Histochemie 29, 213--219 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Mise en 6vidence par immunofluorescence des cellules s6cr6trices de glucagon dans le pancr6as endocrine

du Poisson t616ost6en Xiphophorus helleri H.*

Cather ine Kle in

Laboratoire de Zoologie et d'Embryologie exp6rimentale, Universit6 Louis Pasteur, Strasbourg, France (Directeur: Prof. J. H. Vivien)

Ra iner H. Lange

Anatomisches Institut der Universit~it, GieBen, Deutschland (Direktor: Prof. Dr. A. Oksche)

Regu le 8 d6cembre 1971

Immunof luo rescen t Demons t r a t i on of Glucagon Secret ing I s l e t Cells in the Bony F i sh Xiphophorus helleri H.

Summary. By immunofluorescence technique performed on material embedded in epoxy- resin, glucagon containing islet cells were demonstrated in the teleost, Xiphophorus helleri H. Rabbit anti-pig glucagon serum was employed. Correlative tryptophan DMAB-nitrite staining shows that only some of the immunofluorescent glucagon cells are positive; this discrepancy is discussed.

Rdsumd. La technique d'immunofluorescence d6montre l'existence de cellules s6cr6trices de glucagon dans l'ilot pancr6atique endocrine du Poisson t616ost6en Xiphophorus helleri H. La r6action est faite sur du mat4riel fix6 et inclus pour la microscopic 61ectronique, avec un s6rum de lapin anti-glucagon de porc. Le tryptophane est mis en 6vidence sur les coupes ad- jacentes par la r6action au DMAB-nitrite; un certain nombre de cellules fluorescentes sont n6gatives pour cette r6action. La diff6rence entre les r6sultats dorm6s par les deux techniques est discut6e.

Introduction

L'exis tence , dans le pancr6as endocr ine des Vert6br6s, des cellules s6cr6trices de glueagon (cellules A2) n ' es t p lus raise cn doute ~ l 'heure actuelle. Diff6rentes techniques de colorat ion du t r yp tophane , bas6es sur l ' exis tence du noyau indol, comme celle b~ la p -d im6thy l -aminobenza ld~hyde-n i t r i t e selon Adams , on t 6t6 utilis6es pour les me t t r e en 6vidence. N6anmoins, les 6tudes h is tochimiques plus pr6cises, qui, pa r exemple , impl iquen t des r6actions immunologiques , sont tr6s rares, su r tou t chez les Vert6br6s inf6rieurs. Chez la Grenouil le (Lange, 1971) et chez les Rept i les (Lange, Klein et T randaburu , r6sul ta ts en cours de publ icat ion) , la technique de A d a m s p e r m e t de colorer deux cat6gories de cellules, d is t inctes des cellules B, don t l '6 tude pa r immunofluorescence mont re que les unes cont iennent du glucagon immuno-r6act i f , alors que les au t res n ' en cont iennent pas.

* Travail r6alis6 grace ~ raide du Deutscher Akademischer Austauschdienst et de la Deutsche Forschungsgemeinschaft. Nous exprimons nos vifs remerciements s la firme Novo (GmbH, Mainz) qui nous a fourni le s6rum anti-glucagon.

214 C. Klein et R. H. Lange:

F a l k m e r (1966), T i t l b a c h (1968), Fa l l e r e t L a n g e (1969) o n t d~mont r~ la pre-

sence de t r y p t o p h a n e dans ce r ta ines cel lules du panc rea s endoc r ine des Poissons

t~l~ost~ens. Mais le p rob l~me de l ' i den t i t~ de ces cellules e t des cellules c o n t e n a n t

du g lucagon i m m u n o - r ~ a c t i / r e s t a i t ~ rSsoudre. N o u s p r4sen tons ici unc ~tude

c o m p a r a t i v e des r~sul ta t s ob tenus , chez le Po i sson t~l~ostSen Xiphophorus helleri H. , apr~s r~ac t ion i m m u n o - h i s t o c h i m i q u e e t co lo ra t ion du t r y p t o p h a n e ,

sur des coupes s~ri~es de t issus inc lus dans des r~sines p l a s t i ques (Lange, 1970).

