lmd immunotechnologie et vaccinologie ksouri h & haj sassi f

2me Anne Biologie

LMD Immunotechnologie et Vaccinologie 2008-2009

1

2me Anne Biologie


Fascicule labor par :

KSOURI Habib Haj SASSI Fayal

Anne 2008-20092

2me Anne Biologie


Sommaire

PROTEINES RECOMBINANTES ET ANTICORPS MONOCLONAUX Les protines recombinantes ...6 Production des anticorps monoclonaux .18 Utilisation des anticorps monoclonaux comme outil danalyse .. 30 Utilisation des anticorps monoclonaux en thrapeutique humaine .49 Protomique : Principes et Applications .59

THERAPIE CELLULAIRE Bases fondamentales de limmunomodulation.....74 Cellules dendritiques .....86 Lymphocytes T rgulateurs ..94 Cellules souches msenchymateuses ....101 Nanotechnologies : Principes et Applications .109

ANIMAUX TRANSGENIQUES ET ANIMAUX KNOCKOUT Principes et Applications..118

VACCINOLOGIE Principes et bases immunologiques de la vaccination .136 Classification et mode de prparation des vaccins. Nouveaux vaccins ..151 Les bases pidmiologiques de la vaccination .161 Les stratgies de prvention vaccinale et leur surveillance ..167 Les maladies prvention vaccinale 176 3

2me Anne Biologie


PROTEINES RECOMBINANTES ET ANTICORPS MONOCLONAUX

4

2me Anne Biologie


Objectifs

1- Dfinir une protine recombinante. 2- Citer les principales tapes de production dune protine recombinante. 3- Citer les lments indispensables pour produire une protine dans E. coli. 4- Citer les techniques utilises pour augmenter la force des promoteurs. 5- Citer pourquoi on utilise un promoteur inductible. 6- Citer les facteurs dont doit tenir compte la construction du vecteur gntique. 7- Citer les principaux avantages et les principaux inconvnients de la production de protines recombinantes dans E Coli.

5

2me Anne Biologie


LES PROTEINES RECOMBINANTES

1-

Dfinition : Les protines recombinantes sont des protines produites par des cellules dont l'ADN a

t modifi par recombinaison gntique. Au sens large, un systme de production adapt la fabrication d'une protine recombinante donne, est un processus biotechnologique qui s'appuie principalement sur :

l'emploi d'un vecteur d'expression (en gnral un plasmide ou un virus -pour les vecteurs eucaryotes-), jouant le rle de transporteur gntique du gne d'intrt codant pour la protine recherche ;

l'utilisation d'une cellule hte, charge d'excuter les instructions fournies par le gne d'intrt qui lui est insr, dans l'objectif de synthtiser la protine recherche ;

une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les volumes de protines souhaits.

enfin, une sparation et extraction de la protine du milieu de culture, suivie par une purification de celle-ci.

Un systme de production de protines recombinantes est caractris par un couple constitu d'un vecteur d'expression et d'un hte (cellule ou organisme). 2Techniques mises en uvre : Une vaste gamme de systmes de production de protines recombinantes, c'est--dire de couples vecteurs-htes est aujourd'hui disponible, chacun d'eux prsentant des avantages et des inconvnients. Les htes les plus utiliss l'heure actuelle sont incontestablement la bactrie Escherichia coli, la levure Saccharomyces cerevisiae et les cellules CHO extraites des ovaires de hamster. 3Production des protines recombinantes : Lexpression des protines peut se faire dans un systme eucaryote (ovocyte de Xnope), ou procaryote Escherichia coli (E. coli), qui reste le premier hte utilis pour la fabrication de protines recombinantes. 6

2me Anne Biologie


E. coli est un des organismes actuellement les mieux connus. Cette bactrie a plusieurs proprits intressantes pour tre utilise pour exprimer des protines en grandes quantits : elle est facile manipuler, elle pousse vite dans des milieux relativement peu chers et les souches de laboratoires sont inoffensives.

1) Ce qui est indispensable pour produire une protine dans E. coli. : Pour exprimer un gne dans E. coli, il doit tre insr dans un vecteur qui contient plusieurs lments : 1- Une origine de rplication, un marqueur slectionnable pour trier et maintenir les bactries ayant incorpores le vecteur, et un polylinker comme tous les plasmides servant de vecteur, 2- Un promoteur contrlable dont l'induction produira une grande quantit dARNm partir du gne clon, 3- Les squences responsables de la traduction telle qu'une squence de liaison au ribosome, ces squences doivent tre bien positionnes. a. Lorigine de rplication Le gne doit tre rpliqu dans la bactrie, autrement, on va le perdre trs rapidement. La mthode gnrale consiste linsrer dans un plasmide qui porte une origine de rplication.

7

2me Anne Biologie


b. Les promoteurs Deux domaines en amont du site d'initiation de la transcription sont importants dans les promoteurs procaryotes. Le domaine -10 (Pribnow box, 5' T-A-T-A-A 3') et un domaine -35 (5' T-T-G-A-C-A 3'). Ces deux domaines sont en contact avec la RNA polymrase lors de l'initiation de la transcription. Deux caractristiques des promoteurs sont importantes pour lexpression des protines, la force du promoteur et son inductibilit : La force du promoteur : Les promoteurs bactriens sont relativement faibles pour les besoins de production. Pour les amliorer, des mutations ponctuelles ou des petites dltions ont t effectues au sein de ces promoteurs, ce qui a permis d'augmenter la transcription. Plusieurs techniques ont t utilises pour augmenter la force des promoteurs :

On peut liminer des rpresseurs. Ainsi Le promoteur Plac du gne lacZ dpend de

l'activation par la CRP/cAMP. Pour pouvoir tre utilis, ce promoteur doit tre mut afin que la rpression catabolique ne puisse pas s'exercer (le rle de la rpression catabolique est de ne pas utiliser le galactose en prsence d'autres sources de carbone, principalement le glucose), ainsi on pourra avoir une transcription en prsence de glucose.

La technique de choix pour augmenter la

force dun promoteur est dutiliser un promoteur spcifique dune RNA polymrase quon

Augmentation de la force du promoteur par utilisant la T7 RNA polymrase

surproduit dans la cellule. Le plus utilis est le promoteur de la protine 10 du phage T7. La transcription utilisant la T7 RNA polymrase est trs efficace. En effet, la polymrase utilise la plupart des nuclotides triphosphate de la cellule ce qui inhibe la transcription des gnes de l'hte. Elle est 5 fois plus rapide que les polymrases bactriennes. La transcription peut faire

plusieurs fois le tour du plasmide donnant un ARN trs grand. De plus, la T7 RNA polymrase est trs spcifique, elle ne reconnat pas les promoteurs de la bactrie, si bien qu'elle ne transcrit que le gne d'intrt. 8

2me Anne Biologie gie


-

Linductibilit : Cest dire son contrle : le plus souvent on dsire utiliser un promoteur inductible

par exemple lorsque la protine est trs toxique pour la bactrie. Dans ce cas, la protine est produite en dbut de la culture et inhibe la croissance cellulaire. En utilisant un promoteur utilisant inductible, on cherchera inhiber la production au dbut de la phase de croissance des bactries puis lapproche de la phase stationnaire, on induira la production. On peut utiliser des inhibiteurs de la RNA polymrase. La T7 RNA polymrase est inhibe par le lysozyme. Si on introduit le gne codant pour le lysozyme sur un plasmide, la production de lysozyme inhibera le peu de T7 RNA polymrase produite en labsence dinduction. Par contre en prsence dinduction, linhibiteur sera en trop faible quantit induction. comparativement la T7 RNA polymrase surproduite. On peut ajouter lARN polymrase au moment de la production. Dans certains cas la protine exprime est toxique pour la bactrie. Or tous les promoteurs inductibles ont une activit basale faible, si bien que la protine est produite en faible quantit en l'absence d'induction (on dit que le promoteur fuit). Si la protine est trs toxique, on peut utiliser une autre stratgie pour produire la T7 RNA polymrase en utilisant un phage M13 produisant la re T7 RNA polymrase. On fait pousser les bactries puis avant de produire, on infecte les bactries par le virus. Le virus produit la T7 RNA polymrase puis le gne d'intrt est transcrit. Dautres stratgies sont aussi utilises / : la stratgie antisens.

9

2me Anne Biologie


c. Les squences responsables de la traduction Chez les procaryotes, l'initiation s'effectue par reconnaissance d'une squence particulire (RBS, ribosome binding site). Cette squence est compose dune squence riche en purine (Shine-Dalgarno, RBS, AGGAGG) et du codon d'initiation qui doit tre proche, idalement l'extrmit 3' du RBS doit tre 6 bases de l'ATG. Donc, si on veut exprimer un clone provenant d'une cellule eucaryote dans une bactrie, il faudra incorporer cette squence en amont de l'ATG d'initiation. Gnralement, on mutagenise la squence du gne d'intrt au niveau de l'ATG en y incorporant un site de restriction tel que Nde I (CATATG). Ce site est prsent sur le vecteur 8 nuclotides en aval d'un site de liaison au ribosome. d. Les squences responsables de larrt de la transcription On peut dans certains cas ajouter en 3' du gne des squences responsables de l'arrt de la transcription. Au niveau d'un signal de terminaison, la polymrase libre la matrice et l'ARN monocatnaire nosynthtis. Chez E. coli, il y a deux sortes de terminaison, une terminaison intrinsque et une terminaison dpendante dune protine, la protine . Dans la terminaison intrinsque, la polymrase s'arrte quand elle synthtise une srie de rsidus U dans la mesure o elle a d'abord synthtise une squence auto-complmentaire capable de se replier. C'est le repliement, l'hlice en pingle cheveux, qui se forme rapidement dans cette rgion, qui est cruciale pour l'arrt de la transcription. La squence de la rgion auto-complmentaire peut varier. Lors de la terminaison dpendante, la protine reconnat une squence sur lARN nosynthtis et catalyse larrt de la transcription.

Dans certains cas, on ajoute une squence de terminaison indpendante en 3 du gne, il y a formation dune boucle qui termine la transcription. Cette boucle a un autre avantage, elle stabilise lARN en inhibant lactivit des 3 5 exonuclases qui ne dgradent que lARN simple brin. Toutefois ces squences ne sont indispensables et sont inefficaces pour larrt de transcription dans le cas dune production utilisant la T7 RNA polymrase.

