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Les mthodes du diagnostic virologique

Le diagnostic dune maladie virale associe lisolement du virus responsable (ou la dtection directe de ses composants structuraux) cest--dire le diagnostic direct et le diagnostic indirect (ou dtection danticorps anti-viraux par diffrentes techniques).

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Aussi, le laboratoire de virologie intervient dans diffrentes situations.1- Apporter la preuve de l'origine virale des signes cliniques observs (ex : identification d'un virus Herpes dans une lsion gnitale).2- Permettre la mise en uvre des mesures de prophylaxie et le contrle des pidmies (example : fivres hmorragiques...).3- Suivre l'volution biologique de l'infection (example : tude des diffrents marqueurs du virus de l'hpatite B...).34- Permettre une dcision thrapeutique et juger de son efficacit (ex : traitement par l'Acyclovir au cours d'une infection herptique).5- Apprcier l'tat immunitaire (ex : la rubole).6- Etudier les rservoirs, les vecteurs et la transmission des infections virales.7- Eviter la transmision des virus l'occasion des dons d'organe et de tissus.

4A- Diagnostic direct1- Technique utilisant les cultures cellulaires: Strictement dpendants des cellules pour leur rplication, les virus ne sont cultivables quen cellules vivantes dont il existe 3 sources: les animaux vivants, luf de poule embryonn et les cellules en culture.Chaque virus possde un tropisme cellulaire propre. Le laboratoire doit entretenir un minimum de 2 3 lignes cellulaires pour obtenir la rplication du plus grand nombre de virus pathognes pour lhomme.

55Quand un virus est inocul en culture cellulaire, plusieurs ventualits sont possibles:- absence de rplication: la nappe cellulaire reste intacte;- rplication peu cytolytique, sans modifications morphologiques des cellules: diffrentes caractristiques rservs certaines familles virales sont utilises pour montrer la prsence du virus dans la nappe cellulaire;

6- rplication cytolytique, altrant la morphologie de la nappe cellulaire: on parle deffect cytopathique (ECP).Une fois le virus dtect en culture cellulaire, un diagnostic probabiliste du virus en cause est souvent possible; on peut savoir la famille ou le genre du virus en fonction du type de cellules sur lesquelles il sest multipli, du delai dapparition , des caractristiques de lECP, de lorigine du prlvement. Gnralement on nisole pas de virus envelopp dans les selles.

7Les techniques didentification sont immunologiques: immunofluorescence (IF) ou immunoperoxydase (IP), sroneutralisation (SN), inhibition de lhmagglutination (IHA), hybridation avec des sondes nucliques ou les techniques damplification de squence nuclique.Mme si elles sont parfois longues, ennuyeuses et onreuses, les techniques de culture cellulaire sont sensibles pour les virus facilement cultivables.

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2- Dtection du virus entier par microscopie lectronique (ME): aprs coloration, les virus en grande quantit, la microscopie lectronique est utilise pour dtecter les agents non cultivables responsables de gastro-entrites: rotavirus, .On augmente la sensibilit en mettant un srum dirig contre le virus suspect: les virus apparaissent sous forme dagrgats.La microscopie lectronique ne diffrencie pas des virus de la mme famille, comme les HSV-1 et 2 et le VZV.

103- Dtection directe dantignes viraux: on recourt des techniques rapides (quelques minutes quelques heures) en terme de spcificit et de reproductibilit. Mais ces techniques manquent de sensibilit et ne sappliquent qu certains prlvements (prlvement, virus, techniques).

114- Dtection de gnomes viraux par hybridation sans amplification: lhybridation se fait entre le gnome viral prsent dans lchantillon tester (aprs dnaturation thermique sil sagit dun acide nuclique bicatnaire) et une squence nuclotidique connue, la sonde, marque par un isotope radioactif (sonde chaude) ou par un produit non radioactif (sonde froide). Lhybridation simple manque de sensibilit et ne sapplique qu certains prlvements (verrues, sang de sujet atteint dhpatite B chronique,..).

12 hybridation: fcondation entre des sujets despces diffrentes, mais voisines, ou de mme espce, mais de varit diffrente.amplification gnique: technique moderne danalyse de lADN. Cette technique fait augmenter la quantit ADN provenant du prlvement tudi.

13On distingue 3 variantes mthodologiques pour hybridation sans amplification: - hybridation sur membrane (de nylon ou de nitrocellulose): quand les acides nucliques sont dposs sur la membrane, on parle de technique de dot-blot.Quand les ADN extraits sont digrs par des enzymes de restriction puis spars par lectrophorse avant dtre transfrs sur la membrane, il sagit de la technique de Southern blot.

