le facteur de croissance épidermique: structure, localisation, phosphorylation et régulation de...

BIOCHIMIE, 1984, 66, 515-530

Le facteur de croissance 6pidermique • structure, localisation, phosphorylation et r6gulation de son r6cepteur*.

Ren6 S t - A R N A U D , J ean -Guy CHABOT, Georges PELLETIER, Fernand LABRIE et Peter WALKER.

Unitd de recherche en biologie du ddveloppement et le Centre de recherche en endocrinologie moldculaire, Le Centre Hospitalier de l'Universitd Laval, Ste-Foy, Qudbec, GIV 4G2.

(Refue le 27-4-1984. accept6e apr~s r~vision le 19-9-1984).

R6sum6 - - Afin d'exercer ses nombreux effets dans ses diffdrents tissus-cibles, le facteur de croissance dpidermique (epidermal growth factor; EGF) doit d'abord se lier ~ un rdcepteur membranaire spdcifique. Le niveau de ces rdcepteurs est influencd par certaines hormones, des promoteurs de tumeurs, la transformation virale et par des facteurs de croissance, dont I'EGF lui-m6me. Plusieurs techniques ont permis d'dlucider la structure du rdcepteur, une glycoprotdine transmembranaire de Mr 170 K. Suite ~t la liaison du peptide ~ son rdcepteur, ce dernier s'autophosphoryle de fa¢on spdcifique sur les tyrosines. La cindtique, les substrats et la rdgulation de cette activitd kinasique associde au r6cepteur EGF ont dt6 dtudids.

Au niveau cellulaire, la liaison de l'EGF gt son rdcepteur provoque l'aggrdgation des complexes EGF-rdcepteur et l'internalisation de ces complexes. Les vdsicules endocytiques ainsi

sont ddgradds. Le calcium est ndcessaire au processus d'internalisation du rdcepteur, alors que le cytosquelette ne semble pas intervenir. Cette internalisation des complexes EGF-rdcepteur est responsable de la rdgulation ndgative (down-regulation) du niveau des rdcepteurs EGF induite par le peptide lui-m6me.

Mots-cl6s : EGF / r~cepteurs / phosphorylation / kinase / r6ceptosome / internalisation.

Summary - - Epidermal growth factor (EGF) is a Mr 6045 polypeptide first characterized for its ability to stimulate mitogenesis in epidermal and epithelial cells. The first step in the action o f the growth factor is its binding to specific, high affinity membrane receptors. These receptors have been studied in a number o f tissues and cell culture lines.

The level o f EGF receptors is modulated by man), agents. EGF down-regulates its receptor. In addition, the number o f EGF receptors is decreased by other growth factors (platelet-derived growth factor; transforming growth factor), by many tumor promoters and by viral transformation. Several hormones also can regulate EGF binding in its target tissues.

P Walker, Chercheur-hoursier du Fonds de la recherche eta Sam( du Quebec. R. St-Arnaud, Boursier du Fonds de la recherche ol Sant~ du Quebec. J..G. Chabot. Boursier du Conseil m~dical de recherche du Canada. * Ces travaux sont suhventionn~s par le Conseil m~dical de recherche du Canada.

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Considerable insight has been gained in our understanding of the mechanism of aclion of the peptide by purij:ving the receptor and investigating the biochemical signals initiated by the binding of the peptide to its receptor. The receptor is a transmembrane glycoprotein of Mr 170 K bearing striking homology with the transforming protein of avian erythroblastosis virus (AEV). The locus encoding the human EGF receptor is on chromosome 7. Following binding of the peptide to its receptor, phosphorvlation of the receptor molecule tyrosine residues is rapidly enhanced. Purification of the kinase activity has revealed that the receptor itself is the kinase; the kinetics of the reaction have been characterized. In addition to autophosphorylation of the receptor, binding of the EGF to the EGF-receptor kinase stimulates the phosphorylation of a protein of Mr 34 K in A431 cells and of various other exogenous substrates including antibodies directed against the transforming protein of Rous sarcoma virus, pp60'*'. Tire phosphorylating activity is inhibited by the down-regulation of the EGF receptors and may be modulated by a calcium-dependent endogenous protease.

Binding of the peptide to its receptor initiates a series of events leading to the degradation of tire ligand-receptor complexes in the lysosomes. First, the EGF-receptor complexes aggregate in clusters and are internalized. The clustering and internalization processes have been studied by a variety of techniques including electron microscopy and immunofluorescence. The clustering step has been observed both in clathrin-coated pits and ia uncoated vesicles. Following internalization, the endoo, totic vesicles (receptosomes) are concentrated in the Golgi apparatus prior to their transfer to the lysosomes, in the iysosomes, both the ligand and the receptor are degraded. While lysosomotropic amines inhibit the degraaation process, there remains a controversy regarding the effects of those amines on the binding and internalization steps. Calcium is required for internalization of the ligand-receptor complexes while the cytoskeleton and microtubules do not seem to be involved. The internalization of the EGF-receptor complexes is responsible for the observed downregulation of EGF receptor level~ induced by the g~'owth factor itself.

Key-words : EGF / receptors / tyrosine phosphorylation / kinase / down regulation / internalization.

L'isolement ~ partir de la glande sous-maxillaire de la souris d 'un peptide pouvant acc616rer,

yeux, l 'apparition des dents et la kOratinisation de ia peau [1] est d 'un grand int6r~t pour la biologie du d~veloppement. Cette prot~ine se nomme le facteur de croissance 6pidermique (epidermal growth factor; EGF). Bien que plusieurs travaux traitent des effets biologiques de cette prot6ine [I, 2] ainsi que des facteurs modulant la synthOse de I 'EGF au niveau de la glande sous-maxillaire de la souris adulte [I-3], il existe tr~s peu de documents qui ont 6tudi6 ces questions fonda- mentales chez l 'animal immature. I1 est bien connu que les hormones thyroidiennes exercent un rBle modulateur important sur la biosynth~se de I 'EGF dans la glande sous-maxillaire" l 'hypoth~se avanc6e est que certains des effets biologiques des hormones thyro'fdiennes pendant la maturation peuvent 8tre m~di6s par I 'EGF [3]. De concert avec les travaux physiologiques sur I'EGIT, plusieurs laboratoires ont aeuvr6 sur le signal transmis :~ la cellule-cible suite ~ l'interaction de i 'EGF avec son r~cepteur. Le but de ce document est de r6viser la litt~rature sur le r~cepteur EGF, sa structure, sa localisation et sa

physiologie afin de permettre une meilleure com- pr6hension des 6v6nements amenant ~ la crois- ~,~i~ ~t -~ la . . . . . . . . . . . . . . . . de . . . . t i l l 1 ~ l - e l l ~ l i : l l t l O l l 1 organlsme.