10

2me Anne Biologie


4-

Modifications post-traductionnelles des protines produites : Le choix du systme dexpression est principalement guid par les modifications que

la protine doit subir pour tre biologiquement active. Bien quil existe des techniques permettant le transfert rapide des gnes clons entre diffrents systmes dexpression, le vecteur gntique, utilis pour exprimer le gne recombinant, doit tre adapt lhte choisi. De mme, il est important de connatre le compartiment cellulaire dans lequel la protine dintrt se replie ou exerce son activit biologique naturelle. Selon que cette protine est cytoplasmique, membranaire ou se replie dans un compartiment extracytoplasmique

Le vecteur devra contenir des squences spcifiques permettant ladressage correct de la protine. ce stade, lutilisation doutils informatiques prdictifs facilite lanalyse de la structure primaire des protines en apportant des indications quant sa localisation cellulaire. Ainsi, la prsence dune hlice hydrophobe indique que la protine est insre dans une membrane, ou doit ventuellement la traverser au cours de sa biosynthse pour atteindre un compartiment cellulaire diffrent du cytoplasme dans lequel elle est synthtise. La construction du vecteur gntique devra donc tenir compte de tous ces lments indispensables ladressage correct de la protine dans lhte cellulaire. La glycosylation des protines oriente, videmment, vers une production extracytoplasmique dans les systmes 11

2me Anne Biologie


dexpression eucaryote bien documents, comme les levures, les cellules de mammifres ou encore les cellules vgtales. Cependant, une modification post-traductionnelle souvent nglige au sein des structures protiques est la formation des ponts disulfures. Indpendamment du systme utilis, procaryote ou eucaryote, il nest pas rare que la protine soit produite dans un compartiment cellulaire inappropri ne permettant pas cette modification. La formation des ponts disulfures est catalyse par un complexe enzymatique doxydorductases prsent dans un compartiment mtaboliquement oxydant, qui est soit le priplasme pour les bactries Gram-ngative, soit le rticulum endoplasmique pour les cellules eucaryotes. Les protines possdant des ponts disulfures sont gnralement actives dans un milieu extracytoplasmique, et cette liaison covalente est le plus souvent ncessaire leur stabilit. Par consquent, la production des protines ponts disulfures dans lenvironnement rducteur du cytoplasme conduit le plus souvent des problmes de repliement.

5-

Contrle de la conformation des protines La production dune protine ayant pour objectif dobtenir celle-ci dans une

conformation proche de son tat natif, il est important de pouvoir contrler le produit final. Ce contrle final revt un caractre essentiel dans les cas o la protine recombinante est purifie aprs renaturation des corps dinclusion, ou dans le cas dune application thrapeutique, lobtention dune protine soluble ne signifiant pas toujours quelle est dans un tat natif. Un ensemble de techniques biochimiques comme llectrophorse et la chromatographie par gel filtration, ou biophysiques comme la spectromtrie de masse, sont conduites pour tester lintgrit, lhomognit et la qualit des structures protiques. Si la protine est produite afin de dterminer sa structure tridimensionnelle, par cristallographie aux rayons X ou par rsonance magntique nuclaire, lobtention de cette structure est une excellente validation du processus complet. Mais les tests dactivits biologiques qui dpendent de la protine dintrt, et qui sont par nature trs varis, reprsentent la meilleure sonde de la structure native. Conclusion et perspectives : ct du choix eucaryote versus procaryote, une troisime possibilit a t apporte rcemment par lamlioration des systmes acellulaires qui, fonds sur le couplage des ractions de transcription et traduction in vitro, ont aujourdhui des rendements de synthse 12

2me Anne Biologie


levs. Bien quils soient onreux, ces systmes permettent la production de protines toxiques et offrent une flexibilit incomparable, par rapport aux systmes cellulaires, pour manipuler les paramtres dexpression. Enfin, le choix dun systme dexpression repose sur dautres critres comme sa simplicit dutilisation, le cot de production et de purification de la protine, la capacit de contrler le produit final et les modifications introduites, le temps requis du clonage du gne la protine purifie, et les contraintes rglementaires.

Exemples de protines recombinantes produites dans E.Coli : hormone de croissance humaine, insuline, interfrons, interleukine-2... Principaux avantages : sa gntique est trs bien connue. De nombreux vecteurs plasmidiques ont t construits et sont donc disponibles afin d'insrer et d'exprimer un gne tranger au sein de la bactrie. Elle est par ailleurs facile utiliser, se prte trs bien la culture de masse en fermenteur. Enfin, les taux d'expression obtenus sont levs, c'est--dire qu'elle permet de produire des quantits apprciables de protines (jusqu' plusieurs grammes par litre). Principaux inconvnients : scrtant mal les protines, il est souvent ncessaire de "casser" la bactrie afin de rcuprer la protine (ce qui induit des problmes de purification, ou de solubilisation et de renaturation..., quelquefois au dtriment des rendements). Autre inconvnient majeur : E. coli n'effectue pas les modifications post-traductionnelles des protines (en particulier la glycosylation, la carboxylation, etc.), qui constituent souvent une condition sine qua non d'activit de la protine. Enfin E. coli tant une entrobactrie, il est donc ncessaire de s'assurer de l'absence d'endotoxines dans les protines purifies.

13

2me Anne Biologie


14

2me Anne Biologie


ADN recombinant et clonage de gnes

15

2me Anne Biologie


16

2me Anne Biologie


Objectifs

1- Dfinir un anticorps monoclonal. 2- Citer les diffrentes tapes de production dun anticorps monoclonal par la technique des hybridomes. 3- Dfinir le terme hybridome. 4- Citer les techniques de purification des anticorps monoclonaux. 5- Dfinir un anticorps monoclonal murin, hybride et humanis. 5- Dfinir les termes HAMA et HAHA. 6- Citer les applications des anticorps monoclonaux.

17

2me Anne Biologie


PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX (LA TECHNIQUE DES HYBRIDOMES)

Introduction : Les anticorps monoclonaux (Ac Mo) sont des Ac qui ont t artificiellement produits contre un antigne (Ag) spcifique. Ils sont extrmement spcifiques en se liant leurs Ag cibls. En laboratoire, les Ac Mo sont produits partir de clones d'une cellule. C'est pourquoi ils s'appellent monoclonaux . Ceci signifie que tous les Ac produit par cette cellule sont exactement identiques. La qualit d'une prparation d'Ac pour des fins de dosages ou d'identification repose sur deux facteurs principaux, la spcificit et l'avidit (ou affinit). Tout d'abord, l'Ac ne doit ragir que contre la protine d'intrt pour viter les ractions croises avec d'autres protines susceptibles de la contaminer, c'est la spcificit. D'autre part, il doit ragir fortement avec cette protine et avoir une grande affinit pour elle, c'est l'avidit. En 1975, Khler et Milstein ont russi fabriquer des Ac Mo laide de la technique de lhybridome. Au cours des 25 dernires annes, les techniques de biologie cellulaire et molculaire se sont affines, si bien quil est devenu possible aujourdhui de fabriquer des quantits pratiquement illimites dAc Mo murins, chimres et humaniss pour de nombreuses applications cliniques, notamment dans la recherche, le diagnostic et le traitement des maladies. Les premires applications thrapeutiques ont fait appel des Ac Mo produits chez la souris (Ac murins). Les injections dAc murins provoquaient cependant des ractions immunes et entranaient la formation dAc humains anti-souris (Human Anti-Mouse Antibodies : HAMA). La dcouverte du fondement gntique de la diversit des Ac et la biotechnologie du DNA recombinant ont, par la suite, ouvert la porte aux formes partiellement humanises dAc murins. Les Ac Mo chimres, humaniss et entirement humains sont moins immunognes, et induisent beaucoup moins frquemment la formation dAc anti-immunoglobuline dans le cadre de la pratique thrapeutique. Ces Ac peuvent par consquent tre utiliss de manire rpte durant une priode prolonge. Les Ac Mo se sont ainsi largement imposs au cours des dernires annes dans le traitement de diffrentes formes de cancer, de certaines maladies rhumatismales ou auto-immunes, de mme que dans le contrle des ractions de rejet aprs greffe. 18

2me Anne Biologie


1-

Immunisation des animaux : Certaines espces sont particulirement employes pour produire des Ac Mo: la souris,

le rat etc. ... . Le choix de l'animal repose sur divers critres. Si on doit produire beaucoup d'antisrum, on choisit alors un animal plus grand. D'autre part, si on veut un animal facile manipuler et lever en laboratoire, on se tournera vers des espces plus petites. Quoi qu'il en soit, il est trs important de choisir un animal qui est phylogntiquement le plus loign possible de la source de la protine avec laquelle on veut faire l'immunisation. En effet, une protine est d'autant plus antignique qu'elle ne ressemble pas une protine normalement prsente chez l'espce qu'on veut immuniser. Ainsi, si on veut prparer un Ac contre une protine de rat, on prfrera immuniser un cheval ou une chvre plutt qu'un autre rongeur (souris ou lapin). Il est aussi vident qu'on ne peut pas immuniser un animal contre une protine commune aux animaux de sa propre espce. Les souris sont particulirement employes pour la production d'Ac Mo. On peut injecter l'antigne de plusieurs faons, l'important est que l'antigne reste le plus longtemps possible dans l'organisme et arrive dans la circulation sanguine petit petit pour maximiser la production d'Ac. Les principales voies d'administration sont les voies sous-cutane, intradermique, ou intramusculaire. Pour ralentir la libration de l'antigne dans la circulation sanguine et activer la rponse immunitaire on combine gnralement l'antigne une mulsion appele adjuvant. Le plus connu est sans contredit l'adjuvant de Freund qui est compos d'huile minrale additionne d'un agent mulsionnant (adjuvant incomplet) et de particules de bacille inactiv de la tuberculose (adjuvant complet). D'autres produits sont plus rarement employs comme des sels d'alun, de l'albumine srique de buf mthyle, etc. Le systme immunitaire produit relativement facilement des Ac contre les grosses molcules comme les protines et les polysaccharides, on qualifie ces molcules d'immunognes. Cependant les molcules de petite taille (/ : hormones strodiennes, petits peptides, etc.) sont trs peu antigniques. On peut cependant produire des Ac contre de petites molcules qu'on appelle alors "haptnes". Il faut tout d'abord conjuguer ces petites molcules sur des vecteurs "carriers", des protines comme l'albumine. Ce complexe, une fois inject chez l'animal induira la formation d'Ac contre l'haptne en tant que tel et le vecteur. Aprs avoir dbarrass les Ac contre l'haptne proprement dit de ceux reconnaissant le vecteur, on peut alors utiliser ces anti-haptnes. C'est de cette faon qu'on peut prparer des Ac contre certaines hormones, mdicaments ou des petits peptides.

