Modalités d’Imageries en Microscopie

optique

Yves MELY UMR 7213 CNRS, Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie

ILLKIRCH, France (yves.mely@unistra.fr)

Illkirch, Octobre 12, 2011

Atomes Microscopie à effet tunnel,

“field ion microscope” FIM

Niveau

atomique

Molécules Microscopie à effet tunnel,

à champ proche AFM

Niveau

moléculaire

Ultrastructure

cellulaire, virus,

macromolécules

Microscope électronique Morphologie

sub-

microscopique

Cellules isolées Microscope photonique

contraste de phase,

confocal

Cytologie

tissus Microscope photonique Histologie

Organes, petits

organismes

Oeil loupe Anatomie

Tissu Observation But

Quelle microscopie pour quoi faire?

1mm

100µ

10µ

1µ

0,1µ

10nm

1nm

1A

Taille

Diffraction : Sin = /d

L’image

d’un point

Résolution :

dm = 0,61 / sin

Résolution

Diffraction: image d’un point par une

lentille (objectif) est un disque d’Airy.

Distance minimale dm entre 2 points pour qu’ils apparaissent séparés

= Rayon du disque d’Airy. Objectif d’ ON =1,4 et =500 nm: dm =

216 nm (en xy). dm quand et ON

Sources de lumière

acquisition d ’images photos classiques ou photos numériques

lampe halogène-tungstène

condenseur et sa tourelle

platine orientable

Objectifs sur le revolver

oculaires

Eléments d’un microscope droit

Le microscope inversé

Lampe halogène condenseur platine lampe à épifluorescence objectifs blocs filtres pour fluo

Sortie caméra Oculaires

Les objectifs

Objectifs

Les rayons convergent en un seul point = focale de la lentille

Objectifs : constitués de lentilles convergentes

Equation des opticiens: 1/f’ = (n-1)(1/R1 + 1/R2)

f

n = indice de réfraction de la lentille

1 = indice de réfraction de l’air

R1 et R2 = rayons de courbure

des faces de la lentille

OAOAOFf

1

'

1

'

11Relation de conjugaison:

Ouverture Numérique d’un objectif

Cône de

lumière

ON = capacité de l’objectif à récupérer

la lumière émanant de l’objet

ON = n sin

Lamelle

objet

lame

n = indice de réfraction du milieu (l ’air

ici) entre le front de l ’objectif et la lamelle

Les objectifs à sec

S ’il y a forte réfraction, peu de rayons traversent l ’objectif

1 2

3

4

5

si n diminue……….

……… l ’angle de réfraction augmente

ni sini = nr sinr

Objectif : n= 1,55

Air : nair 1,0003

Lamelle nverre 1,55

objet

lame

Les objectifs à immersion

S’il y a faible réfraction, l’objectif capture plus

de rayons lumineux

ON max = (1,52) = 1,4

Intérêt des objectifs à immersion, de grande ON

1 2 3 4 5 Objectif : n= 1,55

huile : nhuile 1,52

Lamelle : nverre 1,55

objet

lame

Distance de travail du front de l ’objectif à la surface de lamelle quand l’objet est dans le plan focal.

a

Lamelle objet lame

WD en mm).

Caractéristiques des objectifs Distance de travail

Grandissement, ouverture numérique et distance de travail

Lamelle objet lame

7°

x10

20°

x20

60°

x63

WD diminue quand le grandissement augmente.

Caractéristiques des objectifs

Les aberrations chromatiques des lentilles

Lentille standard bleu > vert > rouge => séparation des ondes

Aberrations sphériques

Lumière mono-chromatique

l’image d’un point source n’est pas un point, mais une tâche = « cercle de moindre confusion ».

1 2 3

Aberrations optiques

Objectif plan apochromate

Correction des aberrations

chromatiques et sphériques :

tout le champ est net

les 3 couleurs focalisent au même point

Les différents types d ’observation en microscopie optique

Observation en fond clair

Observation en fond noir

Observation en contraste de phase

Observation en lumière polarisée

Observation en DIC (contraste

interférentiel différentiel)

Tissu contrasté, coloré ou non

structures fines et/ou réfléchissant la

lumière

Tissu peu contrasté, très peu coloré ou

non (coupes fines)

Tissu à propriétés biréfringentes

Cellules vivantes ou fixées non

colorées

structures ou produits autofluorescents

ou marqués par des sondes

fluorescentes

En lumière transmise

En épifluorescence

Le trajet optique en lumière transmise

observateur

oculaires

tube optique

objectif

platine-objet

diaphragme d’ouverture

condenseur

diaphragme de champ

lentille collectrice

source de lumière

Microscopie en fond clair

Pour qu'un objet puisse être visualisé → transparent à la lumière visible échantillons très fins.