Materiel et m~thodes

Notre ~tude porte sur des poissons adultes, males et femelles, de l'esp~ce Xiphophorus helleri H.

a) Fixat ion

Les animaux sont sacrifi~s par d~capitation. L'ilot pancr~atique endocrine, de la grosseur d'une t~te d'~pingle, est fix~ dans une solution de glutarald~hyde soit ~ 2 %, soit s 3 % dans le tampon cacodylate 0.1 M s pH 7,2 pendant 35 minutes. Apr~s 3 bains, de 10 minutes chacun, dans le tampon additionn~ de saccharose (3%), les pi~ces sont deshydrat~es h l'alcool et incluses dans l'araldite (Prochal, Lyon).

b) Colorations

Des coupes semi-fines de 1 ~ et de 0.5 ~, ainsi que des coupes ultra-fines sont faites 5. l 'ultramicrotome Reichert Om U 2 et recueillies sur des lames porte-objet de verre. L'immuno- fluorescence et la coloration du tryptophane sont faites sur des coupes s6ri6es.

Immuno/luorescence. La technique employ6e est une technique de fluorescence indirecte (voir comme article de r6f6rence Holborow et Johnson, 1969). Les s6rums utilis6s sont dilu6s 1 : 20 dans une solution de NaC1 5, 0.85% dans un tampon phosphate 0.004 M (pH 7).

S6rum I: s6rum de lapin anti-glucagon de porc (s6rum K 52, Heding, 1969); S6rum I I : s6rum normal de lapin; S~rum I l I : 7-globulines de ch~vre anti-lapin, marqu6es ~ l 'isothyocyanate de fluoresc~ine

(Farbwerke Hoechst, Frankfurt/M). Les coupes color6es sont des coupes semi-fines de 0.5 ~z et des coupes ultra-fines. Avant l'application des s6rums, l'araldite est dissoute au m6thoxyde de Na (Mayor et al., 1961). Les coupes, amen~es s l 'eau distill6e, sont ensuite s6ch6es pendant 10 ~ 15 minutes dans une 6tuve s 37 ~ L'application des s6rums se fait sur lame, en chambre humide s 37 ~ pendant 20 minutes, le rin~age en cuve, s l~ temp6rature du laboratoire, pendant 10 minutes. 4 s6ries de coupes sont utilis6es: A, B, C, D.

Sdrie A, incubation sp6cifique (fig. l a et b): 1: s6rum I; 2: rin~age; 3: s~rum I I I ; g: rin~age; 5: s6chage des coupes ~ l 'air; 6: montage dans la glyc6rine tamponn6e (glyc6rine

10% dans la solution de Na CI tamponn6e). Les s6ries B, C, D servent de t6moins. Sdrie B (fig. 1 c): 1: s6rum I I ; 2--6: identiques s la s6rie A. Sdrie C (fig. 1 d): les 6tapes 1 et 2 sont omises. Sdrie D (fig. I e) : les coupes, qui n'ont subi aucun traitement, sont mont6es s la glyc6rine

tamponn6e et servent s tester la fluorescence primaire.

Fig. 1 a--e. Ilot endocrine-technique d'immunofluorescence, a - -e : coupes s6ri6es; a, b s6rum I ~-s6rum I I I ; c s6rum l I Jr s6rum I I I ; d s6rum I I I ; e fluorescence primaire. Fluorescence marqu6e des cellules s6cr6trices de glucagon, aussi bien sur la coupe ultra-fine (a) que sur la coupe semi-fine (b); on remarque quelques cellules fluorescentes isol6es, plus centrales (~). Sur les coupes t~moins (c, d, e), les seuls 616ments nettement fluorescents sont les 6rythro-

cytes (~). E cellules pancr6atiques exocrines. • 240

~mmunofluorescence dans le pancr6as endocrine 215

Fig. 1 a-e

216 C. Klein et R. H. Lange:

Coloration du tryptophane. Les coupes de 1 ~z sont color~es ~ la p-dimgthylaminobenzald6- hyde-nitrite de Na (DMAB-nitrite), d'apr~s Adams (Pearse, 1960), ou d'apr~s Glenner (Gabe, 1968).

c) Photographies Les coupes color~es au DMAB-nitrite sont photographi~es sur fond clair et en contraste

de phase. Les s~ries de coupes A s D sont observ~es s l'aide d'un microscope s fluorescence Zeiss (lumi~re transmise et fond clair). Les filtres suivants sont utilis~s: filtres excitateurs UV BG12-BG38 et filtre d'arr~t 50. Les cliches sont pris avec un film Kodak Tri-X Pan et d~velopp~s dans un r~v~lateur Emofin (Tetenal, Hamburg). Ceci permet des temps de pose de 1 minute seulement; il faut noter que, au cours de l'exposition au faisceau lumineux, la fluorescence diminue tr~s rapidement.

