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N° d'ordre 199

UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR

FACULTES DES SCIENCES ET TECHNIQUES

MEMOIRE DE DEA DE BIOLOGIE ANIMALE

Présenté par

Abdoulaye N'GOM

Paludisme humain et présence d'animaux domestiques à Niakhar

(Sénégal): Aspects épidémiologiques et mise au point d'un marqueur

immunologique aux piqûres d 'Anopheles gambiae

Soutenu le 26 juillet 2004 devant la commission d'examen

Président

Membres

Mr Mady

Mr Denis

Mr Karamoko

Mr Lassana

N'DIAYE

BOULANGER

DIARRA

KONATE

REMERCIEMENTS

Au Dr François SIMONDON qui a bien voulu nous accueillir dans son Unité de Recherche.

Nous sommes heureux de pouvoir vous exprimer toute notre reconnaissance.

Au Dr Denis BOULANGER pour la confiance renouvelée en ma personne afin de mener ce

travail. Vous avez toujours répondu présent à mes innombrables sollicitations. Votre rigueur

dans le travail, vos qualités scientifiques et humaines font de vous un exemple.

Au Dr Franck REMOUE qui comme un grand frère sérère m'accompagne dans ma quête du

savoir. L'amour et le respect que vous portez aux autres force l'admiration. Vos

encouragements et conseil ont contribué à la réalisation de ce travail. Ne perdez pas votre

humour « ouafouaf »

Au Dr Karamko DIARRA qui nous a fait l'honneur d'accepter avec spontanéité de présider

ce jury. Veuillez trouver ici le témoignage de notre très grand respect et de toute notre

sympathie.

Au Dr Lassana KONATE qui a été d'un grand apport scientifique. Malgré votre emploi très

chargé vous avez toujours répondu présent à nos multiples sollicitations. Nous tenons à vous

exprimer notre profonde gratitude.

Au Dr Mady N'DIAYE qui a accepté avec spontanéité de juger ce travail. Veuillez trouver

ici le témoignage de notre très grand respect et de toute notre sympathie.

Au Dr Badara CISSE pour sa précieuse collaboration avec le programme IPTc. Sans votre

étude la qualité scientifique de ce travail serait fortement amoindrie. Merci du fond du cœur.

A Tofène N'DIAYE pour son soutient moral, technique. Vos conseils nous serviront dans la

VIe.

A Cheikh Saya SOW pour son aide technique et ses conseils. « boy peulh »

A Jacqueline Milet vous avez été d'un grand apport dans l'accomplissement de ce travail.

« Dieureudieuf »

Aux membres de L'UR 024: Sylvie CORNELIE, Aminata N'DIAYB COLY, Amady

N'DIAYB, Gnagna N'DIAYB MBAYE, Babacar DIOP.

Aux POPULATIONS DE Kotiokh

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1

LISTE DES ABREVIATIONS

QBC : Quantitative Buffy Coat 8

ICT Pf/ Pv: Plasmodiumfalctparumll'lasmodium vivax Immunochromatographic test.. 8

CSP: CircumSporozoïte Protein 8

IP: Indice Plasmodique 9

EIR: Entomological Inoculation Rate 9

ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay " , 13

DEA: Diplôme d'Etudes Approfondies 13

IL: Interleukine 14

IPTc: Intermittent Preventive Treatment in children '" 26

Hl :Hameau 1 26

H2 :Hameau 2 26

LISTES DES TABLEAUX

Tableau 1 : Protéines salivaires majeures d'arthropode et leurs actions 17

Tableau II : Etapes du BCA Protein Assay , .31

Tableau III: Nombre d'enfants et de cas de paludisme dans la cohorte

IPTc/ZOOPROVECT dans les hameaux Hl et H2 .34

Tableau IV. Effectifs recensés par espèce lors de chaque enquête transversale .39

Tableau V. Incidence mensuelle du paludisme par concession entre AI et ~ .40

Tableau VI. Protocole standard ELISA. " " , .46

LISTES DES FIGURES

Fig 1. Cycle de développement de Plasmodiumfalciparum 3

Fig. 2 : Distribution du paludisme dans le monde 6

Fig 3 : Communauté rurale de Niakhar 23

Fig 4: Le village de Kotiokh avec ses hameaux 24

Fig 5: Système de mise sous moustiquaire des rats dans l'animalerie 28

Fig 6: Rat dans une cage au moment. 29

Fig 7: Anophèles se gorgeant sur ratde l'exposition 29

Fig 8: Anophèle en atelier de salivation , '" 31

Fig 9: Schéma de la méthode ELISA 32

Fig 10: Nombre d'animaux par concession recensés en juillet dans le hameau Hl 35

Fig 11 : Répartition des espèces animales en juillet par concession dans le hameau Hl 35

Fig 12: Nombre d'animaux par concession recensés en juillet dans le hameau H2 36

Fig 13 : Répartition des espèces animales en juillet par concession dans le hameau ID 36

Fig 14. Répartition des espèces animales dans les deux hameaux en septembre 37

Fig 15 : Répartition des espèces animales dans les deux hameaux en Décembre '" 38

Fig 16. Incidence mensuelle des cas palustres entre juillet et septembre 2003 selon

l'effectifanimal total de chaque concession 40

Fig 17. Incidence mensuelle des cas palustres entre Septembre et Décembre 2003

selon l'effectif animal total de chaque concession .41

Fig 18. Répartition du paludisme dans les concessions en fonction de l'effectif canin 42

Fig 19 : Incidence mensuelle des cas palustres entre septembre et décembre 2003

selon l'effectif des jeunes animaux dans chaque concession .43

Fig 20. Concentration en protéines salivaire des différents lots de moustiques 44

Fig 21. Antigénicité des lots de salive .45

Fig 22. Ajustement des DO des sérums '" .47

Fig 23. Cinétique des IgG après exposition à 1piqûre d'anophèle 48

Fig 24. Cinétique des IgG après exposition à 5 piqûres d'anophèles 49

Fig 25. Cinétique des IgG après exposition à 25 piqûres d'anophèles .49

Fig 26. Cinétique des IgG après exposition à 125 piqûres d'anophèles 50

SOMMAIRE

INTRODUCTION 1

GENERALITES " 2

1. Paludisme 3

1.1. Cycle asexué chez l'homme 04

1.1.1. Phase hépatique ou exo-érythrocytaire A

1.1.2. Phase érythrocytaire 4

1.2. Cycle sexué chez le moustique femelle .4

1.3. Importance médicale du paludisme 5

lA. Épidémiologie et moyens de diagnostic 5

104.1. Répartition géographique 5

104.2. Transmission anophéliènne et non anophéliènne '" 6

1.5. Traitement 9

1.6. Prophylaxie 9

2. Entomologie , 1a2.1 Anthropozoophagie des moustiques , , '" 10

2.2. Techniques actuelles de mesure de l'affinité trophique

des anophèles 11

3. Rôle des animaux domestiques dans la transmission du paludisme 12

Zoonuisance 12

Zooprophylaxie 13

Neutralité '" 14

4. Relations cible-vecteur " '" .14

4.1. Rôle des protéines salivaires d'arthropodes 14

4.2. Réactions immunitaires de l'hôte à la piqûre d'arthropodes , 18

4.3. Candidats vaccins 19

METHODOLOGIE 21

MATERIELS ET METHODES 22

A.VOLET TERRAIN 23

A.1. Cadre de l'étude '" 23

A.2. Cohorte d'enfants IPTc '" 25

Les facteurs d'inclusion dans la cohorte IPTc 25

Les facteurs d'exclusion de la cohorte IPTc 25

A.3. Cohorte animale (ZOOPROVECT) 26

A.3.1. Mise en place de l'enquête .26

A.3.2. Constitution de la cohorte 26

Critères d'inclusion des concessions 26

Critères d'exclusion des concessions 26

AA. Calcul et analyse statistique 27

B.VOLET EXPERIMENTAL 27

B.l. Animaux et conditions d'élevage 27

B.2. Technique d'exposition .28

Constitution des lots 28

Préparation des moustiques " 28

Préparation des rats 29

B.3. Prélèvements sanguins 30

BA. Production de salive d'anophèle 30

BA.l. Technique de salivation 30

BA.2. Dosage des protéines salivaires ( BCA Protein Assay) 31

B.5. Technique sérologique (ELISA) 31

B.5.l.Principe 31

~S;1l~1r)\1fS;•••••.••••.•.•••.•••.•••••••••••••••••••.••••• •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••33

A. SUNI DE COHORTE 34

A.1.Cohorte IPTc '" '" 34

A.2. Cohorte ZOOPROVECT 34

A.2.1. Première enquête transversale: 31 Juillet - 15 Août 2003 34

Dans le hameau Centre (Hl) 34

Dans le hameau Bak Mbane(H2) 36

A.2.2. Deuxième enquête transversale: 2 - 6 Septembre 2003 .37

A.2.3. Troisième enquête transversale: 19 -23 Décembre 2003 .38

A.3. Synthèse de la cohorte ZOOPROVECT 38

A.3.1 Variation de l'incidence du paludisme chez les enfants

de la cohorte IPTc entre juillet-septembre et septembre-décembre 39

A.3.2. Effectif animal corrélé à l'incidence du paludisme AD

A.3.3. Corrélation entre l'espèce animale et l'incidence mensuelle des cas de

paludisme ,.. , " 41

A.3.4. Corrélation entre l'âge des animaux et l'incidence mensuelle du

paludisme , '" , , 42

B. VOLET EXPERIMENTAL 43

B.l. Production d'antigène 44

B.2. Mise au point de la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) 44

B.2.1. Détermination de l'antigénicité des salives '" .45

B.2.2. Recherche de sérums positifs .45

B.2.3. Standardisation du protocole ELISA .46

B.3.Résultats ELISA sur les sérums de rats .46

B.3.1. Ajustement des données 46

B.3.2. Rats exposés à 1 moustique .47

B.3.3. Rats exposés à 5 moustiques .48



B.4. Synthèse des résultats expérimentaux 50

DISCUSSION 52

PARTIE TERRAIN 53

Utilisation de l'ivermectine 53

Effectifs fluctuants de la cohorte animale , .54

Résultats de la cohorte ZOOPROVECT 54

PARTIE EXPERIMENTALE 56

Provenance des rats , " '" " " 56

Choix du modèle rat 56

Réponse IgG '" , 57

Impact du nombre de piqûres 57

Existence d'autres isotypes 57

CONCLUSION '" 59

RECOMMANDATIONS - PERSPECTIVES 60

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INTRODUCTION

Dans les sociétés rurales africaines, les animaux occupent une place très importante. Ils

constituent une forme de thésaurisation et contribuent à asseoir une notoriété sociale. Les

hommes et les animaux vivent très souvent dans les mêmes aires d'habitation. Cette proximité

est favorable à la circulation des zoonoses (maladies naturellement transmissibles de l'homme

à l'animal et vis versa) entre populations animales et humaines. En complément de ces

zoonoses, certains vecteurs arthropodes hématophages se nourrissent sur les hommes et les

animaux, comme les moustiques du genre Anopheles dont certaines espèces sont responsables

de la transmission de Plasmodium. L'implication de l'homme dans le cycle de vie des

anophèles serait intervenue avec le développement de l'agriculture et de l'irrigation il y a

10 000 ans favorisant l'occupation des forêts par l'homme et la sédentarisation des

populations humaines (Costantini et al., 1999). Au fil du temps, le paludisme est devenu un

problème majeur de santé publique malgré tous les moyens de lutte et de contrôle mis en

oeuvre notamment dans les pays en voie de développement. De nombreuses stratégies de

lutte ont été et sont développées dont certaines sont actuellement utilisées dans les zones

endémiques. Elles peuvent être classées en deux grands groupes complémentaires : la lutte

contre le parasite par la chimiothérapie ou la vaccination et la lutte contre le vecteur

Anopheles par l'utilisation d'insecticides et de moustiquaires. Mais chacune d'entre elle

présente certaines limites d'efficacité, ceci nécessitant une amélioration des stratégies

actuelles et l'élaboration de nouveaux moyens de contrôle. Parmi ces stratégies

complémentaires, l'utilisation des animaux domestiques présents dans les aires d'habitations

comme leurres (zooprophylaxie) a été envisagée.

Notre étude vise à déterminer le rôle des animaux domestiques dans la transmission du

paludisme chez l'homme. En complément de ce travail de terrain et en perspective à de

nouvelles études, notre second objectif est la validation au laboratoire d'un outil

immunologique de quantification de l'exposition du rat aux piqûres de moustiques. Ce volet

expérimental permettrait également d'obtenir un modèle animal d'exposition aux piqûres

d'Anopheles ce qui présente une grande utilité dans le cadre de stratégies de luttes anti

vectorielle et anti-parasitaire.

1

1. Paludisme

Le paludisme est une affection due à la présence dans le sang d'un parasite unicellulaire

(un protozoaire) du genre Plasmodium. Sur plus d'une centaine d'espèces de Plasmodium

parasitant des mammifères, des oiseaux ou même des batraciens, seules quatre espèces

sont spécifiques de l'homme et peuvent déclencher la maladie sous différentes formes . Ce

sont: Plasmodium falciparum, P. malariae , P. vivax et P. ovale. Au Sénégal, P.

falciparum est le principal agent étiologique de l'infection palustre. Les souches de

Plasmodium qui circulent en Afrique , en Asie et en Amérique dériveraient d'une souche

africaine unique, âgée de 6000 ans environ (Coluzzi, 1999). Plasmodium falciparum est

un parasite dixéne. Son cycle de développement comprend une phase asexuée chez

l'homme et une phase sexuée chez l'anophèle (Fig 1).

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Fig 1

Cycle de développement de Plasmodium falciparum

3

1.1. Cycle asexué chez l'homme

1.1.1. Phase hépatique ou exo-érythrocytaire

Lors de son repas sanguin, l'anophèle femelle injecte dans la circulation sanguine des formes

parasitaires infectantes, les sporozoïtes. De par leur tropisme pour le foie, une heure après la

piqûre, ces sporozoïtes disparaissent très rapidement de la circulation sanguine pour pénétrer

dans les hépatocytes. Leur développement et leur multiplication donnent naissance à des

schizontes. A maturité, ces schizontes éclatent, libérant des mérozoites, formes uninucléées

qui initieront la phase érythrocytaire en envahissant le globule rouge.

Cette phase hépatocytaire est cliniquement silencieuse et correspond à une période

d'incubation qui dure quelques jours.

