La Lettre du Cancérologue • Vol. XXI - n° 6 - juin 2012 | 309

DOSSIER THÉMATIQUELa médecine personnalisée

Les puces protéiques en phase reverse et leur application en oncologieReverse phase protein arrays and their application in cl inical oncology

F. Bard*, C. Lecerf*, A. Barbet*, T. Dubois**, L. de Koning*

* Plateforme RPPA, équipe de biologie du cancer du sein, département de recherche translationnelle, institut Curie, Paris.

** Équipe de biologie du cancer du sein, département de recherche translationnelle, institut Curie, Paris.

Le développement des puces à ADN ou à ARN et le séquençage de génomes complets ont permis d’acquérir une vision globale des

processus biologiques et de disposer des premières signatures génomiques et transcriptomiques en cancérologie. L’identifi cation, à partir de données transcriptomiques, des 5 principaux sous-types moléculaires des carcinomes infiltrants du sein (luminal A, luminal B, ERBB2, basale et de type normal) [1] a constitué une avancée majeure. Cependant, il existe des différences importantes entre génomique, transcriptomique et protéomique. Dans un large échantillon de lignées cellulaires, une corrélation de seulement 65 % a été trouvée entre les données transcriptomiques et les données d’expression protéique (2). L’étude protéomique semble donc essentielle pour obtenir une vision complète de l’activité cellulaire. En effet, les taux d’expression de 52 protéines, ajoutés aux données transcriptomiques de 10 000 gènes, ont permis de prédire de façon plus effi cace la sensibilité de lignées cellulaires à des agents anticancéreux (3). Les données de protéomique permettent donc de compléter et de renforcer celles apportées par la génomique et la transcriptomique. De plus, seule l’analyse des protéines permet de visualiser des modifi cations post-traductionnelles, comme les phosphorylations. Ces modifi cations régulent les voies de signalisation qui permettent aux cellules de réagir à leur environnement, et qui sont souvent la cible des nouvelles approches thérapeutiques dites “ciblées” ou “personnalisées”. Il est donc indis-pensable d’avoir une approche capable de rendre compte de l’activation de ces voies de signalisation.

La protéomique a bénéficié du développement de nombreux outils, tels que l’électrophorèse 2D, la spectrométrie de masse, la chromatographie et, plus récemment, les puces protéiques. Ces dernières sont particulièrement bien adaptées aux études à haut débit de petits échantillons tumoraux et offrent des perspectives très prometteuses en recherche clinique. L’idée de la technologie de puces protéiques est venue de R.P. Ekins en 1989, qui a été le premier à s’intéresser à la miniaturisation des immuno-assays (4). Cette technologie comprend 3 étapes fondamentales : la fi xation de l’appât sur un support solide, l’interaction entre appât et proie et, enfi n, la détection de cette interaction. Il existe différents types de puces, réparties en 2 classes principales : les puces à anticorps et les puces à protéines (fi gure 1, p. 310). Ces 2 formats de puces diffèrent dans le type de molécules utilisées comme appâts et celles utilisées comme proies. Sur une puce à anticorps, entre 100 et 1 000 anticorps sont fi xés sur la lame et servent d’appât pour un lysat protéique. Ces puces permettent donc de détecter simultanément de nombreuses protéines dans un échantillon biolo-gique. La détection peut être directe ou indirecte (fi gure 1, p. 310) : dans le cas de la méthode directe, l’antigène est lui-même marqué, généralement par un fl uorophore. Cette stratégie de détection permet de détecter simultanément, sur une même puce, 2 échantillons marqués avec 2 fl uorophores différents, par exemple un échantillon de référence versus un échantillon test. Dans la méthode indi-recte, appelée “sandwich array”, les protéines d’inté-rêts ne sont pas marquées elles-mêmes, elles sont reconnues par un deuxième anticorps, dirigé contre

Figure 1. Les différents types de puces protéiques sont représentés schématiquement : puces à anticorps avec un marquage direct de l’échantillon (à gauche) ; puces à anticorps en “sandwich”, où la détection repose sur un deuxième anticorps marqué (au milieu) ; puces à protéines en phase reverse (RPPA), où les échantillons sont directement déposés sur la surface (à droite).

