la sélection des traces de sang sur des lieux d’investigation

Ecole des sciences criminelles

Faculté de droit, des sciences criminelles et d’administration publique

École des Sciences Criminelles

La sélection des traces de sang sur

des lieux d’investigation

Aide à la prise de décision des prélèvements biologiques sanguins

par la détection de l’antigène A

Thèse de doctorat pour l’obtention du titre de

Docteur ès Sciences en Science Forensique

Valentin Carlier

Codirection : Pr Andy Bécue

Pr Olivier Delémont

Lausanne, le 3 septembre 2020

Faculté de droit,

des sciences criminelles

et d'administration publique

La sélection des traces de sang sur

des lieux d’investigation

Aide à la prise de décision des prélèvements biologiques sanguins

par la détection de l’antigène A

Valentin Carlier

Jury de thèse

Pr Daniel Attinger expert externe∗

Pr Christophe Martinaud expert externe∗∗

Commissaire adjoint Steve Rosset expert externe†

Dre Natalie Kummer experte interne‡

Pr Andy Bécue co-directeur‡

Pr Olivier Delémont co-directeur‡

Pr Olivier Ribaux président du jury‡

∗. Ingénierie mécanique – Université d’Iowa, États-Unis∗∗. Centre de transfusion sanguine des armées françaises – Clamart, France†. Service forensique – Police de Neuchâtel, Suisse‡. École des Sciences Criminelles – Université de Lausanne, Suisse

« La persévérance vient à bout de tout, il n’est point d’obstacle qu’un travailassidu ou une attention continuelle ne parvienne à vaincre : c’est ce qu’on necesse de nous répéter, et que je regarde pas comme vrai en tout point ! Je croisque c’est plus le hasard et les circonstances qui servent un homme qui veuts’élever que tout ce qu’il peut faire lui même ; il est vrai qu’il faut qu’il aide auxcirconstances, mais combien de personnes pour qui elles ne se présententjamais ! »

David Augustin de Brueys

En l’absence de référence, les figures et tableaux présentés dans ce manuscrit sont les propriétés de l’auteur selon les conditions de

« Creative Commons Corporation » † : attribution - pas d’utilisation commerciale - partage dans les mêmes conditions - version

internationale 4.0 – CC BY-NC-SA 4.0.

†. Creative Commons Corporation. Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International. Consulté le 30 avril 2020<http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/> [en ligne]

viii

Remerciements

Cette thèse a débuté en septembre 2014 après que le Pr Olivier Delémont m’ait proposé cet intriguant sujet à

la suite de mon travail de master, déjà sur les traces de sang, et également encadré par le Pr Andy Bécue.

Par ces lignes je souhaite ainsi remercier mes deux directeurs de thèse, le Pr Andy Bécue et le Pr Olivier

Delémont pour leur encadrement. Souvent on me demandait : « ça se passe bien avec deux directeurs, pas trop

dur à gérer ? » Je dois dire que c’était tout sauf compliqué du fait qu’ils étaient toujours d’accord entre eux. Bien

qu’ayant des connaissances et compétences différentes, elles se sont surtout illustrées comme complémentaires.

À mon sens, ce projet s’est développé autour de deux axes, une partie technique en laboratoire qui a dû être

développée pour et autour d’une vision du terrain, investigative. Là a été ma chance d’avoir Andy et Olivier,

qui se sont illustrés dans ces deux axes, chacun avec leurs spécificités.

Merci au Pr Daniel Attinger et au Commissaire Adjoint du Service Forensique de la police Neuchâteloise Steve

Rosset d’avoir contribué au développement de cette recherche. Au fil des discussions que j’ai eues avec ces deux

spécialistes en morpho-analyse des traces de sang, j’ai pu intégrer mon sujet dans ce vaste domaine des traces

de sang et lui donner plus d’envergure que je ne l’aurais pensé au début de mes recherches.

J’adresse tous mes remerciements au Pr Olivier Ribaux, directeur de l’École des Sciences Criminelles, pour

avoir accepté le rôle de Président du jury, au Pr Christophe Martinaud et à la Dre Natalie Kummer pour leur

disponibilité en tant que membres du jury et pour l’apport de leur point de vue sur cette recherche.

J’ai eu la chance de participer à quelques congrès pour présenter mes résultats et je souhaite remercier les diffé-

rentes organisations pour leurs subsides : la Fondation de l’Université de Lausanne, l’Association des Diplômés

en Sciences Criminelles, et l’École des Sciences Criminelles.

J’ai également eu l’opportunité de faire un stage au Service Forensique de la police Neuchâteloise, qui m’a

accueilli en novembre 2018. Je remercie toutes les personnes du service pour leur confiance, leur temps accordé

et leur partage de connaissances. Cela m’a permis de concrétiser ma formation forensique sur le terrain et d’avoir

une vue plus générale du travail dans un service forensique. Je pense que cela a été une plus-value considérable

pour ma recherche, en y intégrant plus concrètement une vision investigative.

Encore une fois, je suis navré pour les petites douleurs et les bleus que vous, donneur-euse-s de sang, avez eus

aux bouts des doigts, mais sans qui je n’aurais pas pu faire autant d’expériences et d’analyses ! Un grand merci

donc à toutes les personnes qui m’ont donné de leur sang !

Cette aventure, qui peut également être définie comme un zigzag, yoyo émotionnel oscillant entre moments de

réussites et d’autres, de profondes exaspérations, a réellement pu se finir grâce à Anne-Céline, Laurane, Lydie,

Stella et William. Merci à vous pour tous ces moments autour d’une bière (ou d’un soda sans sucre de renommé

mondiale), d’un barbec improvisé sur la coursive, au bordu ou sur les terrasses des uns et des autres, d’un café

– spéciale dédicace à une chaîne Américaine de café bien connue – ou ces voyages au bout du monde. Tous ces

moments ont grandement participé à me motiver et à faire avancer ce projet au cours de ces années.

Merci à Jean pour sa patience et ses encouragements pendant ces trois dernières années, qui a su me remotiver

dans les périodes creuses et à ne pas tout lâcher !

Enfin, je veux exprimer toute ma gratitude à ma famille et à leur soutien sans faille au cours de ces longues

années d’études ! Mais c’est tout bon, j’ai fini ! et avec un boulot à la clef !

ix

Publication & Conférences

Article publié en lien avec la thèse

Valentin Carlier, Andy Bécue, Olivier Delémont. La discrimination des traces de sang sur une scène d’inves-

tigation : un soutien pour la sélection de traces pertinentes. Revue Internationale de Criminologie et de Police

Technique et Scientifique, 72(2), pp. 230-348 (2019)

Posters présentés

École doctorale du 24 au 27 août 2015, Les Diablerets (Suisse) – « Bloodstains sampling – How to guide DNA

samples from bloodstains ? »

International Society of Blood Transfusion (ISBT) du 2 au 6 juin 2018, Toronto (Canada) – « Selection of

bloodstains at the crime scene – Development of an in-situ discrimination method based on blood typing »

Présentations orales

École doctorale du 28 au 31 août 2017, Les Diablerets (Suisse) – « Selection of bloodstains during the investi-

gation of a crime scene – Development of a method for discriminating the stains from different sources »

European Association of Forensic Science (EAFS) du 27 au 31 août 2018, Lyon (France) – « Selection of

bloodstains at the crime scene – Development of an in-situ discrimination method based on blood typing »

International Association of Blood Pattern Analysts (IABPA) – conférence Européenne du 17 au 21 juin 2019,

Paris (France) – « The selection of bloodstains at the crime scene – in-situ application of antibodies to discri-

minate bloodstains from their blood groups »

xi

Avant-propos

Au cours du manuscrit, les barres verticales noires qui juxtaposent un paragraphe servent de point de repère

pour attirer le lecteur sur une réflexion, une parenthèse spécifique. Certains paragraphes font également office

de conclusions intermédiaires au sein d’un chapitre, d’une section.

*******************************

Travaillant avec un fluide biologique, le sang, une demande a été adressée à la commission cantonale vaudoise

d’éthique de la recherche sur l’être humain (CER-VD) pour savoir si le travail de recherche présenté nécessitait

l’établissement d’un dossier afin de passer devant la commission d’éthique suisse. Une réponse négative nous a

été transmise le 27 janvier 2017 par le président de la commission, le Pr Patrick Francioli ; le projet de recherche

n’a donc pas nécessité une approbation de la commission d’éthique suisse.

*******************************

Dans le but de simplifier la nomenclature et la lecture, les termes suivants sont utilisés :

Le terme « enquêteur » rassemble toutes les professions et corps de métier (police de proximité, police de

sûreté, ...) qui sont habilités à communiquer avec les investigateurs pour leur demander une intervention

sur des lieux.

Le terme « investigateur » regroupe toutes les professions et corps de métier où une personne intervient sur

une scène d’investigation dans le but de l’investiguer, c’est-à-dire de fixer les lieux et de chercher, détecter,

documenter et collecter des traces.

Le terme « support » correspond à la surface sur laquelle les traces de sang ont été déposées pour y être

séchées (bois, céramique, papier filtre, plastique, tissu, verre).

Le terme « médium » correspond à la surface sur laquelle les traces de sang ont été transférées pour y être

analysées à l’aide des anticorps (membranes, papier filtre).

*******************************

Liste des abréviations utilisées dans les figures et tableaux :

• Ac I : anticorps primaires – ces derniers ciblent les antigènes sanguins ;

• Ac II : anticorps secondaires – ces derniers ciblent les anticorps primaires ;

• Ag : antigènes sanguins ;

• ECL-AP : enhanced chemiluminescence substrate - alkalin phosphatase – solution utilisée pour détecter

les anticorps secondaires en activant l’enzyme, l’alkaline phosphatase, fixée sur ces derniers ;

• TTBS : Tween 20 tris-buffered saline – tampon biologique utilisé pour diluer les anticorps secondaires.

xiii

Préambule

« Quelle-s trace-s de sang prélever ? » Cette question est la charnière de cette thèse. Afin d’y apporter des

réponses, le manuscrit a été divisé en sept parties, regroupant au total quatorze chapitres.

Partie I – La prise de décision sur des lieux d’investigation. La prise de décision est présentée autour

des outils cognitifs et techniques. Les outils cognitifs ciblent l’analyse (le processus d’hypothético-déduction) et

les heuristiques, dans lesquels le modèle de la première reconnaissance est présenté ; ce modèle est centré autour

de la notion de l’intuition. Les outils techniques relatent les différentes méthodes d’analyse des traces de sang

permettant d’obtenir une information utile à la prise de décision.

Partie II – Question de recherche. Cette partie pose les bases théoriques relatives à la trace et à la source

qui seront nécessaires pour la suite du document. Le contexte forensique dans lequel se situe cette thèse est

développé. Ce contexte part du constat que les investigateurs de scène d’investigation peuvent faire face à des

difficultés liées à la sélection des traces de sang pertinentes. Le projet de recherche basé sur le développement

d’une méthode permettant de détecter l’antigène A dans des traces de sang est proposé.

Partie III – Bases théoriques sur le sang. Travailler avec le fluide sanguin nécessite de comprendre sa

composition et son comportement lorsqu’il se retrouve en dehors des conditions physiologiques, c’est-à-dire en

dehors de l’organisme. Peu de recherches sont effectuées dans ces domaines, car les recherches entreprises en

biologie et en médecine se concentrent sur le sang in vivo. Cette partie regroupe les différentes connaissances ac-

tuelles relatives à la composition du sang, en ciblant principalement les antigènes sanguins, et aux modifications

structurelles des traces de sang en fonction du séchage.

Partie IV – Sélection de l’antigène sanguin. Parmi les 300 antigènes sanguins recensés, quel est l’antigène

sanguin présentant le plus haut potentiel pour différencier des traces de sang de sources différentes ? Pour y

répondre, deux critères ont été établis : un critère théorique en calculant le pouvoir discriminatoire de plusieurs

antigènes sanguins, et un critère expérimental en vérifiant que l’antigène sanguin sélectionné restait détectable

dans des traces de sang âgées de plusieurs semaines. La détection expérimentale de l’antigène choisi, à savoir

l’antigène A (système ABO), a été effectuée par la méthode du dot blot.

Partie V – Transposition de la méthode vers l’opérationnel. Cette partie explique les étapes ayant permis

la transposition du dot blot sur des lieux d’investigation. En réduisant la durée du protocole et en modifiant des

étapes charnières, la méthode développée est transportable et dure trente minutes. Cette méthode se fonde sur

le transfert des traces de sang sur du papier filtre imbibé d’anticorps anti-A qui sont ensuite détectés par des

anticorps secondaires, qui engendrent une coloration noire. Un plan d’expérience par criblage a permis d’évaluer

les facteurs ayant une influence significative sur le résultat.

Partie VI – Mise à l’épreuve de la méthode. La méthode développée a été testée sur des traces de sang

déposées dans plusieurs conditions : différents donneurs, différents temps de séchages, différents supports et

analyse de traces de sang à l’aveugle. D’autres personnes ont analysé les résultats afin d’évaluer certains biais

possibles et pour obtenir un retour sur la méthode. Enfin, il a été possible d’appliquer la méthode sur deux cas

réels, ce qui a permis d’améliorer le protocole et d’estimer son applicabilité sur des lieux.

Partie VII – Discussion générale. Les aspects fonctionnels de la méthode développée tout au long du

processus forensique y sont décrits : les étapes décisionnelles auxquelles font faces les investigateurs, les bénéfices

et limites de la méthode proposée, le lien entre la méthode et les analyses génétiques des traces de sang, son

coût, ainsi que plusieurs perspectives de recherches pouvant optimiser la méthode.

xv

Preamble

« Which bloodstains to sample ? » This question is the hinge of this thesis. In order to provide answers, the

manuscript has been divided into seven parts, with a total of fourteen chapters.

Part I – The decision-making process at a crime scene. Selecting the bloodstains implies choosing,

deciding which bloodstain is more relevant than another. The decision-making process presented here is defined

around two axes : the cognitive and technical tools. Cognitive tools focus on the analysis (the hypothetical-

deduction process) and on the heuristics, in which the first recognition model is presented. This model is mainly

centered around the notion of intuition. The technical tools describe the different methods of bloodstain analysis

to get an useful information for the decision-making process.

Part II – Research question. First, this part lays the theoretical bases on the notions of trace and source

that will be necessary for the rest of the document. Then, the forensic context in which this thesis is situated

is developed. This context is based on the observation that crime scene investigators may face some difficulties

in selecting relevant bloodstains. The research project is presented ; it is based on the development of a method

to detect the A antigen in bloodstains.

Part III – Theoretical fundamentals about blood. Working with blood fluid requires an understanding

of its composition and behavior when it is outside physiological conditions, i.e. outside the body. Few research

is done on these fields, as research in biology and medicine focuses on the in vivo, liquid blood. This section

brings together the various current knowledge relating to blood composition, mainly targeting blood antigens,

and structural bloodstain modifications according to the drying process.

Part IV – Blood antigen selection. Among the 300 blood antigens which have been identified, which one has

the highest potential to differentiate bloodstains from different sources ? To meet this requirement, two criteria

were established : a theoretical criterion by calculating the discriminatory power of several blood antigens, and

an experimental criterion by verifying that the selected blood antigen remained detectable in bloodstains several

weeks old. The experimental detection of the selected antigen, namely antigen A (ABO system), was performed

by the ‘dot blot’ technique.

Part V – Transposition of the method to the operational. This part explains the steps allowing the

transposition of the ‘dot blot’ technique onto investigation sites. By reducing the time of the protocol and

by modifying key steps, the method developed is transportable and requires thirty minutes. This method is

based on the transfer of bloodstains to filter paper embedded with anti-A antibodies, which are then detected

by secondary antibodies, producing a black stain. An experimental screening design was used to evaluate the

factors that significantly influenced the outcome.

Part VI – Testing the method. The developed method was tested with bloodstains deposited under several

conditions : different donors, different drying times, different substrates and blind bloodstain analysis. Other

scientists also analyzed the results to assess some possible biases and to obtain a feedback on the method.

Finally, it was possible to apply the method to two real cases, making it possible to optimize the protocol and

to estimate its applicability on site.

Part VII – General discussion. The functional aspects of the method developed throughout the forensic

process are described : the decision-making steps faced by investigators, the benefits and limitations of the

proposed method, the link between the method and genetic analysis of bloodstains, its cost, as well as several

research opportunities allowing method optimization.

xvii

Table des matières

I La prise de décision sur des lieux d’investigation 1

1 Outils cognitifs 3

1.1 Concepts généraux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 L’analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Les heuristiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2 Outils techniques : la trace de sang comme vecteur d’information 11

2.1 Détection et caractérisation du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.2 Classification et identification d’une personne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.3 Reconstruction des évènements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3 Influences des informations perçues 25

3.1 Étapes de décision lors de l’investigation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.2 Informations perçues par les investigateurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.3 Risques de biais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

II Question de recherche 31

4 Paradigmes forensiques 33

4.1 La trace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.2 La source . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5 Une recherche de projet ou un projet de recherche ? 37

5.1 Contexte général . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.2 Quelle méthode choisir ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.3 Méthode choisie : immunologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

III Bases théoriques sur le sang 49

6 Notions biologiques 51

6.1 Composition du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

6.2 Interactions antigènes/anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

6.3 Groupes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

7 Altérations des propriétés du sang en dehors de l’organisme 65

7.1 Principes de l’hémostase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

7.2 Modifications du sang ex vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

7.3 Expérimentations sur l’influence du support et des anticoagulants . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

xix

xx TABLE DES MATIÈRES

IV Sélection de l’antigène sanguin 71

8 Corrélation et pouvoir discriminatoire des antigènes sanguins 73

8.1 Indépendance des antigènes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

8.2 Distribution générale des antigènes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

9 Détection de l’antigène A dans les traces de sang 83

9.1 Principe de la méthode dot blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

9.2 Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

9.3 Résultats de la détection de l’antigène A dans les traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

9.4 Discussion de la méthode appliquée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Conclusion de la partie IV 97

V Transposition de la méthode vers l’opérationnel 99

10 Concepts de la méthode pour une adaptation vers l’opérationnel 101

10.1 Propositions de l’adaptation du protocole dot blot sur des lieux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

10.2 Concept général de la méthode proposée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

10.3 Hypothèse sur la coloration du médium et des traces de sang transférées . . . . . . . . . . . . . . 106

11 Développement du papier filtre imbibé d’anticorps 109

11.1 Approche qualitative – effet des étapes majeures du protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

11.2 Approche quantitative – plan d’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

11.3 Protocole établi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

Conclusion de la partie V 127

VI Mise à l’épreuve de la méthode 129

12 Étude sur des traces de sang âgées jusqu’à quatre semaines, sur différents supports 131

12.1 Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

12.2 Résultats de la détection des antigènes A dans les traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

12.3 Discussion de la méthode appliquée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

13 Contrôles supplémentaires 141

13.1 Traces de sang de groupe A âgées de plus d’un mois . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

13.2 Résultats analysés par d’autres personnes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

13.3 Analyse à l’aveugle de traces de sang déposées par une tierce personne . . . . . . . . . . . . . . . 146

13.4 Étude préliminaire sur les analyses ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

14 Application de la méthode sur deux cas réels 151

14.1 Premier cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

14.2 Deuxième cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

14.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

Conclusion de la partie VI 161

TABLE DES MATIÈRES xxi

VII Discussion générale et Conclusion 163Décider ... à quelle étape ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

Développement de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

Application de la méthode sur des lieux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Expansion de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

Combinaison de la méthode avec des analyses génétiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177

Coût d’une analyse et sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179

Résumé des points forts et des limites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

Synthèse des perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

Bibliographie 183

Annexes IA. Représentation des sucres terminaux des antigènes ABH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III

B. Traces de sang créées avec différents anticoagulants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V

C. Protocoles issus des fournisseurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX

D. Distribution des antigènes sanguins dans la population expérimentales . . . . . . . . . . . . . . . . XV

E. Photos des traces de sang déposées pour étudier la détection des antigènes A par dot blot . . . . . .XVII

F. Membranes LF-PVDF après dot blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XXIII

G. Sang dilué liquide vs. sec . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XXVII

H. Script ImageJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XXIX

I. Tableau du plan d’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XXXV

J. Traces de sang déposées pour l’application de la méthode développée . . . . . . . . . . . . . . . . .XXXVII

K. Papiers filtres pour les traces de sang âgées d’un mois . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XLIII

L. Traces de sang âgées de plus d’un mois . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . LV

M. Traces de sang déposées à l’aveugle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .LVII

N. Conditionnement du kit pour des lieux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .LXVII

O. Fiches de données de sécurité des produits utilisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .LXIX

Première partie

La prise de décision sur des lieux

d’investigation

1

Chapitre 1

Outils cognitifs

« L’intuition est l’une des facultés de l’homme intérieurdont le spécialisme est un attribut. »

Honoré de Balzac

Sommaire1.1 Concepts généraux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 L’analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2.1 Le processus d’hypothético-déduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2.2 L’apport du renseignement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3 Les heuristiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.3.1 Le modèle de la première reconnaissance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.3.2 L’intuition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.1 Concepts généraux

« Quelle-s trace-s faut-il prélever sur des lieux d’investigation ? Où effectuer le-s prélèvement-s ? Comment

choisir ? ». Ces questions, similaires, et selon les cas, pouvant être très complexes, centralisent le point névralgique

de cette recherche.

Bien qu’associée dans cette thèse de doctorat aux traces de sang, la question relative à la sélection de la trace

se pose pour tous les types de traces. Les investigateurs de scènes d’investigation se confrontent fréquemment à

ces questions lors de leurs interventions sur les lieux et lors de la réception de pièces en laboratoire. Sur la base

d’informations contextuelles, de leur expérience et de leur formation, ils doivent choisir l’endroit où prélever la

trace, ce qui influence le nombre de prélèvement-s ; et inversement.

De ce postulat, il peut être intéressant d’expliquer comment une décision est prise, car en comprenant le processus

décisionnel, l’appréhension du choix 1 peut être atténuée, confortant alors la décision. Il peut cependant être noté

que la prise de décision dépend du contexte dans lequel se trouve la personne, soit dans un contexte scolaire,

universitaire, professionnel, familial. Les émotions ayant un rôle fondamental sur la décision.

1. Les termes « choix » et « décision » sont considérés comme synonymes par Guarnelli and Lebraty (2014).

3

Partie I : La prise de décision sur des lieux d’investigation

Deux modèles peuvent être décrits pour prendre une décision (cf. figure 1.1) :

1. les outils cognitifs :

• l’analyse ;

• les heuristiques, soit l’intuition ;

2. les outils techniques.

Figure 1.1 – Illustration des trois outils aidant à la prise de la décision

L’analyse est associée dans ce contexte aux processus cognitifs qu’entreprend un investigateur sur une scène

d’investigation. Elle correspond de ce fait au processus d’hypothético-déduction qui permet d’évaluer et de

réfuter des hypothèses à partir d’observations faites.

Les heuristiques sont des associations d’idées, des raccourcis rapides et le plus souvent plus efficaces pour gérer

la complexité du monde et voir les choses telles qu’il est le plus probable qu’elles soient, et non pas telles

qu’elles sont. Par exemple, en visualisant le dessin suivant « , », une personne va l’associer à un sourire,

smiley, alors qu’en réalité il s’agit de deux points, d’un cercle et d’une petite courbe. Les heuristiques sont

des raccourcis cognitifs, qui sont sensibles aux émotions, et donc aux biais. Il est important de noter que les

émotions interviennent toujours avant la prise de la décision, du jugement (Anselem, 2019).

Afin de consolider la prise de décision, un dernier outil peut être utilisé, à savoir l’ensemble des techniques et

méthodes d’analyses qui permettent d’extraire une information à partir des traces de sang. Plusieurs de ces outils

existent et sont à la disposition des investigateurs qu’ils peuvent utiliser sur des lieux 2. Ainsi, en combinant

l’analyse, les heuristiques et la technique, une décision plus objective, justifiable, peut être prise, ce qui réduit

la possibilité de biais relatifs aux émotions.

1.2 L’analyse

1.2.1 Le processus d’hypothético-déduction

En présence d’une trace, l’un des buts est de l’associer à une source. Il est ainsi primordial de définir la source

de la trace afin de savoir d’où (de quoi, de qui) cette dernière provient. Il doit donc être possible de distinguer

la source de la trace parmi toutes les autres sources envisagées (Champod, 2015; Kwan, 1977).

2. Le chapitre suivant est dédié à ces outils.

4

Chapitre 1. Outils cognitifs

Outre les raisonnements basés sur l’abduction, la déduction et l’induction 3, la dynamique basée sur l’hypothético-

déduction est utilisée en science forensique (cf. figure 1.2) (Kwan, 1977; Schuliar and Crispino, 2013). Cette

logique permet, en posant des hypothèses, de considérer l’ensemble des sources pouvant être à l’origine de la

trace, de réduire le nombre potentiel de sources pour idéalement n’en retenir qu’une seule. Ce processus est

ainsi basé sur un raisonnement de réduction dans lequel le nombre de sources est diminué au fur et à mesure

des observations et des résultats obtenus.

La trace n’est toutefois pas systématiquement reliée à une source unique. En utilisant une source connue, il est

possible d’individualiser un objet 4. Lorsqu’une trace est détectée et qu’il faut remonter à sa source, plusieurs

facteurs peuvent empêcher son individualisation. En effet, la qualité de la trace et l’information partielle qu’elle

transmet sont des freins majeurs à l’individualisation.

règle, lois

cas, évènementrésultat (trace)

(a) abduction

règle, lois


(b) déduction

règle, lois


(c) induction

règle, lois

cas, évènement, hypothèsesrésultat (trace)

(d) hypothético-déduction

Figure 1.2 – Illustration des différents types de raisonnement

1.2.2 L’apport du renseignement

Le renseignement (intelligence-led crime scene processing) constitue aussi une dimension importante dans la

recherche et la sélection de traces sur une scène d’investigation. Le renseignement englobe également le processus

hypothético-déducitf. Dans un cas, la démarche hypothético-déductive se focalise sur un événement ponctuel

(le « cas »), alors qu’en matière de renseignement, la démarche s’applique autour d’un ensemble d’événements

répétitifs.

3. L’abduction est utilisée pour résoudre une énigme, un puzzle ; la déduction est utilisée dans le génie civil et l’ingénierie ;l’induction est utilisée dans la recherche avec les découvertes scientifiques. De base, l’étude d’une trace ne permet que le raisonnementpar induction car elle renvoie au moment de sa création. Cependant, en considérant plus globalement l’ensemble des traces créées,le raisonnement par abduction est utilisé car la découverte d’une trace modifie le raisonnement et les hypothèses émises.

4. Le terme objet désigne ici un élément matériel ou immatériel qui confond trace et référence.

5


Sa contribution a été mise en exergue au sein d’un modèle à quatre niveaux de connaissance liés au processus

d’investigation (cf. figure 1.3) (Delémont et al., 2017; Ribaux et al., 2010) :

1. l’environnement stratégique réfère aux facteurs qui influencent l’enquête, tels que le cadre juridique, les

orientations politiques, la gestion des effectifs ou des ressources ;

2. l’environnement criminel, dans lequel le ciblage et la reconnaissance de points-chauds, signes d’activités

criminelles, renvoie à l’analyse des phénomènes récurrents. En terme d’investigation de scènes, cette di-

mension fait surtout référence à l’appartenance d’un cas à un ensemble de répétitions d’auteurs prolifiques.

Cela influence la recherche de traces de manière concrètes pour confirmer l’appartenance à la série et pour

atteindre une plus-value d’information ;

3. l’environnement situationnel, ou l’analyse de la situation, permet de repérer des récurrences dans les modes

opératoires ou encore des spécificités sur les lieux. Cette dimension prend en compte la situation du cas

pour comprendre l’interaction entre l’auteur, la victime et les lieux. Cela débouche sur la recherche de

traces pertinentes, par exemple des points de contact ;

4. l’environnement physique concerne la connaissance des mécanismes de formation des traces en fonction

de la nature de la trace, du support, de leur persistance ou de leur capacité de transfert.

Ces quatre niveaux de connaissance s’organisent ainsi de manière hiérarchique, plus ou moins proche du travail

d’investigation sur des lieux ; le niveau physique étant la dimension de la technique appliquée. Il est important

de rappeler que l’investigation d”une scène est la première étape de l’enquête policière car elle précède tout le

processus d’analyse et d’interprétation des résultats (Ludwig et al., 2012; Wyatt, 2014). Les autres dimensions,

englobent plus largement la vision du cas pour détecter des récurrences de modes opératoires ou des liens entre

différentes traces provenant de différents cas.

• Points chauds

• Phénomènes récurrentsCriminalité

• Modes opératoires

• Liens traces-tracesSituation

• Science des traces

• Détection, collectePhysique Trace

Stratégie

Figure 1.3 – Hiérarchie des quatre dimensions du renseignementfigure inspirée de Delémont et al. (2017)

En considérant tel ou tel niveau, les décisions d’enquêtes, d’investigations, peuvent être aiguillées. L’évaluation

d’un constat faisant parti d’un phénomène sériel, ou au contraire étant isolé, amène à une recherche de traces

différentes. En effet, si plusieurs cas ont été liés par des liens spatio-temporels et par un type de trace, les traces

de semelles par exemple, alors un investigateur appelé sur un constat situé dans le même environnement aura

tendance à focaliser sa recherche de trace sur les traces de semelles pour confirmer le lien. Cette information

relative au renseignement permet donc d’aiguiller les recherches de traces, et pour le cas présenté, peut aider à

sélectionner les traces de semelles pertinentes de celles trouvées usuellement sur les lieux.

Le processus d’hypothético-déduction (et par analogie le renseignement) ne permet pas d’expliquer toutes

les étapes décisionnelles. Bien que ce modèle permette de cibler les recherches, il n’explique pas du point de

vu cognitif la prise de décision, relative par exemple à la recherche et à la collecte de telle ou telle trace. En

effet, sur un lieu d’investigation, le facteur humain est à prendre en compte, et ne doit pas être négligé.

C’est pour cela qu’est présenté ci-après un modèle cognitif permettant de compléter la compréhension du

processus décisionnel. En psychologie et science cognitive, beaucoup d’études sont réalisées pour comprendre

l’instant crucial où s’effectue la prise de décision. Étudier la décision revient à comprendre les choix qu’opèrent

6


des personnes lorsqu’elles rencontrent un problème. En science forensique, certains articles étudiant la prise

de décision lors d’une investigation et l’influence des informations transmises aux investigateurs mentionnent

le modèle de la première reconnaissance (de Gruijter et al., 2016a,b, 2017b).

1.3 Les heuristiques

1.3.1 Le modèle de la première reconnaissance

Le modèle de la première reconnaissance (Recognition-Primed Decision – RPD) (Guarnelli and Lebraty, 2014;

Klein, 1993; Lebraty, 2007) décrit comment un décideur se comporte lorsqu’il se trouve face à une situation com-

plexe et qu’il doit prendre une décision ; ce modèle ne tend pas à décrire comment un décideur doit se comporter

face à une telle situation. Il s’agit donc d’un modèle explicatif, descriptif, et non d’un modèle prescriptif.

Ce modèle appartient au courant dit « naturaliste » de la décision (naturalistic decision making) qui peut

également être traduit par l’appellation de « décision de situation ». Ce courant de recherche se focalise sur des

décisions prises dans des situations réelles, complexes, en opposition aux décisions prises dans des environnements

contrôlés (tels que la recherche, l’expertise), où des choix cartésiens peuvent être pris. Dans le courant naturaliste,

les décisions ne peuvent se prendre et se comprendre que dans un contexte donné, celui où la décision a été

prise. Ce modèle porte ainsi sur les situations dans lesquelles des personnes expérimentées travaillent dans des

environnements dynamiques et incertains (Guarnelli and Lebraty, 2014; Lebraty, 2007). Ce courant peut donc

être corrélé aux décisions prises par les investigateurs lorsqu’ils interviennent sur une scène d’investigation 5.

Le modèle de la première reconnaissance est apparu par Gary Klein (1993) qui étudiait les décisions prises

par des sapeurs-pompiers dans leur environnement de travail. Les fortes contraintes temporelles réduisant le

temps de réflexion et de décision, une dynamique de recherche sur l’intuition s’est développée. Il s’agit d’utiliser

l’expérience des intervenants pour éviter les limitations liées aux stratégies décisionnelles analytiques afin de

décider rapidement. Cette théorie se base sur l’évaluation de la situation afin de générer des hypothèses plausibles

et sur une simulation mentale pour évaluer l’hypothèse privilégiée. Trois modes de décision sont considérés :

1. la simple correspondance ;

2. l’évaluation de la situation ;

3. la stratégie complexe.

Le premier mode, le plus simple, est activé quand l’intervenant reconnaît la situation et connaît le plan d’action

à appliquer pour résoudre la situation. Le second mode, de difficulté intermédiaire, est activé lorsque la situation

est reconnue, familière, mais reste vague. Une zone d’ombre est perçue et l’intervenant ne sait pas comment agir

avec exactitude. Le troisième mode, le plus complexe, intervient quand la situation est complètement inconnue.

Dans ce cas, il faut que l’individu procède à une forte simulation mentale pour établir un plan d’action. Le

niveau de formation et le cumul des expériences propres à chacun jouent un rôle primordial dans la perception

de la situation et donc du niveau de décision adéquat.

Sur une scène d’investigation, les modes décisionnels 2 et 3 sont rencontrés. En effet, des investigateurs novices

seront initialement confrontés à des situations inconnues, bien qu’ils aient été formés, alors que les investigateurs

ayant plus d’expérience auront connaissance des procédures et des protocoles plus aisément pour faire face à

des situations familières. Par exemple, Baber and Butler (2012) ont constaté que les investigateurs novices se

concentraient sur les traces qui pourraient être liées au crime dans le but de reconstruire l’évènement, alors

qu’au contraire, les investigateurs avec plus d’expérience se concentreraient davantage sur les traces qui pour-

raient servir de preuve, par exemple celles qui permettraient d’être associées à une source. L’expérience acquise

5. Ce courant ne s’applique donc pas aux décisions prises lors de l’analyse de traces ou d’expertises en laboratoire.

7


permettrait de mieux appréhender les lieux en ciblant plus précisément les endroits « traçogènes ». L’impact de

la décision dépend donc fortement de la compréhension de la situation et de l’expérience de l’investigateur.

L’étude de Baber and Butler (2012), qui complète celle de Chi (2006), indique que les investigateurs ayant

plus d’expériences détectent et perçoivent des caractéristiques différentes que des investigateurs novices. Aussi,

leur capacité d’abstraction face à une situation est augmentée pour les personnes ayant plus d’expérience. Au

contraire, les expériences cumulées tendraient à supplanter les connaissances théoriques apprises et enfermeraient

la personne dans ses habitudes, laissant place à de plus grands risques de biais. En effet, l’expérience engendre

le développement d’heuristiques (raccourcis). La situation conventionnelle n’est plus considérée qu’au travers

des expériences passées, ce qui tend à minimiser la prise en compte de la singularité de la situation.

Le processus de compréhension d’une situation constitue ainsi un aspect important de la prise de décision. Trois

phases sont détaillées pour associer la compréhension d’une situation à une prise de conscience (Endsley and

Garland, 2000) :

1. la perception des éléments de l’environnement dans le temps et l’espace ;

2. la compréhension de leurs significations ;

3. l’anticipation de leur évolution future dans le temps et l’espace.

Un individu qui saisit les trois niveaux est considéré comme une personne ayant une bonne compréhension d’une

situation. Le niveau de conscience varie selon les individus, en fonction de leurs expériences respectives et de

leur formation. Cependant, ces deux facteurs ne peuvent pas intervenir seuls pour comprendre une situation

et justifier les choix réalisés. Les décisions font appels à une partie de subjectivité propre à chaque individu,

qui s’appuie sur les expériences de chacun. Dans le cas précis, cette part de subjectivité renvoie à la notion

« d’intuition », notion centrale du modèle de la première reconnaissance.

1.3.2 L’intuition

D’ordinaire, justifier un choix par l’intuition engendre beaucoup de questionnement à l’égard de la légitimité

de celle-ci. Une décision basée sur l’intuition est généralement assimilée à un manque de confiance du fait de

l’absence d’éléments scientifiques la soutenant.

Au contraire, les études menées en psychologie cognitive définissent l’intuition comme une connaissance basée

sur l’expérience (Klein, 2004). La connaissance de ces expériences et leur intégration par le cerveau stimuleraient

la partie inconsciente du cerveau qui évaluerait une situation rapidement, tacitement. L’intuition se construisant

au travers des expériences passées, stimulerait inconsciemment un réseau neuronal qui se déclenche face à une

situation inhabituelle pour prendre des décisions.

Une décision intuitive suit le processus cyclique présenté en figure 1.4 (Klein, 2004) 6. Face à un problème,

l’observation de la situation génère des repères. Une fois associés à des références connues (le modèle) liées aux

expériences et à la théorie, une action peut être entreprise. Une part de l’action est liée aux hypothèses initiales

que posent les investigateurs. Selon les informations qu’ils ont reçues et les hypothèses posées, la démarche

investigative est modifiée. C’est ce qui entre dans la catégorie « simulation mentale » présentée. L’autre catégorie,

« schémas mentaux » correspond à l’évaluation des décisions à prendre, en considérant les hypothèses.

Bien qu’au final l’intuition soit basée sur l’expérience et ait des valeurs objectives plus solides qu’il n’y paraît,

plusieurs causes peuvent expliquer pourquoi l’intuition n’est pas mise en avant pour justifier des décisions

(Guarnelli and Lebraty, 2014) :

• bien que basé sur les expériences, la formation et la compréhension de la situation, le mécanisme de pre-

mière reconnaissance lié à l’intuition est extrêmement rapide, voire instantané. Ce mécanisme inconscient

est difficilement justifiable du fait que le décideur lui-même éprouve des difficultés à l’expliquer ;

6. Il peut être remarqué que ce modèle rejoint le raisonnement par hypothético-déduction.

8


• l’intuition est à l’opposé du raisonnement fondé, cartésien. Or, ce dernier est spécifique aux sciences et est

censé être extrêmement objectif ;

• l’intuition est l’une des limites du raisonnement par analogie 7 qui stipule que si deux situations sont

identiques, il reste toujours la possibilité qu’elles divergent dans un contexte particulier 8. De ce fait,

suivant la situation, la conclusion peut changer. Or, il est difficile d’expliquer le choix de ce contexte par

rapport à un autre si la décision s’est faite à partir de l’intuition.

Actions!

Simulation mentale!

Schémas mentaux!

Situation!

Repères !

Modèles !

Actions!

génère !

reco

nnaissen

t !activent !

affecten

t !

Figure 1.4 – Modèle de la première reconnaissance lors de décisions intuitivesfigure inspirée de Klein (2004)

Par ailleurs, l’intuition présente plusieurs limites (Klein, 2004) :

• les situations trop complexes sont difficilement compréhensibles par le décideur. Or, selon le niveau de

compréhension de la situation, le modèle de l’intuition associé aux évènements peut ne pas être fiable ;

• le manque d’expérience. Bien qu’avec la pratique l’expérience augmente, pour avoir une « bonne intuition »,

il faut que la situation à laquelle le décideur se confronte lui rappelle une expérience passée similaire ;

• les conclusions faites sur les expériences passées sont potentiellement erronées ;

• le trop de confiance en soi. Dans des situations complexes, l’expérience peut aider à se focaliser sur certains

indices, mais il est important de garder l’esprit ouvert à toutes éventualités et ne pas s’enfermer dans une

vision fixe (effet tunnel).

Le modèle de première reconnaissance permet d’analyser et de comprendre les différentes étapes par lesquelles

passe une personne qui doit prendre une décision dans un environnement complexe, lorsqu’elle est confrontée

à des contraintes spatio-temporelles et économiques.

La compréhension de la situation, l’expérience de la personne et sa formation lui permettent d’évaluer une

situation pour prendre une décision en accord avec l’évènement. Ces facteurs sont également associés à la

notion d’heuristiques (d’intuition) qui ne doit pas avoir une connotation péjorative, mais au contraire soutenir

et rassurer l’investigateur lorsqu’il intervient sur une scène d’investigation pour sélectionner des traces.

7. Le raisonnement par analogie est une forme particulière du raisonnement par induction ; il consiste à s’appuyer sur unecomparaison, ressemblance entre deux situations.

8. Une analogie peut être faite par rapport au niveau de source. Une source peut être identifiée dans un contexte particulier,mais ne le sera pas dans d’autres circonstances.

9


Le processus d’hypothético-déduction, le renseignement et les heuristiques, de par l’intuition, n’englobent

toutefois pas tout le processus décisionnel. Ces concepts s’appliquent sur l’étude de la trace et se pondèrent

selon l’information véhiculée par celle-ci. Pour extraire cette information, il est nécessaire d’étudier la trace

en utilisant différentes méthodes d’analyses, différents tests. L’association d’outils techniques aux outils

cognitifs permet d’asseoir la décision en la consolidant par une base technique, permettant alors d’obtenir

des informations plus objectives.

10

Chapitre 2

Outils techniques :

la trace de sang comme vecteur d’information

"Blood tells, blood always tells."

Dexter

Sommaire2.1 Détection et caractérisation du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.1.1 Brigade canine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.1.2 Observation visuelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.1.3 Méthodes optiques et spectroscopiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.1.4 Méthodes spectrométriques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.1.5 Colorations et réactions chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.1.6 Biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.2 Classification et identification d’une personne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.2.1 Brigade canine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.2.2 Méthodes spectroscopiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.2.3 Méthodes spectrométriques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.2.4 Biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.3 Reconstruction des évènements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.3.1 Association d’une trace de sang à un évènement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.3.2 Datation des traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Les traces de sang fournissent de multiples informations aux forensiciens. Dans un contexte d’investigation, la

présence d’une trace de sang questionne sur son origine, réponse qui fournit potentiellement une information

sur l’action qui l’a générée.

Lors du processus d’investigation, plusieurs étapes nécessitent une prise de décision en fonction de l’information

reçue. Une première information est perçue lors de la recherche d’une trace potentiellement sanglante, et lors

de la confirmation de la nature du fluide à l’origine de la trace. Une décision doit ensuite être prise quant à son

prélèvement. En fonction des différents prélèvements et de leur localisation, les investigateurs peuvent obtenir

plusieurs informations relatives à la source. Les analyses génétiques permettent d’obtenir des informations liées

au profil génétique de la trace (complet ou non, simple ou de mélange).

11


Ce chapitre permet de faire le point sur ces situations, dans lesquelles une information est extraite de la trace

de sang. Le champ d’étude est volontairement large pour poser le cadre de la recherche et de la problématique,

tout au long du processus forensique lié à l’analyse des traces de sang.

2.1 Détection et caractérisation du sang

Lorsqu’une trace de sang est latente, c’est-à-dire invisible à l’œil nu, elle doit être détectée. Parfois, si la trace

est légèrement visible, elle peut également être renforcée pour augmenter son contraste avec le support.

Ensuite, il est important de caractériser le fluide de la trace comme étant du sang (humain), par le biais d’un test

indicatif au sang par exemple ; le contexte et la localisation de la trace de sang permettent également d’émettre

une hypothèse sur la nature du fluide. La caractérisation de la nature du fluide est souvent nécessaire, d’une

part, aux fins de l’enquête et d’autre part, du fait que les analyses génétiques sont spécifiques à l’ADN humain.

Plusieurs techniques existent pour détecter, renforcer et caractériser les traces de sang. La plupart d’entre elles

peut s’utiliser directement et rapidement sur des lieux d’investigation. D’autres méthodes sont développées dans

une optique de recherche afin de montrer les différents champs d’application possibles de nouveaux appareils.

Toutefois, l’utilisation de ces dernières est rarement applicable sur une scène d’investigation.

2.1.1 Brigade canine

Les odeurs sont générées par certaines molécules appelées composés organiques volatils (volatile organic com-

pounds – VOC). Ces molécules sont détectées par les chiens 9 (Chilcote et al., 2018; de Greeff, 2013; Forbes et al.,

2014; Rust et al., 2016), mais sont toutefois dégradées par les conditions climatiques et environnementales, ce

qui rend leur détection difficile (Forbes et al., 2014; Rust et al., 2016). Les chiens policiers peuvent être appelés

pour rechercher des traces de sang sur des lieux d’investigation situés à l’extérieur ou dans de grands espaces.

Cette possibilité est une alternative à l’utilisation de produits chimiques, tels que le luminol, dont l’application

peut être difficile dans ces conditions environnementales (Dilbeck, 2006).

Les chiens peuvent détecter et marquer des traces de sang qui sont très fortement diluées (cf. tableau 2.1) (Lanz,

2018), ce qui permet de considérer leur utilisation sur des scènes d’investigation en extérieur. Schoon (2013) a

comparé la limite de détection de deux chiens policiers face à deux tests chimiques indicatifs au sang (luminol

et Kastle-Mayer). Son étude montre que la porosité du support est un facteur à prendre en considération. Les

chiens se sont montrés plus performants lorsque le sang était sur des surfaces poreuses, rugueuses.

Support Bitume Céramique Herbe Linoléum Moquettechien 1 0.5 % 0.1 % 0.5 % 0.1 % 0.1 %chien 2 0.5 % 0.1 % 5.0 % 0.1 % 0.1 %

Tableau 2.1 – Limites de détection de traces de sang dilué sur différentes surfaces (Lanz, 2018)Le pourcentage indique le taux de dilution du sang dans de l’eau.

2.1.2 Observation visuelle

Des examens optiques peuvent tout d’abord être effectués par une observation des traces à l’œil nu et au toucher

si le support y est propice. Cette méthode permet de localiser de potentielles traces sanglantes, mais permet

uniquement de voir si une trace est rouge, foncée ou a un aspect sec au toucher (Coquoz and Taroni, 2006b).

9. Les chiens sont utilisés pour rechercher des traces car ils sont 20 à 60 fois plus sensibles aux odeurs que les humains. Ilspeuvent être appelés dans plusieurs cas de figure, tels que la recherche de stupéfiants, d’explosifs ou de produits inflammables, decadavres et de fluides biologiques, ou encore de personnes disparues ou en fuite (Chilcote et al., 2018; Schoon and Haak, 2002).Selon la situation, le chien dispose d’une odeur de référence (comme dans la recherche de stupéfiants ou de cadavres), ou, s’il n’endispose pas, c’est au maître-chien de la définir (comme pour la recherche de personnes disparues).

12

Chapitre 2. Outils techniques : la trace de sang comme vecteur d’information

2.1.3 Méthodes optiques et spectroscopiques

Une trace de sang peut absorber la lumière à 415 nm sur un support en tissu par exemple. Cependant, suivant le

support, comme du tissu noir, cette méthodologie n’apporte pas beaucoup d’information, car le contraste entre

la trace et le support est très faible. Pour renforcer la visualisation de traces de sang sur des supports foncés, il

est possible de les observer en infra-rouge (Finnis et al., 2013). En effet, le sang absorbe les infra-rouges, alors

que les supports ont tendance à les réfléchir ; la trace de sang apparaît alors foncée sur un fond clair.

L’imagerie hyperspectrale 10 peut être utilisée en science forensique pour détecter, voire caractériser des traces

de sang en les différenciant d’autres liquides (par exemple, du café, du vin rouge, de la sauce tomate) (Yang

et al., 2018). Généralement la caractérisation du sang se base sur l’identification du spectre d’absorption visible

de l’hémoglobine, soit entre 400-680 nm (Cadd et al., 2016) ou entre 400-500 nm (Li et al., 2014a). Elle peut

également être utilisée afin de détecter les traces de sang difficilement observables à l’œil nu, lorsque par exemple,

le support est foncé (tissu rouge, noir) (Edelman et al., 2015; Li et al., 2014a).

Plusieurs études ont fait état de l’application de la spectroscopie Raman 11 dans le but de caractériser la

composition du sang humain (Atkins et al., 2017; Enejder et al., 2002; Virkler and Lednev, 2009a). En appliquant

la spectroscopie Raman (excitation à 785 nm) à des traces de sang, Virkler and Lednev (2008) ont pu leur associer

une signature spectrale, avec l’hémoglobine, la fibrine et le glucose comme composants majoritaires.

2.1.4 Méthodes spectrométriques

Cette technique 12 permet de mettre en évidence des différences qualitatives et quantitatives dans la composition

de spécimens sanguins. Elle a, par exemple, été employée pour déterminer la composition du sang et analyser

les composés organiques volatiles émanant du sang (Forbes et al., 2014; Hoffman et al., 2009). Ces deux études

sont également intéressantes dans le domaine de l’identification des odeurs émanant du sang. L’identification de

ces composés permettrait notamment d’émettre des hypothèses sur ce que sentent les chiens, et donc d’aiguiller

les entraînements des chiens policiers quant à la recherche de traces de sang.

Parmi les composants du sang, qu’il s’agisse de sang complet, de plasma ou des cellules sanguines, plus de 180

métabolites et 270 protéines ont pu être détectées et identifiées (Blount et al., 2006; Ojanperä et al., 1996; Palma

et al., 2010; Zukunft et al., 2013). Suite à l’identification de ces molécules, des recherches ont été réalisées pour

différencier des traces de sang d’autres fluides biologiques, tels que la salive, le sperme ou l’urine (Kamanna

et al., 2016; Kusano et al., 2011, 2013).

2.1.5 Colorations et réactions chimiques

Les colorations chimiques 13 sont utilisées pour détecter les traces de sang latentes, c’est-à-dire non visibles à

l’œil nu (sang nettoyé ou quantité de sang insuffisante) et pour renforcer leur visibilité. Parmi ces tests, il existe

entre autres la double coloration de Crowle, le leuco crystal violet, le noir amido, le rouge de Hongrie, le vert

malachite, le test de Kastle-Mayer et l’ortho-tolidine (Forsythe-Erman, 2001; Martin et al., 2010).