1.1.2. Phase érythrocytaire

Après éclatement des hépatocytes infectées, la totalité des mérozoïtes de P. falciparum gagne

le flot sanguin et pénètre dans les hématies où ils se développent pour donner naissance à une

forme en anneau appelée trophozoïte. Ce trophozoïte va croître en dégradant l'hémoglobine

de l'érythrocyte et évoluer en schizonte dans lequel s'accumule I'hémozoïne (pigment

malarique, produit de dégradation de l'hémoglobine). De nombreuses divisions nucléaires se

produisent dans le schizonte aboutissant à l'individualisation de nouveaux mérozoïtes qui sont

libérés lorsque le schizonte mature (corps rosacé) éclate. Chaque mérozoïte peut alors infester

une nouvelle hématie et ainsi recommencer le cycle intra-érythrocytaire. La lyse des hématies

parasitées par les schizontes mûrs est responsable des accès fébriles.

Après plusieurs cycles intra-érythrocytaires, certains mérozoïtes pénètrent dans le globule

rouge et se différencient en gamétocytes mâles ou femelles. Ces gamétocytes permettent la

poursuite du cycle du parasite (Ghosh et al., 2000, Winstanley 2000).

1.2. Cycle sexué chez le moustique femelle

L'anophèle ingère les gamétocytes en piquant un hôte intermédiaire infesté par P. falciparum.

Les micro-gamétocytes subissent une ex-flagellation dans l'estomac du moustique donnant

naissance aux gamètes mâles alors que les macro-gamétocytes évoluent en gamètes femelles.

La fécondation aboutit à un œuf mobile appelé ookinète qui traverse la paroi stomacale et

4

migre vers la face externe de l'épithélium intestinal où il s'enkyste pour former l'oocyste

mature. Ces sporozoïtes s'individualisent par division nucléaire et sont libérés suite à une lyse

de l'oocyste mature. Ils vont s'accumuler dans les glandes salivaires de l'anophèle pour être

inoculés lors du prochain repas sanguin.

1.3. Importance médicale du paludisme

Le paludisme est l'infection parasitaire la plus importante dans les pays du sud. Il menace

40% de la population mondiale et 300 à 500 millions de cas cliniques sont observés chaque

année (Mac Lean et al. 1997), la mortalité annuelle étant évaluée à 2 millions de personnes.

Chaque année, au moins 23 millions de grossesses sont menacées par le paludisme et plus de

200000 nouveaux-nés souffrent des conséquences de cette maladie (McDermott et al., 1996).

Le paludisme est considéré comme une maladie de la pauvreté, et, est une cause de pauvreté.

Au Sénégal, où il sévit de manière endémique, le paludisme représente 35% des motifs de

consultation et constitue la première cause de morbidité et de mortalité (rapport 2003

«Atelier national de consensus sur la politique de traitement antipaludique au Sénégal» du

Programme National de Lutte Contre le Paludisme).

1.4. Épidémiologie et moyens de diagnostic

1.4.1. Répartition géographique

Le paludisme sévit de façon endémique sur plusieurs continents (Fig 2). De temps à autre, le

nombre de cas de paludisme dans ces régions peut atteindre des niveaux épidémiques du fait

des résistances, de programmes de lutte contre le paludisme défaillants... (source :

usinfo.state.gov/regional/af/usafr/frenchlf2100404.htm). Dans la majeure partie du territoire

sénégalais, la transmission du paludisme s'effectue au cours de la saison des pluies et au

début de la saison sèche, seules périodes où la densité des populations vectorielles est

importante (Robert et al., 1998).

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Malaria, 2003

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Fig. 2Distribution du paludisme dans le monde

(source: http://www.who.int/ith/chapter05_m08_malaria.html)

1.4.2. Transmission anophéliènne et non anophéliènne

Classiquement, la transmission du parasite se fait lors du repas sanguin de l'anophèle chez

l'homme. Notons cependant qu'elle peut également se produire dans d'autres circonstances:

• de la mère vers l'enfant via le placenta (Djibo et al. 2000, Zenz et al. 2000) ;

• lors d'une transfusion sanguine utilisant du sang provenant d'un donneur infecté

(Kinde et al., 2000; Frey- Wettstein et al., 2001; Lee et al., 2001) ;

• par l'utilisation de seringues contaminées (Brown et al., 1975; Gonzalez Garcia et

al., 1986).

A l'heure actuelle, plusieurs méthodes d'évaluation des niveaux de transmission ont cours:

Diagnostique clinique

» Morbidité clinique

Elle est basée sur l'enregistrement des cas de paludisme à partir des signes cliniques:

Crise simple: fièvre, céphalées, vomissements, diarrhée. Triade frissons - chaleur - sueur

(jamais pour la primo invasion).

6

Accès pernicieux: complication majeure du paludisme due uniquement à P. falciparum.

Association des symptômes de la crise simple avec des troubles neurologiques, convulsions,

coma. On observe fréquemment un ictère avec anémie sévère.

Ces signes sont évocateurs en zone infectée ou après un séjour du patient dans une telle zone.

Diagnostique de laboratoire

~ Goutte épaisse

C'est une technique de concentration des hématies en vue d'identifier les stades sanguins de

Plasmodium (trophozoïtes, mérozoïtes et gamétocytes) et de calculer la parasitémie. Il s'agit

de prélever une grosse goutte de sang capillaire et de l'étaler sur une lame.

~ Frottis sanguin

Il se fait par étalement sur une lame d'une goutte de sang prélevée au doigt. Le frottis sanguin

permet de déterminerl'espèce plasmodiale.

» Sérologie

Différentes techniques sérologiques sont actuellement commercialisées sous forme de Kit et

détectent la présence de différents antigènes plasmodiales: QBC (Secardin and Le Bras,

1999), lCT malaria P.f/P.v test (Murahwa et al., 1999). Une autre méthode très utilisée se

base sur la recherche d'anticorps contre la Protéine CircumSporozoïte (CSP). La détection de

ces anticorps témoigne du passage du parasite dans l'organisme.

~ Estimation des charges parasitaires

A l'heure actuelle la technique de la goutte épaisse est la méthode de référence pour la

détermination des charges parasitaires qui sont calculées par rapport à la leucocytémie

moyenne/pl de sang. Elles peuvent également exprimées en nombre moyen de globules

rouges parasités sur le frottis sanguin.

Estimation de l'endémicirté d'une zone

~ Indice plasmodique (IP)

L'indice plasmodique représente la proportion (exprimée en pourcentage) de porteurs

d'hématozoaires d'une population donnée à un moment donné. Calculé chez les moins de 10

ans, il permet la classification du paludisme en 4 niveaux d'endémicité :

• hypo-endémique: IP < lO%

• méso-endémique: Il% < IP < 50%

7

• méso-endémique : Il% < IP < 50%

• hyper-endémique: IP> 50%

• holo-endémique : IP> 75% (une telle valeur peut être atteinte chez les nourrissons).

~ Indice splénique

L'indice splénique correspond au taux d'hypertrophie de la rate observé chez les enfants de

deux à neuf ans, dans une région donnée. Il permet également de déterminer les niveaux

d'endémicité du paludisme. Cependant la splénomégalie peut être induite pars des micro

organismes autres que les Plasmodium.

~ Indice gamétocytaire

Il représente la proportion (exprimée en pourcentage) de porteurs de gamétocytes d'une

population donnée à un moment donné.

~ Indice d'évaluation entomologique

Le taux d'inoculation entomologique ou EIR (Entomological Inoculation Rate), représente le

nombre de piqûres infectantes par homme et par unité de temps. Il peut être exprimée par nuit,

semaine, par mois ou par année selon les études entomologiques réalisées. il n'existe pas de

classification des zones endémiques à partir de l'EIR. Cependant, une relation étroite entre

l'intensité de transmission anophélienne et le taux d'endémicité a été constatée (Killeen et al.,

2000):

• hypo-endémicité: EIR < 10 piqûres infectantes/hommes/an

• méso-endémicité: 10 :s EIR < 50 piqûres infectantes/hommes/an

• hyper-endémicité: 50 :s EIR < 100 piqûres infectantes/hommes/an

• holo-endémicité: EIR 2: 100 piqûres infectantes/hommes/an

1.5. Traitement

Depuis la quinine, de nombreuses molécules ont été mises sur le marché pour lutter contre le

paludisme. Cependant, leur utilisation intensive ou leur mauvaise prescription favorise

l'apparition de souches de P. falciparum résistantes à la plupart d'entre elles. C'est le cas, en

particulier, pour

./ la sulfadoxine/pyriméthamine (Fansidar®) (Deloron et al., 2000; Wongsrichanalai et

al., 2002) ;

8

./ la méfloquine dérivée du quinoline-méthanol et structurellement proche de la

quinine (Cosgriff et al., 1985);

./ la chloroquine qui a longtemps été la molécule la plus utilisée dans les zones

endémiques (Mshinda et al., 1996; Trape et al., 1998; White 1992).

En plus de cette résistance, certaines molécules entraînent des effets secondaires indésirables.

Tel est le cas pour ;

./ la quinine (Bateman et al., 1986) ;

./ l'association sulfadoxine/pyriméthamine ;

./ la méfloquine seule (Taylor et al., 2004).

La résistance à la chloroquine, molécule la plus prescrite pendant longtemps en Afrique, a

entraîné une augmentation dramatique des taux de morbidité et de mortalité infantiles (Trape

et al., 1998; Priee et al., 2001).

De nos jours, les associations avec les dérivées de l'artémisinine, plus efficaces, sont les

médicaments recommandés par l'OMS dans le traitement du paludisme simple mais ils restent

pour l'instant hors de portée pécuniaire des populations les plus exposées.

1.6. Prophylaxie

De nombreuses stratégies de lutte ont été élaborées pour lutter contre le parasite. Ainsi la

chimiothérapie et, la vaccination sont développées contre le parasite. Cette lutte est aussi

dirigée contre le vecteur, par l'utilisation de moustiquaires, d'insecticides et de répulsifs.

Récemment, les bases d'une stratégie anti-transmission a été envisagée par l'utilisation de

moustiques transgéniques bloquant le cycle parasitaire intra vecteur (Ito et al., 2002). Par

ailleurs le développement de vaccins anti-vecteurs reste d'actualité. L'induction, chez

l'homme, d'une réponse anticorps spécifique aux antigènes de moustiques pourrait permettre

soit de diminuer la susceptibilité du vecteur à l'infection plasmodale, soit d'inhiber la

fécondité ou d'induire la mort du moustique après un repas sanguin chez cet hôte immunisé

(Noden et al., 1995; Brennan et al., 2000). Cependant, de nombreux facteurs entravent la mise

en place d'une prophylaxie efficace contre le paludisme:

~ absence de vaccin efficace (Moore et al., 2002) ;

~ accroissement du nombre de souches de P. falciparum résistantes aux différentes

thérapeutiques;

9

~ faible taux d'utilisation des moustiquaires;

~ augmentation des moustiques résistants aux insecticides (Brooke et al., 2002; Diabate et

al., 2002; Hougard et al., 2002)

~ problème d'innocuité des insecticides sur l'environnement (Satoh et al., 2000).

Il se pose notamment dans la plupart des pays un problème d'accessibilité géographique et

financière, de disponibilité et d'acceptabilité des traitements antipaludiques et des

moustiquaires ainsi que d'utilisation rationnelle des différents moyens prophylactiques. Selon

l'OMS, le prix des moustiquaires imprégnées peut représenter jusqu'à 8% du produit national

brut (PNB) par habitant dans certains pays.

Tous ces facteurs font que le paludisme, malgré l'arsenal des moyens déployés, demeure

toujours un problème majeur de santé publique.

2. Entomologie

2.1 Anthropozoophagie des moustiques

L'affinité trophique des anophèles a fait l'objet de nombreux travaux. Ainsi, des anophèles

vecteurs du paludisme faisant preuve de zoophagie ont été identifiés:

.:. An. gambiae sensu lato (s.l.) présente une zoophagie de 22% sur 4581 repas sanguins

analysés dans plusieurs localités du Sénégal. Les résultats indiquent que 977 repas ont

été effectués sur hôtes uniques et 339 sur hôtes mixtes, homme/animal ou

animal/animal. Pour les repas provenant de deux espèces animales distinctes, les

associations équin/ovin, bovin/ovin, équinlbovin étaient les plus fréquentes (Konate et

al., 1999).

•:. En 1992, 15% des An. lunestus capturés dans les chambres à Dielmo, Sénégal, avaient

pris leurs repas sur un bovin (Diagne et al., 1994). En plus des bovins, An. funestus

peut aussi prendre son repas sanguin chez le mouton et le cheval (Githeko et al.,

1994). Dans le sud-est du Sénégal, à Wassou au Boundou, les femelles d'An. funestus

étaient nettement plus zoophiles (69,9 % des repas analysés étaient d'origine animale)

que celles récoltées à Dielmo dans le Saloum (Faye et al., 1995a).

•:. A Madagascar, An. arabiensis Giles s.s (sensu stricot) et An. gambiae s.l. font preuve

d'une très grande zoophagie notamment envers le veau. Dans le reste du continent

africain, c'est l'anthropophilie qui domine chez ces espèces ( Githeko et al., 1994;

Duchemin et al., 2001). Dans le village de Ndiop (Sénégal), des études menées de

10

1993 à 1996 ont montré une zoophagie de 27,0% et 28,3% chez respectivement An.

gambiae s.s. et An. arabiensis (Fontenille et al., 1997).

•:. An. nili considéré comme vecteur secondaire du paludisme dans de nombreuses

régions d'Afrique tropicale (Fontenille, communication personnelle).

•:. An. melas qui fait partie du complexe gambiae avec une proportion exophile (préfère

prendre leur repas sanguin en dehors des cases) et zoophile (Bryan et al.,1987) .

•:. Au Sénégal, An. pharoensis est prédominant dans les zones d'aménagements

hydroagricoles du delta du fleuve Sénégal. Sur 544 repas sanguins analysés, 10,5%

des femelles zoophages s'étaient nourries sur ovins ou caprins, contre 3% pour les

bovins. Avec seulement 2 repas, les équins ne constituent pas un hôte de choix pour

cette espèce (Konate et al., 1999). An. sergenti, An. multieolor (Kenawy et al., 1990)

et An. farauti (Foley et al., 2000) peuvent également piquer les animaux.

•:. An. vestitipennis certains auteurs soutiennent la thèse d'un déterminisme génétique

pour expliquer la zoophilie ou l'anthropophilie de cette espèce (Arredondo-Jimenez et

0/.,1996).

La zoophagie d'Anopheles gambiae et de d'Anophelesfunestus semble varier au Sénégal. En

effet les résultats montrent qu'elle dépend fortement de la zone d'étude (bassin arrachidier,

vallée du fleuve, zone d'agriculture, zone d'élevage). li serait donc intéressant d'avoir un

outil d'évaluation de l'exposition des animaux aux piqûres de ces vecteurs du paludisme.

