mémoire de dea

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Sommaire Résumé Introduction Matériels et méthodes 1 – Matériels a – Types cellulaires b – Amorces et sondes de RT-PCR quantitative en temps réel 2 – Méthodes a – Conditions générales de culture b – Extraction des ARN messagers c – Comparaison de la sensibilité au NGF des diverses lignées épithéliales de sein humain d – Test de l’effet de l’inhibition de contact e – Effet de substances agissant sur la croissance et/ou l’apoptose

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Page 1: Mémoire de dea

Sommaire

Résumé

Introduction

Matériels et méthodes

1 – Matériels

a – Types cellulaires

b – Amorces et sondes de RT-PCR quantitative en temps réel

2 – Méthodes

a – Conditions générales de culture

b – Extraction des ARN messagers

c – Comparaison de la sensibilité au NGF des diverses lignées épithéliales de

sein humain

d – Test de l’effet de l’inhibition de contact

e – Effet de substances agissant sur la croissance et/ou l’apoptose

f – RT-PCR quantitative en temps réel

g – Immunoprécipitation et analyse en Western blot

h – Test d’apoptose en Hoescht

Page 2: Mémoire de dea

Résultats

1 – Expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75) dans les lignées

de cancer du sein et sur les cellules normales

a – Expression du gène p75

b – Expression du gène TrkA

c – Expression du gène du NGF

2 – Variation de l’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75)

en fonction de l’inhibition de contact

3 – Variation de l’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75)

en fonction de substances agissant sur la croissance et/ou l’apoptose

Discution et conclusion

Bibliographie

Remerciments

Page 3: Mémoire de dea

Sébastien DUPRAT, DEA biologie santé 1999-2000.

REGULATION DE L’EXPRESSION DU NGF ET DE

SES RECEPTEURS (TRKA ET P75) DANS LES

CELLULES DE CANCER DU SEIN.

RESUME   :

Le cancer du sein touche près d’une femme sur dix. La meilleure compréhension de

cette maladie est un des défis prioritaires de la santé publique à l’heure actuelle.

Il a préalablement été prouvé dans le laboratoire que le Nerve growth factor (NGF)

stimule la croissance et la survie des cellules de cancer du sein par l’intermédiaire de deux

récepteurs : TrkA et p75 (Descamps et al. 1998). Dans cette recherche il a également été

démontré que les cellules épithéliales mammaires normales ne sont pas stimulées à proliférer

par ce facteur de croissance. L’objectif de mon travail de DEA est de définir la régulation du

NGF et de ses récepteurs dans les lignées de cancer du sein en culture.

Différentes lignées de cancer du sein ainsi que des cellules épithéliales mammaires

normales ont été cultivées en présence de facteurs modifiant la prolifération et la survie

cellulaire. Les résultats ont alors été analysés en RT-PCR quantitative en temps réel ou en

western blot.

Page 4: Mémoire de dea

INTRODUCTION   :

La recherche en biologie cellulaire

sur les cancers hormonaux dépendants

repose principalement sur l’étude de la

prolifération, de la différentiation et de

l’apoptose. Ces phénomènes sont

conditionnés par l’environnement

cellulaire, notamment par les molécules de

signalisation. On trouve dans cette

catégorie les facteurs de croissance, petits

polypeptides de faible poids cellulaire qui

agissent par l’intermédiaire de récepteurs

membranaires.

Le NGF est le premier facteur de

croissance à avoir été caractérisé. Ce

travail a valu le prix Nobel de médecine en

1986 à Rita-Levi Montalcini. C’est

l’archétype des facteurs de croissance

neurotrophique. Il a été très largement

étudié pour son rôle d’induction de la

croissance et de la survie des neurones

sympathiques. Plus récemment, une

activité mitogène lui a été attribuée sur

certaines lignées de cellules épithéliales.

Dans un travail effectué préalablement à

mon arrivée dans mon laboratoire

d’accueil, cet effet a été démontré sur les

cellules épithéliales mammaires

cancéreuses (Descamps et al. 1998). Une

particularité est intéressante dans ce

modèle : le NGF stimule les cellules

cancéreuses du sein à proliférer mais reste

sans effets mesurables sur les cellules

normales.

