monolisa™ total anti-hav plus 2 plăci - 192 72481 · 4 conjugatul enzimatic în exces este...

20
Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 TRUSĂ DE DETECTIE ŞI CUANTIFICARE ANTICORPILOR TOTALI ANTI-HAV ÎN SER/PLASMĂ A PRIN ANALIZĂ IMUNOENZIMATICĂ 883674 - 2014/02

Upload: others

Post on 22-Feb-2020

2 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 TRUSĂ DE DETECTIE ŞI CUANTIFICARE ANTICORPILOR TOTALI ANTI-HAV ÎN SER/PLASMĂ A PRIN ANALIZĂ IMUNOENZIMATICĂ

883674 - 2014/02

Page 2: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

2 [RO]

CUPRINS

1. APLICAŢIILE CLINICE 2. PRINCIPIUL DE TESTARE 3. COMPONENTELE TRUSEI 4. MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ 5. INSTRUCŢIUNI DE IGIENĂŞI PROTECŢIA MUNCII 6. PRECAUŢII 7. PROBELE BIOLOGICE 8. RECONSTITUIREA REACTIVILOR -VALABILITATE -PĂSTRARE 9. METODA DE LUCRU 10. ADAPTAREA LA INSTRUMENTE 11. CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR -METODA CALITATIVĂ 12. CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR -METODA

CANTITATIVĂ 13. VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A

REACTIVILOR (OPŢIONALĂ) 14. PERFORMANŢELE ACESTUI TEST 15. LIMITELE TESTULUI 16. BIBLIOGRAFIE

Page 3: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

3 [RO]

1 - APLICAŢIILE CLINICE Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS este un test imunoenzimatic pentru detecţia şi cuantificarea anticorpilor totali anti–HAV (virusul hepatitei A) în serul sau plasma umane. Acest test poate fi folosit ca instrument ajutător în diagnosticarea unei infecţii curente sau trecute cu virusul hepatitei A. Acest test poate fi folosit de asemenea şi pentru stabilirea statutului imun înainte de vaccinare precum şi evaluarea gradului de imunizare după vaccinarea împotriva Virusului Hepatitei A. După vaccinarea anti-HAV, anticorpii anti-HAV pot fi detectaţi după aproximativ 2 săptămâni de la vaccinare şi, în mod obişnuit, timp de mai mulţi ani. Determinarea nivelurilor de anti-HAV a fost standardizată prin folosirea celui de-al doilea standard internaţional OMS (WHO Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard, 1998). Preparatul este standardizat în miliunităţi internaţionale per mililitru (mUI/ml). O concentraţie de 20 mUI/ml este în general considerată ca prag de garanţie a imunităţii pacientului faţă de infecţia cu HAV. Astfel, valoarea medie a absorbţiei standardului de 20 mUI/ml (standard atestat în raport cu WHO Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard, 1998) a fost aleasă ca valoare prag (cut-off) pentru aceasta testare. 2 - PRINCIPIUL DE TESTARE Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS este un test imunoenzimatic de inhibiţie bazat pe utilizarea microplăcilor sensibilizate cu anticorpi monoclonali anti-HAV de şoarece, a antigenului viral HAV şi a probei de testat şi apoi în a doua etapa a unui conjugat enzimatic alcătui din anticorpi monoclonali anti-HAV de şoarece cuplaţi cu peroxidaza din hrean. 1 In timpul primei etape de incubare, probele de testat (sau controalele) şi

antigenul viral HAV sunt incubate împreună timp de 1 oră la 37°C. Dacă în proba de testat exista anticorpi anti-HAV, aceştia complexează reactivul antigen viral HAV, împiedicând legarea antigenului la anticorpii de pe faza solidă (microplaca).

2 La sfârşitul primei etape de incubare, printr-o etapă de spălare se îndepărtează componentele nereactive din probă, antigenul HAV rămas nelegat, precum şi complexele solubile HAV/anti-HAV.

3 În fiecare godeu se adaugă conjugatul enzimatic, alcătuit din anticorpi monoclonali anti-HAV de şoarece marcaţi cu peroxidază, şi apoi se incubează timp de 1 oră la 37°C. Cantitatea de conjugat enzimatic legată la faza solidă prin intermediul antigenului viral HAV şi activitatea enzimatică rezultată în consecinţă sunt invers proporţionale cu anticorpii anti-HAV prezenţi în proba de testat sau în serul de control.

4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie de substrat/cromogen TMB.

5 După 30 de minute de incubare la temperatura camerei, reacţia este stopată, iar citirea se efectuează la spectrofotometrul echipat cu filtre de 450/620-700 nm.

Absorbţia măsurată a unei probe permite determinarea prezenţei sau cuantificarea anticorpilor totali anti-HAV în acea probă.