RSsultats

I mmuno/luorescence

Sdrie A (fig. 1 a e t b). Los cellules fluorescentcs sont essentiel lement groupies la p~riph~rie de l ' f lot; quelques cellules isol6es peuven t s 'observer dans la r~gion

centrale. On remarque que la fluorescence est aussi ne t te sur la coupe ul tra-f ine que sur la coupe semi-fine de 0.5 Ex.

Sdries tdmoins (fig. I c, d, e). Dans ces trois s~ries, les seuls ~16ments fluorescents sont les ~rythrocytes contenus dans les capfllaires. La fluorescence que nous observons apr6s appl icat ion du s6rum anti-glueagon, mise en regard des r6aetions par fa i tement n6gatives des trois sgries de coupes t~moins, permet de d6finir la pr6sence de glueagon immuno-r6act i f dans les eellules loealis6es dans la zone ex- terne de l ' ilot.

Comparaison avec les rdsultats donnds par la coloration du tryptophane

La comparaison des r~sultats obtenus avec les deux techniques souligne l'h~t~rog~n~it6 de la popula t ion des cellules immuno-rdact ives (fig. 2). La r~action de Adams int~ressc un pet i t nombre de cellules, situ~es tou t ~ fait ~ la p~riph~rie

Fig. 2 aet b. R~action de Adams et immunofluorescence; zone p6riph~rique de ]'ilot. a R6action de Adams, observ~e en contraste de phase; les cellules positives, qui sont bleues sur fond clair, apparaissent sombres en contraste de phase (1 s 5). • 670. b Coupe adjacente trait~e avec les s~rums I e t I I I . • 600. Certaines cellules sont positives pour les 2 r~actions (1 ~ 5), d'autres

seulement pour l'immunofluorescencc (fl~ches)

Immunofluorescence dans le pancr6as endocrine 217

de l'ilot (la m6thode de Glenner donne des rTsultats identiques). Les autres cellules, fluorescentes, mais nSgatives pour la r6action au DMAB-nitrite, sont localis6es dans une zone plus interne.

Discussion

Diff6rentes techniques histologiques, histochimiques et pharmacologiques ont 5t6 utilis6es pour la caract6risation des cellules qui synth6tisent le glucagon (voir comme article de rTf6rence Bussolati et al., 1971). La technique d ' immuno- fluorescence que nous avons appliquSe chez le Xiphophore pr6sente une grande sp6cificitT; en effet, tous les tests de contrTle sont nSgatifs. Un test de contrTle supplSmentaire pour le s6rum anti-glucagon employ5 ici (s6rum I) a 6t6 fait chez la Grenouille : le s6rum I e s t remplac6 par un s6rum anti-glucagon de porc, pr6ala- blement incub6 avec du glucagon de porc; dans ce cas, la fluorescence des cellules A2 est tr~s affaiblie (Lange, 1970). Nous pouvons conclure que nous mettons en 6vidence des cellules immuno-r6actives au s6rum anti-glucagon de porc, d6finies comme cellules A2. L 'aspect physiologique du probl6me est plus complexe. Los auteurs qui ont essay5 de d6montrer que les cellules A 2 lib6rent dans la circulation un principe hyperglycSmiant n 'ont pas apport6, jusqu'~ ce jour, de preuves totalement convaincantes.

