lectures 2-6 pharm biotech 2019 - users.auth.grusers.auth.gr/pchristo/teaching/lectures 2-6_pharm...

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΧρήστοςΠαναγιωτίδης,Ph.D.ΚαθηγητήςΚυτταρικής/ΜοριακήςΒιολογίαςΕργαστήριοΦαρμακολογίας, ΤομέαςΦαρμακογνωσίας/ΦαρμακολογίαςΤμήμαΦαρμακευτικής, ΣχολήΕπιστημώνΥγείας,ΑριστοτέλειοΠανεπιστήμιοΘεσσαλονίκης

Φαρμακευτική BιοτεχνολογίαΔIAΛEΞΕΙΣ 2-6(7, 10, 14 & 17/10/2019)

EIΣAΓΩΓH ΣΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ

ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA & ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ DNAΚΑΙ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNΑ ΣΕ

ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΧΟΥΣ


Σύγχρονη Βιοτεχνολογία και Γενετική Μηχανική

α) Η σύγχρονη Βιοτεχνολογία ξεκίνησε σχεδόν παράλληλα με την ανάπτυξη των τεχνολογιών γενετικής μηχανικής που επέτρεψαν την απομόνωση, τροποποίηση, εισαγωγή και έκφραση τμημάτων γενετικού υλικού.

β) Τα «εργαλεία» που έχει αναπτύξει η γενετική μηχανική μας επιτρέπουν:

•Να ταυτοποιούμε το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος•Να κόβουμε την αλληλουχία του DNA που περιέχει αυτήν την αλληλουχία του γονιδίου •Να κλωνοποιούμε το γονίδια αυτό σε έναν κατάλληλο φορέα, π.χ. πλασμίδιο ή βακτηριοφάγο•Να προσδιορίζουμε την αλληλουχία του γενετικού υλικού•Να χρησιμοποιούμε τους φορείς αυτούς για να μεταφέρουμε το γονίδιο του ενδιαφέροντος σε άλλους οργανισμούς, όπως το βακτήριο Escherichia coli ή και σε κύτταρα θηλαστικών που αναπτύσσονται σε κυτταροκαλλιέργειες κλπ.•Να επάγουμε (διεγείρουμε) τα κύτταρα αυτά για να ενεργοποιήσουμε την έκφραση του γονιδίου και την παραγωγή της της πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος.•Να εκχυλίσουμε και να καθαρίσουμε την πρωτεΐνη για θεραπευτική χρήση.


Μπορούμε να κόψουμε το DNA σε μικρότερα «κομμάτια» σε καθορισμένες πάντα θέσεις με

ακρίβεια και επαναληψιμότητα;


DNA μπορεί να απομονωθεί είτε από κύτταρα ή από ιστούς προκειμένου να μελετηθεί

• ΠΡΟΣΟΧΗ:

Το DNA είναι ένα ΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο (ακόμη και το DNA των σχετικά μικρών βακτηριακών γονιδιωμάτων είναι αρκετά μεγάλο) που είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στη μηχανική καταπόνηση, δηλαδή μπορεί πολύ εύκολα να «σπάσει» σε μικρότερα θραύσματα κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών χειρισμών.

ΕΠΟΜΕΝΩΣ

üΤο «κόψιμο» του DNA σε μικρότερα θεραύσματα μπορεί να βελτιώσει τη μηχανική του σταθερότητα και να απλοποιήσει το χειρισμό του


Πως μπορούμε να «κόψουμε» το DNA σε μικρότερα θραύσματα;

ME TH XPHΣH EIΔIKΩN ENZYMΩN

✍YΠAPXOYN ΠPOΫΠOΘEΣEIΣ;

✔NAI, TA ENZYMA AYTA ΘA ΠPEΠEI NA ΔIAΣΠOYN TO DNA ΠANTA ΣTIΣ IΔIEΣ AΛΛHΛOYXIEΣ OI OΠOIEΣ EINAI EK TΩN

ΠPOTEPΩN ΓNΩΣTEΣ


Τι είναι οι ενδονουκλεάσες περιορισμού;

Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριμένες παλινδρομικές

αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις ίδιες προκαθορισμένες θεσεις.

