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BP 2047 - 53020 Laval Cedex 9Tél. 02 43 49 22 22 Fax 02 43 53 36 53http://www.asept.asso.fr E-mail : asept@asept.asso.fr

COMPTE-RENDU DE LA MATINEE

LISTERIA

Laval le 20 novembre 1998

Rédaction

– Les méthodes alternatives de recherche et de dénombrement de ListeriaMuriel Coignard m.coignard@asept.asso.fr– Incidence de Listeria monocytogenes dans le poisson fumé à froidMarielle Gay m.gay@asept.asso.fr– Inhibition des Listeria par les bactériocines des bactéries lactiquesAnita Métivier a.metivier@asept.asso.fr

Ce document comporte 25 pages.

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Les méthodes alternatives de rechercheet de dénombrement de Listeria

Muriel COIGNARD, Chef du Laboratoire

Listeria est une bactérie Gram positive ayant la forme de petits bacilles. Elle ne formepas de spore et cultive en absence ou en présence d’oxygène avec une préférencepour les pressions réduites en oxygène. Sa température optimale de croissance est de30 à 37°C. Elle réagit positivement au test de la catalase et est oxydase négative. Ellea la capacité de cultiver à température comprise entre 0 et 45°C, peut survivre à uneactivité de l’eau de 0,83.Sept espèces constituent le genre Listeria (voir tableau 1).

Listeria monocytogenesListeria ivanoviiListeria innocua

Listeria welshimeriListeria seeligeri

Listeria grayiListeria murrayi

Tableau 1. Les sept espèces du genre Listeria

Parmi ces sept espèces, une seule espèce est pathogène pour l’homme : Listeriamonocytogenes.Elle provoque des méningites, septicémies et avortements chez la femme enceinte.Les populations à risque vis-à-vis de Listeria monocytogenes sont notamment lespersonnes âgées, les femmes enceintes, les nourrissons et les personnesimmunodéprimées.

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Précautions à prendre pour la prévention de la listériose chez lesfemmes enceintes, les patients immunodéprimés et les personnes âgées

Aliments à éviter

• Eviter la consommation de fromages à pâte molle• Enlever la croûte des fromages avant consommation• Eviter la consommation de fromages vendus râpés• Eviter la consommation de poissons fumés• Eviter la consommation de graines germées crues (soja, luzerne, (alfafa) ...);• Eviter la consommation de produits de charcuterie cuite consommés en l'état, par

exemple : pâté, rillettes, produits en gelée, jambon cuit ; Si achetés, préférer lesproduits préemballés et les consommer rapidement après leur achat.

• Eviter la consommation de produits de charcuterie crue consommés en l'état - Lesfaire cuire avant consommation, ex : lardons, bacon, jambon cru ;

• Eviter la consommation de produits achetés au rayon traiteur ;• Eviter la consommation de coquillages crus, surimi, tarama. Règles d'hygiène à respecter

• Cuire soigneusement les aliments crus d'origine animale (viandes, poissons) ; enparticulier le steak haché doit être cuit à cœur ;

• Laver soigneusement les légumes crus et les herbes aromatiques ;• Conserver les aliments crus (viande, légumes, etc.) séparément des aliments cuits

ou prêts à être consommés ;• Après la manipulation d'aliments non cuits se laver les mains et nettoyer les

ustensiles de cuisine qui ont été en contact avec ces aliments ;• Nettoyer fréquemment et désinfecter ensuite avec de l'eau javellisée votre

réfrigérateur ;• Les restes alimentaires et les plats cuisinés doivent être réchauffés soigneusement

avant consommation immédiate.

D'après la prévention de la listériose chez les femmes enceintes, les patientsimmunodéprimés et les personnes âgées. Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire1995 n°23.

1 - Méthodes classiques de détection et de dénombrement des Listeria

La détection des Listeria s’effectue par la méthode NF EN ISO 11290.1 (1997). Cetteméthodologie est décrite sur le schéma 1.

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Schéma 1 : Recherche de Listeria monocytogenes(NF EN ISO 11290-1 ; 1997)

Prise d’essai de 25 gEnrichissement - Fraser 1/2

24h à 30°C

0,1 ml de culture dans 10 ml Fraser - 48h à 37°C

Isolement sur Oxford et Palcam - 24 à 48h à 37°C

Isolement sur Oxfordet Palcam - 24 à 48h à 37°C

Essais de confirmation

Essais de confirmation

– Repiquage sur TSA– Réaction de la catalase– Coloration de Gram– Essai de Camp– Hémolyse– Utilisation des sucres

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Le dénombrement des Listeria s’effectue par la méthode NF EN ISO 11290-2 (1998).La méthodologie est présentée sur le schéma 2.