1. D i s t r i b u t i o n

La premiere 6tape conduisant ultimement aux diff6rentes actions biologiques de I 'EGF dans ses tissus-cibles est sa liaison h un r6cepteur membranaire sp6cifique [4]. La pr6sence de ces r6- cepteurs a 6t6 mise en 6vidence de faqon indi- recte, en d6terminant ia stimulation de la croissance cellulaire [5] ou la stimulation de I'incorporation de thymidine triti~e dans le DNA [6], mais aussi en mesurant directement la liaison de I 'EGF marqu6 ~ I'iode radioactif (~-~51-EGF) [7].

Par i 'une ou I'autre de ces m6thodes, des r6cepteurs pour i 'EGF ont 6t6 mis en 6vidence dans de nombreux tissus chez plusieurs esp~ces, incluant I'homme. La distribution tissulaire du r6cepteur EGF est importante : cellules 6pidermi- ques [I,5,8-12], fibroblastes [5-7,13-21], foie [I, 1 I, 22-27], reins [19, 26, 28-30], ovaires [26, 31-37], testicules [38], prostate [39], ut6rus [40],

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placenta [11, 41-43], glande mammaire [14, 44-48], os [49-511, poumons [52], de m6me oue de nombreuses autres lignSes cellulaires normales [1, 7, 9, 18, 40, 53-72] ou canc6reuses [14, 19, 43, 53, 68, 73-88]. La lign~e cellulaire ayant g6n6r6 le plus de travaux sur le r6cepteur EGF est sans doute la lign6e A431 issue d'un carcinome 6pidermoide humain. Origineilement mises en culture en 1973 [89], les cellules A431 poss~dent environ 2,5 x 10 ~ sites r6cepteurs pour I 'EGF par cellule [19,901, une concentration 20 fois sup~rieure /t celle ob- serv6e dans les autres tissus.

La localisation et la distribution du r6cepteur EGF ont 6t6 6galement identifiSes par des techniques qui permettent une visualisation directe en microscopie optique ou en microscopie 61ectroni- que. Suite /~ une injection intrap6riton6ale du ~3~I-EGF, une captation du ligand sup6rieure /l celle mesur6e dans le sang a 6t6 enregistr6e au niveau de l'6piderme et de la corn6e [54]. Toute- fois, la sp6cificit6 de la captation n'a pas 6t6 d6montr6e. Etant donn6 que la pr6sence de r6cepteurs sp6cifiques /~ I 'EGF a 6tb. montr6e au niveau de divers tissus de i'embry~n de souris, lors d'incubations in vitro [91, 92], Adamson et aL [93] ont mis en 6vidence une captation sp6cifique de I 'EGF au niveau de plusieurs tissus d'em- bryons de souris ayant requ une injection du L'51-EGF. R6cemment, une captation sp6cifique de I 'EGF a 6t6 observ6e au niveau du foie de rat adulte [94, 95]. Par autoradiographie en micros- r,r~r~i~ c m d ¢ l~c h,~patney~e~ pr~.~entaient un • ~ , ~ , i J i ~ . , ~ . , ~ . ~ 1 ~ . . ~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

marquage sp6cifique avec un gradient d6croissant de marquage entre I'espace-porte et la veine centrolobulaire [94-96]. 11 y a 6gale,,~ent une captation sp6cifique du ~2-~I-EGF au niveau de I'hypophyse, du petit intestin, du foie, du pan- cr6as, de la surr6nale et de I'ovaire et une captation non sp~cifique au niveau du cerveau, du cervelet et du poumon. Un marquage sp~cifique est visualis~ au niveau des types cellulaires sui- vants • cellules 6pith61iales absorbantes et calici- formes de I'intestin gr61e; ceilules du canal inter- calaire et de I'il6t de Langerhans du pancr6as; cellules de la capsule de la surr6nale" cellules de la m6dul|o-surr6nale" ceilules de la th~que interne du follicule et cellules lut6ales du corps jaune de i'ovaire; et cellules de l'ad~nohypophyse [96].

2. Modulation du niveau des r~cepteurs

L'EGF devant se lier fi son r6cepteur pour exercer ses effets, un des premiers paliers de contr61e de Faction de I 'EGF est la modulation

du nombre de sites r6cepteurs disponibles pour lier le peptide. Une des substances provoquant la diminution du nombre de r6cepteurs pour I'EGF est le facteur de croissance lui-m6me. Carpenter et Cohen [17] ont montr6 que Fincubation de fibroblastes humains en pr6sence d 'EGF provoque une diminution rapide de ta liaison du I-'5I-EGF se poursuivant plusieurs heures. Ce ph6nom6ne a par la suite 6t6 observ6 dans d'autres lign6es ceilulaires [34, 65, 73, 97], mais ne survient pas chez certaines cellules cultiv6es en milieu d6fini en absence de s6rum [98]. Les m6canismes responsables de cette r6gulation n~gative ("down regulation") seront d6taiil~s plus loin.

D'autres facteurs de croissance influencent la liaison de i 'EGF/l son r6cepteur. L'incubation de cellules 3T3 de souris avec le facteur de croissance d~riv6 de~ plaquettes (platelet-derived growth factor, PDGF) provoque une diminution de la liaison de I 'EGF sur ces cellules [99-101]. Cette r6gulation n6gative h6t6rologue, qui a aussi 6t6 observ6e dans des cellules d'ost6osarcomes humains [86], est amplifi6e par le chol6rag6ne [102] et d'autres substances provoquant l'accumulation d 'AMP cyclique (cAMP) intracellulaire [103]. Le PDGF semble agir en diminuant I'affi- nit6 du r~cepteur EGF pour son ligand [104, 105] et non en 6tant en comp6tition avec I 'EGF pour se lier au m6me r6cepteur [104] ou en provoquant l'internalisation simultan6e des deux r6cepteurs fllll'll l~,c lr~,ot,~,,r~ rl,- ,-'r,~;~cnnc'~ prndnil~ par de~ [ i v v j . i . . ~ o i u 1 . , L ~ . , , , . . . . . . . . . . . .

cellules canc~reuses (transforming growth factors, TGF) inhibent aussi la liaison de i 'EGF /t la surface de la cellule, soit par un m~canisme similaire/l celui rapport6 pour le PDGF [106], soit en se liant directement au m6me r6cepteur que i 'EGF [107-1091.

Le niveau des r6cepteurs EGF semble aussi influenc6 par diff6rentes hormones. Certains glucocorticoides augmentent la liaison de I 'EGF dans plusieurs types cellulaires d'origines diff6- rentes [110-1141. La vasopressine [115] et les agonistes I~-adr6nergiques [116] diminuent la liaison de I 'EGF fi son r6cepteur, alors que les gonadotropines LH (hCG) et FSH augmentent ia concentration des r6cepteurs EGF ovarien_ [37]. A des doses 61ev6es, les prostaglandines A inhibent la liaison de I 'EGF dans plusieurs lign6es cellulaires [117].