Le NGF agit par l’intermédiaire de

deux récepteurs membranaires : TrkA et

p75. Le proto-oncogène TrkA (p140trk) est

un récepteur à activité tyrosine kinase,

c’est le récepteur à haute affinité du NGF.

P75 est un récepteur accessoire, de basse

affinité, et sans activité tyrosine kinase. Ce

dernier semble pourtant posséder une voie

de transduction propre liée aux fonctions

de survie cellulaire.

L’étude du rôle du NGF dans le

cancer du sein en est à ses débuts. Dans le

cadre de ce stage de DEA, nous nous

Page 5: Mémoire de dea

somme intéressé aux mécanismes régulant

la sensibilité des cellules épithéliales

mammaires humaines pour ce facteur de

croissance. Notre approche nous a

renseigné sur l’évolution de cette

sensibilité au NGF induite par des

molécule agissant sur la croissance et/ou

l’apoptose.

Page 6: Mémoire de dea
Page 7: Mémoire de dea

MATERIEL METHODES   :

1 - Matériel

a) Types cellulaires

Un certain nombre de types

cellulaires ont été utilisés. Ce sont des

lignées cancéreuses ou des cellules

normales, mais toutes sont d’origine

épithéliales mammaires humaines.

- la lignée MCF-7 est hormono-

dépendante. Elle a été établie à

partir d’effusions pleurales d’un

adénocarcinome. Cette lignée a

conservé de nombreuses

caractéristiques d’un épithélium

mammaire (particulièrement

pour la présence des récepteurs

à haute affinité des œstrogènes

et progesterone). En plus de la

lignée MCF-7 commune, nous

avons également utilisé des

MCF-7 transfectées par le

proto-oncogène ras

(dénomination : MCF-7 ras).

Ces dernières se comportent en

permanence comme stimulées

par des facteurs de croissance,

même en milieu de sevrage

(sans sérum de veau fœtal).

- Les lignées T47D et SK-Br-3

sont également hormono-

dépendantes et peu invasives.

Elle sont issues

d’adénocarcinomes. SK-Br-3

surexprime le récepteur erb-B2,

et T47D possède des récepteurs

à certains stéroïdes.

- La lignée BT20 semble être

hormono-dépendante, mais ceci

est controversé dans la

littérature. Elle est issue de

cellules échapées d’une tumeur

en culture primaire. Elle a la

Page 8: Mémoire de dea

particularité de ne pas posséder

de récepteurs aux œstrogènes.

- Nous avons également étudié 3

lignées de MDA. Elles sont

toutes trois hormono-

indépendantes. Ce sont les

lignées MDA-MB-231 (issues

d’effusions pleurales

d’adénocarcinomes, fortement

invasive. Ces cellules

n’expriment pas de récepteurs

aux œstrogènes et à la

progestérone), MDA-MB-453

(possédant de nombreux

récepteurs aux androgènes et

très invasive. Elle surexprime

également erb-B2) et MDA-

MB-468 (possède de nombreux

récepteurs à l’EGF et

surexprime le FGF-2).

- Enfin, nous avons utilisé des

cellules épithéliales mammaires

humaines normales

(dénomination : CEMN). Ces

cellules sont issues de réduction

mammaires non pathologiques

(venant du département de

chirurgie plastique, CHU Lille,

Dr.Pellerin) et mises en culture

primaire au laboratoire.

b) Amorces et sondes de RT-

PCR quantitative en temps

réél.

Les séquences des amorces sens et

antisens ainsi que des sondes sont les

suivantes :

TrkA :

Sens : CATCGTGAAGAGTGGTCTCCG

Antisens :

GAGAGAGACTCCAGAGCGTTGAA

Sonde :

AGGAGTGAAATGGAAGGCATCTGGC

G

P75 :

Sens :

CCTACGGCTACTACCAGGATGAG

Antisens : TGGCCTCGTCGGAATACG

Sonde :

CTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGC

Page 9: Mémoire de dea

NGF :

Sens :

Antisens :

Sonde :