2.2. Techniques actuelles de mesure de l'affinité trophique des anophèles

La détermination du degré d'anthropophagie et/ou de zoophagie se basait autrefois sur

l'observation directe, sur l'utilisation d'hôtes potentiels comme appâts ou sur l'examen

cytologique du repas sanguin. L'étude de l'indice d'anthropophilie des arthropodes

hématophages s'est développée avec le test des précipitines qui permet de déterminer

l'origine des repas sanguins (Schubert et al., 1956; Tempelis et al., 1963). De nos jours, la

technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) est la plus usitée du fait de sa

grande sensibilité (Beier et al., 1998). Cette technique se base sur la recherche

d'immunoglobulines spécifiques à chaque espèce animale, dans le sang ingéré par le

moustique.

11

3. Rôle des animaux domestiques dans la transmission du paludisme

La prise du repas sanguin de l'anophèle femelle est indispensable à la maturation de ses œufs.

Ce repas sanguin pouvant se dérouler chez l'homme et/ou chez d'autres animaux. Ainsi,

beaucoup d'anophèles font preuve d'une zoophagie plus ou moins prononcée. Plusieurs

auteurs se sont penchés sur cette question avec des conclusions différentes:

Zoonuisance:

Certains auteurs ont rapporté que la présence des animaux augmente le taux d'infection

palustre chez l'homme. En effet, une étude menée au Pakistan sur deux groupes d'enfants,

l'un possédant des animaux dans les concessions et l'autre pas, a montré que le nombre de cas

de paludisme était plus élevé dans les villages avec des animaux dans les concessions(Bouma

et Rowland, 1995). La présence des animaux dans les concessions favoriserait donc la

transmission anophélienne du paludisme chez l'homme. La présence d'animaux domestiques

dans les concessions augmenterait le nombre d'anophèles zoophages au Pakistan où la

proximité d'un bœuf augmente de 38% le risque pour l'homme de recevoir une piqûre

d'anophèle. Ce demier est de 50% en présence de deux caprins (Hewitt et al., 1994). En

raison de l'augmentation du risque d'exposition pour l'homme, les auteurs préconisent ainsi

d'éloigner les animaux des hommes. En Ethiopie, il a été démontré que le nombre de piqûres

d'An. arabiensis chez les enfants de moins de 10 ans tend à augmenter avec la présence

d'animaux dans les concessions (Seyoum et al., 2002). Ces résultats sont en faveur du rôle

nuisant des animaux domestiques face au paludisme

Zooprophylaxie :

Certains auteurs par contre rapportent que les animaux joueraient un rôle d'écran en se faisant

piquer à la place de la population humaine. En Ethiopie, il a été noté que la proportion de

repas sanguins d'origine humaine est très faible dans les zones où les hommes et les animaux

cohabitent comparativement à celles où les animaux sont éloignés des personnes (Ijumba et

al., 1990; Githeko et al., 1994). Cette baisse est encore plus marquée dans les zones où les

hommes vivent dans des plates-formes élevées (Hadis et al., 1997; Sota et al.,1989;

Habtewold et al., 2001).

D'autre part, les études effectuées par McCall et al. (2001) et Ulloa et al. (2002) sur la fidélité

d'An. vestitipennis vis-à-vis de son hôte d'engorgement primaire ont montré que 80% des

12

femelles primairement gorgées sur un animal, retournent vers cette même espèce animale

pour le repas suivant. En revanche, seulement 63% des femelles ayant pris leur premier repas

sur un homme se gorgent à nouveau sur l'homme (Ulloa et al., 2002). Cependant, d'autres

travaux portant sur le même sujet ont révélé la présence de repas de bœuf chez des anophèles

primairement gorgés sur homme (McCall et al., 2001).

L'apport bénéfique des animaux domestiques peut aussi être indirect, comme, par exemple,

l'effet d'insecticides et d'antiparasitaires sur l'évolution de la population anophélienne

zoophage. Une étude a notamment montré que la déltaméthrine utilisée sur les animaux

domestiques induit une diminution de 56% des cas de paludisme humain dus à P. falciparum

et de 31% de ceux dus à P. vivax dans les concessions où le bétail et les volailles ont été

traités (Rowland et al., 2001). D'autres études sur la famille des pyréthrénoïdes aboutissent à

la même conclusion (Hewitt et al., 1999). La diminution du nombre de piqûres chez l'homme

a également été obtenue suite à l'injection d'ivermectine (antiparasitaire sanguin) chez les

animaux domestiques (Foley et al., 2000). Cette diminution de la population anophélienne est

plus marquée chez les anophèles zoophages que chez les anophèles anthropophiles.

Neutralité:

En Gambie, Bogh et al. (2001) ont montré que la présence d'animaux n'avait un impact ni

prophylactique ni nuisible sur l'exposition des hommes aux piqûres d'anophèles. En effet, il

n'a pas été noté de différence significative à la fois dans le nombre de moustiques capturés et

la proportion de repas pris sur homme quand les enfants dorment à moins de 20m ou à plus de

50 m des animaux (Bogh et al., 2001).

Il apparaît donc que l'impact de la présence des animaux domestiques dans la transmission

palustre n'est pas encore tranché et semble fortement dépendre des zones d'études. Il est donc

nécessaire de préciser cet impact par des études complémentaires, ce que nous proposons

d'évaluer dans ces travaux de Diplôme d'Etudes Approfondies (DEA).

13

4. Relations cible-vecteur

4.1. Rôle des protéines salivaires d'arthropodes

L'organisme de l'hôte réagit aux piqûres des arthropodes par des mécanismes visant tous à

perturber leurs repas sanguin et à se débarrasser d'eux; c'est donc une réaction défensive.

L'hôte développe ainsi une réponse inflammatoire souvent accompagnée de prurit, une

vasoconstriction, une agrégation plaquettaire, un afflux de neutrophiles et de macrophages

(Ribeiro, 1995; Alexander, 1996; Champagne et al., 1996; Stark et al., 1996). Certaines

piqûres peuvent engendrer des phénomènes allergiques (Alexander, 1996) avec, dans de rares

cas, évolution vers un choc anaphylactique (Ribeiro et al., 1986b). Ces réactions induisent

également une douleur (Alexander, 1996; Ribeiro, 1996) pouvant aboutir à l'expulsion

physique du vecteur.

Pour Ribeiro (1996), les arthropodes, vu d'une façon globale, ont développé au cours de leur

évolution des constituants salivaires nécessaires pour lutter en permanence contre cette

réaction adaptative de l'hôte mammifère à la piqûre. Pour assurer le succès du repas sanguin

et contrecarrer cette réponse de 1'hôte, les arthropodes vecteurs doivent notamment échapper à

la réponse immunitaire (Ribeiro 1996). La salive injectée lors du repas sanguin possède des

propriétés pharmacologiques intervenant sur la modulation de la réponse immunitaire innée et

acquise de l'hôte (Ribeiro, 1987; Champagne, 1994; Bowman et al., 1996; Stark et al., 1996).

Par exemple, la tique Ixodes scapulari, vecteur de la maladie de Lyme, se fixe pendant

plusieurs jours sur son hôte pour prendre son repas sanguin. Chez l'homme et chez quelques

animaux domestiques, l'immunité innée intervient précocement par l'action des neutrophiles

(Wheeler et al., 1989) puis une réponse spécifique se développe grâce aux lymphocytes T et B

(Trager, 1939; Brossard et al., 1982). Ces réactions influent sur le bon déroulement du repas

sanguin et conduisent à l'éjection de la tique. Pour pallier cela, la tique doit disposer

d'éléments anti-inflammatoires et immuno-suppresseurs. En effet, des expériences in vitro ont

montré que des protéines salivaires sont capables:

• d'inhiber l'action des neutrophiles de l'hôte (Ribeiro et al., 1990)

• de réguler négativement des cytokines inflammatoires telles l'IL-I et le TNF-a

(Gillespie et al., 2000) et

• d'interférer sur le système du complément (Ribeiro et al., 1986b).

14

De même, cette immunomodulationa été observée sur l'activité des cellules tueuses naturelles

(NK) et sur les macrophages appartenant à la première ligne de défense de l'hôte

(Ramachandra et al., 1992; Kubes et al., 1994; Ferreira et al., 1998; Kopecky et al., 1998).

Ainsi la prostaglandine E2 (PGE2) sécrétée dans la salive inhibe la réponse innée de l'hôte

(Ramachandra et al., 1992; Inokuma et al., 1994b; Ribeiro, 1995) et intervient également sur

la régulation des lymphocytes T et B (Bahl et al., 1990; Spatafora et al., 1990). L'analyse

d'extraits de glandes salivaires de tiques (Dermacentor andersoni) a révélé des protéines

d'environ 36 kDa qui seraient responsables de l'inhibition de la prolifération des lymphocytes

T (Bergman et al., 1995). Cependant le mécanisme d'action n'est pas connu à ce jour.

D'autres études chez la souris ont révélé que les protéines salivaires peuvent stimuler la

sécrétion de cytokines régulatrices IL-4, IL-lO (Schoeler et al., 1999). La salive de

phlébotome permet en effet la diminution de radicaux oxygénés et azotés produits par les

macrophages de la peau et entraîne également une inhibition de l'activité des cellules T

(Titus, 1988; Nong et al., 1989; Theodos et al., 1993). Ces effets sont induits par un peptide

salivaire: « Erythema-Inducing Factor» (EIF) ou maxadilan (MAX) (Nong et al., 1989;

Titus et al., 1990; Lemer et al., 1991). Ce peptide injecté à des souris a le même effet que la

salive totale dans la pathogénie de la leishmaniose. Le rôle immunosuppresseur du MAX

s'exerce aussi par augmentation de la sécrétion des cytokines IL-lO, IL-6 et des PGE2,

médiateurs anti-inflammatoires. A ce jour, le MAX serait le plus puissant vasodilatateur

peptidique connu (Ribeiro et al., 1986a). Une autre enzyme, l'apyrase, présente dans la salive

de tous les arthropodes hématophages (sauf Amblyomma americanum) (Ribeiro, 1995),

intervient dans l'anti-hémostasie de l'hôte. Elle inhibe l'agrégation des plaquettes en

hydrolysant l'adénosine triphosphate (ATP) et l'adénosine diphosphate (ADP) en adénosine

monophosphateet en phosphate inorganique (Ribeiro, 1995).

En 1999, des études ont démontré que la salive des phlébotomes contient deux substances

ayant des activités similaires à l'inhibition de l'agrégation plaquettaire. Il s'agit de la 5'

adénosine monophosphate cyclique (5' AMPc) et de son précurseur l'adénosine (Ribeiro et al.,

1999).

Le pathogène transporté par le vecteur peut utiliser aussi l'action de ces facteurs

immunomodulateurs pour faciliter son passage chez son hôte mammifère. Ainsi, le spirochète

Borrelia burgdorferi, agent étiologique de la maladie de Lyme, reste au point d'injection

15

durant toute la durée du repas sanguin de la tique. Cette dernière ayant besoin de plusieurs

jours pour sa réplétion (Binnington et al., 1980), l'agent pathogène va ainsi profiter des effets

immuno-suppresseurs et anti-inflammatoires locaux des protéines salivaires (Gillespie et al.,

2000b) pour diffuser plus facilement à travers la peau de 1'hôte définitif.

Toutes ces observations laissent croire que la co-évolution entre l'hôte, le vecteur et l'agent

pathogène est régulée par le rôle immuno-supresseur des composants salivaires du vecteur

(Randolph et al., 1994).

Un autre exemple de l'utilisation des protéines salivaires du vecteur par le parasite est illustré

par l'infection expérimentale de la souris par Leishmania. En effet, pour reproduire l'infection

à L. major, il faut inoculer plusieurs millions de parasites avec une seringue alors que

seulement une centaine de parasites est suffisante pour infecter l'hôte lors de la piqûre par le

phlébotome (Warburg et al., 1986). Ces résultats suggèrent une intervention des protéines

salivaires dans le processus de transmission du parasite à l'hôte (Gillespie et al., 2000a). Il a

été démontré que l'injection de lysat salivaire avec L. major augmente le taux d'infection et le

développement des parasites chez la souris (Titus, 1988). D'autres études ont confirmé ces

résultats avec d'autres espèces de leishmanies (Samuelson et al., 1991; Theodos et al., 1991;

Warburg et al., 1994; Lima et al., 1996).

L'infection par Plasmodium falciparum pourrait également modifier le comportement des

moustiques vis à vis de l'homme (James et al., 1991). En effet, la sécrétion de l'apyrase est

fortement diminuée chez un anophèle infecté, ce qui entraînerait une augmentation de la durée

du repas sanguin, facilitant ainsi la transmission du parasite (Ribeiro, 1995).

Le tableau 1 présente quelques composants salivaires aujourd'hui connus et leurs actions

physiologiques.

16

Tableau 1

Protéines salivaires majeures d'arthropode et leurs actions

Apyrase

5' nucleotidase

Tachykinines

Rôle

Anti -agrégation

plaquettaire

Vasodilateur

Espèces Références

Tous les arthropodes (Ribeiro et al.,

hématophages (sauf 1985; Robert et al.,

Amblyomma americanum) 1998)

Aedes aegypti (Ribeiro 1992;

Aedes triseriatus Champagne et al.,

1994b; Ribeiro et

al., 1994)

PGE2 Vasodilatateur

Bloque la

immédiate

Ixodes dammini

RI Amblyomma americanum

Boophilus microplus

(Inokuma et

al.,1994a; 1994b)

(Champagne et al.,

1996).

Cathécoloxydasel Vasodilatateur

Peroxydase

NO binding Anti-agrégation

protein plaquettaire

Anti-histaminique

Carboxypeptidase Détruit

bradykinine

Anopheles gambiae

Anopheles albimanus

Rhodnius prolixus

Cimex lectularis

la Ixodes dammini

(Ribeiro

1994).

(Ribeiro

1986b)

et al.,

et al.,

Maxadüan

(EIF)

= Immunosuppresseur

Anti -inflammatoire

Vasodilatateur

Lutzomia longipalpis (Soares et al.,

1998; Morris et al.,"

2001; Gnilpin et

al., 2002)

Desintegrin

peptide

like Inhibe la sérotonine Ornithodoros moubata

et la noradrénaline Triatoma pallidipennis

Rhodnius prolixus

Aedes aegypti

Novel protein Anti-coagulant Simulium vittatum

17

(Abebe et al.,

1996)

4.2. Réactions immunitaires de l'hôte à la piqûre d'arthropodes

La réponse immunitaire de l'hôte mammifère aux piqûres d'arthropodes a principalement été

étudiée dans l'optique de la recherche de vaccins et dans les mécanismes d'allergie à la piqûre.