Page 4: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

4 [RO]

3 - COMPONENTELE TRUSEI

Identificare pe etichetă Descriere Prezentare Preparare

72481

R1 Microplate Microplaca 12 barete a câte 8 godeuri sensibilizate cu anticorpi monoclonali anti-HAV

2 plăci

R2 Concentrated washing solution (20X)

Soluţie de spălare concentrată (20X) Soluţie tampon Tris NaCl pH 7,4 Conservant: ProClin™ 300 (0,04%)

1 flacon 235 ml

R3 Negative control

Control negativ Ser uman, anti-HAV negative, AgHBs negativ, şi negativ pentru anticorpii anti-HCV şi anti-HIV1-2 Conservant: Azidă de sodiu (< 0,1%)

1 flacon 1,5 ml

R4 Positive cut-off

Standard pozitiv 20 mUI/ml Ser uman, anti-HAV pozitiv şi negativ pentru AgHBs, anticorpii anti-HCV şi pentru anticorpii anti-HIV1-2, diluat într-un amestec de ser uman anti-HAV negativ Conservant: Azidă de sodiu (< 0.1%)

1 flacon 3 ml

R5 Positive control

Standard pozitiv 80 mUI/ml Ser uman, anti-HAV pozitiv şi negativ pentru AgHBs, anticorpii anti-HCV şi pentru anticorpii anti-HIV1-2, diluat într-un amestec de ser uman anti-HAV negativ Conservant: Azidă de sodiu (< 0.1%)

1 flacon 1 ml

R6 Specimen diluent

Antigen viral HAV Tampon Tris cu proteine, lizat viral HAV şi indicator de culoare pentru controlul adăugării probei Conservanţi: ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon 28 ml

R7 HAV viral antigen

Conjugat Tampon Tris cu proteine, conjugat anti-HAV marcat cu peroxidază şi indicator de culoare pentru controlul adăugării probei Conservanţi: ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon 26 ml

R8 Substrate buffer

Substrat Soluţie de acid citric şi acetat de sodiu, pH 4,0, conţinând H2O2 (0,015%) şi sulfoxid de dimetil (DMSO) 4%

1 flacon 60 ml

R9 Chomogen: TMB solution (11X)

Cromogen: Soluţie TMB Soluţie conţinând 3,3’, 5,5’ tetrametilbenzidină (TMB)

1 flacon 5 ml

R10 Stopping solution Soluţie de stopare Soluţie de acid sulfuric (H2SO4 1N)

1 flacon 28 ml

Page 5: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

5 [RO]

4 - MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ • Apă distilată sau deionizată. • Hipoclorit de sodiu (clor menajer) şi bicarbonat de sodiu. • Hârtie absorbantă (de filtru, sau şerveţele). • Mănuşi de unică întrebuinţare. • Ochelari de protecţie. • Eprubete de unică folosinţă. • Pipete automate sau semiautomate reglabile sau cu volum fix, pentru pipetarea a

50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl şi 1 ml. • Cilindri gradaţi cu capacităţi de 10 ml, 200 ml şi 1000 ml. • Agitator tip vortex. • Sistem de spălare a microplăcilor: automat*, semiautomat* sau manual. • Baie de apă sau incubator uscat*, termostatate la 37°C ± 1°C • Container de deşeuri contaminate. • Dispozitiv de citire a microplăcilor* (echipat cu filtre de 490, 620, 450/620-

700 nm). (*) Informatii suplimentare asupra echipamentelor validate de serviciul nostru tehnic

se pot obtine de la serviciile tehnice autorizate sau de la reprezentantă. 5 - INSTRUCŢIUNI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII Toţi reactivii trusei sunt destinaţi în exclusivitate diagnosticului ”in vitro“. • Numele testului, precum şi numărul de identificare specific testului sunt scrise pe

rama fiecărei microplăci. De asemenea, acest numărul de identificare specific este scris şi pe fiecare baretă.

Monolisa™ Total Anti HAV PLUS : Număr ID Specific = 59 Verificaţi numărul de identificare specific înaintea fiecărei utilizări. Dacă numărul

de identificare lipseşte, sau este diferit de cel menţionat anterior ca specific trusei, bareta nu trebuie folosită la testare.

• Purtaţimănuşi de unică întrebuinţare atunci când manipulaţi reactivi şi probe şi spălaţi-vă mâinile temeinic după ce aţi manipulat asemenea materiale.

• Nu pipetaţi cu gura. • Materialul din sursă umană folosit la prepararea controalelor negativ (R3), pozitiv

(R5) şia standardului pozitiv de 20 mUI/ml (R4) a fost testat şigăsit nereactiv pentru antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B (AgHBs), anticorpii specifici de virusul hepatitei C (HCV) şi anticorpii anti-HIV1 şi anti-HIV2. Deoarece nici o metodă de testare cunoscută nu poate garanta în mod absolut absenţa agenţilor infecţioşi, manipulaţi reactivii şi probele pacienţilor ca materiale potenţial infecţioase, luând precauţiile necesare.

• Orice alt material ce vine în contact direct cu probele şi reactivii de provenienţă umană, ca şi soluţiile de spălare colectate, trebuie considerate materiale infecţioase.

