Les facteurs de virulence des bactéries à tropisme

intestinal

JM SCHEFTELVendredi 4 mars 2011Master Physio-Pathologie Cellulaire et Moléculaire

différents types de syndromes gastro-intestinaux infectieux

Gastro-entérite aiguë

Diarrhées hydriques: cholériformes

Diarrhées dysentériques: dysentériformes

Diarrhées hémorragiques, ulcéro-hémorragiques

Les bactéries à tropisme intestinal engendrent

Bactéries à tropisme intestinal, responsablesde syndromes digestifs: exemples

Salmonella typhimuriumShigella dysenteriaeYersinia enterocoltica Escherichia coli (pathovars)Vibrio choleraeCampylobacter jejuniAeromonas hydophilaClostridium difficileStaphylococcus aureus

Les différents types de diarrhées infectieuses

mettent en jeu des mécanismes physio-pathologiques spécifiques basés sur l’ implication de facteurs de virulence selon des stratégies de mieux en mieux connues.

Facteurs de virulence

Facteurs d’adhésion, facteurs de colonisation Facteurs d’invasionProduction d’entérotoxines cytotoniques ou cytotoxiques

Escherichia coli : exemple type

Entérobactérie commensale habituelle du côlon, prédominanteau sein de la flore aérobie-anaérobie facultative de l’intestin

Mais certaines souches (pathovars ou pathotypes) sont de véritables pathogènes intestinaux en provoquant différents types de syndromes gastro-intestinaux.

Les différents pathovars d’ E.coli

From Bacterial Pathogenesis1994

Les EPEC : 1ères souches d’E.coli identifiées comme agent de diarrhées responsables de troubles intestinaux graves chez les jeunes enfants enfants de moins d’un an. Diarrhée néo-natale (important taux de décès dans les pays en voie de développement )

Virulence: Présence de facteurs d’adhésionPrésence de facteurs d’attachement-

effacementAbsence de facteurs entérotoxiques

Les souches EPEC

Modèle de virulence pour le pouvoir d’adhésion

les formes d’attachement de la bactérie à l’entérocyte

piédestal

bactérie

lumière intestinale

Travaux de Ilan Rosenshine Ann de l’Institut Pasteur, actualités (1997) 8,2,157-161

Liaison initiale : due à des pili qui forment des faisceauxBFP: bundle- forming pilifimbriae de type IVBFP provoque agrégation des EPEC et la formation de micro-colonies à la surface de la cellulehôte. Les bactéries attachées par BFP se trouvent à une distance de100 nm à 300 nm de la membrane de la cellule hôte. Ce contact avec l’entérocyte déclenche chez EPEC l’expression del’ îlot de pathogénicité (locus d’effacement des entérocytes)

Liaison initiale

TIR

ex Hp 90

Liaison intime : produite par uneprotéine de la membrane externe, l’intimine.La distance entre la membrane externeet la cellule hôte est de 10 nmL’ intimine induit la formation d’une protéine par le système TSSS (typeIII secretion system) qui est insérée dans la membrane :Translocated intiminreceptor (TIR) (ex Hp 90)

Esps: EPEC secreted proteinsEspA, EspB, EspD engagées dans leprocessus d’attachement-effacement

Liaison intime

TIRex Hp90

La signalisation intracellulaire

Phosphorylation de la tyrosine de TIRActivation de la phospholipase CGénération d’un flux Inositol PIP3 provoque un flux de Ca2+Activation de LCM kinase: phosphorylation de LCM.

Polymérisation de l’actineet phosphorylation de la myosine

formation d’un piédestal

TIR

ex Hp 90

Polymérisation de l’actine

Piédestal à l’origine de la formation des lésions A/E de la bordure en brosse.

Les gènes nécessaires à ces processussont regroupés dans le locus d’effacement des entérocytes (LEE)C’est un îlot de pathogénicité de 35 kbcontenant les gènes d’un systèmesecréteur de type III et de protéines effectrices transportées dans la cellule

Piédestal et EPEC

Travaux de J Cleary et al

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adhesion to intestinal Epithelial cells: role of bundle-forming pili (BFP), EspA filaments and intimin

Microbiology 150 ,2004, 527-538

Protocoles expérimentaux (E.coli) Travaux de Cleary et coll (2004)

Souches Génotype PhénotypebfpA espA eae cellules intestinales Caco-2

adhésionE2348/69 + + + 100

UMD 880 + - - 110

UMD 886 - + - 8

UMD 883 - - + 0

UMD 888 - - - 0

La souche sauvage E.coli 2348/69 adhère rapidement (< 10 min) à la bordure en brosse des cellules Caco-2 et forme des micro-colonies et des lésions typiquesA/E.La souche double mutante UMD880 (bfpA+, espA-,eae-) adhère aussi rapidement

La souche UMD886 (bfpA-, espA+,eae-) adhère plus tardivement (> 1h) et moins efficacement.

La microscopie confocale indique que l’adhésion est médiée par BFP et EspALa souche UMD883 (bfpA-, espA-,eae+) , incapable d’effectuer la translocationde TIR , n’adhère pas.