10. L’imagerie hyperspectrale consiste à scanner une surface et à associer une information spectrale à chaque pixel de l’image.Le résultat de cette analyse se présente sous la forme d’un « data-cube », constitué de trois niveaux d’information (x et y, lescoordonnées spatiales ; et z, l’information spectrale associée). Par l’analyse des données du data-cube, il est possible d’identifier descaractéristiques spectrales propres à certains fluides (Edelman et al., 2012a,b).

11. Le principe de la spectroscopie Raman repose sur la diffusion de la lumière. Lorsqu’une surface est excitée à l’aide d’unlaser monochromatique, la lumière émise est diffusée, d’une part selon un mode dit élastique, et, d’autre part, selon un mode ditinélastique. Le décalage entre les modes élastique et inélastique pour une longueur d’onde de laser donnée permet de caractériserle matériau composant la surface.

12. La chromatographie permet de séparer les composés d’un mélange, que ce soit du sang complet, du plasma ou du sérum ; lespécimen analysé pouvant être solide ou liquide. Le spectromètre de masse permet par la suite de détecter chacun des composésséparés, et fournit des informations structurales, qui permettent souvent leur identification (Zapata et al., 2015).

13. Ces colorants réagissent par réaction d’oxydo-réduction en présence des atomes de fer présents dans l’hémoglobine.

13


Sur les scènes d’investigation, le luminol 14 est la molécule la plus couramment utilisée, car elle permet de

détecter des traces de sang en très faibles quantités, jusqu’à 1 ng (Espinoza, 2004). Une solution commerciale

du luminol existe, il s’agit du Bluestar Forensic® qui est, selon les recommandations du fournisseur, compatible

avec les analyses ADN (Dilbeck, 2006; Girardet, 2003; Jakovich, 2007).

2.1.6 Biologie moléculaire

Utilisation d’anticorps

Les anticorps sont utilisés pour détecter des traces, telles que les traces digitales, et pour détecter, différencier les

traces de fluides biologiques. Frascione et al. (2012) ont utilisé des nanoparticules paramagnétiques d’oxyde de

fer conjuguées à différents anticorps pour distinguer du sang de la salive lorsque ces deux fluides sont mélangés

sous forme de trace. Concernant le sang, les globules rouges et les globules blancs peuvent eux-mêmes être

différenciés les uns des autres.

Thorogate et al. (2008) ont également pu détecter les érythrocytes et les leucocytes présents dans des traces de

sang par immunofluorescence des anticorps utilisés. Ces derniers ont permis de cibler des molécules spécifiques

du sang et de distinguer ce fluide des deux autres testés, à savoir la salive et le sperme.

Les test immunochromatographiques 15 sont extrêmement spécifiques à une molécule donnée. Selon la nature du

fluide recherché (salive, sang, sperme, urine), il existe plusieurs tests immunochromatographiques disponibles

sur le marché. Par exemple, le test commercial, Hexagon OBTI ® s’applique très localement sur la trace et

permet de confirmer la nature du fluide comme étant du sang de primate en ciblant l’hémoglobine (Johnston

et al., 2008; Schweers et al., 2008; Virkler and Lednev, 2009a).

Afin de différencier des fluides mélangés de natures différentes, il est possible de séparer les cellules provenant

d’une même lignée cellulaire. Cela permet, par exemple, de séparer les lymphocytes (sang) des cellules épithéliales

(sécrétions vaginales). La séparation est possible par coloration cellulaire à l’aide d’anticorps ; les cellules étant

ensuite piégées et isolées dans des capsules (Anslinger and Bayer, 2019) 16.

Analyse des acides nucléiques

À l’aide de techniques d’amplification 17 de l’ADN et par l’analyse de l’ARN messager (ARNm) 18, il est possible

d’identifier des gènes, marqueurs génétiques qui sont exprimés plus spécifiquement dans le sang que dans d’autres

tissus (Ja Hyun et al., 2012). Zubakov et al. (2008) ont par exemple, attribué neuf gènes pour caractériser du

sang complet. Haas et al. (2011) ont eux mis l’accent sur le gène de l’hémoglobine β (HBB) pour différencier

du sang de la salive.

14. Le luminol (3-aminophthalhydrazide) est une molécule cristalline soluble luminescente. Ses propriétés de chimiluminescenceont été décrites pour la première fois en 1928 par H. O. Albrecht et c’est en 1937 que le criminaliste W. Specht a initié l’étudesur le rôle du luminol dans la détection des traces de sang. La réaction du luminol, d’origine lente, est catalysée par les produitsde dégradation de l’hémoglobine dans les traces de sang. Cette catalyse entraîne une chimiluminescence spontanée bleue (425 nm)visible dans l’obscurité (Barni et al., 2007; Bremmer et al., 2012; Martin et al., 2010).

15. Les tests immunochromatographiques sont des tests basés sur l’emploi d’anticorps qui permettent de détecter rapidement laprésence d’un antigène ou d’une protéine dans un spécimen. L’exemple le plus classique du test immunochromatographique consisteau test de grossesse qui détecte la présence de l’hormone chorionique gonadotrope humaine (HCG) dans les urines.

16. L’appareil DEParray™ permet par exemple d’effectuer une telle séparation cellulaire.17. Par réaction en chaîne par polymérisation (Polymerase Chain Reaction – PCR).18. L’ARN messager est une copie transitoire d’une fraction d’ADN. Cette copie est l’intermédiaire entre l’ADN et la protéine

synthétisée ; une fois l’ADN transcrit en ARNm, ce dernier est traduit en protéine. L’ADN est identique dans tous les types cellulaires(hors mutations, chimères) ; c’est l’expression de l’ADN qui change selon le type cellulaire pour assurer les besoins spécifiques dela cellule. En présence d’ARNm dans un mélange, il peut donc être conclu que la fraction d’ADN copiée est exprimée, et que laprotéine est donc synthétisée dans la cellule. Il est donc possible, par analyse de l’ARNm, de déduire l’expression des gènes, laprésence des protéines dans une cellule, et donc de distinguer différents types cellulaires. Les protéines ne sont généralement pasdirectement recherchées car elles sont moins stables que l’ARNm.

14


Watanabe and Akutsu (2019) ont comparé un kit de co-extraction d’ADN, d’ARNm et de micro-ARN (miARN) 19

(kit AllPrep) par rapport aux extractions séparées d’ADN et d’ARN, sur des traces de sang et de salive. Les

résultats des auteurs suggèrent que le kit de co-extraction donne des résultats quasi-équivalents à ceux de chaque

kit d’extraction standard. Il serait dès lors possible d’étudier ces acides nucléiques pour identifier du sang et

le différencier d’autres fluides biologiques. Les auteurs discutent également de la possibilité d’analyser l’ADN

microbien 20 (Choi et al., 2014; Hanssen et al., 2017) ou l’ARN circulaire (circARN) 21 (Liu et al., 2019; Zhang

et al., 2018) pour identifier un fluide biologique, tel que le sang.

Il est également possible d’étudier le taux de méthylation 22 de l’ADN pour identifier un fluide biologique (Kader

et al., 2019). Dans leurs études, An et al. (2013) et Lee et al. (2012) ont pu identifier du sang et différencier ce

fluide de la salive et du sperme. Frumkin et al. (2011) complètent ces études en différenciant le sang de cellules

de peau, de la salive, des sécrétions vaginales, du sperme et d’urine.

La principale limite à l’information reçue lorsque la nature d’une trace supposée sanglante est confirmée,

concerne la spécificité des tests effectués. Ces tests de détection et de caractérisation comportent des faux

négatifs et faux positifs, car le sang de certains animaux, d’autres primates généralement, réagit. C’est lors

des analyses génétiques qu’un résultat définitif est obtenu du fait que ces analyses sont spécifiques à l’ADN

humain. Ainsi, lorsqu’aucun profil ADN n’est obtenu avec une trace déterminée comme sanglante, il peut

être supposé que celle-ci n’était pas d’origine humaine. Pour identifier l’espèce à l’origine de la trace de sang,

d’autres analyses génétiques doivent être effectuées.

Du fait que chaque test possède ses propres seuils de détection et de spécificité, une limite de ces tests se pose

quand plusieurs tests donnent des résultats différents. Dans l’ordre de la procédure, les tests sont appliqués

du moins spécifique au plus spécifique : toucher, tests optiques, chimiques et immunochromatographiques.

Comment interpréter des résultats lorsqu’ils diffèrent selon la séquence utilisée ? Par exemple, si un test

chimique donne un résultat positif, mais pas le test immunochromatographique ? Ou inversement ? Dans ces

cas, l’information est limitée pour l’investigateur qui devra prendre une décision quant au prélèvement de la

trace, ou à son envoi pour une analyse génétique. Lorsque les tests sont appliqués en séquence sur une même

trace de sang, il est également possible que les tests interfèrent entre eux ; le premier test pouvant inhiber

ou activer le second test pour induire des faux négatifs ou faux positifs.

Une dernière limite relative à l’information perçue peut être soulevée. Les tests indicatifs ciblent un seul type

de fluide biologique par analyse. Le problème posé par les traces de sang visibles est que ces dernières aiguillent

rapidement, de par leur couleur (foncée) et leur texture (dure, partie sèche au toucher), vers l’hypothèse

que la trace est de nature sanglante. La même problématique se pose si le test indicatif est effectué après

l’utilisation du luminol pour détecter les traces de sang latentes. De ce fait, seuls les tests ciblant le sang

sont généralement effectués. Or, en cas de mélange de plusieurs fluides, comme par exemple, sang-salive, cas

retrouvé fréquemment avec du sang expiré23, ou sang-urine, le second fluide présent dans la trace ne sera pas

identifié. L’information portée par les résultats est donc incomplète. Des recherches peuvent être effectuées

pour développer des protocoles utilisant les différents kits en cascade, permettant ainsi d’identifier plusieurs

fluides mélangés dans une même trace, tout en réduisant au maximum la détérioration de la trace.

19. Les miARN ont un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en protéines.20. L’ADN microbien correspond à l’ADN présent dans les bactéries qui se retrouvent dans un fluide.21. Contrairement aux autres types d’ARN, tels que l’ARNm ou les miARN qui sont linéaires, les circARN sont fermés et forment

un cercle. Bien que leur rôle ne soit pas formellement connu, il semblerait que ces ARN ne soient pas traduits en protéines.22. Certains facteurs, tels que l’environnement et les habitudes alimentaires, peuvent modifier de façon réversible et transmissible

l’expression de certains gènes (domaine d’étude relatif à l’épigénétique). Ces modifications peuvent s’effectuer par exemple, parl’ajout d’un groupe méthyle (-CH3) sur la cytosine (une des quatre bases formant l’ADN) ; phénomène regroupé sous le terme deméthylation de l’ADN.

23. Ce modèle correspond à l’ensemble de projections résultant de sang propulsé par le flux respiratoire (Esperança, 2019a).

15


2.2 Classification et identification d’une personne

Une fois qu’une trace a été détectée et que la nature du fluide a été confirmée, les investigateurs doivent décider

quelles traces il est pertinent de prélever pour en déterminer leur source. L’identification est un terme utilisé

pour définir l’attribution d’une trace à une source connue. Cette notion est intimement liée à celle de la source,

qui sera développée à la section 4.2. La présente section illustre plusieurs méthodes permettant de classifier et

d’identifier les sources, voire d’individualiser une personne, quel que soit le niveau de la source défini.

Selon le facteur de réduction d’identification, il est par exemple, possible de classifier les traces de sang selon :

• l’espèce animale ;

• le sang menstruel vs. le sang périphérique 24 ;

• le sang d’homme vs. le sang de femme ;

• le sang d’adulte vs. le sang d’enfant.

La différenciation de sang d’enfant, d’adulte, menstruel ou périphérique peut être primordiale pour les inter-

venants. Ces cas se présentent lors de parricides, fratricides ou d’infanticides, par exemple, lorsqu’une grande

quantité de sang est retrouvée sur des draps de lit. La question peut se poser de savoir s’il s’agit de sang mens-

truel ou de sang périphérique qui pourrait être dû à une fausse couche ou à un infanticide. La différenciation

du type de sang permettrait alors d’envisager d’autres hypothèses de travail.

2.2.1 Brigade canine

Il est possible d’entraîner un chien policier pour qu’il compare une odeur de référence avec des odeurs de

comparaison ; le chien indique alors si l’une d’elles correspond à l’odeur de référence. Il s’agit du domaine de

« l’odorologie » (identification lines-up) (Marchal et al., 2016; Schoon and Haak, 2002). Cependant, aucune

recherche faisant état de l’utilisation des chiens policiers pour différencier des traces de sang de différentes

sources n’a été trouvée dans la littérature.

2.2.2 Méthodes spectroscopiques

Zhang et al. (2019) ont montré que les spectres d’émission de sang liquides obtenus par spectroscopie en réflexion

et en transmission diffèrent selon l’espèce animale. Des spécimens de sang de plusieurs espèces animales (singe,

chèvre, porc, furet et humain) ont été analysés à l’aveugle. À l’aide d’une analyse statistique, la différenciation

du sang humain du sang des animaux a été effectuée à 100% par la spectroscopie en réflexion, contre 80% pour

la spectroscopie en transmission.

Il est aussi possible d’utiliser l’imagerie hyperspectrale pour différencier du sang d’humain d’autres espèces ani-

males (Kuula et al., 2012). Dans cette étude, quatre traces de sang d’origines différentes (trois provenant d’êtres

humains et une de bovin) ont été déposées côte à côte sur du denim et analysées par imagerie hyperspectrale

dans le domaine des infrarouges courts (1000-2500 nm). En considérant les différences spectrales, les auteurs

ont pu différencier les différents sangs.

Plusieurs études ont comparé et différencié du sang de différentes espèces animales, dont du sang humain par

spectroscopie Raman (Bai et al., 2016; de Wael et al., 2008; Fujihara et al., 2016; Huang et al., 2019; McLaughlin

et al., 2014a,b; Mistek et al., 2016; Virkler and Lednev, 2008, 2009b, 2010).

Sikirzhytskaya et al. (2014) ont également utilisé le Raman pour différencier le sang menstruel du sang périphé-

rique. Leurs résultats montrent qu’avec du sang séché une nuit, les spectres du sang périphérique présentent des

24. Sang provenant du corps humain, autre que le sang menstruel.

16


pics de plus grandes amplitudes pour le tryptophane, l’hème et les amides tertiaires par rapport aux spectres

du sang menstruel ; inversement, les spectres du sang périphérique présentent de plus petites amplitudes pour le

pic des amides primaires. Enfin, par microspectroscopie Raman, Fujihara et al. (2018) ont permis de différencier

du sang sec d’adulte (moyenne d’âge de 55,8 ± 26,5 ans, [26-87 ans], n=5) par rapport à du sang sec provenant

d’enfant (moyenne d’âge de 3,1 ± 2,7 mois, [0-6 mois], n=5). La présence d’un pic supplémentaire au niveau

du spectre Raman des sangs d’adultes (à 1105 cm-1), assigné à l’acide aminé histidine, semble être un point de

différenciation entre les deux types de sang. Ce pic serait dû au fait que l’hémoglobine fœtale est différente de

l’hémoglobine adulte.

Sikirzhytskaya et al. (2017) ont cherché à distinguer des traces de sang par le genre de la personne. La vi-

sualisation des spectres Raman a montré des caractéristiques spectroscopiques similaires pour les spécimens

issus d’hommes ou de femmes. Cependant, des analyses statistiques poussées (Support Vector Machines – SVM

et Artificial Neuron Network – ANN) ont permis de différencier le genre des traces de sang avec un taux de

précision de 98%.

2.2.3 Méthodes spectrométriques

Curran et al. (2005) et Curran et al. (2010) ont développé une méthode d’analyse de l’odeur humaine par

micro-extraction sur phase solide (SPME) couplée à une GC-MS afin de différencier des odeurs émises par les

hommes et les femmes. Leurs résultats indiquent des différences qualitatives et quantitatives entre les hommes

et les femmes étudiés. Cependant, ces études se basent sur l’analyse primaire des personnes, c’est-à-dire de

l’odeur émanant de la peau, et non du sang. Aucune recherche basée sur l’étude des VOCs issus des traces de

sang n’a été trouvée à ce jour dans le but de différencier la source des traces de sang.

L’utilisation de la spectrométrie de masse s’est également développée dans un domaine défini comme la protéo-

mique qui permet d’analyser les spectres des protéines au niveau de leurs séquences d’acides aminés 25. L’analyse

du protéome 26 dans le sang par spectrométrie pourrait donc permettre de classifier le sang et de distinguer

des différences entre différents types de sang (Aebersold and Mann, 2003; Domon and Aebersold, 2006; Illiano

et al., 2018; Pasini et al., 2010a,b; Patel et al., 2016; Tran et al., 2011).

2.2.4 Biologie moléculaire

Isotypes des protéines

L’électrophorèse sur gel 27 peut être utilisée pour différencier du sang périphérique du menstruel. Les isotypes

4 et 5 de l’enzyme lactate déshydrogénase 28 sont ciblés, car ils se retrouvent principalement dans le sang

menstruel par rapport au sang périphérique (Asano et al., 1972). Divall and Ismail (1983) complètent cette

étude en précisant que les isotypes trouvés sont initialement présents dans les sécrétions vaginales.

Utilisation d’anticorps

Historiquement, les tests de paternité et les prémisses d’identification de sources de sang étaient effectués par

l’analyse des groupes sanguins (Chisum, 1971; Culliford, 1971; Gaensslen, 1989; Rittner and Waiyawuth, 1974).

25. Une protéine peut exister sous diverses formes, variantes, qui diffèrent selon les espèces animales et les individus. Ces variantessont dues aux variations des séquences nucléotidiques et aux modifications post-traductionnelles des ARNm.

26. Le protéome correspond à l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule, portion de cellule ou groupe de cellules.27. Méthode permettant de séparer des molécules (protéines, acides nucléiques) selon leur poids moléculaire ; elle est par exemple,

utilisée pour détecter différents types d’une même protéine, c’est-à-dire les isotypes.28. Enzyme intervenant dans le métabolisme du glucose pour la production d’énergie.

17


Ces tests se basaient sur les capacités d’agglutination des globules rouges en présence d’anticorps ciblant les

antigènes du groupe ABO, principalement.

En comparant l’expression et la distribution de certaines molécules, antigènes dans le sang, il est possible de

différencier les espèces animales. Thorpe and Feizi (1984) ont pu différencier par immunofluorescence du sang

de chien, d’humain, de lapin, de porc, de rat, de singe et de souris. Toujours par immunofluorescence, Thorogate

et al. (2008) ont également différencié dans leur étude du sang d’humain de sang d’autres espèces animales

(furet, lapin, mouton, porc, poulet, rat, souris et vache).

En utilisant l’immunocytochimie 29, Thomsen and Adamzik (1990) ont réalisé des colorations de cellules en

ciblant les antigènes A1, A2, B, H, M et N retrouvés dans des traces de sang. Autrement, Bunai et al. (1999)

ont montré qu’il était possible de détecter les antigènes A et B à partir de traces de sang superposées et de

sources différentes. Dans leur étude, une première trace de sang a été déposée sur une lame chirurgicale et sur

de la céramique. Une seconde trace de sang, de source différente, a été superposée à la première trace après

plusieurs temps de séchages (entre cinq et trente secondes). Sur la quasi-totalité des superpositions effectuées, les

auteurs ont pu colorer, par immunocytochimie, les cellules possédant les antigènes sanguins A et B, permettant

alors de différencier les deux traces de sang superposées.

Gray et al. (2012) ont développé un test immunochromatographique permettant de différencier du sang mens-

truel du sang périphérique en ciblant les métalloprotéinases matricielle 14 (matrix metalloproteinase – MMP) 30

et le récepteur ↵ à l’œstrogène.

Dans l’étude de Holtkötter et al. (2018), les auteurs ont développé un test immunochromatographique, le SERA-

TEC PMB, pour différencier du sang menstruel du sang périphérique en ciblant respectivement l’hémoglobine

et le D-dimère 31. Miyaishi et al. (1996) avaient montré au préalable que le taux de D-dimère dans le sang

menstruel était deux cents fois plus élevé que dans le sang périphérique.

Analyse des acides nucléiques

Par l’analyse de l’ARNm, il est possible de différencier du sang menstruel du sang périphérique. Bauer and

Patzelt (2002, 2008); Jakubowska et al. (2013); Liang et al. (2018) ont montré que les MMP7, 11 et 14 sont

spécifiques à l’endomètre. Dans ces travaux de recherches, les auteurs ont montré que les gènes de ces protéines

sont fortement exprimés lors des cycles menstruels.

L’ARNm peut également être analysé pour différencier du sang d’adulte de sang de nouveau-né. Ballantyne

(2018) et Alvarez and Ballantyne (2006) ont identifié quinze marqueurs et gènes ménagers 32 (housekeeping

genes) permettant de différencier cinq catégories d’âges à partir de traces de sang :

1. les nouveau-nés (d’une heure à trois mois) ;

2. les nourrissons/bébés (de quatre mois à six ans) ;

3. les enfants/adolescents (de sept à dix-sept ans) ;

4. les adultes (de dix-huit à soixante ans) ;

5. les personnes âgées (plus de soixante ans).

29. L’immunocytochimie est une méthode d’analyse et de détection des cellules in situ en les colorant à l’aide d’anticorps,fluorescents pour la plupart. Cette technique nécessite plusieurs étapes, dont la fixation des cellules sur des lames de microscope etl’incubation des cellules avec les anticorps ; un microscope est nécessaire pour visualiser les résultats de la coloration cellulaire.

30. Enzymes responsables de la dégradation des matrices extracellulaires, telles que l’endomètre, la muqueuse utérine.31. Les D-dimères sont des produits de la dégradation de la fibrine lors de la fibrinolyse, processus complexe relatif à la destruction

des caillots sanguins.32. Les gènes ménagers regroupent les gènes servant au maintien de base de la cellule. Ils se retrouvent dans quasiment toutes

les cellules et ont une expression très stable, même en modifiant les conditions environnementales. C’est pourquoi, ces gènes sontgénéralement étudiés lors d’expériences, car ils servent de contrôle.

18


Polymorphisme génétique des séquences répétées – STR

Actuellement, la grande majorité des analyses génétiques se base sur l’étude du polymorphisme de séquences

connues constituées de courtes répétitions de nucléotides (short tandem repetition – STR) (Jakovich, 2007).

L’analyse des STR s’effectue par migration de l’ADN lors d’une électrophorèse capillaire. Selon les kits utilisés

et le cadre légal, plusieurs STR sont analysés pour obtenir un pouvoir discriminatoire extrêmement élevé (Butler,

2005; Jobling and Gill, 2004). En effet, la probabilité que deux individus (hors jumeaux monozygotes et individus

apparentés) aient le même profil génétique basé sur l’analyse des STRs est de 10-13 (Foreman and Evett, 2001).

De nouveaux appareils sont développés afin d’accélérer les analyses. C’est le cas par exemple avec l’IntegenX

RapidHIT™200 ou le Para-DNA system®. Ces technologies se basent sur l’analyse des STRs, réalisable avec

l’utilisation d’un seul appareil, invoquant ainsi sa portabilité et rapidité. Par exemple, l’analyse de prélèvements

de salive prend 90 minutes. Des profils ont pu être obtenus à partir d’ADN issus de lymphocytes (Mogensen

et al., 2013; Verheij et al., 2013). Des tests ont été réalisés sur des traces de sang, sperme, salive et des traces

digitales (Dawnay et al., 2014b; Tribble et al., 2015). Les résultats indiquent que l’ADN présent dans les traces

digitales (traces de contact) peut être analysé avec un tel appareil, mais de meilleurs rendements sont obtenus

avec les traces riches en ADN 33 (Donachie et al., 2015). Ces appareils peuvent également être utilisés lors de

grandes catastrophes pour identifier rapidement les personnes sur les lieux (Turingan et al., 2020).

Séquençage de l’ADN

Frumkin et al. (2011) ont également cherché à différencier du sang périphérique et du sang menstruel en étudiant

le taux de méthylation de l’ADN.

En analysant le taux de méthylation de l’ADN, il serait également théoriquement possible de différencier des

jumeaux homozygotes par leur ADN (Vidaki et al., 2013). En effet, même si les séquences STRs sont iden-

tiques pour des jumeaux homozygotes, l’environnement ou les habitudes alimentaires des personnes ne sont pas

identiques, engendrant alors des modifications épigénétiques.

Il est possible de séquencer 34 des portions définies, codantes ou non-codantes, de l’ADN et d’analyser le po-

lymorphisme d’un seul nucléotide (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) entre les individus (Kumar et al.,

2012; Shendure and Ji, 2008). Cette méthode permet d’être plus spécifique et ainsi d’éviter des erreurs d’inter-

prétation des profils ADN dues aux limitations des techniques d’analyses ADN classiques, telles que l’apparition

d’artefacts dans les profils ADN. C’est pourquoi l’analyse des SNP est de plus en plus préférée aux STR (Amorim

and Pereira, 2005; Berglund et al., 2011; Phillips et al., 2008).

Deux limites peuvent être posées au niveau de l’information transmise par les profils génétiques. La première

est en lien direct avec la limite des tests indicatifs, dans le cas où plusieurs fluides sont à l’origine d’une trace,

mais où seul du sang a été identifié. En considérant l’hypothèse selon laquelle deux fluides sont mélangés

dans une trace, le profil génétique établi ne permet pas d’associer les allèles du profil au fluide biologique. De

ce fait, comment être sûr que certains allèles proviennent exclusivement de sang et non pas de salive ? Les

protocoles actuels ne permettent pas de répondre à cette problématique ; des travaux de recherche pourraient

être entrepris dans ce domaine afin de compléter les analyses génétiques actuelles en ciblant des marqueurs

spécifiques à certains tissus par exemple.

Le second point projette les résultats du profil génétique au niveau de l’investigation. Comment être sûr que

tous les profils génétiques pertinents et en lien avec la scène d’investigation ont été obtenus ? Si tous les profils

33. Les fluides biologiques considérés comme des traces riches sont le sang, le sperme et la salive.34. La méthode de Sanger est la méthode historique du séquençage (Sanger and Coulson, 1975; Sanger et al., 1977). Des nou-

velles générations de séquenceurs ont été développées et ciblent l’ARNm, principalement. Ces techniques se basent également surl’utilisation de bases de données de séquences nucléotidiques. Elles permettent de réaliser le séquençage de plusieurs segments enparallèle et aussi de réduire le coût (Ansorge, 2009; Mardis, 2008; Shendure and Ji, 2008).

19


génétiques indiquent la présence d’une seule personne, est-ce parce qu’une seule personne était présente ?

Ou est-ce parce que des traces de sang provenant d’une autre source n’ont pas été analysées, voire prélevées

ou même découvertes ? La réponse à ce problème se situe lors de la phase d’investigation. Pour y remédier,

il serait intéressant d’être en possession d’une méthode permettant de déterminer le nombre de personnes

à l’origine des traces de sang. L’application de cette méthode avant l’étape de prélèvement des traces de

sang pour les analyses génétiques permettrait d’y répondre. Le raisonnement est posé au niveau des traces

de sang, mais concerne toutes les traces biologiques, dont principalement les traces de contact. Comment

détecter et identifier les différentes sources des traces lors de l’investigation afin de prélever toutes les traces

pertinentes ? Cette information amène donc à s’interroger sur le nombre de sources, sur leur pertinence, et

sur le choix des prélèvements à effectuer sur des lieux.

2.3 Reconstruction des évènements

Sans connaître la source d’une trace de sang, il est toutefois possible d’exploiter les informations mesurées à

partir de cette trace pour comprendre les évènements passés. Il est ainsi, possible de retrouver l’évènement à

l’origine de la trace de sang par la morpho-analyse, et de dater une trace.

2.3.1 Association d’une trace de sang à un évènement

La morpho-analyse des traces de sang (Blood Pattern Analysis – BPA) permet, de par une description de la

forme, de la taille, de la distribution et de la dispersion des traces de sang, de reconstruire les évènements à

l’origine de la formation des traces de sang. Ce domaine est donc susceptible de fournir des informations sur la

production de la trace (distance, trajectoire, position relative, direction de la source de la trace par rapport à

la trace), sur des lieux, sur la victime (sa position, savoir si elle était en mouvement ou si elle a été déplacée),

voire sur le nombre de personnes impliquées (Wonder, 2014). L’International Association of Bloodstain Pattern

Analyts (IABPA) rassemble les experts internationaux du domaine pour standardiser la nomenclature et la

méthodologie de l’analyse des traces de sang (Eckert and James, 1998; Macdonell, 1982).

En discutant avec un expert en morpho-analyse des traces de sang, il m’a été communiqué que les intervenants ne

prélevaient pas forcément les traces de sang là où les quantités de sang sont les plus importantes. Au contraire, ils

regardent dans les autres pièces et au niveau des voies de passage pour chercher des traces de sang qui pourraient

indiquer la présence d’un ou de plusieurs individu-s. Plusieurs situations, découlant de la morpho-analyse des

traces de sang, peuvent orienter la démarche de collecte de prélèvements :

• si du sang est trouvé dans différentes pièces ;

• si dans une même pièce, différents motifs de traces de sang sont identifiés ;

• si les traces de sang ne correspondent pas aux déclarations données par les protagonistes ;

• si les traces de sang sont de différentes tailles.

Le dernier point est intéressant et peut être illustré comme suit. En cas de superposition de traces passives 35,

le diamètre des traces circulaires peut être différent (cf. figure 2.1a). Lorsqu’une goutte de sang tombe à la

verticale sans force impliquée, autre que la pesanteur, le sang liquide s’accumule à l’extrémité de l’objet. Lorsque

l’équilibre entre les forces de tension superficielle de surface et la force de pesanteur se rompt, la goutte de sang

tombe (loi de Tate). À partir d’une certaine hauteur, le facteur limitant la taille de la goutte n’est donc pas le

volume du sang, mais la surface de l’objet source (cf. figure 2.1b). De ce fait, lorsque des traces de sang passives

de diamètres différents sont identifiées, cela peut indiquer que les surfaces sources ne sont pas les mêmes. De ce

fait, différents individus peuvent être supposés.

35. Ce modèle correspond à une trace de sang résultant de la chute d’une goutte de sang formée sous l’action principale de lapesanteur (Esperança, 2019a).

20


(a) Superposition deplusieurs traces de sang

(b) Illustration de la chuted’une goutte de sang

Figure 2.1 – Schématisation de la chute de gouttes de sang depuis un objet d’origine d’épaisseur différenteEn (a) : superposition de plusieurs traces de sang passives de diamètres différents, indiquant donc une origine différente ;

en (b) : les objets présentés en (1) et en (2) sont d’épaisseurs différentes, engendrant des gouttes de sang plus ou moins grosses,engendrant dès lors des traces de sang passives de diamètres différents.

Que la morpho-analyse soit effectuée directement sur des lieux d’investigation ou par l’intermédiaire de

photographies, cette méthode contribue à la sélection de traces de sang pertinentes. Dans des cas complexes,

comme lors d’agressions de multiples victimes ou survenant dans des lieux exigus, il devient difficile d’associer

des groupes de traces sanglantes à différents protagonistes. Afin d’être systématique, il est possible, voire

recommandé, d’effectuer un prélèvement biologique par motif de traces de sang défini. Toutefois, l’appel à

des morpho-analystes sur toutes les scènes d’investigation sanglante n’est à l’heure actuelle pas systématique,

rendant dès lors plus difficile l’exploitation et l’interprétation des différents motifs de sang. Aussi, en présence

d’un nombre élevé de motifs de traces de sang, et donc de prélèvements biologiques, il n’est pas certain que

tous les prélèvements soient envoyés en analyse génétique. Il est alors nécessaire de trier les prélèvements

en leur attribuant une priorité d’analyse. Or, à l’heure actuelle, il est difficile d’attribuer une priorité aux

prélèvements car il n’existe pas de méthode ou de test le permettant.

2.3.2 Datation des traces de sang

La question « quand ? » est importante, car il peut être nécessaire de savoir quand a eu lieu un évènement

pour le placer chronologiquement. La trace de sang a pu être déposée avant, pendant ou après l’évènement. La

datation des traces de sang pourrait mettre en exergue des sources différentes, car si des traces de sang ont été

créées à des moments différents, alors la possibilité qu’elles soient issues de différentes sources est à considérer.

Méthodes spectroscopiques

Les propriétés du tryptophane (acide aminé fluorescent endogène le plus abondant dans le sang) ont permis de

montrer que l’intensité de sa fluorescence diminuait au cours du temps. Des résultats identiques ont été observés

avec des protéines composées de tryptophane, telles que l’albumine (deux tryptophanes) ou la γ-globuline (plus

de dix tryptophanes). Ces tests ont été réalisés sur du sang déposé dans boîtes plastiques de Petri, sur une

période de sept jours (Guo et al., 2012).

Les propriétés de l’hémoglobine peuvent être étudiées au niveau des variations de son signal par spectroscopie

de résonance paramagnétique électronique (RPE) dues au changement de la charge de la molécule (passage de

l’oxyhémoglobine à la méthémoglobine par l’absence du cytochrome b5) (Bremmer et al., 2012).

21


En spectroscopie en proche infra-rouge, Edelman et al. (2012b) ont analysé des traces de sang âgées de trente

jours. Selon leurs résultats, le taux d’erreur de prédiction de l’âge d’une trace de sang âgée de trente jours est

de 8,9%. Ce pourcentage tend à diminuer lorsque les traces de sang sont plus fraîches.

L’imagerie hyperspectrale a été utilisée dans plusieurs recherche pour déterminer l’âge d’une trace de sang.

En analysant par imagerie hyperspectrale des traces de sang âgées de trente jours, Li et al. (2013) arrivent à

déterminer le nombre de jours de séchage avec une erreur de plus ou moins 1,17 jours. Edelman et al. (2012c)

ont pu dater des traces de sang âgées jusqu’à deux cents jours en comparant les spectres liés aux catabolites 36

de l’hémoglobine (hémichromes, méthémoglobines et oxyhémoglobine).

Récemment, Cadd et al. (2018) ont étudié, par imagerie hyperspectrale, la datation de traces digitales ensan-

glantées à l’aide du pic d’absorption à 415 nm (bande de Soret) et le rapport entre les pics à 525 et 550 nm. En

associant une coloration aux traces de sang en fonction des spectres obtenus, les auteurs arrivent à conclure sur

l’âge des traces, allant d’une heure à trente jours.

Les recherches de Doty et al. (2016, 2017) ont montré que les spectres Raman de traces de sang montraient des

pics spécifiques à la dégradation de l’hémoglobine dans le sang. Avec des outils statistiques, il est possible de

déterminer un temps de séchage allant jusqu’à deux ans.

Chromatographie couplée à un spectromètre de masse

Dans les années 1990, des mesures faites en chromatographie liquide à haute performance (high performance

liquid chromatography – HPLC) ont montré la présence d’un pic dont l’aire augmentait avec l’âge de la trace

de sang. La protéine associée à ce pic est toujours dénommée protéine X (Andrasko, 1997; Inoue et al., 1992).

Une autre étude a montré que les quantités de β et γ-globulines augmentaient avec l’âge de la trace de sang

(Rajamannar, 1977).

En ciblant les caractéristiques de l’hémoglobine dans des traces de sang, les protéines sanguines ont été facilement

détectées dans des traces de sang âgées jusqu’à 11 ans (Kamanna et al., 2016). Par HPLC, Seok et al. (2018) ont

identifié deux métabolites présents dans les traces de sang pour déterminer l’âge d’une trace : le L-tryptophane

et l’ergothionéine 37. Leur taux semble diminuer au cours du temps dans des traces de sang, sur une période de

21 jours.

Biologie moléculaire

Le taux de racémisation 38 de l’acide D-aspartique peut être étudié dans la membrane plasmique des hématies,

sachant que ce dernier augmente quand la trace est âgée (Arany and Ohtani, 2011; Brunauer and Clarke, 1986).

L’analyse de l’ARN, plus stable que l’ADN, peut être utilisée pour dater une trace de sang. Le ratio de la

quantité d’ARN β-actinine sur celle de l’ARN 18S diminue au cours du temps. Il est donc mesuré et peut

permettre de dater la trace (Alrowaithi et al., 2014; Anderson et al., 2005, 2011).

Zubakov et al. (2009) ont également pu déterminer neuf marqueurs génétiques, gènes qui sont spécifiquement

exprimés dans le sang. Les quantités associées en ARNm varieraient au cours du temps lorsque le sang est sec.

Il serait également possible de dater une trace de sang en considérant le taux de méthylation de l’ADN (Kumar

et al., 2012; Shendure and Ji, 2008). En effet, plus le vieillissement cellulaire est important, plus l’ADN est sujet

au phénomène de méthylation.

36. Un catabolite est une substance résultante de la dégradation d’une autre molécule.37. Acide aminé naturel dérivé de l’histidine.38. La racémisation fait référence à la proportion d’acides aminés dits lévogyres et dextrogyres contenus dans un mélange.

22


Même s’il existe beaucoup de techniques pour dater les traces de sang, les recherches ne sont pas toujours

entreprises dans des conditions réelles. Pour la plupart, les traces de sang sont réalisées en laboratoire

avec l’ajout d’anticoagulant et ne prennent pas en compte les conditions environnementales auxquelles les

traces de sang sont exposées, alors que les hautes températures accélèrent la décomposition, l’oxydation et

la dénaturation des composés sanguins. D’autres recherches utilisent du sang d’animal39, voire du sang ne

contenant plus de fibrine pour supprimer toute action de la coagulation40 (Wang et al., 2019).

De même, l’intra- et l’inter-variabilité de la composition du sang des personnes sont difficilement prises en

comptes. Or, les variations de composition du sang par rapport aux métabolites, aux substrats ou au fait

que la personne soit malade peuvent influencer les résultats obtenus (Bremmer et al., 2012).

Enfin, les traces de sang trouvées sur une scène d’investigation sont incomplètes, imparfaites ou polluées,

alors que les conditions de création de traces de sang en laboratoire sont maintenues dans des conditions

connues, voire contrôlées. L’historique et les conditions initiales de production d’une trace de sang sur une

scène d’investigation ne sont pas connus.

Travailler avec des fluides biologiques entraîne de multiples questions quant à la reproductibilité des expé-

riences réalisées. Avoir l’opportunité d’appliquer une méthode développée en laboratoire sur des traces de sang

provenant de réelles scènes d’investigation est une étape indispensable avant une application opérationnelle.

39. Généralement du sang de cheval, de vache ou de porc.40. Il est possible d’enlever la fibrine sans modification chimique du sang, par simple centrifugation du sang.

23

Chapitre 3

Influences des informations perçues

« Les influences qu’on n’arrive pas à discerner sont les plus puissantes. »

Gustav Meyrink

Sommaire3.1 Étapes de décision lors de l’investigation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.1.1 Collecter les traces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.1.2 Analyser les traces collectées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.2 Informations perçues par les investigateurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.2.1 Informations d’enquête . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.2.2 Informations forensiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.3 Risques de biais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.1 Étapes de décision lors de l’investigation

Lors de l’investigation d’une scène d’investigation, plusieurs décisions sont à prendre (Bitzer, 2016) :

1. la décision de se rendre sur les lieux d’investigation ;

2. la décision de chercher des traces ;

3. la décision de collecter les traces ;

4. la décision d’analyser les traces collectées ;

5. la décision d’utiliser les traces dans l’enquête ;

6. la décision de chercher l’information transmise par la trace dans une banque de données ;

7. la décision d’utiliser la trace lors du procès.

Cette recherche de doctorat cible les points 3 et 4 (cf. figure 3.1). La décision de collecter ou non des traces

comporte une composante de perception de la pertinence, perception qui est favorablement influencée par

l’obtention d’une information sur la trace, par exemple de sa source. De ce fait, l’étape de tri pour sélectionner

les prélèvements biologiques à envoyer en analyse génétique devrait être fortement simplifiée.

25


Quelle trace prélever ?Application d’un test pour

différencier des sources

?

Quel-s prélèvement-s envoyer ?

Figure 3.1 – Représentation des niveaux de décisions impliqués dans cette recherche

3.1.1 Collecter les traces

Idéalement, pour collecter toutes les traces de sang pertinentes sur une scène d’investigation, il faudrait pouvoir

détecter, documenter et surtout déterminer la source de l’ensemble des traces détectées avant de décider lesquelles

collecter. En déterminant la source des traces de sang directement sur les lieux, il serait alors possible d’estimer

le nombre de personnes à l’origine des traces de sang, de situer la localisation des traces de sang de sources

différentes et donc d’aiguiller les prélèvements biologiques.

En présence d’un grand nombre de traces de sang sur des lieux, l’investigateur peut être confronté à se demander

quelle trace il est nécessaire de tester. Afin de réduire cette incertitude, il faudrait idéalement tester l’ensemble

des traces de sang en un minimum de fois possible. Cette remarque soulève la notion du pouvoir couvrant de la

méthode, c’est-à-dire le nombre de traces de sang qui peut être testé en une seule application du test.

L’utilisation d’un spray, d’un laser ou d’une caméra permettrait de recouvrir aisément l’ensemble des traces de

sang en une étape, et donc de réduire les moments décisionnels relatifs au choix des traces de sang à tester. Au

contraire, une méthode qui nécessite d’effectuer un prélèvement d’une trace de sang pour l’analyser rajoute de

multiples points décisionnels pour chacune des traces de sang.

Afin de décider quelles traces collecter, l’investigateur se base sur leur qualité, leur pertinence ou encore les

ressources matérielles à disposition. L’étape de collecte impose donc un compromis sur le nombre de traces de

sang à prélever, entre trop de traces et pas assez.

26

Chapitre 3. Influences des informations perçues

3.1.2 Analyser les traces collectées

Une fois les traces prélevées, elles sont soit analysées, soit conservées à toutes fins utiles. Les traces conservées

peuvent être analysées plus tard, si les premières analyses ne donnent pas d’information utile, par exemple. En

effet, en raison de contraintes de temps, matérielles et financières, il n’est pas possible de toutes les analyser

(Bitzer, 2016; Ribaux et al., 2010). Une étape importante de tri doit donc être réalisée en associant une priorité

à chaque trace. Ces priorités permettent de savoir quelles traces doivent être analysées en premier, et quelles

traces en dernier. Cela permet d’obtenir le plus rapidement possible une information nécessaire pour l’enquête.

Les priorités dépendent du type de la trace, du support sur lequel elle a été récoltée, ou encore de sa localisation

(en distinguant par exemple les traces laissées par une contamination des lieux de celles laissées par l’activité

délictueuse).

Certaines traces peuvent être analysées en interne, telles que les traces digitales ou les traces de semelles, mais

d’autres doivent être envoyées à des laboratoires externes. C’est le cas par exemple pour les prélèvements bio-

logiques. Lorsque plusieurs prélèvements sont effectués, la gravité du cas conditionne le nombre de prélèvement

envoyé en analyse génétique. Si les premières analyses ne permettent pas d’obtenir de profil génétique, si ce

dernier n’est pas interprétable, ou s’il n’est pas pertinent à l’enquête, alors d’autres prélèvements biologiques

peuvent être envoyés par la suite. Cette manière de procéder permet de ne pas envoyer simultanément tous les

prélèvements biologiques.

Dans sa thèse, Bitzer (2016) ajoute la notion « d’utilité » au modèle de Ribaux et al. (2010) dans lequel elle

définit l’utilité comme la valeur ajoutée en termes d’information sur l’affaire. Anticiper l’utilité d’un indice

permettrait de guider la décision d’analyser une trace.

À chacune de ces étapes, des risques de biais existent. Comme indiqué précédemment, ces biais s’expriment par

les émotions, qui interviennent toujours avant la prise de décision. Comme il n’est pas possible d’exclure tous

les biais, il est donc important d’en avoir connaissance et d’en être conscient pour réduire leurs influences.

3.2 Informations perçues par les investigateurs

La science forensique, faisant intervenir une personne humaine, est inévitablement prédisposée aux biais. Tous

les biais ne sont toutefois pas à proscrire. Ceux qui augmentent le risque d’erreur, tels que les préjugés sur

des personnes ou de vérifier la comparaison d’une trace avec sa référence en connaissant le résultat, le sont.

Cependant, comme vu précédemment, les biais liés aux heuristiques, qui sont donc inconscients, basés sur des

connaissances et des expériences ne sont pas à péjorer.

Les décisions prises subjectivement ne sont pas moins pertinentes et moins défendables que des décisions prises

objectivement, mais elles sont plus susceptibles aux biais, nommés contaminations ou biais cognitifs (par exemple

les biais de halo, de primauté, d’ancrage). En cela, il est important d’être conscient de ces risques de biais pour

asseoir la décision prise.

Lors de l’investigation de lieux, plusieurs étapes clefs sont sujettes à engendrer un biais chez l’investigateur. Ces

moments sont principalement corrélés aux différents types d’informations perçues par l’investigateur (de Gruijter

et al., 2017b) :

• les informations d’enquête : lors de la communication du cas à l’investigateur qui réceptionne des infor-

mations contextuelles ;

• les informations forensiques :

— liées à la scène d’investigation : lors de son arrivée sur les lieux, l’investigateur prend possession des

lieux et sa perception de la scène aiguille sa réflexion ;

— liées aux traces : lors de la détection et de la collecte des traces.

27


3.2.1 Informations d’enquête

Dans la procédure normale, un investigateur est appelé sur des lieux par un enquêteur, dépêché en premier

sur place. La perception et la compréhension des lieux par l’enquêteur et sa manière de communiquer cette

information à l’investigateur sont susceptibles d’engendrer un biais (Cooley and Turvey, 2007; Ribaux et al.,

2010; Roux et al., 2012; van den Eeden et al., 2016). Ainsi, dès la réception de l’information, soit même avant

d’arriver sur les lieux, l’investigateur peut être influencé, biaisé.

Par exemple, lors de l’intervention sur un cambriolage, l’information transmise peut faire référence à un vol

par effraction et ne pas tenir compte des autres possibilités, telles qu’une escroquerie à l’assurance. Le même

constat peut être relevé pour l’investigation sur une levée de corps, les informations contextuelles données par

l’enquêteur peuvent faire part d’un suicide ou d’une mort naturelle, avant que l’investigateur ait été sur les

lieux. En arrivant sur des lieux, l’investigateur doit donc considérer les hypothèses alternatives. Les hypothèses

posées sont ensuite évaluées selon sa propre perception des lieux et des traces détectées et collectées (Inman

and Rudin, 2000a, 2002; van den Eeden et al., 2016).

Les premières informations données risquent ainsi de biaiser l’investigateur, mais servent toutefois à le condi-

tionner pour son travail sur les lieux. En effet, pour des cas graves, comme des levées de corps, connaître des

informations sur le contexte et sur l’identité de la personne décédée peut être bénéfique pour se préparer et

pour se remémorer des situations similaires.

Dans une étude menée par van den Eeden et al. (2016), la réflexion de 58 investigateurs de scène d’investigation

fût testée en fonction du type d’information transmise avant leur investigation 41 : les informations contextuelles

indiquent un suicide (groupe 1), les informations contextuelles indiquent un meurtre (groupe 2), et sans infor-

mations données (groupe 3 de contrôle). Les résultats ont montré que quel que soit le groupe, la majorité des

participants ont indiqué que leur première hypothèse était un suicide après avoir pris connaissance des quatre

photographies.

À l’issu de l’investigation photographique, les participants ont rendu leurs conclusions et la majorité d’entre

eux a modifié leur hypothèse en meurtre, qui était le bon scénario présenté. Les résultats suggèrent que les

informations contextuelles sembleraient influencer les réflexions, car seuls 26% des participants du groupe 1

(suicide) ont modifié leur hypothèse initiale en meurtre (contre 47% suicide et 26% ne se prononcent pas) 42.

Autre point intéressant de l’étude, les auteurs ont montré en parallèle que les participants du groupe 2 (meurtre)

ont collecté et sécurisé plus de traces que les participants du groupe 1 (suicide). Cependant, leurs résultats ne

montrent pas de différences significatives entre le type de trace collecté et l’hypothèse émise initialement. Cette

étude, associée aux travaux de Cooley and Turvey (2007) permettent de montrer qu’il existe un risque de biais

lors de la prise d’informations contextuelles avant l’intervention sur la scène d’investigation. Ce biais se carac-

tériserait par un mécanisme conscient ou inconscient qui contaminerait la réflexion objective de l’investigateur.

Bien qu’il soit important d’être conscient de ce risque de biais, ce dernier se manifesterait principalement lors

de la prise d’information et de la détermination des hypothèses, et moins au niveau de la recherche et de la

collecte des traces. Or, c’est dans ces domaines que se pose la problématique liée à la décision du prélèvement

de la trace pertinente. La partie ci-dessous explore les risques de biais liés à la collecte des traces, lorsqu’il est

possible d’obtenir un résultat d’analyse et de comparaison de traces, directement sur la scène d’investigation.

41. Les 58 participants ont travaillé à partir de quatre photographies.42. Pour le groupe 2 (meurtre) : 42% meurtre, 37% suicide et 21% ne se prononcent pas ; pour le groupe 3 (groupe contrôle) :

60% meurtre, 30 % suicide et 10 % ne se prononcent pas.

28

Chapitre 3. Influences des informations perçues

3.2.2 Informations forensiques

Pour formuler des hypothèses, l’investigateur se repose sur sa compréhension de la situation, de ses expériences,

de sa formation et des résultats obtenus. La détection (ou non) de traces dépend des outils et de la méthode

appliquée. Le recul scientifique permet d’assurer un très haut niveau de confiance dans les méthodes utilisées

aujourd’hui. Cependant, l’interprétation liée à la détection (ou non) des traces peut entraîner un changement

des hypothèses.

Usuellement, ces hypothèses sont réévaluées lorsque les résultats des analyses des traces parviennent aux inves-

tigateurs. Les informations transmises par la trace, telles que l’information de sa source, sont primordiales pour

les forensiciens pour reconstruire les évènements et pour donner des informations d’enquête quant à l’identifi-

cation d’une personne. Toutefois, les informations d’identification ne seraient pas systématiquement intégrées

aux hypothèses posées. L’information perçue serait principalement intégrée si les résultats sont conformes aux

attentes des investigateurs, qui chercheraient plutôt une confirmation de leurs hypothèses. Ces informations

influenceraient alors le travail des investigateurs sur les lieux quant à la recherche de traces pertinentes et à la

reformulation des hypothèses (de Gruijter et al., 2016b, 2017a).