L'observation que I 'EGF agit de faqon syner- gique avec certains promoteurs de tumeurs comme Fester de phorbol 12-O-tetradecanoyl- phorbol-13-acetate (TPA) pour stimuler la syn-

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th~se de DNA dans des c~lb,les.. _. --.._ ,.,,it..,..,,,.,. . . . . [11o1,,,j a g6n6r6 plusieurs travaux sur l'influence du TPA et d'autres substances analogues sur la liaison de i 'EGF :i son r6cepteur. Ces promoteurs de tumeurs inhibent la liaison de I 'EGF [10, 69, 75, 82, 112, 119-134], probablement en diminuant l'affi- nit6 du r6cepteur pour son ligand [10, 69, 119, 123, 124, 128, 131, 133, 134]. Les analogues de la vitamine A, en particulier I'acide r6tinoique, qui pr6viennent la carcinog6n6se chimique chez plusieurs esp6ces animales, ont un effet oppos6 sur ie nombre de r6cepteurs EGF [4, 135, 136] et sont ainsi des antagonistes de I'effet des promoteurs de tumeurs sur le niveau des r6cepteurs EGF [131, 1371.

La transformation de cellules en culture par certains types de virus affecte aussi l'interaction entre I 'EGF et son rrcepteur. Todaro et de Larco [18, 29, 138] ont d6montr6 la perte de liaison de r E G F dans diffrrents types de cellules transfor- mres par des virus de sarcomes aviaires. Cette inhibition serait caus6e par un facteur de croissance diffrrent de rEGF, synth6tis6 par la cellule transform6e (sarcoma growth factor, SGF, ou TGF) et pouvant se lier au r6cepteur EGF [107-109, 139-144]. Paradoxalement, Guinivan et Ladda [145] ont rapport6 la synthrse d 'un facteur stimulant la liaison de I 'EGF :~ son r6cepteur par des cellules N R K infectres par le virus du sarcome de Kirsten. L'inhibition de la liaison de I 'EGF dans des cellules en culture suite A une transformation par d'autres types de virus a aussi ~'*~',.,,. rapportre [76, Jt~'"'Jt, 146-148].

La capacit6 de liaison de I 'EGF sur ses cellules-cibles est aussi drpendante de l'intrgrit6 de la fonction cellulaire. L'inhibition de la synthrse protrique [149] et la perturbation des phospholi- pides membranaires [150] inhibent la liaison du facteur de croissance/~ son rrcepteur. Des cellules d6ficientes dans la synthrse de glycoprotrines lient des quantit6s moindres d 'EGF [151]. La densit6 des cultures de cellules influence 6gale- ment l 'interaction EGF-r6cepteur. Dans certains systrmes (cellules 3T3 et BSC-!), des cultures plus denses lient moins d 'EGF [28, 152, 153], alors que l'inverse est observ6 darts des cellules gliales [65]. La diffrrenciation cellulaire augmente le hombre de rrcepteurs pour I 'EGF [4,78], alors que la rapide rrgrnrrat ion tissulaire suivant une hrpa- tectomie partielle s 'accompagne d 'une diminution du hombre de sites rrcepteurs pour ce peptide [154]. Finalement, le calcium semble influencer la liaison de r E G F / ~ son rrcepteur, mais ses effets sont variables suivant les types de cellules [41, 155-158].

3. S t ruc ture et purification du rdcepteur

Plusieurs techniques ont 6t6 mises au point afin de caractrriser le rrcepteur pour I 'EGF clans diffrrents tissus. En utilisant la liaison covalente de I 'EGF radioactif /l son rrcepteur (marquage d'affinitr) grfice/~ des agents de couplage photo- r6actifs, Das et al. [159, 160] ont mis en 6vidence une protrine de Mr 190 K. Utilisant d 'abord la glutaraldrhyde [161, 162] puis des molrcules pho- torractives comme agents de couplage, le groupe de Hollenberg a caractrris6 le rrcepteur EGF comme un doublet de protrines de Mr 160 K et 180 K [42, 163]. lls ont sugg6r6 que les deux protrines 6taient apparentres, une pouvant 6tre le prrcurseur ou le produit de drgradation de l'autre. Par la suite, l 'observation qu'une certaine proportion de I 'EGF marqu6 /l l 'iode radioactif par l 'emploi de la chloramine-T formait des liens covalents avec son r6cepteur [164-167] a simplifi6 les techniques de marquage d'affinit6 et confirm6 la masse mol6culaire du r6cepteur [99, 164-166, 1681.

En utilisant la chromatographic d'affinit6, Cohen et al. [169-171] ont purifi6 le r6ceptem EGF /t partir des cellules A431 et du foie. Pat marquage d'affinit6 et par marquage au [32p], ils ont identifi6 une prot6ine de Mr 170 K qui peut 6tre mrtabolisre en un fragment plus petit (Mr 150 K). D'autres techniques de marquage ont c n n f l r r n ~ r ~ rrsu!tats [172, i-ral . . . . . . . . . . . . ~ o , i t • . , , , l j .

L'inhibition de la liaison de I 'EGF A son rrcepteur par des iectines [174], de mrme que la fixation du rrcepteur EGF solubilis6 sur une matrice de lectines-agarose [175], suggrraient une nature glycoprotrique pour le rrcepteur EGF. La production d'anticorps monoclonaux dirigrs contre le rrcepteur EGF des cellules A431 a rrcemment permis de prrciser la nature des sucres lirs /l la protrine [176, 177]. Un anticorps carac- t6ris6 par le groupe de Willingham et Pastan se lie sur un site immunog6nique autre que le site de liaison du peptide [177]. En utilisant cet anticorps, Fredman et al. [176] ont d6montr6 qu'une des s6quences d'oligosaccharides associ6e au rrcepteur EGF humain (issu de cellules A431) est la suivante : Fuc 0t 1-2 Gal 131-3 Glc NAc. L'inca- pacit6 de certains des anticorps monoclonaux, produits jusqu'/t maintenant, de se lier au r6cep- teur EGF sur d'autres lign6es cellulaires que celles /t partir desquelles ils ont 6t6 produits suggrre certaines variations entre les rrcepteurs EGF dans les diffrrents tissus [177, 178].


Certaines lignees cellulaires mutantes prove- nant de m61anomes de souris ont perdu la capa- cit6 de lier i 'EGF. Des hybrides cellulaires issus de la fusion de ces cellules avec des fibroblastes humains poss6dent une partie d6termin~e du mat6riel chromosomique humain. En 6tudiant ia capacit6 de liaison de I 'EGF de ces hybrides, deux groupes ind6pendants ont mis en 6vidence la pr6sence d'un g6ne permettant de lier I 'EGF Iocalis6 sur ie chromosome 7 [179, 180]: g~ne structural du r6cepteur EGF ou g6ne modifiant la structure du r6cepteur en le glycosylant. L'utilisation d'anticorps polyclonaux [181] dirig6s contre ces hybrides cellulaires ou d'anticorps monoclonaux dirig6s contre le r6cepteur EGF [182, 183] a permis d'6tablir que le g~ne codant pour le r6cepteur EGF humain est situ6 sur la r6gion p12 /l p22 du chromosome 7 humain.