Schéma 2 : Dénombrement de Listeria(NF EN ISO 11290-2 ; 1998)

Prise d’essai de x gDiluant - Base Fraser 1/2 ou

EPT

Revivification - 1 h à 20°C

Ensemencement sur gélosePalcam - 24 à 48 h à 37°C

Dénombrement descolonies suspectes

Confirmation du genre Listeria– ensemencement sur gélose TSYEA– réaction de la catalase– coloration de Gram

Confirmation de L.monocytogenes– hémolyse– utilisation des glucides– test de Camp

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Pour les deux méthodes normalisées, une identification de l’espèce est nécessaireafin de savoir si l’on est en présence de Listeria monocytogenes. Les testsd’identification sont :- le test de la catalase- la coloration de Gram- le test de l’hémolyse- le test de Camp- les fermentations des sucres (rhamnose et xylose) avec production d’acides.

Listeria monocytogenes est catalase + et Gram+ comme toutes les autres espèces deListeria. Elle est hémolytique, présente une réaction positive au test de Camp vis-à-visde Staphylococcus aureus et enfin utilise le rhamnose mais pas le xylose.

Le temps de réponse pour la méthode de détection varie de 4 à 8 jours en fonction dela présence ou de l’absence de Listeria. Le dénombrement est obtenu entre 48h et 5jours.

2 - Méthodes alternatives de détection et de dénombrement des Listeria

De nombreuses méthodes alternatives permettent de détecter Listeria ou Listeriamonocytogenes dans un délai plus court que les méthodes classiques.

La première alternative par rapport aux méthodes classiques normalisées est deréduire le temps de confirmation et d’identification de l’espèce de Listeria. Pour cela,deux milieux gélosés ont été développés par Sanofi et AES Laboratoire :respectivement le Rapid’L.mono et le milieu ALOA.Ces deux milieux gélosés sont basés sur la détection d’une phospholipase Cspécifique de Listeria monocytogenes qui donne des colonies bleues sur le milieuRapid’L.mono et des colonies bleues entourées d’un halo opaque sur le milieu ALOA.Le milieu Rapid’ L.mono permet en outre de différencier Listeria monocytogenes etListeria ivanovii par la présence dans le milieu du sucre xylose. Avec ces méthodes, letemps de réponse est diminué des 3 jours de confirmation.

Les méthodes permettant de diminuer considérablement le temps de réponse sontbasées sur des principes différents des simples bouillons et géloses auxquelles on esthabitué en laboratoire de microbiologie.Le tableau 2 récapitule les méthodes actuellement disponibles avec leur principe et legerme visé.

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Nom de la

méthode

Fournisseur Temps de

réponse*

Principe Germe détecté

Listeria Rapid Test Oxoïd 2 j Immuno-

chromatographie

Listeria spp

Test Elisa Divers 2 j Réaction immuno-

enzymatique

Listeria spp

Vidas™ Biomérieux 2 à 3 j Réaction immuno-

enzymatique

Listeria spp et

L. monocytogenes

Listerscreen™ AES

Laboratoires

Immunocapture Listeria spp

Gene Trak™ Diffchamb 3 j Hybridation d’ADN L. monocytogenes

Accuprobe™ Euralam 3 j Hybridation d’ADN L. monocytogenes

* : le temps de réponse est donné pour des échantillons négatifs.

Tableau 2. Récapitulatif des méthodes alternatives

Les principes et protocoles détaillés de ces méthodes sont présentés sur les schémas3, 4, et 5.En cas de résultat positif de la méthode, il est nécessaire de confirmer pour la méthodeListeria Rapid Test, les tests Elisa, le Vidas et le Listerscreen. Les autres méthodes nenécessitent pas de test de confirmation.

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Schéma 3 : Listeria Rapid Test

Peser 25 gEnrichissement en Fraser 1/2

21h à 30°C

0,1 ml en BLEB - 21h à 30°C

Traitement thermique - 20 min à 80°C

Dépôt de 135 µl sur la plaquette

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Schéma 4 : LA MÉTHODE ACCUPROBE

1. Lyse des bactéries

37°C - 5 min

2. Hybridation

Sonde marquéeEster d’Acridinium

+ 60°C - 15 min

3. Destruction de l ’ester d ’acridinium

60°C - 5 min

4. Détection par luminescence

+ NaOH Emission de photons

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Schéma 5 : L ’immunocapture

Listeria Capture

Listeria

AIMANT

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De nouvelles méthodes alternatives se développent aujourd’hui pour répondre auxbesoins des industriels en terme de délai de réponse encore plus court. En, effettoutes les méthodes présentées ci-dessus ont un délai de réponse de 2 à 3 jours.Deux méthodes actuellement commercialisées permettent l’obtention d’un résultat en30 h. Il s’agit de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction) et de la méthodeLumiprobe 24.

La PCR est une méthode nécessitant un enrichissement préalable de l’échantilloncomme toutes les méthodes de détection de pathogènes, une lyse des bactéries, uneextraction de l’ADN, une amplification de cet ADN par multiples phases dedénaturation et élongation puis une phase de détection par révélation colorimétrique.