Plusieurs techniques ont été développées pour être déployées sur des lieux afin d’y analyser directement des

traces. Dans le cadre d’identification de personnes, peuvent être cités des appareils portatifs permettant des

analyses génétiques, tels que le RapidHIT™(Hennessy et al., 2014; Holland and Wendt, 2015; LaRue et al., 2014)

ou le ParaDNA® (Ball et al., 2015; Dawnay et al., 2014a,b), ou permettant d’analyser et d’envoyer une trace

digitale dans une banque de données (de Gruijter et al., 2016a; Kurpershoek, 2009). Bien que pouvant être

employés sur des lieux, ces appareils ne le sont que très rarement car leur prix peut être dissuasif et les temps

d’analyse, même in situ peuvent être relativement longs pour le travail quotidien.

Une étude initiale menée en 2016 a permis de montrer l’influence de tels appareils (de Gruijter et al., 2016a)

lors de la première phase d’investigation, liée à l’exploration visuelle de la scène d’investigation. Les auteurs

ont déduit que les appareils d’identification rapide n’étaient initialement pas utilisés pour cette fonction. Les

participants de l’étude semblaient se concentrer davantage sur les performances techniques plutôt que sur l’uti-

lisation de l’information transmise. Par exemple, les investigateurs ayant la possibilité d’utiliser un appareil

d’imagerie hyperspectrale pour détecter des traces de sang sur des supports foncés, voulaient l’utiliser ; alors

que les personnes n’y ayant pas accès, ne prévoyaient pas de chercher des traces de sang sur les supports foncés.

À partir d’autres scènes fictives, d’autres études se sont intéressées à l’influence qu’apportait l’utilisation de

ces appareils durant toute l’investigation (de Gruijter et al., 2017a,b). Les intervenants ont été divisés en deux

groupes, dont l’un pouvait utiliser des appareils d’identification rapide, alors que l’autre groupe n’y avait pas

accès. Les résultats indiquent que les investigateurs se concentraient principalement sur les traces qui ont obtenu

une correspondance avec une banque de données ; les sources liées à une personne auraient plus de poids que les

autres. Le type de la trace et sa localisation seraient également des critères importants pour donner un poids

à l’information reçue. Ceci illustre un risque de biais, car dans l’étude menée, les investigateurs ont montré un

certain niveau de sélectivité. En effet, ils ont considéré les traces liées à un criminel connu comme étant plus

importantes que les traces liées à une personne inconnue.

3.3 Risques de biais

Les études de de Gruijter et al. (2016a, 2017a,b) montrent que les investigateurs utilisent l’information selon le

ratio suivant :

• en n’ayant pas accès à l’identification rapide : 60% information forensique et 40% information d’enquête ;

• en ayant accès à l’identification rapide : 77% information forensique et 23% information d’enquête.

29


L’apport d’informations d’identification au début de l’investigation conduit à la reconnaissance d’informations

pertinentes supplémentaires. Lorsque les appareils d’identification rapide ne sont pas disponibles, les investiga-

teurs semblent porter plus d’importances aux informations d’enquête. Lorsque les informations d’identification

sont disponibles, les investigateurs peuvent modifier plus aisément leur réflexion, en fonction des résultats. La

recherche de traces s’en trouve indéniablement impactée ; par hypothèse, elle serait alors plus pertinente.

Il existe cependant un risque de biais lors de l’utilisation des informations d’identification. En effet, dans l’étude

menée par de Gruijter et al. (2016a, 2017a,b), des informations identiques données aux intervenants ont été

interprétées différemment selon que les investigateurs avaient accès aux informations d’identification ou non. Il

semblerait qu’obtenir un retour rapide sur l’analyse des traces dès l’investigation des lieux influence les hypo-

thèses émises par les investigateurs. Ces résultats confirment également que les investigateurs sont influencés par

les informations qui leur sont transmises par les enquêteurs, lorsqu’ils les informent des circonstances du cas. Ce-

pendant, les investigateurs mettraient plus de poids dans les informations d’identification obtenues tardivement

lors de l’investigation. Cette chronologie (présentation du cas par un enquêteur, puis obtention d’information

pendant l’investigation) permettrait d’émettre des hypothèses plus précises et correctes. En effet, les informa-

tions reçues quant à l’identification d’une source permettraient de valider ou de réfuter une hypothèse émise ;

ce qui corrobore l’utilisation du processus d’hypothético-déduction.

En ayant la possibilité de modifier les hypothèses par l’utilisation de telles techniques, l’apport des informations

d’identification a également influencé la quantité de traces recueillies. Les informations d’identification ont

entraîné une réduction du nombre de traces sélectionnées. Du fait que ces informations fournissent déjà une

indication sur la source, voire l’identité d’une personne, le nombre de prélèvements peut être réduit.

Les travaux menés montrent également l’importance de la propre réflexion des investigateurs, et que toute

l’investigation soit menée pour qu’ils se déterminent pleinement sur les hypothèses. Les appareils développés

et utilisés doivent être complémentaires au travail du forensicien. En l’absence d’information d’identification,

la compréhension de la scène d’investigation se base sur les informations d’enquête et l’expérience qui aide

les investigateurs à reconnaître les endroits « traçogènes ».

Les études décrites ci-dessus ont montré que les investigateurs ont un intérêt à utiliser de nouvelles technolo-

gies directement sur les scènes d’investigation. L’identification rapide de l’information transmise par l’analyse

de l’ADN ou des traces papillaires semble aiguiller les investigateurs dans leurs hypothèses et la recherche de

traces. À partir de ces conclusions, le même corollaire peut être envisagé par l’emploi de nouvelles méthodes

permettant l’identification et la différenciation des sources à partir des traces de sang. Il semble intéressant de

développer une méthode pouvant être appliquée sur des lieux pour obtenir des informations d’identification

rapide quant à la source de la trace de sang. Ces informations permettraient de différencier les sources des

traces de sang, et donc d’orienter les hypothèses et les prélèvements biologiques.

Par rapport à la décision de prélever telle ou telle trace de sang, il n’existe actuellement pas de moyen

technique applicable directement sur les lieux. La décision dépend alors des autres moyens d’analyses et des

heuristiques, mais n’est pas supplée par un moyen technique. Développer une méthode applicable sur des

lieux d’investigation permettrait alors de compléter le panel d’outils à disposition des investigateurs pour

les aiguiller, les conforter dans leur prise de décision. Les trois dimensions présentées à la figure 1.1 seraient

alors combinés pour conforter la prise de décision.

30

Deuxième partie

Question de recherche

31

Chapitre 4

Paradigmes forensiques

« L’Intuition. Cette faculté prodigieuse à saisir les indices les plus subtils, ceuxque personne n’aperçoit. »

Jean-Claude Lalanne-Cassou

Sommaire4.1 La trace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.2 La source . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4.2.1 Lien trace/source . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4.2.2 Niveau de la source . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Ce chapitre explique le contexte forensique dans lequel se trouvent les investigateurs qui sont amenés à prendre

des décisions sur des lieux d’investigation ; décisions qui concernent majoritairement l’élément central de la

science forensique, la trace. À la trace se rajoute la notion de la source, qui va définir la base de cette recherche,

car selon sa définition et le niveau de source choisi, le seuil de spécificité de la technique varie.

4.1 La trace

Suivant le niveau d’information, Margot (2014) définit plusieurs sens, qui peuvent être ambiguës. La trace, ici

matérielle, est « une marque, signal ou objet, [...] un signe apparent (pas toujours visible à l’œil nu), le vestige

d’une présence et/ou d’une action à l’endroit de cette dernière. » La dimension temporelle, notion fondamentale,

est à associer à l’existence des traces. Le temps qui passe dégrade inévitablement la trace créée et il est impossible

d’estimer cette variable. Selon l’environnement dans laquelle elle se trouve, la trace est plus ou moins rapidement

dégradée, modifiée.

Dulong (2004) décrit que la trace existe en tant qu’objet, de manière réelle, indépendamment de l’observateur,

car la trace existe qu’elle est été détectée ou non, qu’elle est été collectée ou non. Lorsqu’elle est détectée, Dulong

(2004) parle « d’invention » de la trace et définit deux critères pour qu’une trace soit découverte 43 :

1. que la personne qui la perçoive soit compétente à lire ce type de traces ;

2. que l’investigateur soit dans un contexte stimulant.

43. Ces deux critères rejoignent les trois phases décrites à la page 8 en lien avec la compréhension d’une situation du modèle dela première reconnaissance.

33

Partie II : Question de Recherche

Il est ainsi aisé d’assimiler l’importance de la compréhension d’une scène d’investigation, d’où découlent la

compréhension des traces, leur recherche, puis la décision à prendre quant à leurs prélèvements. La signification

de la trace dépend du contexte dans lequel elle est trouvée et de sa compréhension. Il survient alors le risque de

mal la comprendre ou de lui associer une interprétation différente. C’est pour cela qu’il faut que les investigateurs

s’appuient sur une formation solide et sur leurs expériences passées. Le professionnalisme des investigateurs agit

sur la valeur de l’analyse de la trace.

Cependant, il est rare, voire impossible de détecter toutes les traces sur une scène d’investigation. En effet, la

limite de détection et la spécificité des techniques, qui sont certes extrêmement élevées, ne sont pas infinies. Un

doute perdure donc toujours quant à savoir si toutes les traces d’intérêt ont été détectées.

La décision de sélectionner les traces se limite aux traces détectées et n’est donc pas globale ; la question de la

sélection des traces se pose dès qu’une trace a été détectée. Prendre la décision de collecter une trace influence

grandement la suite du processus forensique. Une trace n’apporte un sens que si l’information perçue est réinsérée

dans le contexte dans lequel la trace a été trouvée.

Lors de l’arrivée d’investigateurs sur des lieux, l’une des premières étapes est de détecter les traces laissées

par l’activité délictueuse. La découverte des traces, assimilée à l’invention des traces par Dulong (2004),

permet ainsi d’aiguiller la recherche et la réflexion sur les traces pertinentes et d’acquérir des signes, voire

des indices par l’exploitation de l’information transmise par les traces.

Suivant les caractéristiques intrinsèques de la trace, le niveau de l’information peut être défini pour positionner

le niveau de l’interprétation du résultat, soit au niveau de la source, de l’activité ou du crime. Dans cette

recherche de doctorat, la question ciblant la discrimination de personnes des traces de sang impose de rester

au premier niveau d’information, à savoir la source. En effet, cette question ne permet pas de se prononcer

sur les deux autres niveaux.

4.2 La source

4.2.1 Lien trace/source

Il n’existe pas de définition générale de la source. Celle-ci est définie par la question (Inman and Rudin, 2000b).

Une source peut être définie selon différentes relations qui existent entre la trace et la source (Kwan, 1977) :

1. la trace est produite par la source ;

2. la trace est une partie de la source ;

3. la trace est altérée par la source ;

4. la trace et la source sont liées géographiquement.

4.2.2 Niveau de la source

Le niveau de la source permet notamment de définir le lien trace/source au cas par cas et ainsi de répondre à la

question posée. Le processus d’hypothético-déduction part du présupposé que toutes les sources sont initialement

envisagées, puis par un raisonnement de réduction, le nombre de sources est diminué au maximum. Cela suppose

que la définition de la source dépend du degré de spécificité choisi et qu’un certain niveau (ou seuil) de source

peut être admis en préalable. Il est possible de définir la source selon trois niveaux (Kwan, 1977) :

1. un niveau minimum – toutes les sources sont considérées ;

2. un niveau maximum – une seule source est considérée (source individuelle) ;

34

Chapitre 4. Paradigmes forensiques

3. un niveau intermédiaire – selon les classes, sous-classes définies, des niveaux de sources intermédiaires sont

considérés.

Kwan (1977) conclut même que les niveaux minimum et intermédiaire peuvent finalement être combinés, car ils

se distinguent du niveau maximum dans lequel le caractère unique de la source est recherché. Afin de réduire

les hypothèses et sources potentielles, il est nécessaire de montrer des caractéristiques concordantes et l’absence

de caractéristiques discordantes entre la trace et la source potentielle issue d’un matériel de référence. La

détermination de la source de la trace (ou objet au sens large) est définie en science forensique par le terme

« d’identification » (Champod, 2015; Kwan, 1977). L’identification correspond donc à une classification dans

une catégorie regroupant un nombre plus ou moins importants de sources individuelles ; l’identification d’une

source dépend donc du niveau de la source choisi. Dans le cas où le niveau maximum de source est défini et que

l’identification est justifiée, alors il s’agit d’une individualisation.

L’identification d’une source se base sur deux conditions (Kwan, 1977) :

1. l’unicité des caractéristiques ;

2. la constance des caractéristiques.

Principe d’unicité

La première condition est l’unicité des caractéristiques qui permettent de différencier plusieurs sources poten-

tielles à l’origine de la trace. Ces caractéristiques doivent être rares, voire uniques pour permettre de distinguer

une source parmi d’autres. Ce principe sous-entend de facto que les caractéristiques définies doivent faiblement

varier au sein de chaque source (faible intra-variabilité) et au contraire, elles doivent fortement varier au sein

d’une population de sources envisagées (forte inter-variabilité).

Suivant le niveau de la source, il est important de noter que deux sources peuvent être différenciées par un critère

définit, et non par un autre. En effet, il est par exemple possible de différencier du sang de deux personnes en se

basant sur l’ADN, mais pas sur le groupe sanguin (si les deux personnes sont de groupes A). La distinction des

sources est dépendante du niveau de source considéré et du pouvoir discriminatoire de la caractéristique définie.

Par rapport à l’exemple donné ci-dessus, le pouvoir discriminatoire de l’établissement du profil génétique d’un

spécimen de sang est beaucoup plus élevé que celui de la détermination de son groupe sanguin.

Selon Coquoz and Taroni (2006a), le pouvoir discriminatoire d’un examen est « la probabilité d’avoir des éléments

différents en examinant deux éléments pris au hasard dans un groupe donné ». Cette mesure dépend de trois

facteurs :

1. le caractère polymorphe de la caractéristique ;

2. la méthode d’analyse ;

3. la population étudiée (ethnicité et taille de la population).

La mesure du pouvoir discriminatoire permet de chiffrer la capacité d’une méthode à discriminer des observa-

tions en sachant que ces dernières proviennent de sources différentes. La notion du pouvoir discriminatoire est

nécessairement liée à la spécificité et à la limite de détection de la méthode qui est capable de déterminer la

caractéristique définie pour distinguer deux sources différentes.

Principe de constance

La seconde condition est liée à la constance de la caractéristique définie dans le temps. Cette dernière ne doit

pas varier dans le temps, ou rester suffisamment stable sur une période définie. Ce principe pose toutefois une

certaine dichotomie due aux effets du temps et de l’environnement sur une source et la trace. Le principe de

constance peut être défini par deux arguments :

35


1. la constance de la source : les caractéristiques de la source devraient généralement demeurées constantes,

mais il peut être bénéfique que la source soit modifiée au cours du temps, car la source acquiert de nouvelles

caractéristiques qui lui sont propres dans ces conditions environnementales ;

2. la constance de la trace : l’environnement modifie la trace.

La dégradation de la trace ne modifie cependant pas la source, qui reste identique, même si la caractéristique de

cette dernière peut être modifiée. C’est le cas pour la recherche de l’ADN dans des traces de sang. La dégradation

de la trace de sang, de par son environnement ou son âge altère l’ADN, mais ne modifie pas la source même de

la trace de sang, à savoir la personne qui a saigné.

L’évolution d’une caractéristique dans le temps influence fortement l’intra-variabilité de cette dernière et elle

doit systématiquement être prise en compte lors de son évaluation.

Kwan (1977) définit deux critères pour que le principe de constance soit respecté :

1. la standardisation ;

2. l’indépendance.

Le principe de standardisation permet de contrôler que les caractéristiques sont évaluées de manière équitable,

avec les mêmes protocoles et méthodes. En effet, si des divergences (ou similitudes) sont observées, ces dernières

doivent uniquement être dues aux caractéristiques, et non pas aux autres facteurs intervenus lors de l’analyse,

tels que la méthode d’analyse. C’est pourquoi, dans le cas idéal, lors d’une comparaison d’une trace avec une

source de référence, il faudrait que la référence ait été exposée aux mêmes conditions que la trace. Bien qu’il ne

soit pas possible de connaître ces modifications, des tests peuvent être effectués sur la référence pour les simuler.

D’autre part, il est possible d’intégrer les différences observées dans l’intra-variabilité de la caractéristique.

Le second principe réside dans le fait que les caractéristiques définies doivent être indépendantes. L’ajout de

nouvelles caractéristiques n’est pertinent que si elles rajoutent une information bénéfique pour distinguer des

sources entre elles, et donc d’augmenter le pouvoir discriminatoire. C’est le cas pour les analyses génétiques ou

les groupes sanguins ; les caractéristiques (allèle donné ou antigène sanguin) doivent être indépendantes.

Il ressort que les notions de la trace et de la décision peuvent paraître antinomiques car la trace existe

indépendamment de la volonté de l’investigateur . La trace n’est pas le résultat d’un choix mais peut être

considérée comme un « accident » découlant d’une présence ou d’une action. La gestion de la sélection de la

trace nécessite donc que celle-ci ait été détectée, inventée. Le choix de son exploitation, pouvant être perçue

comme la décision de la prélever, est conditionné par la limite des ressources à disposition pour l’exploiter.

Toutes les traces ne pouvant être prélevées, l’investigateur doit effectuer ce choix et se conditionner à prendre

des décisions, qu’il devra expliquer.

Cette prise de décision peut, en fonction des circonstances connues des évènements, reposer sur différentes

conditions dont la visibilité (invisibilité) de la trace, la qualité de la trace, le nombre de traces, ou encore

la pertinence de celles-ci, à savoir la valeur ajoutée d’information utile pour reconstruire le déroulement des

actions.

L’importance de ces critères est d’autant plus haute que l’écart entre le nombre de traces et les ressources à

disposition est grand. En considérant l’exemple des scènes d’investigation sanglantes comprenant un nombre

considérable de traces de sang, il n’est pas possible de prélever toutes les traces de sang ; les ressources (temps

d’investigation, ressources économiques) limitant le nombre de prélèvements biologiques de traces de sang.

36

Chapitre 5

Une recherche de projet ou un projet de recherche ?

« Et à quoi bon exécuter des projets ; puisque le projet est en lui-même unejouissance suffisante ? »

Charles Baudelaire

Sommaire5.1 Contexte général . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.1.1 "The Sheppard murder case" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.1.2 Reprise du contexte actuel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

5.1.3 Portée attendue de la recherche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5.2 Quelle méthode choisir ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.2.1 Critères de sélection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.2.2 Exclusion des méthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.3 Méthode choisie : immunologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

5.3.1 Persistance des antigènes ABH dans les traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

5.3.2 Méthodes similaires dans la littérature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

5.3.3 Niveau de la source considéré dans cette recherche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

5.1 Contexte général

5.1.1 "The Sheppard murder case"

En 1954, Marilyn Sheppard fut retrouvée morte dans sa demeure de l’Ohio (USA) où elle a succombé des suites

de multiples blessures. Son mari, Sam Sheppard fut le suspect principal. Il fut condamné pour meurtre au second

degré la même année, puis fut acquitté en 1966 (AMSEC, 1995; Cooper and Sheppard, 1995; Holmes, 1966).

Au total, trente-cinq coups de couteau furent dénombrés sur le corps de Mme Sheppard, ce qui entraîna une

très grande quantité de traces de sang sur les lieux. Le service de médecine légale effectua à l’époque des tests

sérologiques en laboratoire afin de déterminer le groupe sanguin de certaines traces de sang 44. Sur deux montres

retrouvées sur la scène d’investigation, celle de Mme Sheppard au sol et celle de M. Sheppard dans un sac, la

44. Mme et M. Sheppard étant respectivement de groupe O et A.

37


recherche des antigènes A et B du groupe ABO fut testée, mais les résultats furent non conclusifs. La recherche

des antigènes M, N et S du groupe MNS fut alors effectuée (AMSEC, 1995) ; la présence de l’antigène M fut

confirmée sur les deux montres. Cependant, comme environ 80% de la population caucasienne possédent cet

antigène (Reid et al., 2012b), l’information obtenue n’est pas discriminante.

En 1966 prit place le jugement en appel de l’affaire. C’est à ce moment-là que la défense présenta les conclusions

obtenues par Paul Kirk, criminaliste. Ce dernier avait effectué des tests sérologiques sur d’autres traces de sang :

une sur la couverture de lit et deux situées sur la porte de la garde-robe. Selon ses conclusions, les trois traces

de sang étaient de groupe O, mais l’une des traces de sang retrouvée sur la porte ne provenait pas de la même

source que les deux autres (Cooper and Sheppard, 1995; Holmes, 1966). En effet, il remarqua des différences de

couleur et de temps de réaction lors de l’analyse de ces traces de sang (Holmes, 1966). Ce fut là l’un des indices

qui justifia, entre autres, l’acquittement de M. Sheppard en 1966.

Ce cas présente une difficulté qui demeure d’actualité quant à l’exploitation d’une scène d’investigation pré-

sentant de multiples traces sanguines. La reconstruction des évènements passe en partie par l’identification des

sources des traces de sang. Lors de mort violente, bien souvent, l’hypothèse selon laquelle les traces de sang

retrouvées proviennent de la ou des victimes est formulée. Cependant, il est possible que certaines traces de

sang, potentiellement une minorité, puissent provenir d’autres sources ; possiblement le ou les auteurs. La dis-

crimination, lors de l’investigation, des traces de sang provenant de sources différentes reste une problématique

majeure à laquelle, 65 ans après l’homicide de Marylin Sheppard, aucune solution technique et concrète et n’a

été développée pour aider les investigateurs.

5.1.2 Reprise du contexte actuel

L’investigation relative au décès de Mme Sheppard illustre bien le contexte dans lequel cette recherche de

doctorat se place. Sur des lieux présentant de multiples traces sanguines, les investigateurs doivent effectuer

des prélèvements de ces dernières. En se basant sur plusieurs éléments (localisation des traces, expérience

personnelle, configuration des lieux), l’investigateur décide quels prélèvements effectuer. Il n’est toutefois pas

possible de prélever l’ensemble des traces de sang, car les investigateurs sont soumis à différentes contraintes,

telles que financières et/ou temporelles. Les investigateurs doivent donc prendre des décisions et sélectionner

les prélèvements. Mais comment choisir ? Combien de traces de sang prélever ? Où les prélever ? Un compromis

est de ce fait établi en fonction de chaque cas.

Ces questions restent toujours d’actualité. En effet, un cas récent a permis de se confronter à la complexité

d’une scène d’investigation sanglante 45, dans lequel deux personnes sont décédées. Les circonstances du cas et

les premiers résultats soutiennent les hypothèses d’un huis-clos et de l’homicide d’une deux personnes, suivi par

le suicide de la seconde. L’hypothèse du huis-clos permet de ne pas considérer la recherche de traces d’une tierce

personne. Les traces de sang présentes sont dès lors associées à l’une des deux personnes décédées 46, ce qui

permet de reconstruire les évènements et de les comprendre. Sur cette scène d’investigation présentant de très

nombreuses traces de sang, la question des traces sanglantes devant faire l’objet d’un prélèvement biologique

était très complexe. Les ressources à disposition et le coût des analyses génétiques ont été des freins à l’analyse

de chaque prélèvement biologique. En outre, parmi tous les prélèvements biologiques effectués, comment choisir

ceux à analyser en prioritaire ? Pour ce cas, les premières réponses des analyses génétiques ont été données deux

jours et demi après l’envoi des prélèvements. Or, ces derniers n’ont pas été envoyés le jour même de l’investigation

(environ un jour après le début des investigations), ce qui augmente le délai d’attente des résultats.

Ces situations soulèvent un questionnement inhérent au travail des investigateurs. Une notion de « tri » en deux

temps apparaît : seule une partie des traces détectées fait l’objet d’un prélèvement sur les lieux, et seule une

partie de ces prélèvements est soumise à une analyse au laboratoire. Plusieurs facteurs peuvent influencer ce

45. Ce cas est présenté au chapitre 14, page 155.46. En considérant que les traces de sang sont concomitantes aux évènements.

38

Chapitre 5. Une recherche de projet ou un projet de recherche ?

tri, tels que la gravité du cas ou la pertinence de chaque prélèvement. De ces choix découle l’établissement d’un

niveau de priorité pour chaque prélèvement qui doit également considérer le temps de traitement de l’information

entre l’investigation de la scène d’investigation et le retour des résultats des analyses en laboratoire (phénomène

connu sous le terme de backlog) (Almog, 2006; Ribaux et al., 2010; Robertson, 2003)). Les délais peuvent parfois

être longs, même lorsque la procédure pénale régit le temps de traitement règlementaire (DFJP, 29 juin 2005a).

De telles situations rendent pratiquement impossible l’analyse génétique de l’ensemble des traces. Il n’est pas

possible de savoir si toutes les traces de sang pertinentes ont été prélevées ou analysées. L’information transmise

sur le nombre de sources à l’origine des traces de sang est de ce fait toujours incomplète. À l’heure actuelle,

le nombre de sources des traces de sang retrouvées sur une scène d’investigation ne peut pas être déterminé.

En effet, quel que soit le nombre de sources défini par les analyses génétiques, une question risque toujours de

subsister, à savoir « est-ce que toutes les traces de sang issues de sources différentes ont été prélevées sur la

scène d’investigation ? ».

Comme toutes les traces ne sont pas analysées, d’autres options doivent être considérées. De ces observations

ressort tout l’intérêt à développer une méthode qui permettrait de discriminer des traces de sang selon leurs

sources, directement sur la scène d’investigation. Cette méthode, élément central de cette thèse, permettrait

de renseigner sur la présence de sang de plusieurs sources et de localiser ces différents sangs. De fait, cette

information soutiendrait les investigateurs dans leur décision quant à sélectionner les traces de sang à prélever

et à envoyer en analyse (cf. figure 5.1).

prélèvements sélectifs

analyse ADN

applicationtechnique

différence de réaction

analyse ADN

Figure 5.1 – Représentation de la problématique associée à la discrimination de source des traces de sang

Enfin, le choix des prélèvements des traces de sang n’a pas uniquement pour but de différencier les sources des

traces de sang pour trouver le sang de l’auteur sur la scène d’investigation ; il est en effet possible que ce dernier

ne se blesse pas. Toutefois, il est toujours important pour les intervenants de pouvoir relier un ensemble de

traces de sang à un évènement et/ou à une personne.

5.1.3 Portée attendue de la recherche

Pertinence de la trace de sang

Il peut être difficile de différencier les traces, légitimement présentes dans l’environnement (contamination de

l’environnement) des traces laissées par l’action délictueuse. L’enjeu est important, et il s’exprime sous la forme

d’une notion centrale, la pertinence ; ne sont pertinentes que les traces laissées par une activité en lien avec

l’objet de l’investigation.

Une trace pertinente, qui n’est donc pas une contamination, contient une information sur sa source ; la trace

devient un signe. Toutes les traces ne sont donc pas des signes ; seules celles ayant été jugées pertinentes

deviennent des signes. La signification de l’information transmise est toutefois encore inconnue (Margot, 2014).

Lorsque cette signification est reconnue, le signe devient un indice permettant d’expliquer, avec une certaine

probabilité, la présence de la trace. Une trace devient un signe quand elle est associée à des fins d’enquête, et en

39


indice quand elle permet de reconstruire les évènements. La notion de preuve nécessite un niveau supplémentaire ;

un indice ne peut devenir une preuve que lorsqu’il est utilisé à des fins judiciaires au tribunal. Dans le sens

commun, les distinctions élémentaires entre trace, signe, indice et preuve peuvent être occultées et utilisées

de manière interchangeable. Ces distinctions linguistiques ont une grande importance selon la question qui est

posée, et donc des décisions qui doivent être prises, tant au niveau de la détection des traces, de leur observation

ou de leur interprétation.

La notion de pertinence renvoie à ce qui est logique, approprié, justifié à son objet. Cette notion est perçue comme

une connexion logique, qui fait sens, et adaptée entre un élément et une question dans un contexte précis. Une

étude menée entre différents services forensiques suisses a permis d’associer quatre principales caractéristiques

relatives à leur perception de la pertinente d’un élément dans une situation : son adéquation, sa valeur, la

connexion entre les deux et la logique apparente. La pertinence d’un élément est perçue comme une « mise en

évidence d’une connexion entre deux éléments ou par le caractère adéquat de l’élément ou encore par la valeur

de cet élément » (Hazard, 2013).

Mise dans le contexte forensique, la pertinence d’une trace trouvée sur une scène d’investigation se définit par

des caractéristiques liées à la trace, telles que sa qualité, son lien avec l’environnement et l’information qu’elle

transmet. D’autre part, elle se définit également par des caractéristiques liées au raisonnement associé à la trace

pertinente, telles que les paramètres qui influencent la recherche et l’évaluation des traces pertinentes (modus

operandi, formation, expérience personnelle) et tout le questionnement propre à l’investigateur et à sa perception

de la scène d’investigation (Hazard, 2013). Une trace pertinente constitue ainsi un moyen de faire avancer la

réflexion sur un cas. L’information transmise par la trace est de haut potentiel et a un effet sur le processus de

décision pour prélever et analyser la trace par rapport à une autre.

Dans la perspective de la présente recherche de thèse, la discrimination de traces issues de source différentes

apporte trois informations pertinentes :

1. sur la localisation des traces de sang de sources différentes ;

2. sur le nombre potentiel de sources des traces de sang trouvées sur une scène d’investigation ;

3. sur la sélection des prélèvements à effectuer et à envoyer pour analyse.

Localisation des prélèvements biologiques

En différenciant les trace de sang en fonction de leur source, le choix des prélèvements biologiques est simplifié.

En effet, ils devraient être réalisés sur les traces de sang de sources différentes. Par exemple, l’établissement

des profils génétiques de trois traces de sang provenant d’une même source X ne semble pas nécessaire si

l’information transmise est la même pour les trois traces de sang. Au contraire, dans le cas où deux traces

de sang proviennent d’une même source X mais que la troisième trace de sang provient d’une source Y, alors

l’information récoltée apporte une plus-value considérable. Dans cette thèse, la caractéristique de la source a été

définie par la présence de l’antigène sanguin A. Plusieurs traces de sang peuvent posséder l’antigène sanguin A,

sans toutefois provenir de la même personne. En effet, plusieurs personnes peuvent partager les mêmes antigènes

sanguins (typiquement les personnes de groupe A et AB).

Nombre minimum de sources

En connaissant le nombre de sources différentes, donc potentiellement de personnes différentes, l’information

permet de faire avancer l’enquête, de modifier les hypothèses émises par les investigateurs et de modifier leur

investigation, par exemple en adaptant leur réflexion quant à la recherche de traces et de leur prélèvement.

40


Tri des prélèvements pertinents

Différencier les sources des traces de sang permet enfin de prioriser les prélèvements biologiques pour les analyses

génétiques. Sur les lieux, plusieurs prélèvements de traces de sang sont généralement effectués aux endroits

jugés pertinents. Cependant, pour des raisons de temps et principalement de coûts, tous les prélèvements ne

peuvent pas être analysés. Une liste de priorité est alors usuellement établie afin de savoir quels prélèvements

il est nécessaire d’analyser en premier. En fonction de ces premiers résultats, les prélèvements suivants sont

éventuellement envoyés. Les priorités sont généralement mises sur la localisation du prélèvement et sa pertinence

mesurée par rapport avec l’activité du cas.

La localisation sur les lieux des traces de sang de sources différentes permet de faciliter l’étape du tri des

prélèvements à envoyer en analyse génétique. La méthode permettrait donc de guider le choix en aiguillant les

investigateurs vers les prélèvements les plus pertinents.

5.2 Quelle méthode choisir ?

5.2.1 Critères de sélection

Bien qu’il existe une kyrielle de méthodes permettant d’analyser les traces de sang, et pour certaines d’entre

elles, permettant de distinguer des traces de sang provenant de sources différentes, aucune d’entre elles n’est

réellement adaptée à une application sur les lieux pour orienter la sélection des prélèvements. Il existe donc un

réel intérêt à développer une méthode simple et rapide à appliquer sur les traces de sang.

Outre la manutention, le coût de la méthode et la durée de l’analyse, deux grands facteurs ont été considérés

pour sélectionner la méthode : le pouvoir couvrant et le pouvoir discriminatoire.

Le pouvoir couvrant de la méthode se justifie par la capacité de chaque méthode à analyser un maximum

de traces en une analyse, cela sans avoir recours à un prélèvement préalable. La majorité des méthodes ne

permettent que d’analyser ponctuellement une trace de sang. Parfois, la méthode requiert de prélever la trace

de sang afin de l’analyser. Cette étape soulève une difficulté technique, car cela nécessiterait de sélectionner les

traces à tester, de les prélever, de les préparer pour l’analyse, de les analyser et, selon les résultats obtenus, de

répéter ces opérations pour d’autres traces. La préparation des spécimens sur la scène d’investigation n’est pas

optimale du fait du temps et du matériel nécessaires, ce qui ne permet pas d’envisager une analyse systématique

et exhaustive de toutes les traces.

Le pouvoir discriminatoire de la méthode doit être élevé afin de discriminer des sources différentes. Avec une

application sur les lieux, le pouvoir discriminatoire de la méthode ne peut cependant pas être aussi élevé que

celui des méthodes utilisées en laboratoire, telles que l’analyse de l’ADN. En effet, l’accès au matériel est optimal

en laboratoire ; les contraintes temporelles sont moindres et les spécimens sont plus facilement préparés. C’est

pourquoi il est difficile de concevoir une méthode pouvant analyser sur le terrain plusieurs caractéristiques

intrinsèques à la trace. Les analyses ADN permettent d’analyser simultanément plusieurs caractéristiques 47

engendrant dès lors un très haut pouvoir discriminatoire de la méthode. La valeur du pouvoir discriminatoire

est corrélée à la caractéristique choisie et à la méthode. L’utilisation d’une méthode sur des lieux avec un

pouvoir discriminatoire plus faible n’est en soi pas un frein au développement d’une telle méthode, car le

but est d’améliorer la sélection des prélèvements des traces de sang pour permettre à la méthode utilisée en

laboratoire de déployer toute l’information véhiculée par les traces de sang. Ces deux approches, sur le terrain

et en laboratoire, sont à considérer comme complémentaires.

47. En Suisse, la loi instaure l’analyse de seize marqueurs et de l’amélogénine pour déterminer le sexe génétique (DFJP, 29 juin2005b). En France, la loi instaure l’analyse de vingt marqueurs et également de l’amélogénine (LegiFrance, 10 août 2018).

41


5.2.2 Exclusion des méthodes

En considérant le premier des deux critères établis ci-dessus, à savoir le pouvoir couvrant de la méthode, la

plupart des techniques présentées au chapitre 2 peuvent être écartées, à savoir l’imagerie hyperspectrale, la

spectroscopie Raman, la spectrométrie de masse et certaines des techniques de biologie moléculaire. L’imagerie

hyperspectrale et la spectroscopie Raman peuvent être utilisées directement sur une trace, sans la prélever,

mais les mesures demeurent ponctuelles, à effectuer trace par trace, ou sur une surface restreinte. Les autres

techniques nécessitent quasiment toutes le prélèvement, voire une préparation supplémentaire du spécimen à

analyser. Les configurations techniques de ces appareils excluent donc la possibilité de combiner en une seule

manipulation l’analyse de plusieurs traces, et donc d’analyser une zone importante en peu de manipulations.

Même si la recherche évolue et qu’actuellement certains appareils sont transportables, comme les Raman, les

GCMS ou les appareils permettant d’obtenir des profils génétiques sur site, le pouvoir couvrant est réduit à

l’analyse individuelle de chaque trace. Ce critère a été favorisé par rapport au pouvoir discriminatoire de la

méthode, du fait que la méthode développée doit être applicable sur des lieux.

Par rapport au deuxième critère, le pouvoir discriminatoire de la méthode, ce dernier dépend essentiellement

des composés ciblés par la méthode et recherchés dans la trace de sang. Dans le cas d’une analyse binaire, à

savoir étudier la présence ou l’absence d’un seul composé dans des traces de sang 48, le taux de discrimination

maximum est de 50%. Pour augmenter ce pouvoir discriminatoire, il est nécessaire d’augmenter le nombre de

composés ciblés. Selon la méthode utilisée, plusieurs composés peuvent être analysés simultanément, offrant

dès lors un haut pouvoir discriminatoire en une analyse. Les techniques de biologie moléculaire, par l’analyse

de l’ADN typiquement, permettent d’analyser et de combiner plusieurs caractéristiques (possédant même des

variantes). D’autres techniques, telles que la spectroscopie Raman ou la spectrométrie de masse combinent

plusieurs informations (liées à différentes structures chimiques par exemple), permettant d’obtenir un profil lié

à la mesure faite sur la trace. Une hypothèse peut dès lors être posée, à savoir que les profils obtenus, pourraient

être différents selon les caractéristiques mesurées, et donc différents selon les personnes.

La plus-value d’analyser un spectre de lumière (pour l’imagerie hyperspectrale), spectroscopique ou spectromé-

triques est toutefois contrebalancée par l’influence du support sur lequel est déposée la trace de sang. En effet,

selon le support, tel qu’un support poreux où le sang y diffuse aisément, ces méthodes risquent fortement de

considérer les molécules composant le support et de les intégrer aux spectres obtenus. À l’inverse, si le support

est lisse, et dans le cas où les traces de sang se fissurent, il est possible de prélever un fragment de la trace sans

le support, réduisant fortement la contamination du profil par le support. Des analyses de blancs, spécifiques

aux supports, devraient être effectuées en parallèle pour réduire au maximum les artéfacts des spectres.

Plus le nombre de composés analysés est grand, plus le risque de dégradation d’un certain nombre de ces compo-

sés augmente. Les traces de sang étant exposées aux conditions environnementales, des composés peuvent être

dégradés plus rapidement que d’autres, engendrant des profils, des spectres tronqués, rajoutant une complexité

supplémentaire à l’analyse et à l’interprétation des résultats.

L’interprétation du résultat est bien évidemment un facteur à considérer. Bien que les investigateurs de scène

d’investigation puissent être formés, développer une méthode facilement interprétable est une volonté de cette

recherche. L’utilisation d’un appareil analytique, la nécessité de post-traitements et l’interprétation de profils

complexes sont des facteurs limitants ; de bonnes connaissances en chimie analytique et en génétique peuvent

également être requises.

Par ailleurs, l’appel à une brigade canine semble difficile, car il est impossible à l’heure actuelle de savoir ce que

les chiens sentent et pistent. L’appel à ces derniers augmente potentiellement les risques de contamination sur

les lieux. Enfin, en présence de traces de sang proches, voire confondues localement au sein de motifs de sang

juxtaposés, il ne sera pas possible de distinguer quelles sont les traces de sang de sources différentes.

48. Cette condition impose donc que la caractéristique choisie n’a pas de variantes.

42


Enfin, les derniers facteurs entrant en compte sont la manutention et le coût de la méthode, qui peuvent être

un frein à une utilisation courante dans les services de police scientifique. En fonction de l’information qu’elles

permettent d’obtenir, de leurs avantages et inconvénients, ces techniques ont été classées selon leur potentiel à

être déployées sur des lieux :

1. l’immunologie (anticorps) ;

2. l’imagerie hyperspectrale ;

3. la spectroscopie Raman ;

4. la chromatographie couplée (ou non) à la spectrométrie de masse ;

5. les méthodes biologiques (gels d’électrophorèse, immunocytochimie, analyses génétiques) ;

6. la brigade canine.

5.3 Méthode choisie : immunologique

5.3.1 Persistance des antigènes ABH dans les traces de sang

D’après les recherches bibliographiques et la problématique de cette thèse, l’étude des groupes sanguins semble

prometteuse. Leur présence est corrélée à l’expression des gènes, qui ne varient pas au cours du temps. Les

phénotypes sanguins ne subissent donc pas de modification. La présence de nombreux antigènes sanguins permet

d’étudier des molécules ayant une faible intra-variabilité et une inter-variabilité élevée. D’autre part, les anticorps

ont déjà fait l’objet de recherches en science forensique pour détecter des traces digitales et des fluides organiques

(Akutsu et al., 2012; de Almeida et al., 2011; Drapel et al., 2009; Old et al., 2009; Stewart et al., 2018; Turrina

et al., 2008). Les résultats des recherches de Thomsen and Adamzik (1990), El-Habashi et al. (1991), Bunai et al.

(1999) et Mishra and Yadav (2012) sont encourageants car ils démontrent que les antigènes ne se dégradent

pas rapidement et qu’ils restent détectables plusieurs années dans des traces de sang. Ainsi, si des difficultés

apparaissent quant à la détection des antigènes sanguins, la dégradation de ces antigènes n’en serait pas la

cause principale. Dès lors, la méthode employée et/ou la diminution de l’accessibilité des antigènes seraient

deux hypothèses à envisager.

Parmi les recherches trouvées, celle de (El-Habashi et al., 1991) peut tout d’abord être citée. Par une méthode

d’absorption-élution 49, les antigènes A, B et H ont pu être détectés dans les conditions expérimentales suivantes :

• des températures extrêmes de -4°C et 150°C (les antigènes ont pu être retrouvés dans les traces de sang

congelées et dans 65% des traces exposées à de très hautes températures) ;

• un délai de séchage de six mois (conservés à température ambiante) ;

• l’utilisation de différents textiles ;

• la putréfaction (elle entraîne la dégradation des antigènes sanguins dans 80% des cas après 90 jours).

Une seconde recherche, plus récente, a permis de conforter ces résultats à l’aide de la même méthode d’analyse,

l’absorption-élution des antigènes A, B et H. Ainsi, Mishra and Yadav (2012) ont étudié la dégradation de ces

antigènes dans des traces de sang âgées de trois à douze ans, déposées sur différents supports (coton, bois et

tissu synthétique). Leurs résultats indiquent que :

• sur le coton, les antigènes sont retrouvés après une période de séchage de dix ans ;

• sur des vêtements synthétiques, les antigènes ne sont plus retrouvés au-delà de trois à cinq ans ;

• sur des objets en bois, le délai maximal pour retrouver des antigènes est de cinq à huit ans.

49. La technique d’absorption-élution, ou de fixation-élution, est une technique qui permet de déterminer les groupes sanguinsABO ou pour déterminer des antigènes, anticorps complexes, rares.

43


D’autres recherches ont également pu détecter les antigènes du groupe ABO à l’aide de la méthode immuno-

enzymatique ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 50. Ainsi, Kimura et al. (1993) ont développé un

test de détermination de sang humain basé sur l’ELISA en sandwich Les auteurs ont montré la présence des

antigènes A et B dans des traces de sang, même contaminées par d’autres fluides, tels que de la salive ou du

sperme. Aussi, leurs résultats montrent que ces deux antigènes sanguins peuvent être détectés dans des traces

de sang âgées de six mois. Autrement, par une variante de l’ELISA par compétition, Takada et al. (2014) ont

détecter les antigènes A et B dans des traces de sang (âgées de cinq à dix ans) des groupes A, B et AB.

Kamińska et al. (2016) ont par ailleurs utilisé le Raman 51 pour étudier les interactions entre les antigènes

sanguins du groupes ABO et les anticorps. Ainsi, aux longueurs d’onde d’excitation de 514 et 785nm, les

groupes sanguins A, AB, B et O du sang ont pu être différenciés.

5.3.2 Méthodes similaires dans la littérature

Bien que les études mentionnant l’utilisation d’anticorps impliquent des étapes conséquentes lors de la prépa-

ration des spécimens, l’application des anticorps sur la scène d’investigation peut également être envisagée en

considérant une méthode ne nécessitant pas de prélèvement préalable, ni de matériel encombrant. Il serait ainsi

possible de réaliser des tests sérologiques in situ afin de déterminer le groupe sanguin d’une trace de sang.

Par le biais d’études préliminaires, des chercheurs ont démontré la possibilité de détecter les antigènes du système

ABO en employant une membrane. À l’aide du dot-ELISA 52, Zhou et al. (1990) et Pflug et al. (1989) ont ainsi

pu détecter ces antigènes dans de la salive, des sécrétions vaginales, du sperme, de la sueur et de l’urine. Les

auteurs n’avaient cependant pas testé cette méthode avec du sang.

Également basé sur l ?utilisation d ?une membrane, le kit Phadebas® consiste en l ?emploi de feuilles composées

de substrat pour détecter et localiser les traces de salive sur des textiles. (Hedman et al., 2008, 2011). Lors de

l’application de la feuille, une réaction chimique s’opère et des taches de couleur bleu apparaissent sur la feuille

en présence de l’alpha-amylase 53 dans la trace. Lors de cette procédure, une humidification à l’aide d’un spray

de la feuille et du textile est nécessaire. Cette méthode, de par l’utilisation d’un papier filtre permet d’adapter

la surface d’analyse, adaptant ainsi le pouvoir couvrant.

Pour répondre à la problématique de cette thèse, un test combinant les principes du dot-ELISA et du

Phadebas® a été considéré. Ce test sérologique se baserait sur l’utilisation d’un médium physique sur lequel

une solution d’anticorps aurait été déposée au préalable (cf. figure 5.2). Il serait alors possible d’appliquer le

médium sur une trace de sang afin de visualiser une réaction lors de la formation des complexes anticorps-

antigènes sanguins. En cas d’absence de l’antigène sanguin dans la trace de sang, aucune réaction ne serait

visible sur le médium. Selon le support sur lequel sont présentes les traces de sang, une étape préliminaire

pourrait être effectuée afin de solubiliser localement le sang et améliorer le transfert de la trace de sang sur

le médium.

En considérant le pouvoir discriminatoire, il a été décidé de se concentrer sur l’analyse d’un seul antigène

sanguin. Comme aucune méthode apparentée n’a été trouvée dans la littérature, tout le processus de déve-

loppement est plus aisé et envisageable en considérant initialement un seul antigène sanguin. L’ajout d’autres

50. L’ELISA est une méthode de dosage utilisée en immunologie pour détecter la présence d’un anticorps (méthode ELISAindirect) ou d’un antigène (ELISA en sandwich, ELISA par compétition) dans un spécimen. Elle se base sur l’utilisation d’anticorps,primaires et/ou secondaires, possédant une sonde (tag). La sonde est ensuite détectée à l’aide d’une réaction enzymatique, ou parfluorescence. Les méthodes d’ELISA s’opèrent en utilisant des plaques plastiques composées de puits permettant de contenir lesspécimens et les solutions d’anticorps. De lourdes étapes d’extraction des antigènes sanguins sont toutefois requises, car très peusont solubles dans le sang. En effet, la grande majorité des antigènes est fixée aux structures cellulaires.

51. Par le biais de la technologie SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) qui permet d’améliorer la diffusion Raman parl’utilisation de nanoparticules adsorbées sur des surfaces.

52. Contrairement à l’ELISA classique, cette version permet de fixer les antigènes sur une membrane et non pas dans des puitsd’une plaque en plastique. La membrane sert ensuite de médium physique pour l’immunodétection.

53. L’↵-amylase est une enzyme salivaire.

44


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45


antigènes sanguins pourrait être envisagé à la suite de ce travail de recherche, lorsqu’une méthode de base

aura été établie.

Avec une telle méthode, la manutention de la méthode serait minimale. En effet, peu de matériel est à

transporter et il n’est pas encombrant. Aussi, il existe un nombre très important d’anticorps et de fournisseurs

différents, ce qui permet de les acheter à des prix abordables.

5.3.3 Niveau de la source considéré dans cette recherche

Le sujet de la thèse portant sur la discrimination des traces de sang de sources différentes, il est alors nécessaire

de définir les notions de « trace » et de « source » selon les définitions données en page 34 :

La trace : présence de sang humain visible sur un support ;

La source : individu à l’origine de la trace de sang 54 ;

Le lien trace/sang : la trace est issue de la source ;

La caractéristique considérée : antigène A du groupe sanguin ABO (ISBT 001) 55 présent dans le sang ;

Le niveau de réduction : intermédiaire – tout individu possédant l’antigène A (cf. figure 5.3) 56.

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Figure 5.3 – Illustration des différents niveaux source

Pour cette thèse, les traces de sang sont matérielles, visibles à l’œil nu et d’origine humaine (le sang des autres

espèces animales n’est pas considéré). Lorsque plusieurs traces de sang sont proches, les traces de sang sont

dites mêlées, à savoir que chaque trace de sang est issue d’une source unique, en opposition à des traces de sang

mélangées, où une trace de sang peut contenir plusieurs sangs d’individus différents.

Au niveau du lien trace/source, la relation est associée au point 1 (cf. page 34), à savoir que la trace est

issue de la source. Le point 2 (la trace est une partie de la source) pourrait être considéré a priori puisque

le sang constituant la trace de sang provient du volume sanguin total d’un individu. Cependant, lors de sa

classification, Kwan (1977) semble faire référence à un lien physique observable, tel qu’un fragment ou un

segment qui manquerait à la source et qu’il serait possible d’assembler. Le point 3 (la trace est altérée par

54. En considérant un seul individu à l’origine d’une trace de sang ; les mélanges ne sont pas envisagés dans ce cas présent.55. ISBT : International Society of Blood Transfusion.56. Le niveau minimum serait « tout individu présentant au moins un antigène du système ABO (A, B) ou n’en présentant

aucun » ; le niveau maximum serait « tout individu présentant uniquement l’antigène A du système ABO. »

46


la source) n’est pas non plus considéré car la trace de sang provient directement de la source (l’individu).

Au contraire, il est attendu que c’est la trace qui altère la caractéristique de la source (l’antigène A), car les

modifications physico-chimiques de la trace de sang dues aux conditions environnementales peuvent altérer cette

caractéristique. Enfin, aucun lien géographique n’est montré entre la trace et la source (point 4).