19

2me Anne Biologie


Le srum contenant l'Ac recherch est appel antisrum. Il contient normalement plusieurs espces d'Ac diffrents (environ une dizaine de clonotypes) dirigs contre plusieurs pitopes (dterminants ou sites de liaison) du mme antigne, on appelle cette prparation polyclonale. Avec un tel mlange, une mme molcule d'antigne peut fixer en mme temps plusieurs Ac diffrents, chacun sur son pitope spcifique. On a dvelopp des techniques permettant d'isoler et de cloner des lymphocytes ne produisant qu'une espce molculaire (i.e. clonotype) d'Ac, ces Ac sont appels Mo. Ces Ac ne reconnaissent qu'un seul pitope de l'antigne.

2-

Prparation d'Ac Mo : Une prparation d'Ac Mo contient une seule espce d'Ac (clonotype) ne reconnaissant

qu'un seul pitope de l'antigne. Pour obtenir une telle prparation, on injecte tout d'abord l'antigne une souris. Aprs quelques jours, la rate contiendra un grand nombre de lymphocytes B produisant divers clonotypes. Les lymphocytes B ne peuvent pas prolifrer dans des cultures de cellules in vitro. Ces lymphocytes B de la rate peuvent quand mme tre isole et fusionner grce au polythylne glycol (PEG) avec des cellules de mylome, qui sont des cellules transformes, c'est--dire des lignes immortelles. Les souches de mylome utilises doivent tre des mutants n'ayant pas, soit la thymidine kinase (TKase), soit la HGPRTase, deux enzymes ncessaires la biosynthse de novo des nuclotides. Ces cellules ne peuvent se dvelopper et se multiplier qu'en produisant des nuclotides par les voies mtaboliques de rcupration des nuclotides. Ces voies sont inhibes par des antagonistes de l'acide folique comme l'aminoptrine. Ces mylomes mutants meurent dans un milieu contenant de l'aminoptrine o tout antagoniste de l'acide folique parce qu'ils sont incapables de biosynthtiser des nuclotides. En effet l'aminoptrine bloque la biosynthse via les voies de rcupration et la mutation empche le fonctionnement des voies de novo. Le milieu contient aussi de la thymidine et de l'hypoxantine (milieu HAT), les deux bases azotes qui constituent les points de dpart des voies de rcupration.

20

2me Anne Biologie


Immunisation de la souris

Ablation de la rate Fusion des et extraction des Lymphocytes B

Microculture primaire

cellules splniques des cellules et mylomatoses en milieu HAT

Le rsultat de la fusion donnera un mlange contenant alors trois types de cellules. Des cellules de rate non fusionnes qui produisent des Ac, mais qui sont incapables de croitre in vitro. Des cellules transformes non fusionnes capables de se multiplier mais sont inhibes par l'aminoptrine. Enfin, des hybridomes, c'est--dire les cellules rsultant de la fusion des cellules transformes et des lymphocytes. Les hybridomes sont capables de se multiplier indfiniment car ils possdent le gnome des cellules transformes. De plus, comme ils possdent aussi le gnome des lymphocytes, les hybridomes sont capables de biosynthtiser des nuclotides par la voie de rcupration en utilisant la thymine et l'hypoxanthine du milieu. Donc seuls les hybridomes seront capables de prolifrer dans ce milieu et de produire des Ac. Evidemment la plupart des hybridomes ne produiront pas l'Ac recherch, il faut alors procder un criblage pour les isoler et les cloner. Pour isoler des clones ne produisant qu'une seule espce d'Ac, on a recourt la technique des dilutions limites ou la cytomtrie de flux. On dilue les hybridomes une concentration trs faible. On prpare des cultures avec de trs petits volumes. La dilution limite fait en sorte que les probabilits que ce trs petit volume contienne deux cellules sont extrmement faibles. On est donc quasi assur que les cellules obtenues dans chaque culture ne proviennent que d'une seule cellule initiale; ce sont donc des clones purs qui videmment, ne produisent qu'un seul clonotype d'Ac. Les clones produisant un Ac adquat peuvent ce moment tre identifis. Le rendement de cette mthode est videmment trs faible, et une trs faible fraction des hybridomes produiront un clonotype contre l'antigne.

21

2me Anne Biologie


Sceening des microcultures primaires pour leur croissance. Tester les Ac utiles dans le surnagent des cultures cellules. Utiliser le srum de la souris immunise comme contrle positif. Le srum dune souris nave et le surnageant de culture des cellules mylomateuses fourniront les contrles ngatifs. Transfrer les cultures scrtant les Ac dans des Viaux de plus en plus grands, pour les expendre

Slectionner les hybridomes scrtant les Ac Mo voulus grce un trie par le cytomtre flux ou par dautres mthodes (dilutions limites)

Ces clones doivent tre alors l'objet de cultures massives pour produire des quantits suffisantes d'Ac. Mme si ces cultures massives peuvent tre faites in vitro, elles sont cependant plus souvent faites in vivo. Pour cela, on injecte ces cellules dans l'abdomen d'autres souris o elles prolifreront sous forme d'ascites. Ces ascites scrteront des Ac dans la cavit pritonale de ces souris. Ces Ac pourront ensuite tre rcuprs en prlevant le liquide ascitique.On injecte ces cellules dans l'abdomen d'autres souris o elles prolifreront sous forme d'ascites. Ces ascites scrteront des Ac dans la cavit pritonale de ces souris. Ces Ac pourront ensuite tre rcuprs en prlevant le liquide ascitique

22

2me Anne Biologie


Les techniques sont trs coteuses en termes d'installation, de ractifs, de temps et de main-duvre. Les Ac obtenus sont cependant extrmement spcifiques. Cependant, comme cette spcificit ne dpend que d'un seul pitope, les Ac Mo se fixent aussi fortement sur toute protine contaminante contenant cet pitope que sur l'antigne original. De plus, les techniques immunochimiques ncessitant la formation de prcipitines ou de gros complexes Ac-antigne sont inutilisables avec des Ac Mo.

3- Purification des Ac : Dpendant de l'usage prvu, on emploiera des prparations plus ou moins purifies d'Ac. Certaines applications n'exigent qu'un antisrum, d'autres ncessitent des Ac purs, mais la plupart auront des exigences entre ces deux extrmes. La technique de purification la plus souvent employe est la chromatographie d'affinit. Mais, avant, on peut procder une sparation brute des Ig des autres protines sriques (albumine, transferrine, etc.) par prcipitation diffrentielle au sulfate d'ammonium. Une

chromatographie d'change ionique est aussi possible, quoique moins employe. De plus en plus, on procde par chromatographie d'affinit avec la protine A ou la protine G comme ligand. Ce sont des protines de source bactrienne ayant la capacit de se fixer sur la rgion Fc des Ac. Une protine rcemment dcouverte, la protine L, se liant aux chanes k de certaines classes d'Ac, devient de plus en plus populaire. Ensuite, pour purifier l'Ac spcifique, on peut procder une chromatographie d'affinit avec l'antigne comme ligand. Seul l'Ac contre cette protine devrait s'attacher sur la colonne, toutes les autres protines du srum tant laves dans l'lut. On peut aussi utiliser des "peptides artificiels" ressemblant certains pitopes particulirement antigniques de l'antigne (ligands peptidomimtiques). Il ne reste qu' rcuprer l'Ac qui est ce moment pratiquement pur. Les colonnes de chromatographie classiques sont aussi en voie d'tre remplaces par des billes magntises de rsine sur lesquelles est li le ligand choisi. Le gros avantage de cette approche est la rapidit de sparation. Plutt que de laisser percoler divers tampons travers une colonne, on peut facilement rcuprer les billes magntises (et ce qui est li dessus) avec un aimant.

23

2me Anne Biologie


La purification des Ac obtenus du liquide sascite se fait grce la chromatographie daffinit ou grce la technique des billes magntises

4-

De la souris lhomme: Ac Mo chimres, humaniss et entirement humains : Les techniques de la gntique permettent aux scientifiques de fabriquer des Ac Mo

humaniss (presque humain) en greffant un Ac humain sur un Ac d'une souris. Seulement la partie de l'Ac de la souris qui est critique la liaison de l'antigne cibl, demeure sans changement. Les Ac Mo humaniss sont humains environ 90%. Ils seront probablement moins rejets par le corps humain, et probablement plus efficaces. La recherche est axe maintenant sur la production d'Ac entirement humains partir de souris transgniques. Dans un premier temps, on sest mis produire des Ac Mo chimres. Ceux-ci sont constitus dune partie murine variable et dune partie humaine constante. La frquence dinduction dune rponse anti-Ac, a ainsi considrablement diminu, mais la formation de HAMA reste toujours un problme potentiel significatif. La poursuite systmatique des efforts de recherche a par la suite conduit au dveloppement dAc humaniss. Dans les Ac humaniss, toutes les squences dacides amins provenant de la souris sont remplaces par des squences humaines, lexception des Complementary Determing Regions (CDR) responsables de la formation de lantigne.

Ac Mo recombinants. Les squences de souris sont reprsentes en noir, les portions humaines en blanc.

24

2me Anne Biologie


On esprait obtenir ainsi une rduction significative de limmunognicit encore associe aux Ac chimres. En pratique, on sest cependant trouv confront linduction de ractions Ac humains antihumains (HAHA), dont lincidence tait nanmoins relativement faible par rapport celle constate avec les Ac chimres. Lhumanisation des Ac murins ne se fait donc pas sans problmes, car les squences dacides amins situes entre les rgions CDR contribuent de manire non ngligeable laffinit des Ac. Il nest donc pas possible, dans lhumanisation de certains Ac, de conserver exclusivement les rgions CDR, et il faut souvent se rsoudre maintenir aussi certaines squences dAc murins dans les segments situs entre les zones CDR (Framework). Des Ac entirement humains ont t dvelopps au cours des dernires annes, afin de diminuer encore plus limmunognicit des Ac Mo thrapeutiques. Diffrentes mthodes ont t utilises: des souris porteuses dun dfaut immunitaire (severe combined immune deficiency, SCID) peuvent tre reconstruites laide de tissu foetal humain. Limmunisation de ces souris gnre des Ac humains. La plus grande partie des Ac humains est cependant produite in vitro par la mthode Phage- Display ou par lintermdiaire de souris transgniques produisant des Ac entirement humains. Limmunognicit des Ac thrapeutiques constitue un srieux problme qui limite en pratique leur utilisation rpte dans le traitement de diffrentes maladies. Limmunognicit des Ac Mo est due dabord la reconnaissance par le systme immunitaire des squences dacides amins trangres (squences murines). Cest la reconnaissance de ce phnomne qui a conduit au dveloppement successif dAc initialement chimres, puis humaniss et maintenant entirement humains. Il faut toutefois bien comprendre que mme les Ac entirement humains conservent, de par leur spcificit, une squence dacides amins unique (trangre) pour lorganisme. Cette squence contient le site de formation des Ac et est appele idiotype. Lorganisme peut donc rpondre la prsence de cette rgion idiotype des Ac entirement humains par la formation dAc humains antihumains (HAHA). On peut retenir, en rsum, que le dveloppement successif dAc chimres, humaniss, puis entirement humains a permis de diminuer significativement limmunognicit des Ac initialement murins. Si cette volution a autoris une utilisation thrapeutique de ces Ac dans de nombreuses maladies de lhomme ncessitant des applications rptes, on ne saurait considrer simplement le passage des Ac chimres aux Ac humaniss, puis aux Ac entirement humains, comme un progrs constant de la technique de traitement. Chacune de ces classes dAc provenant de procds de fabrication biotechnologique diffrents a ses

25

2me Anne Biologie


avantages et ses inconvnients, quil sagit dexaminer au cas par cas, dans une perspective dexprimentation clinique.

