LES LYMPHOCYTES T RI GULATEURS PROTI GENT CONTRE LE Dt VELOPPEMENT DE LATHt:ROSCLEROSE

Hafid Ait-Oufetla a, Alain Tedgui a, Ziad Mallat a,*

1. R61e pathog~ne des lymphocytes T CD4 + dans I'ath6roscl6rose

D epuis une vingtaine d'annees, de nombreux travaux realises chez I'animal et chez I'homme ont confirme que I'atherosclerose est une

maladie inflammatoire chronique des gros vaisseaux tocalisee au niveau de I'espace sous-intimal [17]. Au meme titre que les autres maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatdl'de ou encore la mala- die de Crohn, elle fait intervenir des acteurs cellulaires comme les mono- cytes/macrophages, des mediateurs chemo-attractants comme les chi- miokines et des cytokines [35]. Le r61e des monocytes/macrophages est fondamental dans le developpement de la plaque comme I'ont mon- tre plusieurs travaux utilisant des souris genetiquement modifiees : I'invalidation du gene codant pour MCP1 (une chimiokine) [15] ou la deletion du gene codant pour le M-CSF [38], un facteur de croissance indispensable & la proliferation et/ou la maturation des monocytes cir- culants en macrophages, empechent le developpement de I'athero- sclerose. Ces cellules infiammatoires ont un rele dans le developpement de la plaque mais aussi dans sa vulnerabilite. Cette conclusion resulte de travaux anatomopathologiques realises notamment par I'equipe de Virmani qui a compare la composition des plaques coronaires rompues par rapport a. celle de plaques stables, prelevees sur des cadavres humains. Elle a montre que les plaques rompues, responsables d'eve- nements ischemiques, sont caracterisees par une infiltration conside- rable de cellules inflammatoires et une diminution d'elements stabilisants comme les cellules musculaires lisses et le collagene [43].

II a fallu attendre quelques annees pour montrer que les lymphocytes T CD4 + ont aussi un rele pathogene dans cette maladie vasculaire. Tout d'abord, ils sont presents dans les plaques, surtout au stade pr6- coce ou ils representent 10 & 20 % de la population cellulaire totale. Ensuite, ils sont actives car ils se trouvent frequemment co-localises en immunohistochimie avec le CMH de classe I1. Chez la souris sen- sible & I'atherosclerose, I'absence de lymphocytes T et B, obtenue en croisant des animaux deficients pour I'apolipoproteine E (apoE v-) et des souris SCID-/-, induit une diminution de 90 0/o de la taille des

a Centre de recherche cardiovasculaire Inserm Lariboisiere (unite 689) Hepital Lariboisiere 41, bd de la Chapelle 75475 Paris cedexl 0

* Correspondance mallat@larib.inserm.fr

© 2006 - Elsevier Masson SAS - Tous droits reserves.

lesions au niveau du sinus aortique. De plus, la reconstitution de la population lymphocytaire, par injection intraveineuse de lymphocytes CD4 +, augmente considerablement les plaques aussi bien au niveau de la crosse de I'aorte que du sinus aortique [10, 48].

2. R61e pathogene des lymphocytes T CD4 + de type Thl clans ratheroscl6rose

Les lymphocytes T impliques clans I'atherosclerose sont essentielle- ment de type Thl c'est-&-dire qu'ils produisent de grandes quantites d'interferon gamma (IFNy) et d'lL2 contrairement aux lymphocytes T de type Th2 qui produisent de I'lL4, IL5 et de I'lL10. L'lFNyest retrouve en immunohistochimie dans les plaques d'atherosclerose darts les memes regions que les cellules T. Le transfert in vivo de lymphocytes T CD4 +, realise dans le travail de Zhou precedemment decrit, s'ac- compagne d'une augmentation considerable des taux plasmatique et splenique d'lFNy [48]. In vivo, Gupta a confirme son r61e pro-athe- rogene en montrant que I'inactivation du recepteur de I'IFNy reduit de 60 0/0 les lesions aortiques [16] tout en induisant un phenotype lesion- nel stable. L'effet pro-atherogene de cette cytokine passe par de nom- breuses voies: activation des macrophages et des cellules endo- theliales, inhibition de la proliferation des cellules musculaires lisses et inhibition de la production de collagene [18, 46].