Par rapport à la caractéristique de la trace, le principe d’unicité est lié au fait que l’antigène A peut être

présent ou non chez les individus. Sa fréquence d’apparition dans une population indique que cet antigène

possède un haut pouvoir discriminatoire (cf. chapitre 8). Par rapport au principe de constance, les résultats des

expérimentations menées montrent que l’antigène A est dégradé au cours du temps, mais reste détectable après

un mois dans des traces de sang créées dans un environnement contrôlé en laboratoire (cf. chapitre 9).

La caractéristique de la trace (unicité et constance) permet de définir la spécificité de la méthode développée, à

savoir la détection des antigènes A dans des traces de sang. Cette spécificité permet donc de classer les individus

en deux groupes : ceux possédant l’antigène A et ceux ne le possédant pas. La caractéristique choisie (l’antigène

A) se retrouve donc partagée au sein d’une sous-population. La méthode proposée permet donc d’associer une

trace de sang à une classe de la population, et non d’individualiser la trace de sang à une source unique.

C’est pour cela qu’un facteur de réduction intermédiaire a été choisi. Ce niveau de classification permet de

différencier les individus A/AB des individus B/O (cf. figure 5.3). Afin d’individualiser l’individu à l’origine de

la trace de sang, il est nécessaire d’effectuer une analyse génétique de la trace de sang.

47

Troisième partie

Bases théoriques sur le sang

49

Chapitre 6

Notions biologiques

« Un jour j’irai vivre en Théorie, car en théorie tout se passe bien. »

Pierre Desproges

Sommaire6.1 Composition du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

6.1.1 Compartimentation sanguine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

6.1.2 Fraction liquide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

6.1.3 Fraction solide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

6.2 Interactions antigènes/anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

6.2.1 Antigènes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

6.2.2 Anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

6.2.3 Liaisons entre antigènes et anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

6.3 Groupes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

6.3.1 Classification et fonction des antigènes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

6.3.2 Système ABO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

6.3.3 Établissement du groupe sanguin en transfusion sanguine . . . . . . . . . . . . . . . 63

6.1 Composition du sang

6.1.1 Compartimentation sanguine

Le sang est un fluide circulant dans les vaisseaux sanguins. Il assure le renouvellement du liquide interstitiel 57

et le maintien de l’homéostasie, qui est l’aptitude d’un organisme à conserver son équilibre fonctionnel. Plus

précisément, le sang assure le transport de la chaleur, des gaz, des hormones et des nutriments dans un orga-

nisme ; il a également un rôle dans la coagulation, l’immunité et le maintien des équilibres osmotiques entre les

différents compartiments (Richard et al., 2010).

57. La répartition hydrique d’un organisme est divisée en deux principaux compartiments : les milieux intra- et extra-cellulaires.Le milieu intracellulaire représente le liquide contenu dans la cellule, il est donc limité par la membrane plasmique. Le milieuextracellulaire correspond au liquide contenu en dehors des cellules. Il se divise en deux groupes : le liquide plasmatique contenudans les vaisseaux sanguins et le liquide interstitiel qui comprend la lymphe et les liquides non canalisés, donc les liquides danslesquels baignent les cellules.

51

Partie III : Bases théoriques sur le sang

Le sang circule dans des vaisseaux sanguins : les artères, les veines et les capillaires. Les artères transportent le

sang du cœur aux organes ; de ce fait, elles transportent majoritairement du sang riche en oxygène, à l’exception

des artères pulmonaires qui contiennent du sang riche en dioxyde de carbone. À l’inverse, les veines transportent

le sang des organes au cœur ; elles contiennent donc du sang riche en dioxyde de carbone, à l’exception des

veines pulmonaires qui transportent du sang oxygéné. Les capillaires sanguins sont situés au niveau des organes

et constituent un filet où s’effectuent les échanges gazeux entre le sang et les cellules (Richard et al., 2010).

Le sang est un tissu mésenchymateux 58 d’environ quatre-cinq litres, rouge, composé d’une fraction liquide et

d’une fraction solide (cf. figure 6.1). La fraction liquide correspond au plasma et représente environ 55% du tissu

sanguin. La fraction solide, soit les 45% restants du volume sanguin, regroupe les éléments figurés sanguins 59,

tels que les érythrocytes, les leucocytes et les thrombocytes (Lu et al., 2014; Sébahoun, 2005).

Figure 6.1 – La compartimentation sanguinefigure inspirée de Richard et al. (2010)

6.1.2 Fraction liquide

Le plasma est le liquide du sang ; ce dernier est constitué entre autres d’éléments chimiques, d’électrolytes,

d’hormones, de nutriments, de protéines. Les trois principales protéines retrouvées dans le plasma sont les

albumines (55%), les globulines (38%) et le fibrinogène (7%) (cf. figure 6.1). Lorsque le fibrinogène et les autres

facteurs de la coagulation sont soustraits du plasma par centrifugation, le surnageant est nommé sérum (Ono

et al., 1981; Rehak and Chiang, 1988; Richard et al., 2010).

La concentration de certains composés, comme le glucose, est diminuée dans le sérum par rapport au plasma,

alors que pour d’autres composés, comme le lactate, le phosphate ou le potassium, leur concentration augmente

dans le sérum par rapport au plasma. La nature physico-chimique du plasma diffère ainsi de celle du sérum ;

des recherches ont été réalisées afin de connaître plus précisément les conditions de prélèvement du sang (sang

complet, plasma ou sérum) pour une multitude de métabolites (Boyanton and Blick, 2002; Diver et al., 1994;

Ellis et al., 2003; Heins et al., 2009; Oddoze et al., 2012). Le moyen de conservation du sang est également étudié,

58. Le mésenchyme est un tissu embryonnaire à l’origine des tissus sanguins, musculaires et osseux.59. Le terme de cellule n’est pas choisi ici car les globules rouges, ainsi que les plaquettes ne sont pas des cellules à proprement

parlé, car non aptes à se reproduire de façon autonome.

52

Chapitre 6. Notions biologiques

car selon le métabolite, les conditions de conservation du sang changent (Heins et al., 2009; Ono et al., 1981;

Prentice et al., 2013; Rehak and Chiang, 1988). Selon Adkins et al. (2002), plus de 10’000 protéines peuvent

être présentes dans le sérum à des concentrations très faibles pour certaines.

6.1.3 Fraction solide

Érythrocytes (globules rouges ou hématies)

Les érythrocytes sont des éléments discoïdes, biconcaves d’environ 8 µm de diamètre, anucléées 60 et de couleur

rouge-rose. Le nombre d’hématies varie entre 4,5 et 5,8 millions/µL de sang pour les hommes et entre 4,2 et

5,2 millions/µL de sang pour les femmes ; elles représentent environ 93% du nombre de cellules sanguines. Les

globules rouges ont une durée de vie d’environ 120 jours puis sont détruits par la rate (Hamasaki and Yamamoto,

2000; Lu et al., 2014; Richard et al., 2010). Les érythrocytes servent au transport de gaz (oxygène et dioxyde

de carbone) entre le sang et les autres cellules via une protéine, l’hémoglobine, qui représente à elle seule 70%

de la masse d’une cellule.

Leucocytes (globules blancs)

Les leucocytes sont les cellules responsables de la défense immunitaire de l’organisme. Ils sont nucléés et repré-

sentent seulement 1% du nombre de cellules sanguines, mais leur nombre peut considérablement augmenter en

cas d’inflammation ou d’infection. Les leucocytes se divisent en trois catégories cellulaires : les granulocytes, les

lymphocytes et les monocytes (cf. figure 6.1) 61.

La réaction du luminol est catalysée par les produits de dégradation de l’hémoglobine dans les traces de sang ;

l’hémoglobine se situant dans les érythrocytes. Dans certains cas, une trace de sang testée révélée au luminol

ne donne pas de profil génétique exploitable. L’écart important de concentration entre les érythrocytes et les

leucocytes pourrait être une hypothèse envisagée pour expliquer ce phénomène ; les limites de détection des

techniques n’étant pas les mêmes.

Thrombocytes (plaquettes)

Les thrombocytes sont des fragments cellulaires cytoplasmiques communément appelés plaquettes. Ces frag-

ments sont des disques biconvexes de 2-4 µm et représentent environ 6% des cellules sanguines. Les thrombocytes

ont un rôle dans l’hémostase en intervenant dans la formation du clou plaquettaire.

6.2 Interactions antigènes/anticorps

6.2.1 Antigènes

Par définition, un antigène est une molécule capable de se lier à un anticorps. Lorsque plusieurs conditions sont

rassemblées, cette liaison entraîne une réponse immunitaire dans un organisme humain ; ce qui définit le pouvoir

immunogène. De ce fait, toutes les molécules pouvant déclencher le système immunitaire sont définies comme

molécule immunogène. Toutes les molécules immunogènes sont des antigènes, mais tous les antigènes ne sont

pas obligatoirement immunogènes. En effet, les haptènes par exemple, sont des antigènes qui ne peuvent pas

60. Du fait que les hématies ne possèdent pas de noyaux, elles ne contiennent pas d’ADN nucléaire ; les analyses génétiques del’ADN nucléaire réalisées à partir des traces de sang ciblent les uniques cellules nucléées du sang, à savoir les globules blancs.

61. Les leucocytes peuvent également être classés selon leur rôle cellulaire (lymphocytes, cellules présentatrices de l’antigène etcellules effectrices), mais cette classification est plus complexe.

53


déclencher une réponse immunitaire du fait de leur très faible poids moléculaire. Les haptènes doivent être liés

à d’autres molécules pour engendrer une réaction immunogène (Turgeon, 2013b).

Trois propriétés font que les antigènes possèdent un pouvoir immunogène (Stanley, 2002c; Turgeon, 2013b) :

1. il s’agit d’une substance étrangère, appartenant au non-soi ;

2. la molécule est un complexe chimique (naturel ou recombiné, synthétisé) ;

3. la molécule possède un haut poids moléculaire.

Les antigènes sont donc des macro-molécules (protéines, polysaccharides, acides-nucléiques ou lipides) qui pos-

sèdent au moins une région pouvant être reconnue spécifiquement par des anticorps. Ces régions sont nommées

épitopes ou déterminants antigéniques. Selon leur nombre sur un antigène, se distinguent (Chiaroni et al., 2012a;

Stanley, 2002c,d; Turgeon, 2013b) :

• les antigènes univalents : antigènes ne possédant qu’un seul épitope ; généralement non immunogènes du

fait de leurs faibles poids moléculaires ;

• les antigènes multivalents : antigènes possédant plusieurs épitopes ; ces épitopes peuvent être soit de même

nature (antigènes multivalents, uni-déterminant), soit de natures différentes (antigènes multivalents, multi-

déterminants) (cf. figure 6.2).

Figure 6.2 – Structure d’un antigène multivalent multi-déterminant (chaque épitope est différent)Dans le cas d’un antigène multivalent uni-déterminant, chaque épitope serait le même.

figure inspirée de Stanley (2002c)

Les antigènes sanguins sont présents sur les trois types d’éléments figurés du sang, mais la très grande majorité

des antigènes sanguins se retrouvent sur les érythrocytes (Daniels, 2013a).

6.2.2 Anticorps

Les anticorps sont des glycoprotéines solubles de la famille des immunoglobulines (Ig) capables de se lier spéci-

fiquement à des antigènes et de provoquer une réaction immunitaire. Ils sont très largement utilisés en biologie

afin de montrer la présence d’un antigène dans un milieu (Chiaroni et al., 2012a). Il existe cinq classes d’immu-

noglobulines : les IgA, IgD, IgE, IgG et IgM (Stanley, 2002b; Turgeon, 2013b).

Les immunoglobulines les plus répandues dans le sang humain sont les IgG, qui servent de modèle de base pour

représenter les anticorps. Ces dernières sont formées de quatre chaînes polypeptidiques : deux chaînes lourdes H

et deux chaînes légères L composées chacune de domaines constants et variables (cf. figure 6.3.a). Ces chaînes

sont liées entre elles par des ponts disulfures et forment une structure similaire à un Y. Les ponts disulfures

peuvent être détruits par l’action de certaines enzymes (telles que la papaïne ou la trypsine) ; les fragments

Fab et Fc sont alors créés. La combinaison des extrémités des domaines variable et constant de chaque chaîne

constitue le paratope. Cette région reconnaît spécifiquement la région antigénique, nommée épitope (Murray

et al., 2015; Stanley, 2002b; Turgeon, 2013b). Les IgG ont une masse d’environ 150 kDa.

54


V

C

P

V

C C

C

V V

VFab

Fc

(a) IgG

V

V

V

V

V

(b) IgM pentamérique

Figure 6.3 – Structures schématiques des immunoglobulines (Ig) G et M pentamériqueEn bleu : chaîne lourde H ; en orange : chaîne légère L ; en rouge : pont disulfure ; en noir : chaîne J ;

C : domaine constant ; P : paratope ; V : domaine variable.figure inspirée de Stanley (2002b)

Les IgM se retrouvent sous forme monomérique (lorsqu’elles sont accrochées aux membranes plasmiques) ou

pentamérique (lorsqu’elles sont sous forme soluble). La forme monomérique d’une IgM est semblable à celle

d’une IgG ; la forme pentamérique peut être représentée comme cinq IgM monomériques assemblées par des

ponts disulfures et par une chaîne centrale, J (cf. figure 6.3.b), ce qui augmente leur masse à environ 900 kDa

(Moutschen and Scheen, 2009; Murray et al., 2015; Richard et al., 2010; Stanley, 2002b; Turgeon, 2013b). Selon

l’épitope que reconnaît l’anticorps, il existe :

• des mélanges d’anticorps monoclonaux : chaque anticorps reconnaît le même déterminant antigénique d’un

antigène donné, qu’il soit uni- ou multivalent (Stanley, 2002b; Turgeon, 2013b) ;

• des mélanges d’anticorps polyclonaux : chaque anticorps reconnaît un épitope donné, mais l’ensemble des

anticorps présents dans le mélange reconnaît les différents épitopes de l’antigène multivalent.

6.2.3 Liaisons entre antigènes et anticorps

Forces impliquées

La force de liaison entre un paratope et son épitope complémentaire définit « l’affinité » d’un anticorps. Lorsque

tous les paratopes d’un anticorps sont pris en compte, l’ensemble de ces forces définit « l’avidité ». La force

d’attraction entre les deux sites dépend ainsi de la spécificité de l’anticorps par rapport à l’antigène. Ces

liaisons sont non covalentes, spécifiques et réversibles, elles suivent la loi d’action de masse qui permet de définir

l’équilibre d’un système réactionnel. La constante d’équilibre est définie par l’équation suivante :

Ac+AgK1

−−*)−−K2

AcAg (6.1)

K =K1

K2

=[AcAg]

[Ac][Ag](6.2)

Ac : anticorps ; Ag : antigène ; K : constante d’équilibre ; K1 : constante de vitesse de réaction de

formation ; K2 : constante de vitesse de la réaction inverse ; [x ] : concentration de x (mol.L-1)

La constante d’équilibre de la liaison anticorps/antigène peut être associée à la mesure de la qualité d’ajustement

(the goodness of fit) (Stevens, 2009b; Turgeon, 2013b). Cette mesure dépend des forces de liaison entre un

anticorps et un antigène, et principalement de la forme des sites de liaison (paratope et épitope). Plus la

complémentarité des conformations est importante, plus les forces de liaison entre les deux sites sont grandes,

55


ce qui permet de maintenir la liaison. Les différentes liaisons et forces impliquées sont les liaisons hydrophobes,

hydrogène, ioniques et les forces de Van der Waals (Chiaroni et al., 2012a; Stanley, 2002d; Stevens, 2009b;

Turgeon, 2013b).

Lorsque la complémentarité et la spécificité entre le paratope et l’épitope sont faibles, il est possible que l’anti-

corps se fixe sur un antigène dont la structure de l’épitope est similaire à l’antigène d’origine. Ce phénomène est

connu sous le nom de « réaction croisée » (cross-reactivity) (Stanley, 2002b; Stevens, 2009b; Turgeon, 2013b).

Les cas les plus connus sont ceux où les anticorps se lient avec des antigènes d’espèces animales différentes, du

fait des similarités structurales des molécules entre les espèces.

Précipitation

La précipitation correspond à la formation d’un complexe anticorps/antigène lorsque les anticorps et les antigènes

sont en solution. Les complexes formés sont ainsi directement visibles. Pour former un précipité, il est donc

nécessaire que (Stanley, 2002d; Stevens, 2009b) :

• les anticorps et les antigènes soient solubles ;

• les antigènes soient multivalents (uni- ou multidéterminants) ;

• la valence 62 des anticorps soit au moins de deux (deux sites de liaisons par anticorps) ;

• le mélange contienne la même proportion d’anticorps et d’antigènes.

Comme présenté en figure 6.4, si les anticorps sont en excès par rapport aux antigènes, alors de nombreux

paratopes ne sont pas liés à un antigène (pro-zone, des anticorps libres sont présents). Au contraire, si les

antigènes sont en excès par rapport aux anticorps, alors tous les paratopes des anticorps sont occupés (post-

zone, des antigènes libres sont présents). Dans les deux cas, il n’est pas possible d’observer une précipitation

complète (zone d’équivalence) car les complexes anticorps/antigènes sont formés individuellement.

Figure 6.4 – Précipitation des complexes anticorps/antigènesAc : anticorps ; Ag : antigène ; igure inspirée de Stanley (2002d)

62. Le nombre de sites de liaison par anticorps (qui peut être corrélé au nombre de paratopes) définit la valence d’un anticorps(Chiaroni et al., 2012a) ; plus un anticorps a une valence élevée, plus il est apte à se lier à d’autres antigènes.

56


Agglutination & hémagglutination

Si les antigènes sont situés sur un médium (bactérie, cellule, particule de latex, ...), alors les complexes anti-

corps/antigènes forment un amas, nommé agglutinat. Les anticorps capables d’agglutiner des antigènes sont

nommés agglutinines ; les antigènes associés sont nommés agglutinogènes. Dans le cas d’agglutination relative

aux cellules sanguines, le terme employé est hémagglutination (Stanley, 2002a; Stevens, 2009a).

Pour l’hémagglutination, les antigènes sanguins sont fixés aux membranes cellulaires des cellules sanguines.

Les anticorps créent alors un pont entre deux antigènes situés sur deux cellules différentes, provoquant le

rapprochement des cellules sanguines. Quand les anticorps engendrent l’agglutination totale des cellules, ceux-ci

sont nommés anticorps complets ; ils sont dits anticorps incomplets dans le cas contraire.

Compte tenu des caractéristiques structurales des IgG et des IgM, les comparaisons suivantes peuvent être faites

(Chiaroni et al., 2012a; Stevens, 2009a) :

• Les IgG sont principalement des anticorps incomplets, alors que les IgM sont majoritairement complets.

• Les IgG possèdent deux sites de valence, contre dix pour les IgM pentamériques 63 ; ces dernières permettent

donc de lier un plus grand nombre d’antigènes. Du fait de la valence de ces deux classes d’anticorps, les

IgM ont un potentiel d’agglutination 700 fois plus important que les IgG.

• Du fait de la conformation spatiale des IgG et des IgM, la distance maximale entre deux points de valence

est de 12 ou 14 nm pour les IgG (cf. figure 6.5.a) contre 35 nm pour les IgM (cf. figure 6.5.b).

(a) Distance de valence des IgG

(b) Distance de valence des IgM

(c) Distance de valence après traitementenzymatique (papaïne)

Figure 6.5 – Distances des hématies minimales selon les IgG, IgM et traitement enzymatiqueIgG-M : immunoglobuline de type G-M ; figure inspirée de Chiaroni et al. (2012a)

63. La valence de dix des IgM pentamériques reste théorique, car en fonction de l’encombrement stérique de l’IgM, tous lesparatopes ne peuvent pas être disponibles.

57


De ce fait, les IgM peuvent plus facilement se lier aux hématies contenant les antigènes par rapport aux IgG ;

l’agglutination est facilitée avec l’emploi d’IgM. L’hémagglutination se fait en deux étapes (Stevens, 2009a) :

1. Lors de la première étape, dite de sensibilisation, les anticorps se fixent aux antigènes. Du fait des confor-

mations spatiales, chaque anticorps se fixe tout d’abord sur un seul déterminant antigénique (un seul

paratope est occupé). Cette étape est rapidement réversible et principalement affectée par l’affinité, l’avi-

dité et la classe des anticorps en jeux.

2. La seconde étape correspond à la formation de l’agglutinat. Lors de cette étape, dépendante des conditions

environnementales (pH, concentrations en anticorps et antigènes, force ionique et température, principa-

lement), les anticorps créent des ponts entre les antigènes situés sur des cellules différentes. Les autres

paratopes des anticorps sont alors liés à un autre déterminant antigénique.

Facteurs influençant l’agglutination

L’agglutination d’antigènes est conditionnée par plusieurs facteurs, tels que (Gaensslen, 1984; Stanley, 2002a;

Stevens, 2009a) :

• le nombre et la disposition des déterminants antigéniques par cellule ;

• la constante d’équilibre de la solution d’anticorps ;

• la concentration relative d’anticorps et d’antigènes ;

• le pH de la solution des tampons utilisés (tampon de dilution des anticorps) ;

• la forme cellulaire et les phénomènes de spiculation 64 ;

• le potentiel de surface cellulaire ;

• la constante diélectrique ;

• la force ionique ;

• la présence de polymères colloïdaux ;

• la pression osmotique des colloïdes extracellulaire ;

• le taux d’hydratation du milieu ;

• la température ambiante ;

• la classe des anticorps.

L’hémagglutination peut être améliorée en faisant varier certains facteurs (Gaensslen, 1984; Stevens, 2009a). Par

exemple, l’ajout d’une solution d’albumine à 5-30% permet de neutraliser les charges de surface sur les cellules.

Il est aussi possible de modifier la viscosité du milieu en ajoutant du dextrane et du glycol, ce qui facilite le

rapprochement des cellules. Certaines enzymes (broméline, ficine, papaïne, trypsine) réduisent l’encombrement

membranaire en dégradant certaines protéines ; de ce fait, l’accès à certains antigènes est facilité. Par exemple,

la papaïne permet de rapprocher les hématies à 11.3 nm (cf. figure 6.5.c) (Oss and Absolom, 1984). Cependant

l’emploi de ces enzymes peut également dégrader les anticorps, en créant les fragments Fab et Fc (cf. figure 6.3a),

ce qui réduit drastiquement leur activité. Enfin, il peut être noté que selon la classe des anticorps, la température

optimale n’est pas la même. Ainsi, pour les IgG, la température optimale est entre 30-37°C, contre 4-20°C pour

les IgM. Pour le groupage des antigènes sanguins, et principalement pour le système ABO, l’utilisation d’IgM

est privilégiée car elles agglutinent très bien à température ambiante.

Du fait que les membranes des cellules sont chargées 65, il existe un potentiel électrique entre une cellule et son

environnement. Ce potentiel de charge est appelé potentiel zeta, et crée une force de répulsion entre les hématies.

S’il est diminué, alors la distance entre les cellules diminue, ce qui permet de faciliter leur rapprochement. Le

potentiel zeta peut être diminué par l’ajout de colloïdes polymériques (tels que l’albumine ou du dextrane) ;

64. La spiculation est un processus de création de spicules, c’est-à-dire d’expansions membranaires ayant la forme d’aiguilles.65. La paroi interne est chargée positivement, alors que la paroi externe est chargée négativement.

58


ce qui améliore l’agglutination (Pollack et al., 1965). Des tampons, tels que le LISS (low ionic strengh solu-

tion) contenant une solution de glycine et d’albumine, diminuent le potentiel zeta tout en stimulant les sites

antigéniques à l’agglutination (Chiaroni et al., 2012a; Stevens, 2009a; Turgeon, 2013a).

6.3 Groupes sanguins

6.3.1 Classification et fonction des antigènes sanguins

Un groupe sanguin peut être défini au sens large comme « toute variation ou polymorphisme détecté dans le

sang » (Daniels, 2013b). Cette définition inclut donc toutes les variations observables dans le sang entre différents

individus. Un groupe sanguin se constitue d’une ou de plusieurs entité(s), les antigènes sanguins. Un antigène

sanguin est un élément présent dans le sang capable de déclencher une réaction immunitaire. Ces antigènes

sont retrouvés sous forme libre dans le plasma, ou au niveau des membranes plasmiques des éléments figurés

sanguins. La majorité des antigènes sanguins est présente au niveau des membranes plasmiques des érythrocytes.

Ils peuvent avoir différentes structures (glycoprotéines, lipides, protéines membranaires, etc.), ce qui entraîne des

fonctions différentes (activités enzymatiques, éléments structurels et de maintien cellulaire, récepteurs cellulaires

ou transporteurs membranaires).

Aujourd’hui, 315 antigènes de groupes sanguins ont été authentifiés et classifiés en trente-six systèmes, cinq

collections et deux séries (Bailly et al., 2015d; Daniels, 2013b; ISBT, 2019) :

• Un système (cf. tableau 6.1) regroupe un ou plusieurs antigène-s codé-s par un gène unique ou par un

complexe de gènes appartenant à un haplotype 66.

• Une collection rassemble des antigènes selon des liens biochimiques, génétiques et sérologiques. Le manque

de connaissance de ces antigènes et de leurs gènes ne permet pas de les attribuer à un système.

• Une série regroupe des antigènes n’appartenant ni à un système, ni à une collection. Selon leur fréquence

d’apparition dans la population, deux séries se distinguent :

1. la série des antigènes à basse fréquence (antigènes présents à moins de 1% dans la population) ;

2. la série des antigènes à haute fréquence (antigènes présents à plus de 99% dans la population).

En raison des recombinaisons génétiques lors de la méiose, de la transmission des allèles par les gamètes et des

mutations, tous ces antigènes ne sont pas systématiquement présents dans le sang, ce qui engendre différentes

distributions de ces antigènes chez les individus. Il existe de ce fait une multitude de phénotypes érythrocytaires

possibles, pouvant amener à discriminer du sang de sources différentes.

6.3.2 Système ABO

Phénotypes et distribution

Le système ABO étant utilisé dans ce travail de recherche, il est développé dans cette section. Ce système est le

groupe sanguin le plus connu et le plus utilisé en transfusion sanguine. Le groupe sanguin ABO est un système

de reconnaissance des cellules sanguines érythrocytaires. Sa première observation date du début du 20e siècle

par Landsteiner qui avait remarqué que le sang de différentes personnes s’agglutinait différemment. Quatre

phénotypes majeurs ont été recensés : les groupes A, B, AB et O. Les personnes de groupes A et B présentent

respectivement les antigènes A et B ; les personnes de groupe AB possèdent les deux antigènes A et B, alors que

les personnes de groupe O n’en ont aucun (antigène H seul) (Bailly et al., 2015c; Stroup and Treacy, 1985a).

66. Un haplotype est un regroupement de gènes qui ne peuvent pas être séparés lors de la méiose.

59


Numéro Nom du système Symbole du système

001 ABO ABO002 MNS MNS003 P1PK P1PK004 Rh RH005 Lutheran LU006 Kell KEL007 Lewis LE008 Duffy FY009 Kidd JK010 Diego DI011 Yt YT012 Xg XG013 Scianna SC014 Dombrock DO015 Colton CO016 Landsteiner-Wiener LW017 Chido/Rodgers CH/RG018 H H019 Kx XK020 Gerbich GE021 Cromer CROM022 Knops KN023 Indian IN024 Ok OK025 Raph RAPH026 John Milton Hagen JMH027 I I028 Globoside GLOB029 Gill GIL030 Rh-associated glycoprotein RHAG031 FORS FORS032 JR JR033 LAN LAN034 Vel VEL035 CD59 CD59036 Augustine AUG

Tableau 6.1 – Systèmes des groupes sanguins

Les antigènes A et B sont les deux antigènes principaux, mais plusieurs variations de ces antigènes sanguins

existent. Ainsi, le groupe A est divisé en deux sous-groupes : A1 et A2 (Bailly et al., 2015c; Homberg, 1999).

Ces variantes sont dues au polymorphisme génétique trouvé au niveau des allèles responsables des groupes A,

B, AB et O. En prenant en compte ces deux sous-groupes, ce sont finalement six phénotypes qui constituent

le système ABO : A1, A2, B, A1B, A2B et O (cf. tableau 6.2). Il existe ainsi une multitude de sous-groupes

différents, dits phénotypes rares, tels que Aint, A3, Ax, Aend, Abantu, Afinn, B3, Bx ou Bel (Bailly et al., 2015c).

Génotype Antigène Phénotype

A1/A1

A A (A1)A1/A2

A1/OA2/A2

A A (A2)A2/OB/B

B BB/OA1/B

A & BAB (A1B)

A2/B AB (A2B)O/O H O

Tableau 6.2 – Nomenclature du système ABO

Plusieurs études ont été réalisées afin de connaître la distribution des phénotypes A, B, AB et O (cf. tableau

6.3). Le groupe sanguin le plus commun est le groupe O dans les pays d’Amérique, d’Afrique et d’Australie, mais

60


pas dans les pays d’Europe et d’Asie où le groupe A prédomine. Le sous-groupe A2 ne dépasse généralement

pas 10% de la population caucasienne. Le groupe B est plus présent en Asie centrale. Enfin, le groupe AB est

le groupe le plus rare (Bailly et al., 2015c; Daniels, 2013a).

A B AB O Nombre de personnes Pays Référence

43,26 10,71 4,82 41,21 624’124 Allemagne Wagner et al. (1995)42,00 9,00 3,00 46,00 non donné Canada Héma-Québec (2018)37,10 12,20 4,10 46,60 3’086’215 États-Unis Garratty et al. (2004)42,27 10,80 3,96 42,96 non donné France Bailly et al. (2015c)22,54 23.86 4,72 48,88 59’450 Guinée Loua et al. (2007)38,65 22,15 9,95 29,25 4’465’349 Japon Fujita et al. (1978)28,28 18,56 4,06 49,10 10’116 Mauritanie Hamed et al. (2012)47,00 8,00 4,00 41,00 non donné Suisse Croix Rouge Suisse (2019)

Tableau 6.3 – Distribution des phénotypes ABO

Structure et déterminant antigénique

Plusieurs études ont permis de démontrer la nature des antigènes du système ABO (David, 2012; Laine and

Rush, 1988; Lloyd, 2000; Lowe, 1995; Morgan and Watkins, 2000; Watkins, 2001). Comme le système ABO

(ISBT 001) est associé au système H (ISBT 018), les deux systèmes sont souvent mis en commun et dénommés

système ABH. Les gènes du système ABH codent pour des enzymes de la catégorie des transférases, qui ajoutent

une molécule de sucre sur d’autres structures.

Selon l’activité de l’enzyme codée par le gène, le sucre terminal de la chaîne diffère (Bailly et al., 2015c),

induisant plusieurs versions d’antigènes (les sucres sont présentés en annexe A) :

• pour l’antigène A, un N-acétyl-galactosamine ;

• pour l’antigène B, un D-galactose ;

• pour l’antigène H, un fucose.

Il existe six différentes chaînes sur lesquelles peuvent venir se fixer ces sucres ; elles sont nommées chaînes

précurseurs I à VI. Ces chaînes sont des oligosaccharides, soit des successions de plusieurs molécules de sucres.

Sur les érythrocytes, les déterminants antigéniques ABH sont majoritairement de type II (Bailly et al., 2015c;

David, 2012). Sur ces chaînes, vient se fixer en premier un fucose afin de former l’antigène H. Après, selon le

génotype de l’individu, vient se fixer le sucre spécifique de l’antigène A et/ou B (cf. figure 6.6).

Figure 6.6 – Schéma illustrant les structures des déterminants ABH1. absence de déterminant H sur la chaîne précurseur (phénotype Bombay) ;

2. chaîne H : ajout d’un fucose sur la chaîne précurseur ;3. antigène A : ajout d’un N-acétyl-glycosamine sur la chaîne H ;

4. antigène B : ajout d’un D-galactose.figure inspirée de Stroup and Treacy (1985b)

61


La seule présence des chaînes H, sans les déterminants A et/ou B, correspond au groupe O. C’est pourquoi,

lorsque la chaîne H est présente sans les déterminants A et/ou B, le groupe O est associé à l’antigène H. Il

existe une mutation rare qui induit l’absence du gène codant la transférase de l’allèle H ; ce phénotype est

nommé phénotype de Bombay. Dans cette configuration, les chaînes précurseurs restent vierges du fucose de la

chaîne H. De ce fait, les déterminants des antigènes A et B ne peuvent s’y fixer, même en présence des gènes du

système ABO. Le phénotype résultant est similaire aux personnes de groupe O, car le sang ne réagit pas aux

anticorps anti-A et anti-B, mais contrairement aux personnes O, le sang ne réagit pas non plus aux anticorps

anti-H (Bailly et al., 2015c).

Les chaînes précurseurs se trouvent rattachées à d’autres structures, qui peuvent être libres, solubles, ou associées

aux membranes cellulaires. Au niveau des globules rouges, la principale structure support des chaînes précurseurs

et donc des antigènes ABH, est la protéine bande 3 ; 80% des chaînes H sont fixées dessus (cf. figure 6.7). Cette

macromolécule est également la principale protéine membranaire des érythrocytes (plus d’un million de copies

par cellule (Bursaux, 1998)) et a un poids moléculaire compris entre 95 et 105 KDa, soit 911 acides aminés

(Bailly et al., 2015b). La protéine bande 3 appartient à la famille des transporteurs et échangeurs d’anions qui

permettent d’équilibrer les concentrations en chlorure et en bicarbonate de part et d’autre de la membrane

plasmique. Cette protéine transmembranaire traverse quatorze fois la membrane plasmique et comporte sept

boucles extra-cellulaires et six boucles intra-cellulaires. L’asparagine en position 642 présente un site de N-

glycosylation permettant d’associer les épitopes ABH (Bailly et al., 2015b; Tanner, 1997).

Asn642

1NH2

911COOH

membrane plasmique

milieu extra-cellulaire

milieu intra-cellulaire

Figure 6.7 – Structure schématique de la protéine bande 3En rouge, position du site de N-glycosylation des déterminants ABH au niveau de l’asparagine en position 642.

figure inspirée de Bailly et al. (2015b)

Allèles du système ABH

Deux gènes situés sur le chromosome 19 sont responsables de la synthèse de l’enzyme catalysant la fixation du

fucose sur les chaînes précurseurs (antigène H) : les gènes FUT1 (fucosyltransférase – allèles H/h) et FUT2

(allèles Se/se). Exception faite du phénotype de Bombay, toutes les personnes expriment le gène FUT1. Les

personnes qui expriment le gène FUT2 sont dites « sécrétrices » car elles peuvent fixer le fucose sur des chaînes

précurseurs situées dans d’autres fluides que le sang. Des structures supports sont en effet exprimées sous forme

soluble et se retrouvent dans d’autres fluides et tissus biologiques (sauf le liquide cérébro-spinal).

Ensuite, interviennent les gènes responsables des déterminants A et/ou B, qui sont localisés sur le chromosome

9. Suivant l’allèle du gène, l’activité de la transférase codée (ou non codée pour les personnes de groupe O)

engendre un phénotype A et/ou B en ajoutant le sucre spécifique sur la chaîne H. Lorsqu’une personne est

sécrétrice, les sucres des antigènes A et B peuvent aussi être fixés sur les chaînes H, et il est alors possible

de déterminer les antigènes ABH dans la salive ou les urines par exemple. Environ 80% des caucasiens sont

sécréteurs (Stroup and Treacy, 1985b).

62


La nature des chaînes précurseurs est importante car selon le type de la chaîne, l’affinité des sucres terminaux

et des transférases n’est pas la même, ainsi :

• Les personnes de groupe A1 peuvent fixer le sucre terminal sur les chaînes de type I à IV, alors que les

personnes de groupe A2 ne peuvent le fixer que sur les types I et II. Cela explique en partie pourquoi le

nombre d’antigènes A est moins important chez les personnes de groupe A2 par rapport au groupe A167.

Une étude d’Economidou et al. (1967) estime leur présence entre 980’000 et 1’170’000 pour les sujets A1

contre 240’000 à 290’000 pour les sujets A2. Une seconde étude de Williams and Voak (1972) estime que

les sujets A1 ont cinq fois plus d’antigène A que les sujets A2 (de 150’000 à 800’000).

• Les enzymes des personnes sécrétrices (gène FUT2) fixent le fucose sur les chaînes I et III, alors que les

enzymes exprimées par le gène FUT1 transfèrent le fucose sur les chaînes II et IV (Bailly et al., 2015c).

6.3.3 Établissement du groupe sanguin en transfusion sanguine

Les services de transfusion utilisent de multiples tests basés sur l’utilisation d’anticorps pour établir le groupe

sanguin d’un individu. Les techniques conventionnelles servent toujours de référence, et notamment pour lever

le doute sur certains résultats. De plus en plus de tests immunochromatographiques rapides sont développés

pour simplifier les analyses, mais ne permettent pas d’identifier des phénotypes rares.

Méthodes conventionnelles

La première méthode conventionnelle est l’épreuve globulaire de Beth-Vincent qui permet de déterminer la pré-

sence ou l’absence des antigènes A et B sur les globules rouges. Elle s’effectue classiquement à l’aide d’anticorps

pour provoquer l’hémagglutination des cellules (Chiaroni et al., 2012b).

La seconde, l’épreuve plasmatique de Simonin, recherche à l’inverse les anticorps naturels anti-A et anti-B

dans le plasma du sang. Une personne de groupe A possède des antigènes A sur ses globules rouges, et de fait

des anticorps anti-B dans son plasma. Selon le même processus, une personne de groupe B possède donc des

anticorps anti-A ; une personne de groupe AB ne possède pas d’anticorps anti-A et anti-B ; une personne de

groupe O possède les deux types d’anticorps (Chiaroni et al., 2012b).

La plus classique est celle de l’absorption-élution, qui permet entre autres de détecter les phénotypes rares. Elle

consiste à fixer des anticorps sur les antigènes. Lorsque les antigènes ciblés sont faibles, aucune agglutination

n’est attendue du fait du manque d’antigènes dans le milieu. Comme la fixation anticorps/antigène est réversible,

une seconde étape permet de détacher les anticorps fixés, de les récupérer et de les détecter à l’aide d’hématies

comportant les antigènes de la même famille, mais non faibles (Chiaroni et al., 2012b).

Tests immunochromatographiques

Ces kits contiennent une membrane, généralement en nitrocellulose, sur laquelle des anticorps ciblant différents

antigènes ont été déposés et fixés (cf. figure 6.8). Lorsque le sang est testé, il diffuse sur la membrane et, lorsque les

antigènes sont présents, la migration du sang est entravée par la formation des complexes antigènes/anticorps.

En dehors de ces complexes, le sang diffuse aisément, ce qui entraîne l’apparition de lignes au niveau des

complexes. Une ligne correspond donc à un résultat positif, et indique dès lors la présence de l’antigène dans

le sang. Le kit utilisé dans cette thèse, les MDMulticards® ABO-D-Rh subgroups-K for donors permettent de

détecter les antigènes suivants : A, B, Dvi+, Dvi– 68, C, c, E, e et K.

67. Une autre raison expliquant la différence de sites antigéniques entre les deux sous-groupes est l’affinité et l’efficacité del’enzyme exprimée par les personnes de groupe A2 qui sont plus faibles que l’enzyme exprimée chez les personnes de groupe A1.

68. Dvi+ et Dvi– sont deux épitopes de l’antigène D (groupe Rhésus).

63


(a) carte neuve (b) carte utilisée : phénotype A–, c-c, e-e

Figure 6.8 – Test immunochromatographique MDMulticards® ABO-D-Rh subgroups-K for donors

Agglutination dans une colonne de gel

Ces kits ont la forme d’une carte de crédit, contenant plusieurs puits dans lesquels est inséré du gel (cf. figure

6.9). Suivant le kit utilisé, le gel contient déjà, ou non, des anticorps. Lorsque le sang est ajouté aux puits,

il migre dans le gel et en présence des antigènes ciblés, des agrégats se forment dans le gel. La migration est

accélérée par centrifugation. Lorsque tout le sang passe à travers le gel, un résultat négatif est alors conclu ;

quand le sang ne traverse pas le gel, un résultat positif est conclu. Lorsque le sang traverse partiellement le gel,

un résultat positif partiel est conclu. Cela arrive lorsque le sang contient une faible quantité de l’antigène ou

alors une variante spécifique de l’antigène. Dans cette thèse, trois plaquettes sont utilisées :

1. ID-Antigen profile I : antigènes P1, Lea (LE1), Leb (LE2), Lua (LU1) et Lub (LU2) ;

2. ID-Antigen profile II : antigènes k (KEL2), Kpa (KEL3), Kpb (KEL4), Jka (JK1)et Jkb (JK2) ;

3. ID-Antigen profile III : antigènes M, N, S, s, Fya (FY1) et Fyb (FY2).

(a) plaquette neuve (b) plaquette utilisée ; phénotype : Lea, Lub

Figure 6.9 – Agglutination dans une colonne de gel – ID-Antigen Profile I (Bio-Rad)

64

Chapitre 7

Altérations des propriétés du sang en dehors de l’organisme

« Une trace ineffaçable n’est pas une trace. »

Jacques Derrida

Sommaire7.1 Principes de l’hémostase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

7.1.1 Traitements anticoagulants et thrombolytiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

7.1.2 Médicaments utilisés dans cette recherche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

7.2 Modifications du sang ex vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

7.2.1 Composition du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

7.2.2 Coagulation du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

7.2.3 Évaporation du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

7.3 Expérimentations sur l’influence du support et des anticoagulants . . . . . . . . . . . . . . . 68

Les traces de sang sont sujettes à des modifications causées par leur environnement. Les traces de sang modifiées

par leur environnement sont considérées comme des PABS (physiological altered bloodstains). Les principaux

facteurs de modifications sont les phénomènes de coagulation et d’évaporation des traces (Wonder, 2014). Peu

de recherches sont cependant entreprises dans ces domaines.

7.1 Principes de l’hémostase

L’hémostase correspond à un processus physiologique permettant de maintenir le sang dans les vaisseaux san-

guins. Elle entraîne une modification physico-chimique importante de la composition sanguine en faisant interve-

nir une multitude de protéines et facteurs de coagulation. Peu de recherches sont réalisées sur les conséquences

de l’hémostase sur la composition des traces de sang. Elle regroupe trois étapes (Galley and Webster, 2004;

Heemskerk et al., 2002; Hoffman et al., 2005; Jandrot-Perrus, 2002; Mann, 1999) :

1. L’hémostase primaire (activation plaquettaire) permet la formation du clou plaquettaire, c’est-à-dire la

formation d’un amas de plaquettes ;

2. L’hémostase secondaire permet de transformer le fibrinogène en fibrine par l’activation de la thrombine.

Cela constitue un maillage résistant et insoluble qui, associé au clou plaquettaire, forme le caillot sanguin ;

65


3. La fibrinolyse correspond à l’activation du plasminogène en plasmine, molécule qui permet de dissoudre

le caillot sanguin en provoquant la lyse de la fibrine.

7.1.1 Traitements anticoagulants et thrombolytiques

Les principaux inhibiteurs physiologiques de la coagulation sont l’antithrombine, les protéines C et S et l’inhi-

biteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI). Ils ont une action régulatrice négative sur l’hémostase à différents

niveaux. Les anticoagulants (pris dans le cadre d’un traitement médical par exemple) peuvent agir :

• pour bloquer les ions calcium (comme le citrate ou l’acide éthylène diamine tétra-acétique – EDTA) 69 ;

• pour stimuler les inhibiteurs de la coagulation tels que de l’antithrombine (comme l’héparine) 70.

En médecine, lorsque le caillot sanguin se forme dans les vaisseaux et qu’il est nécessaire de le briser, des

médicaments doivent être utilisés ; il s’agit des thrombolytiques (également nommés fibrinolytiques). Les deux

principales molécules utilisées sont l’urokinase et l’activateur du plasminogène (t-PA), qui activent le plasmino-

gène en plasmine. La plasmine est une molécule qui lyse la fibrine, permettant de briser les caillots sanguins.

7.1.2 Médicaments utilisés dans cette recherche

Dans ce projet de recherche, aucun médicament de type anticoagulant n’a été utilisé pour conserver le sang

des donneurs. Du fait que la coagulation est un processus qui modifie la composition et les propriétés physico-

chimiques du sang, il a été jugé primordial d’en tenir compte lors de la création des traces de sang. Au contraire,

une fois que le sang était sous forme de trace, il a été décidé de tester des médicaments afin de remettre le sang

en solution et de dissoudre les caillots sanguins. Pour cela, deux molécules ont été choisies :

1. Un anticoagulant, l’héparine qui se retrouve dans le médicament Liquémine® (Compendium.ch®, 2017b) ;

2. Un thrombolytique, l’alteplase qui est une forme recombinante du t-PA. Elle compose le principe actif du

médicament nommé Actilyse® (Compendium.ch®, 2017a).

7.2 Modifications du sang ex vivo

7.2.1 Composition du sang

Dans l’organisme, le sang n’a pas une composition homogène. La différence de densité entre les fractions liquide

et solide engendre un cœur central formé par les globules blancs et rouges qui circulent au centre des vaisseaux,

alors que le plasma et les plaquettes circulent plutôt en périphérie. Ceci peut expliquer la raison pour laquelle

les traces de sang n’ont pas une composition semblable à celle du sang dans l’organisme et ont, au contraire, une

concentration en globules rouges plus élevée (Wonder, 2001a). En effet, comme illustré sur la figure 7.1, suite à

la brèche de la paroi sanguine, celle-ci se replie vers l’intérieur du vaisseau sanguin, entravant ainsi l’écoulement

de la partie périphérique du sang et favorisant la sortie de la partie centrale.

Lorsque le sang est projeté, il peut également se mélanger à diverses substances selon la surface sur laquelle il

est transféré. La plupart du temps, le sang se mélange avec de l’eau ou des substances aqueuses telles que les

fluides biologiques de la personne (urine ou liquide cérébro-spinal par exemple) ou des liquides présents dans

la pièce. La composition de ces fluides entraîne une modification de la composition du sang. Par exemple, si le

liquide contient du sel (NaCl), celui-ci accélère la lyse cellulaire et donc la coagulation sanguine ou la libération

d’hémoglobine dans la trace. Le sel pose également un problème au niveau de la conservation de l’ADN, qui se

dégrade plus rapidement (Wonder, 2014).

69. L’absence de calcium inhibe directement l’hémostase primaire et indirectement l’hémostase secondaire.70. L’antithrombine inhibe l’activation de la thrombine ; la formation de fibrine est donc limitée.

66

Chapitre 7. Altérations des propriétés du sang en dehors de l’organisme

flux sanguin

plasma et plaquettes

coeur : globules blancset rouges

brèche du vaisseau sanguin

Figure 7.1 – Illustration de la brèche de la paroi sanguinefigure inspirée de Wonder (2001b)

7.2.2 Coagulation du sang

En dehors de l’organisme, le sang subit une sédimentation qui permet aux cellules de se regrouper. Lorsque la lyse

des plaquettes a lieu, ces dernières déversent dans le milieu les facteurs qui initient la coagulation sanguine. La

lyse cellulaire aussi également un déséquilibre osmotique qui active et stimule certains facteurs de la coagulation.

Virkler and Lednev (2010) montrent qu’à partir d’analyses Raman de traces de sang, la coagulation en dehors

de l’organisme sépare chimiquement deux composants majoritaires, l’hémoglobine et la fibrine.

7.2.3 Évaporation du sang

De plus en plus de recherches sont réalisées sur le phénomène d’évaporation de traces de sang isolées. Un

phénomène de gélification de la trace de sang est observé de l’extérieur vers l’intérieur (cf. figure 7.2). Du fait

que le contour de la trace est plus fin, cette partie s’évapore plus rapidement ; la périphérie a donc un aspect

gélifié par rapport au reste de la trace qui garde une phase liquide plus importante. Plus la trace s’évapore, plus

des craquelures apparaissent au centre. Il est à noter que des auteurs séparent ce phénomène d’évaporation en

deux régimes (Brutin et al., 2012) :

1. le régime R1 (régime de gélification) (cf. figure 7.2t0−t20)

2. le régime R2 (régime de fracturation) (cf. figure 7.2t30−t90)

Ces deux régimes diffèrent principalement par le ralentissement du temps d’évaporation de la phase liquide. En

effet, l’évaporation est 56 fois plus lente lors du second régime que pendant le premier (vitesse d’évaporation de

0,092 µg/s pour R2 contre 5,2 µg/s pour R1) (Sobac and Brutin, 2011). Il a également été observé que plus le

volume de la trace de sang augmente, plus la durée du régime de fracturation augmente. Pour les trop petites

traces, la distinction entre ces deux régimes est plus difficile à mesurer.

Ramsthaler et al. (2012) ont montré que la température ambiante est le principal facteur ayant un rôle dans

la vitesse d’évaporation des traces de sang 71. Lorsque la température augmente, l’évaporation est plus rapide

et inversement, quand elle diminue, le temps d’évaporation est plus long. Plus récemment, Laan et al. (2016)

ont complété ces études en décrivant cinq étapes liées au séchage des accumulation de sang. Cette étude définit

plus précisément le régime de fracturation :

1. la coagulation ;

2. la gélification avec la formation du front de gélification ;

3. le séchage du pourtour ;

4. le séchage du centre ;

5. le séchage final.

71. Les autres facteurs testés étaient la pression, le taux d’humidité et la présence d’anticoagulants due à un traitement médical(Aspirine®, Fragmin® et Plavix®).

67


(a) t0 (b) t10 (c) t20

(d) t30 (e) t40 (f) t90

Figure 7.2 – Évolution structurale d’une trace de sang à différents temps de séchage – grossissement 4xLes temps (a), (b), (c) correspondent au régime R1 de gélification et les temps (d), (e), (f) correspondent au régime R2 de fracturation.