Θα δείξουμε μερικά παραδείγματα στις επόμενες δύο διαφάνειες


Εργαλεία στην Φαρμακευτικη Βιοτεχνολογία – Γενετική Μηχανική

Ενδονουκλεάσες περιορισμού:

•Αυτά τα ένζυμα προέρχονται από βακτήρια όπου χρησιμοποιούνται ως μηχανισμός άμυνας ενάντια στους ιούς (βακτηριοφάγους) που τα προσβάλλουν, αποικοδομώντας το DNA των εισβολέων. Υπάρχουν εκατοντάδες τέτοιες ενδονουκλεάσες περιορισμού που τις χρησιμοποιούμε σαν μοριακά ψαλίδια για να κόψουμε το DNA σε συγκεκριμένες θέσεις και να απομονώσουμε τα γονίδιαDNA λιγάση:

•Το ένζυμο αυτό χρησιμοποιείται φυσιολογικά στην αντιγραφή αλλά και στην επιδιόρθωση «σπασμένου» DNA. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για την ενσωμάτωση νέων γονιδίων στο DNA.Πλασμίδια και κοσμίδια:

•Είναι κυκλικά DNA. Μπορούν να διαμορφωθούν για να μεταφέρουν τα γονίδια του ενδιαφέροντος ή ανασυνδυασμένο DNA. Βακτηριοφάγοι (ή φάγοι):

•Είναι ιοί που μολύνουν τα βακτήρια. Οι βακτηριοφάγοι μπορούν να διαμορφωθούν για να μεταφέρουν τα γονίδια του ενδιαφέροντος ή ανασυνδυασμένο DNA.


Τέσσερις “δημοφιλείς” ενδονουκλεάσεςπεριορισμού


Πέψη DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού παράγει είτε λεία είτε κολλώδη άκρα


Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού προέρχονται από βακτήρια


Από που προέρχονται οι ενδονουκλεάσεςπεριορισμού;

✔Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού απομονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός

μηχανισμού άμυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από μόλυνση

με κάποιον βακτηριοφάγο.

✄Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισμού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τις παράγει;


Χημικές τροποποιήσεις του DNA των βακτηρίων που παράγουν ενδονουκλεάσες

περιορισμού το προστατεύουν από ενδονουλεολυτική πέψη από αυτές

ΜεθυλιωμένοDNA

Μη μεθυλιωμένοDNA

Η EcoRI δε μπορεί να διασπάσει το μεθυλιωμένο DNA

Μη μεθυλιωμένοDNA

Διάσπαση του DNA

«κολλώδη» άκρα

Ενδονουκλεάση περιορισμούEcoRI

EcoRIμεθυλάση

Ενδονουκλεάση περιορισμούEcoRI


ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΚΟΠΗ ΤΙ;

Πως αναλύεται και πως χρησιμοποιείται το DNA μετά την πέψη του με ενδονουκλεάσες

περιορισμού;


Hλεκτροφορητική ανάλυση του DNA

κοντό θραύσμα

μεσαίου-μεγέθους θραύσμα

κοπή με ενδονουκλεάση

περιορισμού





DNA

Μεγαλύτερο μέγεθος

μικρότερο μέγεθος

Δίκλωνο πλασμιδιακό DNA

Πέψη με EcoRI Πέψη με HindIII

Αρχή

Τέλος

Εμφάνιση φιλμ

εμφανισμένο αυτοραδιογράφημαφύλλο φωτογραφικού

χαρτιού

πηκτή αγαρόζηςζε

ύγη

νουκ

λεοτ

ιδίω

ν(Χ

1000

)

201086

2

+

-


Η σημασία του μάρτυρα μεγέθους θραύσματος DNA στην ηλεκτροφόρηση


Τα στάδια της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης σε πηκτές αγαρόζης