2 – méthodes

a) Conditions générales de

culture

En routine, les cellules sont

maintenues en MEM (Milieu essentiel

minimum, avec des sels de Eagle) (Gibco

BRL) supplémenté avec 5% de sérum de

veau fœtal (SVF) (Eurobio ? ? ? ?), 1%

d’acides aminés essentiels (Eurobio), 2

mM de glutamine (Eurobio), 5 l/ml

d’insuline (Organon), et des antibiotiques

(Penicilline-Streptomycine : 100 U/ml et

Gentamycine : 50 l/ml) (Eurobio). Les

cellules sont encemencées dans des

flasques de plastique de 75 cm2 (Falcon) et

incubées dans un atmosphère humide, à

37°C en présence de 5% de CO2. Le milieu

est changé tous les 2 jours. Les cellules

sont régulièrement décolées, avant la

confluance dans une solution de trypsine

(0,1%) – EDTA (0,25%) (eurobio), à 37°C

pendant 5 à 10 minutes (en fonction du

type cellulaire). La trypsine est inhibée par

5 ml de MEM SVF (décrit ci-dessus).

Les cellules en culture sont

régulièrement observées au microscope

inversé à contraste de phase. Cela permet

de suivre l’évolution de la confluance et de

s’assurer du maintient de la morphologie

épithéliale.

Avant un traitement de facteurs de

croissance, les cellules sont sevrées dans

du MEM supplémenté comme pour le

MEM – SVF d’acides aminés non

essentiels, de L-glutamine, de

pénistreptomycine, de gentamycine, de

bicarbonate de sodium, et d’HEPES. A

ceci, nous ajoutons 2 g/ml de fibronectine

et 30 g/ml de transférine.

b) Extraction des ARN

messagers

Page 10: Mémoire de dea

Les ARN totaux ont été extraits

avec le kit Quiagen selon le protocole

décrit par Quiagen. Ensuite, on évalue la

quantité d’ARN en spectrophotométrie à

260 nm de longueur d’onde. On vérifie

aussi la pureté du résultat en s’assurant que

le ratio 260/280 est compris entre 1,7 et

2. Les ARN sont dilués à 10g /ml puis les

solutions mères et dilués sont stockées à –

80°C.

c) Comparaison de la

sensibilité au NGF des diverses

lignées épithéliales de sein humain

Pour évaluer le niveau d’expression

du NGF et de ses récepteurs, les cellules

ont été ensemencées dans des boites de

petri 100mm (………), à 10000 cellules

par cm2, puis cultivées dans deux

conditions standard :

- 48 heures en MEM – SVF :

condition de sérum.

- 48 heures en MEM – SVF puis

48 heures en MEM sevrage :

condition de sevrage.

(Remarque : dans cette partie, le milieu MEM de

sevrage ne contient pas de rouge de phénol. Ce

n’est pas le cas dans le reste de l’étude.)

Ensuite, les cellules sont trypsinisées. La

quantité de cellules comprise dans chaque

échantillon est déterminée par comptage

sur lame de Malassez. Ensuite, on

centrifuge 10 minutes à 1200 tour par

minutes. Les culots sont conservés à –80°C

en attendant d’en extraire les ARN

messagers. Les ARN seront analysés en

RT-PCR quantitative en temps réel.

d) Test de l’effet de

l’inhibition de contact

Les cellules MCF-7 ont été

ensemencées à 10000 cellules par cm2 dans

des boites de Petri de 100mm de diamètre

puis cultivées en MEM – SVF. Le milieu

est régulièrement changé. Chaque jours,

Page 11: Mémoire de dea

trois boites sont récoltées par une solution

de trypsine, le nombre de cellules est

déterminé par un compteur de cellules

automatique. A partir de ces cellules, on

extrait les ARN messager que l’on analyse

en RT-PCR quantitative en temps réel.

e) Effet de substances agissant

sur la croissance et/ou l’apoptose

Les cellules (MCF7 et BT-20) ont

été ensemencées à 5000 cellules par cm2

dans des boites de petri de 100mm de

diamètre. Les cellules ont été laissées 48h

en MEM – SVF dans un incubateur (37°C,

5% de CO2). A partir de cette étape, il faut

différencier deux cas :

- Pour le test du FGF-2, ainsi que

le test conjoint du butyrate de

sodium (NaB) et du C2 avec le

NGF, les cellules ont été lavées

2 fois avec du PBS stérile (15

minutes puis 2 heures) et mises

24h en MEM sevrage. Enfin,

elles ont été traitées 48h dans

du MEM sevrage supplémenté

de 1ng/ml de FGF-2, 0.5mM de

NaB, 2M de C2, et/ou 200

ng/ml de NGF.

