BIOCHIMIE, 1971, 53, 303-306.

Mise en dvidence des activitds ribonucldasiques et ddoxyribonucldasiques apr6s 61ectrophor se en acrylamide-agarose,

par Josette BEnGEs et Jos6 URIEL.

Institut de Recherches Scienti[iques sur le Cancer, 91~ - Villejui[, France. (I~-2-1971/20-~-1971)

Summary. - - A method for the characterization of endonucleases after electrophoresis in aerylamide-agarose composite gels is described. The procedure consists in the use of two gels with different sieving properties : a small pore gel (aerylamide-agarose) for the electrophoresis and a large pore gel (agarose) for the catalytic reaction.

The technique allows the detection of endonuclease activity on natural or synthetic polynucleotides of high molecular weight and has been applied to the demonstration of ribonueleases and deoxyHbonueleases from different origin.

II y a quelques ann6es, une technique de carac- t6risation des ribonucl6ases aprSs 6tectrophorSse en g61ose a 6t6 d6crite par r u n d 'entre nous [1] et plus rdcemment, le m6me proc6d6 a 6t6 adapt6

l'61ectrophor6se en gel de polyacrylamide [2].

Chacune de ces techniques pr6sente des incon- v6nients qui l imitent le champ de ses applica- tions. Darts le cas de la g61ose, la technique, bien que tr6s sensible, s'av6re inad6quate pour la caract6risation des pr6parat ions r ibonucldasiques de faible activit6 sp6cifique, ce qui est g6n6rale- ment le cas des extraits t issulaires ou des l iquides biologiques. En ce qui concerne la polyacryl- amide, la petite taille des pores dans ce gel est incompatible avec la p6n6trat ion des grosses mo- l~cules de polym6res. De ce fait, l 'activit6 de ren- zyme ne peut 6tre d6montr6e qu 'en pr6sence des ARN fortement d6polym6ris6s.

Le proc6d6 que nous ddcrivons, ci-dessons, a 6t6 d6velopp6 pour pal l ier /~ ces l imitations. La s6paration 61ectrophor6tique de r6chant i l lon 6tu- di6 est faite dans un gel mixte d 'acrylamide-aga- rose [3]. Celui-ci est ensuite mis en contact avec une plaque de gel d'agarose contenant le mil ieu rdactionnel : substrat, sels, tainpon, etc.. Apr6s nn certain temps d ' incubat ion, pendant lequel les enzymes de l '6chanti l lon diffusent dans le gel r6actionnel oil a lieu l 'hydrolyse du substrat, les deux gels sont s6par6s. Sur le gel r6actionnel cst caract6risde l 'activit6 nucl6asique, landis que le gel d 'acrylamide-agarose sert pour la coloration des protdines du m61ange. Le m6me pr inc ipe a 6t6 appliqu6 h la raise en 6vidence aussi bien des ribonucl6ases (RNases) que des d6oxyribonu- cl6ases (DNases).

MATI~RIEL

L'acide r ibonucl6ique (ARN) de levnre prove- nai l de SCH'~VARZ Bio-Research (USA).

Une pr6parat ion hautement polym6ris6e d'acide d6oxyribonucl6ique (ADN) de thymus de veau nous a 6t6 a imablement fournie par le Docetur R. VENDRELY (I.R.S.C. Villejuif).

Les prdparat ions de DNase I de pancr6as de boeuf et d 'acide polyur idyl ique (Poty U) prove- naient de MILES Laboratories, Inc. (USA) et celle de RNase pancr6at ique de CHOAV (Paris, France) .

L'extrait de foie de rat a 6t6 pr6par6 suivant la technique de MATHIAS [4] ; le surnageant de ]a centr ifugation h 100000 g appel6 par r au teu r << fraction soluble >>, est celui que nous avons ana- lys6.

L'extrai! de E. coli a 6t6 obtenu par broyage avec de l ' a lumine suivi d 'une centr ifugation h 12 000 g. Le surnageant utilis6 avait une teneur en prot6ines de 7,5 mg/ml .

Le monom~re et le dimbre d 'acrylamide prove- naient de CANAL Industr ia l Co. (USA) et ragarose de r Indus t r i e Biologique Francaise /t Genne- villiers, France.