5- Applications : Une fois injects dans des patients, les Ac Mo ont dclench une rponse du systme immunitaire, parce que le corps humain les a identifis comme substance trangre. Des injections rptes ont eu comme consquence le dgagement rapide de l'Ac des souris, qui l'a rendu inefficace. Dans certains cas, les deuximes ou les injections suivantes ont entran une raction d'hypersensibilit reprsentant un danger pour la vie. La gntique est utilise pour surmonter cet obstacle srieux. Etude approfondie des spcificits et idiotypes des immunoglobulines. Reconnaissance et sparation des diffrentes catgories cellulaires impliques dans la

rponse immune. Typage des cellules tumorales et lymphodes et localisation des tumeurs infra-cliniques Srodiagnostic des affections bactriennes et virales. Elimination cible des cellules tumorales ; inactivation et destruction de nombreuses

catgories cellulaires.

AUTRE METHODE POUR FABRIQUER DES AC MO : LA TECHNIQUE DU PHAGE DISPLAY

La prsentation la surface de phages de protines, le phage display, est un puissant outil de slection de protines combinatoires. Les phages peuvent prsenter leur surface des fragments d'anticorps scFv (single chain Fv), Fab et Fv. Un lment essentiel de cette technologie est la construction de banques combinatoires d'anticorps. Les domaines variables des immunoglobulines peuvent tre exprimes soit sous forme scFv dans les quels les domaines VH et VL rarrangs sont lies de manire covalente par un court peptide, soit sous forme de Fab. Avant tout isolement d'anticorps recombinants en utilisant la technologie du phage display, il est ncessaire de raliser des banques de phages prsentant des anticorps, ou plus exactement des fragments d'anticorps, de talles et de complexits convenables. Un des lments dterminants pour atteindre cet objectif est le choix de la source des gnes d'immunoglobulines.

26

2me Anne Biologie


Pour amplifier par PCR les rgions V des diffrentes classes d'immunoglobulines, il est possible d'utiliser des lymphocytes d'individus immunises. En effet, de tels individus auront une rponse immunitaire qui aura multipli, par expansion clonale, les lymphocytes B possdant les rgions V irnpliques dans la rponse immunitaire dirige contre I antigne d'intrt. De faon naturelle, le rpertoire de ces individus est enrichi en immunoglobulines possdant une bonne affinit, augmentant ainsi la probabilit d'isoler un anticorps de haute affinit. Des banques peuvent galement tre assembles aprs amplification de gnes provenant d'individus non immunises ou nafs afin d'obtenir une diversit maximale. En effet chez des sujets nafs, des gnes d'immunoglobulines ne seront pas surreprsents, comme dans le cas d'individus fortement rpondeurs, offrant la possibilit d'amplifier et de cloner un vaste panel de gnes donnant naissance a une banque de phages plus uniforme. II faut noter ici que la constitution de banques a partir d'individus immunises ou nafs ne refltera jamais la diversit obtenue dans les lymphocytes qui est le rsultat de mcanismes de rarrangements, de mutations, d'insertions..., qui seront absents lors du clonage des seules rgions V. La diversit des banques (surtout naves) peut tre trs largement augmente en utilisant un grand nombre de donneurs. Une autre mthode d'obtention d'une banque possdant une grande diversit est d'en construire une, dite alors semi-synthtique, par mutation alatoire par PCR des rgions CDR. II est ainsi possible d'obtenir des anticorps qui auraient t limins par la slection naturelle. II est donc envisageable par cette technique d'isoler des anticorps qui n'ont jamais existe chez le donneur de lymphocytes. Dans la littrature, il a t dcrit de nombreuses banques obtenues par diverses rnthodes et d'aprs les rsultats, il sernble que la complexit de la banque soit un des lments clef pour I obtention d'anticorps de bonne affinit. Des phages exprimant des anticorps de spcificits intressantes peuvent tre isoles partir de banques selon un protocole schmatique liaison des phages sur I antigne d'intrt, limination, par lavages, des phages non fixes ou ayant une faible affinit, lution des phages avec dtermination du nombre de phages lus, infection dE.coli et multiplication des phages afin de produire la premire sous-

banque. Ces quatre tapes constituent un tour de bio-panning qui sera rpte plusieurs fois. Le nombre de phages mis en contact avec I antigne tant connu, te suivi du nombre de phages

27



Clues aprs chaque tour de bio io-panning permet de rnesurer l'enrichissement en clones positifs 'enrichissement au cours des tapes de bio-panning. panning. Un des facteurs importants pour la russite de l'isolement d'anticorps est lantigne : la 'isolement grande majorit des expriences ont t faites l'aide d'antignes purifies fixes sur une surface 'aide de plastique (comme dans une raction ELISA classique). La puret et la conformation de I antigne vont jouer dans lobtention de clones positifs : si I antigne est peu reprsent, il obtention sera difficile voire impossible d'identifier des clones positifs car les phages prsentant des fragments d'irnmunoglobulines ne pourront tre enrichis lors des tours de slection su successifs. La conformation de lantigne fixe sur la surface plastique ne doit pas tre trop lo antigne loigne de la conformation de la molcule active si on veut viter l'obtention de clones reconnaissants de 'obtention pseudo-pitopes. Production dAc Mo en utilisant la technique du phage display

28

2me Anne Biologie


Objectifs

1- Citer les diffrentes tapes de limmunolectrophorse. 2- Citer les principales tapes de la technique ELISA. ; 3- Citer le principe de lELISA sandwich. 4- Citer le principe des tests dagglutination quantitatifs. 5- Citer le principe des tests de Coombs. 6Citer et connaitre les principes des tests de purifications et

didentification des protines. 7- Citer et connaitre les principes des techniques de marquage et

dtection des antignes cellulaires et tissulaires.

29

2me Anne Biologie


UTILISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX COMME OUTIL DANALYSE

INTRODUCTION De par leur extrme spcificit pour leur antigne, les anticorps monoclonaux constituent des outils diagnostiques trs utiles dans les domaines didentification, de purification et de quantification des antignes solubles ou particulaires. De plus la possibilit de conjuguer ces Ac des substances fluorescentes, radio-mettrices ou autres, permet de pousser le diagnostic in vivo.

1-

limmunodiffusion

1-1-Immunodiffusion radiale (mthode de Mancini) : Cette technique consiste couler une glose dans laquelle on fait incorporer un antisrum (Ac). Une fois la glose endurcie, on dpose au niveau des puits la solution contenant la protine (Ag) que lon veut doser. La diffusion de la protine dans la glose contenant lanti-srum cre une zone circulaire de prcipitation qui correspond la formation de complexes immuns (Ac-Ag). Le diamtre au carr de cette zone est proportionnel la concentration de la protine dans la solution analyser. On utilise des solutions talons o les concentrations de la protine en question sont connues et on dduit la concentration de la protine dans la solution analyse par extrapolation partir des diamtres des solutions talons.

30

2me Anne Biologie


1-2- Immunolectrophorse : Cette technique combine une lectrophorse des protines (Ag) suivie dune diffusion des Ag (spars lectrophortiquement) et des anticorps. La solution antignique (srum, urines etc..) est spare au pralable par lectrophorse, dans des conditions non dnaturantes, puis elle diffuse dans un gel o lanticorps est incorpor. Cette extension de la migration durant llectrophorse permet une information additionnelle au sujet de la structure antignique. On dpose au niveau du second puits un chantillon tmoin qui sert de rfrence. Les diffrentes tapes sont entrecoupes par des lavages dans des solutions spciales pour dcrocher les protines fixes de faon non spcifique. Aux dernires tapes on utilise un colorant des protines pour visualiser les arcs de prcipitation, enfin on limine lexcs de colorant par une solution base dacide actique. 1- Dposer la solution contenant les protines (Ac) analyser dans les puits. 2- Faire migrer dans un champ lectrique. 3- Dposer les anti-srums correspondants au niveau de chaque rigole. 4- Laisser diffuser. 5- Colorer avec un colorant des protines (Amido-Schwartz). 6- Lire la plaque.