Χειρισμός της πηκτής αγαρόζης μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης


Ηλεκτροφορητικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται και για τον προσδιορισμό

της αλληλουχίας του DNA


Χάρτες περιορισμού γονιδίων και γονιδιωμάτων

Χάρτες περιορισμού των DNA του φάγου λ και του αδενοϊού. Υποδεικνύονται οι θέσεις κοπήςτων ενζύμων BamHI, EcoRI και HindIII πάνω στα γονιδιωματικά DNA του βακτηριοφάγου λ (48,5kb) και του ανθρώπινου αδενοϊού 2 (35,9 kb).


Διαδικασία αλληλούχισης DNA με τη μέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση

διδεοξυνουκλεοτιδίων

Διδεοξυαδενοσίνη (ddATP)


Aλληλούχιση DNA με τη μέθοδο του Sanger


Αυτοματοποιημένος προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA


Η πρώτη αλληλούχιση πλήρους γονιδιώματοςεπιτεύχθηκε το 1995 για το DNA του

βακτηρίου Haemophilus influenza

Σταθμοί στην αλληλούχιση γονιδιωμάτων1996: Πρώτη αλληλούχιση γονιδιώματος ευκαρυωτικού οργανισμού (ζυμομύκητας –

Saccharomyces cerevisiae)1997: Ολοκλήρωση της αλληλούχισης του γονιδιώματος της Escherichia coli1998: Πρώτη αλληλούχιση γονιδιώματος πολυκύτταρου ευκαρυώτη (Caenorhabditis elegans)2000: Aλληλούχιση γονιδιωμάτων Drosophila melanogaster & Arabidopsis thaliana2004: Πλήρης αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος


Η γνώση της αλληλουχίας των βάσεων του DNA επιτρέπει την κοπή του σε θέσεις που είναι εκ των προτέρων

γνωστές, κυρίως όμως:


Η γνώση της αλληλουχίας των βάσεων του DNA επιτρέπει τον προσδιορισμό των

περιοχών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες

πλαίσια ανάγνωσης




DNA

DNA

Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της πάνω αλυσίδας του DNA

Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της πάνω αλυσίδας του DNA

Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της κάτω αλυσίδας του DNA

Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της κάτω αλυσίδας του DNA


Και μετά την κοπή του DNA ποια είναι τα επόμενα στάδια;

Τι μπορούμε να κάνουμε με τα θραύσματα του DNA;


KΛΩNOΠOIHΣHH «αρχειοθέτηση» του DNA στο

εργαστήριο


Τι είναι οι φορείς κλωνοποίησης;


Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης


Πλασμίδια: Οι πιο κοινοί φορείς κλωνοποίησης

Ανασυνδυασμένο DNA

Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007


H διαδικασία της κλωνοποίησης

ΚΟΠΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

θραύσμα DNA που θα κλωνοποιηθεί

ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗ ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ DNAΛΙΓΑΣΗ

δίκλωνο κυκλικό πλασμιδιακό DNA

ανασυνδυασμένο DNA


Τα βήματα της διαδικασίας κλωνοποίησης


Πολλαπλασιασμός των αντιγράφων ενός γονιδίου με κλωνοποίηση

βακτηριακόκύτταρο καλλιέργεια για τον

πολλαπλασιασμό των βακτηριακών κυττάρων

Μετά από λύση των βακτηριακών κυττάρων απομονώνονται μεγάλες ποσότητες DNA

Το ανασυνδυασμένοπλασμιδιακό DNA εισάγεται στο βακτηριακό κύτταρο


Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA - 1


Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA - 2


Aπαραίτητες ιδιότητες ενός πλασμιδιακούφορέα κλωνοποίησης

1. Aλληλουχίες έναρξης αντιγραφής (ORI)2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή (π.χ.

αντίσταση σε αντιβιοτικό)3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές

ενδονουκλεάσες περιορισμού (polylinker)4. ( Υποκινητής που επιτρέπει ρυθμιζόμενη

έκφραση)


1) Ωστόσο,δεν διαφοροποιεί αποικίες που περιέχουν ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ φορείς από αυτές που περιέχουν «άδειους» φορείς.