Lorsque le L~-~I-EGF se lie de faqon covalente son r6cepteur sur les cellules A431, la radioacti-

vit6, en plus d'6tre retrac6e dans le doublet Mr 160-145 K, est observ6e dans des fragments plus petits : Mr 80 K, 62 K, 47 K et 37 K [99, 159]. Apr6s fractionnement sous-cellulaire, ces fragments co-migrent avec les lysosomes Iorsque le marquage d'affinit6 est effectu6 sur des ceilules enti6res [99, 1591. Comme la portion du r6cepteur accessible /l I'espace intralysosomal est celle qui est pr6alablement expos6e /l l'espace extracellulaire, Fox et al. [99] ont propos6 qu'au moins une portion du r6cepteur EGF de Mr 80 K (portion sur laquelle r6side l'activit6 de liaison du peptide) soit expos6e /l l'ext6rieur de la cellule. Un fragment de Mr 115 K marqu6 au ~-"~I-EGF est ob- serv6 lorsque des membranes de cellules A431 sont soumises /l Faction de ia trypsine [184]. Ce fragment n'est pas observ6 lorsque des cellules enti6res sont marqu6es, sauf lorsque ieurs membranes sont perm6abilis6es par la iysol6cithine : le site de digestion tryptique r~side donc du c6t~ cytosolique. Ceci sugg6re que le r6cepteur EGF est une prot6ine transmembranaire, avec au moins une portion de Mr 45 K expos6e du c6t6 intracellulaire [99, 184].

Plus r6cemment, Downward et aL [185] ont purifi6 le r6cepteur EGF /~ partir des cellules A431 et du placenta humain,/~ l'aide d'anticorps monocionaux dirig6s contre le r6cepteur EGF. L'analyse de la s6quence des acides amin6s des peptides obtenus par la digestion tryptique du r6cepteur purifi6 a permis de mettre en 6vidence la tr6s grande similitude existant entre une portion du r6cepteur (six peptides totalisant 83 acides amin6s) et ia prot6ine cod6e par le proto-onco- g6ne du virus de 1'6rythroblastose aviaire (AEV),

v-erb-B. Les s6quences identiques (74 a.a. sur 83) semblent appartenir aux r6gions transmembranaire et intracellulaire du r6cepteur EGF car v-erb-B ne poss6de pas la partie du r6cepteur expos6e/l l'espace extra-cellulaire et sur laquelle r6side l'activit6 de liaison du peptide.

4. Ev6nemenls mol6culaires suivant la liaison

L'6tude des m6canismes cellulaires activ6s suite /l la liaison de I 'EGF /l son r6cepteur ne permet pas d'6tablir les modifications biochimi- ques survenant au niveau mol6culaire lorsque le peptide se fixe/l la surface des cellules dans ies tissus-cibles. Le d6veloppement de syst6mes acel- lulaires (membranes purifi6es) poss6dant un r6- cepteur EGF fonctionnel devait permettre une meilleure compr6hension du m6canisme d'action de I'EGF. En utilisant des membranes purifi6es de cellules A431 capables de lier I 'EGF de faqon sp6cifique avec une haute affinit6, Carpenter et al. [186] ont mis en 6vidence la stimulation de ia phosphorylation de prot6ines membranaires sous i'influence de I 'EGF in vitro. Cette stimulation est rapide, sp6cifique fi I 'EGF, ind6pendante des nucl6otides cycliques, et requiert la pr6sence d'ions divalents (M n+-" ou Mg.+'; Ca +-' est ineffi- cace) [187, 188]. Le [.~.32p] ATP est le meilleur donneur de phosphate, mais le syst6me peut aussi utiliser le [y.32p] GTP [187]. Cassell et Glaser [189] ont aussi d6montr6 que le [y-3SS]-ATP est un substrat aussi efficace que ie [y-'2P]-ATP. La d6- phosphorylation des prot6ines thiophosphoryl6es est beaucoup plus lente que celle des prot6ines phosphoryl6es sans le marqueur [35S] [1891.

L'analyse des produits de la r6action de phosphorylation sur gel de polyacrylamide a montr6 que I 'EGF stimule la phosphorylation d'un doublet de prot6ines de Mr 170 K et Mr 150 K [169]. En purifiant ie r6cepteur EGF par chromatographie d'affinit6, Cohen et al. [169, 171] ont montr6 que le r6cepteur EGF 6tait le principal substrat phosphoryl6" de plus, i'activit6 kinasique est co-purifi6e avec le r6cepteur, sugg6rant qu'elle r6side sur la m6me prot6ine ou sur une prot6ine 6troitement associ6e au r6cepteur. Afin de d6ter- miner si le r6cepteur EGF est lui-m6me la kinase, Buhrow et al. [190, 191] ont utilis6 un marclueur d'affinit6, le 5'-p-fluorosulfonylbenzoyl ad6nosine marqu6 au [14C] (5'-p-FSO:Bz[~4C]Ado). Cette sonde modifie le site de liaison de I'ATP sur de nombreuses enzymes, y compris des phosphopro- t6ines kinases [192-198]. L'incubation de v6sicules membranaires de cellules A431 avec le 5'-p-

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FSO2Bz[~4CIAdo inhibe la stimulation de la phosphorylation induite par I'EGF dans ces v6sicules. L'inhibition est proportionnelle :~ l'incorporation de la radioactivit6 du marqueur dans les v6sicules. Le marquage d'affinit6 est inhib6 par le 5'-adeny- lyl imidodiphosphate, un analogue non-hydroly- sable de I'ATP, sugg6rant que la prot6ine marqu6e est bien la kinase [191]. Les prot6ines marqu6es par le 5'-p-FSO2Bz[~4C]Ado ont la m6me masse mol6- culaire que le r6cepteur EGF. De plus, lorsqu'on isole le r6cepteur EGF par chromatographie d'af- finit6 :~ partir de v6sicules membranaires de cellules A431 trait6es au 5'-p-FSO2Bz[I~C]Ado, le r6cepteur purifi6 contient le marqueur d'affinit6 de la kinase [190]. Ces r6sultats exp6rimentaux ap- puient fortement l'hypoth6se que l'activit6 kinasique et l'activit6 de liaison du peptide r6sident sur la me:me prot6ine.

La stimulation de la phosphorylation sous l'influence de I 'EGF est aussi observ6e dans des cellules A431 intactes [199,200]. Le principal acide amin6 phosphoryl6 par la kinase stimul6e par I 'EGF est la tyrosine [201,202], bien que le r6cepteur EGF de certaines lign6es cellulaires contient aussi un certain pourcentage de phos- phos6rines [181,202]. Par l'analyse des fragments du r6cepteur marqu6 au [32p] soumis /l une hydrolyse par ia trypsine dans des cellules per- m6abilis6es ou non, Linsley et Fox [184] ont d6termin6 que le site accepteur de phosphate est situ6 sur une portion de Mr 30 K du r6cepteur EGF, expos6e du c6t6 cytoplasmique de la membrane. Le r6cepteur EGF, qui semble phos- phoryl6 /~ plus d'un site in vitro [203], ne serait phosphoryl6 qu'en une seule location dans ies cellules intactes [204].