31

2me Anne Biologie


1-3- immunofixation : Technique comparable limmunolectrophorse, mais qui prsente un avantage par rapport cette dernire : une sensibilit plus grande et un temps dexcution beaucoup plus court. Le milieu contenant lAc (srum) est dpos dans des puits au niveau de diffrentes pistes, on pratique ensuite une lectrophorse. Chaque piste est ensuite incube avec un Ac particulier anti-classe chanes lourdes et anti-classes chanes lgres (anti-srum) et la ligne de prcipitation est rvle par un colorant des protines. Les diffrentes tapes sont : 1-Dpt du srum et migration 2-Dpt des anti-srum anti : -IgG, -IgA, -IgM, -, -, et de lanti-srum total (ELP) et diffusion. 3- Rvlation : bande IgG monoclonale

2-

Radioimmunologie et immunoenzymologie : Les principales applications quantitatives des immunodosages sont l'ELISA :

"enzyme-linked immunosorbent assay" et le dosage radio-immunologique ou RIA "radioimmunoassay". Ces techniques sont assez semblables quant leurs principes. La diffrence majeure est la nature du signal mesur: radioactivit dans un RIA et activit enzymatique dans un ELISA. Dans un RIA les anticorps secondaires (ou la protine A ou la biotine) sont conjugus un atome radioactif (tritium, iode-125, etc.) tandis qu'une enzyme (phosphatase alcaline, peroxydase de raifort, etc.) est utilise dans un ELISA. On peut se servir de mthodes dites en phase liquide (ou homognes) ou en phase solide (ou par adsorption). Une technique plus rcente consiste utiliser des anticorps

32

2me Anne Biologie


secondaires conjugus des microparticules aimantes, les complexes ternaires peuvent alors tre facilement spars des anticorps ou antignes primaires en excs (Imx = immunoparticles assay). Les RIA sont surtout de type phase liquide puisqu'il faut tre capable de les transfrer dans une fiole scintillation. Dans ces techniques l'emploi d'un agent bloquant est aussi de rigueur. Les techniques en phase solides peuvent procder par diffrents types d'adsorption: liaison directe, "en sandwich", ou en pont. Il faut se souvenir que, peu importe les types de liaison, il faut empcher l'adsorption sur la matrice solide des molcules qui ne doivent pas s'y attacher directement. Ceci vise diminuer autant que possible le bruit de fond. On utilise donc un agent bloquant. Pour bloquer ces sites, on peut saturer les sites libres avec un agent saturant aprs l'adsorption. On peut aussi mettre dans le milieu un agent de surface qui inhibe l'adsorption additionnelle de molcules, mais sans dtacher les molcules dj adsorbes. Dans ce dernier cas, un dtergent trs doux comme le "Tween 20" est employ. Pour la saturation des sites on peut utiliser une protine comme l'albumine, le collagne, etc. Les ELISA sont surtout de type phase solide. De nombreux lavages servent aussi diminuer le bruit de fond.

Plaque ELISA

33

2me Anne Biologie


Enzyme + substrat

2-1- RIA directe :

34

2me Anne Biologie


2-2-ELISA ou RIA comptitives:

2-3-ELISA ou RIA sandwich : La mthode sandwich utilise deux Ac diffrents qui ragissent avec lAg dont on veut mesurer la concentration. Une quantit fixe dun Ac (1) est attache une srie de supports solides / : puits de microtitration en plastique (plaque ELISA). Des solutions tests contenant des Ag une concentration inconnue ou des sries de solutions standards avec des concentrations connues sont dposes dans les puits. Les Ag non fixs sont limins par des lavages, et le second Ac (2) marqu (radioisotope ou enzyme) est dpos et il se fixe lAg qui sert de pont entre les Ac (1) et (2). Ainsi, plus il y a dAg dans les solutions standard ou les solutions tests, plus il y aura dAc (2) marqus fixs. Les rsultats obtenus partir des solutions standards sont utiliss pour construire une courbe de fixation de lAc (2) en fonction de la concentration de lAg. A partir de cette courbe on peut valuer la quantit dAg. Lutilisation de cette technique ncessite que les deux Ac reconnaissent des pitopes antigniques qui ne se chevauchent pas, sinon lAc (2) ne pourra pas se fixer sur lAg. Une des variantes de cette technique est reprsente par lutilisation dAg fixs au support solide (soit directement soit par lintermdiaire dun Ac lui mme attach ce support), dans le cas o on rechercherait dans le srum dun individu, des Ac spcifiques un Ag donn / : Ac anti-Ag de surface du virus de lhpatite B.

35



3-

Electrosynrse et lectrophorse en fuse : Support: gel d'agarose dont le pH est choisi de telle sorte que l'anticorps soit charg

positivement et l'antigne ngativement. Technique: on applique un courant lectrique travers le gel, l'antigne et l'anticorps migrent l'un vers l'autre et prcipitent. Avantages: sensibilit 10 20 fois augmente par rapport l'immunodiffusion double. Les antignes peuvent tre quantifis en les soumettant une lectrophorse dans un gel soumettant contenant l'anticorps, selon la technique d'lectrophorse en fuse. Le pH est choisi de telle sorte que les anticorps soient immobiles et lantigne soit charg ngativement. Des lignes de prcipitation dlimitent la hauteur des fuses proportionnellement la concentration de l'antigne et les concentrations sont obtenues par extrapolation partir d'talons.

36

2me Anne Biologie


4-

Agglutination :

4-1- Les tests dagglutination : aAgglutination-hmagglutination:

Quand lAg se trouve sous forme particulaire, la raction dun Ac avec lAg peut tre dtecte par agglutination de lAg. Si lAg est un globule rouge (GR), on utilise le terme dhmmaglutination. Le terme agglutinine est utilis pour dcrire les Ac qui agglutinent les Ag particulaires. Si lAg est un GR, le terme hmagglutinine est utilis. Tout les Ac peuvent thoriquement agglutiner les Ag particulaires, mais cest lIgM grce sa grande valence qui constitue la meilleure agglutinine. bles tests qualitatifs dagglutination : Ces tests peuvent tre utiliss pour mettre en vidence la prsence dun Ag ou dun Ac. LAc est mlang avec lAg particulaire et la positivit du test est indique par lagglutination des Ag particulaires (dtermination des groupes rythrocytaires).

c-

les tests dagglutination quantitatifs : Sont utiliss pour quantifier le niveau des Ac dirigs contre un Ag particulaire. Dans

ce test on effectue des dilutions sries de lchantillon analyser, on rajoute aprs un nombre fixe de GR ou de bactries ou dautres Ag particulaires et on dtermine la dilution maximale qui provoque une agglutination et on appellera cette dilution titre. Les rsultats seront indiqus comme la rciproque de la dilution maximale qui provoque une agglutination.Leffet de zone : Dans certains cas o la concentration des Ac est leve (faibles dilutions), il ne se produit pas dagglutination. Lagglutination apparatra au fur et mesure que lchantillon est dilu. Ce fait de zone est d lexcs dAc rsultant dans la formation de petits complexes qui ne sassocient pas pour former une agglutination visible.

37

2me Anne Biologie


4- 2- Hmagglutination passive : Les tests dagglutination utilisent uniquement les Ag particulaires. Cependant il est possible de fixer des Ag solubles la surface des GR, et dutiliser ces GR dans un test dagglutination pour des Ac dirigs contre cet Ag soluble. Le procd est le mme que les autres tests dagglutination.

4-3- Le test de Coombs (test antiglobuline) : atest de Coombs direct : La fixation dAc sur les GR ne rsulte pas toujours en une

hmagglutination (zone dexcs dAg ou dAc, empchement de lagglutination cause des charges lectriques prsents la surface des GR). Dans ces cas lAc est dit incomplet , et il sagit l dune dfinition purement fonctionnelle. Dans le but de dterminer la prsence de ces Ac non agglutinants sur les GR, on rajoute un second Ac (anti-immunoglobuline) dirigs contre lac fix la surface du GR. Cette anti-immunoglobuline provoque alors une agglutination des GR.

b-

test de Coombs indirect : Si on veut dterminer la prsence dAc dirigs contre un GR

particulier dans un srum et si en plus on veut tre sur de dtecter la prsence dAc non agglutinants, on pratique le test de Coombs indirecte. On incube les GR avec le srum, on fait un lavage pour liminer les Ac non fixs, et on rajoute une anti-immunoglobbuline qui ponte les GR.

38

2me Anne Biologie


4-4- Test dinhibition de lhmagglutination : Le test dagglutination peut tre modifi de sorte pouvoir dterminer le taux des Ag solubles. Au cours de ce test, on mesure la capacit dun Ag soluble inhiber lagglutination de GR sensibilises par cet Ag par un Ac. Un taux fixe dAc dirigs contre lAg en question est mlang un taux fixe de GR sensibiliss par cet Ag. On rajoute lensemble diffrentes quantits de lchantillon dans lequel on veut analyser la prsence de lAg. Si lchantillon contient lAg, lAg soluble va entrer en comptition avec lAg fix sur la GR quand sa fixation de lAc, inhibant ainsi lagglutination des GR. Par des dilutions sries de lchantillon, on peut quantifier lAg prsent dans cet chantillon.

5-

Test de fixation ou de dviation du complment : Les ractions Ag-Ac conduisent la formation de complexes immuns qui activent la voie

classique du complment, cette raction peut tre exploite pour dterminer la quantit dAg ou dAc prsents. La raction de fixation du complment dtecte la prsence des anticorps : 1- Titrage du srum tester par des dilutions de 2 en 2. 2- Ajouter une quantit constante dantignes. Si le srum contient les anticorps recherchs, il se forme des complexes immuns (CI) 3-Le complment est ajout ensuite, la prsence des CI entrane une consommation du complment. 4- On ajoute les cellules indicatrices, qui sont des globules rouges (GR) recouverts dune dose subagglutinante dAc anti-globules rouges. La persistance dune activit du complment est mise en vidence par la lyse des globules rouges (La quantit de complment ajoute est choisie de faon ce quelle soit tout juste capable de lyser les GR en labsence de CI).

39

2me Anne Biologie


6-

Purification et identification des protines : Les Ac peuvent tre utiliss pour purifier et identifier des protines partir de

solutions. 6-1 - Chromatographie daffinit : Permet de purifier des Ac de spcificit dtermine partir dun mlange htrogne (srum). On couple lAg un support inerte (billes de dextran) quon place dans une colonne travers laquelle on introduit la prparation dAc dans des conditions de temprature et de pH permettant la fixation des Ac. Les Ac dirigs contre les Ag restent fixer la colonne alors que les autres sont limins par lavages. Les Ac fixs sont lus de la colonne avec un tampon dlution qui dissocie les Ag des Ac.

40

2me Anne Biologie


6-2- chromatographie changeuse dions :

41

2me Anne Biologie


6-3- Immuno-blot (Western Blotting) : Cette technique est utilise pour dterminer la quantit relative et le poids molculaire dune protine prsente dans un mlange de protines ou dautres molcules. Le mlange est tout dabord soumis une sparation analytique par lectrophorse en gel de polyacrylamide en prsence de SDS (Sulfate Dodecyl Sodium) de telle sorte que la position finale des diffrentes protines dans le gel est fonction de leurs poids molculaires. La gamme des protines spares est ensuite transfre du gel vers un support membranaire (nitrocellulose) par capillarit (blotting) ou par lectrophorse. La membrane acquiert ainsi une rplique de la gamme des protines spares prsentes dans le gel. Durant ce transfert le SDS est dplac des protines, et les dterminants antigniques natifs se reconstituent lors du repliement des protines. La position dune protine donne peut tre alors dtecte par la fixation dAc marqus spcifiques de cette protine, fournissant de la sorte des renseignements au sujet de la taille et de la quantit de cette protine antignique. ETAPES DE LIMMUNO-BLOT1- Electrophorse des protines, 2- Migration des diffrentes protines, 3- Transfert des protines sur nitrocellulose, 4- Immunomarquage par un anticorps spcifique de la protine recherche, 5- Visualisation des bandes correspondant la protine recherche.