Chez l'homme, la réponse immune envers le vecteur est bien décrite pour certaines maladies,

le modèle le mieux étudié étant certainement celui de la réponse immune anti-piqûre de

phlébotome, vecteur de la leishmaniose (Gillespie et al., 2000a). Des lapins exposés aux

piqûres de phlébotomes montrent une réponse anticorps contre plusieurs protéines salivaires

dont certaines sont des glycoprotéines (Ellis et al., 1986). Chez les populations exposées à la

maladie de Chagas, des anticorps IgG1 et IgG4 dirigés contre des extraits salivaires totaux de

réduve (Triatoma infestans) ont été détectés (Nascimento et al., 2001). De même, la réponse

IgG spécifique aux protéines salivaires semble être un marqueur d'exposition aux tiques,

vecteur de la maladie de Lyme (Schwartz et al., 1990)

Dans un modèle murin, l'immunisation par les extraits de glandes salivaires de la simulie

(mouche noire), vecteur de l'onchocercose, induit une réponse anticorps (lgG, IgM, IgE)

dirigée contre certaines de ces protéines (Cross et al., 1993b). Cependant cette réaction

immunitaire diffère qualitativement et quantitativement en fonction du mode d'injection de la

salive: soit la salive est injectée par la simulie lors du repas sanguin, soit elle est injectée par

voie intra-péritonéale avec une seringue. Dans le premier cas, la salive agit sur le complexe

majeur d'histocompatibilité (CMH) par diminution de la prolifération lymphocytaire alors que

l'inoculation d'extraits de glandes salivaires n'affecte pas la prolifération lymphocytaire chez

la souris (Cross et al., 1993a; 1993b). Tous ces remaniements peuvent réduire l'aptitude des

cellules présentatrices d'Ag (Schoeler et al., 2001).

Concernant la réponse immune contre les moustiques, elle a surtout été étudiée dans le cadre

des réactions allergiques chez l'homme. En effet l'hypersensibilité résultant de la piqûre de

moustiques serait liée à la présence de protéines salivaires immunogéniques (Wu et al., 1989).

D'autres études conduites en Finlande, au Canada et au Japon, se sont attachées à caractériser

les phénomènes d'hypersensibilité induits par la piqûre de Aedes aegypti (vecteur de la

dengue, de la fièvre jaune et de filarioses dans les Pays du Sud). Certaines protéines

immunogéniques ont été caractérisées avec un poids moléculaire compris entre 21,5 et 36

kDa ; ces protéines salivaires sont reconnues par les isotypes IgG l , IgE et IgG4 (Reunala et

al., 1991; Peng et al., 1995; Brummer-Korvenkontio et al., 1997a; Jeon et al., 2001; Peng et

18

al., 2001). Ces protéines salivaires antigéniques présentent une importance majeure car elles

pourraient être utilisées pour le diagnostic (exposition aux piqûres allergisantes) ou en

immunothérapie dans le cadre d'une désensibilisation (Brummer-Korvenkontio et al., 1997b).

Toutefois, il semblerait que la réponse anti-salive varie en fonction de la saison et de l'âge ce

qui suggère que l'analyse de cette réponse Ac spécifique pourrait être un bon marqueur

d'exposition aux piqûres de moustique (Konishi, 1990; Reunala et al., 1994a; Palosuo et al.,

1997).

Étrangement, la réponse anticorps dirigée contre la salive d'anophèles a été peu étudiée. Des

réponses IgE et IgG4 spécifiques ont cependant pu être mises en évidence, par

immunoblotting, chez les populations exposées (Brummer-Korvenkontio 1997a; Matsuoka et

al., 1997; Palosuo et al., 1997). Les protéines salivaires reconnues semblent être spécifiques

du genre Anopheles car une faible réaction croisée a été observée avec la salive d'autres

moustiques présents dans les zones d'études (Aedes, Culex). Chez les personnes vivant en

zone impaludée, il a été noté une réponse IgG spécifique à une protéine sécrétée dans la salive

d'anophèle et induisant une réaction inflammatoire (NCF, Neutrophil Chemoattractant

Factor); cette réponse n'a pas été détectée chez les personnes non exposées à l'anophèle

infecté (Owhashi et al., 2001).

4.3. Candidats vaccins

Il ne serait pas illusoire d'envisager l'élaboration de vaccins dirigés contre les vecteurs pour

une lutte plus efficace contre les pathologies à transmission vectorielle. Une vaccination anti

vecteur contre de nombreuses espèces de moustiques a déjà été envisagée. En effet, des

travaux sur lapins et souris ont montré des résultats reproductibles allant dans le sens d'une

baisse de la fécondité, d'une hausse de la mortalité et d'une perturbation du repas sanguin

chez Aedes aegypti (Hatfield 1988; Ramasamy et al., 1988). Une étude intéressante de Matha

et al. (1989) a mis en évidence l'efficacité du transfert passif d'immunoglobines anti-extraits

salivaires de glossines dans un modèle lapin (Matha et al., 1989). Chez les lapins ayant subi le

transfert passif, on note la conservation de l'effet létal sur la glossine.

L'effet de cette immunité vaccinale semble être spécifique de l'espèce de moustique

considérée. Ainsi, la prise du repas sanguin chez un hôte vacciné contre An. tesselatus

entraîne des effets anti-fécondité et augmente la mortalité chez ce moustique alors que seule

19

l'augmentation de la mortalité est observée chez Culex quinquefasciatus gorgé chez les

mêmes sujets immuns (Ramasamy et al., 1992). Concernant l'anophèle, l'induction, chez

l'hôte mammifère, d'une réponse anticorps (Ac) spécifique aux antigènes de moustiques

(principalement intestinaux) pourrait permettre soit de diminuer la susceptibilité du vecteur à

l'infection plasmodiale, soit d'inhiber la fécondité ou d'induire la mort du moustique après un

repas sanguin chez un hôte immunisé (Noden et al., 1995; Brennan et al., 2000).

A l'heure où les rapports d'activité consacrés à la mise en place des différentes stratégies de

lutte contre le paludisme affichent des perspectives particulièrement pessimistes (Yamey,

2004), il en ressort qu'il n'existe pas un seul moyen de contrôle contre le paludisme mais

qu'il faudra une action concertée associant plusieurs outils complémentaires pour venir à bout

de cette maladie.

Parmi les méthodes alternatives, il convient d'explorer toutes les voies. Le rôle des animaux

dans la transmission du paludisme humain apparaît en être une importante, notamment en

Afrique où les hommes et les animaux vivent dans les mêmes aires d'habitations.

20

METHODOLOGIE

Notre travail avait deux objectifs:

• déterminer le rôle des animaux domestiques dans la transmission du paludisme

humain

• valider chez l'animal d'expérience un marqueur sérologique d'exposition à la piqûre

d'Anopheles gambiae

Sur le terrain, nous nous sommes appuyés sur l'existence d'une étude clinique englobant 11

villages de la zone de Niakhar dans le district de Fatick. Cette étude prévoyait la détection,

par visites domiciliaires, de tous les cas de paludisme développés au sein d'une cohorte de

plus de 1000 enfants de moins de 6 ans.

Pour des raisons de faisabilité, nous nous sommes intéressés à deux hameaux du village de

Kotiokh. Lors de trois passages au cours de l'hivernage 2003, les animaux domestiques

séjournant dans les concessions où vivait au moins un enfant de la cohorte précédemment

mentionnée, ont été recensés. L'analyse finale prévoyait de mettre en parallèle à l'intérieur

d'une même concession (i) d'une part l'incidence des cas palustres chez les enfants, (ii)

d'autre part les effectifs des différentes espèces domestiques présentes. Une association

positive irait dans le sens d'une zoonuisance, une association négative dans le sens d'une

zooprophylaxie.

Expérimentalement, nous avons choisi un modèle murin que nous avons exposé à un nombre

variable mais calibré de piqûres d'Anopheles gambiae. Des prélèvements sanguins répétés

devaient permettre de vérifier (i) d'une part si le rat développait une réponse anticorps IgG

spécifique dirigée contre les antigènes salivaires de l'anophèle, (ii) d'autre part si l'intensité

de cette réponse pouvait être mise en relation avec le nombre de piqûres subies.

21

A.VOLET TERRAIN

A.I. Cadre de l'étude

Le village de Kotiokh se situe dans la communauté rurale de Niakhar, région de Fatick, à 150

km à l'Est de Dakar. Cette zone s'étend sur 200 Km2 dans la région sahélienne du bassin

arachidier. Le site de Niakhar regroupe plusieurs hameaux (quartiers) formant les 30 villages

de la communauté rurale (fig 3).

s

_ Zones ilondable~

Denmi de populationo llIbils de 100 hato Entn! 100 et 150o Entn! 150 et 250

Plus de 250 habl

Fig 3.Communauté rurale de Niakhar

Les hameaux, entités géographiques, sont constitués par le regroupement de plusieurs

concessions. La concession comprend au moins une cuisine: cette dernière représente le

23

ménage d'appartenance de la personne, constituant ainsi l'unité de production et de

consommation. Depuis 1962, un suivi démographique a été mené sur 8 villages du site.

A partir de 1983, ce suivi couvre l'ensemble des 30 villages. Des informations sur la

population telles que les mariages, les grossesses, les naissances, les causes de morbidité et

mortalité, le statut vaccinal. .. sont enregistrées systématiquement.

Le village de Kotiokh est caractérisé par l'importance de sa population anophélienne. En

effet, durant l'hivernage 2002, ce village a présenté le plus grand nombre de moustiques

capturés par pièges lumineux avec 275 Anopheles gambiae s.l. soit 32,35% du total des Il

villages (Ba, non publiés). Kotiokh comptait 1363 habitants à la date du 1er Décembre 2003.

Cette population est répartie dans 6 hameaux (figure 4) dont les hameaux « Centre» et « Bak

Mbane » qui sont les plus importants en terme d'effectif avec respectivement 413 et 328

habitants.

J(ocoxCentreoNen-Kor

o...o ;t

~

Nqeran

Fig 4.Le village de Kotiokh avec ses hameaux

Cette zone est soumise au climat soudano-sah élien continental caractérisé par deux saisons :

• une longue saison sèche de novembre à juin qui correspond à la période d'accalmie

dans la transmission palustre Q ;",11,.,[

24

• une courte saison des pluies de juillet à octobre, dénommée hivernage. C'est durant

cette période que la transmission du paludisme atteint son maximum (Robert et al.,

1998) avec la présence d'innombrables points d'eau, favorables à la pullulation des

anophèles.

A.2. Cohorte d'enfants IPTc

Le programme IPTc (Intermittent Preventive Treatment in children), dont l'investigateur

principal est le Dr Badara CISSE (IRD-UR077), est un essai clinique randomisé en double

aveugle avec placebo. Son objectif est de déterminer l'efficacité sur la morbidité palustre en

Afrique sub-saharienne d'un traitement intermittent préventif associant artésunate et

sulfadoxine/pyriméthamine. L'essai clinique a débuté en 2002 et s'est poursuivi en 2003 par

une mesure de l'effet rebond (évaluation du possible excès de cas palustres dans le groupe

traité une année auparavant). La mesure de cet effet rebond a nécessité un relevé

hebdomadaire des cas de paludisme survenus dans la cohorte. Des enquêteurs professionnels

ont recensé les cas palustres dans les concessions et dans les dispensaires. La cohorte est

constituée d'enfants âgés de 11 mois à 6 ans. Les hameaux Centre (Hl) et Bak-Mbane (H2)

du village de Kotiokh, cadre d'étude de notre programme, comprennent chacun 22

concessions. Sur ces 22 concessions, 17 abritent au moins un enfant de la cohorte IPTc dans

chacun des hameaux. Au total nous avons recensé 88 enfants inclus dans les hameaux Centre

(n = 44) et Bak-Mbane (n = 44) qui ont été inclus dans notre étude. Toutes ces données nous

ont été aimablement fournies par l'équipe du Dr. Badara CISSE et en particulier par Ernest

FAYE.

Les critères d'inclusion dans la cohorte IPTc

o Etre âgés de 6 semaines à 5 ans en 2002

o Vivre en permanence dans l'un des Il villages sélectionnés de la zone de Niakhar

o Etre en bonne santé (absence de symptômes et/ou de signes cliniques).

Les critères d'exclusion de la cohorte IPTc

o Avoir un état de santé débilitant

o Refus des parents

o Séjour en dehors de la zone d'étude.

25

A.3. Cohorte animale (ZüüPRüVECT)

A.3.l. Mise en place de l'enquête

La première enquête animale a eu lieu en juillet 2003. Ce mois correspond au début de la

saison des pluies donc au début de la transmission palustre. Dans un premier temps, nous

avions décidé de n'inclure que les concessions du hameau Hl. Mais vu le petit nombre de

concessions éligibles, nous avons alors décidé d'étendre l'étude au hameau H2 pour accroître

la taille de notre échantillon. Ainsi le nombre de concessions est passé de 17 à 32.

La deuxième enquête animale a été effectuée au mois de septembre. Nous avons étudié les

mêmes concessions que lors de la première enquête (n=32). Le mois de septembre correspond

au pic de la transmission palustre. Le début de la deuxième enquête animale était fonction de

l'incidence palustre dans les concessions incluses. En effet, elle devait débuter au moment où

au moins un cas de paludisme aurait été noté dans la moitié des concessions. A la date du 2

septembre, début de la deuxième enquête animale, les concessions « impaludées» étaient au

nombre de 12. Durant la deuxième enquête, des cas de paludismes n'ont été enregistrées que

dans deux nouvelles concessions. Donc les cas de paludisme ont été notés que dans 14 des 32

concessions incluses dans la cohorte soit 43,7% au lieu des 50% initialement prévu. Ainsi, 18

concessions où aucun cas de paludisme n'a été observé chez les enfants ont constitué le

groupe témoin.

Concernant la troisième enquête animale, elle a eu lieu au mois de décembre. Cette période

coïncide avec la fm de la transmission anophélienne du paludisme dans cette zone. Nous

sommes repassé dans toutes les concessions sélectionnées.

A.3.2. Constitution de la cohorte

Critères d'inclusion des concessions

../ Avoir au moins un enfant de la concession inclus dans le programme IPTc.

../ Avoir au moins un mammifère domestique qui passe la nuit dans la concession.

../ Faire partie des hameaux 1 ou 2 du village de Kotiokh.