La méthode Lumiprobe 24 est une méthode d’hybridation d’ADN avec deux sondesspécifiques de Listeria monocytogenes. Après enrichissement de l’échantillon, lesbactéries sont lysées. L’ARN ribosomal des bactéries lysées est mis en présenced’une sonde d’ADN spécifique fixée au fond d’un tube. En cas de présence de Listeria,il y a hybridation entre la sonde d’ADN fixée et l’ANRr. Une deuxième sonde d’ADNspécifique est ajoutée en solution et peut se fixer à l’autre extrémité de l’ARNr. Enfin, larévélation colorimétrique se fait par ajout d’un réactif conjugué au marqueur fixé sur laseconde sonde d’ADN. Un substrat est ajouté qui se fixe au réactif conjugué et uneémission de photons détectables par un luminomètre.

Le tableau 3 récapitule les caractéristiques de ces deux méthodes.

Nom de la

méthode

Fournisseur Temps de

réponse*

Principe Germe détecté

Probelia™ Sanofi 30 h PCR L. monocytogenes

Lumiprobe 24™ Euralam 30 h Hybridation d’ADN

double

L. monocytogenes

* : le temps de réponse est donné pour des échantillons négatifs.

Tableau 3. Caractéristiques de la PCR et du Lumiprobe 24™.

En ce qui concerne le dénombrement de Listeria monocytogenes, il n’existe pas deméthode alternative actuellement commercialisée.

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Schéma 6 : Le principe Lumiprobe 24

ARN r bactérien

support coaté

sonde fixée sur le support

sonde en solutionportant un marqueur

réactif conjugué

substratdégradable

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En conclusion, il existe de nombreuses méthodes alternatives de détection de Listeriasp. ; aucune d’elle ne permet de donner une réponse dans la journée. Tout utilisateurdoit choisir la méthode qui lui convient en fonction de différents critères : germerecherché (genre Listeria ou espèce Listeria monocytogenes), délai de réponsesouhaité, spécificité de la méthode, adaptabilité et fiabilité par rapport à l’alimentanalysé et enfin le coût.

ASEPT peut vous proposer les méthodes suivantes :

1. Listeria Rapid Test™ pour la détection du genre Listeria en 2 jours2. Accuprobe™ pour l’identification de Listeria monocytogenes en 3 jours3. VIDAS™ pour la détection de Listeria et Listeria monocytogenes

Toutes ces méthodes sont validées par l’AFNOR pour tous produits alimentaires.Elles ne permettent pas non plus de caractériser les souches détectées : pour cela, ilfaut utiliser d’autres techniques telles que l’électrophorèse en champ pulsé, la RFLP,etc., méthodes de biologie moléculaire qui permettront par leur développement decaractériser les souches détectées et ainsi de faire un lien entre les souches détectéesdans les aliments et celles retrouvées dans l’environnement. Ces techniques sont encours de mise en place au sein du laboratoire de l'ASEPT et vous seront proposéescourant 1999.

Muriel COIGNARDChef du LaboratoireTél. 02 43 49 22 22 Fax 02 43 53 36 53E-mail : m.coignard@asept.asso.fr

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Incidence de Listeria monocytogenesdans le poisson fumé à froid

Marielle Gay, Attachée de recherche

Ce travail de recherche s’inscrit dans le cadre d’un programme européen sur la qualitéet la sécurité des poissons fumés à froid. Au niveau européen, 9 partenaires sontimpliqués dans ce programme :

- Escola Superior de Biotecnologia de Porto - Portugal- Danish Institute for Fisheries Research - Danemark- ENITIAA, Nantes - France- The Icelandic Fisheries Laboratories - Islande- IFREMER, Nantes - France- University College of Cork - Irlande- RIVO-DLO - Pays-Bas- Leatherhead Food Research Association - Grande-Bretagne- ASEPT, Laval - France

Ce projet de recherche se décompose en trois parties principales :

1. Etude des mécanismes d’altération des poissons fumés à froid

D’un point de vue microbiologique, il est actuellement difficile d’établir une relationentre la flore totale (quantité de micro-organismes présents) et l’acceptabilité (ou lerejet) d’un échantillon par analyse sensorielle. Certains échantillons fortementcontaminés sont considérés comme acceptables par les tests d’analyse sensorielle, etd’autres faiblement contaminés sont rejetés par l’analyse sensorielle. Le premier butde cette partie est de déterminer s’il existe une flore spécifique responsable del’altération des produits finis. De plus, il est également difficile d’établir une relationentre la composition en composés chimiques volatils et l’altération des produits. Lesecond objectif de cette partie est de déterminer quels sont les composés chimiquesvolatils responsables de l’altération et de les quantifier. Le but général de cettepremière partie est d’établir des indices objectifs pour déterminer la qualité (seuild’acceptabilité) des poissons fumés à froid, par la compréhension des mécanismesd’altération.