Puces à anticorps Puces à protéines(phase reverse)

Direct :échantillon marqué

En “sandwich” :deuxième anticorps marqué

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RésuméLa technologie des puces protéiques en phase reverse (RPPA) est une approche de dot blot miniaturisé, où les lysats protéiques sont déposés sur des lames couvertes de nitrocellulose. Ensuite, chaque lame est révélée avec un anticorps primaire spécifique pour la protéine d’intérêt. Les avantages de la RPPA sont :– la faible quantité de matériel nécessaire ; – la possibilité d’analyser jusqu’à un millier d’échantillons simultanément sur la même lame ;– la possibilité d’étudier l’activation des voies de signalisation en utilisant des anticorps contre des protéines modifiées (par exemple phosphorylées).Dans cette revue, nous expliquons en détail la technologie, et nous discutons ses applications actuelles et à venir, notamment en clinique.

Mots-clés ProtéomiquePuces protéiques en phase reverseSignalisation cellulaireThérapies cibléesEssais cliniques

SummaryThe Reverse Phase Protein Array (RPPA) technology is a miniaturized dot blot approach in which protein lysates are deposited onto arrays covered with a thin layer of nitrocel-lulose. Each array contains all samples and is labeled with one primary antibody specifi c for the protein of interest. The advantages of RPPA are :– the small amount of material that is required;– the possibility to analyze up to one thousand different samples simultaneously on the same array;– the possibility to study the activation status of cell signaling pathways by using antibodies against modified (e. g. phosphorylated) proteins. In this review, we explain in detail the technology, its requirements and possibilities, and its current and future appli-cations in the fi eld of clinical practice.

KeywordsProteomics

Reverse phase protein array

Cell signaling

Targeted therapy

Clinical trials

un épitope différent de la même protéine. Dans ce cas, la spécifi cité est meilleure qu’avec la méthode directe, car la liaison à l’antigène est réalisée à la fois par l’anticorps de capture et par l’anticorps marqué. Grâce à une spécifi cité et une sensibilité plus élevées, cette technique s’est beaucoup déve-loppée. Cependant, elle présente l’inconvénient de nécessiter une paire d’anticorps spécifi ques pour chaque antigène étudié. Plusieurs équipes ont rapporté l’utilisation de 40 à 50 paires d’anticorps sur une même puce sans réactions croisées (5, 6). Les puces à anticorps ont fait leurs preuves en tant qu’outils innovants pour le diagnostic de certains cancers tels que ceux du sein, de la vessie, de la prostate et du côlon (7).Ici, nous nous concentrerons sur les puces protéiques en phase reverse (RPPA), développées par les équipes de E. Petricoin et L. Liotta aux États-Unis pour des études protéomiques sur des lysats obtenus à partir de biopsies microdisséquées (8, 9). Elles sont l’inverse (“reverse”) des puces à anticorps dans le sens où les lysats protéiques sont déposés sur la lame et servent d’appât pour un anticorps contre la protéine d’intérêt (fi gure 1). Contrairement aux puces à anticorps, cette technique permet donc d’analyser un grand nombre d’échantillons (jusqu’à un millier) en même temps, tout en consommant

beaucoup moins de matériel biologique (moins de 1 ng/spot). Elle est particulièrement adaptée à l’analyse de grandes séries d’échantillons précieux, comme des biopsies et des populations de cellules transfectées ou triées. Un grand nombre de puces identiques peuvent être produites, dont chacune est incubée avec un anticorps différent. Ainsi, l’expres-sion et l’état d’activation des protéines impliquées dans les voies de signalisation cellulaires sont étudiés de manière semi-quantitative.

RPPA : la technique

La lyse des échantillons est la première étape primor-diale de la RPPA. Différents tampons de lyse peuvent être utilisés ; ils permettent de conserver ou non l’état natif des protéines d’intérêt (10). Cependant, si la validation des anticorps primaires s’est faite dans des conditions dénaturantes (western blot), il est préférable d’effectuer la RPPA dans ces mêmes condi-tions afi n de retrouver une liaison similaire entre anticorps et antigène. De plus, selon le mode de détection choisi, le tampon diffère. En effet, certains tampons de lyse sont naturellement fl uorescents et sont donc incompatibles avec une détection par fl uorescence.

Figure 2. RPPA : la technique. Une puce révélée en fl uorescence (spots rouges) est utilisée comme exemple. Chaque spot contient moins de 1 ng de matériel. Schématiquement, les différentes protéines présentes dans un lysat sont déposées sur la nitrocellulose. La protéine d’intérêt est détectée avec un anticorps primaire, qui est lui-même détecté avec un anticorps secondaire couplé à de la peroxydase de raifort (HRP). Cette peroxydase est utilisée pour l’amplifi cation du signal par un complexe avidine-biotine. La révélation se fait par des molécules fl uorescentes (alexa-647) couplées à la streptavidine.