L'6tude de la cin6tique enzymatique de la r6action de stimulation de la phosphorylation de prot6ines sous l'influence de I 'EGF a permis d'6tablir que la liaison de I 'EGF augmente la Vmax de la r6action de phosphorylation tout en diminuant 16g6rement le Km de l'enzyme vis-fi-vis de ses substrats [85]. L'analyse de la cin6tique/l l'6quilibre et l'emploi d'inhibiteurs comp6titifs et non comp6titifs ont conduit Erneux et ai. [205]/l sugg6rer un m6canisme s6quentiel ordonn6 du type Bi-Bi pour la r6action de phosphorylation, dans lequel le substrat et I'ATP se lient/t l'enzyme en premier, puis le substrat phosphoryl6 et finalement I 'ADP sont lib6r6s.

Carpenter et al. [187] avaient d6j~i d6montr6 qu'en plus de s'autophosphoryler, la kinase as- soci6e au r6cepteur EGF est capable de phosphoryler des substrats exog6nes, notamment des

histones. D'autres substrats ont par la suite 6t6 mis en 6vidence. Le r6cepteur EGF-kinase peut phosphoryler des anticorps dirig6s contre la prot6ine cod6e par le g6ne du virus du sarcome de Rous, pp60 Src [206,207]. Cette prot6ine est elle-m6me une phosphoprot6ine-kinase sp6cifique aux tyrosines [208-211]. Bien que le r6cepteur EGF ne soit pas pr6cipit6 par les anticorps dirig6s contre pp60 ~r~, l'observation que ces derniers peuvent servir de substrats pour la kinase associ6e au r6cepteur EGF sugg6re une certaine similarit6 entre le r6cepteur EGF et pp60 Src. La s6quence des acides amin6s autour du site de phosphorylation de pp60 ~r~ a r6cemment 6t6 61ucid6e [212-215]. Des peptides synth6tiques contenant cette s6quence sont phosphoryl6s par la kinase associ6e au r6cepteur EGF [85, 205, 216]. De plus, on a rap- port6 que la phosphorylation de la gastrine [217] et de l'hormone de croissance humaine (hGH) [218] 6taient stimul6es par I 'EGF in vitro.

Dans les cellules A431 intactes, la kinase stimul6e par I 'EGF semble phosphoryler d'autres prot6ines que le r6cepteur EGF seu/ [200]. Une prot6ine dont la masse est estim6e entre Mr 34 K et Mr 39 K a 6t6 identifi6e [219-221]. Cette pro- t6ine, dont la phosphorylation est aussi stimui6e par pp60 ~c [222-225], a 6t6 iocalis6e par immunofluorescence pr6s de la membrane cellulaire, du c6t6 cytoplasmique [226]. Une prot6ine de masse mol6culaire comparable, la prot6ine ribosomale $6, est aussi phosphoryl6e sous l'influence de I 'EGF dans des pr6adipocytes [227, 228] et dans les cellules 3T3 [229].

La stimulation de la phosphorylation du r6cep- teur EGF sous l'influence de I'EGF a aussi 6t6 observ6e dans le foie [170], dans des cellules de rein [230], dans des membranes isol6es/l partir du placenta humain [231] et dans certains tissus chez l'embryon de rat et de souris [232]. Dans l'ovaire de rat, I 'EGF stimule la phosphorylation d'une prot6ine de Mr 37 K [233] dont la parent6 avec le substrat de m~me masse mol6culaire identifi6 dans les cellules A431 n'a pas 6t6 6tablie.

5. Modulation de l'activit~ de la kinase asso- cite au r6cepteur EGF

L'EGF exerce lui-m6me un contr61e sur l'acti- vit6 de la kinase de son r6cepteur. La "down regulation" du site r6cepteur qui caract6rise la liaison du peptide sur ses cellules-cibles s'accompagne d'une diminution de la phosphorylation du r6cepteur lors d'une stimulation subs6quente par


I'EGF [234, 235]. Cette inhibition de la phosphorylation EGF-d6pendante est fonction de la concentration d 'EGF dans le milieu, du temps et de la temp6rature d'incubation ainsi que de la densit6 des cultures de cellules.

D'autres conditions affectant le nombre de sites r6cepteurs pour I'EGF influencent aussi le niveau de stimulation de la phosphorylation observ6e sous l'influence de I'EGF. Des cellules mutantes d6riv6es de la lign6e A431 et qui ont perdu une partie de leurs sites r6cepteurs pour I 'EGF montrent une alt6ration de la stimulation de la phosphorylation EGF-d6pendante [236]. La r6g6n6ration des tissus du foie suite ~ une h6pa- tectomie partielle s'accompagne d'une perte de la liaison de I 'EGF [154] et d'une diminution de la phosphorylation induite par I 'EGF [237]. La transformation par certains virus aviaires provoque aussi ie m6me ph6nom~ne [145].

Le niveau de phosphorylation stimul6e par I 'EGF peut aussi 6tre modul6 par des agents contr61ant l'activit6 d'une phosphotyrosyl-prot6i- nes phosphatase, enzyme catalysant la r6action inverse, c'est-/~-dire ia d6phosphorylation des phosphotyrosines. Dans les cellules A431, le zinc (Zn +:) et ie vanadate (VOa -3) inhibent i'activit6 de cet enzyme et emp6chent la d6phosphorylation des prot6ines phosphoryl6es sous I'influence de I'EGF [238, 239].

Lorsque le r6cepteur EGF est purifi6 sous forme d'un doublet de prot6ines de Mr 170 K et Mr 150 K, la forme Mr 170 K montre une plus grande tendancc h s'autophosphoryler alors que la forme Mr 150 K phosphoryle mieux les substrats exog6nes [171]. Cette modification de l'acti- vit6 kinasique du r6cepteur EGF due ~ une prot6olyse partielle sugg6re un m6canisme endo- g6ne de contr61e de la kinase stimul6e par I'EGF. Linsley et Fox [184] avaient d6j/~ sugg6r6 i'exis- tence d'une prot6ase endog6ne pour expliquer la d6gradation du r6cepteur en sa forme Mr 145 K. R6cemment, plusieurs groupes ont caract6ris6 cette prot6ase clans les cellules A431 [240-242]. L'enzyme n6cessite la pr6sence de calcium pour exercer son activit6, et est inhib6 par la leupeptine. La sensibilit6 de l'enzyme/~ l'inhibition par l'acide iodoac6tique r6v61e la pr6sence de grou- pements sulfhydriles. Ces observations sugg6rent que l'enzyme est la prot6ase neutre activ6e par le calcium [241, 242]. La caract6risation de cet enzyme et des facteurs contr61ant son activit6 dans le foie de rat [243] sugg6rent que la d6gradation du r6cepteur EGF par cette prot6ase serait un m6canisme r6pandu de modulation de ractivit6 du r6cepteur dans plusieurs tissus.