• Evitaţi împroşcarea cu probe sau soluţii ce conţin material biologic. • Stropii trebuie clătiţi cu clor diluat la 10%. Dacă lichidul de contaminare este un

acid, trebuie să neutralizaţi mai întâi aceste picături cu bicarbonat de sodiu, apoi să curăţaţi cu clor şi în final să le ştergeţi cu hârtie absorbantă. Materialul folosit la curăţenie trebuie aruncat în containerul de deşeuri contaminate.

• Probele, reactivii de provenienţă umană, ca şi materialele şi produsele contaminate trebuie decontaminate înainte de aruncare: fie prin scufundare în clor la concentraţia finală de 5% hipoclorit de sodiu (1 volum de clor la 10 volume de apă sau alt lichid contaminat) timp de 30 de minute, sau prin autoclavare la 121°C timp de minimum 2 ore.

Page 6: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

6 [RO]

PRECAUTIE: NU INTRODUCETI ÎN AUTOCLAVĂ SOLUTII CE CONTIN HIPOCLORIT DE SODIU.

• Evitaţi orice contact cu pielea sau mucoasele al tamponului substrat, al cromogenului sau al soluţiei de stopare.

• Nu uitaţi sa neutralizaţi şi/sau sa autoclavaţi înainte de a vărsa la chiuvetă soluţiile contaminate sau lichidele de spălare folosite, sau orice alt fluid ce conţine probe biologice.

• Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente chimice din acest kit de test, vă rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la www.bio-rad.com.

6 - PRECAUŢII Calitatea rezultatelor depinde de respectarea următoarelor Bune Practici de Laborator: Nu folosiţi reactivi expiraţi. • Nu amestecaţi reactivi din loturi diferite în aceeaşi runda de lucru. REMARCĂ: În cazul solutiei de spălare (R2, etichetă de identificare: 20X, scris

cu verde), a tamponului substrat pentru peroxidază (R8, etichetă de identificare: TMB buf, scris cu culoare albastra), a cromogenului (R9, etichetă de identificare: TMB 11X, scris cu culoare mov) şia solutiei de stopare (R10, etichetă de identificare: 1N, scris cu culoare roşie), este permisă folosirea altor loturi decât cele din trusa de lucru curentă, având grijă ca în aceeaşi rundă de lucru să folositi acelaşi lot pentru fiecare din reactivii mentionati. Aceşti reactivi se pot folosi şi cu alte produse de diagnostic Bio-Rad. În plus, solutia de spălare (R2,etichetă de identificare : 20X scris cu culoarea verde) poate fi amestecată cu 2 alte solutii de spălare incluse în diverse truse de reactivi Bio-Rad (R2, etichetă de identificare : 10X scris cu albastru sau 10X scris cu culoarea portocaliu) dacă sunt reconstituite corect (diluate în proportia necesară), şi cu conditia ca într-o serie de lucru să se folosească numai un singur amestec. Contactati specialiştii Bio-Rad pentru informatii mai amănuntite.

• Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 de minute pentru ca toţi reactivii să ajungă la temperatura camerei.

• Reconstituiţi cu grijă reactivii evitând contaminarea. • Nu efectuaţi testul în prezenţa vaporilor reactivi (de acizi, baze sau aldehide) sau

în încăperi prăfuite, deoarece aceste noxe pot afecta activitatea enzimatică a conjugatului.

• Folosiţi sticlărie spălată temeinic şi clătită foarte bine cu apă deionizată sau, de preferinţă, materiale de unică folosinţă.

• Nu lăsaţi microplaca să se usuce între sfârşitul operaţiei de spălare şi distribuţia următorului reactiv.

• Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la metale sau ioni metalici. Prin urmare, nu trebuie să permiteţi contactul metalelor sau al ionilor acestora cu diverse soluţii de conjugat sau substrat.

• Soluţia de developare (tampon substrat + cromogen) trebuie să fie de culoare roz. Modificarea acestei culori specifice în primele (două) minute după reconstituire indică alterarea soluţiei ce nu poate fi folosităşi trebuie înlocuită.

• Prepararea soluţiei de developare se poate face într-un recipient de plastic de unică întrebuinţare, curat, sau într-un recipient de sticlă, spălat în prealabil cu HCl 1N, clătit foarte bine cu apă distilatăşi uscat. Acest reactiv trebuie păstrat la întuneric.

Page 7: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

7 [RO]

• Folosiţi conuri noi pentru pipetarea fiecărei probe de ser. • Spălarea godeurilor reprezintă o etapă critică în acest procedeu: respectaţi

numărul de cicluri de spălare recomandat şi asiguraţi-vă că toate godeurile sunt bine umplute şi apoi complet golite. Spălarea incorectă poate duce la rezultate imprecise.

• Nu folosiţi niciodată acelaşi container pentru a distribui conjugatul şi soluţia de developare.