Echantillons biologiques difficiles à observer car les différents constituants de la cellule absorbent la lumière de manière à peu près égale → images peu contrastées.

Microscopie en fond clair, car source lumineuse pour éclairer l'objet.

On utilise des colorants qui se fixent +/- sélectivement à certaines structures permettant ainsi de les visualiser.

Pour cellules vivantes, techniques de coloration fortement perturbantes.

Microscope à contraste de phase Ne nécessite pas de colorants et s’applique aux cellules vivantes.

Légères d'indice de réfraction ou d'épaisseur entre différentes zones de l'objet ou entre l'objet et le milieu qui le baigne sont converties en intensité lumineuse.

Lumière retardée dans milieux d'indice de réfraction élevé → une partie des ondes lumineuses qui traversent l'objet est réfractée et déphasée par rapport à la partie qui n'a pas traversé l'objet.

Déphasage proportionnel à la différence d'indice de réfraction et à l'épaisseur de l'objet traversé.

Lumière incidente traverse diaphragme annulaire et focalisée en anneau circulaire sur l'objet.

Lumière qui ne traverse pas l'objet reste intacte et est focalisée par l'objectif sur l'anneau gris épais de la plaque de phase qui absorbe une partie du faisceau et change sa phase.

Quand objet réfracte ou diffracte la lumière modification de la phase et déviation des ondes lumineuses vers région mince de la plaque de phase.

Ces ondes interfèrent avec faisceau d'ondes non réfractées. Image finale constituée de différents degrés de brillance ou d'extinction en fonction de l'indice de réfraction de chaque point de l'objet.

Microscope àcontrastede phase

Images beaucoup plus contrastées qu’en fond clair.

Microscope àcontrastede phase

DIC permet de percevoir des différences de structure fine dans les cellules.

Microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC)

Microscopie de fluorescence

acquisition

d ’images photos

classiques

ou

photos

numériques

lampe halogène-

tungstène

condenseur

et sa tourelle

platine orientable

Objectifs sur

le revolver

oculaires lampe à épifluorescence

lampe HBO

filtre

an

tica

loriq

ue

filtre

in

fra

-ro

ug

e

dia

ph

rag

me

de

ch

am

p

filt

re d

’excit

ati

on

miroir dichroïque

filtre d ’émission

objectif

échantillon

oculaires

Trajet optique en épifluorescence

Trajet optique dans un microscope inversé

Filtres à l’émission

1. Short pass

2. Long pass

3. Narrow pass

4. Band pass

3

1 2

4

% transmission

On sélectionne la zone spectrale d’observation avec des filtres

Fluorescence directe :

- présente dans les cellules vivantes => auto-fluorescence.

Ex : chlorophylle,

composants des parois,

vitamines, résines.

- les fluorochromes peuvent se lier spécifiquement à des

macromolécules in vivo.

Ex : Dioc6 pour le réticulum,

Dapi pour l’ADN,

mitotracker pour les mitochondries.

phalloïdine pour la F-actine

Microscopie de fluorescence

- ADN :

iodure de propidium, YOYO, Syto16,

chromomycine A3, mithramycine; DAPI,

Hoechst, DRAQ5, TOTO3

- mitochondrie : sensible au potentiel membranaire

Rhodamine 123, DiOC6(3), DiOC7(3),

JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-

fixation possible)

- membranes :

FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers

anticorps de surface

- Viabilité : FDA, exclusion d’iodure de

propidium,… morphologie, avec DIC

- réticulum endoplasmique:

(non spécifique) DiOC6(5), GFP-taggée

- appareil de Golgi : GFP-taggée,

anticorps, NBD-C6-ceramide (pas pour

végétaux)

- dépendance envers le pH :

carboxy-SNARF-1, BCECF

- dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed,

CalciGreen, Indo-1, Cameleon

- divers :

Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer

Yellow, chlorophylle,

Principaux fluorochromes

Fluorescence directe :

Microscopie de fluorescence

Mitotracker: marquage des mitochondries.

LysoSensor: marquage des lysosomes.

Microscopie de fluorescence

aFluorescence indirecte :

• Les fluorochromes peuvent être couplés à des marqueurs

spécifiques des macromolécules d’intérêt.

Ex : anticorps pour des peptides et protéines.

ge des anticorps

Marquage des cellules

Les Ac ne rentrent pas dans la cellule: fixation et perméabilisation

Protéines fluorescentes Travail sur cellules vivantes: protéines de la famille des GFP (Green Fluorescent Proteins). Protéine de méduse. Chromophore formé de 3 acides aminés modifiés post-traductionnellement.