14 - lhybridation in situ, partir dune coupe de tissu (par exemple, dtection dADN de papillomavirus sur biopsie de lsion verruqueuse); elle renseigne sur le nombre et le type histologique des cellules infectes. - Lhybridation en milieu liquide (en tube ou en micro-plaque); lintensit du signal, proportionnelle la quantit de matriel viral prsent dans lchantillon, permet dapprcier la charge virale. La mthode est utilise pour mesurer la charge virale dans le srum au cours de linfection par HIV et des hpatites chroniques B et C.

155- Dtection de gnomes viraux par les techniques damplification de squence nuclique (PCR): ces techniques sont applicables tous les agents viraux qui sont difficiles ou impossibles multiplier in vitro. Le prototype des techniques damplification est la raction damplification en chane par polymrases ou PCR (Polymerase Chain Reaction).Ces techniques sont trs sduisantes pour leur grande sensibilit et leur extrme polyvalence.

16 6- Squenage: avec les techniques froides utilisant des fluorochromes, des squenceurs automatiques et des logiciels dalignement de squences, les techniques de squenage des gnomes viraux ( partir des produits de clonage ou de produits de PCR) servent ltude des dterminants de rsistance dite gnotypique aux antiviraux (HIV) et au typage molculaire de virus comportant une grande diversit gntique, example: HCV, HIV, HPV (papillomavirus humain).

17B- Diagnostic indirect: caractrisation des anticorps viraux dans le srum. Par cette mthode, on peut savoir une infection rcente ou ancienne.1- Technique permettant de distinguer lisotype des anticorps: Les techniques ELISA sont les plus utilises en srologie virale et sont automatises.

18La technique dimmunofluorescence demeure la rfrence pour la dtection des anticorps de lEBV (Epstein Barr virus). Les techniques dimmuno-blot, Western blot sont utilises comme tests de confirmation de linfection par HIV, HTLV (virus du lymphome humain cellules T) ou EBV (cest- dire ltude analytique des anticorps dirigs contre diffrentes protines virales).

192- Techniques ne distinguant pas lisotype des anticorps: la sroneutralisation et linhibition de lhmagglutination sont utilises pour mettre en vidence des anticorps et pour valuer la protection dun individu vis--vis dun virus.Lagglutination passive (ou conditionne) est utilise pour le diagnostic dune infection rcente.

203- Dosage de linterfron alpha: le dosage biologique de linterfron alpha se fait dans le sang ou le LCR.Linterfron alpha est inductible par une infection virale.En association avec dautres investigations plus spcifiques, ce test est utile dans le diagnostic de la rubole congnitale et des encphalites.

21C- Indications des examens de diagnostic virologique: toute infection prsume virale ne justifie pas la prescription dun examen virologique.Les indications de ces examens sont la svrit ou le caractre proccupant de linfection, soit pour le patient, soit pour la collectivit.Les examens virologiques participent de plus en plus au suivi des traitements antiviraux.221- Donnes du diagnostic direct: la dcouverte dun virus ou de ses constituants dans un prlvement est utile quand le virus est dtect dans un site correspondant au processus pathologique (liquide cphalo-rachidien au cours dune mningite, lavage broncho-alvolaire au cours dune peneumopathie).2- Donnes du diagnostic indirect: les renseignements cliniques fournis avec le prlvement (ge dun trs jeune enfant, des anticorps maternels, notion de srothrapie, transfusion, vaccination rcente) sont indispensables au biologiste pour fournir une interprtation.

23Les srologies virales ont 3 indications: a- le diagnostic dune infection actuelle, aigu ou persistante, b- la dtermination du statut immunitaire dun individu vis--vis dun virus un moment donn, c- lvaluation de lefficacit dune vaccination antivirale.

24-vis dun virus 24Le diagnostic srologique dinfection rcente est difficile et repose sur 2 notions:a- laugmentation significative des anticorps entre 2 prlvements successifs, ce qui suppose la quantification de la rponse humorale; lexpression des rsultats est variable selon le virus, la technique et le laboratoire.

25b- la mise en vidence danticorps antiviraux de classe IgM. Thoriquement ils signent une primo-infection. En fait, il arrive quon les trouve au cours dinfections secondaires ou persistantes; dautre part, leur prsence est inconstante ou retarde, en particulier en cas de dficit immunitaire.Compte tenu de la permabilit de la barrire placentaire aux IgG, la prsence d anticorps IgM ou IgA est un argument srologique permettant daffirmer une infection chez le nouveau-n et le nourrisson.