42

2me Anne Biologie


6-4- Elispot : ELISpot est un test d'immunologie bas sur la technique ELISA, technique immunoenzymatique permettant de dnombrer des cellules partir de leur scrtion. Son principe consiste capturer la scrtion de molcules par des cellules (anticorps ou cytokines) sur un support solide sensibilis. Aprs limination des cellules, l'immunocomplexe est rvl par une mthode ELISA utilisant un substrat chromogne insoluble, dont la prcipitation localise gnre des taches colores ou immunospots. LELISpot technique, grce sa haute sensibilit, sa reproductibilit et sa simplicit, reste de nos jours la technologie de rfrence pour la mesure des rponses spcifiques des lymphocytes T avec des applications dans de multiples domaines de recherche (dveloppement de vaccins, maladies infectieuses, allergies, tumeurs et maladies autoimmunes).

7-

Marquage et dtection des antignes cellulaires et tissulaires :

7-1- Immunofluorescence et immunohistochimie : Les Ac peuvent tre utiliss pour la distribution anatomique dun Ag dans un tissu ou lintrieur des compartiments cellulaires. Le tissu est dcoup en fines lamelles de quelques microns dpaisseur. La lamelle est alors incube avec un Ac marqu par un fluorochrome et spcifique de lAg recherch. Un microscope fluorescence est alors utilis pour localiser lAg en question par lintermdiaire de la fluorescence mise par lAc marqu et fix cet Ag, cest limmunofluorescence directe (IF). 43

2me Anne Biologie


Dans limmunofluorescence indirecte (IFI), le premier Ac qui reconnat lAg est lui mme reconnu par un second Ac qui porte le fluorochrome. Cette technique est utilise dans les cas o on veut rechercher la prsence dans le srum ou les liquides biologiques dun individu, dAc dirigs contre un Ag connu prsent dans le tissu utilis. En plus des fluorochromes, les Ac rvlateurs peuvent tre marqus par / : des enzymes (peroxydase, phosphatase alcaline). Cette technique peut aussi tre utilise dans lisolement et/ ou lidentification dAg prsents sur, ou dans des cellules en suspension permettant ainsi de les classer. La lecture se fait grce un microscope fluorescence.

7-2- La cytomtrie en flux Cette technique permet didentifier, les lignes, les tapes de maturation, ltat dactivation dune cellule, par la dtermination de lexpression de diffrentes molcules prsentes la surface ou lintrieur de cette cellule. La cellule est colore par une sonde (Ac) spcifique pour ces molcules et marqu par un fluorochrome. Le cytomtre flux dtecte alors la quantit de fluorescence mise par la cellule qui a fix la sonde marque. Le FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter = analyseur et trieur de cellules) est une variante du cytomtre de flux, qui permet de sparer les populations cellulaires selon le type et la quantit de fluorescence mise. La prsence de dflecteurs permet de sparer les cellules selon des champs magntiques dont la force et la direction varient en fonction de lintensit du signal de fluorescence mis.

44


LMD Immunotechnologie et Vaccinologie 2008-2009 Principe du cytomtre flux

Aspect de limage des cellules Limage est donne selon 2 axes : Laxe des x pour la taille. Laxe des y pour la granulosit.

granulosit

Taille

7-3- Isolement des populations cellulaires par les billes magntises : Lisolement des populations lymphocytaires repose sur lutilisation d dAc, spcifiques de certaines structures qui se trouvent la surface de ces cellules (antignes de surface), ces anticorps sont associs des billes magntises. Les cellules possdant ces Ag se fixent sur les billes recouvertes danticorps, et les billes seront spares par un aimant.

45

2me Anne Biologie


7-4- Marquage des cellules in vivo : (Immunoscintigraphie) Il sagit de marquer les cellules in vivo par des Ac Mo coupls des produits radioopaques par exemple, et dpister ainsi un tissu pathologique. C'est la dtection immunologique de tumeurs et de leurs mtastases par l'utilisation d'Ac marqus par des produits radioactifs dirigs contre les antignes tumoraux. Une tumeur est caractrise par les antignes qu'elle secrte. Certains antignes restent l'intrieur ou la surface des cellules, d'autres peuvent tre dverss dans la circulation. Le principe est d'utiliser des Ac Mo pour reconnatre ces antignes tumoraux.

Ces anticorps lis une substance radioactive vont se lier aux antignes tumoraux. Un examen scintigraphique du corps entier permettra de visualiser les diffrentes localisations de ces antignes tumoraux. Les mtastases, mme trs petites, pourront tre dtectes et ne le seraient pas par une autre technique. La rcidive locale d'un cancer galement.

46

2me Anne Biologie


47

2me Anne Biologie


Objectifs1- Citer et connaitre les mcanismes daction des anticorps monoclonaux. 2- Dfinir et citer le mcanisme daction dun anticorps bispcifique. 3- Dfinir un anticorps monoclonal murin, hybride et humanis. 4- Dfinir et indiquer le mcanisme de formation des HAMA et HAHA. 5- Citer les problmes poss par lutilisation des anticorps monoclonaux.

48

2me Anne Biologie


UTILISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX EN THERAPEUTIQUE HUMAINE

1- Introduction :Les anticorps monoclonaux (Ac Mo) sont des Ac qui ont t artificiellement produits contre un Ag spcifique. Ils sont extrmement spcifiques en se liant leurs Ag cibls. En laboratoire, les Ac Mo sont produits partir de clones d'une cellule. C'est pourquoi ils s'appellent Mo . Ceci signifie que chaque Ac produit par cette cellule est exactement identique. Ceci leur donne la spcificit d'optimisation collective d'action qui peut tre utilise dans le traitement et le diagnostic des maladies. La biotechnologie a jou un rle important dans la cration des Ac Mo. Deux principales techniques de la biotechnologie, la fusion de cellules et la culture de cellules, ont t utilises intensivement dans la production des Ac Mo. Les Ac Mo sont crs partir de la technologie de fusion de cellules (la cration de cellules hybridomes) et la technologie de culture de cellules (culture de cellules mylomateuses et hybridomes en laboratoire). Une fois injects dans des patients, les Ac Mo ont dclench une rponse du systme immunitaire, parce que le corps humain les a identifis comme substance trangre. Des injections rptes ont eu comme consquence le dgagement rapide de l'Ac des souris, rendu inefficace. Dans certains cas, les deuximes ou les injections suivantes ont entran une raction d'hypersensibilit reprsentant un danger pour la vie. La gntique est utilise pour surmonter cet obstacle srieux. Les techniques de la gntique permettent aux scientifiques de fabriquer des Ac Mo humaniss (presque humain) en greffant un Ac humain sur un Ac d'une souris. Seulement la partie de l'Ac de la souris qui est critique la liaison de l'Ag cibl, demeure sans changement. Les Ac Mo humaniss sont humains environ 90 pour cent. Ils seront probablement moins rejets par le corps humain, et probablement plus efficaces. Actuellement, la recherche est axe sur la production d'Ac entirement humains partir de souris transgniques. Cette introduction dune nouvelle gnration dAc a permis dentrevoir un potentiel clinique considrable touchant diffrents domaines de la mdecine : oncologie, cardio-vasculaire, rhumatologie, greffe Ce renouveau important des Ac Mo usage thrapeutique est non seulement li des stratgies dingnierie dAc mieux adaptes, mais galement une meilleure comprhension des mcanismes cellulaires et molculaires de

49

2me Anne Biologie


pathologies (o une intervention thrapeutique laide dAc peut tre envisage), et une meilleure dfinition de molcules cibles.

2-

Mcanismes daction des Ac Mo :Le mcanisme de base d'un Ac monoclonal est identique celui des Ac produits par le

corps humain. Cependant, lorsque des Ac Mo sont utiliss dans le diagnostic et le traitement de maladies, certaines substances sont souvent ajoutes pour leur donner leurs caractristiques thrapeutiques et diagnostiques. Ils peuvent galement tre utiliss seuls pour bloquer ou encourager certaines rponses du systme immunitaire. Lorsque des Ac Mo sont utiliss en thrapie, ils sont souvent attachs diffrents mdicaments ou toxines, qui sont ensuite livres aux cellules cibles sans nuire aux autres cellules du corps. Utiliss seuls, ils peuvent encourager le systme immunitaire du corps identifier certaines cellules comme tant trangre et lancer une attaque contre ces cellules. 2-1Mcanismes effecteurs immunotransmis : Les Ac Mo ne sont pas en soi cytotoxiques pour une cellule cible. Ils induisent en revanche des effets cytotoxiques (par ex. contre les cellules tumorales) par une interaction avec le systme du complment ou avec des cellules effectrices (lymphocytes T, monocytes, granulocytes, osinophiles, etc...Mcanismes effecteurs des Ac Mo. Effets immunotransmis par lactivation de la cascade du complment par liaison de C1q lIgM membranaire ou des molcules dIgG (CDC) ou par le recrutement de cellules effectrices via des rcepteurs Fc (ADCC). Fonctions biorgulatrices par liaisons croises de rcepteurs cellulaires avec transduction directe designaux intracellulaires (par ex. signaux dapoptose) ou blocage de rcepteurs ou de ligands (par ex. rcepteurs du facteur de croissance).