HRP IProtéine d’intérêt détectée par un anticorps primaire spécifi que1 puce = 1 anticorps

StreptavidineAlexa-647

Lysat protéique

1 spot = ± 1 ng de lysat protéique

Lame couverte de nitrocellulose1 puce = jusqu’à 10 000 spots

Nitrocellulose

BI

NE

O T

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DOSSIER THÉMATIQUE

Les différents échantillons sont ensuite déposés de façon aléatoire et robotisée sur des lames de micros-cope recouvertes de nitrocellulose. Idéalement, chaque échantillon est déposé en plusieurs dilu-tions successives, ce qui permet de mieux connaître la linéarité de chaque anticorps par la suite. Selon le spotteur et la taille de la nitro cellulose, jusqu’à 10 000 spots peuvent être déposés sur chaque lame (fi gure 2). Ces robots permettent de ne déposer que quelques nanolitres de chaque échantillon, en limitant leur évaporation grâce à un contrôle de l’humidité ambiante. Les spotteurs peuvent être à pointes pleines ou à pointes creuses. Les pointes creuses aspirent un volume nécessaire pour plusieurs spots, alors que les pointes pleines véhiculent une goutte pour 1 seul spot. L’utilisation de pointes creuses nécessite un volume d’échantillon de départ plus important ainsi qu’un entretien constant pour éviter le bouchage des pointes. Un spotteur à pointes pleines demande très peu d’entretien, mais les dépôts sont plus longs, car la machine fait un aller-retour pour chaque spot. La révélation des puces se fait soit manuellement, soit de façon robotisée grâce à des machines déve-loppées pour l’immunohistochimie (par exemple, un autostainer). La méthode de révélation est semblable à celle utilisée pour un western blot et requiert donc l’utilisation d’anticorps primaires et secondaires ; on y ajoute cependant une étape d’amplification pour améliorer la détection du signal (fi gure 2). Cette amplifi cation se fait soit par une succession d’anticorps secondaires (antibody-mediated signal amplifi cation) [11], soit en utilisant une amplification par avidine-biotine (tyramide signal amplifi cation) [12]. Comme pour des puces à anticorps, la principale restriction de la RPPA réside dans la disponibilité d’anticorps primaires de qualité. Contrairement à un western blot, la RPPA ne sépare pas les protéines selon leur poids moléculaire. Toutes les protéines se retrouvent au sein du même spot, et il est donc impossible de différencier un signal spécifi que d’un signal aspécifi que. C’est pourquoi chaque anticorps primaire doit être préalablement testé en western blot sur un panel d’échantillons afi n de vérifi er sa spécifi -cité. L’anticorps ne doit reconnaître que la protéine d’intérêt, ce qui se traduit en western blot par une seule bande au poids moléculaire attendu. Chaque nouveau lot d’anticorps est soumis à cette vérifi cation, car des différences entre lots peuvent être observées. La révélation des puces peut se faire par marquage chromogénique, chimiluminescent ou fluores-cent. Le signal chimiluminescent est très sensible,

mais il est instable et nécessite une lecture rapide ; il est donc peu utilisé en RPPA. Malgré sa faible réso-lution (gamme de concentrations protéiques dans laquelle le signal de l’anticorps augmente de façon linéaire), le marquage chromogénique est souvent utilisé en RPPA, parce qu’il est visible à l’œil nu et ne nécessite donc pas de matériel onéreux pour la lecture. Les marquages fl uorescents, qui requièrent un scanner à laser, ont pour avantages d’être stables et d’avoir une large gamme de linéarité. Le fl uoro-chrome utilisé peut émettre dans le spectre visible (figure 2) ou dans l’infrarouge. L’infrarouge offre une très grande sensibilité et permet d’éviter la fl uorescence naturelle de la nitrocellulose dans le spectre visible.

Analyse des données des RPPA

L’analyse et l’interprétation des puces RPPA se déroulent en plusieurs étapes. La première étape de l’analyse des données consiste à détecter les spots sur une image scannée de la puce et à en déterminer l’intensité. Cette intensité sera la valeur brute et refl ète le taux de protéine présent dans le spot en question.