De nombreuses etudes ont montre que des cytokines ou des facteurs de transcription nucleaire impliques dans I'activation et/ou la diffe- rentiation des ceflules Thl participent aussi a la progression de I'athe- rome. La differenciation des lymphocytes T necessite leur interaction avec des cellules dendritiques, qui sont des cellules presentatrices d'antigenes [3]. L'IL12 produite par les cellules dendritiques joue un r61e dans la differenciation Thl des lymphocytes CD4 + puisque la sou- ris deficiente en ILl 2 n'est plus capable d'induire une reponse de type Thl [24]. D'ailleurs, la deficience en ILl 2 chez des souris sensibles & I'atherosclerose (apoE-/-(13)/IL12 -/-) s'accompagne d'une diminution des lesions arterielles [11].

ILl 8 est aussi une cytokine proatherogene qui stimule la production lymphocytaire d'interferon y. Uinjection d'lL1 8 recombinante chez la souris s'accompagne d'une augmentation de la taille des plaques d'atherosclerose avec une augmentation de la production systemique d'lFNy [47]. L'injection d'lL1 8 n'a plus effet chez la souris deficiente en IFNy. Dans le laboratoire, nous avons montre que le blocage in vivo de I'lL1 8 par son inhibiteur physiologique I' lL18BP (Binding Protein) permet une diminution de la taille des lesions chez la souris tout en induisant un phenotype lesionnel stable [28]. De plus, I'lL1 8 est expri- mee dans les plaques atherosclereuses humaines et son taux au sein des lesions vasculaires (evalue en PCR quantitative) est plus impor- tant chez les patients symptomatiques (AIT ou AVC) que chez les patients asymptomatiques [27]. A I'etage coronaire, il a ete montre sur

Supplement au N ° 389, Revue Francophone des Laboratoires, f6vrier 2007 23

49 es Journ6es de biologie clinique

une cohorte de plus de 1 000 patients que le taux d'lL18 plasmatique est, chez les coronariens, un facteur pronostique d'evenements car- diovasculaires [7].

Les cellules dendritiques apportent aussi des signaux de co-stimula- tion, comme le CD40 Ligand, qui orientent les cellules T vers un phe- notype Thl . Cette molecule est retrouvee dans la plaque d'athero- sclerose, sa d6ficience s'accompagne d'une diminution de la taille des plaques d'atherosclerose chez I'animal [23]. Ces resultats trouvent un echo chez I'homme puisqu'il a ete montre que le taux plasmatique de CD40L est un marqueur pronostique d'evenements cardiovasculaires :hez ies coronariens [20].

3. R01e protecteur ou pathogene des lymphocytes CD4 + de type Th2

L'orientation lymphocytaire Th2 est guidee par des cytokines comme I'lL6, I'lL4 et certains types de cellules dendritiques. L'IL4 active des facteurs transcriptionnels (GATA3) qui favorisent la production d'lL5 et qui diminuent la production d'IFN 7 [39]. La vole Th2 constitue donc un syst~me de contre-regulation physiologique de la vole Thl pro-athe- rogene et pourrait 6tre anti-atherogene. Un certain nombre d'expe- riences chez I'animal, en particulier celles explorant le systeme humo- ral, ont conforte I'hypothese que la reponse humorale Th2-dependante pouvait 6tre atheroprotectrice. Une deviation de la reponse vers un type Th2 dans des modeles experimentaux d'atherosclerose s'accompagne d'une diminution de la taille des lesions avec une augmentation de la production d'anticorps anti-LDL oxyde. Ces anticorps sont produits par des cellules B1 qui sont sous le contr61e de I'lL5 [5, 6]. De plus, la surexpression de I'lL10 s'accompagne de la production d'anticorps de type IgG1, dependants de la vole Th2, et induit une diminution des plaques d'atherosclerose [32].