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2. Etude de l’incidence de Listeria monocytogenes dans les poissonsfumés à froid et développement de moyens permettant de limiter lacontamination des produits finis par Listeria monocytogenes.

Le but de cette partie est de déterminer la fréquence de contamination par Listeriamonocytogenes des poissons fumés à froid en Europe et de développer des moyenspermettant de réduire cette contamination. Dans cette partie, des analyses surl’environnement, sur les produits à chaque étape de fabrication et sur les produits finissont réalisées. Ces analyses consistent à rechercher la présence de Listeria spp. et deListeria monocytogenes dans les échantillons. L’étude des pratiques de fabrication,des pratiques de nettoyage et désinfection, et d’une manière générale de l’hygiènedans l’entreprise doit permettre de limiter la contamination des produits finis parListeria monocytogenes.

3. Etude de bactériocines capables d’inhiber la croissance de Listeriamonocytogenes dans les produits finis.

Il existe des souches de bactéries lactiques qui produisent des composés anti-microbiens, appelés bactériocines. Ces bactériocines peuvent avoir un effet inhibiteurvis-à-vis de Listeria monocytogenes. Le premier objectif de cette partie est dedéterminer si une ou plusieurs bactériocines sont efficaces contre Listeriamonocytogenes dans les conditions du produit fini (conditionnement sous-vide à 4°C).Si cet objectif est atteint, le second objectif sera d’établir l’efficacité et les moyensd’application appropriés de souches de bactéries lactiques ou de leurs produits pourinhiber ou détruire Listeria monocytogenes dans les produits.L’IFREMER de Nantes est impliqué dans la partie 1, ASEPT dans la partie 2 etl’ENITIAA dans la partie 3.

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Etude de l’incidence de Listeria monocytogenesdans les poissons fumés à froid.

I. Matériels et méthodes

En France, quatre usines de fumage de poisson ont été volontaires pour participer àcette étude. Les quatre usines diffèrent principalement par leur taille et leurimplantation géographique.

Afin de déterminer l’incidence de Listeria monocytogenes dans les poissons fumés àfroid, des produits en cours de fabrication, des produits finis et des prélèvementsd’environnement sont analysés selon une méthode dérivée de la méthode ISO 11290-1. Les prélèvements d’environnement sont réalisés en cours de fabrication avec desgazes stériles, des chiffonnettes ou des éponges.

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Le protocole de recherche de Listeria monocytogenes utilisé est le suivant :

25 g d’échantillon (ou éponge, ou gaze) dans 225 ml de bouillon Fraser au demi

Incubation 18-24 h à 30°C

0,1 ml dans 10 ml de bouillon Fraser

Incubation 48 h à 37°C

Isolement sur Palcam

Incubation 48 h à 37°C

Colonies

suspectes

OUISélectionner 5 colonies typiques

Test de la Catalase

Coloration de Gram

Bacilles Gram +, catalase +

NON : OUI :

Pas de Listeria dans l’échantillon Présence de Listeria spp.

Fermentation du xylose et du rhamnose Test de Camp

Incubation 48 h à 37°C Incubation 24 h à 37°C

Résultats : identification de l’espèce de Listeria (voir tableau page suivante)

NON :Pas de Listeria dansl'échantillon

Isolement sur TSA-YEIncubation 24 h à 37°C

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Espèces deListeria

Test de CAMP Fermentation des sucres

Staphylococcusaureus

Rhodococcusequi

Xylose Rhamnose

L.monocytogenes + - - +L.innocua - - - VL.ivanovii - + + -L.welshimeri - - + VL.seeligeri + - + -

Tableau 1. Caractéristiques des différentes espèces de Listeria

Le protocole de la méthode de recherche de Listeria monocytogenes a été validé eninterne. Les essais obtenus sur la matrice “ poisson fumé ” montrent que tous leséchantillons qui contiennent des Listeria spp. ont été détectés sur gélose sélectivePalcam et seulement 80% sur gélose Oxford. De plus, la totalité des échantillonspositifs est détectée après 48 h d’incubation des bouillons Fraser et seulement 70%des échantillons positifs sont détectés après 24 h d’incubation du bouillon Fraser audemi.

Un dénombrement de Listeria spp. sur gélose sélective Palcam est réalisé pour leséchantillons de produits contaminés. Une dilution au cinquième de l’échantillon dansdu Tryptone-Sel est réalisée. 0,2 ml de cette suspension sont ensemencés en surfacede cinq boîtes de gélose sélective. Le seuil de détection avec cette méthode dedénombrement est de 5 UFC de Listeria spp./g.

Afin de déterminer quelles sont les voies de contamination des produits finis parL.monocytogenes, les souches isolées des produits ont été caractérisées.Actuellement, sur 300 souches de Listeria monocytogenes isolées des produits et del’environnement, 150 ont été caractérisées. La caractérisation est basée sur lesérotypage et la résistance à des composés anti-microbiens.