50

2me Anne Biologie


Mcanismes daction des Ac Mo thrapeutiques

Les effets cytotoxiques gnrs par lactivation de la cascade du systme du complment et par la cytotoxicit induite par le complment sont globalement dsigns par le terme de Complement-Dependent Cytotoxicity (CDC). Les mcanismes effecteurs qui font appel des cellules effectrices secondaires sont appels Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC). Lactivation de la cascade du complment et celle des cellules effectrices se fait par lintermdiaire de la partie Fc de lAc. La partie Fc de lIgG1 humaine est particulirement efficace dans lactivation de la cascade du complment et des cellules effectrices chez lhomme. La rgion constante de lIgG1 humaine est par consquent privilgie dans la fabrication des Ac Mo chimres et humaniss ayant pour objectif une cytotoxicit in vivo aussi puissante que possible 2-2Actions biorgulatrices : Les Ac Mo peuvent cependant aussi induire des effets thrapeutiques sans devoir activer des mcanismes effecteurs immunologiques. Les Ac Mo peuvent bloquer des rcepteurs cellulaires de surface ou neutraliser des ligands solubles (par ex. vascular endothelial growth factor [VEGF], TNF-, etc.). Les Ac peuvent aussi entraner la transduction directe de signaux intracellulaires par cross-linking de rcepteurs. Ceci peut induire, suivant le rcepteur, lapoptose immdiate de la cellule. Un exemple dAc monoclonal effet biorgulateur est le trastuzumab (Herceptin), qui se lie au rcepteur epidermalgrowth- factor family (HER-2/neu), facteur de croissance pithliale des cellules

51

2me Anne Biologie


tumorales. Le blocage de ce rcepteur rduit le potentiel prolifratif des cellules qui expriment le HER-2/neu de manire excessive. Le Rituximab, un Ac Mo chimris, dirig contre la molcule CD20, est employ avec succs dans les lymphomes non Hodgkiniens. On notera nanmoins que les effets biorgulateurs sont souvent difficiles distinguer des effets immunotransmis. 2-3Immunoconjugus: Ac porteurs Le terme dimmunoconjugu est utilis pour dcrire des Ac Mo (ou dautres sousunits) utiliss comme porteurs de substances actives, par ex. des radio-isotopes, des toxines, des cytostatiques, des cytokines ou des cellules. Lactivit immunologique de ces Ac est alors sans importance. Les effets quils dveloppent sont ceux de la substance quils transportent. Les Ac Mo conjugus avec les radio-isotopes comme liode131, litrium90 paraissent trs prometteurs dans loptique des applications thrapeutiques. La fixation de lisotope lAc permet dappliquer un rayonnement relativement concentr sur le tissu tumoral. Lun des principaux avantages thrapeutiques de la radio-immunothrapie par rayons bta est que le rayonnement pntre de plusieurs millimtres dans la tumeur. Il nest donc pas ncessaire que lAg cible soit exprim dans chaque cellule tumorale. 2-4Autres formes dAc : Les Ac dits bispcifiques sont capables de reconnatre deux Ag diffrents. Leurs effets sont indpendants de la rgion Fc, si bien que ces molcules nactivent que trs peu le systme du complment et quainsi une partie des effets indsirables associs ce mcanisme peut tre supprime. Les Ac bispcifiques ne ncessitent ds lors pas la totalit des structures de la molcule dIg et peuvent tre rduits des fragments de Fab. Les combinaisons de deux ou trois chanes individuelles de Fab rsultent en des Ac bispcifiques de masse molculaire minime qui pntrent dans les tissus de manire optimale. Malheureusement, leur demi-vie in vivo est courte si on la compare celle des molcules structure IgG complte.

52

2me Anne Biologie


3-

Ac monoclonaux chimres, humaniss et entirement humains : Lanticorps anti-CD3 (Orthoclone OKT3, muromonab- CD3) est un reprsentant de

la premire gnration. Il est utilis dans le traitement du rejet aigu aprs greffe dorgane et a t le premier anticorps monoclonal admis pour lusage thrapeutique chez lhomme. Lexprience clinique a montr que le muromonab-CD3 doit tre utilis en association avec dautres mdicaments immunosuppresseurs pour prvenir la rponse immunitaire contre lanticorps murin. Les anticorps HAMA peuvent nanmoins apparatre malgr lapplication simultane dune immunosuppression intensive. Contrairement au traitement limit dans le temps, propre aux rejets aigus de greffes, celui des maladies cancreuses ou auto-immunes ncessite des applications sur des priodes relativement prolonges pour obtenir leffet thrapeutique dsir de faon durable. La constatation selon laquelle la raction immunitaire du patient contre les anticorps de souris compromet lefficacit thrapeutique dans ces affections chroniques a conduit au dveloppement de stratgies visant diminuer limmunognicit des anticorps monoclonaux. 3-1- Ac monoclonaux chimres : Dans un premier temps, on sest mis produire des anticorps monoclonaux chimres. Ceux-ci sont constitus dune partie murine variable et dune partie humaine constante. La frquence dinduction dune rponse anti-anticorps, a ainsi considrablement diminu, ce qui a permis dadministrer ces mdicaments de manire rpte. Certains anticorps chimres, par ex. le rituximab (Mabthera) et le ctuximab (Erbitux) ninduisent que rarement la formation danti-anticorps, alors que dautres non. La formation de HAMA reste par consquent un problme potentiel significatif, mme si les anticorps monoclonaux chimres se sont aujourdhui solidement implants dans la pratique clinique. Ils exigent toutefois un suivi attentif et, le cas chant, ladministration concomitante de corticostrodes, voire parfois linterruption du mdicament. 3-2- Ac monoclonaux humaniss : Dans les anticorps humaniss, toutes les squences dacides amins provenant de la souris sont remplaces par des squences humaines, lexception des Complementary Determing Regions (CDR) responsables de la formation de lantigne. On esprait obtenir ainsi une rduction significative de limmunognicit encore associe aux anticorps chimres. En pratique, on sest cependant trouv confront linduction de ractions anticorps humains antihumains (HAHA), dont lincidence tait nanmoins relativement faible par rapport celle constate avec les anticorps chimres. Lalemtuzumab(Mab- Campath) induit 53

2me Anne Biologie


des HAHA avec une incidence de lordre de 1,9% et le transtuzumab (Herceptin ) avec une incidence encore infrieurede0,1%. Dautres anticorps humaniss, tels que le daclizumab (Zenapax), induisent en revanche des HAHA avec une incidence atteignant 34%. Lhumanisation des anticorps murins ne se fait donc pas sans problmes, car les squences dacides amins situes entre les rgions CDR contribuent de manire non ngligeable laffinit des anticorps. Il nest donc pas possible, dans lhumanisation de certains anticorps, de conserver exclusivement les rgions CDR, et il faut souvent se rsoudre maintenir aussi certaines squences danticorps murins dans les segments situs entre les zones CDR (Framework). 3-3- Ac monoclonaux entirement humains : Des anticorps ont t dvelopps au cours des dernires annes, afin de diminuer encore plus limmunognicit des anticorps monoclonaux thrapeutiques. Diffrentes mthodes ont t utilises: des souris porteuses dun dfaut immunitaire (severe combined immune deficiency, SCID) peuvent tre reconstruites laide de tissu ftal humain. Limmunisation de ces souris gnre des anticorps humains. La plus grande partie des anticorps humains est cependant produite in vitro par la mthode Phage- Display ou par lintermdiaire de souris transgniques produisant des anticorps entirement humains. Plusieurs de ces anticorps exclusivement humains sont actuellement tests dans le cadre dessais cliniques de phase I III. Les anticorps entirement humains sont-ils ds lors suprieurs dans leurs applications thrapeutiques aux anticorps humaniss, et ces derniers sont-ils vraiment meilleurs que les anticorps chimres?

4-

Problmes poss par lutilisation des Ac Mo : Limmunognicit des anticorps thrapeutiques constitue un srieux problme qui

limite en pratique leur utilisation rpte dans le traitement de diffrentes maladies. Limmunognicit des anticorps monoclonaux est due dabord la reconnaissance par le systme immunitaire des squences dacides amins trangres (squences murines). Cest la reconnaissance de ce phnomne qui a conduit au dveloppement successif danticorps initialement chimres, puis humaniss et maintenant entirement humains. Il faut toutefois bien comprendre que mme les anticorps entirement humains conservent, de par leur spcificit, une squence dacides amins unique (trangre) pour lorganisme. Cette squence contient le site de formation des anticorps et est appele idiotype. Lorganisme peut donc rpondre la prsence de cette rgion idiotype des anticorps entirement humains par la formation danticorps humains antihumains (HAHA). Les anticorps ont fait leur apparition au 54

2me Anne Biologie


cours de lvolution pour renforcer limmunognicit des protines trangres. Ils le font en se liant des rcepteurs Fc ou par lactivation de la cascade du complment. Ces fonctions contribuent conserver le caractre immunogne des anticorps, quils soient chimres, humaniss ou entirement humains (de par leur idiotype). Et, ce sont prcisment ces proprits des anticorps qui sont indispensables pour produire leffet thrapeutique qui consiste en la destruction des cellules cibles (par ex. tumorales). La fabrication dun anticorps avec une fonction effectrice maximale contre certaines cellules cibles, mais sans potentiel immunogne propre, constitue donc une vritable gageure. On dit souvent des anticorps monoclonaux quils prsentent une homologie de squence par rapport lIgG humaine de 75% pour les anticorps chimres, de 95% pour les anticorps humaniss et de 100% pour les anticorps entirement humains. Ces chiffres ne sont toutefois corrects que si lon part de lide que les anticorps humains et murins sont totalement diffrents. Dun ct, il existe des homologies de squences fortement conserves entre les anticorps humains et les anticorps murins. Dun autre ct, les anticorps entirement humains ne correspondent pas totalement la squence programme du gnome, puisquune mutation somatique efficace a lieu au cours de la maturation de laffinit de lanticorps.

Il est possible de produire : un anticorps humanis

monoclonal (zumab), ou totalement

humain

(mumab)

potentiellement

mieux tolr quun anticorps chimrique

(ximab).

55

2me Anne Biologie


5-

Perspectives : Dautres approches dutilisation dAc Mo sont aujourdhui activement explores. Des

fragments dAc (anti-virus, anti-oncognes, anti-enzymes) ont t exprims dans des cellules tumorales, dans des cellules infectes par des virus, pour bloquer ou moduler les fonctions de protines intracellulaires ("Intrabodies"). A tout cela sajoutent des tudes intensives sur la stabilit et le repliement des Ac recombinants, quils soient sous forme monomrique, bispcifique, voire multimrique. Les recherches portent aussi sur loptimisation des proprits effectrices des rgions Fc, la production en masse dAc thrapeutiques par des plantes transgniques (mas) ou dans le lait danimaux transgniques (lapins, chvres et vaches) etc. Le dveloppement successif danticorps chimres, humaniss, puis entirement humains a permis de diminuer significativement limmunognicit des anticorps initialement murins. Si cette volution a autoris une utilisation thrapeutique de ces anticorps dans de nombreuses maladies de lhomme ncessitant des applications rptes, on ne saurait considrer simplement le passage des anticorps chimres aux anticorps humaniss, puis aux anticorps entirement humains, comme un progrs constant de la technique de traitement. Chacune de ces classes danticorps provenant de procds de fabrication biotechnologique diffrents a ses avantages et ses inconvnients, quil sagit dexaminer au cas par cas, dans une perspective dexprimentation clinique.