Cependant, d'autres donnees plus recentes suggerent que la reponse Th2 peut 6tre pro-atherogene. In vitro, il a ete montre que I'lL4 induit I'expression dans les cellules endotheliales de genes pro-inflammatoires impliques dans la formation de la plaque. UIL4 active le gene codant pour VCAM-1, une molecule d'adhesion leucocytaire, ou encore le gene codant pour MCP1, une chimiokine importante pour le recru- tement des monocytes. In vivo, la transplantation de moelle deficiente en IL4 chez la souris sensible & I'atherosclerose ou encore la deficience g(~netique realis6e en croisant des animaux apoE -/- et IL4 -/ induit une diminution de la taille des plaques au niveau de plusieurs sites arte- riels [11,21 ]. Chez I'homme, des etudes epidemiologiques ont mon- tr6 que les patients asthmatiques, qui ont un profil inflammatoire de type Th2, ont un risque accru de developper des plaques d'athero- sclerose [22].

Des Iors la theorie attractive qui opposait Thl et Th2 comme le Yin et le Yang dans I'atherogenese est probablement simpliste et fausse. II existe au cours de la formation de la plaque une dysfonction lym- phocytaire T, avec des lymphocytes de type Thl et/ou Th2, plus ou moins pathogenes et nous avons emis I'hypothese que, dans le contexte de I'atherosclerose, la dysfonction lymphocytaire Test liee f~ un defaut de regulation par des cellules T regulatrices qui contr6- !ont leur action en amont [25, 41].

4. Tolerance immunitaire et cellules T regulatrices

L'efficacite du systeme immunitaire adaptatif repose sur la capacite & gen6~er un grand hombre de recepteurs capables de reconnaitre de fs~on sp~cifique une multitude d'antigenes. Cependant, le risque est

la reconnaissance d'antigenes du sol et I'induction d'une auto-agres- sion appelee auto-immunit& Dans le thymus, la deletion clonale des lymphocytes T dont le recepteur TCR possede une trop grande affi- nite pour son antigene reduit ce risque. Un autre mecanisme de regu- lation, identifie plus recemment, implique la generation de lymphocytes T appeles regulateurs (Treg), capable d'inhiber I'activite des lympho- cytes T pathogenes qu'il soit de type Thl ou Th2. Plusieurs etudes ont montre le rele cle des Treg darts le maintien de I'homeostasie immu- nitaire et dans la protection contre les maladies immuno-inflammatoires [36, 44]. La majorite des Treg sont CD4 +, ils sont produits dans le thy- mus puis gagnent la peripherie. Leur orientation vers un profil Treg necessite d'une part I'interaction entre le TCR et le couple antigene- CMH II et d'autre part I'interaction entre le 0D28 sur le lymphocyte T et le CD80/86 sur la cellule presentatrice d'antigene. Ces elements permettent I'expression de FOXP-3 un facteur transcriptionnel spe- cifique de la lignee regulatrice [13]. Chez la souris, la depletion en Treg naturels, par thymectomie neonatale, s'accompagne d'un syndrome poly-auto-immun. Chez I'homme, le syndrome lie & I'X caracterise par une polyendocrinopathie et surtout une maladie immuno-inflammatoire severe est de & un deficit genetique en FOXP-3 [4]. Le couple CD28/CD80-CD86 est crucial pour le developpement et le maintien de la population Treg, & tel point que la souris deficiente en CD28 ou en CD80/86 a une diminution de plus de 80 o/0 des Treg et developpe plus facilement des maladies auto-immunes comme le diabete (sur fond genetique NOD) [37].

5. IL l0 et le TGFI3 sont importants pour la fonction et la g6n6ration de Treg

Deux cytokines immunosuppressives, I'interleukine 10 (ILl 0) et le trans- forming growth factor I~ (TFGI3), sont impliquees dans I'orientation des cellules T vers un phenotype regulateur via les cellules dendritiques [9, 14]. En effet, la culture in vitro de cellules dendritiques en presence d'lL10 leur confere un profil tolerogenique puisqu'elles produisent des cytokines immunosuppressives et orientent, in vitro et in vivo, les cel- lules T vers un profil regulateur (Trl) capable de guerir des maladies immuno-inflammatoires. De plus, Iorsque des cellules dendritiques pha- gocytent des debris apoptotiques, elles produisent de I'lL10 et du TGF~ et participent & la generation de Treg. [_'administration d'anti- genes & faibles doses, connue pour proteger contre les maladies inflammatoires, induit des lymphocytes Treg producteurs d' lL10 (Trl) si I'antigene est delivre par vole nasale ou des Treg agissant via le TGFI3 (Th3) si I'antigene est delivre par vole orale dans I'alimentation [2, 8].