Sérotypage : trois antiserum différents sont utilisés : antiserum type 1,antiserum type 4 et antiserum poly A. Les résultats ainsi obtenus pour chaquesouche permettent de déterminer le sérogroupe.Résistance : la résistance de chaque souche à la tétracycline, au cadmium et àl’arsenic est testée.

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II. Résultats- Discussion

2.1. Incidence de Listeria spp. et de Listeria monocytogenes dans l e poisson frais

Pour l’analyse des poissons frais, trois prélèvements sont réalisés sur plusieurspoissons d’un même lot. Les prélèvements sont réalisés par écouvillonnage du mucusde la peau, de la cavité abdominale et des ouïes. Les résultats obtenus montrent quesur 111 lots analysés, 42 (37,8%) sont contaminés par Listeria spp. dont 20 (20,7%)par Listeria monocytogenes.Selon les usines de transformation, la contamination du poisson frais par Listeria spp.varie de 31,3% à 43%. L’incidence de Listeria monocytogenes varie de 14% à 29,4%.La contamination des poissons frais en Listeria monocytogenes, entrant dans lesusines varie donc du simple au double. Ces résultats peuvent être expliqués parplusieurs hypothèses, notamment la sélection des producteurs vis à vis du critèreListeria monocytogenes.

2.2. Incidence de Listeria spp. et de Listeria monocytogenes dans les produits

Pour l’analyse des produits finis, trois prélèvements de 25 g sont réalisés sur unproduit fini. Ces trois prélèvements constituent un échantillon. Les résultats obtenusmontrent que sur 140 échantillons analysés, 54 (38,6%) sont contaminés par Listeriaspp. dont 47 (33,6%) par Listeria monocytogenes.Selon les usines, la contamination des produits finis par Listeria monocytogenes variede 9% à 52%. L’incidence de Listeria monocytogenes varie donc de manière trèsimportante selon les usines.

Les résultats des analyses effectuées sur le produit en cours de fabrication montrentégalement des différences importantes selon les usines.Normalement, la chair du poisson frais est stérile et ne contient donc pas deListeria spp. La contamination de la chair du poisson (ou du filet frais) est donc liée àla contamination externe du poisson. L’analyse des filets frais montre que lacontamination par Listeria monocytogenes varie de 2% à 51%. Ces résultats montrentque l’étape de filetage est un point critique de la contamination des filets frais. Lorsd’un salage au sel sec et du fumage, une diminution de la contamination est observée.Si le salage est effectué par injection de saumure, la contamination des produits parListeria monocytogenes augmente au cours du salage. Lors du tranchage et duconditionnement des produits, une augmentation de la contamination des produits estobservée.

Il faut cependant noter que les pratiques hygiéniques de transformation jouent un rôleimportant car des différences importantes sont observées selon les usines. A titred’exemple, dans l’une des usines, 2,2% des filets fumés sont contaminés par Listeriamonocytogenes et 8,9% des produits finis sont contaminés par Listeriamonocytogenes. Dans une autre usine, 5,9% des filets fumés sont contaminés parListeria monocytogenes et 35% des produits finis sont contaminés par Listeriamonocytogenes. Ces deux exemples montrent bien que les opérations de tranchage

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et de conditionnement augmentent la fréquence de contamination des produits.Cependant, des différences très importantes sont observées selon les usines.

Les résultats des dénombrements effectués sur les échantillons contaminés parListeria spp. montrent que le niveau de contamination dans les produits finis est trèsfaible : généralement moins de 5 UFC de Listeria spp. par gramme de produits. Seulsdeux échantillons étaient contaminés à des concentrations supérieures à 102 UFC/g.

2.3. Incidence de Listeria spp. et de Listeria monocytogenes dans l’environnement

Les prélèvements d’environnement sont réalisés pendant fabrication. Sur 1077échantillons analysés, 205 (19%) sont contaminés par Listeria spp. dont 159 (14,8%)sont contaminés par Listeria monocytogenes. Selon les usines, la contamination del’environnement par Listeria monocytogenes varie de 3,5% à 35,5%. Ces résultatsmontrent que la contamination de l’environnement est très variable selon les usines. Ilest à noter que les produits finis les plus contaminés sont issus des usines dontl’environnement est le plus contaminé. Ces résultats montrent que d’une manièregénérale, la qualité hygiénique des produits est liée l’hygiène dans l’entreprise.

2.4. Car actérisation des souches de Listeria monocytogenes

Les résultats de la caractérisation des souches ont permis de définir 8 biotypesdifférents.