26D- Evaluation de la rsistance aux antiviraux: outre leur intrt diagnostique, les tests virologiques sont utiliss dans le suivi des infections virales chroniques et dans leur traitement, comme infections HIV, hpatites virales chroniques, infections virales des personnes immunodprimes.Regardons la rsistance aux antiviraux: au laboratoire, il existe 2 faons d valuer cette rsistance antivirale.

27- valuer la quantit du virus en culture cellulaire en prsence de lantiviral; on parle de tests phnotypiques; on voit la concentration inhibitrice 50 ou 90% (CI 50 ou CI 90 ), cest la concentration dantiviral rduisant la production de virus en culture de 50 ou 90%; - rechercher des mutations connues comme cause de rsistance; on parle de tests gnotypiques.

28a- Tests phnotypiques: ils sont effectus en microplaques de 24, 48 ou 96 puits sur des cultures cellulaires traites par diffrentes concentrations dantiviral.La multiplication virale dans la culture cellulaire peut tre mesure par une quantification de lECP (dnombrement des plages de lyse , dnombrement des cellules vivantes par colorimtrie, pourcentage de puits ayant un ECP) ou par une quantification des antignes ou des acides nucliques produits.

29Les tests phnotypiques sont utiles pour surveiller lvolution de la rsistance des virus aux traitements antiviraux, par example HSV, CMV, VZV, HIV.b- Tests gnotypiques: ils sont utiliss pour le suivi de linfection par HIV, HBV, CMV,Ils dterminent la rsistance aux antirtroviraux: type sauvage, mut ou mixte. Certaines mutations signent la rsistance telle molcule et certaines mutations induisent une rsistance croise entre plusieurs molcules de mme mcanisme.

30Cultures cellulaires: les cultures cellulaires in vitro sont largement utilises dans les laboratoires de virologie. Trois grands types de cellules sont utiliss.- Les cellules de primo-explantation: elles proviennent dorganes frais trypsins (la trypsine rompant les ponts inter-cellulaires et permettant une culture en momocouche); elles sont sensibles de nombreux virus mais ont linconvnient de ne pas supporter de passage, example les cellules de rein de singe (RS).

31Le passage tant le ddoublement aprs trypsination dune bote de culture dont le tapis cellulaire est arriv confluence.- Les cellules diplodes: ce sont des cellules normales qui peuvent supporter une cinquantaine de passages et peuvent tre maintenues un certain temps au laboratoire. Ex. MRC5, fibroblastes humains dorigine embryonnaire pour lisolement du CMV.- Les cellules en lignes continues: ces cellules, gnralement dorigine cancreuse, souvent htroplodes ont acquis la possibilit de prolifrer au laboratoire; example la ligne HeLa.3232

33 Immunofluorescence: les antignes recherchs sont dtects par des anticorps spcifiques lis une molcule fluorescente. Les virus grippaux, le virus respiratoire syncytial pourront tre diagnostiqus dans des frottis de larbre respiratoire. La technique dimmunofluorescence demeure la rfrence pour certaines srologies comme la dtection des anticorps de lEBV (fig 6B).34

35Techniques immuno-enzymatiques (ELISA): des anticorps dirigs contre un antigne viral sont fixs sur une plaque de polystyrne; si le prlvement tudi contient lantigne correspondant , ce dernier va se fixer; un deuxime anticorps li une enzyme viendra saccrocher et aprs lavage, lorsquon rajoutera le substrat de lenzyme, il se produira une raction colore. 36

37 Les techniques qualifies de srologie virale ont pour but la mise en vidence danticorps spcifiques dun virus, comme tmoins dune infection rcente ou ancienne. Elles sont trs diverses dans leur principe et leurs performances.38Lagglutination passive est utilise pour le diagnostic dune infection rcente que pour dfinir le statut immunitaire dun individu vis--vis dun virus. La fixation du complment manque de sensibilit chez le jeune enfant et limmunodprim.

Prlvement: le sang doit tre prlev de faon aseptique sur tube sec.

39Pour choisir la technique utiliser dans une situation donne, il faut tenir compte:de la spcificit de la technique;de la rapidit dapparition et de la dure de la rponse en anticorps;de la sensibilit de la technique et .........de son cot.40Par example, il vaut mieux utiliser la fixation du complment (Fc) que linhibition de lhmagglutination IHA, pour le diagnostic srologique des Adnovirus parce que la fixation du complment indique un antigne de groupe alors que linhibition de lhmagglutination est spcifique de type (il existe 42 types donc il faudrait 42 IHA). 41Un autre example, dans le cas de la rubole, les anticorps dtects en IHA apparaissent plus rapidement et persistent plus longtemps que les anticorps dtects en Fc. La raction dIHA est donc plus adapte au diagnsotic de la rubole.Application en virologie: la raction de dviation du complment est utilise en virologie pour mettre en vidence les Ac dirigs contre la quasi-totalit des virus.