IL l0 et le TGF~, en plus de leurs r61es dans la generation de Treg, sont des mediateurs utilises par cette population pour inhiber les lymphocytes T pathogenes. D'autres mecanismes comme le CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigene 4) ont ete rapportes [44].

De fagon interessante, les Treg specifiques d'un antigene induisent une reponse suppressive dite ,, bystander ,> qui correspond & I'inhibition des T pathogenes presents dans leur environnement proche. Les mecanismes en cause sont soit la desactivation de cellules presen- tatrices d'antigene soit la production de cytokines suppressives [45]. Cette propriete fait des Treg des candidats attractifs dans le traitement de maladies immuno-inflammatoires comme I'atherosclerose oQ il n'existe pas un mais plusieurs antigenes impliques dans I'initiation et la progression de la maladie.

,)~ Supplement au N ° 389, Revue Francophone des Laboratoires, fevrier 2007

6. L'IL10 et TGFI3 sont des modulateurs potentiels de I'ath(~roscl(~rose

L'IL10 est presente dans les plaques d'atherosclerose humaines [31] et son expression locale est inversement correlee & I'inflammation et la mort cellulaire. Autrement dit, les plaques riches en ILl 0 sent carac- terisees par une moindre accumulation de cellules infiammatoires et de cellules apoptotiques. Les souris invalidees pour le gene de I'lL10, mises sous regime riche en matieres grasses, developpent plus de plaques d'atherosclerose que les souris contreles et ces lesions sent caracterisees par une infiltration plus importante de cellules inflam- matoires comme les lymphocytes T [26, 33]. Dans un modele d'an- gioplastie au ballonnet ou d'implantation de stent chez le lapin hyper- cholesterolemique, I'administration d' lL10 recombinante reduit I'infiltration parietale de macrophages et diminue I'hyperplasie intimale [12]. Ces resultats ont une relevance clinique puisqu'il a ete montre que le taux plasmatique d'lL10 est significativement plus faible chez les patients admis en syndrome coronarien aigu que chez les coro- nariens stables. Sur une cohorte plus importante de patients, il a ete montre que I'association d'un taux plasmatique eleve de CRP et un taux bas d'lL10 est un marqueur de mauvais pronostic chez les patients admis pour anger instable [19]. D'autre part, les patients dent les leu- cocytes circulants manifestent une plus faible capacite de production d' l l l 0, en reponse & une stimulation inflammatoire, ont un risque rela- tif plus important d'accident vasculaire cerebral et un risque cumula- tif de mortalite cerebro-vasculaire significativement plus eleve [42].

Le TGF~ possede des proprietes anti-inflammatoires puissantes sur les cellules vasculaires. L'invalidation du gene codant pour le TGFI}I chez la souris s'accompagne d'une maladie inflammatoire multifocale atteignant notamment le cceur et les poumons. II existe une plus forte adhesion des leucocytes b. I'endothelium des veines pulmonaires. L'expression endotheliale d'ICAM-1 et de VCAM-1, ainsi que I'infiltration macrophagique, au niveau du sinus aortique, sent plus importantes chez les souris heterozygotes pour le gene du TGF~I (TGFJ~I +/-) mises sous regime enrichi en cholesterol, par rapport aux animaux contreles soumis aux memes conditions experimentales [34]. Par ailleurs, I'inhibition in vivo de la vole du TGFI~ chez des souris apoE /- par administration d'anticorps bloquants accelere le develop- pement des plaques d'atherosclerose et surtout en modifie la com- position. Les lesions des souris traitees avec I'anticorps anti-TG F~ pre- sentent un phenotype plus instable avec une infiltration de cellules inflammatoires et une diminution des composants stabilisants comme le collagene et les cellules musculaires lisses [30].

