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Les mthodes du diagnostic virologique

Le diagnostic dune maladie virale associe lisolement du virus responsable (ou la dtection directe de ses composants structuraux) cest--dire le diagnostic direct et le diagnostic indirect (ou dtection danticorps anti-viraux par diffrentes techniques).

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Aussi, le laboratoire de virologie intervient dans diffrentes situations.1- Apporter la preuve de l'origine virale des signes cliniques observs (ex : identification d'un virus Herpes dans une lsion gnitale).2- Permettre la mise en uvre des mesures de prophylaxie et le contrle des pidmies (example : fivres hmorragiques...).3- Suivre l'volution biologique de l'infection (example : tude des diffrents marqueurs du virus de l'hpatite B...).34- Permettre une dcision thrapeutique et juger de son efficacit (ex : traitement par l'Acyclovir au cours d'une infection herptique).5- Apprcier l'tat immunitaire (ex : la rubole).6- Etudier les rservoirs, les vecteurs et la transmission des infections virales.7- Eviter la transmision des virus l'occasion des dons d'organe et de tissus.

4A- Diagnostic direct1- Technique utilisant les cultures cellulaires: Strictement dpendants des cellules pour leur rplication, les virus ne sont cultivables quen cellules vivantes dont il existe 3 sources: les animaux vivants, luf de poule embryonn et les cellules en culture.Chaque virus possde un tropisme cellulaire propre. Le laboratoire doit entretenir un minimum de 2 3 lignes cellulaires pour obtenir la rplication du plus grand nombre de virus pathognes pour lhomme.

55Quand un virus est inocul en culture cellulaire, plusieurs ventualits sont possibles:- absence de rplication: la nappe cellulaire reste intacte;- rplication peu cytolytique, sans modifications morphologiques des cellules: diffrentes caractristiques rservs certaines familles virales sont utilises pour montrer la prsence du virus dans la nappe cellulaire;

6- rplication cytolytique, altrant la morphologie de la nappe cellulaire: on parle deffect cytopathique (ECP).Une fois le virus dtect en culture cellulaire, un diagnostic probabiliste du virus en cause est souvent possible; on peut savoir la famille ou le genre du virus en fonction du type de cellules sur lesquelles il sest multipli, du delai dapparition , des caractristiques de lECP, de lorigine du prlvement. Gnralement on nisole pas de virus envelopp dans les selles.

7Les techniques didentification sont immunologiques: immunofluorescence (IF) ou immunoperoxydase (IP), sroneutralisation (SN), inhibition de lhmagglutination (IHA), hybridation avec des sondes nucliques ou les techniques damplification de squence nuclique.Mme si elles sont parfois longues, ennuyeuses et onreuses, les techniques de culture cellulaire sont sensibles pour les virus facilement cultivables.

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2- Dtection du virus entier par microscopie lectronique (ME): aprs coloration, les virus en grande quantit, la microscopie lectronique est utilise pour dtecter les agents non cultivables responsables de gastro-entrites: rotavirus, .On augmente la sensibilit en mettant un srum dirig contre le virus suspect: les virus apparaissent sous forme dagrgats.La microscopie lectronique ne diffrencie pas des virus de la mme famille, comme les HSV-1 et 2 et le VZV.

103- Dtection directe dantignes viraux: on recourt des techniques rapides (quelques minutes quelques heures) en terme de spcificit et de reproductibilit. Mais ces techniques manquent de sensibilit et ne sappliquent qu certains prlvements (prlvement, virus, techniques).

114- Dtection de gnomes viraux par hybridation sans amplification: lhybridation se fait entre le gnome viral prsent dans lchantillon tester (aprs dnaturation thermique sil sagit dun acide nuclique bicatnaire) et une squence nuclotidique connue, la sonde, marque par un isotope radioactif (sonde chaude) ou par un produit non radioactif (sonde froide). Lhybridation simple manque de sensibilit et ne sapplique qu certains prlvements (verrues, sang de sujet atteint dhpatite B chronique,..).

12 hybridation: fcondation entre des sujets despces diffrentes, mais voisines, ou de mme espce, mais de varit diffrente.amplification gnique: technique moderne danalyse de lADN. Cette technique fait augmenter la quantit ADN provenant du prlvement tudi.

13On distingue 3 variantes mthodologiques pour hybridation sans amplification: - hybridation sur membrane (de nylon ou de nitrocellulose): quand les acides nucliques sont dposs sur la membrane, on parle de technique de dot-blot.Quand les ADN extraits sont digrs par des enzymes de restriction puis spars par lectrophorse avant dtre transfrs sur la membrane, il sagit de la technique de Southern blot.