7 - PROBELE BIOLOGICE Recoltaţi probele de sânge în acord cu practicile uzuale şi reglementările în vigoare. Testul trebuie efectuat pe ser sau plasma nediluate (recoltate pe anticoagulanţi pe baza de EDTA, citrat, ACD [acid-citrat-dextroză] şi heparină). Separaţi serul sau plasma cât mai repede cu putinţă pentru a evita hemoliza. Hemoliza severă poate altera performanţele testului. Probele ce conţin agregate trebuie clarificate prin centrifugare înainte de testare. Agregatele sau particulele de fibrină în suspensie pot produce rezultate fals pozitive. Probele trebuie păstrate la +2-8°C dacă testarea se face în 7 zile de la recoltare, sau congelate la -20°C. Evitaţi congelarea/decongelarea repetată. Dacă probele trebuie transportate, împachetaţi-le în acord cu reglementările privind transportul agenţilor etiologici, şi transportaţi-le de preferinţă îngheţate. NU FOLOSIţI SERURI CONTAMINATE, HIPERLIPEMICE SAU HIPERHEMOLIZATE. REMARCĂ: Probele ce contin până la 60 g/l de albumină, 100 mg/l de bilirubină, probele lipemice cu continut de până la 36 g/l echivalent de trioleină, şi cele hemolizate cu până la 5 g/l de hemoglobină, nu influentează rezultatele. Probe negative şi pozitive pentru anticorpi anti-HAV au fost testate înainte şi după efectuarea a 3 cicluri de îngheţare/dezgheţare. Acest tratament nu a influenţat detecţia de anticorpi. 8 - RECONSTITUIREA REACTIVILOR – VALABILITATE – PĂSTRARE Înainte de a folosi reactivii trusei Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS, aceştia trebuie să se stabilizeze la temperatura camerei (18-30°C) timp de 30 minute. 1) Reactivi gata de utilizare Microplaca (R1) Fiecare cadru suport de 12 barete este împachetat într-o pungă cu nervură. Tăiaţi punga cu foarfeca sau bisturiul la 0,5-1 cm deasupra nervurii de plastic. Deschideţi punga şi scoateţi suportul. Reţineţi atâtea barete câte sunt necesare, apoi reintroduceţi în pungă baretele în plus. Închideţi cu grijă nervura returnaţi la 2-8°C. Control Negativ (R3) Standard Pozitiv 20mUI/ml (R4) Control Pozitiv (R5) Antigen Viral (R6) Conjugat (R7) Omogenizaţi reactivii înainte de utilizare. 2) Reactivi de reconstituit Solutia de spălare concentrată (20X): R2 Diluaţi soluţia de spălare (R2) în proporţie de 1:20 cu apă distilată. Preparaţi 800 ml pentru o placă de 12 barete.

Page 8: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

8 [RO]

Solutia de revelare enzimatică (R8 + R9) Diluaţi reactivul (R9) în proporţie de 1:11 folosind reactivul R8 (de ex: 1ml de reactiv R9 în 10ml de reactiv R8). Pentru 1 până la 12 barete, vă sunt necesari şi suficienţi 10 ml. Omogenizaţi. 3) Reactivi de diluat pentru testul cantitativ Pentru testul cantitativ, preparaţi controalele de concentraţie 10 şi 40 mUI/ml prin diluţia în proporţie de 1:2 în R3 a reactivilor R4 şi respectiv R5. Curba de calibrare va fi alcătuită din următoarele puncte : Cal 80 = 80 mUI/ml calibrator = R5 Cal 40 = 40 mUI/ml calibrator = R5 diluat 1/2 în R3 (100 + 100 µl) Cal 20 = Standard Pozitiv 20 mUI/ml = R4 Cal 10 = 10 mUI/ml calibrator = R4 diluat 1/2 în R3 (100 + 100 µl) Cal 0 = 0 mUI/ml calibrator = R3 4) Valabilitatea -Păstrare Trusa trebuie păstrata la +2-8°C. Dacă se păstrează la această temperatură, fiecare reactiv din trusă se poate folosi până la data de expirare menţionată pe ambalaj (cu excepţia cazurilor în care există instrucţiuni specifice). R1 : După deschiderea pungii protectoare, baretele păstrate la 2-8°C în ambalajul original atent resigilat sunt utilizabile timp de 4 săptămâni. R2 : Soluţia de spălare diluată se poate păstra la +2-30°C timp de 2 săptămâni. Soluţia de spălare concentrată (R2) se poate păstra la +2-30°C. R8 + R9 : După reconstituire, reactivul păstrat la întuneric se poate folosi timp de 6 ore la temperatura camerei (+18-30°C). 9 - METODA DE LUCRU • Urmaţi cu stricteţe protocolul de lucru. • Folosiţi serurile de control negativ şi pozitiv la fiecare runda de lucru, pentru a

valida calitatea testului efectuat. • Respectaţi şi aplicaţi Bunele Practici de Laborator. Metodele de lucru. 1) Stabiliţi cu atenţie distribuţia probelor şi planul de identificare în placă. 2) Preparaţi soluţia de spălare la concentraţia de lucru (diluaţi R2). 3) Scoateţi rama microplăcii şi baretele gata de întrebuinţare (R1) din punga

protectoare. 4) Pipetaţi direct şi în următoarea succesiune, fără a spăla microplaca în prealabil: - 100 µl de Antigen viral (R6) în fiecare godeu. Pentru metoda calitativă 50 µl de control negativ (R3) în godeul A1, 50 µl de Standard Pozitiv 20 mUI/ml (R4) în godeurile B1, C1, D1, 50 µl de control pozitiv (R5) în godeul E1, 50 µl din proba 1 în godeul F1, 50 µl din proba 2 în godeul G1, etc… Pentru metoda cantitativă 50 µl de CAL 0 în godeurile A1, B1 50 µl de CAL 10 mUI/ml în godeurile C1, D1 50 µl de CAL 20 mUI/ml în godeurile E1, F1 50 µl de CAL 40 mUI/ml în godeurile G1, H1

