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Méthodologie de recherche des 5 EHEC Typiques majeurs en méthode de routine
Steakexpert, le 22 juin 2011
Méthode de recherche des EHEC Typiques majeurs: retour d’expérience
Méthode de détection des E.coli EHEC Typiques majeurs Eléments de choix
Le mode opératoire
Les délais analytiques Le screening négatif
Les confirmations
Eléments de maîtrise de la prestation analytique Le respect des délais analytiques
Prise en compte de la variabilité du volume analytique
Garantir la fiabilité des résultats Les témoins quotidiens de Recherche
Concordance SIlliker/CNR E. Coli STEC
Eléments de maîtrise de la prestation analytique
Perspectives
Eléments de choix de la méthode
Disposer d’une méthode reconnue Mode opératoire reposant sur le projet de norme ISO/TS 13136
Disposer d’un screening rapide des échantillons négatifs pour libérer les lots
Disposer rapidement de résultats fiables sur colonies susceptibles de déclencher la procédure d’alerte pour éviter les retraits
Mode opératoire selon Projet de norme ISO/TS 13136
25 g d’échantillons dilués au 1:10 dans bouillon EPT
Incubation à 41,5°C pendant 8-12H (J0-18H)
Extraction de l’ADN présent dans le bouillon d’enrichissement (J1)
PCR pour détection des gènes stx (stx1 et stx2), eae et O157 (J1)
Si eae et/ou stx négatifs: absence de STEC pathogène (J1-12H)
Si eae et stx positifs, PCR pour identification des sérovars O157:H7, O26, O111, O145 et O103 (J1)
Si tous les sérovars sont négatifs : Absence STEC pathogène (J1-16H)
Si un des sérovars est positif
Enrichissement du bouillon d’enrichissement par immunoconcentration (J1)
Mode opératoire selon Projet de norme ISO/TS 13136
Isolement sur gélose spécifique du sérovar (J1)
Incubation 37°C x 18-24 h (J1)
Sélection au maximum de 50 colonies caractéristiques (J2)
PCR pour détection des gènes stx, eae et E. coli O157 sur les 50 colonies (J2)
Si eae et/ou stx négatifs: absence de STEC pathogène (J2-17H)
Si eae et stx positifs, PCR pour identification des sérovars O157:H7, O26, O111, O145 et O103 (J3)
Si tous les sérovars sont négatifs : Absence STEC pathogène (J3-12H)
Si un des sérovars est positif (J3)
Confirmation biochimique (J4)
Envoi des souches STEC au CNR pour confirmation (J+5-17H)
Méthode Genecycler (Genesystems)
Méthode Genecycler (Pall-Genesystems)
Disques de 6 / 12 chambres réactionnelles 1 disque O157, stx1, stx2 et eae (et Salmonella) 1 disque H7, O26, O111, O103, O145
Eléments de maîtrise de la prestation analytique
Respect des délais analytiques
Fiabilité des résultats
Le respect des délais analytiques
Pouvoir s’affranchir de la variabilité du volume analytique Les causes:
-Variabilité du nombre d’échantillons réceptionnés
-Variabilité du % de confirmation à réaliser (re-test sur colonies isolées)
_Augmentation de l’échantillonnage (3 fois n=30) en cas de positif confirmé
Les moyens d’action:-disposer d’un pool d’équipement suffisant
-disposer d’un nombre de technicien qualifié important avec contrainte de flexibilité
(horaire, activité)
La fiabilité des résultats
Témoins quotidiens de recherche (validation du process analytique)
Concordance Silliker Cergy/Centre National de Référence sur colonies isolées
Témoin Quotidien de Recherche
Matrice artificiellement contaminée avec pellets calibrés de O157:H7 (matériaux de référence calibrés avec souches connues et repérables à une concentration d’environ 4 UFC/25g)
Validation de l’ensemble des étapes critiques:
-enrichissement
-extraction
-amplification
-détection
-immuno-concentration
Concordance Silliker Cergy / CNR: validation de la technique PCR
Bilan sur les 4 derniers mois:
Nb colonies isolées à Cergy envoyées au CNR pour confirmation: 72
Répartition: O26: 71 %O157: 24 %O103: 4 %
Concordance: 97,3 %
Nature des discordances: Silliker Cergy O26:H11 stx+ eae+ O26:H11 stx+ eae+
CNR Lyon O26:H11 stx- eae+ O26:H11 stx- eae+
résultats sur colonies
Résultats concordants entre Silliker et le Centre National de RéférenceRésultats concordants entre Silliker et le Centre National de Référence
Perspectives
Amélioration de la technique de screening
Introduction de facteurs de screening complémentaires: gène nleB, variants eae associés au sérogroupes
Les attentes
Augmenter le % de lot libéré à l’issue de la 1ère étape de screening
Baisser le nombre de confirmation sur les colonies isolées
Merci de votre attention
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Joël CROCIANIExpert Microbiologie
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