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43Raction de dviation du complment ou fixation du complment, Fc (fig. 7.10): Matriel: srum tudier qui doit tre au pralable dcomplment (56o C pendant 30 minutes);lantigne (Ag) vis--vis duquel on recherche les anticorps (Ac); du complment de cobaye pralablement titr ( pour la raction);- des globules rouges du mouton (GRM);du srum de lapin anti-GRM pralablement titr appel srum hmolytique (SH).

44Premire possibilit: le srum tudier prsente des Ac spcifiques de lAg connu. Il ny a pas dhmolyse (fig. 7.10 a). On a comme titre en Ac, linverse de la dilution laissant au moins 50% de GRM intacts. Deuxime possibilit: le srum tudier ne possde pas dAc spcifique de lAg. Il y a la lyse des GRM (fig. 7.10 b).

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46Inhibition de lhmagglutination (IHA) :On utilise pour le diagnostic srologique des infections par des virus hmagglutinants comme le virus de la rubole, de la grippe, de la rougeole, les adnovirus, de nombreux arbovirus......Principe: la raction est base sur la proprit du virus de se fixer la surface des hmaties par lintermdiaire dhmagglutinines, et de former des ponts entre les hmaties (hmagglutination virale). Les anticorps spcifiques du virus se fixent sur le virus.

47Lorsque le virus est entour danticorps, il na plus daccs la surface de lhmatie: il y a inhibition de l hmagglutination (fig.7.11). Chaque virus agglutine les hmaties despces animales dtermines. Ex:Rougeole: hmaties de singe;Grippe: hmaties de cobaye.

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49Western blot ou immunoblotOn utilise pour la recherche du VIH et aussi pour confirmer dun test de dtection ELISA positif. Aprs avoir cultiv, concentr et purifi du VIH-1, on peut sparer par lectrophorse les diverses protines qui le constituent: Gp160, Gp110, p68, p55, Gp41, p40, p34, p25 et p18. Ces protines sont alors transfres sur un filtre de nitrocellulose puis celui-ci est dcoup en bandes utilises pour le diagnostic srologique.

50Aprs avoir incub avec un srum, rinc puis incub avec un conjugu anti-immunoglobuline humaine li une enzyme, puis ajout le substrat de lenzyme, on voit les bandes apparaissent; cela signifie que le patient a les anticorps correspondants (fig. 7.15).

5151Raction de neutralisation: cest la neutralisation de linfectivit dun virus. La technique, trs ancienne, est souvent la technique srologique de rfrence.Principe: la mise en contact dun virus avec un srum contenant des anticorps dirigs contre lui, avant son inoculation sur un systme-hte vivant sensible, inhibe linfectivit du virusLe systme-hte varie selon le virus: animaux, oeufs embryonns, cultures de cellules.52Hmadsorption: lors de la sortie hors des cellules, par bourgeonnement, des virus hmagglutinants envelopps, les spicules hmagglutinants se trouvent la surface des cellules au niveau des bourgeons. Si on met dans le milieu des globules rouges, ceux-ci se fixeront la surface des cellules infectes.

53INTERPRTATION DES RSULTATS

Le plus souvent, l'isolement d'un virus ou la dtection d'un de ses constituants dans un produit pathologique tel qu'un LCR, une aspiration nasale, un prlvement de gorge, des leucocytes, est en faveur de l'tiologie virale de l'infection observe par le clinicien. Il faut se souvenir que la prsence d'un virus dans un chantillon est la traduction de la rplication virale dans les tissus pouvant aboutir une cytolyse dont dcoulent en partie les signes cliniques. La rponse immune est variable d'un sujet l'autre (certains sujets bons rpondeurs auront des titres d'anticorps sriques levs,sans pour cela qu'il y ait une relation avec l'importance de l'expression clinique de l'infection).

54L'expression des rsultats est souvent variable d'une technique l'autre, d'un laboratoire l'autre. Les normes du laboratoire sont en gnral mentionnes sur la feuille de rsultats. - Chez les patients immunodprims, du fait de l'atteinte du systme immunitaire, les srologies virales sont peu informatives.Il faut privilgier l'isolement viral. - Chez le nouveau-n, la prsence dIgG d'origine maternelle gne l'interprtation des srologies pendant 6 10 mois. Il faut faire la recherche des IgM spcifiques (ex: rubole, cytomgalovirus) et celle du virus.

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