Finalement, d'a-t¢es agents peuvent modifier la phosphorylation du r6cepteur EGF, en pr6- sence ou en absence du peptide. Des anticorps monoclonaux ,...irig6s contre le r6cepteur [244], des TGFs [245] de m6me que le dim6thyle sulfoxyde [246-248] stimulent la phosphocylation du r6cep- teur EGF en absence d'EGF. Navarro et al. [249] ont aussi d6montr6 l'inhibition de l'activit6 kinasique du r6cepteur EGF par des c6tones halo- m6thyl6es, en pr6sence ou en absence d'EGF.

6. Internalisation du r6cepteur EGF

Selon le mod61e de la mosaique fluide [250], la membrane plasmique est constitu6e par une mer de lipides dans laquelle les prot6ines intrins6ques se baignent. Ces prot6ines poss~dent une distribution al6atoire et un d6placement lat6ral dans le plan de la membrane. La distribution du r6cep- teur EGF au niveau de la membrane plasmique de diff6rentes lign6es cellulaires a 6t6 6tudi6e lors d'incubation ~ basse temp6rature en pr6sence de divers d6riv6s de rEGF. Sous ces conditions, ia fluidit6 membranaire est r6duite mais la liaison de I'EGF avec son r6cepteur est permise. Aiors, les complexes EGF-r6cepteur, mis en 6vidence par des d6riv6s de i 'EGF marqu6s /t ia rhodamine [90, 251-253], fi la ferritine [77, 2£4],/t ia peroxydase [255] et /l la biotine [256] se pr6sentent de faqon pr6dominante sous une forme monodisper- s6e et se!on une distribution a!6atoireo Toutefois~ certaines observations sugg6rent la pr6sence de r6cepteurs sous une forme pr6-aggr~g6e malgr6 le fait que rendocytose soit inhib6e fi 4°C [77, 257, 258].

Suite ~ la formation des complexes ligand- r6cepteur/l 4 °C, de nombreux travaux ont montr6 une aggr6gation de ces complexes lors de la hausse de la temp6rature /l 37 °C [77, 252, 254, 255, 259-262]. Cette transition d'une forme monodispers6e fi une forme aggr6g6e des complexes EGF-r6cepteur est amorc6e par une mo- bilit6 lat6rale accrue des complexes [252, 262, 263]. Ce processus d'aggr6gation est engendr~ par la formation de microaggr6gats de complexes ligand-r6cepteur. Ces microaggr6gats semblent form6s par un nombre tr6s restreint de complexes ne permettant pas leur d6tection par microscopie ~i fluorescence [90, 252]. L'6tape finale se solde par la formation de macroaggr6gats de complexes EGF-r6cepteur [77, 252, 254, 255, 259-262] qui deviennent immobiles [252, 264]. II s'ensuit donc une diminution du nombre de complexes ligand-


r6cepteur mobiles avec un coefficient de diffusion lat6rale inchang6 [262].

Cette macroaggr6gation des complexes EGF-r6cepteur a lieu dans certaines r6gions sp6- cialis6es ou non de la membrane plasmique, selon le type cellulaire 6tudi6. Ces aggr6gats peuvent 6tre concentr6s au niveau de cavit6s enrob6es de la membrane plasmiques de cellules A431 [77, 255], de cellules KB [255, 2611, de cellules 3T3 [255] et de fibroblastes humains [257, 258]. L'as- pect enrob6 de ces invaginations de la membrane plasmique est dO h la pr6sence d'une prot6ine, la clathrine [265]. Toutefois, le r61e de ces cavit6s enrob6es au niveau de l'aggr6gation pr6c6dant l'internalisation des complexes EGF-r6cepteur n'apparait pas g6n6ralis6. En effet, une proportion assez importante de ces complexes peut 6tre visualis6e au niveau de r6gions lisses de la membrane plasmique de cellules A431 [77] et de fibroblastes humains [258]. En outre, aucune cavit6 enrob6e n'est observ6e au niveau de la membrane plasmique d'h6patocytes incub6s en pr6sence du mI-EGF [266].

L'6tape ult6rieure ~i ia liaison de I'EGF avec son r6cepteur et /~ l'aggr6gation des complexes EGF-r6cepteur au niveau de la membrane plasmique est l'internalisation de ces complexes. Ce processus est d6pendant de la temp6rature et exige de l'6nergie. I! requiert une temp6rature sup6deure :~ 4 °C [17, 24, 90, 97, 252, 254, 255, 258, 261, 262, 267]; et il est absent lorsque les cellules sont mises en pr6sence d'inhibiteurs m6taboliques (2-deoxyglucose, azide de sodium, fluorure de sodium) [97, 174, 252].

Une fois fix6 au r6cepteur, l'inaccessibilit6 du ligand/t un traitement acide ou / t une exposition

des enzymes prot6olytiques [24, 97, 164, 174, 268-270] de m6me que la capacit6 d6croissante de liaison d'un anticorps anti-EGF marqu6 au ~251 au niveau de fibroblastes incub6s en pr6sence d 'EGF [174] indiquent une localisation intracellulaire du ligand. De plus, utilisant la centrifugation par gradient isopycnique ou par s6dimentation /~ l'6quilibre, la pr6sence du 12SI-EGF est d6tect~e au niveau de fractions repr6sentant des organites cellulaires, lorsque des tibroblastes sont incub6s en pr6sence du ligand [271,272].

L'internalisation des complexes EGF-r6cepteur est 6galement observ6e morphologiquement. Ainsi les complexes EGF-r6cepteur sont visuali- s6s /t l 'int6deur des cellules par microscopie fluorescence au niveau de divers types cellulaires [90, 252, 253, 255, 261]. Une preuve suppl6men- taire est fournie par l'immunofluorescence indi-

recte [90]. Finalement l'utilisation de d6riv6s de I'EGF, marqu6s au t251, conjugu6s ~ la ferritine ou

la peroxydase de m6me qu'un syst~me faisant intervenir un conjugu6 ~t la peroxydase et un anticorps anti-peroxydase coupl6 ~ For colloidal a permis de constater par ia microscopie 61ectro- nique l'internalisation des complexes EGF-r6cep- teur au niveau de cellules cultiv6es [77, 254, 255, 257, 258, 261, 267] et d'h6patocytes [94, 266].