2)Υπάρχουν τρόποι να επιλέξουμε τις αποικίες που περιέχουν ανασυνδυασμένους φορείς;

Η ύπαρξη γονιδίου αντίστασης σε αντιβιοτικό μας επιτρέπει να επιλέξουμε τα κύτταρα τα οποία έχουν προσλάβει πλασμιδιακό DNA


Διάκριση μπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισμό ανασυνδυασμένων φορέων


Eντοπισμός ανασυνδυασμένων φορέων με βάση την έκφραση ενός γονιδίου θανάτου

Nsi I*

Hind

III

Asp7

18 I

Kpn

IEcl1

36 II

Sac I

Bam

H I

Spe

IEcoR

IPst I

EcoR

VNo

t IXho

INsi I*

Xba

IDra

IIApa

IBstB

I

pZErO™-2.13.3 kb

Stu IPlaclacZα ccdB

f1 ori

Apo I†

BspH I

SnaB I

Comments for pZErO™-2.1 3297 nucleotides

Lac Promoter/Operator Region: bases 95-216M13 Reverse Priming Site: bases 205-221LacZα ORF: bases 217-558Sp6 Priming Site: bases 239-256Multiple Cloning Site: bases 269-381M13 (-20) Forward Priming Site: bases 415-430M13 (-40) Forward Priming Site: bases 434-450Fusion Joint: bases 559-567ccdB Lethal Gene ORF: bases 568-870f1 origin: bases 895-1307Kanamycin Resistance ORF: bases 2116-1322ColE1 origin: bases 2502-3175

ColE1Kanamycin

Afl III

* The two Nsi I sites in theMCS are the only sites inthe vector.

† There are two tandemApo I sites at thislocation. Apo I alsorecognizes the EcoR Isite.

Sp6

A-160319

The sequence of pZErO™-2.1 has been compiled from information in sequence databases, publishedsequences, and other sources. This vector has not been completely sequenced. If you suspect an error in thesequence, please contact Invitrogen's Technical Services Department.


Bιβλιοθήκες DNA μπορούν να κατασκευασθούν και σε βακτηριοφάγους

λυτική οδόςλυτική οδόςσχηματισμός προφάγου (λυσιγονία)

βακτηριακό κύτταρο

βακτηριακό χρωμόσωμα

βακτηριφάγοςλάμδα

το DNA του φάγουκυκλοποιείται

πρόσδεση του φάγου στον ξενιστή και «ένεση» του ιικού DNA

σύνθεση των ιικώνπρωτεϊνών που

χρειάζονται για το σχηματισμό νέων ιών

Ταχεία αντιγραφή του DNA του λ φάγου και

πακετάρισμα σε πλήρεις ιούς

λύση του κυττάρου και απελευθέρωση

μεγάλων ποσοτήτων νέων ιών

βήμα ενεργοποίησης

Ενσωμάτωση του DNAτου λ φάγου στο χρωμόσωμα του

ξενιστή

κυτταρική διαίρεση

το ενσωματωμένο DNA του λ φάγουαντιγράφεται μαζί με το χρωμόσωμα του ξενιστή


Τα κοσμίδια είναι πλασμιδιακοί φορείς κλωνοποίησης που περιέχουν μία ή δύο

θέσεις �cos�. (Η θέση cos είναι μία αλληλουχία περίπου 200bp που προέρχεται από τον φάγο λ και η οποία είναι απαραίτητη για το «πακετάρισμα» του DNA σε

σωματίδια φάγου).

Πως κλωνοποιούμε το DNA σε ένα κοσμίδιο;1. Χρησιμοποιούμε τη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (polylinker) για να ενθέσουμε

θραύσματα DNA που έχουν δημιουργηθεί με πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού.