7.3 Expérimentations sur l’influence du support et des anticoagulants

En plus de la température, deux autres facteurs influençant l’évaporation du sang peuvent être mis en exergue :

le support et l’utilisation d’anticoagulant. Le matériau du support joue un rôle prédominant, puisqu’il modifie

les caractéristiques de fixation du sang sur le support. Par exemple, le sang diffuse aisément sur un support

poreux, tel que du papier. Au contraire, sur du plastique, les interactions électrostatiques empêchent le sang de

s’y fixer correctement, la trace de sang pouvant facilement être détachée du support.

Par rapport au second critère, les anticoagulants mentionnés ici diffèrent de ceux utilisés dans le cadre d’un trai-

tement médical, suite auquel ces derniers se retrouvent dans la composition du sang, in vivo. Dans cette section,

les anticoagulants concernés sont ceux utilisés pour conserver le sang après son prélèvement d’un organisme,

comme lors d’une prise de sang. Dans la littérature, de nombreuses recherches font état de l’utilisation de sang

conservé à l’aide d’anticoagulant pour éviter d’en prélever fréquemment, ou de sang d’autres espèces animales

(cheval, vache). Or, ces derniers peuvent différer de la composition du sang humain et également modifier les

caractéristiques physico-chimiques du séchage du sang, et donc interférer lorsque le sang est sous forme de trace.

Une partie expérimentale a été entreprise afin de montrer l’influence de ces deux constatations. Pour cela, cinq

supports (bois, papier filtre, plastique, tissu et verre) et deux anticoagulants couramment utilisés en médecine

(EDTA et héparine) ont été testés. Après déposition de 50 µL de sang (frais 72, conservé à l’aide d’EDTA

et d’héparine 73) sur chaque support, des photographies ont été prises toutes les dix minutes pendant deux

heures (soit un total de treize photographies, en comptant la photographie au temps zéro). La température

ambiante a régulièrement été mesurée et montre une variation comprise entre 23 et 26°C de la pièce. L’appareil

photographique est un Canon EOS 600D 74 monté sur un macroscope LEICA M125 (objectif LEICA 10446157).

La figure 7.3 présente les photographies relatives aux intervalles théoriques des régimes de gélification (de zéro

à 20 minutes) et de fracturation (de 30 à 90 minutes) pour les traces de sang déposées sur du verre. Les

photographies des traces de sang déposées sur les autres supports sont présentées en annexe B.

72. Directement prélevé d’un même donneur.73. Il s’agit de fioles de sang du même donneur, récupérées lors d’une prise de sang ; les fioles indiquent les anticoagulants utilisés, à

savoir de l’EDTA (K2 ou K3-EDTA) et de l’héparine (héparine de lithium ou de sodium), mais n’indiquent pas leurs concentrations.74. Réglages photographiques : temps de pose de 1"3, ISO 100.

68

Chapitre 7. Altérations des propriétés du sang en dehors de l’organisme

(a) t0 – frais (b) t0 – EDTA (c) t0 – héparine

(d) t20 – frais (e) t20 – EDTA (f) t20 – héparine

(g) t30 – frais (h) t30 – EDTA (i) t30 – héparine

(j) t90 – frais (k) t90 – EDTA (l) t90 – héparine

Figure 7.3 – Évolution structurale d’une trace de sang sur du verre – grossissement 2xPhotographies prises en éclairage par transmission ;

du temps t0 à t20 : régime R1 de gélification ;du temps t30 à t90 : régime R2 de fracturation.

Deux principaux constats peuvent être développés après l’analyse visuelle des photographies :

1. Le sang conservé à l’aide d’anticoagulant est moins visqueux que le sang physiologique. De ce fait, le sang

conservé à l’aide d’anticoagulants semble s’étaler, diffuser plus facilement sur le support.

2. Le sang conservé à l’aide d’anticoagulant est plus foncé que le sang physiologique ; il en est de même pour

la coloration de la trace de sang. Cependant, la différence de coloration semble moins importante entre le

sang frais et le sang conservé avec de l’héparine, par rapport à l’EDTA.

Cette étude préliminaire montre l’importance d’utiliser du sang frais, non conservé à l’aide d’anticoagulants,

pour la recherche basée sur l’analyse des traces de sang. La différence de viscosité pourrait être un facteur

important à tenir en compte, typiquement lors de l’impact de la goutte de sang avec le support, qui peut

engendrer des variations dans la forme et la taille de la trace de sang. Aussi, la différence de coloration peut

être problématique par rapport aux études portées sur l’analyse des spectres des longueurs d’ondes des traces

de sang, comme en microspectrométrie (MSP) ou en spectroscopie Raman.

Pour ces différentes raisons, l’utilisation de sang physiologique frais a été choisie pour créer les traces de sang

dans cette recherche. Aucun anticoagulant n’a été utilisé. Afin de réduire les prélèvements de sang, et du fait

que cette procédure est invasive, des aliquots de sang ont été conservés à -80°C.

69

Quatrième partie

Sélection de l’antigène sanguin

71

Chapitre 8

Corrélation et pouvoir discriminatoire des antigènes

sanguins

Sommaire

8.1 Indépendance des antigènes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

8.1.1 Coefficient de corrélation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

8.1.2 Pouvoir discriminatoire des antigènes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

8.2 Distribution générale des antigènes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

8.2.1 Distribution dans une population expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

8.2.2 Fréquence des antigènes sanguins dans la population expérimentale . . . . . . . . . . 76

8.2.3 Coefficient de corrélation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

8.2.4 Pouvoir discriminatoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

8.1 Indépendance des antigènes sanguins

Les objectifs de cette partie sont d’étudier le degré de dépendance de différents antigènes sanguin dans une

population et, par extension, d’évaluer le pouvoir discriminatoire d’une combinaison d’antigènes. Sur cette base,

un choix d’un ou de plusieurs antigène-s sanguin-s peut être réalisé dans la perspective de discriminer des traces

de sang de sources différentes.

L’ISBT recense plus de 300 antigènes sanguins. Une première étape a consisté à réduire la liste des antigènes

sanguins potentiels à ceux utilisés en transfusion sanguine, car ces derniers appartiennent tous à des systèmes de

groupe sanguin ; leurs structures et fonctions sont ainsi connues, maîtrisées et renseignées dans la littérature par

rapport aux autres. Cette observation a permis de cibler 24 antigènes sanguins, regroupés dans neuf systèmes

(ISBT 001 à ISBT 009). La présence ou l’absence de ces derniers est très rapidement et facilement détectable

par l’utilisation de kits commerciaux, tels que les MDMulticards® (Grifols) et ID-Antigen Profile (Bio-Rad).

Le phénotype érythrocytaire d’une personne est alors aisément établi.

73

Partie IV : Sélection de l’antigène sanguin

8.1.1 Coefficient de corrélation

En prenant par exemple les systèmes ABO (ISBT 001) et Rhésus (ISBT 004) et en détectant la présence ou

l’absence des antigènes A, B et D 75, les observations suivantes peuvent être établies :

• Si chaque système est étudié individuellement, alors :

— l’analyse seule du système ABO permet de définir quatre phénotypes principaux : A, B, AB et O ;

— l’analyse seule du système Rhésus permet de définir deux phénotypes : Rhésus positif et négatif.

• Si les deux systèmes sont étudiés ensemble, alors huit phénotypes peuvent être déduits : A+, A-, B+, B-,

AB+, AB-, O+ et O-.

Cette observation montre que selon le nombre d’antigènes sanguins détectés, le nombre de combinaisons aug-

mente, permettant d’obtenir une distribution des antigènes sanguins différentes chez les individus testés. Comme

vu avec le système ABO, la présence ou non d’un antigène sanguin est déterminée génétiquement. Sur les neufs

systèmes, cinq ont leurs gènes situés sur des chromosomes différents (cf. tableau 8.1), alors que les gènes des

groupes Rhésus et Duffy sont situés sur le chromosome 1 et les gènes des groupes Lutheran et Lewis sur le

chromosome 19. Bien qu’ils soient localisés sur les mêmes chromosomes, leur position est éloignée, du fait que

les gènes des groupes Rhésus et Lewis sont situés sur les bras courts (bras p) des chromosomes, alors que les

systèmes Lutheran et Duffy sont situés sur les bras longs (bras q). Le fait que les gènes soient situés sur les bras

différents permet les phénomènes de recombinaison entre chromosome lors de la méiose et donc d’augmenter le

polymorphisme.

Numéro ISBT Système sanguin Chromosome Antigène étudié

001 ABO 9 A, B002 MNS 4 M, N, S, s003 P1PK 22 P1004 Rhésus 1p C, c, E, e, D005 Lutheran 19q Lua, Lub

006 Kell 7 K, k, Kpa, Kpb

007 Lewis 19p Lea, Leb

008 Duffy 1q Fya, Fyb

009 Kidd 18 Jka, Jkb

Tableau 8.1 – Numéro du chromosome où se situent les gènes des systèmes sanguinsp : bras court du chromosome ; q : bras long.

Dans certains cas, l’expression des antigènes sanguins est antithétique. Cela signifie que l’absence d’un antigène

sanguin donné entraîne de facto l’expression de son antigène homologue ; sauf mutation génétique. La présence

d’un des deux antigènes n’entraîne par contre pas l’absence de l’autre. Les couples d’antigènes suivants suivent

une expression antithétique (Bailly et al., 2015a) :

• M et N

• S et s

• C et c

• E et e

• Lua et Lub

• K et k

• Kpa et Kpb

• Fya et Fyb

• Jka et Jkb

Bien qu’indépendante, il est toutefois intéressant de vérifier que la distribution des antigènes, antithétiques ou

non, suit bien une distribution aléatoire sans corrélation entre eux dans une population donnée. En considérant

un seul antigène sanguin et en étudiant uniquement de façon binaire sa présence ou son absence dans le sang,

alors la probabilité P maximale de différencier deux traces de sang est égale à 0,50. En combinant plusieurs

antigènes sanguins, la probabilité de différencier les traces de sang tend vers 1, soit une différenciation des

traces de sang dans 100% des cas, à condition que les antigènes sanguins ne soient pas corrélés entre eux, qu’ils

présentent donc une forte indépendance.

75. Pour le système Rhésus, la présence de l’antigène D indique que la personne est « positive » alors que son absence indiqueque la personne est « négative ».

74

Chapitre 8. Corrélation et pouvoir discriminatoire des antigènes sanguins

Prenons le cas suivant pour exemple : les antigènes A et D sont considérés pour différencier les sources de deux

traces de sang. Pour obtenir une information pertinente, il est nécessaire que la distribution de ces deux antigènes

soit bien indépendante, car si la présence des antigènes A entraîne la présence ou l’absence de l’antigène D,

alors l’utilisation de ce couple d’antigène n’est pas pertinente. En effet, la détection de l’antigène D n’apporte

aucune plus-value si la détection de l’antigène A suffit.

Dans l’objectif de développer une méthode permettant la combinaison de plusieurs antigènes sanguins, il est

important d’estimer ces niveaux de corrélation, même si la distribution des antigènes est théoriquement in-

dépendante. Afin de tester cette hypothèse, des mesures de corrélation sont calculées entre tous les couples

d’antigènes. Pour obtenir des données sur lesquelles se baser, il est nécessaire de connaître la distribution de

tous ces antigènes dans une population. La fréquence seule d’un antigène dans une population ne permet pas

de mesurer les corrélations. En effet, il est nécessaire d’obtenir pour chacun des antigènes, leur distribution

chez chaque individu. Ces données n’ont pas été trouvées dans la littérature. C’est pourquoi il a été néces-

saire de déterminer préalablement le phénotype érythrocytaire de ces antigènes sanguins dans une population

expérimentale.

8.1.2 Pouvoir discriminatoire des antigènes sanguins

En reprenant l’exemple des systèmes ABO et Rhésus, une autre observation peut être remarquée. En effet,

chaque antigène n’est pas représenté équitablement dans une population donnée. Certains comme l’antigène D

est présent à 85% dans la population caucasienne, alors que l’antigène B n’y est présent qu’à 13% (Reid et al.,

2012a). La même réflexion peut être faite en considérant d’autres antigènes sanguins. En cumulant certains

antigènes, le pouvoir discriminatoire augmente. Pour différencier des traces de sang de sources différentes, il

est alors nécessaire de considérer une combinaison d’antigènes. Suivant la combinaison choisie et le nombre

d’antigènes considéré, la valeur du pouvoir discriminatoire varie.

Le calcul du pouvoir discriminatoire peut être effectué pour un antigène et une combinaison d’antigènes. Les

calculs se basant sur les fréquences d’apparition des antigènes sanguins, il est dans ce cas possible d’utiliser les

données issues de la littérature et celles obtenues expérimentalement.

8.2 Distribution générale des antigènes sanguins

8.2.1 Distribution dans une population expérimentale

La distribution de 24 antigènes sanguins a été déterminée chez 52 donneurs de sang volontaires, 31 femmes et

21 hommes. La population testée est principalement caucasienne. Le volume de sang nécessaire à l’utilisation

des kits présentés ci-dessous (120 µL) a été prélevé chez chaque donneur à l’aide des kits Safe-T-Pro plus

(Accu-Check®). Les kits MDMulticards® (Grifols) et ID-Antigen Profile (Bio-Rad) ont été utilisés selon les

recommandations des fabricants (cf. annexe C). Les cartes ID-Antigen Profile ont nécessité la centrifugeuse

ID-centrifuge 12S II (Bio-Rad). Ces différents kits ont permis d’analyser les antigènes suivants :

• MDMulticards® ABO-D-Rh subgroups-K for donors (Grifols) : A, B, Dvi+, Dvi–, C, c, E, e et K (KEL1)

• ID-Antigen Profile I (Bio-Rad) : P1, Lea (LE1), Leb (LE2), Lua (LU1) et Lub (LU2)

• ID-Antigen Profile II (Bio-Rad) : k (KEL2), Kpa (KEL3), Kpb (KEL4), Jka (JK1) et Jkb (JK2)

• ID-Antigen Profile III (Bio-Rad) : M, N, S, s, Fya (FY1) et Fyb (FY2)

Les profils érythrocytaires ont été anonymisés numériquement et comparés entre eux. Pour cela, une conversion

binaire des profils érythrocytaires a été effectuée en attribuant la valeur de 0 pour l’absence d’un antigène et la

75


valeur de 1 pour sa présence. Pour chaque antigène donné et chaque distribution, la fréquence d’apparition a

été calculée.

À partir des données expérimentales obtenues, des mesures de corrélation ont été calculées dans le logiciel

RStudio (Version 0.99.902© 2009-2016 RStudio, Inc.) selon la méthode de Spearman 76.

À partir de données issues de la littérature classifiées en tant que « mondiale » (Chandanayingyong et al., 1979;

Fisher, 1951; Garratty et al., 2004; Howes et al., 2011; Myhre et al., 1980; Nathalang et al., 2001; Stedman,

1972; Wagner et al., 1995) et « caucasienne » (Reid et al., 2012a), et des données expérimentales, la valeur du

pouvoir discriminatoire (DP – cf. équations 8.1 et 8.2) a été calculée selon la formule de Smalldon and Moffat

(1973) pour des variables discrètes non corrélées.

DPk = 1−

kY

i=1

PMi (8.1)

PMi =

nX

j=1

(Pj)2 (8.2)

où DPk est le pouvoir discriminatoire de l’entité k, PMi est la probabilité de

correspondance (probability of match) et Pj, sa proportion dans une population

8.2.2 Fréquence des antigènes sanguins dans la population expérimentale

La fréquence d’apparition des antigènes sanguins testés dans cette population de 52 personnes est donnée dans

le tableau 8.2. Tous les antigènes testés se retrouvent dans la population étudiée. Les antigènes e, k, Kpb et Lub

sont toujours retrouvés dans la population donnée. D’autres, comme les antigènes K et Kpa, sont retrouvés à

moins de 10% dans cette population.

Antigène Fréquence d’apparition (%)

k 100Kpb 100Lub 100e 98s 90

P1 83c 81D 81

Jkb 81Fya 77M 77Fyb 75Leb 73Jka 71N 69C 58S 56A 48E 25

Lea 21B 19

Lua 12K 8

Kpa 4

Tableau 8.2 – Fréquence d’apparition de 24 antigènes sanguins dans une population de 52 donneurs

76. Packages nécessaires : corrplot, car et ade4.

76


Le tableau 8.3 résume les différents phénotypes érythrocytaires détectés dans une population de 52 individus 77.

Le phénotype O a été déduit de l’absence de réaction positive aux antigènes A et B. De même, il est apparu dans

les résultats bruts que les personnes possédant l’antigène D possédaient systématiquement les deux épitopes

Dvi+ et Dvi– ; ces derniers sont groupés dans l’antigène D.

Individus Phénotype érythrocytaire

1 A+, C, c, e, k, Kpb, Jka, P1, Leb, Lub, N, s, Fya, Fyb

2 B+, C, c, e, k, Kpb, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, s, Fya, Fyb

3 A+, C, e, k, Kpb, Jkb, P1, Lea, Lub, M, N, s, Fya, Fyb

4 A-, c, e, k, Kpa, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, N, s, Fya

5 O+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Lub, M, N, S, Fya, Fyb

6 O+, c, E, e, k, Kpa, Kpb, Jkb, P1, Leb, Lub, N, s, Fya

7 O+, C, c, e, k, Kpb, Jkb, P1, Lea, Lub, M, S, s, Fya, Fyb

8 O+, c, E, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, N, S, s, Fya, Fyb

9 AB+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, N, s, Fya

10 A+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, Lea, Lub, M, N, S, s, Fya, Fyb

11 A-, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, Lea, Lub, M, N, S, Fyb

12 O+, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Lea, Lub, M, N, s, Fyb

13 O+, C, c, E, e, K, k, Kpb, Jka, P1, Leb, Lua, Lub, M, N, S, s, Fyb

14 A+, c, E, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, S, s, Fya, Fyb

15 A-, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Lea, Lub, N, S, s, Fya

16 A+, C, e, k, Kpb, Jka, Leb, Lub, N, s, Fya

17 B+, C, e, k, Kpb, Jkb, P1, Leb, Lub, M, S, s Fyb

18 B+, c, E, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, s, Fya, Fyb

19 O+, C, c, E, e, k, Kpb, Jka, Jkb, Leb, Lub, M, N, S, s, Fya, Fyb

20 O+, C, c, e, k, Kpb, Jkb, Lub, N, s, Fya, Fyb

21 B+, c, E, e, k, Kpb, Jka, Jkb, Lub, M, S, s, Fyb

22 A+, C e, k, Kpb, Jkb, P1, Lea, Leb, Lub, M, N, s, Fya

23 A-, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, s, Fya, Fyb

24 O+, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, s, Fya, Fyb

25 A+, C, e, k, Kpb, Jka, P1, Leb, Lub, M, S, s, Fyb

26 AB+, C, c, e, K, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, s, Fyb

27 O-, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, S, s, Fya

28 A+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Lea, Lub, M, S, s, Fya, Fyb

29 B+, C, e, k, Kpb, Jkb, Leb, Lub, M, N, S, s, Fya

30 A+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, S, s, Fya, Fyb

31 O+, C, c, E, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, s, Fya, Fyb

32 O+, c, E, e, k, Kpb, Jkb, P1, Lub, M, N, S, s, Fya, Fyb

33 A+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, N, S, s, Fya, Fyb

34 A+, c, E, e, k, Kpb, Jkb, P1, Leb, Lub, M, S, Fya

35 B+, c, E, e, K, k, Kpb, Jka, P1, Leb, Lub, M, S, Fyb

36 O-, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lua, Lub, M, N, S, s, Fya, Fyb

37 A+, C, c, e, k, Kpb, Jkb, P1, Leb, Lub, M, N, s, Fyb

38 O+, c, E, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Lea, Leb, Lub, M, N, S, Fya, Fyb

39 A-, c, e, k, Kpb, Jkb, P1, Leb, Lub, N, S, s, Fya, Fyb

40 O+, C, e, k, Kpb, Jkb, P1, Lea, Lub, M, s, Fya, Fyb

41 A-, c, e, k, Kpb, Jkb, Lea, Lub, M, N, s, Fyb

42 O+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lua, Lub, M, N, S, s, Fya

43 AB+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lua, Lub, M, S, s, Fya

44 A+, C, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lua, Lub, M, S, s, Fya, Fyb

45 A+, C, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, S, s, Fya, Fyb

46 A+, C, c, e, k, Kpb, Jka, P1, Leb, Lub, M, N, s, Fya, Fyb

47 O-, c, e, k, Kpb, Jka, Jkb, P1, Leb, Lub, M, s, Fya

48 O+, C, e, k, Kpb, Jka, Leb, Leb, N, s, Fya, Fyb

49 B+, c, E, e, k, Kpb, Jka, P1, Leb, Lua, Lub, M, N, S, s, Fyb

50 O+, C, c, e, k, Kpb, Jka, P1, Lua, Lub, M, S, s, Fyb

51 O+, C, e, k, Kpb, Jka, P1, Leb, Lub, M, s, Fya

52 A-, c, e, k, Kpb, Jkb, P1, Leb, Leb, N, s, Fya, Fyb

Tableau 8.3 – Groupes sanguins érythrocytaires de 52 donneursLes individus 1 à 31 sont des femmes – les individus 32 à 52 sont des hommes ;

les symboles « + » et « - » indiquent respectivement la présence et l’absence du facteur Rhésus D.

77. Une représentation plus visuelle de la distribution des antigènes sanguins dans la population expérimentale est présentée enannexe D.

77


La fréquence d’apparition de chaque phénotype est la même (0,02), ce qui équivaut à une apparition unique de

chacun des phénotypes dans cette population. Ce résultat montre que la distribution des 24 antigènes sanguins

étudiés est différente dans une population donnée. L’étude des antigènes sanguins peut être une caractéristique

à rechercher dans les traces de sang pour en différencier des sources de différentes.

8.2.3 Coefficient de corrélation

La matrice de corrélation de Spearman est présentée en figure 8.1. Ce graphique ne représente pas les 24

antigènes testés car les antigènes k, Kpb et Lub sont systématiquement présents chez les 52 donneurs et le D

regroupe les épitopes Dvi+ et Dvi-.

Figure 8.1 – Matrice de corrélation de 21 antigènes sanguins selon le modèle de Spearman ; population de 52 donneurs

Le plus haut score de corrélation est associé au couple Lea-Leb, qui sont corrélés négativement (valeur de -0,64).

Cela implique que dans 64% des cas, la présence d’un des deux antigènes entraîne l’absence de l’autre. Seules

trois couples d’antigènes présentent une corrélation égale ou supérieure à 0,50, les couples C-D et Lea-Leb et

Fya-KEL1 et trois combinaisons d’antigènes (P1-S, N-E et N-Fyb) ne présentent aucune corrélation entre les

deux antigènes (valeur de 0).

78


Au final, sur les 210 paires d’antigènes possibles, près de la moitié des paires (47,14%, soit 99 paires) présente une

corrélation inférieure ou égale à 0,10 en valeur absolue 78 (cf. tableau 8.4). Ce taux chute à 22,86% (48 paires)

lorsque l’intervalle de corrélation est rapporté à une valeur de 0,05. Dans le tableau est également présentée la

position de la médiane qui indique que 50% des antigènes présentent un taux de corrélation inférieur à 0,20. De

ce fait, pour 50% des antigènes étudiés dans la population donnée, la présence de l’un entraîne l’absence ou la

présence d’un autre dans 20% des cas. Ces résultats suggèrent que les antigènes sanguins présentent une faible

corrélation entre eux dans la population donnée.

Intervalle de corrélation Nombre de couples d’antigènes Pourcentage cumulé

0 3 1,43[-0,10 ; 0,10] 98 46,67[-0,20 ; 0,20] 164 78,10[-0,30 ; 0,30] 195 92,86[-0,40 ; 0,40] 205 97,62[-0,50 ; 0,50] 207 98,57[-0,60 ; 0,60] 209 99,52[-0,70 ; 0,70] 210 100,00[-0,80 ; 0,80] 210 100,00[-0,90 ; 0,90] 210 100,00

[-1 ; 1] 210 100,00

Tableau 8.4 – Nombre de paires d’antigènes corrélées par intervalle de corrélationEn rouge, intervalle de corrélation comprenant la médiane.

Ce résultat permet de justifier le choix des équations (6.1) et (6.2) quant au calcul du pouvoir discriminatoire

pour des variables non corrélées. Si plusieurs antigènes sanguins doivent être ciblés dans les traces de sang, aucun

d’entre eux ne montre une forte corrélation avec d’autres antigènes. Les couples Lea-Leb et C-D seraient tout

de même à éviter. Une étude complémentaire pourrait être effectuée en augmentant la taille de la population

et en diversifiant les ethnies ; la population testée dans cette partie étant majoritairement caucasienne.

8.2.4 Pouvoir discriminatoire

Le tableau 8.5 donne les valeurs du pouvoir discriminatoire calculées pour chaque antigène, d’après les données

expérimentales obtenues sur 52 donneurs et des données de la littérature. Pour un même antigène, les différences

s’expliquent par la taille de la population considérée et par l’ethnicité. En effet, les antigènes sont issus du

polymorphisme génétique, caractère qui n’est pas le même selon l’ethnie d’une population. Aussi, le calcul du

pouvoir discriminatoire se base sur la taille et le nombre d’apparition de l’entité dans une population, ce qui

permet d’expliquer des différences entre les données expérimentales réalisées à partir de 52 donneurs et les

données obtenues par la littérature qui se basent sur plus de trois millions de donneurs (comme pour l’antigène

A, d’après Garratty et al. (2004)).

D’après le tableau 8.5, l’antigène A (système ABO – ISBT 001) atteint la valeur maximale (0,50) du pouvoir

discriminatoire dans deux populations, la population caucasienne et la population expérimentale. Cela démontre

que la détection de l’antigène A dans les traces de sang permet de différencier deux traces de sang différentes,

dont l’une possède l’antigène A et l’autre pas, dans 50% des cas et pour chacune des deux populations décrites.

Le tableau 8.6 présente les combinaisons d’antigènes, selon la population, permettant d’atteindre un pouvoir

discriminatoire de 100%. Comme la formule du pouvoir discriminatoire est basée sur une multiplication des

probabilités de correspondance PMi, seules les plus hautes valeurs des PMi de chaque antigène ont été multipliées

afin d’obtenir le pouvoir discriminatoire maximal des combinaisons testées. Il est constaté que selon la population

choisie, le nombre minimal d’antigènes nécessaires pour atteindre un pouvoir discriminatoire de 100% n’est pas

le même : 8 sont nécessaires pour la population « mondiale » alors que pour les populations caucasienne et

expérimentale, il en faut 10. Aussi, les combinaisons d’antigènes ne sont pas identiques entre les trois populations.

78. Les valeurs de corrélation données après sont toujours à considérer en termes de valeur absolue.

79


Cette observation s’explique principalement par le fait que la distribution et les fréquences des antigènes sanguins

diffèrent considérablement par les différences d’ethnies étudiées.

AntigènesPopulation « mondiale »

basée sur la littératurePopulation caucasienne

basée sur la littératurePopulation expérimentale

A 0,48 0,50 0,50B 0,25 0,23 0,31C 0,44 0,44 0,49c 0,47 0,32 0,31D 0,26 0,26 0,31E 0,38 0,41 0,38e 0,31 0,04 0,04

Fya 0,47 0,45 0,36Fyb 0,50 0,28 0,38Jka 0,50 0,35 0,41Jkb 0,50 0,38 0,31K 0,08 0,16 0,14k 0,01 0,00 0,00

Kpa 0,02 0,04 0,07Kpb 0,00 0,00 0,00Lea 0,39 0,34 0,33Leb 0,49 0,40 0,39Lua 0,03 0,15 0,20Lub 0,01 0,00 0,00M 0,34 0,34 0,36N 0,44 0,40 0,43P1 0,49 0,33 0,29S 0,37 0,50 0,49s 0,45 0,20 0,17

Tableau 8.5 – Valeurs du pouvoir discriminant associé à chaque antigèneValeur selon la littérature : calculée d’après les fréquences de chaque antigène trouvé données par la littérature ; valeur expérimentale :

obtenues à partir des 52 donneurs ; en rouge, les valeurs maximales,

Population Nombre d’antigènes Combinaison Pouvoir discriminatoire

1 Fyb 0,502 Fyb, Jkb 0,753 Fyb, Jkb, Jka 0,874 Fyb, Jkb, Jka, Leb 0,94

« Mondiale »5 Fyb, Jkb, Jka, Leb, P1 0,976 Fyb, Jkb, Jka, Leb, P1, A 0,987 Fyb, Jkb, Jka, Leb, P1, A, c 0,998 Fyb, Jkb, Jka, Leb, P1, A, c, Fya 1,001 A 0,502 A, S 0,753 A, S, Fya 0,864 A, S, Fya, C 0,925 A, S, Fya, C, E 0,95

caucasienne6 A, S, Fya, C, E, Leb 0,977 A, S, Fya, C, E, Leb, N 0,988 A, S, Fya, C, E, Leb, N, Jkb 0,999 A, S, Fya, C, E, Leb, N, Jkb, Jka 0,9910 A, S, Fya, C, E, Leb, N, Jkb, Jka, Lea 1,001 A 0,502 A, S 0,753 A, S, C 0,874 A, S, C, N 0,935 A, S, C, N, Jka 0,96

Expérimentale6 A, S, C, N, Jka, Leb 0,977 A, S, C, N, Jka, Leb, E 0,988 A, S, C, N, Jka, Leb, E, Fyb 0,999 A, S, C, N, Jka, Leb, E, Fyb, Fya 0,9910 A, S, C, N, Jka, Leb, E, Fyb, Fya, M 1,00

Tableau 8.6 – Valeur du pouvoir discriminant des combinaisons d’antigènes selon la population d’intérêt

80


Le pouvoir discriminatoire des kits utilisés pour établir les phénotypes érythrocytaires a été calculé dans les

trois populations (cf. tableau 8.7). Ces kits ont l’avantage de combiner plusieurs antigènes sanguins en une seule

analyse, et donc d’augmenter drastiquement le pouvoir discriminatoire. Certains de ces kits ont un pouvoir

discriminatoire très élevé. Cependant, pour utiliser ces kits sur des traces de sang, il est nécessaire de prélever

la trace de sang à tester et de la solubiliser, car seul du sang liquide peut être utilisé. L’utilisation de ces kits

ne semble donc pas adaptée en considérant le pouvoir couvrant d’une méthode permettant d’analyser le groupe

sanguin d’une trace de sang, malgré le haut pouvoir discriminatoire des kits.

Kits & combinaisonsd’antigènes

Population« mondiale »

basée sur la littérature

Populationcaucasienne

basée sur la littérature

Populationexpérimentale

MDMulticards®A/B/D/C/c/E/e

0,96 0,95 0,96

ID-Antigen Profile IP1/Lea/Leb/Lua/Lub 0,85 0,78 0,77

ID-Antigen Profile IIk/Kpa/Kpb/Jka/Jkb 0,75 0,62 0,62

ID-Antigen Profile IIIM/N/S/s/Fya/Fyb 0,97 0,94 0,94

ID-Antigen Profile I-II-III 1,00 0,99 99

Tableau 8.7 – Valeur du pouvoir discriminant calculée selon les kits MDMulticards® (Grifols) et ID-Antigen Profile (Bio-Rad)

L’étude du pouvoir discriminatoire de chaque antigène sanguin a permis de démontrer que certains antigènes

possèdent un potentiel de discrimination plus élevé que d’autres. C’est le cas des antigènes A et S, qui ont

une valeur de 0,50 dans la population caucasienne, alors que la valeur associée à l’antigène Kpb pour cette

même population est de 0,00. Il a également été démontré que ces valeurs changent selon la population

d’intérêt : l’antigène c, par exemple, n’a pas les mêmes valeurs dans les trois populations (0,47, 0,32 et 0,31

respectivement pour les populations « mondiale », caucasienne et expérimentale). Il est donc nécessaire de

prendre en compte la taille et l’ethnie de la population pour se prononcer sur le choix des antigènes sanguins.

Un choix théorique peut ainsi être effectué et a été porté par deux facteurs :

1. Du fait qu’aucun autre travail dans le même domaine n’a été trouvé à ce jour dans la littérature, il a

été nécessaire de développer une méthode d’analyse des antigènes sanguins dans les traces de sang en

tenant en compte des considérations pratiques. Même si en considérant plusieurs antigènes sanguins, le

pouvoir discriminatoire augmente, il n’est pas réaliste d’entreprendre des démarches expérimentales en

considérant plusieurs antigènes sanguins. Afin de mettre en place le protocole expérimental, la décision

a donc été prise de ne retenir qu’un seul antigène sanguin.

2. Enfin, comme cela a été explicité avant, l’utilisation d’un anticoagulant n’est pas souhaitable dans

ce travail de thèse. Il est alors nécessaire de disposer de sang frais sur toute la durée de la partie

expérimentale. Cette requête nécessite donc des prélèvements fréquents de sang sur un même donneur ;

procédure invasive et donc contraignante. Le choix de l’antigène sanguin a donc également été évalué

en fonction du phénotype érythrocytaire du donneur principal.

Pour ces deux raisons, le choix s’est initialement porté sur l’analyse d’un seul antigène sanguin, à savoir

l’antigène A (groupe ABO – ISBT 01). D’autres recherches peuvent être entreprises afin d’étudier la possibilité

de combiner plusieurs antigènes sanguins pour augmenter le pouvoir discriminatoire.

81

Chapitre 9

Détection de l’antigène A dans les traces de sang

Sommaire9.1 Principe de la méthode dot blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

9.2 Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

9.2.1 Préparation des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

9.2.2 Extraction des protéines sanguines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

9.2.3 Analyse par dot blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

9.2.4 Optimisation de la méthode dot blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

9.3 Résultats de la détection de l’antigène A dans les traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . 89

9.3.1 Analyse par ImageJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

9.3.2 Spécificité et sensibilité de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

9.3.3 Impact du temps et du support sur la trace de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

9.3.4 Conclusion sur la détection de l’antigène A dans des traces de sang . . . . . . . . . . 94

9.4 Discussion de la méthode appliquée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

9.4.1 Création des traces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

9.4.2 Extraction des protéines sanguines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

9.4.3 Choix des anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

9.4.4 Détermination de la limite de détection des anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

9.1 Principe de la méthode dot blot

Le chapitre précédent a permis de choisir l’antigène A du groupe ABO comme cible d’intérêt ; il s’agit d’un

choix théorique basé sur les calculs du pouvoir discriminatoire. Pour être définitivement choisi, l’antigène A doit

présenter une certaine stabilité dans les traces de sang, c’est-à-dire qu’il doit rester détectable dans le temps. En

effet, si ce dernier se dégrade dans un intervalle de temps de quelques heures lorsque le sang est sous forme de

trace, alors son utilisation ne serait pas adaptée au contexte d’application. Comme le sang sous forme de trace

est soumis aux conditions environnementales et que les conditions de séchage dépendent également du support,

l’hypothèse selon laquelle l’antigène A se dégrade au cours du temps peut raisonnablement être posée. Il est

toutefois nécessaire d’estimer ce temps, et d’établir un intervalle de détection.

Afin de vérifier cette hypothèse, la présence de l’antigène A dans des traces de sang a été évaluée qualitativement

par la technique du dot blot. Celle-ci consiste à déposer de petits volumes (extraits de protéines, d’antigènes) sur

83


une membrane. Après séchage, celle-ci est immédiatement utilisable pour l’étape d’immunorévélation permettant

de détecter les composés voulus à l’aide d’anticorps (Pflug et al., 1989) (cf. figure 9.1).

Selon la technique du dot blot, différents anticorps peuvent être utilisés. Lorsque le dot blot est réalisé en mé-

thode directe, seul un type anticorps est utilisé. Ce dernier cible l’antigène et est directement détecté, souvent

par immunofluorescence. En méthode directe, le signal lumineux émis peut toutefois être faible. Pour amplifier

ce signal, une méthode indirecte peut être effectuée en utilisant deux types d’anticorps. Les premiers anti-

corps utilisés (anticorps primaires) ciblent l’antigène. Ensuite, d’autres anticorps (anticorps secondaires) ciblent

les anticorps primaires. Ce sont les anticorps secondaires qui sont alors détectés chimiquement, ou également

par immunofluorescence. L’utilisation de couples d’anticorps primaires-secondaires permet d’amplifier le signal

lumineux émis.

D’autres études, également basées sur les dot blots se sont focalisées sur la détection des antigènes sanguins des

groupes ABH dans plusieurs fluides biologiques, tels que la salive (Bolton and Thorpe, 1986; Pflug et al., 1989;

Zhou et al., 1990), la sueur (Pflug et al., 1989), l’urine (Pflug et al., 1989), le sperme (Pflug et al., 1989; Zhou

et al., 1990) ou les sécrétions vaginales (Pflug et al., 1989; Zhou et al., 1990), mais pas dans le sang.

Figure 9.1 – Protocole d’immunodétection du dot blot établi à partir de sang liquide

9.2 Matériel et méthode

9.2.1 Préparation des échantillons

Création des traces de sang

Douze donneurs ont été sélectionnés : trois personnes par groupe sanguin du système ABO (A, B, AB et O)

(cf. tableau 8.3) :

• pour le groupe A : donneurs 3, 41 79, 44 ;

• pour le groupe AB : donneurs 9, 26, 43 ;

• pour le groupe B : donneurs 2, 35, 49 ;

• pour le groupe O : donneurs 8, 40, 42.

Le sang des donneurs a été prélevé à l’aide des kits Accu-Check® Safe-T-Pro plus. Du fait qu’aucun anticoagulant

n’a été utilisé, le sang de chaque donneur a été distribué en aliquots de 20 µL et congelé à -80°C.

Les traces de sang ont ensuite été déposées sur cinq supports :

• lisses : carrelage et verre (lamelle de microscopie) ;

• poreux : papier filtre (Whatman® grade 595), tissu blanc (100% coton) et bois brut d’épicéa.

79. Le sang de ce donneur a également été utilisé pour réaliser tous les tests.

84

Chapitre 9. Détection de l’antigène A dans les traces de sang

4 semaines

3 semaines

2 semaines

1 semaine

x y z

même groupe sanguin

support

trace de sang

(a) Supports concernés : bois, carrelage, tissu et verre

4 semaines 3 semaines

2 semaines 1 semaine

x y

z x

y z

z y

x z

y x

(b) Support concerné : papier filtre

Figure 9.2 – Protocole de dépôt des traces de sang sur les différents supports, avec du sang de trois donneurs (x, y et z )appartenant au même groupe sanguin

L’expérimentation s’est déroulée sur une période de quatre semaines consécutives, avec des intervalles de dépôt

des traces de sang d’une semaine. Une illustration du protocole de dépôt des traces de sang sur les cinq supports

est présentée en figure 9.2.

Chaque semaine, un aliquot par donneur a été décongelé (sous agitation à 500 rpm 80 à 37°C) et le sang (20 µL) a

été déposé sur un support donné. Les supports ont été laissés à l’air libre dans un laboratoire réglé à température

ambiante, ventilé et éclairé principalement à la lumière du jour. A la fin du temps de séchage maximal (quatre

semaines), l’ensemble des traces de sang déposées sur un support ont été prélevées et analysées concomitamment.

Les photographies de l’ensemble des traces de sang déposées sur les cinq supports sont présentées en annexe E.

Prélèvement des traces de sang

La méthode de prélèvement des traces de sang dépend du support :

• pour le carrelage et le verre : le sang a été gratté à l’aide d’un scalpel ;

• pour le papier filtre et le tissu : le support a été découpé ;

• pour le bois : un écouvillon humidifié avec du tampon de lyse RIPA (ThermoFisher Scientific™) a été

utilisé pour prélever la trace de sang, puis le reste de la trace de sang a été gratté avec un scalpel.

Préparation des contrôles

Pour chaque donneur et chaque support, un aliquot de sang supplémentaire a été décongelé à température

ambiante. Le sang n’a pas été déposé en tant que trace de sang, mais directement utilisé lors de l’étape d’ex-

traction des protéines sanguines décrite ci-dessous. Cela permet d’obtenir un référentiel au temps zéro avec du

sang liquide lors de l’analyse de l’ensemble des traces de sang.

Un aliquot de sang a également été utilisé lors des dot blots afin d’obtenir un contrôle supplémentaire. Ce

contrôle a pour but d’obtenir la réponse opposée à celle souhaitée sur l’ensemble de la membrane. Ainsi, un

aliquot de sang congelé :

• de groupe O a été utilisé lors des dot blots réalisés avec les extraits de sang des groupes A et AB ;

• de groupe A a été utilisé lors des dot blots réalisés avec les extraits de sang des groupe B et O.

80. rpm : rotation par minute

85


9.2.2 Extraction des protéines sanguines

Chaque spécimen (prélèvements des traces de sang et des contrôles) a été transféré dans un tube Eppendorf®

de 200 µL contenant 40 µL de tampon de lyse RIPA (ThermoFisher Scientific™) ; à l’exception des prélèvements

issus du bois, où le volume de RIPA a été augmenté à 100 µL afin de pouvoir immerger l’écouvillon. Les tubes

ont été incubés sous agitation (500 rpm) pendant trente minutes. Après l’incubation, chaque prélèvement a

été transféré dans un tube pour centrifugeuse contenant un filtre d’acétate (Corning® Costar® Spin-X® stérile,

pore de 0,45 µm ; Sigma-Aldrich®) puis centrifugé à 2’500g pendant 5 minutes. Le filtrat obtenu contient donc la

portion de sang remise en solution avec les extraits de protéines cellulaires et plasmatiques.

9.2.3 Analyse par dot blot

Lors des étapes décrites ci-dessous, il est convenu que les étapes se sont déroulées à température ambiante.

Sensibilité et spécificité

En statistiques, et plus particulièrement dans le domaine de la médecine (Loong, 2003; Zhu et al., 2010), la

sensibilité d’une méthode est la faculté du test à obtenir la caractéristique réelle de l’élément analysé. Cette

meure permet donc d’estimer le taux de faux négatif de la méthode (équation 9.1). À l’opposé, la spécificité est

la faculté du test à ne pas donner une caractéristique erronée de l’élément analysé, donc d’estimer le taux de

faux positif (équation 9.2). Ainsi, en augmentant la sensibilité, le taux de faux négatif diminue et en augmentant

la spécificité, le taux de faux positif diminue.

sensibilite =V P

V P + FN(9.1)

specificite =V N

V N + FP(9.2)

où FN = faux négatif ; FP = faux positif ; VN = vrai négatif ; VP = vrai positif

Pour chaque groupe sanguin, douze traces de sang ont été déposées sur chaque support, auxquels s’ajoutent les

contrôles. Au total, 300 traces de sang ont été analysées par cette technique, soit 150 traces contenant l’antigène

A (groupes A et AB – étude de la sensibilité) et 150 ne le contenant pas (groupes B et O – étude de la spécificité).

Dépôt des échantillons sur la membrane

Après avoir activé la membrane LF-PVDF (Low-Fluorescence Polyvinylidene DiFluoride ; pore de 0,2 µm ;

ThermoFisher Scientific™) selon les recommandations du fabricant (cf. annexe C), des spots de 2 µL des filtrats

de sang ont été déposés sur la membrane (cf. figure 9.3) :

• les extraits des traces de sang issus d’un même support et d’un même groupe sanguin ont été déposés de

façon à les rassembler par temps de séchage et en conservant l’ordre des donneurs ;

• trois contrôles ont été déposés :

1. le volume du contrôle de sang décongelé, permettant d’effectuer un contrôle inverse, comme indiqué

précédemment ;

2. le contrôle négatif, en déposant un volume du tampon RIPA ;

3. le contrôle positif, en déposant un volume d’anticorps primaires anti-A.

La membrane a été laissée à l’air libre pendant trente minutes afin que les dépôts puissent sécher.

86


x y z

1 2 3

4 semaines

x y z

3 semaines

x y z

1 semaine

x y z

2 semaines

x y z

temps zéro contrôles

Figure 9.3 – Protocole de dépôt des extraits de sang d’un même groupe et issus du même support, sur une membrane LF-PVDFLe coin biseauté en haut à gauche permet de repérer l’orientation de la membrane ; les lettres x, y et z correspondent aux mêmes

donneurs que ceux de la figure 9.2 ; les contrôles suivent la même numérotation que dans le texte.

Immunorévélation

Le protocole développé est repris depuis des articles ayant procédé à la détection d’antigènes par immunodé-

tection (dot blot, reverse ELISA) (Bolton and Thorpe, 1986; Pflug et al., 1989; Zhou et al., 1990). Toutes les

immersions ont été effectuées à température ambiante et sous agitation à 100 rpm.

La membrane a été immergée dans une solution de blocage (5% lait en poudre dilués dans du TTBS 81) pendant

trente minutes. La membrane a été incubée deux heures dans une solution d’anticorps primaires anti-A (issus

du clone BIRMA-1, IgM de souris – Bioscot® reagents Merck Millipore) diluée 100 fois dans un autre volume de

solution de blocage. Après trois lavages successifs de cinq minutes au TTBS, la membrane a été immergée deux

heures dans une solution d’anticorps secondaires de lapin anti-IgM de souris couplés à la phosphatase alcaline

(AP) (Novus, n° NBP1-72685) diluée 10’000 fois dans du TTBS (concentration finale = 1.10-5 mg/mL). Deux

nouveaux lavages à l’aide de TTBS ont été effectués, puis les anticorps secondaires ont été révélés avec le kit

Novex® AP Chromogenic Substrate (ThermoFisher Scientific™) pendant deux minutes.

Enregistrement et traitement des images

Les membranes ont été sauvegardées numériquement à l’aide d’un scanner Epson Perfection V330 avec les

paramètres suivants :

• mode : professionnel ;

• type de document : opaque ;

• source du document : vitre d’exposition ;

• option d’auto exposition : photo ;

• type d’image : 24-bits Couleur ;

• résolution : 600 ppp ;

• ajustement : netteté(K).

Par la suite, les images ont été rognées et converties en niveaux de gris (mode 8-bit) à l’aide du logiciel ImageJ

(Schneider et al., 2012). Le plugin "Protein Array Analyzer" (Gilles, 2010; Orgaz et al., 2014) a été utilisé afin

d’analyser les membranes selon les paramètres suivants :

• background subtracted : linear ;

• radius for 2D rolling ball : 75 ;

• normalized contrast : 0,00%.

81. TTBS : Tween 20 - Tris/Glycine/SDS ; 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7,5. La solution de blocage, qui estoptionnelle, permet d’éviter la fixation des anticorps primaires non spécifique sur la membrane.

87


Chaque spot (point) a été détouré à l’aide de l’outil de sélection proposé et les valeurs des aires intégrées ont été

sauvegardées. Les mesures d’intensité sont données par ImageJ en tant que "Integrated Area", qui correspond

au produit de niveau de gris par l’aire mesurée.

Traitement des données

Afin de pouvoir comparer les données entre différentes membranes, deux étapes ont été effectuées :

1. la valeur du contrôle négatif (spot 2 – RIPA) a été soustraite de chaque point ;

2. chaque valeur a été normalisée à la valeur du contrôle positif (spot 3 – anticorps primaires anti-A).

Pour comparer les moyennes obtenues (moyennes par donneur, par groupe et par support), le t-test (ou Welch

test dans le cas où les variances ne sont pas les mêmes) a été utilisé. Lorsque les différences observées entre les

moyennes sont significatives, l’ampleur de cette différence est évaluée par le calcul du êta-carré (⌘2) :

⌘2 =t2

t2 + (N +N − 2)(9.3)

où t est la valeur du t-test obtenue et N, l’effectif du groupe.

Lorsque la valeur du ⌘2 est proche de (SPSS, 2017) :

• 0,01, alors la différence est faiblement significative ;

• 0,06, alors la différence est modérément significative ;

• 0,14, alors la différence est fortement significative.

Afin de visualiser les résultats, des box-plots ont été créés à l’aide du logiciel OriginLab® (Origin 2016).

9.2.4 Optimisation de la méthode dot blot

Tous les tests effectués dans l’optique du développement et de l’optimisation de la méthode du dot blot ont été

réalisés à partir d’un même donneur. Avant de travailler avec des traces de sang, les tests ont été réalisés à partir

de sang liquide, fraichement récolté pour travailler dans des conditions optimales. Le fait de travailler avec des

traces de sang ajoute une difficulté supplémentaire quant à l’influence de l’environnement sur la composition

du sang qui sèche et coagule.

Trois membranes ont été testées ; à savoir les membranes en biodyne, en nitrocellulose et en polyfluorure de

vinylidène (PVDF).

Protocole d’extraction des protéines sanguines

Afin d’extraire les protéines, plusieurs kits ou solutions de lyses cellulaires ont été testés. Comme les antigènes

sanguins A sont principalement retrouvés au niveau des membranes plasmiques des globules rouges, un kit

permettant l’extraction des protéines membranaires a initialement été utilisé, le kit Mem-PER™ Plus Membrane

Protein Extraction (ThermoFisher Scientific). Le protocole choisi pour l’extraction de protéines cellulaires issues

d’une suspension de cellules de mammifères (présenté en annexe C) consiste en deux étapes principales :

1. une lyse cellulaire et la récupération des protéines cytoplasmiques et nuclaires ;

2. la récupération des protéines membranaires.

88


Détermination de la limite de détection des anticorps primaires

Différents tests ont été réalisés afin d’optimiser les dilutions des anticorps primaires et secondaires utilisés. Le

fournisseur des anticorps secondaires anti-IgM de souris (Novus) préconise une dilution de 20’000 fois pour les

techniques d’immunorévélation. Afin d’assurer une bonne amplification du signal lorsque les traces de sang sont

âgées et pour compenser la dégradation envisagée de l’antigène A dans les traces de sang, une dilution de 10’000

fois a été choisie au préalable.

9.3 Résultats de la détection de l’antigène A dans les traces de sang

9.3.1 Analyse par ImageJ

La figure 9.4 illustre l’application du script ImageJ avec la fonction "Protein Array Analyzer". La première

étape consiste en la conversion en niveaux de gris de l’image originale. La seconde étape colore numériquement

les intensités de niveaux de gris, après qu’une soustraction du bruit de fond ait été effectuée. La coloration, ici

violette sur fond bleu, est juste visuelle et peut être changée.