L'utilisation de la microscopie 61ectronique a montr6 que la premiere 6tape intervenant dans le processus d'internalisation est ia s6questration des complexes ligand-r6cepteur au niveau de v6sicules endocytiques [77, 254, 255, 257, 258, 261]. Celles-ci semblent provenir de la membrane plasmique. N6anmoins, une ambiguit6 existe quant ~t leur structure; certains auteurs pr6tendent que ces v6sicules sont de type enrob6 [257, 258, 271] tandis que d'autres soutiennent qu'elles sont de type iisse [77, 255, 257, 261]. Toutefois, la plupart des travaux effectu6s en microscopie 61ectronique montrent que les complexes iigand- r6cepteur se retrouvent au niveau de v6sicule :~ paroi lisse. Ce type de structure se nomme r6- ceptosome [273]. Sa formation peut s'effectuer selon deux mod61es. Un premier mod61e propose que le r6ceptosome est issu d'une v6sicule enro- b6e qui s'est d6partie de son enrobage de clathrine qui serait recycl6 au niveau de la membrane plasmique; cette v6sicule enrob6e provien- drait d'un bourgeonnement au niveau de la cavit6 enrob6e [273]. Cependant, ces v6sicules enrob6es ne sont r6ellement que des sections tangentie!!es de cavit6s enrob~es qui sont en communication avec le milieu extracellulaire par I'interm6diaire d'un long canal [274]. De plus, la microinjection d'un anticorps dirig6 contre la clathrine ne per- turbe pas i'internalisation de i'o~2-macroglobuline; ce r6sultat sugg~re que la formation de v~sicules enrob6es n'a pas lieu [273, 275, 276]. A partir de ces observations, un second module propose que le r6ceptosome est form6 par invagination d'une r6gion de la membrane plasmique adjacente fi la cavit~ enrob6e (canal de la cavit~ enrob6e).

Par la microscopie h fluorescence, il a 6t6 observ6 que les v6sicules renfermant le iigand sont mobiles et se d~placent par des mouvements saitatoires dans ie cytoplasme [252]. De nombreuses 6tudes ont permis de d~celer la pr6sence du complexe ligand-r6cepteur au niveau de corps muitiv~siculaires, puis ult6rieurement et finalement au niveau des lysosomes [77, 94, 254, 255, 258, 261, 266, 267]. Cette association du ligand avec un ~16ment du syst~me lysosomial est ~galement observ~e biochimiquement [128,271,277]


par l'utilisation de ia centrifugation diff6rentielle et par combinaison de la microscopic h fluorescence et h contraste de phase [252]. Jusqu'h r6cemment, les autres types d'organites cellulaires n'6taient pas impliqu6s dans le transfert des complexes ligand-r6cepteur. N6anmoins des travaux r6cents ont montr6 que les complexes EGF-r6cepteur ne sont pas dirig6s directement vers le syst6me iysosomiai. Le syst6me golgien parait impliqu6 dans le transfert entre les r6cepto- somes et le syst~me lysosomial [255,261,277]. Biochimiquement, il a 6t6 d6montr6 que ia plupart du '251-EGF intracellulaire est localis6 pre- mi~rement au niveau de v6sicules pr6sentant les caract6ristiques de l'appareii de Golgi avant d'6tre d6tect6 au niveau de la fraction lysosomiale [277]. Willingham et ai. [255, 261] ont 6galement nots cette intervention du complexe golgien au niveau du cheminement intracellulaire de rEGF marqu6 h la peroxydase dans les cellules KB. S'appuyant sur les observations recueillies, le processus suivant semble intervenir au niveau de ces cellules incub6es en pr6sence de i 'EGF : apr6s liaison, aggr6gation et internalisation au niveau des r6ceptosomes, le ligand marqu6 se retrouve au niveau d'616ments tubulaires de la portion r6ti- culaire du syst6me goigien, avec lesquels se fusionnent les r6ceptosomes; ensuite, une concentration du ligand s'effectue au niveau de structu- res enrob6es (coated pits) du syst6me golgien avant son transfert aux iysosomes [261]. L'association du ligand et de son r6cepteur au syst6me lysosomial va conduire ~ leur d6gradation.

7. Catabolisme du complexe EGF-r~cepteur

Comme toutes les hormones polypeptidiques 6tudi6es [278-280], I 'EGF est d6grad6 apr/:s sa liaison avec ses r6cepteurs au niveau d'une cellule-cible. Ce processus de d6gradation est d6- montr6 biochimiquement par l'identification par chromatographie de fragments monoiodotyrosv- 16s [17, 262, 270, 272, 281, 282], et par la pr6sence de radioactivit6 acido-soluble [24, 36, 158, 253, 266, 268, 283, 284], ou non immunopr6cipitable [285, 286], dans le milieu de culture de cellules pr6incub6es en pr6sence d 'EGF radioactif. Ces d6riv6s sont aussi retrouv6s dans la bile chez des rats ayant requ une injection intraveineuse du ligand [94, 95].

Le lysosome apparait 6tre le site ultime de la d6gradation de I'EGF. Cette possibilit6 est ap- puy6e par l'utilisation d'agents lysosomotropiques (chlorure d'ammonium, m6thylamine, ~thy-

lamine, chloroquine, dansylcadav6rine) qui provoquent une hausse du pH intrav6siculaire des lysosomes [287], et par la leupeptine qui inhibe l'activit6 de la cath6psine [286]. L'addition de ces substances dans le milieu de culture de cellules incub6es en presence du 125I-EGF emp~che la d6gradation du !igand internalis6. Cette inhibition se traduit par une accumulation intraceilulaire du ligand sous une forme intacte et par une r6duc- tion concomitante des m6tabolites iod6s au niveau du milieu de culture [17, 24, 34, 128, 240, 253, 258, 262, 268, 271, 281, 283, 284, 286, 288, 289].

Les constituants prot~iques de la membrane plasmique exhibent un renouvellement constant. Le r~cepteur EGF n'~chappe pas ~ la r~gle, car des 6tudes montrent qu'il est continueilement renouvel6, m6me en l'absence de son ligand [97, 149, 289-291]. Mais, iusqu'h pr6sent, aucune unanimit6 n'existe quant ~t ia valeur de la demi-vie de ce r6cepteur mesur6e chez diff6rentes lign6es cellulaires [97, 149, 289-292]. Quoique les diverses approches utilis6es puissent en &re la cause, il n'est pas exclus que chaque type cellulaire poss~de un taux de renouvellement de ce r6cepteur qui lui soit sp6cifique. Les cellules A431 exhibent un nombre sup~deur de ces r~cepteurs par rapport aux fibroblastes humains en raison d'un taux de synth/~se accrfi et d'une demi-vie plus longue [291].

Le devenir de I'EGF se soide par une prot6o- iyse lysosomiale. A l'inverse de certains r6cep- teurs [_293], !e re_'cepteur EGF n'est pas recycl6 vers ia membrane plasmique mais il est plut6t d6grad6. En effet, des 6tudes utilisant un marquage par photoaffinit6 ont montr6 que ie complexe EGF-r6cepteur est fragment6 en sous-unit6s dont les poids mol6culaires s'6chelonnent entre Mr 37 K et Mr 67 K [99, 159, 163, 164, 166, 294]. En outre, ces fragments s6dimentent dans la zone correspondante h la fraction lysosomiale [159]. Ces fragments n'apparaissent pas lorsque la chloroquine, un agent lysosomotropique, est pr6sente dans le milieu d'incubation [159, 163, 166,294]. M6me si la formation de liaison pont6e entre le ligand et le r6cepteur ne repr6sente que 1% de la totalit6 des complexes ligand-r6cepteur form6s [160], de nouvelles approches ont renforc6 la possibilit6 que le r6cep- teur EGF est d6grad6 suite h son internalisation. En suivant le devenir du r6cepteur par la m6thode du "heavy isotope density shift" [295] et par rimmunopr6cipitation du r6cepteur marqu6 ~ la m6thionine-[35S] [296], la d6gradation du r6cepteur EGF a 6t6 constat6e.