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Une fois les valeurs brutes obtenues pour chaque spot, il est nécessaire de procéder à l’analyse. À l’inverse des puces transcriptomiques, dont les outils d’analyse sont relativement standardisés, peu d’outils sont disponibles pour l’analyse des données RPPA, et chaque plateforme a sa propre façon de faire. Le fait que les puces RPPA soient entière-ment à façon, avec des extraits protéiques et des anticorps différents pour chaque projet, ne facilite pas la mise en place d’outils standardisés. L’analyse comprend 2 grandes étapes : la quantifi cation et la normalisation. La quantifi cation consiste à réduire une série de dilutions (typiquement 5 dilutions successives pour chaque échantillon) à une seule valeur utilisable pour les analyses statistiques. La normalisation des données a pour but de corriger les données pour des sources de variations qui ne sont pas liées à l’expression des protéines. Il s’agit, entre autres :

➤ du bruit de fond de la lame et du tampon de lyse ; ➤ de la liaison aspécifi que des anticorps secon-

daires ; ➤ des différences dues à des variations dans la

quantité totale de protéines déposées sur chaque spot ;

➤ d’éventuels biais spatiaux dus à la fabrication de la lame ou à un marquage inégal de la lame.

Peu d’outils ont été proposés dans la littérature pour la normalisation. Une méthode consiste à déposer autour de chaque échantillon 4 spots témoins, contenant toujours le même lysat (13). Ces spots témoins, qui ont théoriquement la même inten-sité partout sur la lame, servent à normaliser pour des biais spatiaux et améliorent effectivement la reproductibilité et la précision de la technique (13). Cependant, la place nécessaire pour déposer tous ces témoins réduit considérablement le nombre d’échantillons qui peut être déposé sur chaque lame. Pour pallier ce problème, nous développons actuel-lement une autre méthode de normalisation, basée sur l’utilisation d’une lame de contrôle négatif (sans anticorps primaire) et d’une lame avec un marquage de protéines totales.Grâce à la quantification et à la normalisation, une seule valeur par échantillon et par anticorps est obtenue. Cette valeur représente l’expression protéique relative et est utilisée pour les analyses statistiques qui sont propres à chaque projet : clustering pour identifi er des sous-groupes, compa-raison avec la survie des patientes ou identifi cation des protéines exprimées différemment entre 2 condi-tions. Ces analyses seront d’autant plus robustes

que le design expérimental a été correctement établi, avec les contrôles appropriés, et que des réplicats ont pu être incorporés dans l’étude.

Applications de la RPPA : de la recherche fondamentale à la clinique

Dès lors qu’un grand nombre de conditions doivent être testées ou que la quantité de matériel disponible est limitée, la RPPA est une technologie intéres-sante. En recherche fondamentale, il s’agit souvent d’études sur des lignées cellulaires. Par exemple, un criblage à grande échelle par siRNA (petits ARN interférents), suivi d’une analyse en RPPA, a permis de démontrer que l’inactivation de la voie AKT conduit à une activation de la voie MAPK, et vice versa (14).Dans des études précliniques, sur des modèles animaux, la RPPA permet d’identifi er des marqueurs pharmacodynamiques (15) et des marqueurs de résistance à une molécule (16) ou d’étudier la corré-lation entre plusieurs marqueurs (17). Il est possible d’étudier l’effi cacité d’une drogue ciblée au niveau moléculaire dans la tumeur et donc d’apporter une preuve de concept in vivo. De plus, de petites biopsies réalisées chez la souris fournissent suffi samment de matériel pour faire de la RPPA, et permettent donc d’évaluer les marqueurs au cours du temps dans la même souris, en évitant les variations importantes entre différentes xénogreffes.En clinique, la RPPA a jusqu’ici surtout été appliquée à des études rétrospectives sur des collections de tissus. Elle permet, entre autres, d’identifi er des marqueurs prédictifs pour la survie ou la résis-tance aux traitements (18-21), d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques (22-24) ou d’iden-tifi er de nouveaux sous-groupes moléculaires (25). Les premières études appliquaient systématique-ment la microdissection par laser (26) sur des tissus congelés afi n de ne récupérer que les cellules cancéreuses (9). En effet, la microdissection permet d’avoir un tissu plus homogène et peut aider à détecter de faibles variations dans l’expression des protéines (27). Cependant, cette technique demande beaucoup de temps et est donc peu adaptée à une analyse à haut débit. Il a été démontré que l’utili-sation du tissu entier, sans microdissection, permet également d’obtenir de bons résultats (28), et c’est en effet l’extraction à partir d’un tissu entier qui est maintenant le plus souvent appliquée.