2. Το DNA πακετάρεται σε φάγους, ακριβώς όπως και το DNA του ίδιου του φάγου.3. Τα κοσμίδια πολλαπλασιάζονται μέσα στα βακτηριακά κύτταρα όπως και τα

πλασμίδια (δηλ. φέρουν γονίδια που προσδίδουν στα κύτταρα αντίσταση σε αντιβιοτικό).

4. Τα κοσμίδια απομονώνονται ακριβώς όπως και τα πλασμίδια.

Το πλεονέκτημα τους είναι ότι μπορούν να «πακετάρουν» μέσα στην «κεφαλή» του φάγου μεγαλύτερα σε μέγεθος θραύσματα DNA (40-55 kb of DNA, δηλ. σε κοσμίδια μεγέθους ~5 kb μπορούμε να εισάγουμε ενθέματα 33-50 kb).

Kοσμίδια


• Το κοσμίδιο «κόβεται» με την ενδονουκλεάση BglII σε θέση κοντά στη θέση cos .• Το γενωμικό DNA«κόβεται» με την ενδονουκλεάση Sau3A (μερική υδρόλυση) , που δημιουργεί

συμβατά «κολλώδη» άκρα με την BglII. Τα θραύσματα τα κατεργαζόμαστε με αλκαλική φωσφατάση (ΓΙΑΤΙ;)

• Το DNA δότης συνδέεται με το DNA δέκτη (κοσμίδιο) με την DNA λιγάση δημιουργώντας εν σειρά συνδέσεις . Το DNA καθαρίζεται με βάση το μέγεθος.

• Το DNA «πακετάρεται» σε φάγους.

Kλωνοποίηση σε κοσμίδια - Παράδειγμα


Το DNA των κοσμιδίων «πακετάρεται» σε γραμμική μορφή

Θραύσμα προς κλωνοποίηση (35-55bp, κομμένο με BamHI)

Προσθήκη λιγάσης και ATP


Κοσμίδια - ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ


Έκφραση κλωνοποιημένων γονιδίων σε βακτήρια


Προσανατολισμένη κλωνοποίηση του δίκλωνου cDNA σε πλασμιδιακό φορέα


Κατασκευές βιβλιοθηκών γενετικού υλικού με κλωνοποίηση πολύπλοκων μιγμάτων

θραυσμάτων DNA & cDNA1) Τι είναι οι γενωμικές βιβλιοθήκες που κατασκευάζονται με κλωνοποίηση θραυσμάτων DNA& και τι είναι οι cDNA βιβλιοθήκες που κατασκευάζονται με κλωνοποίηση cDNA (δηλαδή συμπληρωματικού DNA που έχει κατασκευασθεί με χρήση μήτρας mRNA).

2) Ομοιότητες/διαφορές γενωμικών και cDNA βιβλιοθηκών και χρησιμότητα τους στη Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία ως πηγών γενετικού υλικού για τον προγραμματισμό της έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών.


Γενωμικές & cDNA Bιβλιοθήκεςχρωμοσωμικό DNA

γονίδιο Α γονίδιο Βγονίδιο Β γονίδιο Α

εξόνιο ιντρόνιο μη-μεταγραφόμενο DNA

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ

ΠΕΨΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ DNA

ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ & ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ DNA

ΣΥΡΡΑΦΗ(ΜΑΤΙΣΜΑ)

ΤΟΥ RNA

mRNAs

RNA μετάγραφα

θραύσματα DNA

γενωμικοί κλώνοι DNA σε γενωμική βιβλιοθήκη cDNA κλώνοι σε βιβλιοθήκη cDNA


Κατασκευή γενωμικών βιβλιοθηκών

DNA ανθρώπουΠΕΨΗ ΜΕ

ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΤΑ ΘΡΑΥΣΜΑΤΑ ΤΟΥ DNAΕΝΣΩΜΑΤΩΝΟΝΤΑΙ ΣΕ

ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ

εκατομύρια θραύσματα γενωμικού DNA

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ

ανασυνδυασμένα μόρια DNA

γενωμική βιβλιοθήκη


Κατασκευή βιβλιοθηκών cDNA


Διαδικασία παρασκευής cDNA

ιστός, π.χ. εγκέφαλος

λύση των κυττάρων και απομόνωση

mRNA

mRNA

υβριδισμός με εκκινητή polydT

mRNAκατασκευή αντιγράφου DNA με

χρήση αντίστροφης μεταγραφάσης

κατεργασία με άλκαλι για να αποικοδομηθεί το RNA

Το 3’ άκρο του cDNA σχηματίζει

θηλειά

σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA με DNA-πολυμεράση, η θηλειά του

3’ άκρου δρα ως εκκινητής

δίκλωνο cDNA αντίγραφο του αρχικού mRNA

κατεργασία με νουκλεάση που αποικοδομεί μονόκλωνο DNA για να

αποικοδομηθεί η θηλειά


Σύνθεση cDNA & προσανατολισμένη κλωνοποίηση δίκλωνου cDNA σε φορείς


Μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε βιβλιοθήκες γενετικού υλικού για να

κλωνοποιήσουμε γονίδια με σκοπό την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών;

1) Ποιες είναι οι ιδιότητες των γενωμικών ή cDNA βιβλιοθηκών που τις κάνουν περισσότερο ή λιγότερο κατάλληλες στη Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία σαν πηγές γενετικού υλικού για τον προγραμματισμό της έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών;

2) Έχουμε άλλους τρόπους για να κλωνοποιούμε και να εκφράζουμε γονίδια; Ποια είναι η χρησιμότητα και οι χρήσεις της PCR;


TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO YΛIKO

ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ IKANEΣ ΠPOΣ

ANAΛYΣH;

ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ

ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)


PCR – Η ενίσχυση του DNA in vitro


Η σημασία της θερμικής σταθερότητας της DNA πολυμεράσης στη διαδικασία της PCR

Πολυμεράση 3’->5’ εξωνουκλεάση

Πηγή και ιδιότητες

Taq όχι Προέρχεται από το Thermus aquaticus. Οχρόνος ημιζωής της στους 95˚C είναι 1,6 ώρες

Pfu ναι Προέρχεται από το Pyrococcus furiosus.Ο χρόνος ημιζωής της στους 95˚C είναι περίπου 6 ώρες

Vent ναι Προέρχεται από το Thermococcus litoralis (είναι γνωστή και ως Tliπολυμεράση). Ο χρόνος ημιζωής της στους 95˚C είναι περίπου 7 ώρες


Ο κύκλος της τεχνικής PCR


Πολλαπλασιασμός του DNA με PCR


Εκθετική αύξηση του DNA κατά την PCR


H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNAκύτταρα

απομόνωση RNAαπομόνωση DNA

DNA που θα κλωνοποιηθεί

mRNA που θα κλωνοποιηθεί

Αποδιάταξη DNA/ προσθήκη εκκινητών

Ενίσχυση με PCRΕνίσχυση με PCRΕνίσχυση με PCR

Αποδιάταξη αλυσίδων & προσθήκη 2ου εκκινητή

Προσθήκη 1ου εκκινητή, αντίστροφης μεταγραφάσης

και νουκλεοτιδίων

Ενίσχυση με PCR

γενωμικοί

κλώνοιcDNA

κλώνοι


Οι θερμοσταθερές πολυμεράσες κάνουν λάθη Τι σημαίνει αυτό στην κλωνοποίηση

προϊόντων PCRΠολυμεράση 3’->5’

εξωνουκλεάσηΠηγή και ιδιότητες Συχνότητα λαθών

Taq ΟΧΙ Προέρχεται από το Thermusaquaticus. Ο χρόνος ημιζωήςτης στους 95˚C είναι 1,6 ώρες