Comme d'autres ligands, I 'EGF exerce une r6gulation n6gative sur son r6cepteur [278]. Ce ph6nom6ne se traduit par une nette diminution de la capacit6 de liaison de I'EGF en fonction du temps chez des cellules pr6alablement incub6es en pr6sence d 'EGF [17, 24, 34, 73, 97, 159, 164, 166, 168, 253, 281, 282, 284, 288, 291, 297-300]. Cette r6gulation n6gative est d6pendactte de la concentration de I'EGF [34, 97, 159, 164, 166, 168, 284, 291, 297]. Les agents lysosomotropiques ne g6n6rent aucune inhibition de ce processus [253,297] et le cytosquelette ne semble gu6re intervenir au niveau de la r6gulation n6gative du r6cepteur par r E G F [284, 300].

De plus, cette r6gulation n6gative n'est pas la cons6quence d'une modification de structure du ligand darts le milieu de culture [24]. Plut6t cette perte de la capacit6 de liaison est principalement due /t une diminution du nombre de r6cepteur sans changement d'affinit6 de ceux-ci envers I'EGF [97, 289, 291]. Ainsi cette perte de la capacit6 de liaison qui accompagne rinternalisation et la d6gradation du peptide est donc attri- buable h rinternalisation et h la d6gradation concomitante des r6cepteurs [97, 159, 164, 166, 168]. De plus, Krupp et al. [291] ont montr6 que l'6tape limitante dans la r6gulation n6gative de I'EGF sur le niveau des r6cepteurs n'est pas le taux de synth6se du r6cepteur mais plut6t le taux de d6gradation du r6cepteur. En effet, le taux de synth6se demeure inchang6 et le taux de d6gra- dation du r6cepteur est accn) lorsque I'EGF est pr6sent dans ie milieu d'incubation. Les r6suitats d'une 6tude r~ente laissent ,,~,i~ que l'activit6 de la fibrinokinase, prot6ine responsable de l'ac- tivation du plasminog6ne, serait impliqu6e dans le processus de la r6gulation n6gative du r6cep- teur EGF [297].

Un retour ~ une capacit6 normale de liaison est not6 Iorsque r E G F est enlev6 du milieu d'incubation [17, 97, 149, 297]. Cette r6cup6ration d6pend de la pr6sence de s6rum dans le milieu de culture [17, 149] et d'une synth6se prot6ique et d'acide ribonucl6ique active [17, 24, 149]. La p6riode de latence varie selon le type cellulaire [97, 149, 297].

Le r61e principal des amines est rinhibition de la d6gradation lysosomiale du ligand et de son r6cepteur [17, 24, 34, 159, 163, 166, 253, 254, 258, 262, 266, 268, 271, 272, 281, 283, 284, 286, 289]. Les amines n'exercent aucun effet au niveau de la liaison de I 'EGF avec son r6cepteur [253, 266, 269, 270, 283]. Certaines 6tudes ont montr6 que les amines inhibent raggr6gation des complexes ligand-r6cepteur au niveau de la surface cellulaire [259, 260, 270, 295]. Etant donn6 que les amines

inhibent 6galement l'activit6 de la transglutami- nase [259, 279], il a 6t6 sugg6r6 que cet enzyme peut jouer un r61e primordial au niveau du processus d'aggr6gation et d'internalisation des complexes ligand-r6cepteur en catalysant une liaison pont6e entre le r6cepteur et une prot6ine donn6e de la cavit6 enrob6e facilitant ainsi rinternalisation [295, 301]. Toutefois cette hypoth6se est fortement remise en question par les r6sultats d6montrant que les amines ne provoquent qu'une inhibition temporaire de raggr6gation des complexes EGF-r6cepteur [253]. De plus, les amines n'exercent aucun effet inhibiteur au niveau de i'internalisation de ces complexes [253, 270, 283, 284, 289]. Ces diff6rences sont attribu6es ~ la puret6 incertaine de la pr6paration d 'EGF utilis6e dans les travaux originaux [259, 260, 295]. Enfin, l'inhibition de rinternalisation des complexes EGF-r6cepteur provoqu6e par la dansylcadav6- rine [269, 270] ne peut 6tre que la cons6quence de l'utilisation d'une dose toxique de cette amine [2531.

De nombreux travaux sugg6rent que certains 616ments du cytosquelette sont impliqu6s darts l'endocytose [280]. L'addition de substances (col- chicine, vinblastine, colcemide, podophyllo- toxine) provoquant la d6polym6risation des microtubules dans le milieu de culture n'emp6che pas la liaison de I'EGF h son r6cepteur ni son internalisation [283, 284, 300]. Toutefois une inhibition de la d6gradation de ce ligand est not6e lorsque ces inhibiteurs sont pr6sents dans le milieu d'incubation [253, 283, 284]. Ces r6suitats n;ont pas 6t6 confirmes par d'autres 6tudes [300].

' i De plus, les microfilaments n appara.ssent pas impliqu6s dans aucun de ces processus [24, 300].

Certains ions pourraient 6tre impliqu6s dans l'endocytose de I'EGF. Le calcium semble intervenir dans la modulation de la stimulation de la prolif6ration cellulaire par r E G F au niveau de cellules fibroblastiques et 6pith61iales humaines en culture [302, 303]. Une concentration extracellulaire de calcium provoquant l'arr6t de croissance de fibroblastes humains n'alt6re pas la liaison, mais provoque une baisse tr6s importante de l'internalisation et de la d6gradation de rEGF [158]. Ces effets peuvent 6tre caus6s par rentre- mise de la calmoduline car une inhibition de l'internalisation et de la d6gradation de I 'EGF est observ6e, lorsque les cellules sont incub6es en pr6sence d'un inhibiteur de la calmoduline [158, 304, 305]. Par ailleurs, Dickson et ai. [306] ont montr6 que rendocytose de rEGF requiert la pr6sence d'ions sodium et carbonate, quoique la liaison du ligand/t son r6cepteur ne rexige pas.

Le r6cepteur EGF 525

La liaison de nombreux ligands ~ des r6cep- teurs pr6sents au niveau de composantes subcellu- laires a 6t6 montr6e dans diverses 6tudes [278, 280]. Les r6sultats de deux travaux indiquent la presence de r6cepteurs de I 'EGF au niveau du noyau de ceUules hypophysaires tumorales (GH.0 [307], et de cellules endoth61iales de la corn6e et de cellules folliculaires de l'ovaire de b~euf [308]. Toutefois la localisation pr6cise du r6cepteur au niveau du noyau, quoique la chromatine puisse 6tre excluse [307, 308], et le r6le de cette interaction restent/~ 6tre d6termin6s.

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