Biotype % desouches

Sérotypage Profil de Résistance (R) /Sensibilité (S)

Antiserumtype 1

Antiserumtype 2

Antiserumpoly A

Sérogroupe Tetracycline Cadmium Arsenic

1 16,0 + - + 1/2 S S S2 44,7 + - + 1/2 S R S3 21,3 + - + 1/2 S S R4 10,7 + - + 1/2 S R R5 1,3 - + - 4 R R S6 2,0 - + + 4 S R S7 2,7 - + + 4 S S R8 1,3 - + + 4 S S S

Tableau 2. Caractérisation des souches de Listeria monocytogenes

Les résultats obtenus montrent que 4 biotypes (1, 2, 3 et 4) représentent la majoritédes souches. Les quatre autres biotypes n’ont été identifiés que sur quelques souchesde Listeria monocytogenes.

Les résultats du biotypage des souches de L.monocytogenes montrent que lesenvironnements des quatre usines sont contaminés majoritairement par des souchesdu biotype 2. Sur les poissons frais, ce biotype est parfois retrouvé mais est

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minoritaire. Enfin, sur les produits finis, on retrouve le biotype 2 (fréquent dansl’environnement), et les biotypes 1 et 3 retrouvés fréquemment sur le poisson frais.L’ensemble des résultats obtenus tend à montrer que la contamination del’environnement n’est pas liée uniquement à la contamination de la matière première.La contamination des produits finis est liée à la fois à la contamination de la matièrepremière et à la contamination de l’environnement.

Conclusion

En moyenne, 23% des poissons frais et 34% des produits finis sont contaminés parListeria monocytogenes. La contamination des poissons frais est à peu prèséquivalente dans les différentes usines. L’incidence de L.monocytogenes sur lesproduits finis varie fortement (de 9% à 53%) d’une usine à l’autre. Ces résultatsmontrent qu’il est possible de limiter la contamination des produits finis. Les pratiquesde fabrication, les mesures d’hygiène et les procédures de nettoyage et désinfection,la gestion du personnel peuvent avoir une grande importance dans la limitation de lacontamination des produits finis par L.monocytogenes.

Les résultats de la caractérisation des souches de Listeria monocytogenes, montrentque :

- la contamination de l’environnement peut être reliée à l’entrée de la matièrepremière contaminée. Cependant ce n’est pas la seule source de contaminationde l’environnement. En effet, certains biotypes ont été retrouvés dansl’environnement et pas sur la matière première.- la contamination des produits finis est liée à la fois à la contamination de lamatière première et à celle de l’environnement. Les biotypes de Listeriamonocytogenes retrouvés dans les produits finis sont soient identiques à ceux dela matière première soient identiques à ceux de l’environnement.

Marielle GAYAttachée de rechercheTél. 02 43 49 22 22 Fax 02 43 53 36 53E-mail : m.gay@asept.asso.fr

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Inhibition des Listeria par les bactériocinesdes bactéries lactiques

Anita METIVIER, Cadre Scientifique en Microbiologie

GénéralitésL’utilisation des bactéries lactiques en industries agro-alimentaires s’explique par leurpropriété organoleptique intéressante au cours des fermentations et leur pouvoird’inhiber des flores d’altération et pathogènes. Le procédé de fermentation estd’ailleurs souvent un moyen d’allonger la conservation d’un produit très sensible àl’état frais. Les propriétés inhibitrices des bactéries lactiques sont attribuées à troisprincipaux facteurs :

- les rejets de catabolisme (acides organiques tels que l’acide lactique)- la production de métabolites de l’oxygène (H2O2, etc.)- la production de bactériocines

Ce troisième mécanisme est intéressant pour une application à la conservation deproduits non-fermentés comme les produits de la mer.

Qu’est-ce qu’une bactériocine ?Une bactériocine est un peptide ou une protéine produite par une bactérie etprésentant une activité inhibitrice contre des bactéries taxonomiquement proches de lasouche productrice et contre certains pathogènes tels que Bacillus, Clostridium etListeria.

Les bactériocines des bactéries lactiquesA l’heure actuelle, un nombre important de bactériocines ont été caractérisées etséquencées. Ces bactériocines présentent une diversité structurale donnant lieu à uneclassification (Klaenhammer, 1993). Elles sont réparties en quatre classes distinctes :

- Classe I : les lantibiotiques Ces peptides renferment dans leur séquence primaire des acides aminés modifiésappélés lanthionines (β- methyl lanthionine, dehydro-alanine et de la dehydro-butyrine). Le représentant de cette classe est la nisine.

- Classe II : les non-lantibiotiques ou cystibiotiques Ce sont des peptides thermostables de poids moléculaire (PM) < 5 kDa. Cette classeest divisée en plusieurs sous-classes :

- Classe IIa : bactériocines anti-Listeria (elles renferment toutes uneséquence N-terminale consensus qui consiste à l’enchaînement de sept acidesaminés : K-Y-Y-G-N-G-V)

- Classe IIb : bactériocines à deux composants (la présence de deuxpeptides est nécessaire à l’activité biologique)

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` - Classe IIc : bactériocines thiol-activées (le groupement thiol doit êtresous forme réduite pour que la bactériocine soit active)

- Classe IId : autres bactériocines (autres peptides qui ne répondent pasaux critères ci-dessus)

Classe III : les protéines de haut poids moléculaire Ce sont des protéines thermolabiles (PM > 30 kDa). Cette classe est représentée parl’helvéticine J (Joerger et Klaenhammer, 1986)

Classe IV : les bactériocines complexesCe sont des protéines hétérogènes. Elles renferment une partie non-protéiqueindispensable à l’activité biologique, le plus souvent c’est un carbohydrate ou unlipide.