La souche UMD 888 triple mutante (bfpA-, espA-,eae-) est incapable d’adhérer

Microscope confocal à balayage laser

Principe du microscope confocal

Cellules Caco-2 normalesMicroscopie confocale: a:vue horizontale et b: vue verticalecoloration de l’actine (vert: fluorescéine)c:Microscopie électronique à balayage

Cellules Caco-2 infectées par la souche sauvage E.coli E2348/69a: 10 min : bactéries (rouges) adhérentes à la bordure en brosse (BB:vert)b: bactéries expriment BFP (rouge), EspA (vert), intimine (vert)c: BFP (vert) induit l’attachement initial à BB(rouge) et agrégation bactérie-bactérie (bleue)d et e: après 3 h : micro-colonies (bactéries liées par BFP)f: après 6 h (A/E lésions) h : SEM: A/E lésions (scanning electron micrograph)

Microscopie confocale : a , b, c, e, f SEM : dSouche E.coli UMD 88O bfpA +, espA-, eae- (a) : adhésion en 10 min (b et c) : fibrilles de BFP adhérents à BB

SEM: fibrilles BFP adhérents aux microvillosités

e et f : micro-colonies

Microscopie confocale: (a) : cellules Caco-2 infectées par souche E.coli UMD 886(bfpA -

espA+ eae -)3h: quelques bactéries (rouge) adhérentes à la bordure en brosse

(vert) (b): adhésion x10 après lavage modéré(c et d) visualisation des filaments EspA (vert) impliqués dans

l’adhésion.

Microscopie confocale: a, b et c Co-infection: A: souche E.coli UMD 883 bfpA-, espA-, eae+ et B : E.coli bfpA+, espA+, eae- Seule souche A colorée : adhésion 3h (accrétion d’actine en vert et bactérie en rouge)

Pouvoir pathogène des EPEC

Capacité d’absorption réduite due à la perte des micro-villosités

Stimulation de la sécrétion de chlorures

Perméabilité accrue de l’épithélium

Diarrhées dysentériques dues à Shigella spp

Facteurs de virulence: Facteurs invasifsFacteurs de dissémination intracellulaireAssocié à production d’entérotoxines

Modèle de pouvoir invasif

Les shigelles pénètrent par les cellules M des plaques de Peyer

Facteurs de virulence: codés par le plasmide de virulence de 220 kb sécrétés par l’intermédiaire du système de sécrétion de type

III Ipa A, Ipa B, Ipa C, Ipa D : invasines

Fait intervenir des changements au niveau des des composants du cytosquelette de la celluleau niveau de l’actine conduisant à la formation d’extensions cellulaires et de ridesExtrusion de la membrane soutenue par des filaments d’actine entourant la bactérieLa bactérie est captée, enveloppée, engloutie en 5-10 min. Il y a activation de GTP ases de type Rho, de la vinculine, recrutement de protéines d’adhésion (ezrine, paxilline,) pour former un complexe d’adhésion focalisé (rôle de Ipa D).Mécanisme de macropynocytose.La bactérie est internalisée dans une vacuole, le phagosome. Lyse de la membrane du phagosome (rôle de Ipa B et Ipa C)

Description du processus d’invasion

Dissémination de la bactérie à l’aide des filaments d’actine la propulsant dans le cytosolvers les cellules adjacentes. Rôles de IcsA, de cadhérineIcsA induit la polymérisation de filaments d’actine, à l’un des pôles de la bactérie.Ceci propulse la bactérie à l’intérieur du cytoplasmedans la direction opposée à cette queue en croissanceLa queue reste stationnaire dans le cytoplasme.C’est le dépôt continu d’actine sur cette queuequi fait se déplacer la bactérie.

La bactérie « mobile »  peut pénétrer dans une cellule adjacente en formant une poche dans la membrane.

Description du processus de dissémination

Accès de Shigella à la membranebaso-latérale des entérocytes du côlon?

la localisation de Shigella sur lamuqueuse apicale stimule la migrationdes PNN ou macrophages sur la face basale.La rupture des jonctions intercellulaires qui s’ensuit permet auxbactéries de traverser cet espace et d’accéder à la face baso-latérale.Endocytose par la face BL augmentant le potentiel invasif de shigella

Facteur de virulence: entérotoxine cytotoxique

Type de la diarrhée dysentérique

Toxines de Shiga, toxines shiga-like (EIEC)Vérotoxines (EHEC): VT1 , shiga-like toxin (SLT 1)

VT2 : 60% identité avec VT1 (SLT 2) Toxine de Shiga: protéine multimérique de 70 kDa composée d’unesous-unité (su) A catalytique de 32 kDa et de 5 su B de 7,7 kDaLes su B se fixent sur un récepteur de nature glycolipidique : globotriaosyl céramide (Gb3)sous unité A est internalisée par endocytoseUn phagolysosome se forme dans lequel les enzymes lysosomiaux clivent A en A1La su A1 inhibe la synthèse protéique en inactivant la su 60 S du ribosome par arrêt de la fixation TRNA-AA induisant l’arrêt de l’élongation des protéines d’où un effet cytoxique

Facteur de virulence: entérotoxine cytotonique

Type de la diarrhée hydrique

Toxine thermolabile d’E.coli ou

Toxine cholérique de Vibrio cholerae

Protéines multimériques de 84 kDa1 su A de 28 kDa catalytique constituée de 2 su A1 et A2 liées par un pont di-S5 su B de 11,5 kDa de fixationMode d’action: su B se fixent à un ganglioside (GM1) présent sur la membrane des entérocytesChangement conformationnel de la toxine - création d’un canal hydrophile

Conclusions

Les bactéries pathogènes à tropisme intestinal développentdes stratégies basées sur des capacités d’adhésion, de colonisationd’invasion d’élaboration de facteurs entérotoxiques

Ces facteurs de virulence sont à l’origine des manifestations digestives observées dans chaque type de pathologie.