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Figure 3. En clinique, la RPPA est particulièrement prometteuse dans la mise en place d’essais cliniques visant à tester plusieurs drogues, où la technique pourra déterminer les voies de signalisation activées dans chaque biopsie et guider le choix de la thérapie ciblée à administrer.

Patient(e)

Biospie

RPPA Voies de signalisation

Essai A Essai B Essai C Essai D

© studiovision

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DOSSIER THÉMATIQUE

De plus, plusieurs équipes ont mis au point l’extraction protéique à partir de tissus fi xés et inclus en paraf-fi ne (29-32), permettant ainsi d’utiliser les banques de tissus constitués depuis des décennies dans les centres anticancéreux. L’application de la RPPA à des fl uides (sérum, plasma) a également été développée (33-36), mais ne semble pouvoir être réalisée que pour des protéines relativement abondantes.Le délai entre l’excision du tissu et sa préservation, que ce soit par congélation ou par fi xation, est parti-culièrement important. En effet, les kinases et les phosphatases restent actives au sein du tissu après excision (37) et peuvent donc modifi er les taux de phosphorylation des protéines. Une augmentation de 20 % de la phosphorylation a été observée pour certaines protéines, notamment celles impliquées dans la signalisation du stress et de l’hypoxie, dans la demi-heure suivant l’excision (37). Si la préser-vation instantanée du tissu n’est pas possible pour des raisons cliniques, l’immersion dans un liquide contenant des inhibiteurs de phosphatases et de kinases a été proposée afi n de mieux conserver les taux de phosphorylation (37, 38).La translation de la RPPA vers des essais cliniques, de façon prospective, est actuellement en cours (39) et suscite un grand intérêt. La technologie associe en effet une faible consommation de matériel avec une reproductibilité et une sensibilité excellentes. Il s’agit d’essais portant sur les cancers du sein (dont les essais multicentriques I-SPY 1 et I-SPY 2), de la tête

et du cou, sur les lymphomes, sur les cancers colo-rectaux, de l’œsophage et de la vessie. Les premiers résultats cliniques de l’étude I-SPY 1 ont récemment été publiés (40), mais n’incluent pas encore de résul-tats obtenus par la RPPA. La prochaine étape décisive sera de déterminer la valeur ajoutée de la RPPA pour la prise de décision thérapeutique. La mise en place d’essais cliniques testant plusieurs traitements ciblés nécessite une stratifi cation des patients en fonction d’un large éventail de biomarqueurs dans chaque tumeur. C’est notamment dans ce cadre que la RPPA semble l’approche la plus prometteuse (fi gure 3).

Conclusions et perspectives

La RPPA n’en est probablement qu’au début de son développement mais suscite déjà un intérêt important en clinique. La multiplication des essais cliniques testant de nouveaux traitements ciblés nécessite des étapes de stratifi cation et de recherche de bio marqueurs pour lesquelles la RPPA est parfai-tement adaptée. Cet intérêt grandissant pour la RPPA, avec à la clé de nouveaux fi nancements, s’ac-compagnera d’avancées technologiques. Il s’agira d’augmenter le débit de la RPPA, en robotisant la manipulation des extraits protéiques, en augmentant le nombre d’échantillons déposés par lame et en améliorant le débit des révélations. La disponibi-lité d’anticorps commerciaux de qualité restera un

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Références bibliographiques

facteur limitant pour la RPPA ; néanmoins, l’offre s’améliore et se diversifi e, avec notamment le déve-loppement de bons anticorps monoclonaux produits chez le lapin. Avec un débit plus important et une plus grande quantité d’anticorps utilisables en RPPA, la technologie deviendra de plus en plus performante et intéressante pour une utilisation en clinique.Un autre challenge sera la mondialisation de la technologie, avec une standardisation des

méthodo logies à travers les différentes plateformes mondiales et un partage des listes d’anticorps testés. La création d’une banque de données en libre accès, où seraient systématiquement déposées toutes les données RPPA au moment de leur publication, telle qu’il en existe déjà pour les données transcrip-tomiques, permettra de comparer les différentes plateformes et d’exploiter au mieux ces données précieuses. ■

Objectif oncologie

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Rédacteur en chef : Pr Jean-François Morère

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r Thomomasas APAAPARICRICIO, DrPr RRenéé A MMMA ADAMMDAM PP, Pr TOncologie digestive

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Références bibliographiques (suite de la p. 314)