- Concernant les test avec le C2

ou le butyrate de sodium (NaB)

en présence de sérum, le milieu

MEM – SVF a été renouvelé

24h puis les cellules ont été

traitées 48h dans du MEM –

SVF supplémenté de 1mM de

NaB ou 10M de C2.

f) RT-PCR quantitative en

temps réel.

La réaction est faite en une seule

étape. Le mélange de réaction se compose

dans chaque tube de : 50ng d’ADN total

d’échantillon, MgCl2 : 6mM pour TrkA ;

3mM pour p75 ; 4mM pour NGF, 5 l de

tampon TaqMan 10X (500mM KCl, 0,1

mM EDTA, 100 mM tris HCl, pH 8.3, 600

Page 12: Mémoire de dea

nM ROX qui est un dérivé de la rhodamine

utilisé comme référence interne passive

pour normaliser la fluorescence), 20 U

d’ADN polymérase AmpliTaq Gold, 300

M de dATP, dCTP, dGTP, dUTP, 200

nM d’amorces sens et antisens et 200 nM

de sonde.

La transcription inverse se fait

pendant 30 min à 48°C. On active ensuite

par chauffage l’AmpliTaq Gold 10 min à

95°C. Puis on effectue 40 cycles dans les

conditions suivantes : 15 sec à 95°C

(dénaturation) puis 90 sec à 60°C

(hybridation + élongation).

Les données recueillies sont

comparées à une courbe étalon amplifiée

simultanément aux échantillons à partir

d’une quantité connue des ARN standard

respectifs. Une courbe d’amplification est

réalisée par informatique (logiciel Abi-

Prism 7700) en rapportant l’intensité du

signal fluorescent au nombre de cycles de

PCR. La courbe étalon est basée sur une

relation linéaire entre le logarithme de la

quantité d’ARN standard de départ et le

seuil significatif d’augmentation de la

fluorescence ( = cycle de sortie).

g) Immunoprécipitation et

analyse en Western blot

Les cellules sont décolées par 200

l (pour une boite de pétri 100mm) de

tampon de lyse (0.3% SDS, 1% -

mercaptoéthanol, 0.5% Triton X100). Les

cellules ainsi récupérées sont laissées 5

min dans la glace, puis les protéines sont

dissociées par ultrasons. On centrifuge 3

min à 10000 tr/min, on dose le surnageant

en spectrophotométrie (longueur d’onde :

595nm), puis on stocke la solution de

protéines à –20°C.

Pour augmenter l’efficacité du

western, on réalise une

immunoprécipitation au préalable avec les

anticorps spécifiques de TrkA, p75 et

NGF.

Page 13: Mémoire de dea

h) Test d’apoptose en Hoescht

Nous avons réalisé les test

d’apoptose dans des boites de pétri de

35mm de diamètre, dans lesquels sont

déposées 3 lamelles de microscopie cottées

au collagène. Les cellules y sont

encemencées et traitées dans les mêmes

conditions que décrites précédemment.

A l’issue du traitement, on aspire le

millieu, les cellules sont fixées au

méthanol à –20°C puis rincées 2 fois au

PBS . On place ensuite les lamelles dans

une solution de Hoescht, 15 min, à

température ambiante et à l’abris de la

lumière. Les lamelles sont enfin rincées 2

fois au PBS puis montées sur lames

microscopiques avec du glycérol.

On lit les lames en microscopie à

fluorescence. L’observation de la

morphologie des noyaux permet de

déterminer la proportion de cellules en

apoptose.

________________________________________________________

Page 14: Mémoire de dea

RESULTATS   :

Les résultats obtenus se composent

en 3 parties, chacune concernant

l’expression du NGF et des ses récepteurs :

dans différents types cellulaires de sein

humain.

et leur évolution en fonction de la

densité cellulaire.

sur des cellules traitées par des facteurs

agissant sur la prolifération ou

l’apoptose.