Page 9: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

9 [RO]

50 µl de CAL 80 mUI/ml în godeurile A2, B2 50 µl din proba 1, ca atare sau diluată, în godeul C2 50 µl din proba 2 în godeul D2, etc… Probele pot fi diluate cu ser de control negativ R3 (Cal 0 mUI/ml). Daca

pipetarea probelor depăşeşte 10 minute, se recomandă pipetarea controalelor negativ şi pozitive DUPĂ ce aţi pipetat probele de cercetat. În funcţie de sistemul utilizat, este posibil să schimbaţi poziţia controalelor în placă.

REMARCĂ : După pipetarea probelor, culoarea godeurile ce contin solutie de antigen viral (R6) precum şi probe sau seruri de control, virează din roşu în portocaliu. Este posibil să verificati prezenta probelor în godeuri prin citire la spectrofotometru la 490 nm (citire monocromatică). Consultati capitolul 13 -VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

5) Acoperiţi godeurile cu folie adezivă. Apăsaţi bine pe întreaga suprafaţă pentru a etanşa.

6) Incubaţi microplaca într-o baie de apă termostatată sau într-un incubator uscat timp de 60 ± 5 minute la 37°C ± 1°C.

7) Îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul godeurilor într-un container de deşeuri contaminate. Adăugaţi minim 0,370 ml de soluţie de spălare în fiecare godeu. Lăsaţi în contact timp de 30 secunde. Aspiraţi încă odată. Repetaţi etapa de spălare de minim 2 ori (in total minim 3 spălări). Volumul rezidual trebuie să fie mai mic de 10 µl (dacă este nevoie, întoarceţi placa cu fundul în sus şi tapotaţi deasupra unei hârtii absorbante). Dacă folosiţi un spălător automat, respectaţi aceleaşi etape de spălare.

8) Distribuiţi rapid 100 µl de soluţie de conjugat (R7) în toate godeurile. Conjugatul trebuie să fie agitat uşor înainte de folosire. Acoperiţi godeurile cu o nouă folie adezivăşi incubaţi timp de 60 ± 5 minute la 37°C ± 1°C.

REMARCĂ: Distributia solutiei de conjugat, care este de culoarea mov, poate fi controlată în această etapă de manipulare prin citire la spectrofotometru la 620 nm (Consultati capitolul 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR).

9) Îndepărtaţi folia adezivă, goliţi toate godeurile prin aspirare şi spălaţi de minim 4 ori conform descrierii anterioare.

10) Preparaţi soluţia de developare enzimatică (tampon substrat + cromogen) (a se vedea capitolul 8 : RECONSTITUIREA REACTIVILOR).

11) Distribuiţi rapid în fiecare godeu câte 80 µl de soluţie de developare proaspăt preparată (R8+R9). Lăsaţi reacţia să se desfăşoare în întuneric timp de 30 ± 5 minute la temperatura camerei (18-30°C). NU folosiţi folie adezivă în timpul acestei incubări.

REMARCĂ: Pipetarea solutiei de developare, care este de culoare roz, poate fi controlată în această etapă de lucru: un godeu gol se deosebeşte net de un godeu în care s-a pipetat solutia de developare de culoare roz. (Consultati capitolul 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR).

12) Adăugaţi 100 µl de soluţie de stopare (R10) în aceeaşi ordine şi cu aceeaşi viteză de pipetare ca pentru soluţia de substrat.

REMARCĂ: Distributia solutiei de stopare, incoloră, poate fi controlată vizual în această etapă de lucru. După adăugarea solutiei de stopare, culoarea substratului roz (pentru probele negative) sau albastră (pentru probele pozitive) dispare şi godeurile devin incolore pentru probele negative sau virează de la albastru la galben pentru probele pozitive.

Page 10: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

10 [RO]

13) Ştergeţi (uscaţi) cu grijă fundul plăcii. După cel puţin 4 minute de la adăugarea soluţiei de stopare şi în interval de maxim 30 de minute de la stoparea reacţiei, citiţi densitatea optică la 450/620-700 nm folosind un cititor de microplăci.

14) Înainte de a nota rezultatele, verificaţi corelaţia dintre citiri şi microplaca (distribuţia probelor şi planul de identificare).