../ Etre indemne de tout accès palustre antérieur à juillet 2003 pour les enfants IPTc.

26

Critères d'exclusion desconcessions:

-/ Absence d'enfants inclus dans l'étude !PTc.

-/ Absence de mammifères domestiques passant la nuit dans la concession.

-/ Survenue d'un cas de paludisme antérieur à juillet 2003 chez les enfants !PTc.

-/ Refus du chefde concession.

Au total, 17 concessions ont été retenues pour ZOOPROVECT dans le hameau Hl et 15 dans

le hameau Hl. Notons que, compte tenu de ces facteurs d'exclusion, certaines concessions

!PTc n'ont pas été retenues (n=4) par ZOOPROVECT en raison (i) soit de l'absence totale

d'animaux éligibles, (ii) soit de la survenue antérieure d'un cas de paludisme. A l'inverse, des

concessions éligibles pour ZOOPROVECT (n=7) ne le furent pas pour IPTc du fait des

critères d'exclusion précédemment cités.

Les animaux recensés ont été identifiés à l'aide de deux procédés :

• une fiche par concession portant une description de l'extérieur de tous les animaux

présents au moment de l'enquête.

• une prise photographique de chaque animal.

A.4. Calcul et analyse statistique

Le traitement premier des données a été effectué avec le logiciel Excel.

Les corrélations ont été testées en utilisant le test non paramétrique de Spearman grâce au

logiciel StatView II. Le risque de 1ère espèce a été fixé à 5%.

B.VOLET EXPERIMENTAL

B.I. Animaux et conditions d'élevage

Dans cette partie expérimentale nous avons travaillé sur des rats blancs (stock non consanguin

dit « Sandaga »), d'un poids moyen de 170 g au moment de l'achat. Ces rats ont été répartis

en quatre groupes de quatre. Dés leur arrivée, ces animaux ont été individuellement placés

sous moustiquaire dans des cages pour éviter toute nouvelle piqûre de moustiques (figure 5).

Ils sont restés sous moustiquaire pendant deux semaines afin d'attendre la probable

diminution de leur réponse immunitaire due à d'éventuelles piqûres antérieures à leur achat.

Notons que les rats sont restés sous la moustiquaire durant toute la période de

27

l'expérimentation. Ils ont été marqués avec du violet de gentiane phénique sur différentes

parties du corps pour identification.

Fig 5.Système de mise sous moustiquaire des rats dans l'animalerie

B.2. Technique d'exposition

Constitution des lots

Chaque groupe est constitué de deux mâles et de deux femelles. Dans chaque groupe, nous

avions tiré au hasard le rat qui sera exposé à l, 5,25 et 125 moustiques. Nous avons cherché à

déterminer à partir de quel nombre (intervalle) de piqûres la réponse immunitaire se

déclenche. Un facteur de 5 a été choisi pour déterminer le nombre de moustiques. Ainsi:

.:. 4 rats ont été exposés à 1 seule piqûre

.:. 4 rats ont été exposés à 5 piqûres



Préparation des moustiques

Les moustiques utilisés sont des femelles d'Anopheles gambiae s.l provenant de l'insectarium

de l'UR 077 (collaboration avec C. Boudin) de l'Institut de Recherche pour le Développement

(IRD) de Dakar (Sénégal).

28

La veille de l'exposition, des anophèles femelles âgées de 3 jours (âge où l'agressivité est au

maximum), n'ayant jamais été gorgées, sont réparties dans des cages d'élevage de

moustiques. La répartition des moustiques dans les cages se fait en lot de 1, 5, 25 et 125

femelles dans 4 cages différentes. Les moustiques sont nourris à l'eau sucrée qui est retirée 4

heures avant l'exposition des rats.

Préparation des rats

Les rats sont anesthésiés avec un mélange de xylazine (RompunND) et d'hydrochlorure de

kétamine (Imalgene®) à raison de 17,5 ml de kétamine à 50 mg/ml pour 2,5 ml de xylazine à

50 mg/ml. Cette solution est administrée par voie intra-musculaire (lM) à raison de 0,2 ml

pour 100 grammes de poids vif. Les rats sont ensuite rasés sur toute une face latérale allant de

la scapula en passant par l'abdomen jusqu'à l'articulation fémoro-coxale.

Un prélèvement sanguin est réalisé sur les rats avant toute exposition aux piqûres de

moustiques, ce qui constitue le prélèvement SO. Chaque rat est ensuite placé dans la cage à

moustiques correspondante, partie rasée vers le haut, pendant 30 à 40 minutes durant

lesquelles les anophèles prennent leur repas sanguin (figures 4 et 5). L'animal est ensuite

retiré de la cage à moustiques et remis à l'animalerie sous moustiquaire. Les cages à

moustiques sont ensuite placées dans un congélateur à -20°C pour tuer les moustiques et

conserver le contenu de leur estomac.

Le décompte des anophèles qui se sont effectivement gorgés se fait par écrasement sous la

pression d'un doigt. En effet, les moustiques gorgés laissent une tâche rouge (sang dans

l'estomac) sur le papier.

Fig 6. Rat dans une cage au moment

de l'exposition

29

Fig 7. Anophèles se gorgeant sur rat

B.3. Prélèvements sanguins

Les rats sont prélevés à partir d'une semaine après la date d'exposition (SI). Les prélèvements

se font à l'œil au niveau du sinus rétro-orbitaire avec une pipette Pasteur. Le sang est récupéré

dans des tubes Eppendorf marqués au feutre. Ces tubes sont placés à +4"C pendant 24h, le

sérum étant ensuite récupéré dans un autre tube Eppendorf avec la même identification. Les

sérums sont alors centrifugés à 5000 tr/min pendant 15 minutes. Les échantillons sont ensuite

conservés à -20°C.

Les animaux sont prélevés toutes les semaines pendant 2 mois. Les saignées sont identifiées

Sn, n étant le numéro de la semaine de suivi.

Remarque

Compte tenu de la mortalité des moustiques et du refus de certains de se gorger, le nombre de

moustiques par cage est toujours supérieur à celui cité précédemment. Par exemple, pour la

cage à 1 moustique, 2 sont introduits et dès que l'un deux se pose sur le rat pour se gorger,

l'autre est sorti de la cage à l'aide d'un aspirateur approprié.

BA. Production de salive d'anophèle

BA.l. Technique de salivation

Nous avons utilisé une technique de prélèvement de salive pure mise au point par une équipe

finlandaise (Brummer-Korvenkontio, 1994). Cette technique a été améliorée et adaptée à

Anophelesgambiae au laboratoire de l'UR024 de l'IRD.

Des cônes de pipettes sont remplis de 10 ul d'eau distillée et scotchés sur une lame de verre.

Les moustiques, âgés de 7 à 15 jours, sont endormis au CO2 puis les pattes et les ailes sont

enlevées. Le proboscis des moustiques séparé des antennes et des palpes est alors introduit

dans le cône (voir la figure 8). La présence exclusive du proboscis dans le cône permet

d'éviter une contamination de la salive par d'autres protéines.

Les moustiques excités avec 0,5 ul de malathion à 0,25% dilué en acétone sont mis à saliver

pendant une heure (figure 8). La salive est ensuite récupérée dans un tube Eppendorf. On

obtient ainsi un lot de salive par journée de salivation.

30

Fig 8.Anophèle en atelier de salivation

B.4.2. Dosage des protéines salivaires (BCA Protein Assay)

Le test BCA kit (acide bicancathénique) permet d'évaluer la concentration protéique des lots

de salives constitués précédemment. Ce dosage est basé sur la réduction des ions Cu++ en ion

Cu+ par les protéines en milieu alcalin (réaction de biuret). Les étapes successives sont

représentées dans l'ordre d'exécution sur le tableau II, selon les recommandations du kit

Tableau IIEtapes du BCA Protein Assay

ETAPES CONTENU DES PUITS

1) Dilution sériée de la gamme 25111 de la gamme diluée en eau distillée

2) Préparation du réactif de travail 1 part du réactif B

50 parts du réactif A

3) Dépôt des salives sur la plaque 25 III de chaque lot de salive pure

4) Dépôt du réactif de travail sur la plaque 200 111

5) Incubation 45 min à 60°C

6) lecture 570nm

B.S. Technique sérologique (ELISA)

B.s.1. Principe

Ce test est utilisé pour la détection d'antigène ou d'anticorps. L'antigène correspondant à

l'anticorps recherché est fixé au fond de la plaque où sont ensuite déposés les sérums

contenant potentiellement l'anticorps recherché. On rince : si les anticorps sont présents, ils

restent fixés aux antigènes au fond de la plaque. Ils sont mis en évidence en utilisant un

31

anticorps spécifique de ces derniers couplés à une enzyme qui transforme un substrat incolore

en un produit coloré, témoin de la présence de l'anticorps recherché.

La figure 9 indique le principe de la technique ELISA:

16- ABTS

5-Ac -peroxanti- IgG de rat

3- Ac spé~ifiques djcette prote me

I-protéines salivaires =4-------------i auuucne

Fig 9Schéma de la méthode ELISA.

Les nwnéros de la figure 9 correspondent à la succession des étapes dans le protocole retenu

(cf tableau VI).

32

A. SUIVI DE COHORTE

Dans cette partie, nous présentons successivement les effectifs des deux cohortes IPTc et

ZOOPROVECT. Une synthèse des facteurs d'exclusion et d'inclusion des deux cohortes a

permis d'identifier les concessions qui réunissent tous les critères d'éligibilité. Dans ces

concessions, l'incidence du paludisme a donc pu être mise en relation avec les espèces

animales présentes ainsi qu'avec leurs effectifs.

A.1.Cohorte IPTc

Sur l'ensemble des 132 enfants âgés de 11 mois à 6 ans que comptent les hameaux 1 (68

enfants) et 2 (64 enfants) du village de Kotiokh, 88 enfants (66%), répartis dans 34

concessions, sont concernés par l'IPTc. Seuls 73 enfants (55,3%) sont éligibles à la fois pour

les deux programmes IPTc et ZOOPROVECT. De ces 73 enfants, 62 ont fait au moins un cas

de paludisme sur la période de suivi. Du 31 juillet au 9 décembre 2003, 118 cas de paludisme

ont été recensés chez ces 62 enfants, soit une moyenne (± SD) de 1,90 ± 0,90 cas de

paludisme par enfant. Notons que dans chaque concession, au moins un cas de paludisme a

été enregistré.

Tableau IIINombre d'enfants et de cas de paludisme dans la cohorte IPTclZOOPROVECT dans les

hameaux Hl et H2.1 Nbre total Nbre Nbre Nbre Nbre Nbre de cas de

d'enfant dans d'enfants d'enfants d'enfants d'enfants paludisme

Hl et H2 IPTc IPTc/ZOOP indemnes impaludés

132 88 73 11 62 118

A.2. Cohorte ZOOPROVECT

A.2.t. Première enquête transversale: 31 JuiJIet - 15 Août 2003

Dans le hameau Centre (Hl)

Le recensement a été effectué du 31 juillet 2003 au 3 août 2003. Dans les 17 concessions

éligibles du hameau, 151 animaux ont été recensés. Quelque soit l'espèce, il a été dénombré

. plus d'adultes (66,2%) que de jeunes animaux (33,8%). Les petits ruminants, représentés par

les caprins et les ovins, sont les plus nombreux dans les concessions avec respectivement

34

49,6% et 27,1% des animaux domestiques; les chevaux représentent 18,0% et les bovins

5,65% de l'effectif total. La figure 10 indique le nombre d'animaux recensés par concession

en fonction de l'âge:

o Adultes

• Jeunes

35

30 -

25

=20-Col

~ 15~

10

5

~0#1 #2 #3 #4 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #16 #17 #70

Numéro de concession

Fig 10Nombre d'animaux par concession recensés en juillet dans le hameau Hl

La répartition des espèces dans le hameau durant la première enquête est présentée sur la

figure Il :

80

70

60

=50 --~ 40....~ 30

20

10

oOvins Caprins Bovins Équins Chiens

Fig IlRépartition des espèces animales en juillet par concession dans le hameau Hl

35

Dans le hameau Bak Mbane(H2)

Un total de 132 animaux a été recensé dans les 15 concessions éligibles du hameau H2. La

figure 12 indique le nombre d'animaux recensés par concession en fonction de l'âge.

-1

25

20

15

10

...,... D....o .- ....#21 #22 #23 #24 #25 #26 #28 #29 #63 #69 #74 #75 #80 #82 #83

5 ·

Numéro de concession

Fig 12.Nombre d'animaux par concession recensés en juillet dans le hameau H2

La répartition des espèces est indiquée par la figure 13.

60

50

20

10

oOvins Caprins Bovins Équins Chiens

Fig 13Répartition des espèces animales en juillet dans le hameau H2

36

Les animaux adultes (72,7%), toutes espèces confondues, sont majoritaires. Les caprins

(52,2%) et les ovins (21,2%) sont les plus nombreux dans les concessions. Dans tout le

hameau, seuls 2 chiens ont été recensés (l,51 %).

A.2.2. Deuxième enquête transversale: 2 - 6 Septembre 2003

La date de cette enquête transversale a été choisie en fonction du nombre de concessions avec

au moins un cas de paludisme à partir de la date de fin des prélèvements de juillet. Il devait

atteindre 50% soit au moins 16 concessions. Au début de la deuxième enquête transversale,

ces concessions étaient au nombre de 12 sur les deux hameaux. L'enquête a été effectuée du

02 Septembre au 06 Septembre 2003.

A la fin de l'enquête, des cas de paludisme n'ont été enregistrés que dans deux nouvelles

concessions soit 43,7% des concessions au lieu des 50% voulus. Sur l'ensemble des deux

hameaux, 32 concessions ont été visitées et 226 animaux recensés , soit 57 (20,1%) animaux

de moins qu'en juillet.

La r épartitionper espèce dans les- deux hameaux est indiquée sur la figure 14.

DAdultesDJeunes

Équins

--.--._----.----~------,

Ch ie n s

1120

1

1

100

80 -

::~ 601.:1

40 -

20

0Ovins Caprins Bovins

Fig 14Répartition des espèces animales dans les deux hameaux en septembre

Les caprins (48,2%) et les ovins (26,1%) demeurent les deux espèces les plus représentées,

suivis des équins 21 ,2% et des bovins 3,53%. Notons également la faible présence des chiens

37

qui sont au nombre de 3 adultes, tant pour la première que pour la deuxième enquête

transversale.