1) Expression du NGF et de ses

récepteurs (TrkA et p75) dans les

lignées de cancer du sein et sur les

cellules normales.

Cette étude regroupe toutes les

lignées décrites dans « matériel et

méthodes ». Les cellules ont été cultivées

dans des conditions d’étude standard : en

MEM – SVF ou en MEM sevrage. Compte

tenu de l’activité oestrogénique du rouge

de phénol, nous avons décidé d’utiliser en

sevrage du MEM sans rouge de phénol.

Ceci nous donne 2 conditions standard

extrêmes de culture : en condition

favorable et en condition limitante.

L’objectif a été de collecter les

informations necessaires au choix d’un

modèle expérimental pour la suite du

travail.

a) Expression du gène p75.

La fig. 1A présente le résultat en

RT-PCR quantitative du niveau

d’expression des ARN messagers de p75.

Les types cellulaires sont classées de la

façon suivante : d’abord les cellules

normales, puis les lignées cancéreuses par

ordre décroissant d’hormonodépendance.

On observe pour la majorité des

types cellulaires une expression de p75

significativement plus importante sans

SVF. Il y a une exception néanmoins : la

Page 15: Mémoire de dea

lignée MCF-7 exprime de façon égale ce

gène dans les conditions de sérum et de

sevrage.

Ce sont dans les lignées MCF-7,

T47-D et BT-20 que l’expression du gène

p75 est la plus importante. Elle est par

contre particulièrement faible dans les

cellules normales, ainsi que dans les

lignées SKBr3, MDA-MB-453 et MDA-

MB-468.

b) Expression du gène TrkA.

Les résultats sont présentés dans la

fig. 1B.

On observe dans la plupart des

types cellulaires une expression

équivalente de TrkA dans les conditions de

sérum et de sevrage. Cela concerne les

cellules normales, ainsi que les MCF-7,

SKBr3, MDA-MB-231, MDA-MB-453 et

MDA-MB-468. Dans le cas des lignées

BT-20 et T47-D, TrkA est largement plus

exprimé dans les cultures avec du sérum.

L’expression de TrkA est la plus

faible dans les cellules normales, les MCF-

7, les MDA-MB-231 et les MDA-MB-453.

c) Expression du gène du

NGF.

Les résultats ne sont pas présentés

car l’expression est nulle ou suffisamment

faible pour ne pas être détectable en PCR,

même après 40 cycles, et ce, dans chacune

des conditions précédentes et pour chaque

type cellulaire testé.

Page 16: Mémoire de dea

Fig. 1A :

Fig. 1B :

Page 17: Mémoire de dea

2) Variation de l’expression du

NGF et de ses récepteurs (TrkA et

p75) en fonction de l’inhibition de

contact.

Cette étude a été réalisée sur la

lignée cancéreuse MCF-7.

L’encemencement s’est fait à 50000

cellules par boites. Le jour 1 correspond à

la phase « lag » avec 71600 cellules par

boites. Les jours 2 et 3 composent la phase

« log » avec respectivement 104000 et

181000 cellules par boites. Enfin, le jour 4

représente le début de la phase plateau

avec 270000 cellules.

Ce travail présente l’expression des

ARN messagers des étudiés.

Le résultat de cette étude est

présenté dans la fig. 2A pour p75 et fig.

2B pour TrkA. Comme dans l’étude

précédente, l’expression du NGF a été

testé et il n’est pas exprimé de façon

mesurable.

On observe une expression

relativement forte des 2 récepteurs du NGF

lors de la phase d’adhérence. Par la suite,

cette expression diminue progressivement

jusqu’à la phase de plateau.

Page 18: Mémoire de dea

Fig. 2A :

Fig. 2B :

Page 19: Mémoire de dea

3) Variation de l’expression du

NGF et de ses récepteurs (TrkA et

p75) en fonction de substances

agissant sur la croissance et/ou

l’apoptose.