10 - ADAPTAREA LA INSTRUMENTE SPĂLAREA : Pentru a obţine performanţele maxime la testare, respectaţi protocolul de spălare descris anterior. Cu unele instrumente s-ar putea să fie necesar sa măriţi numărul de cicluri de spălare şi volumul soluţiei pentru a se atinge criteriile de validare acceptabile (un fond negativ acceptabil). 11 - CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR - METODA CALITATIVĂ Prezenţa sau absenţa anticorpilor anti-HAV detectabili este determinată prin compararea absorbţiei măsurate pentru fiecare probă cu valoarea calculată a pragului de detecţie (cut-off). 1. Calculati media valorilor absorbtiei obtinute pentru Standardul Pozitiv 20 mUI/ml (R4) Exemplu: Standard Pozitiv 20 mUI/ml (R4) Godeul Densitatea optică (absorblia) B1 0,689 C1 0,673 D1 0,680 Total DO 2,042 Totalul densităţilor optice 2,042 Media DO R4 = ----------------------------------- = ---------- = 0,680 3 3 2. Calculati raportului de reactivitate pentru fiecare probă Raportul de reactivitate = Media DO R4 / DO Probă 3. Criteriile de validare sunt următoarele a) Pentru controlul negativ R3: valoarea absorbţiei măsurate trebuie să fie mai

mare de 1,0. b) Pentru Standardul Pozitiv 20 mUI/ml R4: fiecare valoare a absorbţiei măsurată

trebuie să fie mai mare de 0,350. Dacă una din valorile individuale a Standardului Pozitiv 20 mUI/ml diferă cu mai mult de 30% de valoarea medie, eliminaţi această valoare din calcul şi refaceţi calculul folosind cele două valori valide rămase. Media absorbţiilor măsurate pentru Standardului Pozitiv 20 mUI/ml împărţită la absorbţia medie a serului de control negativ (Media DO R4 / DO R3) trebuie să fie mai mică de 0,6.

c) Pentru controlul pozitiv R5: valoarea absorbţiei măsurate trebuie să fie mai mică de 0,300. Valoarea raportului de reactivitate pentru serul de control pozitiv (Media DO R4 / DO R5) trebuie să fie mai mare de 1,5. Testul nu este valid dacă unul dintre aceste criterii nu este respectat.

4. Interpretarea rezultatelor Probele al căror raport de reactivitate este mai mic decât 0,9 sunt considerate negative în testul.

Page 11: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

11 [RO]

Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS. Probele al căror raport de reactivitate este mai mare sau egal cu 1,1 sunt considerate pozitive în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS. Probele al căror raport de reactivitate este mai mare sau egal cu 0,9 şi mai mic de 1,1 trebuie interpretate cu prudenţă şi retestate în simplu înainte de interpretarea finală. După retestare, proba se consideră pozitivă în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS dacă raportul de reactivitate este mai mare sau egal cu 1,1. Proba se consideră negativă în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS dacă raportul de reactivitate este mai mic de 0,9. Dacă raportul de reactivitate al probei este mai mare sau egal cu 0,9 şi mai mic decât 1,1, rezultatul probei nu poate fi interpretat şi se impune testarea unei probe recoltate ulterior. 12 - CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR - METODA CANTITATIVĂ 1. Calculati media valorilor absorbtiei obtinută pentru fiecare calibrator Exemplu: CAL 40 mUI/ml Godeul Densitatea optică (absorblia) G1 0,295 H1 0,292 Total DO 0,587 Totalul densităţilor optice 0,587 Media DO CAL 40 mUI/ml = --------------------------------- = ---------- = 0, 2935 2 2 2. Criteriile de validare sunt următoarele a) Pentru controlul negativ R3 (CAL 0 mUI/ml): Valoarea absorbţiei măsurate

pentru fiecare control negativ R3 trebuie să fie mai mare decât 1,0. b) Pentru calibratorul pozitiv R4 (CAL 20 mUI/ml): Absorbţia măsurată pentru

fiecare R4 trebuie să fie mai mare decât 0,350. Media absorbţiilor măsurate pentru Standardul Pozitiv 20 mUI/ml împărţită la media absorbţiilor măsurate pentru controlul negativ (Media DO R4 / Media DO R3) trebuie să fie mai mică de 0,6.

c) Pentru controlul pozitiv R5 (CAL 80 mUI/ml): Absorbţia măsurată pentru fiecare control pozitiv R5 trebuie să fie mai mică de 0,300. Valoarea raportului de reactivitate pentru serul de control pozitiv R5 (Media DO R4 / Media DO R5) trebuie să fie mai mare de 1,5.

d) Media DO CAL 0 > Media DO CAL 10 mUI/ml Media DO CAL 10 > Media DO CAL 20 mUI/ml Media DO CAL 20 > Media DO CAL 40 mUI/ml Media DO CAL 40 > Media DO CAL 80 mUI/ml Testul nu este valid dacă unul dintre aceste criterii nu este respectat.