A.2.3. Troisième enquête transversale: 19 -23 Décembre 2003

Cette troisième et dernière enquête correspondant à la fin de la saison de transmission, a eu

lieu du 02 au 09 décembre 2003. Sur l'ensemble des deux hameaux, 32 concessions ont été

visitées et 154 animaux recensés soit une baisse de 45,5% par rapport à l'effectif initial de la

cohorte . Malgré cette baisse, les caprins (36,3%) et les ovins (33,1%) sont toujours les plus

nombreux alors que les équins et les bovins ne représentent respectivement plus que 25,97%

et 3,24% de l'effectif total des animaux domestiques passant la nuit dans les concessions.

Seuls 2 chiens ont été recensés. La répartition des animaux domestiques passant la nuit dans

les concessions en fonction de l'espèce est illustrée par la figurel5.

60 o Adultes

50 Jeunes

40....'.cCJ 30~....~

20 -

10

0 c==J

Ovins Caprins Bovins Équins Chiens

Fig 15.Répartition des espèces animales dans les deux hameaux en Décembre

A.3. Synthèse de la cohorte ZOOPROVECT

La cohorte ZOOPROVECT présente donc les caractéristiques suivantes:

~ le nombre d'animaux recensés varie d'une enquête à l'autre ; le tableau 4 indique les

effectifs recensés lors de chaque enquête:

38

Tableau IVEffectifs recensés par espèce lors de chaque enquête

Juillet Septembre Décembre

Ovins 69 58 51

Caprins 144 109 56

Bovins 16 8 5

Équins 51 48 40

Chiens 3 3 2

TOTAL 283 226 154

Le nombre moyen (± SD) est de 9,81 ± 7,00 animaux par concession éligible.

Les perdus de vue correspondent à des transactions commerciales, à la mort de certains

animaux ou à leur migration vers les pâturages. En effet, selon la disponibilité de 1'herbe et la

présence d'un berger, certains animaux ne passent plus la nuit dans les concessions.

Dans toutes les concessions éligibles, tous les cas de paludisme survenus chez les enfants

inclus dans la cohorte IPTc ont été recensés. Nous avons donc pu calculer l'incidence du

paludisme durant la période allant de juillet à décembre 2003 .

A.3.1Variation de J'incidence du paludisme chez Jes enfants de la cohorte

IPTc entre juillet-septembre et septembre-décembre

Avec l'aide des enquêteurs et des données des postes de santé, les cas de paludisme dans les

hameaux Hl et H2 nous ont été notifiés. Deux intervalles de temps L11 et L12 ont été définis.

~1 correspond à la période allant du début de la première enquête transversale à la fin de la

deuxième soit du 31 juillet au 5 septembre 2003. L12 couvre la période entre la fin de la

deuxième enquête transversale et celle de la troisième enquête soit du 6 septembre au 22

décembre 2003. Au cours de ces deux périodes (L1 1 et L12), nous avons comparé les incidences

par mois et par concession par un test t apparié de Student. L'incidence moyenne des cas de

paludisme par mois et par concession est 2,5 fois plus élevée pendant la période Septembre

Décembre que pendant la période Juillet-Septembre. Cette différence est significative au seuil

de 1%0 (Tableau V).

39

Tableau V.Incidence mensuelle du paludisme par concession entre /),1 et /),2

Incidence/mois/concession /),1 /),2

moyenne 0,172 0,428

SD 0,235 0,203

Pour une concession donnée, l'incidence mensuelle du paludisme peut être mise en parallèle

avec la présence d 'animaux domestiques. Les variables à prendre en compte seront l'espèce,

l'effectif et l'âge de ces animaux.

A.3.2. Effectif animal corrélé à l'incidence du paludisme

Les deux figures suivantes illustrent la corrélation entre l'incidence mensuelle des cas de

paludisme et le nombre d 'animaux dans les concessions, d 'abord entre Juillet et Septembre

(/),1 , figure 16) puis entre Septembre et Décembre (/),2, figure 17):

30

•

r = -0,120NS

2520

• •

15

••

10

• •

5

•

•

-t---.-.-. . . .--.- . r---.-.--.--,----~

~ 0,8 00E..,:a 0 ,700=ëii 0,600c.="0 0,500 •~

:; 0 ,400 -..,c

0,300~

E~ 0,200uc~ 0,100"0'ùC 0,000....

0

Nombre d'animaux

Figure 16Incidence men suelle des cas de paludisme entre juillet et septembre 2003 selon l'effectif

animal.

Entre Juillet et Septembre, nous notons que l'incidence mensuelle du paludisme tend à

diminuer quand le nombre d'animaux augmente. Bien que non significative au seuil de 5%

(test de Spearman), cette corrélation négative va dans le sens d'une zooprophylaxie.

40

De Septembre à Décembre, le nombre mensuel de cas de paludisme augmente. La corrélation

de l'incidence du paludisme avec l'effectif animal au cours de cette période est illustrée par la

figure 17:

~ 1,200E •.~'0 1,000 - r = -0,205:l"ii NSCo:l 0,800 -'0 •~ •'ii 0,600 -:l • • • •enC •~

0,400 - • •• • •E~ •C'J •• • • •• • •c 0,200 •~ •:s!C'Jc

0,000-0 5 10 15 20 25 30 35

Nombre d'animaux

Figure 17Incidence mensuelle des cas de paludisme entre Septembre et Décembre 2003 selon l'effectif

animal.

La tendance à une corrélation négative entre l'effectif total des animaux et l'incidence

mensuelle du paludisme a été observée. Cependant, le seuil de significativité (test de

Spearman) n'est pas atteint.

A.3.3. Corrélation entre l'espèce animale et l'incidence mensuelle des cas

de paludisme

Les analyses de corrélation ont été effectuées cette fois-ci en fonction de l'espèce animale.

Seule la présence des chiens est positivement corrélée à l'incidence du paludisme entre juillet

et septembre. Ainsi, au cours de cette période, les cas de paludisme sont significativement

plus nombreux (3,7 fois) dans les concessions qui ont un chien que dans celles qui n'en ont

pas (fig 18).

41

0,800 l~

1

r = 0,490E 0,700.~"C P < 0,02::s 0,600œ •c.

1::s 0,500"C

•~

1~ 0,400::sCIlc~ 0,300E~c.l 0,200c~

"C·ü 0 ,100c-

0,000

0 1

Effectif

Fig 18.Répartition du paludisme dans les concessions corrélée à l'effectif des chiens

Il semblerait donc que les chiens aient un rôle de zoonuisance dans la distribution du

paludisme chez l'enfant.

À noter que la significativit é de cette corrélation disparaît entre septembre et décemb

Pour les autres espèces, même si la significativité statistique n'est pas atteinte, le nombre de

chevaux est positivement corrélé à l'incidence du paludisme Cr = 0,343, P = 0,081). Les

chevaux influeraient donc dans le sens d'une zoonuisance de juillet à septembre. Cette

tendance à la zoonuisance est conservée entre septembre et décembre avec le même r Cr =

0,356, P = 0,081).

A.3.4. Corrélation entre l'âge des animaux et l'incidence mensuelle du

paludisme

L'âge des animaux (jeunes versus adultes) a été corrélé avec les cas de paludisme chez les

enfants. D'une manière générale, l'âge des animaux domestiques n'influe pas

significativement sur la distribution du paludisme dans les concessions. La figure 19 montre

que l'incidence du paludisme infantile diminue en fonction de l'effectif des jeunes animaux

dans les concessions.

42

1,20 l

~

S.~ 1,00"0

-=œCo 080= '

"0

~

] 0,60~=~8~ 0,40t.l

=~"0'Cj 0,20=-

••

•• •

r = -0,387

P = 0,058

•

0,00 - I-----r----~---___,_ --- - --,o 3 6 9 12 15

Effectif des jeunes animaux<- - - - - - - - - --

Fig19Incidence mensuelle des cas palustres entre septembre et décembre 2003 selon l'effectif des

. .Jeunes arumaux.

Contrairement à l'effectif global, seul le nombre de jeunes animaux présents dans les

concessions en Septembre tendrait vers une corrélation négative avec l'incidence des cas

paludisme entre Septembre et Décembre. Elle est très proche de la significativité (p = 0,058).

La présence d'animaux jeunes dans les concessions pourrait donc jouer un rôle

zooprophylactique.

Une analyse espèce par espèce montre que seuls les jeunes bovins sont négativement corrélés

avec l'incidence du paludisme (r = -0,359 , p = 0,0783) ce qui suggère que cette espèce

pourrait intervenir comme zooprophylaxie.

B. VOLET EXPERIMENTAL

Dans cette partie expérimentale, nous avons travaillé sur des rats. Notre objectif est de

montrer l'existence d'une réponse immunitaire anti-salive d 'anophèle après une exposition

unique à des piqûres de moustiques. Nous avons ensuite essayé de suivre cette réponse dans le

temps en fonction du nombre de piqûres reçu.

43

B.l. Production d'antigène

L'antigène nécessaire pour déceler les anticorps anti-protéines salivaires d'anophèle n'est pas

encore commercialisé. Il a donc fallu se le procurer en faisant saliver des anophèles. Nous

avons effectué 44 séances de salivation. La figure 20 indique les concentrations en protéines

obtenues lors des différentes séances de salivation:

1400 -

1200 -

1000

800E-C)~

400

200

aLors DE SALIVE

Fig20.Concentration en protéines salivaires des différents lots de salive d'An. gambiae.

Nous avons observé que la concentration en protéines salivaires variait fortement d'un lot

(collecte journalière de la salive diluée d'anophèles de même âge et issus de la même cage

d' élevage) de moustiques à l'autre. Elle va de 8,4 ug/ml à 1155,1 ug/rnl. Ces résultats

montrent que la concentration en protéines salivaires varie en fonction des moustiques, du

nombre de moustiques et peut être des conditions d'élevage (gorgé avec du sang ou nourri à

l'eau sucrée avant salivation, facteurs ambiants de l'insectarium... ).

B.2. Mise au point de la technique ELISA (Enzyme Linked

ImmunoSorbent Assay)

Les conditions optimales ont été choisies après analyse des différents résultats présentés dans

ce chapitre . Pour s'assurer de la spécificité des réponses obtenues, nous avons tenu à faire

pour chaque sérum des puits sans antigène (salive) en duplicate.

44

B.2.1.Détermination de l'antigénicité des salives

La concentration en protéine salivaire varie d'un lot de salive à l'autre. Nous avons

donc tenu à évaluer la capacité à induire la formation du complexe antigène-anticorps pour

chaque lot de salive. Tous les lots de salive ont ainsi été testés avec le même serum de rat. La

figure 21 montre que les densités optiques (DO) sont différentes en fonction des lots de

salives.

1,600

1,400 -1- - - - - - - - - 1

1,200 -1 - - - - - - - - - 1

1,000 -1- - - - - - - - - 1

DO 0,800 -1---------1

0,600 -1- - - -

0,400

0,200

0,000 -

D~6 D~7 D~O D~l D~2 D~3 D~4 D~5 D~6

lots de salive1- _

Fig 21.Antigénicité des lots de salive.

B.2.2. Recherche de sérums positifs

Après détermination de leur antigénicité, les lots de salive suscitant les DO les plus élevées

ont été ensuite utilisés pour tester les sérums de rats. Dans un premier temps, nous avons testé

les sérums de rats prélevés à la deuxième semaine (S2) . Pour chaque sérum choi si , les

prélèvements à SO ont été testés pour s 'assurer de la spécificité de la réponse des S2. Nous

avons utilisé les conditions suivantes:

o dilution au 1/1Oème des sérums;

o dilution au 1/500ème de l'anti-IgG de rat conjugué à la peroxydase.

45

B.2.3.Standardisation du protocole ELISA

Le principe de la standardisation du protocole ELISA est de définir les conditions techniques

optimales pour bien différencier les sérums positifs des sérums négatifs. Pour cela, nous

avons fait varier :

• les lots de salive;

• sérums de rats ;

• solutions de dilution;

• les saturants ;

• les dilutions des sérums et des anticoprs IgG de rats conjugués à la peroxydase.

Le protocole retenu est indiqué dans le tableau VI :

Tableau VIProtocole standard ELISA

étapes Contenu du I!uits1) coating de l'antigène, 2 h 30 à 37°C - 1ug/ml de protéines salivaires

- en tampon carbonate/bicarbonate +azide 0,02%- 100 ul/puits

2) lavage - eau-Tween 0, 1%3) incubation des sérums, 1 nuit à 4°C - dilution I/S0ème

- en PBS-Tween 1% + azide 0,02%- 100 ul/puits

4) lavage - eau-Tween 0, 1%5) fixation de l'Ac-perox anti-IgG de rat - Ac anti-IgG de rat couplé à la1 h 30 à 37 -c peroxydase

- dilution 1I500ème- en tampon PBS-Tween 1%- 100 ul/puits

6) réaction avec ABTS, Ih à RT - pour une plaque: 10 mg ABTS (tablets)+ 10 ml Tampon Citrate 0,05 M + 10 ~1

H20 230%

7) lecture spectrophotomètre -lecture1 heure après étape 6 à 405 nm

B.3.Résultats ELISA sur les sérums de rats

B.3.1. Ajustement des données

Les lots de salive n'ayant pas la même antigénicité, il a donc fallu ajuster les résultats

obtenus. Un calcul d'étalonnage a été fait pour homogénéiser les résultats obtenus avec

différents lots de salive. Trois sérums positifs avec des DO croissantes ont été choisis et testés

avec tous les lots de salive utilisés par plaque (Pn ; n représentant le numéro de passage de la

plaque). Les DO de ces 3 sérums observées avec P4 ont servi de coordonnées pour la droite

de référence (Linéaire DO P4). Les DO obtenues avec les plaques P2 (Linéaire P2) et P3

46

(Linéaire P3) ont été ajustées à partir de cette droite de référence. La figure 22 représente les

différentes droites obtenues.

1,2 -r-- - - - - - - - - - - - - - - - ---,

• DOP4

DOP3

x DOP2

- Linéaire (DO P3)

- Linéaire (DO P2)

- Linéaire (DO P4)

I- - - ----Iy = 0,95x + 0,1921---~

R2 =0 9992,1

02 Y= 0,5806x - 0,206 I---=-"""'~----t, R2 =0 998,

0,4 -1- - - - - - --:;,0;'- - - - - -

ln(1)

~ 0,6 - ----In(1)

EoCl

°- 1------r---~T---_.---_.___--_1

-0,20,2 0,4 0,6 0,8 1

DO ajustées

Fig 22.Ajustement des DO des sérums

Ainsi , les DO de la plaque P2 ont été ajustées avec un coefficient égal à 0,95 et un coefficient

de 0,580 pour celles de la plaque P3.