Le mode d’action des bactériocinesLes peptides anti-microbiens du règne vivant présentent des modes d’actionsimilaires. Ils ont tous pour cible la membrane plasmique. Ils forment des poresmembranaires qui annulent le rôle de barrière sélective de la membrane entre lemilieu extérieur et le milieu intérieur de la cellule bactérienne.

Mode d’utilisation et exemples d’applications en agro-alimentaireles bactériocines peuvent être utilisées dans les aliments selon trois procédés :

- inoculation de la souche productrice de bactériocine dans le produitSi la bactérie lactique est naturellement présente dans le produit alors dans ce caselle se développe normalement et produit la substance inhibitrice au cours de saphase exponentielle de croissance. Si au contraire, il faut implanter la soucheproductrice le succès de l’opération dépend de la capacité de la souche à sedévelopper et à produire la bactériocine dans un environnement nouveau. Lesconditions de culture (température, pH, aw, exigences nutritionnelles dans l’aliment)peuvent ne pas convenir au développement du microorganisme souhaité.

- utilisation d’une préparation semi-purifiée de bactériocineLe plus souvent, il s’agit du milieu de culture fermenté débarrassé des cellulesbactériennes.

- utilisation de la bactériocine pureDans ce cas, la bactériocine n’est pas accompagnée de substances nuisibles auprocédé de fabrication ou à l’obtention du produit souhaité.

Les exemples d’application sont nombreux pour la nisine car cette dernière a reçu en1969, l’autorisation d’être utilisée en tant qu’additif alimentaire par les organisationsmondiales de la santé publique.Gorris et coll., 1994 ont montré que la nisine était capable d’inhiber les cellulesvégétatives de Clostridium tyrobutyricum mais aussi d’empêcher la revivification desspores dans la fabrication de fromages. L’utilisation d’un levain producteur de nisine

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(Lactococcus lactis subsp.lactis) dans la fabrication de camemberts a fait l’objet d’uneétude approfondie (Maisnier-Patin et coll., 1992). Ces auteurs ont observé unediminution de 2,4 log UFC/g de Listeria monocytogenes dans un fromage fabriquéavec des levains Nis (+). L’action inhibitrice est très élevée au coeur du fromage (pHacide) et son pouvoir inhibiteur diminue au fur et à mesure que l’on approche de lasurface. Des essais d’utilisation de la nisine pour la conservation de la viande dedinde ont été réalisées par Mahadeo et Tatini (1994). Ils observent une diminution dela population de Listeria monocytogenes dans un jus de broyât de dinde avec lanisine. Par contre, l’action inhibitrice de la bactériocine sur la dinde entière dépluméeest beaucoup moins évidente. Cutter et Siragusa (1994) ont appliqué de la nisine sousforme de spray sur des carcasses de boeufs préalablement contaminées par Listeriainnocua et la flore d’altération. Ils ont observé une diminution de 3 log de la populationde Listeria et ils en ont déduit qu’il était possible d’utiliser des sprays de nisine pour ladécontamination des carcasses d’animaux. Les exemples cités auparavant font état del’efficacité de la nisine utilisée seule mais cette molécule peut être combinée à untraitement thermique de l’aliment. Dans un lait chauffé à 54°C, le délai d’éliminationdes cellules de Listeria monocytogenes est réduit de 60 minutes comparé à un laitchauffé à 54°C mais sans nisine (Maisnier-Patin et coll., 1995).