MODE OPERATOIRE.

1. Eleclrophor~se en acrylamide-agarose.

La m6thode employ6e est celle que nous avons d6crite en d6tail pr6c6demment [3]. Les gels util i- s6s avaient la composit ion su ivan t c : 5 p. 100 acrylamide, 0,13 p. 100 bisacrylamide et 0,8 p. 100

304 dose t t e Berges et Josd Uriel .

agarose . Les 6chan t i l lons 6tudi6s (0,1 ml p a r p r i se d 'essai) ont 6t6 soumis p e n d a n t e n v i r o n 3 heu re s

une chu te de po t en t i e l de 10 V o l t s / c m . La s6pa- r a t i on 61ec t rophor6t ique a 0 6 fai te dans un t am- pon d i s c o n t i n u T r i s -g lyc ine pH 8,7 !3].

2. Gel r~actionnel (agarose).

Des so lu t ions de subs t ra t et d ' aga rose ont 6t6 amen6es h 50°C dans un b a i n - m a r i e et m61ang6es ensui te h par t i es 6gales. Le m61ange a 0 6 r ap ide - m e n t coul6 en t re deux p l aques de v e r r e su ivan t le p roc6d6 i l lustr6 p a r ]a f igure 1.

4. Caractdrisation.

Apr6s incuba t ion , les gels ont 6t6 s6par6s. La p laque d ' a c r y l a m i d e - a g a r o s e est u t i l i s6e p o u r la co lo r a t i on des p ro t6 ines avec le Bleu de Coomas- sie se lon la t e c h n i q u e hab i tue l l e [3~. Le gel rdac-

Reservoir de ddpart

Plaque support

~e FIG. 1 . - Prdparation du gel rdactionnel.

Une plaque de verre photographique de faille variable suivant le nombre d'6ehantillons dtudi6s, est posde sur quatre petites cales de plastique (1 mm d'6paisseur) placdes h la surface d'une autre plaque de verre servant de support (plaque support). L'en- semble est chauff~ h 45°-50°C, retir6 ensuite de la source de chaleur et plac6 sur une surface horizontale. On verse immddiatement le m61ange r~actionnel de fa~on h rempl i r par capillarit6 l 'espace entre la plaque de verre photographique et la plaque support. Une fois, le gel pris, les quatre cales sont retirees et la plaque de verre photographique adh6rant au gel est sdpar~e de la plaque support par glissement. Pour assurer l 'adh~rence entre le gel et le verre photographique, la face de contact de celui-ci devra 8tre pr~alablement glae~e avec de l 'agarose selon le proc6d~ habituel [51.

Gel d'acrytarnide agarose

Gel rdactionnel (agarose)

FIG. 2. - - Representation seh~matique du mode opdratoire.

A. Le gel d 'acrylamide-agarose off les nucl6ases ont 6t6 s6par6es, est mis en contact avee le gel r~aetionnel.

B. Le gel d 'aerylamide-agarose est utilis6 pour la coloration des prot6ines du m~lange.

C. Sur le gel r6actionnel, on caract6rise l 'activit6 nucl6asique.

La c o m p o s i t i o n f inale des gels r6ac t ionne l s p o u r la ca rac t6 r i s a t i on des DNases, et des RNases est i nd iqu6e en bas des f igures i l lus t r an t les r6sul ta ts ob tenus avec d ive r ses p r6pa ra t i ons .

3. Incubation.

Apr~s 61ectrophorbse, ]e gel d ' a c r y l a m i d e - a g a - rose a 6t6 lav6 p e n d a n t 30 minu t e s dans une solu- t ion t a m p o n afin de r a p p r o c h e r son p H de ce lu i de la p l a q u e de gel r6ac t ionne l . Dans le eas pr6- sent, un t a m p o n v6rona l -ac6 ta te de Na 100 raM, p H 7 est uti l is6. Ire gel d '61ect rophor~se a 6t6 ensui te mis en con t ac t avec la p l a q u e de gel r6ac- t i onne l (F igure 2) et l ' ensemble , e n v e l o p p 6 d 'une feui l le de p l a s t ique (Saran W r a p p ) (*) p o u r 6v i te r les per tes d ' e au p a r 6vapora t ion , a 6t6 p lac6 dans une 6tuve "~ 40°C p e n d a n t 90 minu tes .