3. Interpretarea rezultatelor Densitatea optică a fiecărui punct din gama de calibrare este reprezentată grafic, punct cu punct, pe axa-y (ordonată), faţă de concentraţia de anticorpi anti-HAV exprimată în mUI/ml pe axa-x (abscisă). Concentraţia de anticorpi anti-HAV (mUI/ml) a fiecărei probe poate fi determinată prin marcarea DO (absorbţiei) probei pe axa-y şi determinarea punctului de intersecţie corespunzător pe axa x. Citiţi concentraţiile probelor testate folosind curba grafică obţinută. Dacă proba a fost diluată, multiplicaţi concentraţia obţinută cu factorul de diluţie. Probele a căror

Page 12: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

12 [RO]

concentraţie este mai mică de 18 mUI/ml sunt considerate negative în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS. Probele a căror concentraţie este mai mare sau egală cu 22 mUI/ml sunt considerate pozitive în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS. Probele a căror concentraţie este mai mare sau egală cu 18 mUI/ml şi mai mică de 22 mUI/ml trebuie interpretate cu prudenţă şi retestate în simplu înainte de interpretarea finală. După retestare, proba se consideră negativă în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS dacă concentraţia este mai mică decât 18 mUI/ml. Proba se consideră pozitivă în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS dacă concentraţia este mai mare sau egală cu 22 mUI/ml. Dacă concentraţia probei retestate este mai mare sau egală cu 18 mUI/ml şi mai mică de 22 mUI/ml, rezultatul probei nu poate fi interpretat şi se impune testarea unei probe recoltate ulterior. 13 - VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRILOR (OPŢIONALĂ) VERIFICAREA PIPETĂRII ANTIGENULUI VIRAL (R6) ŞI A PROBEI ÎN PRIMA ETAPĂ Prezenţa în godeuri a antigenului viral (R6) şi apoi a probei poate fi verificată prin citire la spectrofotometru la 490 nm. Densitatea optică a fiecărui godeu ce conţine soluţie de antigen viral (R6) trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,500. După adăugarea probei, creşterea DO în fiecare godeu trebuie să fie cel puţin egală cu 0,100. Verificarea pipetării probei nu poate fi folosită în cazul agitării/omogenizării reactivului R6 cu proba. REMARCĂ : După adăugarea probei, solutia de antigen viral R6 virează de la culoarea roşie la portocaliu. VERIFICAREA PIPETĂRII CONJUGATULUI (R7) Remarcă: conjugatul (R7) este de culoare mov. Prezenţa în godeu a conjugatului (R7) poate fi verificată prin citire la spectrofotometru la 620 nm : valoarea DO a fiecărui godeu trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,500. VERIFICAREA PIPETĂRII SOLUŢIEI DE DEVELOPARE (R8+R9) Prezenţa soluţiei de developare în godeu poate fi verificată prin citire la spectrofotometru la 490 nm: valoarea DO a fiecărui godeu care conţine soluţie de developare trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,100 (o valoare DO mai scăzuta indică o pipetare inadecvată a soluţiei de developare). REMARCA: Exista o diferentă semnificativa de culoare între godeurile goale incolore şi cele în care s-a pipetat solutia de developare de culoare roz. 14 - PERFORMANŢELE ACESTUI TEST Performanţele testului Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS a fost determinată în 3 centre diferite prin testarea probelor de la donatori neselectaţi, de la pacienţi spitalizaţi, paneluri comerciale, paneluri de seroconversie şi paneluri post vaccinare. A - Studiul specificitătii Specificitatea testului evaluată la 561 de donatori neselecţionaţi a fost de 561/561 = 100% cu un interval de confidenţă (IC) de 95% [99,47% – 100%]. În plus, au fost testate 700 de probe (congelate sau nu) provenind de la pacienţi. S-a constatat că specificitatea a fost de 700/700 = 100%, IC 95% [99,57%-100%]. Au mai fost

Page 13: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

13 [RO]

testate 192 probe provenind de la pacienţi prezentând diferite stări patologice sau condiţii fără legătură cu hepatita A (femei gravide, factor reumatoid, anticorpi antinucleari, anticorpi anti-Ig de şoarece, sau alte infecţii virale sau bacteriene), în paralel cu un alt test EIA comercial. Concordanţa între cele două teste a fost de 191/192 = 99, 48%. Specificitatea în acest grup a fost de 95/95 = 100%. O probă provenind de la un pacient vaccinat antigripal a fost găsită pozitivă în testul EIA comercial alternativ şi negativă în testul Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS. B - Studiul sensibilitătii Studii de sensibilitate au fost efectuate pe un număr de 424 de probe pozitive de la donatori şi 1274 probe pozitive de la pacienţi provenind din 3 centre diferite. Un total de 1698 probe au fost testate cu Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS şi comparate cu test EIA comercial. Sensibilitatea obţinuta a fost de 100% atât pe probe de donatori cat şi pe pacienţi. 3 paneluri comerciale HAV de seroconversie şi 12 paneluri post vaccinare au fost de asemenea studiate şi comparate cu un alt test comercial EIA. Concordanta între cele 2 teste a fost de 100%. C - Precizia Rezultatele cantitative sunt exprimate în mUI/mL şi calibrate faţă de standardul internaţional de referinţă : WHO Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard 1998. Un studiu de corelaţie a fost realizat testând concentraţiile de 0, 10, 20, 40 şi 80 mUI/mL obţinute prin diluarea standardului internaţional OMS în paralel cu calibratori din trusă. Coeficientul de corelaţie ca şi panta dreptei de corelaţie obţinute sunt respective de 0,98 şi 1,04. D - Repetabilitatea şi reproductibilitatea testului Precizia testului Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS a fost determinata prin analiza a 4 probe: 1 probă negativăşi 3 probe pozitive anti-HAV (slab, mediu şi intens pozitivă). Repetabilitatea (intra-testare) a fost evaluată prin analiza celor 4 probe de 30 de ori în aceeaşi rundă de lucru. Reproductibilitatea (inter-testări) a fost evaluată prin analiza aceloraşi 4 probe în duplicat timp de 20 de zile, în 2 runde independente de lucru pe zi. Rezultatele sunt prezentate în tabelele următoare: Tabel 1: Repetabilitatea intra-testare