[_'ensemble de ces resultats provenant de travaux chez I'animal et chez Fhomme suggerent que ces deux cytokines ont un rele protecteur dans la progression et la stabilisation de la plaque d'atherosclerose [40].

7. Lymphocytes Treg et ath~roscl6rose

Puisque I'lL10 et le TGF~ sent deux molecules protectrices dans le developpement de I'atherosclerose et qu'elles sent necessaires au fonctionnement des T regulateurs, nous avons emis I'hypothese que les Treg pouvaient moduler la reponse immuno-inflammatoire du pro- cessus atherosclereux.

Dans le laboratoire, nous avons utilise plusieurs approches pour eva- luer le rele des Treg. Tout d'aberd, dans un travail publie en 2003 dans Circulation, nous avons apporte la preuve de concept que les lym- phocytes Treg de type Trl (producteurs d'lL10) modulent I'inflammation in vivo et limitent la progression de la maladie vasculaire [29]. Pour se faire, nous avons genere m vitro des cellules Trl specifiques d'un seul antigene, I'ovalbumine, puis nous les avons injectes a des souris sen- sibles & I'atherosclerose (apoEV). Nous avons montre que I'injection

de ces Trl, uniquement en presence de leur antigene, induit une sup- pression de la reponse inflammatoire Thl et Th2 et s'accompagne d'une augmentation considerable de la production d'lL10 par les lym- phocytes T spleniques. Sur le plan vasculaire, le co-transfert de Treg et leur antigene specifique s'accompagne d'une reduction de la taille des plaques au niveau du sinus aortique et d'une modification de la composition des lesions, moins riches en cellules inflammatoires. Ces resultats montrent donc que les Trl peuvent moduler la reponse inflam- matoire sans agir sur un antigene specifique de la plaque d'atherome, probablement par un mecanisme ,, bystander ,,, c'est-a.-dire que les cel- lules Trl, en reponse & une stimulation specifique (ici I'ovalbumine), produisent dans leur environnement de I'ILf 0 qui agit sur les cellules T pathogenes. Le risque de cette action non ciblee centre un antigene donne est d'induire une immunosuppression systemique potentielle- ment dangereuse.

Recemment, nous nous sommes penches sur I'etude du r61e poten- tiel dans I'atherosclerose des Treg naturels endogenes qui expriment le CD25 en grande quantite aleur surface (CD4+CD25high+) et le fac- teur de transcription FOXP3 au niveau nucleaire [1 ].

Des souris doublement transgeniques a la fois sensibles a I'athero- sclerose (apoE / ) et depourvues de lymphocytes T et B (RAG2 v) ont ete traitees par une injection intraveineuse de splenocytes provenant soit de souris contr61es soit de souris CD28 -/-, caracterisees par un deficit majeur en Treg. Un dernier groupe a regu dans le meme temps des splenocytes de souris CD28/- associes a des lymphocytes Treg purifies afin de reconstituer un pool physiologique de Treg. Nous avons montre que I'injection de splenocytes deficients en Treg s'accompagne d'une augmentation de la taille des lesions d'atherosclerose au niveau aortique. Le co-transfert de Treg previent I'acceleration de la maladie et stabilise la plaque avec moins de macrophages, de lymphocytes dans les lesions mais plus de collagene. Chez ces animaux, nous avons montre que les cellules injectees survivent apres 6 semaines et qu'elles recolonisent les organes lymphdJ'des. D'ailleurs le co-transfert de Treg, qui conserve leur fonction regulatrice in vivo, induit une deviation de la reponse inflammatoire vers un profil anti-infiammatoire avec une aug- mentation systemique de la production d'lL10 et une diminution de la production d'IFN 7.

En utilisant une autre approche, nous avons evalue I'effet de la deple- tion en Treg sur des animaux immunocompetents. L'injection d'anticorps depletant anti-CD25 chez la souris apoE -/ induit une acceleration de I'atherosclerose avec des plaques plus riches en cellules inflammatoires. Pour confirmer que I'effet des Treg est medie par le TGF~, comme I'attestent plusieurs travaux in vitro, nous avons renouvele la depletion en Treg chez des animaux dent les cellules sent insensibles au TGF~. La depletion de la population T regulatrice naturelle (-75 O/o) n'a aucun effet ni sur la taille ni sur la composition des plaques d'atherosclerose.