Par biologie moléculaire, on peut coupler le gène de la GFP au gène de n’importe quelle protéine pour faire exprimer à la cellule une protéine chimère fluorescente dont on pourra suivre la localisation, le trafic intracellulaire, les interactions…. Possibilité de marquages multiples.

Marquages multiples en épifluorescence

Cellules épithéliales de rein d’opposum

Fluorescéine ou Cy2 ou Alexa 488

rhodamine ou texas red ou Cy3 ou Alexa 568

Cy5 ou Alexa 633

Mettre le schéma de l’appareil, donner les résultats sur cellules fixées avec les Antigènes, puis parler des cellules vivantes avec les GFP.

Limite importante: mélange d'images provenant de différents niveaux de l'objet.

Solution: microscopie confocale.

Marquages multiples en épifluorescence

Microscopie confocale

Mettre le schéma de l’appareil, donner les résultats sur cellules fixées avec les Antigènes, puis parler des cellules vivantes avec les GFP.

Excitation: faisceau laser

et système de balayage.

Coupes optiques de l’objet. Balayages successifs des différents plans focaux.

L’image confocale est reconstruite point par point. Résolution peu améliorée

mais détails mieux perçus.

Trou confocal (pinhole) rejette

la lumière en dehors du plan

focal. Pinhole conjugué avec

le plan focal défini par le laser

et le scanner.

Microscopie confocale

Mettre le schéma de l’appareil, donner les résultats sur cellules fixées avec les Antigènes, puis parler des cellules vivantes avec les GFP.

Champ large

confocal

Moelle

humaine

Fibres

musculaires

de lapin

Pollen

Microscopie confocale

Mettre le schéma de l’appareil, donner les résultats sur cellules fixées avec les Antigènes, puis parler des cellules vivantes avec les GFP.

Coupes en Z à travers

un grain de pollen tous

les 3 µm. On peut

reconstruire l’image du

volume entier.

- Longueurs d’onde d’excitation limitées avec les sources laser habituelles.

Difficulté d’exciter dans l’UV. - Photoblanchiement et phototoxicité importante du fait des faisceaux

lasers intenses nécessaires pour générer une fluorescence exploitable.

- Coût élevé de la technique.

Microscopie multiphotonique

1-ph

2-ph

Excitation 2 photons: laser femtoseconde

Microscopie multiphotonique

photoblanchiement

phototoxicité

sensibilité

profondeur

Gde séparation entre

excitation et émission

Excitation simultanée

de plusieurs sondes

Résolution similaire

Microscopie multiphotonique

Images of acid fucsin stained monkey kidney at a depth of 60 µm by confocal (left) and multiphoton microscopy (right). The confocal image shows a significant increase in

local background resulting in a lower contrast image. However, the multiphoton image maintains contrast even at significant depths within a light scattering

sample.(Biophysical J., 1998,75:2015)

DAPI (DNA), PATMAN (membranes) et TMR (mitochondies)

- Contrast: autofluorescence, light diffusion, overexpression

- Labeling: size, effect on protein structure and function, photobleaching

- Fluorescence intensity = relative measurement instrumentation and concentration dependent

A B

Limites de la microscopie de fluorescence

- Résolution

Fluorescence lifetime imaging Microscopy(FLIM)

Mesure des temps de vie des fluorophores pour chaque pixel de l’image

du microscope.

Source: laser

Sample

Detector

Filter

t

t

Decay curve

t (ps)

Lifetime

Fluorescence lifetimes are absolute parameters, independent of instrumentation and concentration.

FRET

Transfer of Energy

YFP CFP

X Y ( Donor )

( Acceptor )

Mesures de FRET par FLIM

FRET si les sondes sont à moins de 10 nm preuve directe d’une interaction.

En microscopie confocale, colocalisation de deux protéines marquées ne

prouve pas leur interaction: résolution > 200 nm

Superposition Ov GFP-Protein A -Protein B-TRed Superposition

( Donor ) CFP

2 ns

( Donor ) CFP YFP ( Acceptor ) + 2 ns

CFP YFP FRET

7 aa

1.3 ns

FRET intramoléculaire

CFP YFP Lower

FRET

17 aa

1.7 ns

Vpr forms multimers at nuclear membrane.