(a) image originale (b) conversion en niveaux de gris

(c) coloration des niveaux de gris

Figure 9.4 – Conversion d’une image selon la fonction "Protein Array Analyzer" (ImageJ) – grossissement 0.7xL’image originale est une membrane en PVDF sur laquelle ont été déposées de sang issu de traces de sang A déposées sur du tissu.

9.3.2 Spécificité et sensibilité de la méthode

Visuellement, la présence de l’antigène A entraîne un noircissement dans les dépôts analysés par dot blot sur

les membranes en PVDF, comme présenté à la figure 9.5. La différence de coloration est distincte entre un

89


résultat positif (groupes A et AB) et un résultat négatif (groupes B et O) 82. Dans l’exemple illustré, l’influence

du temps ne semble pas engendrer une variation dans la coloration observée. Théoriquement, la diminution de

la quantité de l’antigène A devrait engendrer une diminution de la réaction colorimétrique au cours du temps.

Visuellement, cette observation n’est pas remarquée.

Figure 9.5 – Résultats observés sur des membranes PVDF – grossissement 0.8xTraces de sang déposées sur du verre.

En considérant tous les supports et tous les temps de séchage, les valeurs numériques liées aux intensités mesurées

sont présentées dans la figure 9.6. Les résultats observés sont cohérents avec ce qui était attendu, à savoir une

coloration noire en présence de l’antigène A, qui est présent dans les traces de sang de groupes A et AB. De

plus, les données mesurées pour les traces de sang de groupes A et AB sont significativement supérieures à celles

mesurées pour les groupes B et O (cf. tableau 9.1).

Couple de groupe sanguin p-value ⌘2 interprétationA vs. AB 2,9.10-03 0,06 différence modérément significativeA vs. B 4,7.10-20 0,50 différence fortement significativeA vs. O 2,5.10-21 0,54 différence fortement significative

AB vs. B 1,8.10-41 0,76 différence fortement significativeAB vs. O 4,5.10-40 0,82 différence fortement significativeB vs. O 1,9.10-04 0,09 différence modérément significative

A/AB vs. B/O 9,9.10-46 0,58 différence fortement significative

Tableau 9.1 – Valeurs des tests statistiques (t-test et test de Welch) calculées

Les données enregistrées pour les groupes A et AB sont plus dispersées que celles obtenues pour les groupes

B et O, ce qui était attendu du fait de l’absence d’antigène A dans les groupes B et O. La variation du signal

mesuré dans ces deux groupes est de ce fait faible, même si certaines mesures liées au groupe B donnent une

réponse conséquente, pouvant être assimilée à des faux positifs.

En considérant cette méthode, le taux de faux négatif (sensibilité) est de 6,00% et le taux de faux positif (la

spécificité) est de 2,00%. En considérant la courbe ROC, l’aire sous la courbe est de 0,978, suggérant une bonne

performance de la méthode de détection de l’antigène A dans des traces de sang par dot blot.

82. Toutes les membranes sont présentées en annexe F.

90


Figure 9.6 – Distribution des données classées par groupe sanguin, temps de déposition et supports confondusChaque point correspond à une réponse colorimétrique mesurée d’une trace de sang déposée à l’instant t sur un support donné (n=75) –

valeurs normalisées comme indiqué à la section 9.2.3.

Faux positif - cas d’un donneur de groupe B

La complexité du groupage sanguin réside dans l’existence de groupes rares, où certains antigènes A et B ne

réagissent pas aux anticorps conventionnels, n’engendrant dès lors pas d’agglutination cellulaire. Les groupes

A3, Ax, Aend, Am, Ael et Ay sont classés comme rares pour le groupe A, et les groupes B3, Bx, Bm et Bel le

sont pour le groupe B. Beck et al. (1989) ont par ailleurs décrit le phénotype B(A), dans lequel certaines cellules

de groupe B peuvent s’agglutiner avec des anticorps monoclonaux anti-A puissants. Ce phénotype s’explique du

fait que l’enzyme responsable de la synthèse du D-galactose (déterminant antigénique du groupe B) est aussi

capable de former de petites quantités de N-acétyl-galactosamine (déterminant antigénique du groupe A).

Les faux positifs engendrés par le groupe B proviennent du même donneur (#49) 83 et ont été observés sur quatre

des cinq supports testés, à l’exception du verre. D’autres tests pourraient être entrepris pour identifier un groupe

rare, à savoir les techniques de fixation-élution, l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique. Les glycosyltransférases

présentes dans le sang, voire les allèles des gènes peuvent également être identifiés.

Du fait que seul le sang du donneur #49 engendre une coloration, il peut être émis l’hypothèse selon laquelle ce

donneur possède des antigènes A faibles. Les colorations observées pourraient être dues aux longues incubations

d’anticorps primaires et secondaires (deux fois deux heures) effectuées lors des dot blots.

Autres sources possibles des antigènes sanguins des groupes ABH

Les antigènes des groupes sanguins ABH se retrouvent dans d’autres fluides que le sang. Chez les personnes

sécrétrices, les antigènes se retrouvent par exemple dans la salive (Schiff and Sasaki, 1932; Stedman, 1972). Dans

le cadre de mélanges de fluides, par exemple une trace de sang et une trace de salive, il serait théoriquement

possible d’obtenir des résultats positifs dus à la présence de l’antigène A dans la salive, et non dans le sang. Il

serait intéressant d’étudier la limite de détection de la méthode pour l’antigène A dans la salive.

83. La vérification des tests de groupage sanguin (MDmulticard® – Grifols) confirme le groupe sanguin B.

91


D’autres études ont également montré la présence d’antigènes sanguins ABO équivalents chez certaines bactéries

et d’autres animaux, tels que les primates (de la Rivière and Eyquem, 1953). Un résultat positif lié à la détection

de l’antigène A n’est donc pas à considérer comme un test indicatif du fluide biologique sanguin humain.

9.3.3 Impact du temps et du support sur la trace de sang

L’une des hypothèses émises était que l’antigène A se dégraderait au cours du temps dans les traces de sang. Les

conditions environnementales (température et l’humidité) favorisent plus ou moins rapidement l’évaporation de

la phase liquide. Outre l’évaporation, le sang peut également coaguler en dehors de l’organisme. En raison de

la dégradation structurale des traces de sang et de la dégradation des cellules et des métabolites, il était donc

attendu que le signal relatif à la quantité d’antigène A diminuerait au cours du temps.

La figure 9.7 illustre les résultats observés au cours du temps, tous supports confondus, et classés par groupe

sanguin. Pour les traces de sang de groupes A, les moyennes et médianes mesurées au cours du temps tendent à

diminuer, mais en considérant les dispersions des données, cette observation n’est pas aussi prononcée. D’autre

part, les moyennes et médianes mesurées à chaque temps pour les traces de sang de groupe AB n’indiquent pas

une diminution de la réponse avec l’âge des traces de sang.

Figure 9.7 – Évolution de la réponse colorimétrique obtenue en fonction du temps, tous supports confondusChaque point correspond à la moyenne mesurée des trois traces crée à un instant t sur l’ensemble des supports (n=15) – valeurs

normalisées comme indiqué à la section 9.2.3.

92


Cinq supports ont été testés dans le but d’avoir un aperçu de leur influence sur le séchage des traces de sang et

donc sur la détection de l’antigène A : trois supports poreux (bois, papier filtre et tissu) et deux supports lisses

(céramique et verre). Bien que ces supports puissent être fréquemment retrouvés dans des habitations et donc

être le support de traces de sang, le papier filtre est moins propice à ces cas. Ce support a principalement été

choisi pour ses propriétés favorisant la diffusion du sang dans le support. Aussi, étant un support fin (pouvant

être assimilé à un support en deux dimensions, si l’épaisseur du support est réduite), le sang est en contact avec

de l’air sur quasiment 100% de sa surface. Cela n’est pas le cas pour les autres supports testés. L’influence de

l’air peut donc être prise en considération avec le papier filtre.

La figure 9.8 représente les résultats pour chaque support testé. Pour les traces de sang de groupe A, la diminution

des valeurs mesurées est uniquement observable pour le bois. Pour les autres supports, les moyennes stagnent ou

augmentent, comme pour la céramique. Les résultats sont plus homogènes pour les traces de sang de groupe AB,

où les moyennes calculées varient moins au cours du temps. Les valeurs augmentent toutefois pour la céramique.

Les tests statistiques effectués ne montrent pas de différences significatives entre les différents temps de séchage

au sein d’un même groupe sanguin ; exception faite pour les traces de sang de groupe AB entre quatre semaines

et du sang frais (p-value = 0,029 pour ↵=0,05, bilatéral).

Figure 9.8 – Évolution de la réponse colorimétrique obtenue en fonction du temps et du supportLe point correspond à la moyenne mesurée des trois traces crée à un instant t sur chaque support ;la barre d’erreur indique l’écart-type (n=3) – valeurs normalisées comme indiqué à la section 9.2.3.

93


Par rapport aux traces de sang de groupe B, et spécialement par rapport au donneur #49, il est remarqué que

la plus haute valeur associée à un faux positif est observée à trois semaines sur de la céramique.

Il est toutefois difficile d’estimer l’influence du support sur les résultats observés. En effet, pour extraire les anti-

gènes sanguins, les traces de sang ont été préalablement prélevées. Selon le support, la méthode de prélèvement

a été adaptée :

• grattage au scalpel sur la céramique et le verre ;

• découpage du support pour le papier filtre et le tissu ;

• prélèvement à l’aide d’un écouvillon pour le bois.

La méthode de prélèvement peut expliquer en partie les résultats obtenus. Par exemple, les traces de sang

déposées sur le bois ont été prélevées en frottant un écouvillon. Le sang diffuse en profondeur dans le bois,

nécessitant dès lors différents temps de prélèvement et de force exercée sur l’écouvillon.

La méthode optimale est celle du découpage qui a permis de récupérer l’entièreté du sang. Cependant, la diminu-

tion théorique du signal n’a pas été observé avec cette technique, engendrant même une certaine augmentation,

comme pour les traces de sang de groupe AB déposées sur du papier filtre.

En comparant les données issues des traces de sang de groupe A et AB déposées sur du papier filtre, les

résultats ne sont pas les mêmes. Une diminution de la réponse est observée pour les traces de sang A alors que

les réponses mesurées augmentent pour les traces de sang de groupe AB. La diffusion du sang dans le papier

filtre et l’influence de l’air sur le séchage du sang ne semble donc pas entraîner une variation significative.

9.3.4 Conclusion sur la détection de l’antigène A dans des traces de sang

Dans ces conditions expérimentales, les réponses relatives aux intensités de la coloration en présence d’antigène

A ne diminuent pas significativement au cours des quatre semaines d’étude. Ces résultats ne semblent pas être

liés au support, ni au donneur du sang du fait que des résultats opposés ont été observés avec un même support.

Les variables entrant en jeu pour expliquer ces observations seraient dès lors intrinsèques à la composition du

sang et aux modifications physico-chimiques engendrées par le séchage du sang.

Il n’a pas pu être démontré que le taux d’antigènes sanguins A diminue au cours du temps dans des traces de

sang. Même en l’absence d’une diminution de la réponse colorimétrique, la dégradation des composés cellulaires

et des métabolites favoriseraient l’accessibilité des anticorps primaires aux antigène A.

Toutefois, ces résultats montrent que la méthode appliquée, permet de détecter les antigènes sanguins A dans

des traces de sang de groupes A et AB, après un mois de séchage.

9.4 Discussion de la méthode appliquée

9.4.1 Création des traces

Conservation du sang au congélateur

Il a été choisi de congeler le sang des donneurs afin de simplifier la procédure de prélèvement du sang. En effet, la

méthode de prélèvement est invasive et il était plus pratique au niveau de l’organisation de prélever un volume

de sang plus grand en une fois, puis de le congeler, que de demander aux différents donneurs de venir donner

leur sang quotidiennement.

En transfusion sanguine, la conservation du sang nécessite systématiquement l’utilisation d’anticoagulant pour

prévenir de la coagulation du sang en dehors de l’organisme. Selon l’anticoagulant et le format de conservation,

94


les conditions de stockages changent. Lorsque le sang n’est plus dans les mêmes conditions physiologiques,

plusieurs changements structurels des éléments figurés sont attendus, tels que la formation d’echinocytes 84 et

d’expansions cytoplasmiques des plaquettes. En dessous de 5°C, une lyse cellulaire est également attendue. Pour

prévenir de la lyse cellulaire, du glycérol ou du manitol peuvent être ajoutés ; les cellules devant alors être lavées

avant d’être transfusées. Lorsque du sang a été conservé à basse température, il doit être agité lorsqu’il est

réchauffé à 37°C, sa température optimale, pour éviter la sédimentation des éléments fracturés.

De même, l’étude de la stabilité de l’antigène A dans les traces de sang n’a pas eu pour but de quantifier ou

de semi-quantifier ces antigènes. Les expériences ont été développées à but qualitatif et semi-quantitatif, afin

d’évaluer si l’antigène A était toujours présent ou non dans des traces de sang après un certain nombre de

jours de séchage. De ce fait, même si l’antigène A est dégradé par les étapes de congélation et de décongélation,

les résultats indiquent toujours une réponse positive de la présence de l’antigène A dans les traces de sang.

L’incertitude liée au protocole de conservation du sang pourrait donc négligeable.

Concernant les différents temps de séchage, des tests ont été effectués sur un délai de 24h, avec des traces de

sang déposées toutes les deux heures. Du fait que l’antigène A est détecté après un jour, ces temps de séchage

ont été supprimés du protocole.

Volume des traces de sang

Un volume fixe pour les traces de sang a été choisi et fixé à 20 µL. Aucun test de détectabilité liée au volume

des traces de sang n’a été réalisé dans cette thèse. Des analyses effectuées avec des volumes plus petits, comme

de l’ordre du microlitre, pourraient être effectuées afin de détecter la limite de détection de l’antigène A dans

des traces de sang.

9.4.2 Extraction des protéines sanguines

Pour extraire les protéines membranaires, le tampon de lyse RIPA (ThermoFisher Scientific™) a été utilisé. Un

kit d’extraction de protéines membranaires avait été testé au préalable. Le kit Mem-PER™ Plus Membrane

Protein Extraction (ThermoFisher Scientific™) peut être employé afin d’extraire des protéines membranaires

issues de cellules en cultures (cellules adhérentes ou en suspension) ou de tissus (mous ou durs). Bien que le

sang soit un tissu, le protocole relatif à une « suspension de cellules de mammifères » a été préféré par rapport

au protocole relatif aux « tissus mous ». En effet, ce dernier prévoit de découper les échantillons mous à l’aide

de ciseaux, ce qui n’est pas possible avec le sang.

Deux explications peuvent justifier l’utilisation du RIPA :

1. Le kit Mem-PER™ Plus nécessite plusieurs mélanges de tampon et de manipulations à l’aide de micropi-

pettes. Du fait du faible volume de sang, des difficultés techniques apparaissent lorsqu’il est nécessaire de

ne récupérer que le culot engendré par les cycles de centrifugation.

2. Le kit Mem-PER™ Plus permet de récupérer les protéines membranaires et/ou cytoplasmiques alors que le

tampon RIPA permet d’obtenir l’ensemble des protéines du sang, donc également celles du plasma. L’an-

tigène A pouvant se trouver sur des résidus libres dans le plasma, une plus grande proportion d’antigène

A est théoriquement récupérée avec le tampon RIPA.

9.4.3 Choix des anticorps

L’espèce hôte des anticorps primaires est primordiale. Pour plusieurs antigènes sanguins, il existe des anticorps

primaires issus de l’espèce humaine. Le problème en choisissant de tels anticorps est que les anticorps secondaires

84. Globules rouges déformés qui ont une forme épineuse, dont le rapport surface sur volume diminue.

95


utilisés doivent être spécifiques aux anticorps primaires d’origine humaine. Or, le sang humain contient dans son

plasma de hautes concentrations d’anticorps, IgG et IgM. Des réactions croisées entre des anticorps secondaires

dirigés contre les anticorps humains ont donné des faux positifs. En effet, les anticorps secondaires se fixaient sur

des IgM humains, sans que ces dernières ne soient fixées aux antigènes donnés. Il a donc fallu choisir des anticorps

primaires d’une espèce autre qu’humaine pour limiter les risques de réactions croisées lors de l’utilisation des

anticorps secondaires.

Initialement, des anticorps secondaires marqués avec l’HRP (horseradish peroxidase) avaient été choisis. Cepen-

dant, il a été constaté et confirmé par certains fournisseurs de produits biologiques (Abcam, 2017; Sigma-Aldrich,

2017) que :

• les azotures de sodium contenus dans le tampon de conservation des anticorps primaires anti-A sont des

inhibiteurs irréversibles de l’HRP. En effet, lors des dot blots réalisés, des faux positifs (noircissement des

spots contenant uniquement des anticorps primaires) ont été observés dès l’immersion de la membrane lors

du bain d’anticorps secondaires ; les spots se sont noircis avant que le substrat de l’HRP ne soit ajouté.

• l’HRP réduisant les peroxydes d’oxygène, des faux positifs ont été observés lorsque du sang était immergé

dans une solution contenant des anticorps secondaires couplés à l’HRP. De plus, du fait de la dégradation

de l’hémoglobine dans le sang, la concentration en peroxyde d’oxygène augmente, ce qui amène à la

réaction de l’HRP.

Ces constatations ont de fait orienté le choix d’anticorps couplés avec une autre enzyme, telle que la phosphatase

alcaline (AP).

Pour le contrôle de spot de sang sur la membrane, n’ayant pas trouvé de glycoprotéines recombinantes de

l’antigène A, il a été décidé d’utiliser directement les anticorps primaires afin de montrer la réaction des anticorps

secondaires. La spécificité des anticorps primaires anti-A sur l’antigène A est contrôlée par le spot de sang de

contrôle et le contrôle négatif. De même, les anticorps primaires anti-A sont ceux utilisés en transfusion sanguine,

ce qui ajoute un haut niveau de confiance dans la spécificité de ces derniers.

9.4.4 Détermination de la limite de détection des anticorps

Les protocoles mentionnés dans la littérature proposent généralement de laisser incuber les membranes dans

les différents bains d’anticorps environ une heure à température ambiante ou une nuit à 4°C. Lors de la partie

centrée sur l’étude de la stabilité de l’antigène A, les temps d’incubation des membranes ont été augmentés à

deux heures à température ambiante. Cela pour deux raisons principales :

1. Les anticorps primaires dans ce travail ne sont pas des anticorps primaires classiquement utilisés pour les

techniques de dot blots ; ce sont des anticorps utilisés pour la détermination en transfusion sanguine des

phénotypes érythrocytaires. De ce fait, la concentration des anticorps dans le tampon n’est pas maximale ;

augmenter les temps d’incubation permet de combler cette différence. 85

2. Comme il est attendu que l’antigène A se dégrade au cours du temps, il est de ce fait attendu que leur

concentration diminue également avec des temps de séchage des traces de sang plus importants. Prolonger

les temps d’incubation dans les bains d’anticorps permet d’augmenter le nombre de liaisons des anticorps

avec les antigènes, même si cela risque d’augmenter le bruit de fond sur la membrane.

85. Des anticorps primaires utilisés pour la détermination des phénotypes érythrocytaire ont été choisis dans l’optique d’utiliserces mêmes anticorps directement sur des traces de sang. En effet, étant des IgM, ces anticorps possèdent des caractéristiquesd’agglutination beaucoup plus intéressantes que les IgG usuellement utilisées lors des dot blots.

96

Conclusion de la partie IV

La partie IV a eu pour but de choisir l’antigène sanguin qui avait le plus haut pouvoir discriminatoire des traces

de sang à partir de leur source. Deux principaux critères ont été posés pour effectuer ce choix :

1. théorique : en étudiant les coefficients de corrélations et le pouvoir discriminatoire des antigènes sanguins ;

2. pratique : en étudiant l’accessibilité de l’antigène sanguin sélectionné dans les traces de sang.

Lors du chapitre lié au choix théorique, l’étude de dépendance a montré que parmi les 24 antigènes sanguins

présélectionnés, seuls les trois couples C-D, Lea-Leb et Fya-Kpa présentaient une corrélation égale ou supérieure

à 0,50 (en valeur absolue). Dans l’optique d’utiliser plusieurs antigènes sanguins, ces couples seraient donc à

éviter, du fait de leur forte dépendance.

Les calculs de pouvoir discriminatoire ont été effectués dans trois populations différentes, dont deux basées sur

la littérature, une « mondiale » regroupant diverses ethnies et une caucasienne, et une population expérimentale

(n=52, principalement caucasienne). Les antigènes sanguins qui présentent au taux de discrimination de 0,50

(valeur maximale obtenue pour un antigène sanguin) sont :

• dans la population « mondiale » : Fyb, Jka et Jkb ;

• dans la population caucasienne : A et S ;

• dans la population expérimentale : A.

Afin d’augmenter la valeur du pouvoir discriminatoire, il est nécessaire d’augmenter le nombre d’antigènes

sanguins étudiés. Le nombre et les combinaisons des antigènes diffèrent selon la population étudiée : huit pour

la population « mondiale » et dix pour les deux autres populations.

Bien qu’étudier plusieurs antigènes sanguins augmente le pouvoir discriminatoire de la méthode, tout le protocole

de recherche doit être développé. C’est pour cela qu’un seul antigène, et non une combinaison d’antigènes

sanguins, a initialement été choisi. D’autres recherches pourront dès lors s’appuyer sur ces résultats pour choisir

et combiner d’autres antigènes par la suite. Aussi, du fait qu’aucun anticoagulant n’est souhaité pour cette

recherche, du sang frais doit fréquemment être prélevé. La procédure invasive du prélèvement de sang limite le

nombre de donneur. Pour réduire l’inter-variabilité de la composition du sang, un seul donneur a été choisi pour

établir le protocole d’analyse. De ce fait, l’antigène A du groupe sanguin ABO (ISBT 001) a été sélectionné.

Le second critère, confirmant par la pratique le choix théorique, fut de déterminer si l’antigène A restait accessible

et détectable dans les traces de sang après plusieurs jours de séchage. L’étude menée a permis d’étudier cela en

créant des traces de sang des quatre groupes sanguins A, AB, B et O sur cinq supports (bois, céramique, papier

filtre, tissu et verre) et vieillies jusqu’à un mois. Les résultats ont montré que l’antigène A reste détectable

dans des groupes A et AB, déposées sur quatre supports et jusqu’à un mois de séchage des traces de sang. En

outre, l’absence de cet antigène dans des traces de sang de groupes B et O est confirmée sur ce même intervalle

de temps. La méthode de détection utilisée ici est le dot blot, qui utilise des anticorps primaires anti-A (clone

BIRMA-1, IgM de souris, Bioscot®) et secondaires (anti-IgM de souris, ThermoFisher Scientific™).

97

Cinquième partie

Transposition de la méthode vers

l’opérationnel

99

Chapitre 10

Concepts de la méthode pour une adaptation vers l’opéra-

tionnel

Sommaire10.1 Propositions de l’adaptation du protocole dot blot sur des lieux . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

10.1.1 Transfert des traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

10.1.2 Suppression de l’immersion d’anticorps primaires anti-A . . . . . . . . . . . . . . . . 103

10.1.3 Réduction des temps d’immersion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

10.2 Concept général de la méthode proposée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

10.3 Hypothèse sur la coloration du médium et des traces de sang transférées . . . . . . . . . . . 106

Lors du chapitre précédent, les résultats ont confirmé que l’antigène A était détectable par la technique du

dot blot. Si ce dernier permet d’étudier la détection de l’antigène A dans des traces de sang, ce protocole n’est

cependant pas applicable sur les lieux. Il nécessite beaucoup de matériel, dont une centrifugeuse, et requiert

beaucoup de temps (plus de six heures). Il est ainsi nécessaire de le simplifier en réduisant le matériel requis, le

temps d’analyse et le nombre d’étapes, particulièrement celle relative au prélèvement de la trace de sang.

L’objectif de ce chapitre est d’expliquer la démarche d’adaptation du protocole pour le rendre applicable à une

utilisation sur les lieux. Les concepts généraux sont présentés ici, à l’instar du chapitre suivant, qui présentera

les expérimentations réalisées.

10.1 Propositions de l’adaptation du protocole dot blot sur des lieux

En regard du protocole d’immunodétection développé lors du dot blot (cf. figure 10.1a), trois pistes sont envi-

sagées afin de réduire la durée d’une analyse (classement par ordre de priorité) :

1. supprimer l’étape du prélèvement de la trace de sang et de sa solubilisation dans un tube (cf. figure 10.1b) ;

2. supprimer l’étape d’immersion dans la solution d’anticorps primaires (cf. figure 10.1c) ;

3. réduire les temps d’incubation et d’immersion.

10.1.1 Transfert des traces de sang

L’un des principaux objectifs est d’apporter une méthode qui permette d’orienter la sélection des prélèvements

biologiques des traces de sang par les investigateurs. Il est alors nécessaire de pouvoir analyser les traces de

101

Partie V : Transposition de la méthode vers l’opérationnel

sang sans avoir à les prélever et à les analyser individuellement. Cette possibilité est envisageable si le pouvoir

couvrant de la méthode est augmenté, ce qui rendrait possible l’analyse de plusieurs traces de sang. Aussi, il ne

serait pas nécessaire de prélever ponctuellement chaque trace de sang.

Lors d’un dot blot, les antigènes sont préalablement fixés sur un médium. Puis une série d’immersions permet aux

anticorps (primaires et secondaires) de se fixer sur les antigènes. La présence des complexes anticorps-antigènes

est par la suite signalée par une coloration noire (cf. figure 10.1a).

Le schéma proposé (cf. figure 10.1b) s’écarte du protocole de base dans le sens où le dépôt des antigènes

sanguins diffère. En effet, le dépôt des antigènes se réalise par le transfert d’une trace de sang sur le médium.

Pour améliorer l’efficacité du transfert du sang sec sur le médium, une étape de solubilisation locale du sang

peut être nécessaire. La réponse visuelle devrait toutefois être similaire à celle observée lors d’un dot blot, car

toutes les étapes sont identiques, à l’exception du dépôt des antigènes. Du fait du transfert des traces de sang,

un signal non uniforme peut être attendu, alors qu’un signal uniforme, circulaire s’observe lors des dot blots.

(a) protocole d’immunodétection du dot blot établi à partir de sang liquide, chapitre 9

(b) protocole d’immunodétection établi à partir du transfert d’une trace de sang

(c) suppression de l’immersion dans la solution d’anticorps primaires

Figure 10.1 – Concepts de l’amélioration du protocole d’immunodétection de l’antigène A dans le sangLa flèche circulaire indique le retournement du médium.

La coloration noire du médium de la figure (c) est expliquée à la section 10.3.

102

Chapitre 10. Concepts de la méthode pour une adaptation vers l’opérationnel

10.1.2 Suppression de l’immersion d’anticorps primaires anti-A

Une deuxième possibilité consiste à supprimer l’étape relative à l’immersion du médium dans la solution d’anti-

corps primaires. Cela est possible en fixant au préalable les anticorps primaires sur un médium. Lors du transfert

de la trace de sang sur le médium, l’antigène A se combinerait alors aux anticorps anti-A fixés sur le médium.

Une illustration de cette approche est présentée à la figure 10.1c. Ainsi, seules deux immersions, au lieu de trois,

se succèderaient, à savoir celle des anticorps secondaires et celle de l’immunodétection.

Bien qu’il ait été démontré que l’antigène A puisse être détecté par une technique de dot blots, il est nécessaire

de vérifier et de comprendre la reconnaissance de ce dernier par l’approche envisagée :

• en évaluant les facteurs d’influence ;

• en comprenant le signal envoyé par la coloration du médium.

Le procédé proposé tend à s’écarter d’un protocole classique de dot blot. Dû à l’inversion des étapes « dépôt

de l’antigène » et « dépôt d’anticorps », il est attendu que la coloration observée s’inverse également 86. La

compréhension de cette coloration est importante pour intégrer les mécanismes de détection de l’antigène A

dans les traces de sang.

10.1.3 Réduction des temps d’immersion

La troisième approche envisagée a été de réduire les temps d’immersion en faisant varier les concentrations

d’anticorps et la température d’immersion. Jusqu’à présent, les anticorps primaires étaient dilués 100 fois et les

anticorps secondaire 10’000 fois. Les immersions se faisaient à température ambiante.

Les anticorps primaires étant livrés en solution, il n’est pas possible de les utiliser purs. Une dilution d’un

facteur zéro est assimilée à une utilisation directe de la solution fournie. La solution étant bleue, son utilisation

sans dilution colore fortement le médium. Afin de réduire cette coloration, il est possible de bloquer le médium

avant son immersion dans la solution d’anticorps primaires. Toutefois, en le bloquant, le nombre de sites sur

lesquels les anticorps se fixent est fortement réduit. Cette étape est importante pour les dot blots car elle évite

les liaisons non spécifiques entre les anticorps et le médium. Elle apparaît donc inappropriée pour la méthode

décrite ici, car l’étape de fixation des anticorps primaires précède celle du dépôt des antigènes. Afin de saturer

le médium en anticorps primaires, il a donc été décidé de ne pas diluer la solution d’anticorps primaire. Une

coloration de le médium en bleue est donc attendue.

Selon les recommandations du fournisseur des anticorps secondaires, ces derniers doivent être dilués 20’000 fois

pour les techniques d’immunodétection telles que l’ELISA qui se rapprochent du dot blot. Dans cette recherche, le

facteur de dilution avait été réduit à 10’000 lors des dot blots. Or, les conditions d’application et les changements

physico-chimiques des traces de sang n’étant pas connus et ne pouvant être estimés, il est également attendu

que la concentration de l’antigène A diminue au cours du temps. C’est pour cela que des facteurs de dilutions

moins importants peuvent être testés afin d’augmenter la concentration en anticorps secondaires.

Par ailleurs, en augmentant la température d’immersion, les temps d’immersion sont plus courts, alors qu’en la

diminuant, ils sont plus longs. Généralement les protocoles indiquent une immersion d’une heure à température

ambiante ou d’une nuit à 4°C. Les anticorps primaires utilisés dans cette recherche sont des immunoglobulines de

type M qui sont actives à température ambiante. Les anticorps secondaires utilisés sont des immunoglobulines de

type G et elles sont plus sensibles aux variations de température ; leur température optimale de fonctionnement

se situant aux alentours de 37°C.

Il est aussi possible de réduire la durée de la fixation des traces de sang sur le médium en fixant chimiquement

le sang sur le médium à l’aide de méthanol ou d’éthanol. Cette fixation chimique s’effectue en immergeant dans

86. La visualisation attendue est expliquée plus en détail à la section 10.3, page 106.

103


une solution de méthanol ou d’éthanol pendant quelques secondes. Cependant, en raison de la composition de

certains médiums (en nitrocellulose par exemple), l’emploi de méthanol n’est pas conseillé car il le dégrade

fortement. Les étapes de lavage du médium peuvent également être réduites en ne lavant le médium qu’une

seule fois. Cela risque cependant d’augmenter le bruit de fond et d’obtenir des faux positifs dus aux réactions

croisées (cross reactions) des anticorps lorsqu’ils se fixent de manière non spécifique.

10.2 Concept général de la méthode proposée

En regard des trois propositions énumérées ci-dessus pour réduire les étapes et transposer le dot blot sur les

lieux, la méthode proposée consiste en l’application d’un médium imbibé d’anticorps primaires anti-A sur des

traces de sang préalablement solubilisées. La conception d’un tel médium s’est basée sur des tests immunochro-

matographiques dans lesquels des anticorps sont fixés sur des membranes en nitrocellulose (Al-Tamimi et al.,

2012; Holstein et al., 2016; Jarujamrus et al., 2012; Kim and Herr, 2013; Koczula and Gallotta, 2016; Li et al.,

2014b; Mahler et al., 2010; nan, 2016; Peluso et al., 2003; Sajid et al., 2015; Schramm et al., 1993).

Une fois les traces de sang transférées sur ledit médium, ce dernier est immergé dans une solution d’anticorps

secondaires anti-anticorps primaires. La dernière étape consiste à immerger le médium dans la solution d’immu-

nodétection ECL-AP pour détecter les complexes formés et ainsi visualiser l’antigène A s’il était présent dans

la trace de sang.

La figure 10.2 permet de visualiser les différentes étapes de la méthode proposée :

1. étape de conception du médium en laboratoire :

• le médium, vierge, est immergé rapidement dans la solution d’anticorps primaires anti-A ;

• le médium imbibé est séché puis conservé dans un milieu sec (dessiccateur) ;

2. étape de transfert de la trace de sang sur le médium :

• la trace de sang sélectionnée est solubilisée ;

• le médium imbibé d’anticorps primaires anti-A est appliqué sur la trace de sang pour la transférer ;

• le médium est séché après le transfert ;

3. étape de détection des complexes :

• le médium est immergé dans une solution d’anticorps secondaires anti-anticorps primaires ;

• le médium est immergé dans une solution d’immunodétection ECL-AP afin de visualiser les com-

plexes.

Le protocole présenté permet d’envisager les différents facteurs pouvant faire varier le résultat, à savoir la

coloration du médium en présence de l’antigène A. Ces facteurs, regroupés dans trois domaines, sont :

A. le médium :

• le type du médium ;

• la quantité d’anticorps primaires anti-A fixés sur le médium ;

• le temps de conservation du médium (dessiccateur) ;

B. le transfert des traces de sang sur le médium :

• la solution de solubilisation des traces de sang ;

• le temps de solubilisation des traces de sang ;

• la force appliquée sur le médium pour transférer la trace de sang ;

• la durée du transfert ;

104


Figu

re10.2

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105


C. la détection de l’antigène A :

• le temps de fixation de la trace de sang sur le médium après son transfert ;

• le taux de dilution de la solution d’anticorps secondaires anti-anticorps primaires ;

• le temps d’immersion du médium dans la solution d’anticorps secondaires ;

• le temps d’immersion dans la solution d’immunodétection.

10.3 Hypothèse sur la coloration du médium et des traces de sang

transférées

La figure 10.3 illustre les différentes étapes qui auraient un rôle dans la coloration du médium, en présence de

l’antigène A :

— Avec un médium entièrement recouvert d’anticorps primaires anti-A (point #2), l’antigène A se fixe au

médium par l’intermédiaire des anticorps primaires (point #3).

— Lors de l’immersion du médium dans une solution d’anticorps secondaires (anti-anticorps primaires), des

complexes anticorps primaires-secondaires se forment (point #4). Toutefois, les anticorps secondaires n’ont

pas accès aux anticorps primaires si ces derniers forment déjà des complexes avec les antigènes A.

— L’étape d’immunodétection, qui permet d’activer l’activité enzymatique (alcaline phosphatase) des anti-

corps secondaires (point #5), engendre une coloration noire des complexes anticorps secondaires-primaires.

Au niveau des complexes anticorps primaires-antigènes, aucune réaction enzymatique ne serait donc at-

tendue (point #6).

L’hypothèse émise quant à la coloration du médium en présence de l’antigène A est donc qu’un résultat

positif se visualiserait par l’absence de coloration en noir.

Comme indiqué au début de ce chapitre, les expériences relatives aux concepts présentés ici sont rapportées

dans le chapitre suivant.

106


Figu

re10.3

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107

Chapitre 11

Développement du papier filtre imbibé d’anticorps

Sommaire

11.1 Approche qualitative – effet des étapes majeures du protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

11.1.1 Influence des étapes majeures du protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

11.1.2 Coloration du papier filtre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

11.2 Approche quantitative – plan d’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

11.2.1 Mesure objective de la coloration : script ImageJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

11.2.2 Criblage des facteurs d’influence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

11.2.3 Résultats observés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

11.2.4 Formation de précipités de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

11.3 Protocole établi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

Le but de ce chapitre est de présenter les expériences qui ont été réalisées dans la perspective de développer la

méthode d’analyse des traces de sang, à savoir la création d’un papier filtre imbibé d’anticorps primaires anti-A.

L’influence des facteurs cités dans le chapitre précédent est doublement évaluée, à savoir de façon qualitative et

quantitative.

Une approche qualitative a été effectuée dans le but de comprendre le rôle des étapes majeures décrites dans la

figure 10.3. Cela a permis d’affiner la compréhension des résultats observés et de la coloration du médium.

Une approche quantitative par plan d’expérience a également été réalisée afin d’évaluer objectivement l’influence

de chacun des paramètres établis. Ce plan requiert la définition des variables indépendantes (c’est-à-dire les

facteurs dont l’influence est évaluée) et d’une ou de plusieurs variable(s) dépendante(s), à savoir les paramètres

sur lesquels l’influence de la variation des variables indépendantes est mesurée. La variable dépendante est

l’intensité de la coloration (ou non-coloration) du papier-filtre.

Afin de pouvoir comparer les différents résultats sur une base objective, il a été nécessaire de développer une

mesure de cette intensité de coloration qui puisse être applicable à tous les essais. Cela s’est fait par le biais

d’une quantification de la coloration, mise en place au moyen d’un script sous imageJ.

Ces deux démarches expérimentales ont été réalisées parallèlement. Les résultats observés au cours des expé-

riences ont permis d’affiner les protocoles proposés.

109


11.1 Approche qualitative – effet des étapes majeures du protocole

11.1.1 Influence des étapes majeures du protocole

Trois domaines majeurs du protocole avaient été décrits à la page 104. Une approche qualitative permet de

tester l’influence de ces derniers (facteurs A, B et C) et de comparer les résultats par rapport au protocole de

base (cf. figure 11.1). Toutes les étapes du protocole ont été effectuées à température ambiante, en laboratoire

à la lumière du jour. Les étapes du protocole de base sont les suivantes :

• trois papiers filtres vierges ont été immergés une fois dans la solution d’anticorps primaires anti-A, séchés

une heure à 37°C, puis conservés une nuit dans un milieu sec au dessiccateur ;

• du sang de groupe A a été apposé sur chaque papier filtre. Selon les conditions, le sang était :

— liquide : 20 µL directement déposés sur le papier filtre ;

— sec : 20 µL déposés sur du verre et séchés pendant 5h00. Après solubilisation de la trace par ajout

d’eau (40 µL) et deux minutes d’attente de solubilisation passive, le transfert de la trace de sang sur

le papier filtre s’est fait par force normale du papier filtre sur la trace de sang pendant 15 secondes. ;

— dilué : les dilutions du sang ont été effectuées dans de l’eau distillée selon les facteurs de dilution 0x,

2x, 5x, 10x, 50x, 100x, 500x, 1’000x, 5’000x et 10’000x. Ces dilutions ont été effectuées pour du sang

liquide et sec ;

• après séchage du papier filtre pendant quinze minutes, ce dernier a été incubé dans trois conditions

différentes :

1. dans la solution d’immunodétection (ECL-AP) pendant deux minutes ;

2. dans une solution TTBS, sans anticorps secondaires pendant huit minutes, puis deux minutes dans

la solution d’immunodétection (ECL-AP) ;

3. dans une solution d’anticorps secondaires dilué 1’000 fois dans une solution TTBS pendant huit

minutes, puis deux minutes dans la solution d’immunodétection (ECL-AP) ;

Figure 11.1 – Protocoles de base effectués avec du sang liquide, sec et diluéAc I : anticorps primaires anti-A ; Ac II : anticorps secondaires anti-anticorps primaires ;ECL-AP : solution d’immunodétection ; PF : papier filtre ; TTBS : tampon de dilution

Suite à ce protocole de base, certaines des étapes ont été enlevées pour évaluer l’influence des trois facteurs (A,

B et C). Les modifications du protocole de base sont les suivantes pour le facteur :

A. fixation des anticorps primaires (cf. figure 11.2a) : le protocole de base a été effectué sans l’ajout d’anticorps

primaires anti-A sur les papiers filtres. Cela a permis de vérifier que les anticorps secondaires se fixent

bien sur les anticorps primaires et non sur les antigènes A. Le sang utilisé (antigène A) a soit été liquide,

soit séché pendant 5h00 comme expliqué dans le protocole de base. L’utilisation de sang dilué n’a pas été

testée.

B. fixation des antigènes sanguins (cf. figure 11.2b) : le protocole de base a été effectué sans l’ajout de sang

afin de vérifier la fixation des anticorps primaires sur le papier filtre et la formation des complexes anticorps

primaires-secondaires ;

C. fixation des anticorps secondaires (cf. figure 11.2c) : des papiers filtres vierges, sans anticorps primaire et

sans antigène A, ont été immergés dans les deux types de solutions d’anticorps secondaires afin de vérifier

que les anticorps secondaires ne se fixent pas sur le médium.

110

Chapitre 11. Développement du papier filtre imbibé d’anticorps

(a) Influence des anticorps primaires

(b) Influence de l’antigène A

(c) Influence des anticorps secondaires

Figure 11.2 – Modification du protocole de base (cf. figure 11.1) pour l’évaluation de l’influence de facteurs A, B et CLa croix rouge indique que l’étape n’a pas été effectuée.

Ac I : anticorps primaires anti-A ; Ac II : anticorps secondaires anti-anticorps primaires ;ECL-AP : solution d’immunodétection ; PF : papier filtre ; TTBS : tampon de dilution

Tous les papiers filtres ont été enregistrés numériquement à l’aide d’un scanner Epson Perfection V330 (voir

page 87). La coloration a uniquement été observée de manière visuelle et qualitative afin de voir quelles étapes

entraînent une coloration du papier filtre.

Observation des résultats du protocole complet

En réalisant le protocole complet avec du sang liquide non dilué (cf. figure 11.3a−c), il peut être remarqué que

la zone où le sang a été déposé se démarque de la coloration violette du médium par une coloration plus claire,

rougeâtre. Dans les autres cas, sans l’apport des anticorps secondaires (points #1 et #2 – numéros encerclés de

la figure 11.1), la coloration rouge du sang persiste et aucun bruit de fond violet n’est visible.

Lorsque le sang analysé est sec, non dilué (cf. figure 11.3d−f ), les résultats montrent une coloration noire de

la zone où l’antigène A a été transféré, cela en présence des anticorps primaires et secondaires. La coloration

violette du bruit de fond persiste et est pour ce cas plus prononcée que pour les autres papiers filtres.

L’ensemble des papiers filtres appliqués sur le sang dilué (liquide et sec) est présenté en annexe G. Les photos

sont regroupées sous les catégories « sang dilué liquide » et « sang dilué sec ». Du sang liquide a été dilué afin

de réduire la concentration en molécules dans le sang et ainsi augmenter l’accessibilité des anticorps secondaires

aux anticorps primaires précipités avec l’antigène A. Les papiers filtres montrent que le noircissement est visible

à partir du facteur de dilution 5x. Pour les dilutions inférieures (0 et 2x), aucune coloration noire n’est visible ;

seule une coloration rouge claire est visible.

Avec du sang dilué puis séché, les résultats engendrent un noircissement jusqu’au facteur de dilution 50. Les

dilutions supérieures ne donnent pas de coloration noire. Il est également remarqué qu’en augmentant le facteur

de dilution, et donc en diminuant la concentration de sang transféré, la zone éclaircit n’est pas visible. Cela

soutient l’hypothèse que le sang transféré empêche la fixation des anticorps secondaires sur le médium et donc

la coloration de ce dernier.

111


(a) #1 (b) #2 (c) #3

(d) #1 (e) #2 (f) #3

Figure 11.3 – Coloration du papier filtre avec le protocole complet – grossissement 0,5xa – c : sang liquide non dilué ; d – f : sang sec non dilué ;se référer à la figure 11.1 pour les points #1, #2 et #3.

Ces observations soutiennent l’hypothèse posée à la section 10.3, à savoir que les antigènes présents dans

du sang liquide et précipités avec les anticorps primaires empêchent l’accès des anticorps secondaires aux

anticorps primaires. La coloration résultante est un éclaircissement de la zone où l’antigène A est présent.

Les dilutions effectuées ont également permis de montrer qu’en réduisant la quantité de sang, un noircissement

de la zone d’intérêt se visualise, au lieu d’un éclaircissement. Une hypothèse peut donc être émise quand au

rôle d’un encombrement stérique résultant de la quantité relative en molécule, antigène dans le sang.

Un contraste de coloration entre du sang liquide et du sang sec est observé au niveau de la zone où l’antigène

A est déposé sur le papier filtre : un éclaircissement pour du sang liquide et un noircissement pour du sang

sec. Travaillant avec des traces de sang, et donc du sang sec, la coloration noire est plus significative que la

coloration « blanche ». Un intérêt tout particulier s’est donc porté sur ce noircissement. L’hypothèse d’un

encombrement stérique dû à un excès de l’antigène A été émise.

Observation des résultats selon les facteurs A, B et C testés

Lorsque les anticorps primaires ont été enlevés et que le sang utilisé est liquide (cf. figure 11.4a−c) ou sec (cf.

figure 11.4d−f ), les mêmes résultats se perçoivent, à savoir un éclaircissement de la zone où le sang a été déposé.

Aussi, les anticorps secondaires semblent créer un bruit de fond (coloration violette) sur le papier filtre, qu’il

soit imbibé ou non d’anticorps primaires.

L’absence de l’antigène A sur le papier filtre imbibé d’anticorps primaire (cf. figure 11.4g−i) n’engendre aucune

coloration particulière, exceptée le bruit de fond violet lorsque les anticorps secondaires sont ajoutés. Il est

d’ailleurs remarqué que la zone plus claire constatée ci-dessus n’est pas présente. Les complexes anticorps

primaires-secondaires n’engendrent pas à eux seuls la coloration claire observée en présence de l’antigène A. Les

résultats observés permettent donc de supposer que le sang déposé sur le médium empêche l’accès des anticorps

secondaires au médium.

112


(a) #1 (b) #2 (c) #3

(d) #1 (e) #2 (f) #3

(g) #1 (h) #2 (i) #3

(j) #1 (k) #2 (l) #3

Figure 11.4 – Coloration du papier filtre selon les facteurs A, B et C testés – grossissement 0,5xa – c : protocole sans anticorps et avec du sang non dilué liquide (figure 11.2a) ;

d – f : protocole sans anticorps et avec du sang non dilué sec (figure 11.2a) ;g – i : protocole sans antigène A (figure 11.2b) ;

j – l : protocole sans anticorps primaire et sans antigène A (figure 11.2c).

Lorsque ni les anticorps primaires, ni les antigènes sanguins ne sont présents (cf. figure 11.4j−l), les mêmes

résultats que ceux observés ci-dessus s’observent, à savoir l’absence de coloration pour les points 1 et 2, et

l’apparition d’un bruit de fond violet uniforme pour le point #3. Cette coloration violette s’observe que les

anticorps primaires soient présents ou non, et que les complexes anticorps primaires/antigènes le soient ou non.

L’hypothèse selon laquelle les anticorps secondaires se fixent au médium et ont un rôle dans la coloration du

bruit de fond semble donc se confirmer.

113


Il est intéressant de noter que la méthode développée ne donne pas une même coloration du médium lorsque

le sang est liquide ou sec. Les modifications physico-chimiques engendrées par l’évaporation, la coagulation

du sang semblent impacter fortement les réactions moléculaires. En présence de sang de groupe A ou AB

sec, une coloration noire est alors attendue87.

Les résultats observés qualitativement sur les papiers filtres permettent de montrer que la coloration noire

est la conséquence de la combinaison des anticorps primaires, de l’antigène A (lorsque le sang sec) et des

anticorps secondaires. L’absence de l’un de ces facteurs entraîne l’absence de la coloration noire. Aucune

réaction croisée entre des composants du sang de groupe A et les anticorps secondaires n’a été remarquée.

De plus, une coloration noire, signe d’un résultat positif à la détection d’une molécule, n’est pas insolite car

c’est ce signal qui est perçu lors d’un dot blot classique. La modification du protocole de dot blot par l’ajout

des anticorps primaires sur le médium, avant les antigènes, la réduction des temps d’immersion du papier

filtre dans les différents bains et l’augmentation des concentrations en anticorps sont également des facteurs

à prendre en compte pour expliquer ces résultats.

11.1.2 Coloration du papier filtre

Du fait que la technique développée s’éloigne des protocoles classiques de détection de protéines dans un mélange

(dot blots, western blots), et par le caractère particulier de la méthode qui consiste à travailler avec du sang sec

et non liquide, un intérêt s’est porté sur la compréhension de la coloration du médium.

Les résultats de l’analyse qualitative présentée ci-dessus permettent de déterminer deux phénomènes expliquant

la coloration du papier filtre :

1. l’excès de l’antigène A par rapport aux anticorps primaires adsorbés sur le papier filtre ;

2. l’encombrement stérique.

Avec la méthode proposée, la présence de l’antigène A dans la trace de sang se visualise donc par une coloration

noire dans la zone où l’antigène A a été transféré. L’absence de coloration noire dans cette zone soutient alors

l’hypothèse que la trace de sang ne possède pas de l’antigène A. Il est important de tenir en compte la coloration

mauve du médium qui peut diminuer le contraste avec la coloration noire. Connaître la localisation du transfert

de la trace de sang sur le papier filtre semble être un critère important pour différencier les colorations 88.

De par toutes ces observations, il a été émis l’hypothèse que la concentration plus élevée en antigène A dans

le sang liquide par rapport au sang sec 89 est l’une des causes de cette différence de coloration. La figure 6.4

expliquait le phénomène de précipitation des complexes anticorps-antigènes lié à la concentration d’anticorps.

Si les antigènes sanguins sont en excès par rapport aux anticorps primaires (post-zone), alors tous les sites de

liaison des anticorps (paratopes) sont occupés par les sites de liaison des antigènes (épitopes). En relation avec

la figure 10.3, si tous les sites de liaisons des anticorps primaires sont occupés, alors les anticorps secondaires

n’y ont pas accès. Lors de l’étape d’immunodétection, un éclaircissement de cette zone par rapport au reste du

médium est observé. En transférant une trace de sang, moins d’antigènes A se fixent aux anticorps primaires,

diminuant alors l’encombrement stérique et facilitant l’accès des anticorps primaires aux anticorps secondaires.

Une coloration noire semblable à ce qui est observé lors des dot blots est alors perçue.