Περίπου 3 X 10-4 λάθη ανά ζεύγος βάσεων

Pfu ΝΑΙ Προέρχεται από το Pyrococcus furiosus.Ο χρόνος ημιζωής της στους 95˚C είναι περίπου 6 ώρες

Κάνει τα λιγότερα λάθη σε σχέση με τις άλλες

θερμοσταθερές DNA

πολυμεράσες,

περίπου 1,5 X 10-6 λάθη ανά ζεύγος βάσεων

Vent ΝΑΙ Προέρχεται από το Thermococcus litoralis. Οχρόνος ημιζωής της στους 95˚C είναι περίπου 7 ώρες

Περίπου 3 X 10-6 λάθη ανά ζεύγος βάσεων


Οι θερμοσταθερές πολυμεράσες κάνουν λάθη Γιατί είναι απαραίτητη η αλληλούχιση του

DNA μετά από κλωνοποίηση προϊόντων PCR

Πηγή : New England Biolabs (https://international.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr)

https://international.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr


Πέρα από τη σημασία της στην κλωνοποίηση γονιδίων η PCR έχει πολλές άλλες εφαρμογές

στη Μοριακή Βιολογία και Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία


Μοριακή διαγνωστική με PCR


Μοριακή διαγνωστική με PCR στην ιατροδικαστική

ηλεκτροφορητική ανάλυσηεκκινητέςPCR

ομόλογα χρωμοσώματα

πατρικό

μητρικό

Επαναλλαμβανόμενεςαλληλουχίες σε θέση VNTR

άτομο A άτομο B άτομο C άτομο F

αριθ

μός ε

πανα

λήψ

εων

Ηλεκ

τροφ

όρησ

η

3 ζε

ύγη

ομόλ

ογω

ν χρ

ωμο

σωμά

των

Ηλεκ

τροφ

όρησ

η

VNTR: Variable Number Tandem Repeat(Μεταβλητός αριθμόςιαδοχικών επαναλήψεων)


Aνίχνευση HIV με RT-PCR

δείγμα αίματος από μολυσμένο

άτομο

ελάχιστα ιοσωμάτια HIV στον ορό του μολυσμένου ατόμου

Απομάκρυνση των κυττάρων με

φυγοκέντρηση

Εκχύλιση του ιικού RNA

γονιδιώματος

Αντίστροφη μεταγραφή/ενίσχυση με

PCR

Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή

αίμα μη μολυσμένου ατόμου

χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας


Xρήση RT-PCR με πολλαπλούς εκκινητές στη μοριακή διαγνωστική μιάς ιογενούς νόσου


Χρήση της PCR πραγματικού χρόνου για ποσοτικές μετρήσεις γενετικού υλικού


Ποσοτική ανίχνευση ρετροϊών με PCR πραγματικού χρόνου


Μοριακοί φάροι στην PCR πραγματικού χρόνου


Πολύπλοκες γενετικές κατασκευές μπορούν να γίνουν με διαδοχικές κλωνοποιήσεις

θραυσμάτων DNA πλασμιδιακός φορέας

πρώτο ένθεμα

δεύτερο ένθεμα

τρίτο ένθεμα


Yβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων

μίγμα μονόκλωνων μορίων DNA

υβριδισμός σε 50% φορμαμίδιοστους 42˚C

υβριδισμός σε 50% φορμαμίδιο στους 35˚C

ο υβριδισμός δεν είναι ακριβής

υβριδισμός σε 50% φορμαμίδιο στους 35˚C

μονόκλωνοι DNA ανιχνευτές για το γονίδιο Α

μόνο το Α σχηματίζει σταθερή διπλή έλικα

τα Α, C και Eσχηματίζουν σταθερές διπλές έλικες


Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς Kλώνους με Yβριδισμό


Σάρωση βιβλιοθήκης ανασυνδυασμένου DNA με υβριδισμό νουκλεϊνικών οξέων


ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN

ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN

DNA (πριν την κλωνοποίηση ή και μετά);