56

2me Anne Biologie


L'utilisation des Ac Mo : pas si simple ! De nombreux travaux d'ingnierie cellulaire et molculaire ont t dvelopps afin de rsoudre les problmes poss par certaines des caractristiques intrinsques des Ac Mo, notamment pour pouvoir les utiliser in vivo. Il est frquent que l'affinit, l'isotype (la classe ou la sous-classe de l'Ac) ainsi que les proprits effectrices (fixation aux rcepteurs pour la rgion Fc ou RFc, fixation de la molcule C1q du complment) des Ac Mo obtenus ncessitent des modifications. Les Ac Mo sont par exemple susceptibles de se fixer de faon non spcifique par leur partie constante aux RFc prsents la surface d'un certain nombre de cellules du systme immunitaire. L'utilisation in vivo d'Ac Mo des fins diagnostiques (imagerie) ou thrapeutiques a t freine par ailleurs par la nature xnognique de la plupart des Ac utilisables, qui sont des Ac de souris. Peu d'Ac Mo humains ont pendant longtemps t disponibles (Ac anti-D, anti-toxine ttanique, anti-facteur rhumatode...). L'utilisation d'Ac Mo de souris en immunothrapie humaine conduit souvent l'apparition d'Ac humains anti-Ac de souris ("HAMA", pour "Human Anti-Mouse Antibodies"), phnomne pouvant s'accompagner de ractions d'hypersensibilit et de l'apparition de taux importants de complexes immuns en sus des capacits bloquantes de ces Ac vis--vis de lAc Mo. De plus, les proprits effectrices des Ac de souris injects chez lhomme ne sont pas optimales, mme sil ny a pas de barrire despce au sens strict. Ces problmes ont conduit l'laboration de techniques de manipulation in vitro des hybridomes producteurs d'Ac Mo et au dveloppement de techniques d'obtention d'Ac difficiles gnrer in vivo ou de techniques d'obtention d'Ac humains. Les manipulations in vitro d'hybridomes visent obtenir des Ac de meilleure affinit et/ou ayant des proprits effectrices modifies (absence de fixation au C1q, premire tape de l'activation de la voie classique du complment, qui aboutit la lyse des cellules-cibles, ou aux RFc, responsables de la capture de complexes immuns ou de la cytotoxicit-dpendante d'Ac ("ADCC", pour "AntibodyDependent Cell Cytotoxicity"). Ces manipulations reposent sur l'instabilit intrinsque des hybridomes producteurs d'Ac. Ceux-ci sont en effet susceptibles d'tre l'objet de mutations somatiques survenant avec une frquence leve dans les squences V, D, et J des gnes des rgions variables des chanes lourdes et lgres des Ac qu'ils produisent. In vitro, ces mutations peuvent aussi tre l'origine de la perte de ractivit d'un Ac Mo, accompagne ou non de l'acquisition d'une nouvelle spcificit antignique. Les hybridomes peuvent galement subir des dltions affectant les squences d'ADN codant pour les rgions constantes, ainsi que des commutations de classe ("switch"). Cette instabilit est l'origine tout la fois de nombreux problmes rencontrs par les utilisateurs non avertis d'hybridomes; cependant, elle a permis galement le dveloppement de techniques visant obtenir des ractifs aux proprits fonctionnelles amliores. L'utilisation conjointe de culture et de slection d'hybridomes en agarose, de dilution limite et d'ELISA permet en effet d'obtenir des hybridomes producteurs d'Ac prsentant les caractristiques souhaites.

57

2me Anne Biologie


Objectifs

1- Dfinir la protomique. 2- Citer et dfinir les types de protomique. 3- Citer les technologies utilises en protomique. 4- Citer les facteurs pouvant altrer la qualit de lchantillon lors de la prparation dchantillons biologiques. 5- Citer le principe et les particularits de llectrophorse bidimensionnelle. 6- Citer les applications de la protomique.

58



LA PROTEOMIQUE

Introduction & dfinition: La protomique est dfinie comme la caractrisation des processus biologiques et le dchiffrage des mcanismes contrlant lexpression gnique par la dtermination quantitative de lexpression des gnes au niveau protique. Il sagit dune tude systmatique des une protines base sur leur identification, leur quantification, leur caractrisation et ltude de leur(s) fonction(s). Le protome se dfinit comme lensemble des protines codes par un gnome. La protomique offre la possibilit d'identifier et de quantifier les protines e exprimes par une cellule un moment donn, dans un tissu donn et un environnement donn, divers tats de dveloppement, dans des contextes physiologiques et pathologiques varis. Une tude protomique permet de faire l'inventaire des protines dune cellule ou d'un tissu, dun cellule compartiment subcellulaire, les constituants dun complexe multi protique ou encore les multi-protique acteurs protiques dune voie de signalisation. La diffrence fondamentale entre protome et gnome est quun organisme possde gnome, une trs grande diversit de protomes alors qu'il ne renferme qu'un seul gnome. nde

De la gnomique la protomique Chez les procaryotes, le protome est une notion assez simple (un seul compartiment, un nombre restreint de protines, peu de modifications post traductionnelles). A l'oppos, un post-traductionnelles). vertbr suprieur renferme environ 200 tissus diffrents, dans des contextes 59

2me Anne Biologie


dveloppementaux et physiologiques diffrents, sans compter les situations pathologiques, ce qui se traduit par l'existence de milliers de protomes. Il existe deux types dapproches en protomique, dune part, une approche de caractrisation systmatique du contenu protique dun chantillon et, dautre part, une approche plus cible didentification de protines dont le taux relatif diffre entre deux ou plusieurs chantillons biologiques. 1-protomique descriptive : Le premier point dtude de la protomique est lidentification exhaustive des protines exprimes par un organisme. Ceci a t possible grce au dveloppement simultan des techniques sparatives ainsi que des diffrents appareillages de spectromtrie de masse. Cette approche consiste sparer un mlange protique complexe sur un gel dlectrophorse, digrer les protines les analyser par spectromtrie de masse. Lapplication dune telle technologie de sparation des protines, couple la spectromtrie de masse a permis de raliser des cartes protiques de gel deux dimensions (2D), et donc la mise en place de bases de donns construites autour des gels 2D. Dautres techniques ont aussi t dveloppes afin de pouvoir identifier un plus grand nombre de protines. La technique des chromatographies successives permet daugmenter au maximum le nombre de protines identifies, et par la suite de sparer des mlanges trs complexes de protines avant de les identifier par spectromtrie de masse. 2-protomique diffrentielle et quantification : Le deuxime aspect important de lanalyse protomique est lanalyse diffrentielle qui consiste par exemple comparer les protomes de deux tats distincts (malade/sain ; traitement/pas de traitement ;) en observant lapparition, la disparition ou les variations des quantits des protines. Lapproche de quantification la plus classique consiste sparer les mlanges protiques sur des gels dlectrophorse bidimensionnelle et aprs coloration comparer les diffrences entre les gels. Les spots contenants les protines exprimes de faon diffrentielle seront analyss par spectromtrie de masse qui permet dsormais de raliser des analyses quantitatives.

1-

Les technologies utilises en protomique: Lanalyse protomique se rpartie en 2 tapes:

-

La premire tape consiste en une sparation des protines de lchantillon ou des

peptides issus de la digestion de ces protines. Elle repose sur diffrentes techniques lectrophortiques ou chromatographiques. 60

2me Anne Biologie


-

La seconde tape concerne lidentification des protines ralise par la spectromtrie

de masse. Aprs la sparation et lidentification des protines vient la protomique fonctionnelle qui a pour buts : 1-1Ltude des fonctions biologiques des protines inconnues identifies. La dfinition des mcanismes biologiques cellulaire lchelle molculaire. La prparation dchantillons biologiques : La protomique, ncessite de travailler sur des chantillons biologiques de qualit. Lextraction de protines partir dun mlange complexe (biopsie cellulaire, cellules isoles, liquide physiologique...) est ralise laide de tampons appropris et dpend de la nature des protines qui font lobjet de ltude (protines cytosoliques, membranaires, nuclaires...). Lobjectif tant de maintenir les protines extraites en solution en pralable leur sparation. Les tampons dextraction sont ainsi constitus, sur une base saline (Tris, Hepes), de mlanges dagents rducteurs, de dtergents, voire de solvants organiques, dans des proportions variables. Ils sont gnralement supplments dinhibiteurs de protases et leur pH est ajust de manire approprie. Les facteurs pouvant altrer la qualit de lchantillon sont nombreux. Dune part, ceux qui peuvent perturber les tapes ultrieures de sparation de lchantillon et dautre part, ceux qui affecteront directement la qualit de lchantillon. Lors de lextraction de protines partir dun extrait biologique complexe, la mthodologie et les ractifs utiliss ont pour objectif de limiter les contaminations par des acides nucliques, des lipides et les sels ; ce type de composs pouvant perturber diffrents degrs une sparation par lectrophorse bidimensionnelle ou par chromatographie liquide. Le maintien dans le temps de la qualit dun chantillon est une proccupation majeure en protomique. Le temps de conservation entre la collecte ou la prparation de lchantillon et son utilisation dans le cadre dune tude doit tre valu et discut en pralable au lancement de cette tude et des protocoles stricts de conservation doivent tre tablis. En rgle gnrale, les chantillons biologiques sont conservs des tempratures trs basses (conglation 80 C au minimum, azote liquide). Aux chantillons complexes (extraits cellulaires, liquides physiologiques...) on rajoute des inhibiteurs qui limiteront la dgradation par des protases endognes. Les biopsies tissulaires sont congeler intacts dans lazote liquide ds leur prlvement sils doivent tre utiliss sous quelques semaines. Dans le cas dune conservation sur une longue dure, on procde une homognisation immdiate dans le tampon dextraction puis une conglation 80 C.

61

2me Anne Biologie


Dans tous les cas, le protocole de prparation et de conservation des chantillons en pralable leur tude en protomique doit tre parfaitement standardis. La quantit de matriel ncessaire dpend de lapproche utilise ultrieurement pour la sparation des protines. Dans le cas dune sparation par lectrophorse bidimensionnelle dun mlange complexe (par exemple, extrait cellulaire) et coloration au nitrate dargent, 20 80 g de protines totales sont gnralement ncessaires et permettront didentifier par spectromtrie de masse la grande majorit des spots protiques visibles. Les approches sparatives en chromatographie liquide ncessitent des quantits allant de 50 100 g de protines totales. 1-2L

lmd immunotechnologie et vaccinologie ksouri h & haj sassi f

Documents