Afin de confirmer davantage cette hypothèse, une autre méthode d’analyse pourrait être effectuée. Comme les

anticorps secondaires créent un bruit de fond en présence et en absence d’anticorps primaires, il ne peut pas être

87. Les expériences n’ont pas été effectués avec du sang B ou O car la spécificité de la méthode par rapport à l’antigène A estprésentée au chapitre suivant.

88. Pour sauvegarder la localisation de la trace de sang transférée sur le papier filtre, puis séchée, il peut être bénéfique d’enregistrernumériquement le papier filtre, en le photographiant par exemple.

89. Même si les expériences du chapitre 9 ont montré que les antigènes A présents dans des traces de sang restent accessibles etdétectables après un mois de séchage, il peut aisément être admis que la concentration en antigène A dans du sang sec transféréest plus petite que dans du sang liquide déposé sur le papier filtre.

114


affirmé que ces derniers se fixent efficacement au papier filtre. Des analyses plus poussées quant à la composition

du papier filtre devraient être effectuées avec un protocole similaire. Par exemple, il est possible d’analyser le

papier filtre par chromatographie en phase liquide à haute performance, méthode pouvant être utilisée pour

analyser les macromolécules, telles que les anticorps. La composition des liquides, avant et après immersion du

papier filtre, pourrait également être analysée pour déterminer la présence ou l’absence des anticorps.

11.2 Approche quantitative – plan d’expérience

11.2.1 Mesure objective de la coloration : script ImageJ

Afin d’évaluer objectivement l’intensité de la coloration noire perceptible sur les papiers filtres, une mesure

quantitative est nécessaire. Un script ImageJ a donc été développé dans cette optique. Ce script permet de

convertir les enregistrements numériques en niveaux de gris afin d’obtenir une valeur chiffrée de l’intensité de la

coloration observée. La conversion d’un pixel coloré en niveaux de gris correspond à l’attribution d’une valeur

comprise entre 0 et 255 à ce pixel 90.

Lors du protocole d’immunodétection, une coloration mauve du médium s’observe. Il est alors intéressant de

réduire numériquement la coloration du médium afin d’augmenter le contraste entre le bruit de fond et le résultat

positif. Deux étapes ont été déterminées pour augmenter ce contraste :

1. la soustraction du bruit de fond du médium ;

2. l’application d’un seuil des niveaux de gris fixé.

Soustraction du bruit de fond

Le bruit de fond peut être réduit par la fonction Subtract Background qui propose deux options : le filtre (Light

background, Separate colors, Sliding paraboloid, Disable smoothing) et le rayon (en pixel) du filtre Rolling ball.

En prenant deux photographies, un résultat positif (sang A) et un résultat négatif (sang O), des tests ont été

réalisés en faisant varier la valeur du rayon du filtre de 0 à 100 pixels par pas de 10. Les densités intégrées

mesurée sont présentées à la figure 11.5a. Il est constaté qu’à partir d’une valeur de 50 pixels, les densités

intégrées mesurées pour le contrôle négatif augmentent. Visuellement, cela s’explique par l’apparition d’un bruit

de fond conséquent sur l’ensemble de la figure (cf. annexe H). Aussi, de 0 à 40 pixels, la différence mesurée entre

les deux contrôles augmente considérablement, permettant dès lors de différencier plus aisément un résultat

positif d’un résultat négatif. La valeur de 40 pixels a donc été choisie pour le script.

Application d’un seuil des niveaux de gris

Les colorations observées des résultats positifs tendent vers le noir, alors que la coloration du médium tend vers le

mauve, voire mauve clair. L’inclusion dans le script d’une fonction qui délimite un intervalle des niveaux de gris

permet d’augmenter le contraste en distinguant le bruit de fond de la coloration positive. Il est donc privilégié

de conserver des valeurs numériques faibles (tons noirs). Le seuil des niveaux de gris doit donc correspondre à

un intervalle comprenant les pixels de la valeur de 0 à la valeur seuil à déterminer, afin de supprimer les valeurs

supérieures, relatives à la coloration du médium.

En prenant les mêmes photographies que pour le test précédent, des mesures ont été réalisées en faisant varier

l’intervalle des niveaux de gris entre 0 et 255. Pour le script testé, la valeur de réduction du bruit de fond a été

fixée à un rayon de 40 pixels. Les résultats sont présentés dans la figure 11.5b.

90. Les valeurs proches de 0 correspondent à des pixels dans les tons noirs, alors qu’une valeur élevée est associée au blanc.

115


À partir de l’intervalle 0-190, les niveaux de densité intégrée des résultats obtenus avec du sang O sont supérieures

à ceux obtenus avec du sang A. Dans les intervalles de 0 à 190, le bruit de fond est confondu avec la coloration

engendrée par un résultat positif. À partir de 230, la distinction entre la coloration et le bruit de fond est plus

conséquente (cf. annexe H), donnant donc des valeurs cohérentes avec ce qui est attendu, sauf en considérant

la quasi-totalité des pixels (0-250). Le seuil des niveaux de gris choisi pour le script est donc 0-230.

(a) Influence du rayon (b) Influence du seuil des niveaux de gris

Figure 11.5 – Paramètres permettant de soustraire le bruit de fondPour la figure (b), la valeur de l’axe des abscisses correspond à la valeur haute de l’intervalle des niveaux de gris, la valeur basse étant 0 ;

c+ : contrôle positif analysé, groupe sanguin A ; c- : contrôle négatif analysé, groupe sanguin O.

Analyse numérique de l’intensité de la coloration

L’intensité mesurée est donnée sous forme de densité intégrée (IntDen) 91. Selon la fonction de mesure choisie,

elle correspond au produit de la moyenne des niveaux de gris et :

• de la surface mesurée (fonction Measure) 92 ;

• de la taille moyenne des particules (fonction Analyze Particles) 93.

Mesurer la densité intégrée d’une image est extrêmement sensible et permet de détecter les variations d’une

image au pixel près. Un test a été réalisé afin de montrer leur limite de détection. Pour cela, un pixel (blanc,

gris et noir) 94 a été ajouté au centre d’une image (cf. figure 11.6) à l’aide du logiciel Adobe Photoshop®. Les

densités intégrées ont été mesurées en utilisant les deux fonctions de mesures (Measure et Analyze Particles)

en utilisant une fois le script établi et une fois sans, c’est-à-dire en analysant directement l’image brute 95.

Figure 11.6 – Image originale utilisée pour ajouter des pixels – grossissement 1x

91. Unité en pixel carré.92. Dans Analyze > Measure.93. Dans Analyze > Analyze Particles...94. Valeurs des pixels : blanc = 255 ; gris = 127 et noir = 0.95. Sur les images brutes, la fonction Analyze Particles nécessitant une étape de conversion de l’image en mode binaire, cette

fonction n’a pas été effectuée, car considérée comme non comparable avec les autres mesures.

116


Les résultats du tableau 11.1 montrent une variation des mesures en fonction des pixels ajoutés. Les mesures

sont dépendantes de la couleur du pixel modifié 96. Avec l’analyse brute Measure, la densité intégrée est, par

rapport à l’image originale, plus élevée lors de l’ajout d’un pixel blanc et plus petite lors de l’ajout du pixel

gris et noir. Ces observations sont cohérentes en considérant les valeurs des pixels ajoutés et la valeur du pixel

modifié.

Analyse brute Analyse scriptMeasure Measure Analyze Particles

image originale 199’595’003 9’445’965 20’055,1pixel blanc 199’595’050 9’437’295 20’122,2pixel gris 199’594’906 9’437’805 20’123,3pixel noir 199’594’807 9’437’550 20’122,7

Tableau 11.1 – Densités intégrées mesurées sur l’image de la figure 11.6 en ajoutant un pixel blanc, gris et noirValeur niveaux de gris : pixel blanc = 255 ; pixel gris = 127 ; pixel noir = 0.

Lorsque le script est utilisé, ce dernier modifie l’image en augmentant le contraste (soustraction du bruit de fond

et mise en place d’un seuil des niveaux de gris). C’est pour cela que la variation d’un pixel n’est pas prise en

compte de la même manière qu’avec l’analyse brute de l’image. Toutefois, il peut être noté que le script réduit

fortement la valeur des densités intégrées mesurées ; suggérant dès lors que la coloration du médium est moins

prise en compte. La modification d’un pixel dans l’image est tout de même bien perceptible par le script.

Pour traiter un grand nombre d’images, il est possible d’utiliser la fonction batch 97. Il est alors possible d’activer

le script sur un grand nombre d’images groupées dans un dossier, permettant alors une seule manipulation. En

utilisant la fonction Analyze Particles, les mesures sont données pour chaque image avec le nom de l’image

analysée, alors que pour la fonction Measure, le nom de l’image analysée n’est pas affiché. C’est principalement

pour cette raison que la fonction Analyze Particles a été sélectionnée dans le script.

Explication du script

Le script développé dans le logiciel ImageJ comporte dix étapes :

1. run("Split Channels") ;

2. close() ;

3. close() ;

4. run("Subtract Background...", "rolling=40 light separate") ;

5. setAutoThreshold("Default") ;

6. //run("Threshold...") ;

7. setThreshold(0, 230) ;

8. setOption("BlackBackground", false) ;

9. run("Convert to Mask") ;

10. run("Analyze Particles...", "summarize")

Ces dix étapes permettent d’effectuer les traitements suivants sur une image (cf. figure 11.7) :

1. L’image en couleur est divisée en trois images, chacune supprimant les niveaux bleu, rouge et vert (cf. figure

11.7b,c,d) 98. Cette étape a été réalisée car sur certains médiums, le sang transféré laisse une coloration

rouge, qui aurait été prise en compte dans l’intensité mesurée. Or, seule la coloration noire, résultante de

l’activité enzymatique des anticorps secondaires, doit être considérée.

2. et 3. Des trois images créées, seule l’image supprimant les niveaux de rouges est conservée.

96. Dans l’image originale, le pixel modifié a une valeur des niveaux de gris de 158.97. Dans Process > Batch > Macro...98. Un exemple plus visuel de la séparation des niveaux est présenté en annexe H.

117


4. Le bruit de fond de l’image est supprimé, selon l’algorithme rolling ball paramétré avec un rayon de 40

pixels (cf. figure 11.7e).

5. à 7. Les pixels convertis en niveaux de gris compris entre les valeurs de 0 (noir absolu) et 230 (blanc) sont

considérés. Les pixels compris entre 231 et 255 (blanc absolu) sont exclus de la suite du script.

8. Les pixels pris en comptes sont visualisés en noir, sur un fond blanc.

9. L’image est convertie en noir et blanc selon les réglages de seuils établis (cf. figure 11.7f ).

10. L’analyse de particules permet de compter et de mesurer le nombre d’objets définis (en pixel) dans l’image.

(a) originale (b) split blue

(c) split green (d) split red

(e) soustraction bruit de fond (f) seuil niveau gris

Figure 11.7 – Illustration des différents traitements du script ImageJ – grossissement 1xLes traitements e et f sont effectués à partir du traitement d.

À l’aide du logiciel ImageJ et du script développé, il a donc été possible d’obtenir des données numériques,

quantitatives de la coloration observée sur les papiers filtres. Cette approche permet de comparer objective-

ment l’intensité de la coloration pour développer le protocole de détection de l’antigène A dans des traces de

sang en évaluant les facteurs, paramètres ayant une influence significative sur le résultat.

11.2.2 Criblage des facteurs d’influence

Au chapitre précédent, onze facteurs avaient été identifiés comme pouvant influencer la coloration du médium

en présence de l’antigène A. Ces facteurs regroupent plusieurs variables, paramètres qui sont présentés dans le

tableau 11.2. Le choix des différents paramètres pour chaque facteur est décrit ci-dessous.

Le médium peut être de plusieurs compositions. Par exemple, les membranes en nitrocellulose et PVDF sont

considérées puisqu’elles sont utilisées pour les dot blots. Les réactions d’immunodétection sont alors connues

et possibles avec ce type de médium. Par ailleurs, il est également possible d’utiliser du papier filtre comme

médium, même si ce médium n’est classiquement pas utilisé lors des techniques d’immunodétection. Il l’est

toutefois pour le test du Phadebas®. Ce médium peut cependant présenter des avantages quant au transfert

des traces de sang. En effet, il semble plus malléable que les membranes pour transférer des traces de sang, car

118


ces dernières sont fines et se déchirent facilement. Le papier filtre est également moins cher et ne présente pas

de condition particulière de conservation.

Facteurs Paramètres

1. médium Nitrocellulose LF-PVDF Papier filtre2. Quantité d’Ac I (nombre d’immersions) 1x 4x 8x3. Conservation du médium (dessiccateur) 1 jour 4 jours 8 jours4. Solution solubilisation eau Liquémine® Actylise®

5. Temps de solubilisation 2 min 5 min 15 min6. Force appliquée faible normale forte7. Durée du transfert 2 sec 16 sec 30 sec8. Temps de fixation pas de séchage 15 min 30 min9. Taux de dilution des Ac II 500x 1’000x 2’000x10. Temps immersion Ac II 2 min 8 min 30 15 min11. Temps ECL-AP 2 min 8 min 30 15 min

Tableau 11.2 – Paramètres considérés dans l’étude de criblage des facteurs d’influenceAc I : anticorps primaires anti-A ; Ac II : anticorps secondaires anti-anticorps primaires ; Actylise® : thrombolytique ; ECL-AP : enhanced

chemiluminescence substrate alkalin phosphatase ; LF-PVDF : low fluorescence - polyvinylidene fluoride ; Liquémine® : anticoagulant

Les anticorps primaires doivent être déposés sur le médium. Pour cela, le médium est immergé dans la solution

d’anticorps primaires non diluée. Plusieurs immersions sont testées afin d’évaluer si le médium se sature en

anticorps. Comme indiqué à la page 56, si les anticorps sont en excès par rapport à la quantité d’antigène

sanguin, alors le taux d’agglutination est diminué.

Une fois le médium imbibé d’anticorps, ce dernier doit être conservé. Lors de la conception de tests immunochro-

matographiques, les membranes sont conservées dans un environnement sec. Ce facteur permet ainsi d’estimer

le nombre de jours de conservation des médiums dans ce milieu.

La solution de solubilisation utilisée peut également influencer le résultat. Il est supposé que certaines molécules

chimiques peuvent solubiliser plus efficacement le sang séché. En médecine, divers médicaments sont utilisés,

tels que des thrombolytiques ou des anticoagulants. De telles molécules sont testées et comparées à de l’eau.

La durée de la solubilisation est également testée. En condition réelle, sur des lieux, il n’est pas possible de

solubiliser le sang sec dans un tube, de l’agiter ou de filtrer. Il est alors nécessaire d’estimer la durée de

solubilisation de la trace de sang, sachant que celle-ci doit s’effectuer de manière passive.

La force appliquée et la durée du contact entre la trace de sang et le médium influencent le transfert. Ces deux

facteurs doivent ainsi être estimés. Le transfert s’effectue en appuyant manuellement le médium sur la trace de

sang. Il n’est dès lors pas aisé de garder une force constante sur la durée. Un juste milieu entre la force appliquée

et la durée du transfert doit être trouvé.

Afin que les composants de la trace de sang s’adsorbent sur le médium, ces derniers sont laissés à l’air libre

en séchant. La durée du séchage peut alors influencer le résultat. Lors des dot blots, les membranes en PVDF

séchaient pendant trente minutes. Comme le but est de transposer la technique sur des lieux, la durée totale de

la méthode ne doit pas être excessivement long.

Comme indiqué précédemment, le facteur de dilution de 10’000 utilisé lors du dot blot n’est pas appliqué. D’autres

facteurs de dilution, moins élevés, sont testés afin d’augmenter la concentration en anticorps secondaires. Cela

permet également de réduire les temps d’incubations. Un équilibre peut être trouvé en variant le taux de dilution

des anticorps secondaires et la durée d’incubation. Afin de répondre aux besoins de rapidité de la technique

développée, la durée de chacune des deux immersions (anticorps secondaires et immunodétection ECL-AP) a

été fixée à quinze minutes maximum.

Le protocole suivant a été effectué en modifiant les paramètres décrits ci-dessus. L’influence de ces facteurs a

été mesurée à l’aide d’un plan d’expérience réalisé par criblage. Le plan d’expérience a été réalisé à l’aide du

logiciel Unscrambler® X10.1 (64-bit). La table d’expérience, qui illustre 37 combinaisons, est présentée dans le

tableau figurant à l’annexe I.

119


1. Conception du médium :

• Le médium testé (membrane nitrocellulose, LF-PVDF, papier filtre) a été immergé dans la solu-

tion d’anticorps primaires anti-A (clone BIRMA-1, IgM de souris – Bioscot® reagents Merck Millipore).

L’immersion s’est faite rapidement, de manière à recouvrir totalement le médium de la solution d’an-

ticorps. Lorsque plusieurs immersions d’anticorps primaires ont été testées (jusqu’à huit), le médium

a été séché à l’air libre dix minutes entre chacune d’entre elles.

• Après la dernière immersion, le médium a été séché dans une étuve réglée à 37°C pendant une heure.

• Le médium a été conservé pendant un, quatre ou huit jour-s au dessiccateur.

2. Création des traces :

• Trois traces de sang de groupe A 99 (20 µL) ont été déposées sur une plaque microscopique en verre ;

• Les traces de sang ont été séchées pendant cinq heures dans un laboratoire à température ambiante

et à la lumière du jour.

3. Transfert de la trace :

• Chaque trace de sang a été solubilisée par 40 µL de solution de solubilisation (eau, Liquémine® ou

Actylise®).

• Le médium imbibé d’anticorps primaires a été appuyé sur les trois traces de sang en pressant plus

ou moins fort 100, pendant deux, seize ou trente secondes.

• Les traces de sang transférées ont séché pendant quinze ou trente minutes à l’air libre, ou utilisé

directement sans séchage.

4. Détection de l’antigène A :

• Le médium a été immergé dans une solution d’anticorps secondaires anti-IgM de souris (Novus,

n°NBP1-72685), diluée d’un facteur 500, 1’000 ou 2’000 dans une solution de TTBS. L’immersion a

duré deux minutes, huit minutes trente secondes ou quinze minutes, sous agitation à 100 rpm.

• Le médium a été immergé dans une solution de TTBS pendant deux minutes, sous agitation.

• Le médium a été immergé pendant deux minutes, huit minutes trente secondes ou quinze minutes

dans la solution de détection ECL-AP, sous agitation.

Les médiums ont été sauvegardées numériquement à l’aide d’un scanner Epson Perfection V330 avec les pa-

ramètres donnés à la page 87. Par la suite, les images ont été rognées à l’aide du logiciel Adobe Photoshop®

afin d’obtenir une zone d’analyse de 7,5x3 cm encadrant la zone où les trois traces de sang ont été transfé-

rées. Les images ont été rognées afin d’éviter les artefacts liées à l’enregistrement numérique, tels que certaines

zones d’ombre créées par le scanner. Cela permet également d’avoir une zone d’analyse identique entre chaque

enregistrement. Une fois rognées, les images ont été analysées par le script ImageJ développé à la page 117.

11.2.3 Résultats observés

Résultats préliminaires

Concernant le type du médium (facteur 1), les membranes en nitrocellulose se sont montrées trop fragiles lors

de leur manipulation. En effet, suite au séchage des anticorps dessus, elles se déchirent très fortement lors de

leur apposition sur les traces de sang. Elles ont donc été écartées. Les membranes en PVDF utilisées lors des

expériences de dot blot au chapitre 9 ont également été envisagées. Cependant, elles requièrent une étape dite

d’activation par une immersion dans du méthanol. Vu le caractère toxique du méthanol et de l’encombrement

99. Donneur n°41 du tableau 8.3 ; sang déposé directement après le prélèvement.100. Cinq forces faibles (poids de cinq papiers filtres imbibés d’anticorps), normales et fortes ont été mesurées sur une balance :force faible = 4,0.10-3 ± 9,9.10-5 N ; force normale = 11,9 ± 1,5 N ; force maximale = 77,8 ± 8,6 N.

120


supplémentaire par l’apport de méthanol sur des lieux, les membranes en PVDF ont également été écartées.

De fait, le troisième médium, le papier filtre, a été considéré avec un fort intérêt et utilisé comme seul médium

pour la suite du plan d’expérience.

Concernant la solution de solubilisation (facteur 4), il avait été émis l’hypothèse que la solution utilisée pouvait

favoriser la solubilisation des traces de sang. Les solutions suivantes ont été testées :

• l’eau distillée ;

• la Liquémine®, anticoagulant à base d’héparine ;

• l’Actylise®, thrombolytique à base d’altéplase.

Cependant, d’après des tests préliminaires, aucune plus-value n’a été enregistrée à l’aide de solutions médica-

menteuses par rapport à l’utilisation d’eau distillée. Les médicaments ne semblent pas diluer plus rapidement

et plus efficacement les traces de sang par solubilisation passive. Des tests pourraient être effectués pour vérifier

l’éventuel bénéfice en agitant activement du sang séché et ces médicaments. De plus, l’utilisation d’eau distillée

est moins contraignante que l’utilisation de médicaments, qui coûtent plus chers et qui pourraient interférer avec

les analyses génétiques ultérieures. De ce fait, seule l’eau distillée a été utilisée pour la suite du plan d’expérience.

C’est pourquoi les deux facteurs 1 et 4 ne sont pas évalués par la suite.

Résultats du plan d’expérience

Les résultats du plan d’expérience montrent que trois facteurs entraînent une variation significative au niveaux

de la réponse mesurée, soit l’intensité de la coloration (cf. figure 11.8) :

• le facteur 6 : la force appliquée pour effectuer le transfert de la trace de sang sur le papier filtre ;

• le facteur 8 : le temps de séchage du papier filtre après le transfert des traces de sang ;

• le facteur 11 : le temps d’immersion du papier filtre dans la solution de détection ECL-AP.

Figure 11.8 – Coefficients de régression mesurés pour chaque facteur en fonction de l’intensité de la réponse colorimétriqueLes facteurs 1 et 4 ne sont pas indiqués car ils n’ont pas été testés lors du plan de criblage ;

la barre d’erreur représente l’intervalle de confiance.

121


En considérant la figure 11.8 et le tableau 11.3, il est remarqué que le facteur 6 (force appliquée) est le facteur

ayant le plus d’influence (p-value de 0,000) ; suivent le facteur 8 (temps de séchage – p-value de 0,006) et le

facteur 11 (temps de l’immersion dans la solution de détection ECL-AP – p-value de 0,015).

# Facteur Facteurs Résultat Valeur de l’effet p-value

2 Quantité d’Ac I (nombre de déposition) NS -477,391 0,5173 Conservation du médium (dessiccateur) NS 489,719 0,5065 Temps de solubilisation NS -224,829 0,7596 Force appliquée +++ 522,124 0,0007 Temps de contact NS 541,232 0,4638 Temps de fixation ++ 2164,244 0,0069 Dilution Ac II NS 13,863 0,98510 Temps immersion Ac II NS 1009,192 0,17611 Temps ECL-AP + 1889,957 0,015

Tableau 11.3 – Effets des facteurs sur la réponse mesuréeLes facteurs 1 et 4 ne sont pas indiqués ici car ils n’ont pas été testés lors du plan de criblage.

Ac I : anticorps primaires ; Ac II : anticorps secondaires ;ECL-AP : enhanced chemiluminescence - alkalin phosphatase ; NS : non significatif.

Lorsque la force exercée (facteur 6) augmente sur le papier filtre pour y transférer la trace de sang, la réponse

colorimétrique est plus forte. Les trois niveaux de force testée ont été : force faible, normale et forte 101. Selon

la figure 11.9a, il est à noter que l’absence de force influence très négativement la réponse mesurée, à savoir

l’intensité de la réponse colorimétrique. Entre les deux autres niveaux de force testés, il ne semble cependant

pas y avoir de grandes différences.

Concernant la durée de séchage du médium (facteur 8), la figure 11.9b indique qu’un temps de séchage de quinze

minutes influence positivement et significativement la réponse mesurée. Un temps de séchage de trente minutes

conduirait à une diminution de l’intensité mesurée. Un temps de séchage est toutefois nécessaire, car une nette

diminution de la réponse mesurée est visible lorsque le papier filtre n’a pas été séché.

Les mêmes conclusions peuvent être observées avec la durée d’immersion du papier filtre dans la solution d’im-

munodétection ECL-AP (facteur 11 – cf. figure 11.9c). À partir de huit minutes d’immersion, une augmentation

significative de la réponse mesurée est observée. Toutefois, allonger le temps de détection augmente le bruit de

fond sur le papier filtre. Aussi, le noircissement engendré par une réponse positive se visualise à partir de deux

minutes. Il peut être intéressant d’augmenter le temps d’immersion à huit minutes pour obtenir une visualisation

optimale, mais il n’est pas nécessaire de laisser le papier filtre immergé pendant huit minutes si les résultats sont

visibles avant. Ce facteur est celui qui a le moins d’influence significative par rapport aux deux autres facteurs.

Aussi, du fait que la durée d’immersion peut être stoppée dès que la coloration est visible sur le médium, ce

facteur est jugé comme le moins important des trois facteurs ayant un rôle significatif.

Concernant les autres facteurs n’ayant pas d’influence significative, il a été décidé de fixer les paramètres comme

étant les moins contraignants et les plus rapides :

• quantité d’anticorps primaires (facteur 2) : une immersion dans la solution d’anticorps primaires ;

• conservation du médium (facteur 3) : conservation du papier filtre préparé une nuit au dessiccateur ;

• temps de solubilisation (facteur 5) : deux minutes de solubilisation des traces de sang dans l’eau distillée ;

• temps de contact (facteur 7) : un temps de contact de seize secondes. Bien qu’un temps de contact de

deux secondes semble suffire, un contact plus long n’influence pas négativement la réponse observée, ce

qui permet d’accroître le transfert de la trace de sang sur le papier filtre ;

• facteur de dilution (facteur 9) : les anticorps secondaires sont dilués 1’000x dans une solution TTBS ;

• temps d’immersion dans la solution d’anticorps secondaires (facteur 10) : un temps d’immersion dans la

solution d’anticorps secondaires de huit minutes trente secondes. Plus le temps d’immersion est grand,

plus les complexes Ac I/II se forment. Du fait que le facteur de dilution testé semble saturer rapidement les

101. Pession faible = 4,0.10-3 ± 9,9.10-5 N ; force normale = 11,9 ± 1,5 N ; force maximale = 7,8 ± 8,6 N.

122


anticorps primaires, ce temps d’immersion a pu être choisi. Bien que ce facteur ne semble pas significatif,

des temps d’incubations plus longs que deux minutes semblent toutefois plus entraîner une coloration noire

de plus en plus visible et contrastée avec le médium du papier filtre.

(a) Facteur 6 – force (b) Facteur 8 – temps séchage

(c) Facteur 11 – temps ECL-AP

Figure 11.9 – Effets des paramètres influençant la réponse mesurée sur le facteur testéECL-AP : solution d’immunodétection

11.2.4 Formation de précipités de sang

Sur certains papiers filtres, il a été observé que des précipités de sang se forment et se détachent lors des

immersions dans les solutions d’anticorps secondaires et d’immunodétection ECL-AP (cf. figure 11.10). Ces

précipités sont supposés être des complexes anticorps primaires-secondaires-antigènes du fait qu’ils se colorent

en noir. Ces formations se détachent de la zone où le sang a été transféré et restent par la suite en suspension

dans les solutions. Lorsque les immersions sont terminées, les précipités se redéposent sur le papier filtre.

Figure 11.10 – Précipités formés sur les papiers filtres après l’immunodétection de l’antigène A – grossissement 0.7xLe papier filtre utilisé dans cette illustration est resté huit jours au dessiccateur.

123


Ces agrégats ne sont pas systématiquement observés. Plusieurs hypothèses sont envisagées :

• la durée de conservation des papiers filtres dans l’environnement pauvre en humidité : il semblerait que plus

la durée de conservation du papier filtre au dessiccateur augmente, plus le nombre d’agrégats augmente.

Cela supposerait donc que la conservation du papier filtre sur plusieurs jours dégraderait la fixation des

anticorps primaires sur le papier filtre ;

• le médium du papier filtre : étant une surface très poreuse, le papier peut ne pas fixer correctement les

anticorps et les antigènes, qui s’y décrochent lors des immersions successives ;

• le nombre limité d’étapes de lavage : lors des protocoles classiques de dot blots, trois lavages de cinq minutes

sont réalisés, alors que dans le protocole proposé, seul un lavage est recommandé. Augmenter le nombre

de lavages permet de réduire considérablement le bruit de fond et permettrait de réduire la formation des

agrégats, qui seraient éliminés lors des lavages successifs.

Ces précipités peuvent rendre plus difficile l’interprétation des résultats lorsque plusieurs traces de sang sont

testées simultanément sur le papier filtre. Du fait qu’ils ne soient pas fixés et peuvent se déposer aléatoirement

sur le papier filtre, il peut être effectivement difficile de savoir quelle trace de sang a engendré ces agrégats.

Comme précisé auparavant, pour faciliter l’interprétation de ces résultats, une photo du médium après que les

traces de sang aient été transférées dessus, et après qu’elles aient séché semble être une bonne alternative pour

localiser les traces de sang par la suite.

11.3 Protocole établi

Le protocole de dot blot développé au chapitre 9 durait environ six heures. Le nouveau protocole établi dure

trente minutes, permettant d’envisager une transposition de la méthode sur des lieux. Le plan d’expérience par

criblage a mis en exergue les facteurs et les paramètres influençant significativement la méthode développée.

À partir de ces observations, le protocole établi et jugé le plus efficace est présenté ci-dessous. Une application

du protocole a été faite avec des traces de sang des groupes A, AB, B et O. Pour cela, 20 µL de chaque groupe

sanguin ont été déposés sur du verre puis séchés pendant un jour à température ambiante et à la lumière du jour

en laboratoire. Après chaque étape, un enregistrement numérique du papier filtre a été effectué pour permettre

de visualiser chaque point (cf. figure 11.11) :

1. création du médium :

• immersion rapide (quelques secondes) du papier filtre Whatman® grade 595 (figure 11.11b) dans la

solution non diluée d’anticorps primaires anti-A (issus du clone BIRMA-1, IgM de souris – Bioscot®

reagents Merck Millipore) (figure 11.11c) ;

• séchage du papier filtre par incubation à 37°C pendant 1h00 ;

• conservation pendant un jour dans un endroit sec (dessiccateur).

2. transfert de la trace de sang :

• solubilisation de la trace de sang à l’aide d’eau distillée ;

• solubilisation passive de la trace de sang pendant deux minutes ;

• transfert de la trace de sang solubilisée sur le papier filtre par apposition de ce dernier pendant 16

secondes (force normale 102) ;

• séchage du papier filtre pendant 15 minutes à l’air libre (figure 11.11d) 103.

102. Force normale estimée = 11,9 ± 1,5 N.103. Lors du transfert puis du séchage du papier filtre, le sang solubilisé par l’eau peut diffuser localement au sein du médium.Après la première immersion dans la solution d’anticorps secondaires, la surface diffusée semble lavée par le bain, car seule la zonecentrale, concentrée de la trace persiste sur le médium. Encore une fois, prendre une photographie du papier filtre à cette étapepeut aider à interpréter les résultats de coloration, surtout si les traces de sang se mélangent par leur diffusion.

124


3. détection de l’antigène A :

• immersion du papier filtre sec dans une solution d’anticorps secondaires anti-anticorps primaires

(anti-IgM de souris, Novus n° NBP1-72685) dilués 1’000 fois (concentration finale de 1.10-3 mg/mL)

dans une solution de TTBS pendant 8 minutes (figure 11.11e), sous agitation à 100 rpm ;

• lavage du papier filtre dans une solution TTBS pendant 2 minutes (étape optionnelle – figure 11.11f )

sous agitation à 100 rpm ;

• immersion du papier filtre dans une solution de détection ECL-AP pendant huit minutes au maximum

(figure 11.11g) sous agitation à 100 rpm.

• lavage du papier filtre dans de l’eau distillée pendant 2 minutes (étape optionnelle – figure 11.11h).

Les résultats attendus après l’application de ce protocole sont :

1. un noircissement de la zone du papier filtre où le sang sec contenant l’antigène A a été transféré ;

2. une coloration mauve du papier filtre en l’absence de l’antigène A (bruit de fond).

Le papier filtre n’est usuellement pas utilisé pour un protocole de détection de protéines ; les médiums choisis

pour ces techniques sont soit des membranes en nitrocellulose, soit en PVDF. Le bruit de fond observé est

par exemple beaucoup plus fort avec le papier filtre, qu’avec les membranes en PVDF.

Il est à noter que les deux immersions de lavage dans la solution TTBS (après l’immersion dans la solution

d’anticorps secondaires) et dans l’eau distillée (après l’immunodétection dans la solution ECL-AP) ne sont

pas nécessaires dans une optique d’application sur des lieux. Elles ont été effectuées afin de favoriser la visua-

lisation des résultats et leur conservation. De ce fait, seules les deux immersions dans la solution d’anticorps

secondaires, et dans la solution ECL-AP sont nécessaires, amenant la durée d’immersion à seize minutes. De

plus, le noircissement est visible à partir de 3-4 minutes dans la solution d’immunodétection ECL-AP (pour

huit minutes considérées dans le protocole) ; ce qui permet de réduire le temps d’immersion à douze minutes

pour une utilisation sur les lieux plus rapide.

125


(a) traces de sang (b) vierge

(c) après Ac I (d) après transfert et séchage

(e) après Ac II (f) après TTBS

(g) après ECL-AP (h) après eau

Figure 11.11 – Papiers filtres après chaque étape – grossissement 0.6xQuatre traces de sang (20 µL), une de chaque groupe A, AB, B et O déposées sur du verre, séchées pendant un jour.

Ac I : anticorps primaires ; Ac II : anticorps secondaires : ECL-AP : enhanced chemiluminescence substrate - alkalin phosphatase ;TTBS : Tween 20 tris-buffered saline

126

Conclusion de la partie V

En partant d’un protocole dot blot de plus de six heures, le protocole adapté s’applique en trente minutes. Cette

réduction significative du temps d’expérience a été possible modifiant plusieurs étapes, dont :

• les étapes de prélèvement de la trace de sang et de sa solubilisation ont été remplacées par un étape de

transfert de la trace de sang sur un médium ;

• l’immersion du médium dans la solution d’anticorps primaire a été remplacée par la fixation au préalable

des anticorps primaires sur du papier filtre, servant de médium pour transférer les traces de sang.

• l’immersion dans la solution d’anticorps secondaire a été réduite à huit minutes.

Le plan d’expérience a permis de montrer que trois facteurs ont une influence significative en considérant

l’intensité de coloration mesurée :

1. la pression exercée pour transférer la trace de sang sur le papier filtre ;

2. le temps de séchage de la trace de sang après son transfert ;

3. le temps d’immunodétection dans la solution d’immunodétection ECL-AP.

En pratique, un résultat positif, à savoir la présence d’antigène A dans la trace de sang, se visualise par un

noircissement du papier filtre à l’endroit où la trace de sang a été transférée.

Il est important de signaler que ces résultats ne sont valables qu’avec les conditions expérimentales et avec le

script d’analyse des intensités réalisés dans cette thèse. En effet, une différence est perceptible entre ce que le

logiciel ImageJ extrait des photographies des papiers filtres et les résultats visuels observés et interprétés par

une personne, indépendamment du logiciel.

Le protocole de la méthode a donc été développé et doit donc maintenant être appliqué à des traces de sang de

différents groupes sanguins, sur différents supports, et âgées de plusieurs jours, voire semaines.

127

Sixième partie

Mise à l’épreuve de la méthode

129

Chapitre 12

Étude sur des traces de sang âgées jusqu’à quatre semaines,

sur différents supports

Sommaire12.1 Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

12.1.1 Dépôt du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

12.1.2 Détection des antigènes A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

12.1.3 Mesure de l’intensité colorimétrique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

12.1.4 Traitement des données . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

12.2 Résultats de la détection des antigènes A dans les traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . 134

12.2.1 Coloration du papier filtre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

12.2.2 Spécificité et sensibilité de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

12.2.3 Impact du temps et du support sur la trace de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

12.2.4 Étude supplémentaire avec du sang de groupe B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

12.2.5 Conclusion sur la détection des antigènes A dans des traces de sang . . . . . . . . . . 138

12.3 Discussion de la méthode appliquée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

12.3.1 Concentration en anticorps secondaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

12.3.2 Analyse par ImageJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

12.3.3 Décollement du sang du médium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

Une fois le protocole mis en place, il a été nécessaire de déterminer si cette méthode est applicable sur des traces

de sang âgées de plus de cinq heures. Ainsi, comme au chapitre 9, la spécificité de la méthode a été étudiée en

déposant des traces des quatre groupes, A, AB, B et O. La sensibilité de la méthode a quant à elle été évaluée

en analysant des traces de sang âgées de plusieurs semaines.

12.1 Matériel et méthode

Les protocoles mis en place dans ce chapitre reprennent ceux établis dans les chapitres précédents :

• le chapitre 9 pour la déposition des traces de sang ;

• le chapitre 10 pour l’immunodétection des antigènes A.

131

Partie VI : Mise à l’épreuve de la méthode

12.1.1 Dépôt du sang

Le sang a été prélevé à l’aide des kits Accu-Check® Safe-T-Pro plus. Du fait qu’aucun agent anticoagulant n’a

été utilisé, le sang de chaque donneur a été distribué en aliquots de 20 µL puis congelé à -80°C. Douze donneurs

ont été sélectionnés : trois personnes par groupe sanguin (A, B, AB et O) (cf. tableau 8.3) :

• pour le groupe A : donneurs 3, 41, 44 ;

• pour le groupe AB : donneurs 9, 26, 43 ;

• pour le groupe B : donneurs 17, 35, 49 ;

• pour le groupe O : donneurs 8, 40, 42.

Du fait des résultats obtenus avec l’un des donneurs de sang de groupe B dans le chapitre 9 et des résultats

préliminaires constatés dans ce chapitre, il a été décidé d’augmenter le nombre de contributeurs de groupe B.

Pour cela, une étude supplémentaire a été réalisée avec deux autres donneurs de sang de groupe B (donneurs 18

et 29). Sur les cinq supports présentés, une trace de sang supplémentaire d’un volume de 20 µL a été déposée,

puis séchée pendant trois semaines.

Les traces de sang ont été déposées sur cinq supports :

• deux supports lisses : plastique (coupelle de balance) et verre (lamelle de microscopie) ;

• trois supports poreux : papier filtre (Whatman® grade 595), tissu blanc (100% coton) et bois brut (bois

de sapin en épicéa).

L’expérimentation s’est déroulée sur une période de quatre semaines consécutives, avec des intervalles de dépôt

des traces de sang d’une semaine. Une illustration du protocole de dépôt des traces de sang sur les cinq supports

est présentée en figure 12.1.

4 semaines

3 semaines

2 semaines

1 semaine

x y z

même groupe sanguin

support

trace de sang

(a) Supports concernés : bois, plastique, tissu et verre

4 semaines 3 semaines

2 semaines 1 semaine

x y

z x

y z

z y

x z

y x

(b) Support concerné : papier filtre

Figure 12.1 – Protocole de dépôt des traces de sang sur les différents supports, avec du sang de trois donneurs (x, y et z )appartenant au même groupe sanguin

Chaque semaine, un aliquot par donneur a été décongelé et le sang (20 µL) a été déposé sur le support. Les sup-

ports ont été laissés en intérieur dans un laboratoire, à température ambiante, ventilé et éclairé principalement

à la lumière du jour. Le temps de référence, temps zéro, n’a pas été établi avec du sang liquide, mais également

avec du sang sec, séché pendant 5h00. À la fin du temps de séchage maximal (quatre semaines), l’ensemble des

traces de sang déposées sur un support ont été traitées et les résultats analysés. Les photographies de l’ensemble

des traces de sang déposées sur les cinq supports sont présentées en annexe J.

132

Chapitre 12. Étude sur des traces de sang âgées jusqu’à quatre semaines, sur différents supports

Au total, ce sont donc 310 traces de sang qui ont été déposées et traitées ; 75 traces de sang pour chaque groupe

sanguin, comprenant les cinq supports, les cinq temps de séchages et les trois donneurs. Aux 75 traces de sang

de groupe B se rajoutent aussi les dix traces de sang supplémentaires.

12.1.2 Détection des antigènes A

Création du médium imbibé d’anticorps primaires

Du papier filtre (Whatman® grade 595) a été immergé rapidement (quelques secondes) dans une solution

d’anticorps primaires anti-A (issus du clone BIRMA-1, IgM de souris – Bioscot® reagents Merck Millipore). Après

immersion, le papier filtre a été séché pendant une heure dans une étuve à 37°C. Après le séchage, le papier

filtre a été stocké au dessiccateur pendant la nuit.

Application du papier filtre imbibé d’anticorps primaires sur la trace de sang

Avant d’appliquer le papier filtre, les traces de sang ont été solubilisées par ajout de 40 µL d’eau déionisée.

Deux minutes après, le papier filtre a été apposé sur la trace de sang liquéfiée. Le transfert s’est effectué en

appuyant avec une force normale 104, pendant quinze secondes. Suite au transfert, le papier filtre a été séché

pendant quinze minutes à température ambiante.

Immunodétection des antigènes A

Le papier filtre séché a été immergé huit minutes sous agitation (100 rpm) dans une solution d’anticorps

secondaires anti-IgM (Novus, n°NBP1-72685) dilués 1’000 fois dans une solution de TTBS. Un lavage du papier

filtre a été fait par immersion dans la solution de TTBS pendant deux minutes.

Les complexes anticorps primaires-secondaires et antigènes A sont par la suite détectés par immersion du papier

filtre pendant huit minutes sous agitation (100 rpm) dans la solution d’immunodétection ECL-AP. À des fins

de conservations des papiers filtres, ces derniers ont été lavés dans de l’eau déionisée pendant deux minutes.

12.1.3 Mesure de l’intensité colorimétrique

Les membranes ont été sauvegardées numériquement à l’aide d’un scanner Epson Perfection V330 avec les

paramètres donnés à la section 9.2.3. Ensuite les images ont été rognées et analysées par le script ImageJ,

comme indiqué à la section 11.2.2.

12.1.4 Traitement des données

Pour comparer les mesures obtenues, le t-test (ou Welch test dans le cas où les variances ne sont pas les mêmes)

a été utilisé. Lorsque les différences observées entre les moyennes sont significatives, l’ampleur de cette différence

est évaluée par le calcul du êta-carré (⌘2) selon la formule 9.3 (cf. page 88). Afin de visualiser les résultats, des

box-plots ont été créés à l’aide du logiciel OriginLab® (Origin 2016).

104. D’après le chapitre 11, pression normale = 11,9 ± 1,5 N

133


12.2 Résultats de la détection des antigènes A dans les traces de sang

12.2.1 Coloration du papier filtre

La figure 12.2 illustre des résultats de papiers filtres utilisés sur des traces de sang séchées pendant un mois sur

du tissu. Tous les papiers filtres de cette étude sont présentés en annexe K. Le noircissement des trois traces

transférées indique la présence de l’antigène A dans les groupes sanguins A et AB. Pour les groupes B et O,

aucune coloration noire n’est remarquée. Au contraire, un éclaircissement est visible au niveau de la zone où

les trois traces de sang ont été transféré. Cela tend à confirmer que le dépôt de sang inhibe l’accessibilité des

anticorps secondaires aux anticorps primaires et que la coloration noire est spécifique à la présence des complexes

anticorps primaires-antigènes-anticorps secondaires. La coloration violette du bruit de fond est, comme attendue,

présente. Toutefois, elle ne semble pas empêcher la lecture des résultats.

(a) groupe A (b) groupe AB

(c) groupe B (d) groupe O

Figure 12.2 – Papiers filtres obtenus suite à l’immunodétection des antigènes A dans des traces de sang déposées sur du tissu,après un mois de séchage – grossissement 0,8x

À l’aide du script ImageJ, les papiers filtres sont convertis en niveau de gris et le bruit de fond est fortement

diminué. Le traitement du script sur les images de la figure 12.2 est présenté à la figure 12.3. Pour ces figures,

les valeurs d’intensités mesurées sont de 11’203,83 (groupe A), 10’359,77 (groupe AB), 4’812,24 (groupe B) et

4’159,74 (groupe O).

134


(a) groupe A (b) groupe AB

(c) groupe B (d) groupe O

Figure 12.3 – Papiers filtres après le traitement fait avec le logiciel ImageJ – grossissement 1x

12.2.2 Spécificité et sensibilité de la méthode

En combinant les valeurs numériques de tous les supports, tous temps confondus, il est possible d’observer la

distribution des données (cf. figure 12.4). Chaque box plot contient toutes les valeurs d’intensités mesurées pour

chacun des groupes. Chaque point regroupe ainsi l’intensité de la réponse colorimétrique d’un papier filtre,

comprenant les trois traces de sang de même groupe sanguin déposées sur un support, à un temps donné.

Figure 12.4 – Distribution des données classées par groupe sanguinChaque point correspond à une réponse colorimétrique mesurée d’une trace de sang déposée à l’instant t sur un support donné (n=25).

Il peut être constaté que les moyennes des intensités colorimétriques des groupes A et AB sont bien supérieures

à celles mesurées pour les groupes B et O. Les valeurs de t-tests calculées montrent que les intensités mesurées

entre groupes A et AB ne sont pas significativement différentes (p-value=0,29, ↵=0,05, bilatéral), de même que

pour les groupes B et O (p-value=0,59, ↵=0,05, bilatéral). En associant et en comparant les groupes A-AB

et B-O, les moyennes des intensités calculées sont fortement significativement différentes (p-value=2,02.10-13,

↵=0,05, bilatéral ; et ⌘2=0,31).

135


Les dispersions des données se séparent toutefois moins que celles observées dans la figure 9.6. La courbe ROC

effectuée indique une aire sous la courbe de 0,92, montrant une grande spécificité du protocole effectué en

prenant en compte toutes les données mesurées.

Les hautes valeurs d’intensité mesurées du groupe sanguin B sont là encore dues au donneur #49, déjà remarqué

précédemment (chapitre 9). Des réactions positives ont été mesurées avec ce donneur de sang sur l’ensemble des

supports, à l’exception du papier filtre. Il avait été émis l’hypothèse que les longs temps d’incubation (deux fois

deux heures) utilisés lors du dot blot pouvaient avoir un rôle significatif de la coloration mesurée. Ici seule une

incubation de huit minutes est effectuée dans une solution d’anticorps secondaires. Cependant, il est à noter

que les intensités mesurées sont beaucoup plus faibles que celles observées au chapitre 9.

12.2.3 Impact du temps et du support sur la trace de sang

Les résultats obtenus corroborent ceux illustrés au chapitre 9. L’antigène A présent dans les traces de sang A

et AB reste détectable après un mois de séchage de sang de groupes A et AB (cf. figure 12.5 – tous supports

confondus). Au niveau des intensités mesurées sur chaque papier filtre, les intensités obtenues après quatre

semaines de séchage restent non significativement différentes de celles obtenues après 5h00.

Figure 12.5 – Évolution de la réponse colorimétrique obtenue en fonction du temps (tous supports regroupés)Chaque point correspond à une réponse colorimétrique mesurée d’une trace de sang déposée à l’instant t sur un support donné (n=5).

136


Des cinq supports testés, il a été remarqué que le papier filtre ne permet pas d’obtenir de résultats visuels. La

figure 12.6 illustre bien cette observation ; les plus petites valeurs observées étant celles mesurées sur le papier

filtre. En réalisant les expériences, il a été remarqué que le sang séché sur le papier filtre ne se transfère pas sur

le papier filtre contenant les anticorps primaires. En effet, l’eau utilisée pour solubiliser les traces de sang n’a

pas permis de solubiliser le sang et donc de favoriser son transfert.

Figure 12.6 – Distribution des données classées par support et par groupe sanguinChaque point correspond à une réponse colorimétrique mesurée à partir de traces de sang crées sur un support donné à un instant t (n=5).

En combinant tous les supports, le taux de faux positif s’élève à 4,00%, et le taux de faux négatif à 20,00% ce

qui est relativement élevé. Ce taux élevé s’explique par le papier filtre qui, n’ayant pas favorisé le transfert des

traces de sang, a engendré des faux négatifs pour les traces de sang de groupes A et AB. En ne considérant pas

le papier filtre, le taux de faux positif est de 5,00% et le taux de faux négatif tombe à 2,50% (cf. tableau 12.1).

L’aire sous la courbe ROC sans considérer le papier filtre monte à 0,97.

tous les supports inclus sans le papier filtre

faux positif 4,00 % 5,00 %faux négatif 20,00 % 2,50 %spécificité 96,00 % 95,00 %sensibilité 80,00 % 97,50 %

AUC - ROC 0,92 0,97

Tableau 12.1 – Valeurs statistiques calculées en fonction des supports pris en compteTous les supports : bois, papier filtre, plastique, tissu et verre ;

AUC - ROC : aire sous la courbe ROC.

Ces résultats montrent ici une limite de la méthode appliquée, quant aux supports trop poreux. Sur des lieux

d’investigations les supports poreux de ce type peuvent être retrouvés, par exemple sous la forme de papiers

peints. Afin de favoriser le transfert des traces de sang situées sur ce type de surface, des améliorations du

protocole doivent être entreprises. Il serait possible d’augmenter le volume d’eau pour solubiliser la trace

de sang, d’augmenter le temps de solubilisation ou de transfert. Il serait également possible de changer de

solution de solubilisation en considérant un détergent ou un solvant permettant de détacher le sang sec du

support. Il est en effet possible que de par la porosité du support, une solubilisation passive de la trace de

sang avec de l’eau ne suffise pas car l’affinité du sang pour ce type de support est trop importante.

137


12.2.4 Étude supplémentaire avec du sang de groupe B

Sur les trois donneurs de sang de groupe B utilisés dans cette partie, deux sont les mêmes que ceux utilisés

au chapitre 9. En tenant compte des résultats obtenus aux chapitres 9 et 12, pour le groupe B, les colorations

positives ont toujours été observées avec le sang du même donneur, le #49. Cela tend à confirmer que ce donneur

présente une particularité dans son sang qui engendre de faux positifs, comme discuté précédemment.