Cette étude a été commencé sur

deux lignées cellulaires (MCF-7 et BT-20)

choisies comme modèle d’étude au vue des

résultats précédents. Nous avons défini

l’expression de TrkA et p75 (NGF n’étant

pas exprimé, comme précédemment) après

un traitement par le C2 ou le NaB en

milieu MEM – SVF, ou après un

traitement par le FGF-2 en condition de

sevrage. Suite aux résultats de cette étude

qui montre une réponse parfaitement

identique dans les 2 lignées, nous avons

continué le travail sur la seule lignée MCF-

7.

Nous avons ensuite étudié en détail

l’effet conjoint du NaB ou du C2 avec le

NGF.

Cette 3ème partie comprend des tests

d’apoptose en Hoescht, des tests de RT-

PCR quantitative sur les gènes TrkA et p75

qui sont confirmés par Western blot.

Page 20: Mémoire de dea
Page 21: Mémoire de dea

DISCUSSION   ET CONCLUSION:

Les résultats de cette étude montrent comment évolue la sensibilité des cellules

épithéliales mammaires humaines pour le NGF.

Il a fallu tout d’abord choisir le modèle expérimental de l’étude. Nous avons pour cela

comparé le niveau d’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75) dans les

différentes cellules usuelles d’étude du cancer du sein. Le profil obtenu, tant pour p75 que

pour TrkA, a montré des divergences de comportement entre les différents types cellulaires.

Nous avons donc choisi deux lignées : MCF7 qui est typiquement la lignée prototype des

études sur le cancer du sein ; et BT-20 dont le comportement semble (au vu de cette étude

préalable) différent de MCF7 et qui a l’avantage d’avoir un niveau d’expression assez élevé

pour les gènes de notre étude. Par la suite, en constatant que la réponse de ces deux lignées

aux traitements, aussi bien sur la plan de la croissance que de l’expression des gènes, était

identique, nous avons fini l’étude sur la seule lignée MCF-7.

Tout d’abord, les cellules épithéliales mammaires humaines (aussi bien les cellules

normales que les cellules cancéreuses) ne produisent pas le NGF. L’hypothèse de la voie de

régulation autocrine s’avère donc non fondée.

Nous avons largement observé l’expression des deux récepteurs du NGF (TrkA et

p75) en conditions routinière ainsi que son évolution suite à un traitement par des molécules

agissant sur la prolifération ou/et sur l’apoptose. Grâce à la technique de RT-PCR

quantitative, nous n’avons pas constaté de différence d’expression des récepteurs TrkA et p75

suite à un traitement de 48h avec du FGF-2 ou du C2. Nous avons par contre observé une

expression de p75 de l’ordre de trois fois celle du contrôle en cas de traitement 48h avec du

Page 22: Mémoire de dea

NaB. Avec ce même traitement, TrkA ……… Ceci a pu être vérifié dans deux lignées

différentes (MCF-7 et BT-20), avec un profil de réponse au traitement parfaitement identique.

Page 23: Mémoire de dea

BIBLIOGRAPHIE   :

Descamps et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 : 16659-62.

Page 24: Mémoire de dea

REMERCIMENTS   :

Je remercie chaleureusement le Professeur H. Hondermarck et le Docteur J.P. Peyrat pour

m’avoir laissé beaucoup de liberté dans l’organisation de mon travail tout en me faisant bénéficier

d’un encadrement régulier et de qualité.

Un grand merci au Professeur B. Boilly pour l’interret constant qu’il a porté à mon travail et

pour m’avoir généreusement fait profiter de son expérience.

Je remercie tout particulièrement Simon Descamps pour sa patience et sa disponibilité à mon

égard.

Merci aux Docteurs X. Dong-Lebouhris et Y. El Yazidi pour leur bonne humeur et leur

gentillesse.

Je me dois aussi de ne pas oublier tous ceux sans qui mon travail n’aurait pas pu être aussi

enrichissant : Pr Victor Nurcombe, Dr Patrice Richard, Dr. Louis Hornez, Dr. Françoise Révillon,

Valérie C., Valérie P., Anne-Sophie, Rachel, Sylviane, Isabelle, Marie-Michelle, Laurent, Robert-

Alain, David V., David L., Johan, Alain, Arnaud,…

Une pensée émue enfin, avec l’espoir sincère d’une rapide guérison, pour Anthony, je te

souhaite tous mes vœux pour une longue carrière dans la recherche quand ta maladie sera passée.