Proov Negativă Slab pozitivă Mediu pozitivă Intens pozitivă Media rapoartelor (r) 0,43 2,25 3,08 4,29 Deviaţia standard (DS)

0,02 0,15 0,19 0,19

CV (%) 4,87 6,50 6,29 4,47

Proov Negativă Slab pozitivă Mediu pozitivă Intens pozitivă Titru mediu 2,78 39,96 67,33 >80 Deviaţia standard (DS)

1,21 2,69 5,26 ND

CV (%) 43,53 6,72 7,81 ND

Page 14: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

14 [RO]

Tabel 2: Reproductibilitatea inter-testări

Proov Negativă Slab pozitivă Mediu pozitivă Intens pozitivă Media rapoartelor (r) 0,45 2,13 3,43 4,80 Deviaţia standard (DS) 0,03 0,29 0,33 0,49

CV (%) 6,31 13.68 9,61 10,23

Proov Negativă Slab pozitivă Mediu pozitivă Intens pozitivă Titru mediu 3,10 38,91 71,88 >80 Deviaţia standard (DS) 1,24 3,65 4,13 Δ/Ι

CV (%) 39,96 9,38 5,75 Δ/Ι 15 - LIMITELE TESTULUI Diagnosticul unei boli infecţioase nu poate fi stabilit numai pe baza rezultatului unei singure testări. La stabilirea unui diagnostic precis, trebuie să se ţină cont de anamnezăşi de simptomatologia pacientului, precum şi de ansamblul rezultatelor testelor serologice. Contaminarea bacteriană a probelor poate modifica valorile absorbţiei acestora. 16 - REFERINTE BIBLIOGRAFICE • Costa-Mattioli Mauro, Di Napoli A, Ferré V, Billaudel S, Perez-Bercoff R, Cristina

J : Genetic variability of hepatitis A virus. Journal of General Virology (2003), 84, 3191-3201

• Normann A, Jung C, Vallbracht A, Flehmig B : Time course of Hepatitis A Viremia and Viral Load in the Blood of Human Hepatitis A Patients. Journal of Medical Virology 9999 :1-7 (2003)

• Lutz G. Guertler : Virus safety of human blood, plasma, derived products. Thrombosis Research 107 (2002)S39-S45

• Jennifer A. Cuthbert : Hepatitis A : Old and New. Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2001, p. 38-58

• Morag Ferguson, Dawn Sands, Nico Lelie : Hepatitis A Immunoglobin : An International Collaborative Study to Establish the Second Intertional Standard. Biologicals Vol. 28, Issue 4, December 2000, p. 233-240

• World Health Organization, departement of communicable Disease Surveillance and Response : Hepatitis A. Who/cds/csr/edc/2000.7 (http://www.who.int/emc)

• Centers for Disease Control and Prevention (CDC) : Prevention of hepatitis A through active or passive immunization, recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP). MMWR october 01, 1999 /48(RR12) ;1-37

• Rosa M. Pinto, Juan F. Gonzalez-Dankaart, Gloria Sanchez, Susana Guix, M. Jose Gomara, Monica Garcia, Isabel Haro, Albert Bosch : Enhancement of the immunogenicity of a synthetic peptide bearing a VP3 epitope of hepatitis A virus. FEBS Letters 438 (1998) 106-110

• Stanley M. Lemon : Type A viral hepatitis : epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemistry 43 :8(B) 1494-1499 (1997)

• Stanley M. Lemon and Leonard N. Binn : Serum neutralizing antibody response to hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseseases Vol. 148, no. 6 December 1983

Page 15: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

15 [RO]

• Bertram Flehmig, Michael Ranke, Hans Berthold, Hans-Joachim Gerth : A Solid-Phase Radioimmunoassay for Detection of IgM Antibodies to Hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseases Vol. 140, no. 2 August 1979

Page 16: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

16 [RO]

Page 17: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

17 [RO]

Page 18: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

18 [RO]

Page 19: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

19 [RO]

Page 20: Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plăci - 192 72481 · 4 Conjugatul enzimatic în exces este îndepărtat printr-o etapă de spălare, apoi se adaugă în fiecare godeu o soluţie

20 [RO]