(*) Dow Chemical Co. Midland-Michigan - - U.S.A.

t i onne l a 6t6 t r emp6 p e n d a n t 60 h 90 minu t e s dans une so lu t ion de t a m p o n v6rona l -ac6 ta te de Na 10 raM, p H 7, c o n t e n a n t 1,5 p. 100 de sulfate de s t r e p t o m y c i n e . Ce l avage p e r m e t l '61iminat ion des p r o d u i t s d ' h y d r o l y s e en m 6 m e t emps que la pr6- c i p i t a t i on p a r la s t r e p t o m y c i n e des po lynuc leo - t ides non at taqu6s.

Une fois fix6, le gel a 6t6 color6 p e n d a n t 10 mi- nutes avec une so lu t ion de Bleu de T o l u i d i n e (0,125 p. 100 de co lo ran t dans 0,5 p. 100 d ' ac ide ac6t ique) et ensui te lay6 dans une so lu t ion d ' ac ide ac6 t ique h 5 p. 100 c o n t e n a n t 20 p. 100 d ' a lcoo l m 6 t h y l i q u e et 2,5 p. 100 de g lyc6r ine .

Une ac t iv i t6 nuc l6as ique a p p a r a l t sous l ' a spee t d ' une zone e la i re sur un fond color6 (F igure 2).

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.

E l e c t r o p h o r b s e des n u c l d a s e s en a c r y l a m i d e - a g a r o s e . 305

A P P L I C A T I O N S .

Nous p r 6 s e n t o n s ic i q u e l q u e s e x e m p l e s qu i n e se l i m i t e n t pa s aux e n d o n u c l 6 a s e s 6 tud i6es m a i s i l l u s t r en t les p o s s i b i l i t 6 s d ' a p p l i c a t i o n de la m6- rhode et sa s ens ib i l i t 6 .

®

P o l y U, s o n t m o n t r 6 e s d a n s les f igures 3 et 4, r e s p e c t i v e m e n t . D a n s les c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n - t a les d6c r i t e s , la l i m i t e i n f 6 r i e u r e de s e n s i b i l i t 6 de d 6 t e c t i o n de la RNase p a n c r 6 a t i q u e se s i tue a u t o u r de 0,01 ~ g / m l (0,0005 ~g p a r p r i s e d ' e s sa i ) ct de 0,10 ~ g / m l (0,005 ~tg p a r p r i s e d ' essa i ) se lon q u ' o n u t i l i s e du P o l y U ou de I 'ARN c o m m e s u b s t r a t .

®

FIG. 3. - - Activitd ribonucldasique sur l'acide polyuridylique.

A. RNase pancr6a t ique : 0,20 ~tg/ml (0,01 I~xg pa r prise d'essai).

B. S6rum de ra t adulte (1/6 d i lu t ion finale dans la prise d'essai).

Composit ion du gel r6act ionnel : agarose 1 p. 100 ; Poly U 0,0'05 p. 100 et EDTA 5 mM dans du t ampon v~ronal-ac~tate de Na 25 mM, pH 7.

Les ac t i v i t 6 s r i b o n u c l 6 a s i q u e s d u s 6 r u m de ra t , d ' un e x t r a i t de foie de r a t et d ' u n e p r 6 p a r a t i o n de RNase p a n c r 6 a t i q u e v is -h-v is de I 'ARN et d u

®

©

FIG. 4. - - Activitd ribonucldasique sur ARN de levure.

A. RNase pancr~at ique : 1 ~xg/ml (0,05 Izg par pr ise d'essai).

B. Ex t ra i t de foie de rat . C. S6rum de ra t adulte (1/6 d i lu t ion finale). La composi t ion du gel r6act ionnel est la m~me que

celle indiqu6e dans la Figure 3, saul que de I'ARN /~ 0,5 p. 100 remplaee le Poly U.

La photographie est le n6gatif de la plaque de gel. Cela explique que les zones d 'act ivi t6 appara i ssen t fonc6es sur un fond clair.

1!