Vpr oligomerisation

(Fritz et al, Retrovirology, 08)‏

Vpr-eGFP E = 1- tDA/tD

1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.00

10

20

30

40Vpr-GFP + mCherry-Vpr

pix

els

va

lue

s

Lifetime T (ns)

1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.00

10

20

30

40

50

Vpr-GFP-

Vpr-eGFP + Vpr-mCherry

23%

L23F

1st helix

Q44

2nd helix

L67A

3rd helix Q3R

N-terminal

R90K

C-terminal

W54G

Outside helix

N

C

Q3

W54

R90

L23 L67

Q44

Roques et al, 1997, Schuler et al 1999 , Morellet, N., et al., 2003

Aminoacids in the helices are

involved in the formation of the

oligomers

Vpr oligomerisation

FLIM in leaves: tubule formation in plamodesmata

In leaves, MP subunits of Grapevine

Fanleaf Virus (GFLV) interact in the

tubules and the base of the tubules

interact with the PD protein Pdlp1 .

3ns

1ns

+

Tubule base: 1.82ns

Pdlp1:RFP GFP:2B

(Amari et al, Plos microbiol, 2010)‏

Plasmodesmata are pores for intercellular communication between cells in plants. They allow the passage of viruses, which employ movement proteins (MPs)

Combinaison FLIM/multiphoton Mesure du pH dans le Stratum Corneum (SC)

Combinaison FLIM/multiphoton

Combinaison FLIM/multiphoton

Combinaison FLIM/multiphoton

Combinaison FLIM/multiphoton

Combinaison FLIM/multiphoton

Microscopie TIRF (Total internal reflexion microscopy)

Si > c, réflexion interne totale. Néanmoins faible quantité de lumière traverse l’interface créant un champ E qui se propage dans une région limitée proche (100 nm) de l’interface (onde évanescente).

Excitation of fluorophores in the bulk of the specimen is avoided, a much higher signal-to-noise ratio is achieved compared to conventional widefield epifluorescence illumination: detection of single-molecule fluorescence.

Single particle tracking : TIRF microscopy

TIRF microscopy

Gag-eGFP 10 s

50 ms/frame

Gag-eGFP

Résultats: les différentes trajectoires observées

Representative motions

Motion out of plane

Motion in plane

Low amplitude High amplitude Directed motion

500 nm 500 nm 500 nm

500 nm

Single particle tracking : TIRF microscopy

- « Spot Tracker 2D » ImageJ: x and y coordinates as a function of t

15 µm

0 10 s

0,8 0,4

1,2

0,3

0,6

0,9

0 X

Y

Pixel

Pix

el

<R2> = f (t);

B

C

D

Temps (s)

Dépla

cem

ent quadra

tique m

oye

n (

µm

2)

10-6

A

[A-B]: D= 2,21 x 10-5 µm2/s

[C-D]: D= 7,41 x 10-4 µm2/s

X

Y

0

2

4

2 4

[A-B]: D= 2,46 x 10-5 µm2/s

[C-D]: D= 4,01 x 10-3 µm2/s

Kinetic motions of the Viral like particles

Gag-eGFP

195 fluorescent complexes

High resolution fluorescence microscopy

Dye with controlled emission

[O2]

[MEO]

+

+

STORM(stochastic optical reconstruction microscopy ) Collection of isolated events in the sample: Fluorophore with controlled

emission

Analysis of all series of events to localize each fluorophore with nanometric precision: Reconstruction of the image

0

40

80

120

160

200

240

280

05

1015

2025

510

1520

25

Ph

oto

ns

X DataY axis

Prism-type TIR 0.2 sec integration

Z-Data from Columns 1-21

center

width Position of the centre =

width/√N = 250 nm / √104 = 2.5

nm

STORM(stochastic optical reconstruction microscopy ) Collection of isolated events in the sample: Fluorophore with controlled

emission

Analysis of all series of events to localize each fluorophore with nanometric precision: Reconstruction of the image

center

width Mitochondries et microtubules

Limites: technique lente

Cryo-prepared thin section from a COS-7 cell expressing the lysosomal transmembrane protein CD63 tagged with the PA-FP Kaede. In an obliquely cut region (D), the distribution of CD63

within the membrane plane can be discerned.

TIRF PALM

Mitochondria in a cryo-prepared thin section from a COS-7 cell expressing dEosFP-tagged cytochrome-C oxidase import sequence. Betzig et al, Science 313, 2006

PALM application (photoactivable FPs)

TEM PALM/TEM

STED (Stimulated emission depletion)

1

2

3

4

S0

S1 Absorption

Fluorescence

t≈‏ns

Depletion

t≈100‏ps

Stimulated

I IS

r

)1(2sI

INA

r

Is r

Stephan Hell, Göttingen

Synaptic vesicles

Resolution ~ 20-60 nm Acquisition time: <1 min

Difficulties: two pulsed lasers synchronised, cost

STED