14 - lhybridation in situ, partir dune coupe de tissu (par exemple, dtection dADN de papillomavirus sur biopsie de lsion verruqueuse); elle renseigne sur le nombre et le type histologique des cellules infectes. - Lhybridation en milieu liquide (en tube ou en micro-plaque); lintensit du signal, proportionnelle la quantit de matriel viral prsent dans lchantillon, permet dapprcier la charge virale. La mthode est utilise pour mesurer la charge virale dans le srum au cours de linfection par HIV et des hpatites chroniques B et C.

155- Dtection de gnomes viraux par les techniques damplification de squence nuclique (PCR): ces techniques sont applicables tous les agents viraux qui sont difficiles ou impossibles multiplier in vitro. Le prototype des techniques damplification est la raction damplification en chane par polymrases ou PCR (Polymerase Chain Reaction).Ces techniques sont trs sduisantes pour leur grande sensibilit et leur extrme polyvalence.

16 6- Squenage: avec les techniques froides utilisant des fluorochromes, des squenceurs automatiques et des logiciels dalignement de squences, les techniques de squenage des gnomes viraux ( partir des produits de clonage ou de produits de PCR) servent ltude des dterminants de rsistance dite gnotypique aux antiviraux (HIV) et au typage molculaire de virus comportant une grande diversit gntique, example: HCV, HIV, HPV (papillomavirus humain).

17B- Diagnostic indirect: caractrisation des anticorps viraux dans le srum. Par cette mthode, on peut savoir une infection rcente ou ancienne.1- Technique permettant de distinguer lisotype des anticorps: Les techniques ELISA sont les plus utilises en srologie virale et sont automatises.

18La technique dimmunofluorescence demeure la rfrence pour la dtection des anticorps de lEBV (Epstein Barr virus). Les techniques dimmuno-blot, Western blot sont utilises comme tests de confirmation de linfection par HIV, HTLV (virus du lymphome humain cellules T) ou EBV (cest- dire ltude analytique des anticorps dirigs contre diffrentes protines virales).

192- Techniques ne distinguant pas lisotype des anticorps: la sroneutralisation et linhibition de lhmagglutination sont utilises pour mettre en vidence des anticorps et pour valuer la protection dun individu vis--vis dun virus.Lagglutination passive (ou conditionne) est utilise pour le diagnostic dune infection rcente.

203- Dosage de linterfron alpha: le dosage biologique de linterfron alpha se fait dans le sang ou le LCR.Linterfron alpha est inductible par une infection virale.En association avec dautres investigations plus spcifiques, ce test est utile dans le diagnostic de la rubole congnitale et des encphalites.

21C- Indications des examens de diagnostic virologique: toute infection prsume virale ne justifie pas la prescription dun examen virologique.Les indications de ces examens sont la svrit ou le caractre proccupant de linfection, soit pour le patient, soit pour la collectivit.Les examens virologiques participent de plus en plus au suivi des traitements antiviraux.221- Donnes du diagnostic direct: la dcouverte dun virus ou de ses constituants dans un prlvement est utile quand le virus est dtect dans un site correspondant au processus pathologique (liquide cphalo-rachidien au cours dune mningite, lavage broncho-alvolaire au cours dune peneumopathie).2- Donnes du diagnostic indirect: les renseignements cliniques fournis avec le prlvement (ge dun trs jeune enfant, des anticorps maternels, notion de srothrapie, transfusion, vaccination rcente) sont indispensables au biologiste pour fournir une interprtation.

23Les srologies virales ont 3 indications: a- le diagnostic dune infection actuelle, aigu ou persistante, b- la dtermination du statut immunitaire dun individu vis--vis dun virus un moment donn, c- lvaluation de lefficacit dune vaccination antivirale.

24-vis dun virus 24Le diagnostic srologique dinfection rcente est difficile et repose sur 2 notions:a- laugmentation significative des anticorps entre 2 prlvements successifs, ce qui suppose la quantification de la rponse humorale; lexpression des rsultats est variable selon le virus, la technique et le laboratoire.

25b- la mise en vidence danticorps antiviraux de classe IgM. Thoriquement ils signent une primo-infection. En fait, il arrive quon les trouve au cours dinfections secondaires ou persistantes; dautre part, leur prsence est inconstante ou retarde, en particulier en cas de dficit immunitaire.Compte tenu de la permabilit de la barrire placentaire aux IgG, la prsence d anticorps IgM ou IgA est un argument srologique permettant daffirmer une infection chez le nouveau-n et le nourrisson.

26D- Evaluation de la rsistance aux antiviraux: outre leur intrt diagnostique, les tests virologiques sont utiliss dans le suivi des infections virales chroniques et dans leur traitement, comme infections HIV, hpatites virales chroniques, infections virales des personnes immunodprimes.Regardons la rsistance aux antiviraux: au laboratoire, il existe 2 faons d valuer cette rsistance antivir