+ - _ I

®

®

FIG. 5. - - Activitd ddoxyribonucldasique sur ADN de Thymus de veau.

A. DNase I (pancr6atique) : 2 ~vg/ml (0,1 ~g pa r prise d'essai).

B. Ex t ra i t b ru t d'E. Coli. Composi t ion du gel rfiactionnel : agarose 1 p. 100,

ADN 0,05 p. 100 et sulfate de Mg 20 mM dans un tam- pon v6ronal-ac6tate de Na 10 mM, pH 7.

Le gel a 6t6 s~ch6 dans une 6tuve h 60°C avant d 'etre mis en contact avee la plaque d 'aerylamide-agarose.

La F i g u r e 5 m o n t r e l ' a c t i v i t 6 d 6 o x y r i b o n u c l 6 a - s ique d ' u n e x t r a i t b r u t de E. col i et d ' u n c p r 6 p a - r a t i o n de DNase I. D a n s les d e u x cas, p l u s i e u r s zones d ' a c t i v i t 6 son t d6tec t6es . E n ce qui c o n c e r n e la DNase I, la m 6 t h o d e p e r m e t de d6ce l e r u n e con- c e n t r a t i o n de 0,4 ~ g / m l (0,002 r~g p a r p r i s e d ' e s sa i ) .

L ' a v a n t a g e p r i n c i p a l de la m 6 t h o d e es t ce lu i de c o m b i n e r u n c s 6 p a r a t i o n 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e d ' u n h a u t p o u v o i r de r 6 s o l u t i o n avec la c a r a c t 6 r i s a t i o n d ' u n e ac t iv i t6 n u c l 6 a s i q u e en p r 6 s e n e e de sub- s t r a t s de h a u t p o i d s mo16cu la i re .

I~SUM~.

Nous d6crivons une m6thode pour la caract6r isat ion d 'endonucl~ases apr6s s6parat ion par 61ectrophor6se en acrylamide-agarose. Le proc~d6 consiste en l 'u t i l i - sat ion de deux gels de poros i t6 di f f6rente : uu gel h mail les fines pour l '61ectrophor6se (acrylamide-aga- rose) et un gel poreux (agarose) pour la r6action de caract6risat ion.

BIOCH1MIE, 1971, 53, n ° 3.

3 0 6 J o s e t t e B e r g e s e t J o s d Ur ie l .

Cette t e c h n i q u e p e r m e t d '~ tud i e r F ac t i on des endo - n u e l 6 a s e s en p r6sence de s u b s t r a t s n u e l 6 i q u e s n a t u r e l s ou s y n t h d t i q u e s , de h a u t po ids mo l6cu la i r e . El le a 6t6 app l i qu~e h l ' 6 tude des r i b o n u c l d a s e s et des d6oxy r i bo - n u c l 6 a s e s d ' o r ig ine d ivers .

ZUSAMMENFASSUNG.

W i r b e s c h r e i b e n e ine Methode f i ir d ie K e n n z e i c h n u n g y o n E n d o n u k l e a s e n n a e h T r e n n u n g d u r c h E l e k t r o p h o - rese an A k r y l a m i d a g a r o s e . Das V e r f a h r e n b e r u h t a u f B e n u t z u n g zweie r Gele yon v e r s c h i e d e n e r Porosit~it : e ines Gels m i t f e i n e n M aschen fi ir d ie E l e k t r o p h o r e s e ( A k r y l a m i d a g a r o s e ) u n d e i ne s p o r S s e n Gels (Agarose) f i i r d ie K e n n z e i e h n u n g s r e a k t i o n .

Diese T e c h n i k e r l a u b t die U n t e r s u c h u n g de r Wir- k u n g de r E n d o n u k l e a s e n in G e g e n w a r t yon na t i i r l i chen oder s y n t h e t i s c h e n S u h s t r a t e n y o n h o h e m Molekular - gewicht . Sie i s t a u f d ie U n t e r s u e h n n g de r R i b o n u - k l e a s e n u n d D e s o x y r i b o n u k l e a s e n v e r s c h i e d e n e r Her- k u n f t a n g e w a n d t veorden.

BIBLIOGRAPHIE .

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BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 3.