manipuler les protéines membranaires et les membranes à l ......2 dilution sous cmc (ou biobeads)...
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04
ManipulerManipuler les les protéinesprotéines membranairesmembranaires et les et les membranes à membranes à l’aidel’aide de de polyamphiphilespolyamphiphiles..
Physico-chimie des Polymères et Milieux Dispersés
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Dispersion de membranes
Manipulation de protéines membranaires.Manipulation de protéines membranaires.
Détergent
Retrait possible des micelles labiles (dilution, dialysis, biobeads...)
-STABILITE DU COMPLEXE SANS EQUILIBRE AVEC LA PHASE AQUEUSE
-DISPERSION CONTROLEE DE MIXTES LIPIDES/PROTEINES
1
3
2
Polyamphiphile(Amphipol)
Purification / étude
(chromato, dialyse, centri …)EN PRESENCE DE DETERGENT!
Multiautors review, Cell Mol. Life Sci 60 (2003) 1-16
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04 Assemblages Assemblages polymèrespolymères / membranes/ membranes..
Fluidité / réorganisation des structures:Membranes lipidiques
Vers un boîte à outils membranaires:
+
Adsorption Adsorption DistorsionDistorsionSolubilisationSolubilisationPermPermééabilitabilitééRupture Rupture MicellisationMicellisation
hydrophobe
hydrophile
C. Ladavière, C. Tribet, S. Cribier, Langmuir 2002, 18, 7320F. Vial, S. Rahbi, C. Tribet, Langmuir 2004, in press
pores transitoires rupture ou fuite
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Membranes lipidiques
Modulation des morphologies membranaires.Perméabilisation
Dispersants et stabilisants de protéines.
Extraits membranaires
Quelques polyamphiphiles synthétiques
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04 Polymères modifiés hydrophobe (HMPAs)Polymères modifiés hydrophobe (HMPAs)
structures ajustablesstructures ajustables
code y (mol%)150-1C18 0.9± 0.2
long 150-3C18 3.3 ± 0.3copolymers 150-5C18 5.0 ± 0.4
150-7C18 7.2 ± 0.45-3C18 3.0±0.2short
polymers 5-5C8 5.0±0.1
- long HMPA Mn 150 000; Ip~6
⇒ gels
- Dispersions HMPA courts Mn 5000 ou 20000, Ip~2
Amphipol 5-25C8-40C3
(Mw-yCn-zCm)
Modification de PAA ⇒ même squelette, copolymère aléatoire
Ajustment d’ hydrophobie & densité chargeCH2 CH CH2 CH CH2 CH
C C CO O O
O NH NH
CnH2n+1 C3H7
Na
100-z-y zy
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04 Autres « amphipols » typiques
(CH2 CH)y (CH2
C O
CH)z
C O
(CH2 CH)u
C OCH)x
NH
(CH2)7CH3
NH3C CH3
OHNOH
OHCH2OH
OH
(CH2
C OO- +Na
mphipols anioniques, quasi-neutres ou bien solubles à bas pH
20[15C8-34C2]
20[15C8-50C2]
20[15C8-58C2]
20[20C8-50C2]
20[15C8-78C2] (quasi neutre)
20[33C8-55C2]
20[32C8-25Glu]
télomères neutres avec R1 = chaîne n-heptyle ou n-undécyle. R2 = H ou β-D-galactopyranosyle
N6[18C7,5C12]
N8 [28C7,3C12]
N7[18C7,79Gal,3C12]
N3[25C11,4C12]
N5[22C11,9C12]
N28[17C11,1C12]
(CH2 CH)x
C O
(CH2 CH)y H
C O
NH
C12H25S
NH
O OH OH OH OH OR2
HN
O
R1
C. Prata, F. Giusti, Y. Gohon , B. Pucci , J.-L. Popot , C. Tribet, Biopolymers (2001)
Greffage
Co-télomères
ATRP : (N. Pantoustier)
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Membranes lipidiques
Modulation des morphologies membranaires.Perméabilisation
Dispersants et stabilisants de protéines.
Extraits membranaires
Quelques polyamphiphiles synthétiques
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04 Vésicules lipidiques étudiées
Car
acté
risat
ions
Car
acté
risat
ions
SUV : Rh ≈ 60 nm (sonication) ou GUV: 20-30µm (electroformation)
- Mw : diffusion de lumière statique
- Rayon : diffusion de lumière dynamique
- Perméabilité : fuite de calcein, de Dextran, de protéines
- Adsorption du polymère: NRET , électrophorèse
-Microscopie (épifluorescence)
- Conductance de films noirs (dynamique des pores)
O
P OO
O
CH2CH
O
C O
CH2
O
C O
C15H31 C15H31
CH3
NH3C CH3
CH2
CH2
O
P OO
O
CH2CH
O
C O
CH2
O
C O
C15H31 C15H31
DPPA
eggPC = mélangeR1 60% palmitate 16:0, 30%stearate 18:0
R2 66% oleate 16:1 and 34% 16:2.