Etude de la divercine V41, une bactériocine produite par Carnobacteriumdivergens V41La divercine V41 est une bactériocine anti-Listeria produite par Carnobacteriumdivergens V41, souche isolée de viscères de poisson. La bactériocine est un peptidebasique et amphiphile. Son point isoélectrique est de 10,1. Elle renferme dans saséquence primaire le motif anti-Listeria (KYYGNGV). La concentration minimaleinhibitrice (CMI) de la divercine V41 est de 0,344 µg/ml contre Listeria monocytogenesScott A. Le pouvoir inhibiteur de la bactériocine est limité dans le temps. La croissancede L. monocytogenes Scott A est inhibée durant 12-13 heures en présence de 0,05µg/ml de divercine pure. Au delà, la croissance de Listeria redémarre. Les cellules deListeria ont été récupérées et analysées. Il n’existe pas de déficience d’adsorption dela bactériocine à la surface des cellules cibles. La bactériocine n’a pas été dégradéepar des enzymes protéolytiques susceptibles d’être présentes dans le milieu deculture. La fréquence d’apparition des cellules de Listeria résistantes à la divercineV41 est anormalement élevée, elle est de 10-4. Ce taux d’apparition de résistants estincompatible avec le taux de mutation couramment observé chez les bactéries. Ilsemblerait que le caractère “ résistance ” soit définitivement acquis par les cellulesde Listeria. En effet, les cellules demeurent résistantes même après plusieurs culturesen l’absence de bactériocine. La résistance peut être due à un changement decomposition lipidique entraînant des répercussions sur la fluidité membranaire. Desétudes de composition en phospholipides et acides gras ont été entreprises. Lesrésultats obtenus révèlent des légères différences dans la proportion en acides grasd’une souche de Listeria innocua sensible et résistante à la divercine V41. Des étudesde fluidité membranaire ont été réalisées sur des liposomes de lipides naturels.Malheureusement, aucune différence de fluidité membranaire n’est observée entre lesdeux souches sensible et résistante. Il semblerait que les lipides ne suffisent pas à

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expliquer à eux seuls le phénomène de résistance. La membrane plasmique doit êtreconsidérée dans son intégrité c’est à dire avec ses lipides et ses protéines.

Facteurs limitants de l’efficacité des bactériocines et des souchesproductrices

les souches productrices - Le milieu de culture peut ou ne pas convenir au développement de la soucheproductrice de bactériocine. Si les paramètres de croissance (pH, température,nutriments) ne sont pas optimaux à la croissance de la bactérie lactique alors cettedernière ne pourra pas produire de bactériocine.- La bactérie lactique peut avoir perdu la capacité de produire des bactériocines.- Une attaque phagique dans l’aliment peut entraîner la disparition totale de lapopulation de souches productrices.- Dans l’aliment, la souche productrice va se trouver en compétition avec d’autresmicro-organismes. Il peut y avoir des effets antagonistes limitant la croissance de labactérie lactique.

les bactériocines- Le facteur limitant majeur est la sélection de souches résistantes- La bactériocine peut être dégradée par des protéases contenus dans le milieu ourendue inactive par des réactions d’oxydation- La nature amphiphile des bactériocines fait que ces dernières peuvent être piégéesdans des vésicules lipidiques ou sur des protéines de surface limitant ainsi leur effetinhibiteur- Les bactériocines peuvent être plus ou moins solubles dans les constituantsalimentaires- La présence d’autres additifs peut inactiver la bactériocine- Le pH du milieu peut influencer la stabilité et l’activité des bactériocines

Devenir des bactériocinesLes études réalisées sur l’utilisation des bactériocines comme conservateursalimentaires tendent à montrer que ces molécules présentent des propriétésintéressantes. Toutefois, leur efficacité doit être améliorée pour obtenir des tauxd’inhibition équivalents à ceux observés in vitro. Degnan et coll., 1993 ont démontréque la pédiocine encapsulée dans des liposomes alimentaires conservait 90% de sonactivité. L’inconvénient majeur des bactériocines est que celles-ci présentent desspectres trop étroits. Les conséquences directs sont l’absence d’inhibition de la florepathogène Gram négative et l’apparition de bactéries résistantes Gram positive.L’utilisation des bactériocines combinées à d’autres traitements inhibiteurs peut êtreune solution au problème posé. Kalchayand et coll., 1994 montrent que Listeriamonocytogenes est détruite par un traitement par haute pression couplé à la nisine. Lacombinaison de plusieurs bactériocines peut élargir le spectre d’activité et ainsiminimiser l’émergence de bactéries résistantes.

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Bibliographie

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Degnan A et al., 1993. Antilisterial activity of pediocin AcH in model food systems in thepresence of an emulsifier or encapsulated within liposomes. International Journal ofFood Microbiology 18, 127-138.

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Kalchayand et al. (1994). Hydrostatic pressure and electroporation have increasedbactericidal efficiency in combination with bacteriocins. Applied and EnvironmentalMicrobiology 61, 2873-2878.

Klaenhammer TR (1993). Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria.FEMS Microbiological Reviews 12, 39-86.

Maisnier-Patin et al.(1992). Inhibition of Listeria monocytogenes in camembert cheesemade with a nisin-producing starter. Lait 72, 249-263.

Maisnier-Patin et al. (1995). Combined effect of nisin and moderate heat on destructionof Listeria monocytogenes in milk. Lait 75, 81-91.

Métivier et al. (1998). Divercin V41, a new bacteriocin with two disulphide bondsproduced by Carnobacterium divergens V41 : primary structure and genomicorganization. Microbiology 144, 2837-2844.

Anita METIVIERCadre scientifique en MicrobiologieTél. 02 43 49 22 22 Fax 02 43 53 36 53E-mail : a.metivier@asept.asso.fr