Les techniques de coloration du t ryptophane sont employ6es pour caract4riser les cellules ~ glucagon. On salt que le t ryptophane entre dans la constitution de la molTcule de glucagon (Dayhoff, 1969). Selon Cavallero et al. (1968), ces techni- ques (DMAB-nitrite et xanthydrol) pr6sentent une grande sp6cificit6 pour la mist en 6vidence du glucagon. Bussolati et al. (1971) soulignent l'identit6 des cellulcs r6vT16es par ces techniques et par l 'immunofluorescence. Cependant, chez les Batraciens, (Lange, 1971) et chez les Repliles (Lange, Klein et Trandaburu, r6sultats en cours de publication), le nombre des cellules positives s la r6action de Adams est sup6rieur s celui des cellules immuno-rSactives: les cellules A 1 sont 6galement color6es, quoique plus faiblement que les cellules A2. Cavallero et al. (1968) signalent quc, dans certains cas, les cellulcs D (cellules A1) r6agissent tr~s faiblement. Les observations que nous rapportons ici soulignent la disproportion inverse: chez le Xiphophore, le nombre des cellules positives ~ la rSaction de Adams est inf6ricur s celui des cellules immuno-rSactives. Si on consid6re la varia- bilit6 des r~sultats, il semble difficile d'accorder ~ la mTthode de Adams une tr~s grande sp6cificit6 pour la caractTrisation des cellules A2.

Nous ne pouvons peut-6tre pas exclurc d'cmblTe l 'hypothbse que la substance, dont la pr6sence entraine la fluorescence des ccllules n6gatives ~ la r6action de Adams, ne soit pas du glucagon, mais une autre substance prot6ique, 4galement r6active au s~rum anti-glucagon de porc. En effet, on ne connait pas la localisation exacte des sites r6actifs aux anticorps dans la mol6cule de glucagon. Certaines sSquenccs d'acides amin6s de la mol6cule de glucagon se retrouvent dans d 'autres substances protTiques, comme par exemple la s6crStine (Dayhoff, 1969). La pr6sence des mSmes sites r6actifs dans une autre substance que le glucagon entrai- nerait une r6activit6 analogue des cellules qui la contiennent. On peut aussi avancer l 'hypoth6se que, chcz le Xiphophore, il existe deux formcs de cellules qui synth~tisent le glucagon; leur immuno-rTactivit6 est identique. La prcmi6rc

218 C. Klein et R. H. Lange:

con t iendra i t une forme mol~culaire de glucagon qui r6agit au DMAB-ni t r i t e , la seconde une forme qui ne r~agit pas ; la diff6rence peu t rgsider dans la s t ruc ture te r t ia i re de la m6me molecule prot~ique, qui dans le second cas serai t tel le que les sites r~actifs au DMAB-ni t r i t e soient masqu6s.

Les gtudes de l ' immunofluorescence des cellules A glucagon p o r t e n t en g6ngral sur du matgr ie l inclus A la paraff ine (Lomsk~ et al., 1968, 1971 ; Bussola t i et al., 1971). L ' un de nous a montr~ qu ' i l g ta i t possible de r6aliser cet te technique sur des t issus fixgs et inclus pour la microscopie ~lectronique (Lange, 1970). I1 semble que, pour le Xiphophore comme pour la Grenouille, la fluorescence soit meil leure quand la r6act ion est fa i te apr~s dissolut ion du milieu d ' inclus ion au m~thoxyde de sodium. I1 faut r emarque r que la fluorescence est aussi ne t te sur les coupes ul t ra-f ines que sur les coupes semi-fines de 0.5 [z, ce qui est ~galement le cas chez la Grenouille et le R a t (Lange, 1970); la quant i t~ de glucagon pr~sente dans la coupe ne semble pas in te rveni r d i r ec tement dans l ' in tensi t~ de la r~act ion de fluorescence. La possibili t~ de r6aliser les rgact ions d ' immunof luorescence sur du matgr ie l pr6parg pour la microscopie 61ectronique pr~sente l ' int6rSt de pe rme t t r e la correla t ion de ces ~tudes his tochimiques avec les observa t ions u l t r a s t ruc tu ra le s ; ee t r ava i l est en eours.

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Professor Dr. R. Lange Anatomisches Institut der Universit~t D-6300 GieBen Deutschland

Catherine Klein Laboratoire de Zoologic et d'Embryologie exp6rimentale 12, rue de l'Universit6 F-67 Strasbourg France