DPPC
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Influence d’une adsorption de polymère
sans polymère5-3C18
0.125g/L5-3C180.5 g/L
↑ polymer concentration (16h at 4°C pH 7.0)
• Perte de souplesse
• Formation de spots sombres
G × 25
+ GUV unilamellaires (electro-formation)
egg-PC + NBD-PC•Bis Tris/HCl 10mM pH7• (Polymer / Lipid)wt ≥ 10• Nb C18 / lipid ≈ 3
10 µm
NH
NO
N
NO2
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04 Réorganisation en domaines
phase contrast Fluorescence (488 nm)
Formation of facets
eggPC : NBD-PC + 5-25C8 (0.5g/L) 4°C 1h
a, c : sharp depth of field : periphery b, d : large depth of field: upper crown
+T > Tc
C. Ladavière, C. Tribet, S. Cribier, Langmuir 2002, 18, 7320
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Contrôler la perméabilité membranaire
NBD-PC (fluorescence at 488nm) RITC-Dextran (9300 g/mol; fluorescence at 514 nm)
Surface:Surface: Volume:Volume:
10µm
+ 5-25C8-40C3 + 150-3C18
BisTris/HCl 10mM pH7 // (polymer / lipid)wt/wt≥ 16 // [Dextran]f ≈ 1 g/l
a et b) 1H45 at 4°C, c) 3days, 4°CUnilamellar: 1-2h
Multilamellar: no leakagebefore 24h (& // breakdown…)
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Calcein leakage of egg-PC/DPPA SUV in presence of 5-25C8-40C3(10mM BisTRIS-HCl buffer pH 6.8 and NaCl, 25°C).
Calcein (25mM)
Calcein (10µM)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0 5 10 15 20 25time (min)
I flu
o -Io
no added saltNaCl 25 mMNaCl 50 mMNaCl 100 mM
c.a. 100% release at20% change by SLS
Contrôler la perméabilité membranaire
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04 BILAN :
+
Rh polymer
~1mono/10 lipids
conditions critiques (Solvant, pH, sel)
Permeabilisation sans translocation du polymère
30-50nm
10nm
Cinétiques lentes:heures /jours
hydrophobie
Absence de structure intrachaine
Polydispersité
3-20 « ancres» hydrophobes
Association
monomère/lipide
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Membranes lipidiques
Modulation des morphologies membranaires.Perméabilisation
Dispersants et stabilisants de protéines.
Extraits membranaires
Quelques polyamphiphiles synthétiques
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04
BR
OmpF RC
0
20
40
60
80
100
Heca
meg
buffe
rpr
ecur
sor
A 8-
75A
8-35
A 34
-75
A 34
-35
% o
f pro
tein
in su
pern
atan
t
0
20
40
60
80
100
0.05% 0.005 %
Other proteins
b6 f
A 8-75A 8-35
buffer
A 34-75
A 34-35
AmphipolsAmphipols & protéines: solubilité& protéines: solubilité
Dispersion de complexes protéine/détergent
Amphipol
1
2 Dilution sous CMC (ou biobeads)
Séparation des agrégats
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Dark-field Scanning transmission electron microscopy image of an unstained cytochrome b6 fcomplexed with the amphiphilic short polyanions A8-75 (a C8 modified poly(acrylic acid) of Mw8000). Dark bar: tobacco mosaic virus added as an internal standard of diameter 18 nm. Dots:complexes of diameter c.a. 10-15 nm.
0 2 4 6 8 10 12 14 160 2 4 6 8 10 12 14 160.0
0.1
0.2
0.3
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4TOP BOTTOM
pelle
t
pelle
t
BOTTOMTOP
OmpF
b6 fBR
RC
Prot
ein
conc
entra
tion
(a.u
.)
Fraction number
AmphipolsAmphipols & membrane & membrane proteinsproteins: : dispersitydispersity
Rate zonal Ultracentrifugation (in sucrose gradient)
Complexes with 5-25C8-40C3
S T E M (extensively washedcomplexes on a carbon grid)
Complex with 5-25C8
Faible dispersité en taille.
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04
-1
3
7
11
15
-1 4 9 14 19 24elution volume (ml)
mD
O (U
.A à
554
nm
)
-1
1
3
5
7
9
11
13
15
17
mD
O (U
.A. à
280
nm
)
BR/deuteratedpolym.
BR/hydrog.polym.
(buffer PNa 20 mM pH 7.1, 100 mM NaCl)
ref:catalase (Mw 220 kDa)
Rs app(BR/Apol)=5,1 +/- 0,7 nm
BR/DA8-35 - 85% D2O
-3
-2
-1
0
0 0,002 0,004 0,006 0,008
q2
ln I
Guinier plot of SANS at conditions that match or not the polymer contribution
GPC: low polydispersity
BR/DA8-35 - 0% D2O
-3
-2
-1
0
1
0 0,002 0,004 0,006 0,008
q2ln
I
Complex Rg = 3.0 nm
Protein Rg = 2.4 nm
Catalase
AmphipolsAmphipols & membrane & membrane proteinsproteins: size : size andand structure.structure.
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04 Complexes Complexes amphipolsamphipols / protéine membranaire intégrale/ protéine membranaire intégrale
Polymère amphiphile flexible très hydrophobes ⇒ association multipoints
Métastabilité
“Amphipol”
Tribet R. Audebert, J.-L.Popot, PNAS (1996) C.Tribet, R. Audebert, J.-L.Popot, Langmuir (1997).K. Martinez, Y. Gohon, PJ Corringer, C Tribet, F. Merola, JP Changeux, JL Popot FEBS Lett. (2002)
Avantages: stable à la dilution (CMC=0)
mais association renversable
- Développements: NMR, structures Xtal
- Piégeage de super-complexes ou de Rafts
Multiautors review, Cell Mol. Life Sci 60 (2003) 1-16
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04 Remerciements
Les responsables :-S. Cribier (IBPC, Paris)
-C. Ebel (IBS, Grenoble)
-D. Engelman (Yale)
- M. Haider(EMBL, Heidelberg)
-J.L. Popot (IBPC, Paris)
- P.Timmins (ILL, Grenoble)
……
Les courageux:-Y. Gohon
- C. Ladavière
-S. Rahbi, M. Toustou (DEA)
- F. Vial