre of fois où protéines i et j sont retrouvées quand I est étiquettée

: nombre of proies récupérées quand i est un appât

: nombre de fois où protéines i and j sont copurifiées avec d’autres appâts.

preybaitin =preyjin ,

Page 37: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Recherche de modules

Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

Page 38: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Recherche de modules

Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

Page 39: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Essentialité des gènes

Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231

Page 40: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Essentialité des gènes

Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231

Hubs : 1061 protéines qui ont le plus grand nombre d’interactions

Page 41: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Robustesse du réseau aux mutations

Jeong et al, Nature 2000

Page 42: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Robustesse du réseau aux mutations

Freeland et al. (2000) Mol. Biol. Evol. 17:511–518

Page 43: Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

Kelley & Iteker (2005) Nature Biotechnology  23:561-566

Perspectives : combiner les réseaux