Στύπωμα κατά Southern μετά από ανάλυση DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα


Aνίχνευση της μετάλλαξης που προκαλεί δρεπανοκυτταρική αναιμία με υβριδισμό

νουκλεϊνικών οξέων

πρωτεΐνη

φυσιολογική β-σφαιρίνη

φυσιολογική πρωτεΐνη

μεταλλαγμένη πρωτεΐνη

παθολογική β-σφαιρίνημετάλλαξη

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

ανιχνευτής φυσιολογικού γονιδίου

ανιχνευτής μεταλλαγμένου γονιδίου

άτομα άτομα• Το άτομο 1 έχει δύο

φυσιολογικά γονίδια β-σφαιρίνης

• Το άτομο 2 έχει δύο μεταλλαγμένα γονίδια β-σφαιρίνης

• Το άτομο 3 έχει ένα φυσιολογικό και ένα μεταλλαγμένο γονίδιο β-σφαιρίνης


Χρήση υβριδισμού νουκλεϊνικών οξέων για τον προσδιορισμό της τοπολογίας των

γονιδίων στα χρωμοσώματα


Kατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεσηπλασμιδιακός φορέας

συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο/ εκκινητής που φέρει την

επιθυμητή μετάλλαξη

αποδιάταξηαλυσίδων DNA

κλωνοποιημένο φυσιολογικό γονίδιο

Ολοκλήρωση της σύνθεσης με χρήση DNA πολυμεράσης και

DNA λιγάσης

Εισαγωγή σε κύτταραΑντιγραφή και απομόνωση στα

θυγατρικά κύτταρα

μεταγραφή μεταγραφή

μετάφραση μετάφραση

τα μισά κύτταρα παράγουν φυσιολογική πρωτεΐνη

τα μισά κύτταρα παράγουν μεταλλαγμένη πρωτεΐνη που φέρει

αλλαγή σε ένα αμινοξύ


Eισαγωγή KατευθυνόμενωνTροποποιήσεων στο Γενετικό Yλικό

Φυσιολογικό

γονίδιο Χ

Μόνο το μεταλλαγμένο γονίδιο εκφράζεται

Προσθήκη

γονιδίου

Απαλειφή

γονιδίου

Αντικατάσταση

γονιδίου

Δεν υπάρχει κανένα ενεργό γονίδιο

Εκφράζεται και το φυσιολογικό και το μεταλλαγμένο γονίδιο


Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικώνθηλυκό ποντίκι

τροποποιημένο γονίδιο με μεθόδους γενετικής μηχανικής

ES κύτταρα στα οποία ένα από τα δύο αντίγραφα του γονιδίου

έχει αντικατασταθεί με την μεταλλαγμένη μορφή

εισαγωγή τροποποιημένου γονιδίου στα κύτταρα

τα κύτταρα σχηματίζουν

αποικίες

Απομονωμένο πρώιμο έμβρυο

ζευγάρωμα και αναμονή για 3 μέρες

Ένεση κυττάρων ES στο πρώιμο

έμβρυο

πρώιμο έμβρυο που σχηματίσθηκε

μερικώς και από κύτταρα ES

εισαγωγή εμβρύου σε ψευδο-εγκύους

ποντικούς

αναζήτηση σπάνιων αποικιών που περιέχουν το

τροποποιημένο γονίδιο

Διαγονιδιακός ποντικός με γαμετικά κύτταρα τα οποία περιέχουν και τροποιημένα

αντίγραφα του γονιδίου-στόχου

ελέγχεται η παρουσία του τροποποιημένου γονιδίου σε σωματικά κύτταρα απογόνων και

οι θετικοί απόγονοι διασταυρώνονται

Γέννηση


Εξειδικευμένη γονιδιακή τροποποίηση με το σύστημα CRISP/Cas9


Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας

lectures 2-6 pharm biotech 2019 - users.auth.grusers.auth.gr/pchristo/teaching/lectures 2-6_pharm...

Documents