B.3.2.Rats exposés à 1 moustique

Dans ce groupe, tous les rats ont effectivement subi une seule piqûre après exposition aux

anophèles. La figure 23 présente la cinétique de la réponse IgO anti-salive (moyenne + SD) :

47

1,600 ,--=----------- -------,

1,200

00,800 Q

0,400 ---

8642

0,000 -!--- - - ,--- - - ,--- - - ,--- - ------\

oDate du prélèvement (semaine)

Fig23.Cinétique des IgO après exposition à 1 piqûre d'An. gambiae

De manière étonnante, une DO importante est observée à sa, avant toute exposition

expérimentale à la piqûre d'Anopheles.gambiae . Ceci pourrait être du au fait que la durée de

deux semaines prise pour diminuer au maximum les traces de piqûres antérieures soit

insuffisante.

Nous observons un déclenchement de la réponse immunitaire après 1 seule piqûre. Le pic de

cette réponse est observé une semaine seulement après la piqûre. Elle décroît à partir de la

deuxième jusqu'à la cinquième semaine.

A la 6ème semaine, un second pic d'IgO mais plus faible dans son intensité est observé. Ce

dernier pourrait être du à une (ou d'autres piqûres) accidentelle(s) ou à la détection

d'immunoglobulines différentes que les IgO. Ceci sera discuté ultérieurement.

B.3.3. Rats exposés à 5 moustiques

La figure 24 présente la cinétique de la réponse IgO anti-salive (moyenne +SO) des rats qui

ont reçu en moyenne 5,75 piqûres sur 7 possibles. En effet sur les 7 moustiques présents, tous

ne se sont pas gorgés.

48

oo

1,500

1,000 - j - - - - - ---I

0,000o l 2 3 4 5 6 7 8

Date du prélèvement (semaine)

Fig 24.Cinétique des IgG après exposition à 5 piqûres d'An. Gambiae

Comme pour le lot précédent, une réponse immunitaire est décelée avant exposition (SO). Une

hypothèse pourrait être que ces rats aient été piqués avant exposition" L'exposition aux 5

piqûres est suivie d'une baisse de la réponse IgG anti-salive de SI à S2. La synthèse d'IgG

reprend à partir de S2 pour atteindre son pic à S3.


La figure 25 présente la cinétique de la réponse IgG anti-salive (moyenne +SD) :

0,500 ·1---------1----1- - - 1- - - 1

oQ

0,000 + - - - - - ---,- - - - - ---,---- - - --r--- - - - --1

o 2 4 6 8


Fig25.Cinétique des IgG après exposition à 25 piqûres d'An. gambiae

49

Dans ce groupe, une forte réponse immune est aussi observée avant exposition (Sa).

L'hypothèse d'un contact avec des anophèles pourrait être retenue. Le nombre effectif de

piqûres était de 22,25 en moyenne. Ces 22 piqûres sont suivies d'une absence de synthèse

d'immunoglobuline IgG pendant les 2 premières semaines. A partir de la troisième semaine,

la réponse IgG est de nouveau observée pour atteindre son pic entre S4 et S5.


La figure 26 présente la cinétique de la réponse IgG anti-salive (moyen +SD) des rats qui ont

reçu une moyenne de 100 piqûres d'anophèle. En effet, même si nous avons pris soin de

mettre 130 anophèles dans chaque cage, seuls 100 en moyenne prennent leurs repas sanguins

sur les rats.

0,600

o 0,400 ·I--"~~-----

Q

0,200

0,000

o 2 4 6 8


Fig 26Cinétique des IgG après exposition à 125 piqûres d'An. gambiae

Une très faible réponse IgG anti-salive semble être détectée à sa. Cette réponse IgG atteint

son pic une semaine après exposition et se maintient jusqu'en S2. La réponse IgG chute à la

troisième semaine et se maintient très faiblement jusqu'à S7.

BA. Synthèse des résultats expérimentaux

Après analyse de ces résultats, nous pouvons dire que:

~ Certains rats auraient pu déjà être piqués par des anophèles avant leur arrivée au

laboratoire;

50

~ certains de ces rats ont été repiqués par des anophèles malgré leur séjour sous la

moustiquaire ;

~ une seule piqûre de moustique déclencherait une réponse IgG anti-salive spécifique.

Cette réponse serait transitoire et ne durerait qu'une semaine;

~ le nombre de piqûres influence le déclenchement et la cinétique de la réponse IgG ;

~ l'apparition des IgG est observée entre 1 et 3 semaines après exposition;

~ la réponse IgG semble plus longue en durée chez les rats ayant été exposés à 25 et 125

piqûres.

51

Les résultats de deux approches complémentaires pour une étude visant à préciser le rôle

éventuel des animaux domestiques dans la transmission du paludisme humain ont été

présentés dans ce travail. La première approche, basée sur une enquête de terrain, a cherché à

mettre en corrélation la présence des différentes espèces animales présentes dans les

concessions et l'incidence locale des cas de paludisme chez l'enfant de moins de 6 ans. Cette

étude a eu lieu dans 2 hameaux du site de Niakhar. La deuxième, purement expérimentale,

visait à développer un modèle animal murin d'exposition aux piqûres de moustiques. L'outil

de quantification de cette exposition était sérologique (IgG anti-protéines salivaires

d'anophèles) avec pour hypothèse une relation linéaire entre les titres anticorps et le nombre

de piqûres subies. Appliqué aux espèces animales domestiques, ce modèle pourrait, à terme,

permettre de quantifier l'exposition dans les conditions de terrain.

PARTIE TERRAIN

L'analyse selon l'espèce animale indique que la présence d'un chien dans une concession est

significativement corrélée à une augmentation de l'incidence du paludisme chez les enfants. Il

semble en être de même pour les chevaux même si la significativité statistique n'est pas

atteinte. Quand nous prenons l'âge comme variable, les jeunes animaux, toutes espèces

confondues, et, plus particulièrement, les jeunes bovins semblent avoir un rôle

zooprophylactique avec une significativité statistique approchée mais non atteinte. Cependant,

deux biais potentiels (utilisation d' ivermectine et la variabilité de l'effectif de la cohorte

animale) ont pu influencer les résultats de cette étude. ils sont discutés maintenant.

Utilisation de l'ivermectine

Les ovins, caprins et bovins recensés ont été traités à l'ivermectine en juillet et en décembre

dans le but de remercier les propriétaires de leur collaboration. Ce traitement a pu avoir un

effet allant dans le sens d'une baisse de la population anophélienne dans les concessions

(Foley et al., 2000). Cependant, Anopheles stephensi, espèce sensible au traitement à

l'ivermectine (Iakubovich et al., 1989), n'est pas présente à Niakhar où prédomine An.

gambiae s.l. (Robert et al., 1998). De plus, l'effet létal de l'ivermectine diminue à partir du

troisième jour et s'estompe au bout de 6 semaines (Foley et al., 2000). Les deux traitements

étant séparés de 16 semaines et Anopheles stephensi étant absent dans la zone d'étude,

53

l'influence de l'ivermectine sur le taux de mortalité au sein de la population anophélienne

pourrait être relativement négligeable au cours de notre étude.

Effectifs fluctuants de la cohorte animale

Le traitement gratuit à l'ivermectine en Juillet a incité quelques propriétaires à amener dans

les concessions des animaux qui auraient dû être aux pâturages à cette époque. D'où un

effectif initial (283) pléthorique. Un mois plus tard, 20% des animaux manquent à l'appel. En

Décembre, la baisse atteint 45%. Les perdus de vue constituent l'une des principales

difficultés dans le suivi de cohorte, y compris animale. Une meilleure stabilité des troupeaux

intra-concessionnaires permettrait une interprétation plus solide des corrélations observées.

Résultats de la cohorte ZOOPROVECT

La date des trois recensements a tenu compte de l'évolution des cas de paludisme. Ainsi, le

début, le pic et la fin de la transmission ont pu être couverts.

Pour l'analyse, il est important de préciser à quel biotype la zone de Niakhar peut être

rattachée. Classiquement, le site développe une agriculture pluviale mais les «scéanes » (puits

peu profonds creusés par les habitants à des fins d'arrosage de cultures maraîchères) présents

dans le village de Kotiokh constituent des gîtes larvaires potentiels pour les moustiques

pendant la saison sèche. Ceux-ci peuvent donc jouaient le même rôle que les eaux d'irrigation

dans les zones pratiquant une agriculture irriguée où la zoophagie d'Anopheles gambiae s.l.

est en moyenne plus élevée qu'en zone d'agriculture pluviale(Konate et al., 1999).

Malgré leur forte représentation (75,2% de l'effectif initial), l'effectif des petits ruminants

n'est pas significativement corrélé à l'incidence des cas de paludisme chez les enfants dans la

zone de Niakhar. Cependant, nous ne pouvons affirmer qu'ils sont ou non piqués, d'où

l'intérêt potentiel de disposer d'un marqueur sérologique d'exposition. Ces résultats ne

peuvent toutefois pas être généralisés à toutes les zones impaludées car l'affinité trophique

d 'Anopheles gambiae s.l. dépend des espèces animales disponibles (Konate et al., 1999).

La présence des équins dans les concessions est positivement corrélée à l'incidence du

paludisme (non significatif). Ces résultats associeraient une augmentation des cas de

paludisme chez les enfants à la présence des chevaux dans les concessions. Des travaux

menés en zone d'agriculture pluviale ont montré que les chevaux, en l'absence de bovins,

54

constituent la principale source de repas des anophèles zoophages (Konate et al., 1999). Nous

nous attendions donc à une corrélation négative entre l'effectif des équins et l'incidence du

paludisme chez les enfants.

Une corrélation négative est observée entre la présence des jeunes bovins et l'incidence

mensuelle du paludisme infantile. En effet, les bovins constituent un des hôtes préférés

d'Anopheles gambiae s.l. (Konate et al., 1999; McCall et al., 2001). De plus, le cuir des veaux

n'étant pas encore aussi épais que celui des adultes, il est plus facile pour les moustiques de le

transpercer. La non-significativité statistique de cette zooprophylaxie peut être liée à la

période où l'étude a été menée ou à un manque d'effectif. Durant la saison des pluies, les

bovins de la zone de Niakhar transhument vers le nord. Ce mouvement saisonnier déviant

l'affinité trophique des anophèles (Faye et al., 1995a; Konate et al., 1999), il serait intéressant

de mener une étude similaire dans une zone où les bovins et les anophèles sont présents toute

l'année.

La zoonuisance des chiens, que nous pouvons suggérer avec nos résultats, reviendrait à dire

que les chiens, (directement ou indirectement), attirent les moustiques qui vont ensuite

prendre leur repas sanguin chez les hommes. Ceci reste à confmner dans de futures études

puisque, même si la significativité a été observée, le nombre de chiens inclus dans l'étude

était très faible (n = 3) et le nombre de piqûres n'a été évalué ni chez les chiens ni chez les

enfants. Néanmoins, cette « anthropophilie » d'An. gambiae s.l. que pourrait suggérer nos

résultats malgré la présence de chiens est en contradiction avec les résultats obtenus à Sao

Tomé où Sousa et al. (2001) ont montré qu'An. gambiae s.s. préfère se gorger sur les chiens

aux dépens des hommes et des porcs. An. arabiensis est l'espèce la plus représentée du

complexe gambiae s.l. à Niakhar (Robert et al., 1998). Cependant cette déviation vers la

population humaine malgré la présence d'autres espèces animales dans les concessions où des

chiens ont été recensés (ovins, caprins, bovins, équins) corrobore une anthropophilie d'An.

gambiae s.l. supérieure à sa zoophagie (Robert et al., 1998; Konate et al., 1999).

La population animale totale dans les concessions ne semble pas être corrélée à l'incidence du

paludisme. Or, prises séparément, certaines espèces (chiens, bovins, équins) sont positivement

(zooprophylactique) ou négativement (zoonuisance) corrélées à l'incidence du paludisme.

Nous pouvons donc émettre l'hypothèse d'une zoophagie sélective en fonction des espèces.

Cette hypothèse pourrait être infirmée ou confirmée par l'évaluation quantitative de la

55

réponse Ac anti-salive d'An. gambiae chez ces mêmes ammaux. En effet, ce marqueur

immunologique permettrait d'indiquer plus précisément quelle espèce, à quel âge et à quel

moment de la saison de transmission du paludisme est effectivement piquée. Dans ce sens,

des prélèvements ont été réalisés chez les animaux suivis au cours de cette étude. L'évaluation

des IgG anti-salive de moustique sera réalisée prochainement. Les titres sérologiques seront

alors mis en relation avec les résultats déjà obtenus.

Avant l'évaluation de la réponse immune des animaux domestiques, il était important de

développer, en parallèle, un modèle animal d'exposition destiné à calibrer la réponse

anticorps IgG en fonction du degré d'exposition aux piqûres.

PARTIE EXPERIMENTALE

Le but de cette partie expérimentale était de calibrer la réponse immune IgG en fonction du

nombre de piqûres d'anophèles reçues. Les dosages ont d'abord montré l'existence chez le rat

d'anticorps IgG dirigés contre les protéines salivaires d'anophèle. Nous avons observé aussi

que le déclenchement et la cinétique de cette réponse humorale variaient selon le nombre de

piqûres. Néanmoins, nous avons été confrontés à des problèmes au cours de cette

expérimentation. Ces problèmes font l'objet de la discussion ci-dessous.

Provenance des rats

Il nous a été impossible d'assurer la traçabilité de nos rats. Certains ont certainement été

élevés par des enfants puis revendus au marché. D'autres proviennent de l'Ecole Inter-Etats

des Sciences et Médecine Vétérinaires de Dakar (E.LS.M.V). La probabilité qu'ils aient été en

contact avec des anophèles avant de nous parvenir est très élevée. Ceci semble être corroboré

par la présence d'une DO IgG relativement importante pour certains groupes notamment chez

ceux qui ont reçu 5 et 25 piqûres.

Choix du modèle rat

Le paludisme est une pathologie humaine et notre étude expérimentale pourrait amener de

nombreuses informations sur la transmission du paludisme chez l'homme et sur les réponses

immunes anti-salive impliquées dans celle-ci. Il nous fallait donc un animal de laboratoire

dont l'immunité face aux piqûres de moustique se rapproche le plus de celle de l'homme. Le

56

rat répondait le plus à ces critères par rapport à la souris ou au lapin. Par exemple, il a été

montré que le rat présente une production d'IgE bien supérieure à celle d'un autre modèle de

rongeur, telle que la souris, et que cette production semble dépendre des mêmes facteurs

immunitaires (les cytokines) que ceux retrouvés chez l'homme (pierrot et al., 2001).