8. Perspectives diagnostiques et thdrapeutiques

Nous avons identifie une nouvelle population lymphocytaire qui regule I'activite des lymphocytes T pathogenes Thl et/ou Th2 et qui protege centre le developpement de la plaque et sa destabilisation [41 ]. Chez I'homme, nous examinons actuellement la population Treg circulante afin d'evaluer si le taux sanguin peut constituer un marqueur pronos- tique d'evenements cardiovasculaires chez les patients coronariens.

Dans une approche therapeutique, il serait interessant d'expandre in vivo cette population. La complexite surajoutee consiste a deve- lopper des Treg specifiques d'antigenes de plaque pour avoir une action ciblee et diminuer les effets secondaires systemiques lie a une eventuelle immunosuppression. Plusieurs projets sur ce sujet sent actuellement en cours dans le laboratoire.

Supplement au N ~ 389, Revue Francophone des Laborato;res. fevrier 2007 25

49 es Journ6es de biologie clinique

er l [u rupa[ r l y~ ^-i InKurJ 8yIlOI-UIf]8 ~1 r e , A/i,~i E-~LISUU u y

mutations of FOXP3. Nat. Genet. 27(1) (2001) 20-21.

[5] Binder C.J,, Hartvigsen K., Chang M.K. et al., IL-5 links adaptive and natural immunity specific for epitopes of oxidized LDL and protects from atherosclerosis, J. Olin. Invest. 114(3) (2004) 427-43"7.

[6] Binder CJ., Shaw P.X., Chang M.K. et al., The role of natural antibodies in atherogenesis J. Lipid Res 46('7) (2005) 1353-1363.

106(1) (2002) 24-30.

[8] Chen Y., Kuchroo V.K., Inobe J., Hailer D.A., Weiner H.L., Regulatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune ence- phaomyelitis. Science 265(5176) (1994) 123'7- 1240.

[9] Cottrez E, Hurst S.D. Coffman R.L., Groux H., T regulatory cels 1 inhibit a Th2-specific response in vivo, J. Immunot. 165(9) (2000) 4848-4853.

[1 (3] Daugherty A., Pure E, DelfeI-Butteiger D. st el., The effects of total lymphocyte deficiency on the extent of atheroscierosis in al:~olipoprotein E-I-mice, J. Olin. Invest. 100(6) (199"7) 1575-1580.

20] Heeschen C., Dimmeler S., Hamm C.W. et al., [36] Sakaguchi S., Sakaguchi N., Regulatory T cells o uble CD40 ligand in acute coronary syndromes, in immunologic serf-tolerance and autoimmune

N. EngL J. Med. 348(12) (2003) 1104-1111. disease, Int. Rev. Immanol. 24(3-4) (2005) 211-226.

[21] King V.L., Szilvassy S J,, Daugherty A., [37] Salomon B., Lenschow D.J., Rhee L. et el., Interieukin-4 deficiency decreases atherosclerotic B?tCD28 costimulatien is essential for the homeo- lesion formation in a site-specific manner in female stasis of the CD4+CD25÷ immunoreguletory T cells LDL receptor4*mice, Arterlescler. Thromb. Vasc. Biol. that control auto mmune diabetes, Immun ty 12(4) 22(3) (2002) 456-461. (2000) 431-440.

[22] Knoflach M. Kiechl S. Mayr A, Wilieit J. Pcewe [38] Sm th J D Trot,an E Ginsbern M Gr naux C W., Wick G., A lergtc rh mtm., asthma, and athero s- Tian 3., Miyate M., Decreased atheroscierosis in m ce cierosm m the B~neck an d ARMY studies, Arch. deficiem in both macrophage colony-stimulating fac- Intern. Med. 165(21) (2005) 2521-2526. tor (oo) and aooliooorotein E. Proc. Natl. Acad. Sci.

fen-

14.

., de Craen AJ.,

[13] Doc cell

E-knoc- [46] Warne 2-1237. interferon ir

1 08~

[15]

~(3)

26 Supplement au N ° 389, Revue Francophone des Laboratoires, fevrier 2007