Or, il a été démontré que l'IgE était un isotype prépondérant dans la réponse Ac spécifique à

la salive après piqûre de moustique (Reunala et al, 1994b). Ceci fut une raison

supplémentaire d'avoir choisi le modèle rat dans nos expériences d'exposition.

RéponseIgG

Nos résultats démontrent l'apparition, chez le rat, d'une réponse humorale IgG anti-salive

d'An. gambiae après exposition expérimentale à la piqûre. Ces résultats vont dans le même

sens que d'autres modèles de piqûres d'arthropodes telles les tiques et les glossines (Brossard

et al, 198; Ellis et al., 1986; Mbogo et al., 1993; Mathews et al., 1996). Chez l'homme

exposé, la principale composante de sa sensibilisation immune aux extraits de glandes

salivaires soit d'Aedes (Konishi 1990), soit de triatomes (Konishi 1990; Nascimento et al.,

2001) est également de type IgG.

Impact du nombre de piqûres

Même si des prélèvements à intervalles plus réduits auraient fourni des informations plus

précises, nos résultats suggérent que le nombre de piqûres intervient dans l'intensité et dans la

cinétique de la réponse immune.

Pour des expositions extrêmes (l et 125 piqûres), la réponse apparaît précocément, avec un

pic atteint dès la 1ère semaine, suivi d'une décroissance progressive au cours du temps. La

même observation a été faite chez des lapins exposés à des piqûres de tique (Brossard et al,

1982). La réponse immunitaire décelée après une seule piqûre d'anophèle respecte donc cette

cinétique.

Après 5 piqûres, le pic est plus tardif (troisième semaine) et il est suivi d'une baisse brutale

des titres IgG.

La réponse après 25 piqûres est difficile à interpréter en raison d'une baisse notable et

inattendue des taux d'anticorps après exposition.

D'autre part, la différence entre la hauteur du pic de réponse et la DO initiale (SO) est

maximale après 1 ou 5 piqûres, minimale après 25 piqûres. Cette relation inverse entre le

57

niveau d'exposition et la réponse anticorps n'est pas, pour des raisons éthiques évidentes,

documentée chez l'homme. En revanche, elle est à rapprocher des observations faites chez des

enfants chroniquement exposés aux piqûres d'Aedes chez qui l'intensité de la réponse

immunitaire diminuait avec le nombre de piqûres reçues (Reunala et al., 1994a;Palosuo et al.,

1997,). Notons cependant que nous sommes peu confiants envers les résultats du groupe de

rats ayant reçu une seille piqûre. En effet les cages de ces rats étaient placées sur l'étagère la

plus basse de l'animalerie, position favorable à la pénétration de moustiques dans la

moustiquaire, donc dans la cage.

Existence d'autres isotypes

Nos résultats suggérent l'existence d'une seconde réponse immunitaire 6 à 7 semaines après

exposition pour les groupes ayant reçu 1 ou 5 piqûres. Nous imputons cette réponse soit à

d'autres piqûres incontrôlées après exposition, soit au développement d'autres réponses

isotypiques que les IgG. Cette seconde hypothèse mériterait d'être vérifiée chez le rat,

Reunala et al. (1994) ayant montré l'existence d'isotypes variés (IgGI et IgG4) chez des

enfants piqués par Aedes.

D'autres isotypes peuvent donc rentrer enjeu dans cette réponse anticorps. Nous envisageons

d'analyser ces isotypes prochainement chez le rat (IgG 1, IgG2a, 2b et 2c).

58

CONCLUSION

Le paludisme demeure un problème majeur de santé publique. Plusieurs méthodes de lutte

sont certes mises en œuvre mais elles connaissent des limites qui endiguent leur efficacité. Il

est donc nécessaire d'envisager des moyens de lutte alternatifs et complémentaires. Parmi

ceux-ci, nous avons eu comme objectif de déterminer le rôle que jouent les animaux

domestiques présents dans les concessions aux heures de piqûres des anophèles sur

l'incidence du paludisme. La détermination précise de ce rôle bénéficierait grandement d'une

quantification des niveaux d'exposition. Nous avons donc développé au laboratoire un modèle

rat afin de valider le taux d'anticorps anti-salive d'anophèles comme marqueur sérologique

d'exposition aux piqûres.

Le suivi de cohorte a été mené de Juillet à Décembre 2003. Nous avons travaillé avec un

recensement dynamique des cas de paludisme chez les enfants âgés de Il mois à 6 ans. Ce

recensement s'est accompagné d'un décompte de tous les animaux passant la nuit dans les

concessions éligibles. Il ressort de notre analyse que :

~ de façon générale, l'effectif total des animaux domestiques présents dans une

concession n'est pas corrélé avec le nombre de cas de paludisme chez les enfants;

~ la présence de jeunes animaux, toutes espèces confondues, serait associée avec une

baisse significative de l'incidence du paludisme au sein de la population étudiée:

zooprophylaxie ;

~ elle est particulièrement marquée chez les jeunes bovins ;

~ la présence de chiens est associée à une augmentation significative du nombre de cas

de paludisme chez les enfants de Il mois à 6 ans. Ils représentent donc une

zoonuisance ;

~ les chevaux tendent également vers une zoonuisance, mais de façon non significative.

Concernant le volet expérimental mené de Octobre 2003 à Juin 2004, l'analyse des sérums

révèle:

.:. une antigénicité variable des lots de salive à'anophèles.gambiae;

.:. une réaction humorale de type IgG déclenchée par la piqûre d'Anopheles

gambiae ;

.:. le nombre de piqûres influe sur le déclenchement et la cinétique de cette

réponse humorale;

.:. une seule piqûre suffirait à déclencher une réponse IgG.

59

Au terme de cette étude, il semblerait que les ammaux interviennent dans un sens

(zooprophylaxie) ou dans un autre (zoonuisance) dans l'évolution du paludisme infantile. Une

nouvelle approche immuno-épidémiologique orientée vers la quantification des anticorps anti

protéines salivaires permettrait de mieux définir leur rôle. La détermination à l'aide d'un

modèle murin des protéines salivaires immunogéniques serait d'un grand apport dans la lutte

anti-transmission du paludisme.

RECOMMANDATIONS - PERSPECTIVES

VOLET TERRAIN

D'après les résultats de ce DEA qui devront être confirmés par des études ultérieures, nous

pouvons émettre quelques hypothèses de recommandations pour une meilleure lutte contre le

paludisme.

Il est clairement établi que les anophèles vecteurs du paludisme peuvent être attirés par les

animaux domestiques à l'origine de leurs repas sanguins. Cette zoophagie est plus ou moins

prononcée selon l'espèce animale considérée. Deux cas de figure sont possibles:

~ Espèces animales positivement corrélée à l'incidence mensuelle du paludisme chez les

enfants (zoonuisance) la raison voudrait que l'on éloigne chiens et chevaux des

concessions. Mais en zone rurale, la présence des animaux dans les concessions

s'explique souvent par des raisons de sécurité et de culture. Il serait donc utopique de

demander aux éleveurs de les en sortir. Surtout qu'en période de pluies, la quasi totalité

des surfaces inhabitées est occupée par les champs. L'alternative serait de mettre l'enclos

de ces animaux «zoonuisibles » au fond des concessions, à une distance respectable des

cases. Certains auteurs conseillent le traitement des animaux à l'ivermectine ou

l'utilisation d'insecticides. Cependant ces méthodes pourraient connaître quelques

limites:

• rémanence amoindrie des produits « pour on », surtout en saison de pluies;

• problème d'innocuité pour les animaux et les consommateurs;

• problème des délais d'attente;

• coup élevé du traitement.

~ Espèces animales allant dans le sens d'une zooprophylaxie: la présence des jeunes

animaux toutes espèces confondues, et des jeunes bovins en particulier, diminuerait les

cas de paludisme chez les enfants. Les populations seraient tentées de rapprocher ces

60

animaux de leurs habitations. Néanmoins, il ne faudrait pas perdre de vue le fait que

même si le paludisme est à l'heure actuelle un des plus grands fléaux du monde, il n'en

demeure pas moins qu'il n'est pas le seul qui mérite d'être prévenu. Beaucoup d'autres

pathologies appelées zoonoses peuvent être contractées avec la proximité des animaux.

Pour aider les instances dirigeantes à prendre des décisions applicables, des études doivent

déterminer clairement la part de responsabilité des animaux dans la transmission du

paludisme humain. Une étude basée sur le même principe que la nôtre, mais qui, en plus des

recensements (cas de paludisme et effectifs des animaux), ferait un titrage individuel chez les

animaux du taux d'anticorps anti-salive (des trois principales espèces d'anophèles vecteurs du

paludisme au Sénégal (Anopheles gambiae/arabiensis/funestusï, aiderait en ce sens. Cette

étude pourrait être une des premières voies d'analyse à entreprendre suite aux résultats décrits

dans ce DEA.

PARTIE EXPERIMENTALE

Maîtrise des paramètres

Une telle étude nécessite des rats naïfs, le meilleur moyen de s'en procurer étant d'avoir des

souches élevées dans des maisons spécialisées. L'animalerie doit aussi être d'accès limité et

pourvue de moustiquaires à toutes les ouvertures afm d'éviter le contact avec tout arthropode

piqueur. En effet, toute autre piqûre qui pourrait influer sur la réponse immune doit être

évitée. De plus, un plus grand nombre de rats par groupe serait très utile pour s'assurer de la

reproductibilité de nos résultats.

Exposition chronique

Dans les zones impaludées, les populations humaines sont soumises aux piqûres d'anophèles

de façon chronique. Ce type d'exposition peut être modélisé au laboratoire par une exposition

répétée et calibrée, la réaction à une seule exposition pouvant certainement différer d'une

exposition fractionnée. Le modèle rat pourrait permettre de caractériser la réponse

immunitaire suivant les deux types d'exposition. En effet, il suffirait d'avoir un protocole rat

mimant une transmission saisonnière et un autre protocole rat mimant une transmission

pérenne. L'irnmuno-protéomique pourrait permettre d'identifier les protéines salivaires

immunogéniques suivant que l'on est soumis aux piqûres d'anophèles de façon chronique ou

61

non. Ce modèle animal pourrait donc servir de modèle pour évaluer toute intervention anti

piqûre, ou vaccin anti-transmission par le vecteur.

Les autres isotypes

La réponse anticorps face aux piqûres d'anophèles ne se limite pas seulement aux

IgG. L'évaluation plus fine de la cinétique des sous-classes d'IgG chez le rat (IgG l, 2a, 2b et

2c) et des autres isotypes (IgM, IgE et IgA) aidera à mieux cerner les contours de cette

réponse anti-salive d'anophèle. Des résultats différents de ceux du DEA pourraient alors être

observés.

Etude sur An. gambiae/arabiensis/funestus

Une exposition avec les trois espèces d'anophèles vecteurs du paludisme au Sénégal aiderait à

voir si l'organisme réagit de la même manière aux piqûres d'espèces anophéliennes

différentes. Elle permettra aussi de faire des investigations sur les probables réactions croisées

de la réponse Ac anti-salive entre An. gambiae s.s, An. arabiensis et An. funestus. Il semble

donc important de vérifier l'opportunité d'un même marqueur pour juger de l'exposition à

ces 3 espèces d'anophèles. Une telle étude sera complétée par l'identification des protéines

immunogéniques chez chaque espèce par les techniques d'immuno-protéomiques.

62

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Titre: Paludisme humain et présence d'animaux domestiques à Niakhar(Sénégal):Aspects épidémiologiques et mise au point d'un marqueur immunologique aux piqûresd 'Anopheles gambiae

Nom et Prénom: N'GOM Abdoulaye

Nature du mémoire: Diplôme d'Etudes Approfondies (DEA) de Biologie Animale

Jury : Président Mady N'DIAYE

Membres Denis BOULANGER

Karamoko DIARRA

Lassana KONATE

Soutenu le 26 juillet 2004 à 16 heure à la salle de cours AEA

RESUME Le paludisme demeure un problème majeur de santé publique. De nombreux moyens delutte alternatifs et complémentaires contre le parasite ou le moustique vecteur existent mais chacunprésente des limites d'efficacité. Parmi ces méthodes de lutte, notre objectif était d'évaluer le rôle desanimaux domestiques présents dans les concessions sur l'incidence du paludisme chez l'enfant (voletterrain), la présence de ces animaux pouvant favoriser les cas de paludisme (zoonuisance), les réduire(zooprophylaxie) ou n'avoir aucun rôle (neutralité). La détermination précise de ce rôle bénéficieraitgrandement d'une quantification des niveaux d'exposition à la piqûre du vecteur Anopheles. Nousavons donc, en parallèle, développé au laboratoire un modèle rat afin d'évaluer si le taux d'anticorpsanti-salive d'anophèles pourrait être un marqueur sérologique d'exposition aux piqûres (voletexpérimental).

Pour le volet terrain, la communauté rurale de Niakhar a été choisie comme site d'étude. Lescas de paludisme ont été recensés chez des enfants âgés de Il mois à 6 ans. En parallèle, les animauxpassant la nuit dans les mêmes concessions que les enfants ont été recensés au début, pendant le pic età la fin de la transmission palustre. Nous avons montré que l'effectif total des animaux n'avait pasd'effet sur l'incidence du paludisme infantile. Par contre, les jeunes animaux, notamment les jeunesbovins, tendraient de façon significative à jouer un rôle zooprophylactique. Les chiens représentent laseule espèce dont la présence serait positivement et significativement corrélée à l'incidence dupaludisme. De même, les chevaux tendraient vers la zoonuisance.

Nos études menées sur des rats ont montré qu'une exposition unique à un nombre connu depiqûres d'Anopheles gambiae est capable d'induire une réponse humorale IgG spécifique auxprotéines salivaires du moustique. Le nombre de piqûres reçues influence le déclenchement et lacinétique de la réponse humorale. Une seule piqûre suffit à son déclenchement.

Une nouvelle approche immuno-épidémiologique orientée vers la quantification des anticorpsanti-protéines salivaires d'anophèles permettrait de mieux définir le rôle des animaux domestiquesdans la transmission du paludisme humain. L'identification des protéines salivaires irnmunogéniques àl'aide d'un modèle animal expérimental permettrait de « mimer» l'exposition des populations aupaludisme et serait ainsi d'un grand apport dans la lutte contre la transmission de cette parasitosemajeure. L'ensemble de ces études pourrait être appliqué aux autres maladies à transmissionvectorielle qui sont prépondérantes dans les pays du Sud.

Mots clés: Anopheles -paludisme - animaux domestiques - Sénégal - réponse anticorps - protéinessalivaires - rats

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