Afin d’appuyer cette observation, deux autres donneurs de sang de groupe B ont été inclus dans l’étude et leur

sang a été déposé. Pour des raisons d’organisation, le protocole complet n’a pas pu être mis en place, c’est

pourquoi seule une déposition de sang a pu être faite sur chaque support. Les traces de sang ont été séchées

pendant trois semaines.

Les photographies des traces de sang supplémentaires sont présentées en annexe J, et les papiers filtres en annexe

K. Visuellement, la coloration des papiers filtres est similaire à celles observées sur les papiers filtres issus de

traces de sang de groupe B. Il ne semble pas y avoir de faux positif distinct. Il est difficile d’interpréter et de

comparer ces résultats du fait que seulement deux traces de sang, de deux donneurs, ont été déposées sur les

supports, et cela une seule fois. L’analyse de ces résultats semble toutefois confirmer la tendance selon laquelle

une absence de coloration est visible lorsque du sang de groupe B est analysé, soutenant donc l’hypothèse selon

laquelle le donneur de sang #49 devrait avoir un profil érythrocytaire engendrant de faux positifs.

12.2.5 Conclusion sur la détection des antigènes A dans des traces de sang

Cette étude a permis de montrer l’efficacité de la méthode proposée, à savoir détecter en trente minutes les

antigènes A dans des traces de sang séchées jusqu’à quatre semaines.

Le support sur lequel les traces de sang se trouve est cependant à considérer lors de l’emploi de la technique.

Il a un rôle tout particulier dans la solubilisation des traces de sang lors de l’ajout d’eau. Si les traces de sang

ne se solubilisent pas sur le support, alors elles ne pourront pas se transférer sur le médium du papier filtre,

engendrant dès lors un faux négatif dans le cas où le sang contient bien les antigènes A. Cela a été remarqué

pour le support « papier filtre » qui est très poreux ; le sang sec se transférait difficilement sur le papier filtre

imbibé d’anticorps.

Enfin, il est intéressant de constater que de façon générale, du sang reste toujours visible après l’application du

médium du papier filtre (cf. figure 12.7). Cela permet donc le prélèvement de matière de la trace de sang pour

les analyses génétiques suivantes. Le sang étant un fluide riche en matériel génétique, il n’est pas nécessaire d’en

prélever une grande quantité pour obtenir un profil génétique complet.

(a) avant transfert (b) après transfert

Figure 12.7 – Photographies de traces de sang avant (a) et après (b) leur transfert sur le papier filtre – grossissement 0.8xLes traces de sang (20 µL ont été déposées sur du verre et ont séché pendant un jour.

138


12.3 Discussion de la méthode appliquée

12.3.1 Concentration en anticorps secondaires

La coloration du papier filtre peut être relativement forte. Cela engendre un bruit de fond violet foncé. Bien

qu’une coloration noire soit attendue pour un résultat positif, le bruit de fond peut gêner l’interprétation des

résultats. En présence de sang A et AB, la distinction est relativement aisée. Par contre, avec du sang de groupe

B, surtout en considérant les faux positifs, l’interprétation visuelle du résultat est plus ardue.

Afin de réduire la coloration mauve du bruit de fond, il serait intéressant d’augmenter le facteur de dilution

des anticorps secondaires. Ces derniers sont dilués 1’000x. D’après les recommandations du fabricant, un taux

de dilution de 20’000 est indiqué pour la technique ELISA. Bien que les conditions diffèrent considérablement

entre un ELISA et la technique développée ici, d’autres taux de dilution, plus élevés peuvent être envisagés.

12.3.2 Analyse par ImageJ

Les traces de sang des trois donneurs du même groupe ont été déposées sur les supports côte à côte afin de les

transférer en une fois sur le médium du papier filtre. Ce choix a été pris pour observer la faisabilité de transférer

et d’analyser plusieurs traces de sang en une seule procédure. Les résultats sont d’ailleurs concluants.

Une fois les papiers filtres numérisés, ces derniers ont été analysés par ImageJ. Une sélection rectangulaire (7,5x3

cm) a été faite en rognant les images dans le but :

• de supprimer des zones d’ombres engendrées par le scanner ; zones engendrant par la suite une surestima-

tion de la mesure des intensités ;

• d’uniformiser la dimension des différentes zones d’analyse. En effet, les morceaux de papier filtre utilisés ne

sont pas tous de la même taille ; une zone de sélection identique encadre les trois traces de sang transférées.

Une mesure effectuée par ImageJ comprend donc les trois traces de sang transférées. Chaque mesure n’est alors

pas associée à une trace de sang, d’un donneur, mais aux traces de sang de trois donneurs à un temps donné,

pour un support donné. L’intravariabilité n’est donc pas étudiée dans ce protocole. Pour cela, il aurait fallu

analyser chaque trace de sang individuellement.

12.3.3 Décollement du sang du médium

Comme lors du plan d’expérience mis en place lors du développement du papier filtre, il a été remarqué que

certains agrégats de sang pouvant se décoller du médium du papier filtre. Sur les 25 papiers filtres utilisés pour

les traces de sang A et AB (cinq supports, cinq temps de séchage), onze papiers filtres présentaient des agrégats.

Ils semblent cependant beaucoup moins importants que ceux illustrés au chapitre 10. Le papier filtre présentant

le plus grand nombre d’agrégats est illustré à la figure 12.8.

139


Figure 12.8 – Illustration des agrégats de sang qui se décollent du papier filtre – grossissement 1xLes traces de sang de groupe A ont été déposées sur du verre, puis séchées pendant 4 semaines ;

les petits points noirs ne sont pas fixés sur le papier filtre, ils sont juste déposés dessus.

140

Chapitre 13

Contrôles supplémentaires

Sommaire13.1 Traces de sang de groupe A âgées de plus d’un mois . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

13.1.1 Protocole mis en place . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

13.1.2 Résultats & discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

13.2 Résultats analysés par d’autres personnes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143



13.3 Analyse à l’aveugle de traces de sang déposées par une tierce personne . . . . . . . . . . . . 146



13.4 Étude préliminaire sur les analyses ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

13.4.1 Protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

13.4.2 Résultats préliminaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

13.1 Traces de sang de groupe A âgées de plus d’un mois

13.1.1 Protocole mis en place

Au cours du développement de la méthode, tous les volumes de sang de groupe A du donneur #41 (cf. tableau

8.3) n’ont pas été utilisés. Ces volumes ont toutefois été conservés dans le laboratoire, à température ambiante

dans le but d’obtenir des traces de sang âgées de plus d’un mois. Ces traces de sang sont des restes de sang

prélevé et accumulé sur du plastique ; le volume de sang n’est donc pas connu. Il est cependant largement

supérieur à 20 µL. Les photographies des traces de sang sont présentées à l’annexe L. Entre le temps de dépôt

et la date d’analyse, les délais de séchage ont été de 371 jours (> 1 an) 105, 205 jours (> 6 mois), 189 jours (>

6 mois), 148 jours (> 4 mois), 112 jours (> 3 mois) et 43 jours (> 1 mois).

L’antigène A dans ces traces de sang de groupe A a donc été détecté par le protocole d’immunodétection

développé à la page 124. Les papiers filtres ont été sauvegardés numériquement à l’aide d’un scanner Epson

Perfection V330 avec les paramètres établis à la page 87. Afin de comparer les intensités mesurées, les papiers

filtres ont été analysés par le logiciel ImageJ, à l’aide du script composé à la page 115.

105. Trois traces de sang âgées de 371 jours ont pu être utilisées et ont été numérotées T1, T2 et T3.

141


Par rapport au protocole d’immunodétection établi, deux variations ont été effectuées pour prendre en compte

la taille des traces de sang. Comme le transfert de la trace de sang sur le médium est un facteur majeur, l’étape

de solubilisation du sang sec est primordiale. En considérant la taille de ces traces de sang, il a été estimé que

les conditions expérimentales relatives à la solubilisation du sang sec devaient être modifiées, telles que :

• le volume d’eau utilisé pour solubiliser les traces de sang a été augmenté à 120 µL. En effet, suivant l’âge de

la trace, il a été estimé que 40 µL d’eau ne suffiraient pas à solubiliser efficacement les traces de sang. Avec

seulement 40 µL d’eau, le sang séché formait un agglomérat visqueux. Il a donc été décidé d’augmenter le

volume d’eau dans le but de solubiliser correctement les traces de sang.

• le temps initial de deux minutes pour solubiliser le sang sec a été augmenté à quatre minutes, également

pour permettre au sang de se solubiliser correctement.

13.1.2 Résultats & discussion

Les résultats montrent un bruit de fond très marqué sur le papier filtre (cf. figure 13.1) qui est dû au transfert

de la trace de sang sur le papier filtre. L’augmentation du volume d’eau nécessaire pour solubiliser le sang et

l’augmentation de la durée de solubilisation ont bien entraîné une forte solubilisation du sang ; un bruit de fond

sur le papier filtre, conséquent au transfert, est observé. Durant les immersions dans les solutions d’anticorps

secondaires et d’immunodétection ECL-AP, des agrégats de sang restaient sur le papier filtre.

(a) 371 jours, T1 (b) 371 jours, T2

(c) 371 jours, T3 (d) 205 jours

(e) 189 jours (f) 148 jours

(g) 112 jours (h) 43 jours

Figure 13.1 – Papiers filtres utilisés sur des traces de sang de groupe A, séchées sur du plastique et âgées de plusieurs mois –grossissement 0,8x

142

Chapitre 13. Contrôles supplémentaires

Une coloration noire est observée à l’endroit où les traces de sang ont été transférées, même si la forte coloration

du médium peut rendre la lecture difficile. Les mesures d’intensités effectuées par le logiciel ImageJ (cf. figure

13.2) permettent de montrer que les valeurs obtenues sont plus élevées pour les traces de sang de groupe A,

quel que soit le temps de séchage, par rapport aux contrôles de traces de sang de groupes B et O âgées d’un

mois et déposées également sur du plastique. Une diminution des intensités est toutefois observée en regard des

contrôles des traces de sang A et AB.

Figure 13.2 – Intensités mesurées pour les différentes traces de sang de groupe A, déposées sur du plastique,et âgées de plusieurs mois

Les quatre histogrammes de droite, contrôles, permettent de comparer les valeurs obtenues avec des traces moins âgées ;La valeur de l’histogramme à 371 jours correspond à la moyenne des trois intensités de traces T1, T2 et T3. La barre d’erreur correspond

à l’écart-type (n=3).

Cette étude tend à montrer qu’il est possible de déterminer la présence de l’antigène A dans des traces des

sang âgées de plus d’un mois avec le protocole mis en place.

D’autres études devraient être effectuées pour affiner les résultats observés ; en testant d’autres supports,

et en considérant les quatre groupes sanguins A, AB, B et O de plusieurs donneurs afin d’augmenter la

population expérimentale.

13.2 Résultats analysés par d’autres personnes

Les intensités mesurées sont dépendantes du script ImageJ. En le modifiant, le seuil de sensibilité définissant un

résultat positif peut être augmenté ou diminué. Cependant, l’utilisation d’un logiciel et du script d’analyse n’est

pertinent que dans un but de recherche pour optimiser la méthode par exemple. Leur utilisation l’est moins

pour une application sur les lieux où l’utilisation d’un logiciel n’est pas envisagée car elle nécessiterait une étape

supplémentaire d’enregistrement numérique du papier filtre 106.

106. Il pourrait par ailleurs être envisagé de développer une application sur téléphone portable pour prendre en photographie unrésultat et obtenir une donnée numérique de l’intensité de la coloration. Cela pourrait aider l’interprétation d’un résultat.

143


Dans l’optique de vérifier si l’interprétation à l’œil nu de résultats obtenus après application du protocole

présenté est aisée, des photographies de papiers filtres appliqués sur des traces de sang ont été montrées à six

personnes qui ont dû indiquer si le sang déposé sur le support pouvait contenir l’antigène A ou non.


Chacune des six personnes a reçu un set différent de 24 photos de papiers filtres, issus des résultats illustrés au

chapitre 12 107. Les photographies sont celles de l’annexe K. Un dossier photographique se composait de :

• six papiers filtres de chaque groupe sanguins (A, AB, B et O) ;

• douze papiers filtres de deux supports différents (un poreux et non poreux) ;

• huit papiers filtres de trois temps de séchages différentes (zéro, deux et quatre semaine-s).

Les instructions et informations ont été transmises ainsi aux six personnes :

« L’idée est de voir si quelqu’un qui n’est pas habitué à ces résultats donne les mêmes réponses que moi, et que

le logiciel que j’utilise pour analyser les photos. Vous trouverez ci-joint le dossier dans lequel les photos que vous

devez analyser sont déposées ; vous en avez chacun 24. Indiquez pour chaque photo le résultat que vous pensez

être (positif, négatif ou non concluant) ; la colonne « remarque » est là au cas où.

Quelques indications sur les photos prises :

• trois traces de sang (même groupe sanguin) ont été déposées sur plusieurs supports : bois, papier filtre,

plastique, tissu et verre ;

• les traces de sang ont été déposées toutes les semaines pendant un mois, puis ont toutes été analysées en

même temps ;

• le sang provient des quatre groupes sanguins : A, AB, B et O ;

• dans les traces de sang, l’antigène A est cherché ; donc les traces de sang des groupes A et AB doivent

donner un résultat positif, alors que les traces de sang des groupes B et O donnent un résultat négatif ;

• après séchage des traces de sang, elles ont été solubilisées avec de l’eau puis les trois traces ont été trans-

férées sur un même médium, du papier filtre contenant des anticorps anti-A qui ciblent l’antigène A ;

• après une étape d’immunodétection, la réponse positive se voit par un noircissement de la trace transférée

sur le médium.

Dans le dossier joint, vous trouverez les exemples d’un résultat positif et d’un négatif. Comme l’une des prin-

cipales variables pouvant modifier le résultat final est en lien direct avec le transfert de la trace de sang sur le

médium (papier filtre avec anticorps), il se peut que tout ne se soit pas transféré, ou juste partiellement. Il est

donc possible que vous ne voyiez rien ou pas les trois transferts des trois traces de sang. »


Sur l’ensemble des réponses (144 en tout), huit sont erronées et dix ont été données comme « non conclusif » ;

ces dernières ont dès lors été considérées comme des erreurs comme la bonne réponse n’a pas été trouvée. Le

tableau 13.1 résume les taux de succès selon les trois variables définies, respectivement le groupe sanguin (a),

le support de déposition (b) et le temps de séchage des traces de sang (c).

De ces observations, le taux d’analyse correcte des photographies s’élève à 87,50%, résultant donc en une

interprétation aisée des résultats. La principale difficulté relevée par les examinateurs concernait les photos de

groupe B. En effet, comme relevé dans le chapitre précédent, un des donneurs de sang de groupe B engendre

des faux positifs (cf. figure 13.3).

107. Ces personnes ont une formation universitaire en science forensique.

144


Groupes sanguins Correct Erroné Total % correct

A 34 2 36 94,44AB 32 4 36 88,89B 24 12 36 66,67O 36 0 36 100,00

a) classement par groupe sanguin

Support Correct Erroné Total % correct

bois 20 4 24 83,33papier filtre 19 5 24 79,17plastique 31 5 36 86,11

tissu 21 3 24 87,50verre 35 1 36 97,22

b) classement par support

Temps Correct Erroné Total % correct

0 semaine 42 6 48 87,502 semaines 43 5 48 89,584 semaines 41 7 48 85,42

c) classement par temps de séchage

Tableau 13.1 – Taux de succès de l’interprétation des photographies

Figure 13.3 – Papier filtre utilisé sur des traces de sang de groupe B (trois donneurs) sur du plastique,séchées pendant quatre semaines – grossissement 0.8x

Les résultats erronés sur les groupes A et AB (faux négatifs) sont dus pour cinq d’entre eux au support du

papier filtre. Comme précisé au chapitre précédent, ce support a engendré la majorité des faux négatifs observés

du fait que les traces de sang déposées sur ce dernier se transfèrent difficilement sur le papier filtre contenant

les anticorps. Le sixième faux négatif a été observé pour des traces de sang de groupe AB déposées sur du bois

pendant quatre semaines. Dans ce cas, le transfert de la trace de sang n’a pas été optimal, conduisant à la

détection d’une seule trace de sang sur les trois, raison pour laquelle l’examinateur a indiqué la réponse « non

conclusif ».

Cette vérification a permis de montrer que la distinction entre un résultat positif d’un résultat négatif semble

assez aisée. Cependant elle pourrait être améliorée en :

• expliquant plus clairement la coloration attendue afin de différencier la coloration du bruit du fond qui

peut être importante, avec la coloration de la trace de sang transférée ;

• effectuant une démonstration du protocole de détection ;

• montrant plus d’exemples de vrais/faux résultats positifs/négatifs.

Une optique intéressante serait le développement d’une application qui utiliserait la caméra d’un téléphone

portable pour aider l’utilisateur à se décider et à « interpréter » les résultats. Des apps existent déjà pour

145


certains tests indicatifs de fluides biologiques ou de stupéfiants (Cromartie et al., 2019; Elkins et al., 2017; Merli

et al., 2019).

Dans l’optique de différencier plus clairement le bruit de fond et une réaction positive, et pour éviter une

mauvaise interprétation, il est à noter l’importance de savoir où la trace de sang a été transférée sur le papier

filtre. Certains examinateurs ont fait part de la difficulté de séparer la coloration du papier filtre qui peut

engendrer un bruit de fond conséquent. En connaissant la zone de transfert des traces de sang, cette variable

serait très probablement réduite 108.

13.3 Analyse à l’aveugle de traces de sang déposées par une tierce

personne

Lors du développement de la méthode, le groupe sanguin associé aux traces de sang était connu. Afin de

supprimer ce biais, des traces de sang ont été déposées par une autre personne puis analysées par moi-même

sans connaître le groupe sanguin des traces de sang.


Il a été demandé à une personne de déposer des traces de sang en ayant à sa disposition :

• du sang de quatre individus (groupe sanguin A, AB, B et O 109 – prélevé et conservé à -80°C) ;

• une période de vingt jours pour déposer quand elle le souhaitait les traces de sang ;

• quatre supports (du bois, du plastique, du tissu et du verre). Le papier filtre a été exclu de cette expé-

rimentation du fait qu’il avait engendré un taux élevé de faux négatifs. Le tissu utilisé a également été

changé ; il est composé à 100% de viscose et de différentes couleurs 110.

Aucune indication n’a été donnée à la personne concernant la source du sang à utiliser, le volume et le nombre

de traces de sang à déposer, les dates de dépôts (si ce n’est que les traces devaient être déposées dans l’intervalle

de vingt jours à disposition), le type et le nombre de supports.

Une fois les traces de sang déposées et séchées, elles ont toutes été analysées en même temps par le protocole

d’immunodétection développé à la page 124. Les papiers filtres ont été sauvegardés numériquement à l’aide

d’un scanner Epson Perfection V330 avec les paramètres établis à la page 87. La coloration a uniquement été

observée de manière visuelle et qualitative ; le script ImageJ n’a pas été utilisé.


Au total, dans un intervalle de 17 jours, 39 traces de sang de sources différentes ont été déposées. Les traces de

sang déposées sont présentées en annexe M. En observant visuellement les traces de sang, il n’est pas possible

d’en déterminer le nombre de sources.

Le tableau en annexe M1 présente les conditions expérimentales des traces déposées, à savoir leur groupe sanguin,

le volume de la trace de sang et le nombre de jours de séchage. Ces informations n’ont été transmises qu’après

avoir effectué le protocole d’immunodétection et après avoir interprété les résultats.

Lors des expérimentations d’immunodétection, il est apparu que le tissu utilisé dans cette partie ne se comportait

pas comme celui utilisé dans les chapitres liés au développement de la méthode. En effet, le tissu étudié ici permet

108. Pour cette expérience, les examinateurs n’avaient pas eu cette information.109. Selon le tableau 8.3, groupe A : personne #41 ; groupe AB : #9 ; groupe B : #29 ; groupe O : #42110. Le tissu a été changé du fait que le tissu blanc 100% coton utilisé dans les parties précédente n’était plus le même. L’occasiona donc amené à choisir un tissu différent pour tester l’impact sur les résultats.

146


au sang de se diffuser plus largement au sein de sa matrice. L’humidification des traces de sang par l’ajout de

l’eau est similaire à celle du papier filtre étudié ; à savoir que l’eau ne permet pas de solubiliser efficacement

la trace de sang, inhibant donc son transfert sur le papier filtre source. Dans ces conditions, une absence de

coloration du papier filtre source ne permet pas d’affirmer une réaction négative, soit l’absence des antigènes A

dans la trace de sang. L’absence de transfert du sang solubilisé est à l’origine d’un faux négatif.

En prenant en compte toutes les traces de sang, la réponse a été correctement attribuée dans 64% des traces

de sang (25 traces sur 39) ; 18% ont été faussement attribuées (7 traces de sang sur 39). Concernant les sept

dernières traces de sang, aucune réponse n’a été attribuée, du fait de l’absence de transfert flagrant du sang sur

le papier filtre source. En enlevant le tissu, seul support présentant la réponse non prononcé, et en considérant

les trois autres supports ensemble, le taux de réponses correctes augmente à 83%. L’ensemble de ces observations

est récapitulé dans le tableau 13.2. Le détail de chaque réponse est reporté dans le tableau en annexe M2.

Bois

Correct 10 71 %Faux 4 29 %

Non prononcé 0 0 %Total 14 100%

Plastique



Tissu



Verre



Tous supports



Tous sans tissu



Tableau 13.2 – Synthèse des résultats à l’aveugle

Ces deux études de vérification de l’interprétation des résultats montrent l’importance de connaître la loca-

lisation des traces de sang transférées sur le papier filtre. En connaissant cette information, il semble en effet

plus aisé d’attribuer une réponse à la coloration observée, pour différencier la coloration noire, positive, de

la coloration mauve, associée au bruit de fond.

Les supports poreux, tels que le papier filtre, et le tissu, engendrent plus de faux négatifs que les autres sup-

ports testés. Si des supports similaires sont retrouvés sur des lieux, alors le protocole devrait potentiellement

être adapté pour augmenter l’efficacité de la solubilisation du sang et de son transfert.

Des études supplémentaires peuvent être effectuées avec d’autres supports afin d’évaluer leur influence sur les

résultats de ce protocole. Des modifications du protocole peuvent également être apportées afin de prendre

en compte les différentes surfaces et augmenter ainsi son efficacité.

147


13.4 Étude préliminaire sur les analyses ADN

13.4.1 Protocole

L’évaluation de l’effet des réactifs utilisés dans le protocole sur la qualité de profils génétiques a été initiée

au sein d’une étude préliminaire. Cette étude s’est effectuée en trois temps avec le sang d’un même donneur

masculin de groupe A fraichement prélevé :

1. huit volumes de sang (100 µL) ont été utilisés : quatre volumes de sang liquide et quatre séchés pendant

cinq heures. Ensuite, 100 µL d’anticorps anti-A (Bioscot®, Merck Milipore) ont été ajoutés, puis chacun

des huit spécimens a été prélevé 111.

2. du sang liquide a été mélangé à chaque réactif et chaque combinaison de réactifs. Le tableau 13.3 présente

les différents réactifs mélangés. Chaque réactif a été mélangé à un ratio égal, puis 1 µL du mélange a été

prélevé et ajouté à 1 µL de sang liquide. La totalité de ce mélange a été utilisé pour les analyses génétiques.

3. le protocole d’immunodétection a été appliqué sur du sang sec 112 ; le papier filtre utilisé est illustré dans

la figure 13.4 :

• #10 : un prélèvement111 de la trace de sang après l’application du protocole d’immunodétection ;

• #11 : un prélèvement111 du papier filtre sur la zone colorée en noir ;

• #12 : un découpage du papier filtre sur la zone colorée en noir ;

• #13 : un découpage du papier filtre sur une zone non colorée en noir (blanc) ;

• #14 : un découpage d’un papier filtre vierge non utilisé (blanc).

Spécimen Réactifs

1 Ac I2 eau3 Ac II4 TTBS5 ECL-AP6 Ac I + eau7 Ac I + eau + Ac II8 Ac I + eau + Ac II + TTBS9 Ac I + eau + Ac II + TTBS + ECL-AP

Tableau 13.3 – Liste des réactifs mélangés à du sang liquide (ratio 1:1)Ac I : anticorps primaires ; Ac II : anticorps secondaires :

ECL-AP : enhanced chemiluminescence substrate - alkalin phosphatase ; TTBS : Tween 20 tris-buffered saline.

Figure 13.4 – Papier filtre utilisé pour l’analyse ADN – grossissement 0.7x

111. Le prélèvement a été effectué en utilisant le FLOQSwab™.112. 20 µL, séchés cinq heures sur une plaque en verre.

148


Les profils ont été comparé à deux profils de référence du même donneur, masculin, obtenus à partir d’un frottis

de la muqueuse jugale (FMJ) et d’un prélèvement d’une goutte de sang.

L’ADN a été extrait avec le kit QIAamp DNA Investigator (Qiagen) pour tous les spécimens, à l’exception du

FMJ dans lequel l’ADN a été extrait par une résine Chelex® (Bio-Rad). L’ADN a ensuite été quantifié en utili-

sant le kit Qubit® dsDNA HS Assay (Invitrogen™) et amplifié (29 cycle de PCR) à l’aide du kit AmpFLSTR™

NGM SElect™ PCR Amplification (Applied Biosystems). Les profils ont été établis à partir d’une l’électropho-

rèse capillaire effectuée sur l’instrument 3500 genetic analyzer (Applied Biosystems) et d’une analyse par le

logiciel Genemapper™ ID-X (Applied Byosystems) ; le seuil à été fixé à 80 rfu 113.

13.4.2 Résultats préliminaires

L’analyse et la comparaison des profils a uniquement été faite de manière qualitative. Les profils obtenus sont

simples et incomplets, à l’exception du FMJ qui est complet (cf. tableau 13.4). Une dégradation des profils est

observée par rapport au FMJ ; l’ajout de réactif semble dégrader l’ADN. L’inhibition la plus forte est observée

avec l’ajout de la solution d’immunodétection ECL-AP.

À partir du papier filtre (points #11 et #12), de l’ADN est obtenu. Le profil obtenu à partir du prélèvement

(point #11) est de relative bonne qualité ; la moitié des marqueurs est complet. À partir du découpage du papier

filtre (point #12), seuls trois marqueurs sont complets. Le profil génétique est fortement dégradé. Le contrôle des

deux blancs (points #13 et #14) montre une absence d’ADN. Prélever la zone noire semblerait donc augmenter

la qualité du profil génétique par rapport à découper la zone d’intérêt. Balogh et al. (2003) proposent d’ailleurs

le prélèvement à l’alternative d’une découpe pour les traces papillaires sur du papier. L’affinité des cellules pour

la composition du papier filtre pourrait expliquer pourquoi effectuer un prélèvement mécanique permettrait de

récupérer plus de cellules que par découpe du papier. Voorhees et al. (2006) et Norris et al. (2007) indiquent la

possibilité d’utiliser une cellulase 114 pour augmenter le rendement de l’extraction d’ADN.

SpécimenMarqueurscomplets

Marqueursincomplets

Marqueursvides

Nombred’allèles

FMJ 16 0 0 28goutte de sang 10 3 3 19

1 10 5 1 212 13 3 0 253 9 6 1 214 9 3 4 185 4 5 7 126 8 6 2 187 5 7 4 158 7 7 2 179 9 6 1 2010 14 2 0 2611 8 7 1 1912 3 7 6 913 0 0 16 014 0 0 16 0

Tableau 13.4 – Analyse qualitative et comparaison des profils génétiques

Les résultats montrent une dégradation des profils génétiques obtenus lors de l’ajout des réactifs et lorsque

l’ADN a été extrait à partir du papier filtre. Les profils obtenus à partir de la goutte de sang et de la trace de

sang après son transfert (point #10) ne sont toutefois pas complets. L’analyse des profils des spécimens et

des contrôles montre que les étapes d’amplification et d’électrophorèse n’ont pas inhibé la qualité des profils

obtenus. L’extraction de l’ADN semble être la cause de l’absence de certains allèles à certains marqueurs.

113. rfu : relative fluorescent unit.114. Enzyme permettant de dégrader la cellulose.

149


Le point le plus pertinent à remarquer est qu’un profil simple incomplet (huit marqueurs complets) a été

obtenu à partir du prélèvement biologique sur la zone colorée en noir du papier filtre (point #11), à savoir là

où l’antigène A a été transféré et détecté. Ce profil pourrait être transmis à la banque de données nationale

des profils génétiques CODIS115 puisque pour les profils simples, il est nécessaire d’avoir au minimum six

marqueurs complets (sans compter l’amélogénine) pour répondre aux critères de CODIS. Bien que prélever

le reste de la trace de sang sur son support, après son transfert sur le médium donne un meilleur profil

génétique, il pourrait être intéressant de prélever l’ADN sur le papier filtre dans les cas où les traces de sang

étaient de très petites tailles et qu’il ne reste pas de sang visible.

Bien qu’aucun réplicat n’ai été fait, ces résultats préliminaires suggèrent qu’un profil génétique pourrait être

obtenu depuis le papier filtre, après l’application du protocole d’immunodétection sur des traces de sang.

Cela pourrait permettre d’obtenir un profil génétique lorsque le protocole a été effectué sur des traces de

sang de petites tailles, et que peu de matériel sanguin subsiste après le transfert. D’autres études sont alors

nécessaires afin de connaître précisément l’impact de la méthode sur les analyses ADN.

115. CODIS : Combined DNA Index System.

150

Chapitre 14

Application de la méthode sur deux cas réels

Sommaire14.1 Premier cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

14.1.1 Informations relatives au cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

14.1.2 Morpho-analyse de la trace de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

14.1.3 Détection de l’antigène A dans la trace de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

14.1.4 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

14.2 Deuxième cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

14.2.1 Informations relatives au cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

14.2.2 Morpho-analyse des traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

14.2.3 Détection de l’antigène sanguin dans les traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

14.2.4 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

14.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

Aux mois de novembre 2018 et d’octobre 2019, il a été possible d’appliquer le protocole dans le cadre de deux cas

réels en participant aux interventions de l’inspectrice scientifique Vivian Magalhaes Marques et du commissaire

adjoint Steve Rosset 116. Lors de la première intervention, le protocole était toujours en cours de développement.

Lors de la seconde investigation, le protocole complet développé au cours de cette recherche de doctorat a pu

être appliqué sur plusieurs traces de sang.

14.1 Premier cas

14.1.1 Informations relatives au cas

Il s’agissait d’un homicide ayant eu lieu dans un appartement, action qui a engendré de multiples traces de

sang. Les intervenants de la police cantonale ont procédé à l’investigation des lieux le lendemain des faits. Nous

sommes intervenus une semaine après les faits, l’appartement ayant été scellé.

Les investigateurs avaient déjà effectué les prélèvements biologiques souhaités. Sur une des traces de sang

partiellement prélevée par leurs soins, il a été possible de tester le protocole sur le reste de la trace. Lors de la

discussion avec les investigateurs, ces derniers ont indiqué avoir voulu prélever cette trace du fait de sa forme

et de sa localisation jugées particulières.

116. Service forensique, police Neuchâteloise.

151


14.1.2 Morpho-analyse de la trace de sang

L’analyse morphologique de la trace (cf. photographie 14.1) est la suivante, Esperança (2019b) :

• surface étudiée : surface horizontale, parquet

• forme : complexe

— trace primaire : circulaire avec digitations, épines

— traces secondaires : majoritairement circulaires

• taille :

— trace primaire : centimétrique

— traces secondaires : millimétriques

• distribution :

— trace primaire : centrale

— traces secondaires : périphériques

• modèle : l’analyse de la trace de sang par les critères établis soutient l’hypothèse selon laquelle le modèle

de la trace de sang est une trace passive consécutive à une chute de volume.

Figure 14.1 – Photographie de détail de la trace de sang testée – grossissement 1x

14.1.3 Détection de l’antigène A dans la trace de sang

Préparation & transport du matériel

Concernant la préparation des papiers filtres, ces derniers ont été immergés quatre fois dans la solution d’anti-

corps primaires anti-A. Entre chaque immersion, les papiers filtres ont séché dix minutes à température ambiante.

Après la dernière immersion, les papiers filtres ont séché une heure dans une étude réglée à 37°C. Comme les

papiers filtres doivent être stockés dans un environnement pauvre en humidité, des billes de silice (effet dessic-

cateur) ont été ajoutées dans un sachet minigrip. Ce sachet et les papiers filtres ont également été entreposés

dans un second sac minigrip fermé hermétiquement. Ce conditionnement a permis le stockage et le transport

des papiers filtres sur les lieux.

152

Chapitre 14. Application de la méthode sur deux cas réels

Les anticorps secondaires ont été dilués 1’000x dans une solution de TTBS. Les solutions d’anticorps secondaires

et d’immunodétection ECL-AP ont été conditionnées dans des tubes en plastique (tubes Falcon®) ; 10 mL de

chaque solution par tube. Les tubes contenant la solution d’immunodétection ECL-AP ont été enroulés d’une

feuille de papier d’aluminium afin de préserver la solution des rayons lumineux qui peut déclencher une réaction

chimique. Afin de conserver les produits à une température basse, des blocs de glaces congelés ont été amenés.

Aussi, un agitateur orbital a également été amené sur les lieux afin d’optimiser, comme en laboratoire, l’immer-

sion des papiers filtres dans les solutions chimiques. Tous les produits et le matériel (hors l’agitateur orbital)

ont pu être transportés dans un sac en plastique, type cabas. Ainsi, le matériel apporté pour cinq tests était :

• cinq papiers filtres immergés dans la solution d’anticorps anti-A ; transportés dans un sac en plastique

contenant des billes de silice ;

• cinq tubes Falcon® contenant chacun 10 mL de la solution d’anticorps secondaires diluée 1’000x dans une

solution TTBS ;

• cinq tubes Falcon® contenant chacun 10 mL de la solution TTBS ;

• cinq tubes Falcon® contenant chacun 10 mL de la solution d’immunodétection ECL-AP et enroulé dans

une feuille d’aluminium ;

• cinq bacs en plastique ;

• une pince type brucelle ;

• une micropipette de 20-100 µL et ses embouts ;

• un spray (Sprayer System Preval) contenant 50 mL d’eau désionisée ;

• un agitateur orbital avec aimant ;

• une bouteille en verre permettant de récupérer les solutions après leur utilisation (poubelle chimique) ;

• trois blocs de glaces de congélateurs ;

• deux pochettes en plastique afin d’y stocker les papiers filtres une fois l’immunodétection effectuée.

Application de la méthode

Le protocole a également été modifié sur les lieux afin de prendre en considération les contraintes temporelles

liées au travail d’investigation. De ce fait, le protocole a été effectué comme suit :

1. la trace de sang a été solubilisée à l’aide d’eau distillée appliquée à l’aide d’un spray 117 ;

2. le papier filtre a été apposé sur la trace de sang pendant dix secondes à force normale ;

3. après le transfert, le papier filtre a été séché une heure à température ambiante ;

4. le papier filtre a été immergé sous agitation pendant vingt minutes dans une solution d’anticorps secon-

daires ;

5. le papier filtre a été immergé sous agitation une minute dans une solution de TTBS ;

6. l’étape d’immunodétection ECL-AP a durée quatre minutes sous agitation.

14.1.4 Résultats

La photographie 14.2a présente le noircissement sur une partie du papier filtre à l’endroit où la trace de sang a

été transférée. Ce résultat indique vraisemblablement un résultat positif, soit la présence de l’antigène A dans

la trace de sang. Il est intéressant de noter que la forme du noircissement est semblable à la forme de la trace

de sang avant son transfert. Enfin, suite au transfert de la trace de sang sur le papier filtre (cf. photographie

117. Utilisation du spray pendant approximativement deux secondes.

153


14.2b), il a été constaté que toute la trace de sang ne s’est pas transférée sur le papier filtre, laissant dès lors la

possibilité de prélever la trace de sang après l’application du papier filtre.

D’après les résultats du prélèvement biologique, l’analyse de ce prélèvement biologique a permis d’établir un profil

génétique simple correspondant au profil génétique du prévenu. Cette correspondance soutient extrêmement

fortement l’hypothèse que le prévenu est à la source de cette trace de sang plutôt qu’un inconnu. En effet, il

est plus d’un milliard de fois plus probable d’observer ce résultat si le prévenu est à la source de cette trace

sanguine plutôt qu’un inconnu.

(a) Papier filtre obtenu après application sur la trace de sang– grossissement 1x

(b) Après le transfert de la trace de sang sur le papier filtre

Figure 14.2 – Photographie du papier filtre utilisé sur le cas réel, donnant une réponse positiveLa zone rouge entourée sur le papier filtre correspond à la zone de transfert de la trace de sang entourée en blanc.

Cependant, il n’a pas été possible d’obtenir les informations relatives aux groupes sanguins des deux personnes

concernées, à savoir de la victime décédée et de l’auteur présumé. Bien qu’une autopsie ait été effectuée sur le

corps de la victime, les prélèvements sérologiques ne sont pas analysés dans le but d’obtenir le groupe sanguin.

De même, le procureur en charge n’a pas souhaité demander une prise de sang sur la personne prévenue.

154


14.2 Deuxième cas

14.2.1 Informations relatives au cas

Il s’agit ici d’une double levée de corps. Seuls trois jours se sont écoulés entre la date de notre intervention et

celle de la découverte des deux personnes décédées et de l’intervention de la police cantonale.

Les inspectrices en charge de l’affaire avaient déjà réalisé entre 70 et 80 prélèvements biologiques lors de notre

arrivée sur les lieux. L’appel au service forensique de Neuchâtel a été fait afin d’aiguiller des prélèvements

biologiques supplémentaires et d’aider à sélectionner les prélèvements les plus pertinents pour les analyses

génétiques.

L’affaire étant un huis-clos, la question était de savoir quelles traces de sang provenaient de quel individu.

Une forte volonté de la police judiciaire du canton dans lequel nous sommes intervenus était de connaître la

source des traces de sang le plus rapidement possible, à savoir sur les lieux, sans forcément passer par les

analyses génétiques dont le coût est élevé. Aussi, différencier les deux sources des traces de sang leur permettait

d’aiguiller et de trier efficacement les prélèvements à envoyer en analyse génétique.

Le groupe sanguin des deux personnes n’était pas connu avant l’application du protocole. L’application du

protocole a eu pour but de différencier, sur des lieux d’investigation, des traces de sang de sources différentes.

14.2.2 Morpho-analyse des traces de sang

Lors de notre intervention, la première étape a été d’analyser la morphologie des traces de sang afin de leur

associer un pattern, un modèle de création. La méthodologie de la morpho-analyse préconise d’effectuer un

prélèvement biologique par modèle déterminé. En cas d’analyse de tous les prélèvements biologiques, il serait

alors possible d’associer chaque modèle déterminé à un profil génétique. En présence d’un grand nombre de

modèles, il est alors pertinent de réduire le nombre de prélèvements biologiques, ou du moins, de réduire le

nombre d’analyses génétiques.

En parallèle avec les informations obtenues par les inspectrices de l’affaire, certains modèles de traces de sang

ont été identifiés. La morpho-analyse des traces de sang permet concrètement de déterminer ces modèles et donc

d’aiguiller les prélèvements biologiques. Cependant, elle ne permet pas d’associer une source à chaque modèle,

et donc de les différencier. Avec d’autres informations complémentaires, telles que celles de la médecine légale,

il serait alors possible d’associer un modèle de trace de sang consécutif à une blessure ou à la position d’une

personne. Ces informations arrivent cependant très tard durant l’investigation.

La méthode de détection de l’antigène A a été appliquée sur trois traces de sang. L’analyse morphologique de

ces dernières est la suivante (Esperança, 2019b) :

1. trace 1 (cf. photographie 14.3a) :


• forme : circulaire

• taille : centimétrique

• distribution : linéaire

• modèle : l’analyse de la trace de sang par les critères établis soutient l’hypothèse selon laquelle le

modèle de la trace de sang est une trace passive consécutive à une chute d’une goutte de sang.

L’ensemble des traces passives du même modèle soutient également l’hypothèse d’un cheminement.

2. trace 2 (cf. photographie 14.3b) :


155


• forme : identifiable


• distribution : pas de distribution


modèle de la trace de sang est un transfert de sang ; transfert consécutif à l’apposition d’un pied nu

droit ensanglanté sur la surface.

3. trace 3 (cf. photographie 14.3c) :


• forme : circulaire


• distribution : linéaire


modèle de la trace de sang est une trace passive consécutive à une chute d’une goutte de sang.

L’ensemble des traces passives du même modèle soutient également l’hypothèse un cheminement.

(a) Trace de sang #1 (b) Trace de sang #2

(c) Trace de sang #3

Figure 14.3 – Photographie des traces de sang testéesGrossissements (a) et (c) : 1x ; (b) : 0.5x.

Les traces de sang #1 et #3 sont de couleur foncée, suggérant une plus grande quantité de sang par rapport à

la trace #2, qui est plus claire et semble diluée.

156


14.2.3 Détection de l’antigène sanguin dans les traces de sang

Préparation & transport du matériel

Par rapport à la première application sur des lieux, des contrôles ont été établis. Deux traces de sang servant

de contrôles ont été déposées et ont séché pendant vingt heures 118 :

1. le contrôle négatif : 20 µL de sang de groupe O (donneur #40, cf. tableau 8.3), conservés à -80°C, ont été

déposés sur un morceau de tissu blanc, 100% coton ;

2. le contrôle positif : 20 µL de sang de groupe A (donneur #41, cf. tableau 8.3), fraîchement prélevés ont

été ajoutés sur un autre tissu blanc.

Les deux traces de sang ont été transportées sur les lieux dans deux coupelles en aluminium séparées qui étaient

également dans un sac minigrip afin d’éviter tous risques de contamination.

Aussi, pour réduire le transport de matériel, aucune micropipette (et embouts) n’a été transportée sur les lieux.

Pour déposer l’eau distillée sur les traces de sang, dans le but de les solubiliser, des pipettes en plastique ont été

utilisées. Le spray n’a pas été considéré car lors de tests réalisés en laboratoire, le spray disponible ne répondait

pas aux attentes, à savoir diffuser de façon homogène l’eau, sans de grosses gouttes. Enfin, l’agitateur orbital,

jugé trop contraignant sur des lieux, n’a pas été apporté.

Ainsi, le matériel apporté pour quatre tests 119 était :

• quatre papiers filtres immergés dans la solution d’anticorps anti-A ; transportés dans un sac en plastique

contenant des billes de silice ;

• quatre tubes Falcon® contenant chacun 10 mL de la solution d’anticorps secondaires diluée 1’000x dans

une solution TTBS ;

• quatre tubes Falcon® contenant chacun 10 mL de la solution d’immunodétection ECL-AP et enroulé dans

une feuille d’aluminium ;

• un tube Falcon® contenant 10 mL d’eau stérile ;

• quatre bacs en plastique ;

• une pince type brucelle ;

• quatre pipettes en plastique ;

• une bouteille en verre permettant de récupérer les solutions après leur utilisation (poubelle chimique) ;

• deux blocs de glaces de congélateurs ;

• une pochette en plastique afin d’y stocker les papiers filtres après l’application du protocole.

Le format du kit a été considérablement amélioré par rapport à la première application sur des lieux. Le matériel

nécessaire a été conditionné dans différent sachets en plastique, permettant de mieux le transporter (cf. annexe

N). Conditionné de telle sorte, tout le matériel a pu être transporté dans un sac à dos.

Application de la méthode

Avant d’appliquer le protocole sur des traces, les investigateurs sur les lieux avaient procédé à un bon nombre de

prélèvements biologiques. Aussi, à la vue des circonstances du cas, aucun test indicatif au sang n’a été effectué

sur les traces ; le postulat suggérant qu’il s’agissait bien de sang humain.

Du fait de la quantité de sang observée sur les trois traces de sang, le volume d’eau apposé n’a pas été le même.

Pour les traces #1 et #3, deux gouttes d’eau ont été déposées (volume estimé, 60 µL) 120, alors que sur la trace

#2, seule une goutte d’eau a été utilisée pour ne pas diluer trop fortement le sang.

118. Ces vingt heures correspondent au délai entre l’heure de dépôt des traces de sang et leur utilisation sur les lieux.119. Un test pour les deux contrôles et trois tests différents pour les trois traces de sang120. Pour rappel, le volume utilisé en laboratoire était de 40 µL d’eau pour une trace de sang de 20 µL.

157


Les résultats relatifs aux contrôles (cf. figure 14.4a) montrent des résultats attendus, même si la coloration du

contrôle positif est relativement faible par rapport à d’autres traces de sang de groupe A âgées d’un jour. Ce-

pendant, suite à l’adaptation de la méthode sur les lieux, aucun agitateur orbital ou autre appareil permettant

d’agiter des solutions n’a été apporté. Les différentes immersions dans les solutions d’anticorps secondaires et

d’immunodétection ECL-AP n’ont de ce fait pas été agitées. L’absence d’agitation pourrait réduire les interac-

tions entre les anticorps et les antigènes, pouvant alors expliquer la diminution du signal observé sur le contrôle

positif. En regard de cette observation, la procédure a de ce fait été modifiée lors de l’application de la méthode

sur les traces de sang : les bacs en plastique contenant les papiers filtres immergés dans les solutions chimiques

ont été agités manuellement, de temps en temps, afin de favoriser les interactions chimiques.

(a) Contrôles (b) Trace de sang #1

(c) Trace de sang #2 (d) Trace de sang #3

Figure 14.4 – Photographie des papiers filtres utilisés sur les traces de sang – grossissement 0,8xLes cercles rouges montrent la zone de transfert de la trace de sang.

14.2.4 Résultats

Sur les trois papiers filtres des trois traces de sang (cf. figure 14.4b,c,d) transférées, une coloration noire a été

observée. Cette coloration correspond à une réaction positive à la détection de l’antigène A. Sur la trace de

sang #2, la réaction est très légère par rapport aux deux autres traces de sang testées. La coloration est tout

de même associée à une réponse positive du fait que la trace de sang était moins concentrée en sang (la trace

de sang étant à la base diluée) ; élément qui permet d’expliquer la faible coloration.

158


Les deux personnes décédées sont de groupe A+ 121. La mise en commun de ces informations permet de conclure

que les résultats obtenus sont de vrais positifs, indiquant la présence de l’antigène A dans les traces de sang.

Cette application a été une véritable opportunité de tester le protocole sur un cas réel avec des traces de sang

dont l’origine et leur environnement n’ont pas été contrôlés, ce qui diffère des traces de sang créées en laboratoire.

14.3 Discussion

L’application du protocole de détection de l’antigène A dans des traces de sang sur des lieux a été une réelle

opportunité pour éprouver la dimension opérationnelle de la méthode.

Pour le premier cas, le résultat du test est jugé positif du fait de la coloration noire. Cependant, aucune

information sur le groupe sanguin des deux personnes n’a été donnée. Si elles sont de groupe A ou AB, alors il

s’agirait d’un résultat positif. Au contraire, si elles sont de groupe B ou O, alors il s’agirait d’un résultat faux

positif.

Pour le deuxième cas, la coloration noire du papier filtre observée concorde avec l’hypothèse selon laquelle les

traces de sang testées possèdent l’antigène A. La mise en relation de cette information avec l’obtention des

groupes sanguins des différentes personnes, et avec les résultats des analyses génétiques, permet de conclure que

les résultats obtenus sont de vrais positifs 122.

L’application de ce test sur les lieux a permis de conclure à plusieurs constats :

1. la méthode établie est transportable sur des lieux ;

2. la détection de l’antigène A dans des traces de sang est possible en trente minutes, sur des lieux ;

3. le protocole établi peut être modifié sur les lieux en :

• ajustant le volume d’eau pour solubiliser le sang en fonction de la quantité de sang de la trace ;

• agitant manuellement les blocs plastiques pour favoriser les interactions chimiques ;

4. la morpho-analyse des traces de sang permet de cibler les prélèvements biologiques de traces de sang au

sein de chaque modèle établi. Cette information est réellement une plus-value pertinente pour choisir les

traces de sang à tester avec la méthode établie pour détecter l’antigène A. Ces deux techniques sont de

ce fait extrêmement complémentaires.

En appliquant la méthode sur les deux lieux, il a été constaté qu’obtenir les groupes sanguins des personnes

concernées sur les lieux, lors de l’application du test, serait une réelle plus-value afin de faciliter leurs interpré-

tations et pour décider quelle trace de sang peut être envoyée en analyse génétique. Cette information permet

également de savoir si l’application du protocole est pertinente ou non 123. Il peut dès lors être pertinent de

chercher cette information sur les lieux ; par exemple en cherchant dans des documents de santé, en deman-

dant à des proches, au médecin de famille. Parfois, cette information peut également être renseignée dans une

application santé d’un téléphone portable.

121. Les groupes sanguins ont été obtenus auprès du médecin traitant des deux personnes décédées, information transmise par leservice d’identification judiciaire du canton.122. Comme sur toutes les traces testées une coloration noire a été aperçue, alors aucun résultat négatif (« vrai négatif ») n’a puêtre constaté sur des lieux.123. En effet, pour le 2e cas, si l’information du groupe sanguin des deux personnes avait été connue avant l’application de laméthode, alors il aurait été su que les résultats n’auraient pas donné d’information discriminante sur les groupes sanguins.

159

Conclusion de la partie VI

Cette partie a permis de mettre à l’épreuve la méthode développée avec des traces de sang de plusieurs sources.

Les traces de sang étaient de groupe A, AB, B et O et ont été déposées sur une période d’un mois, sur cinq

supports, à savoir du bois, du papier filtre, du plastique, du tissu et du verre. L’antigène A a été détecté dans

des traces de sang âgées d’un mois, déposées sur quatre des cinq supports, exception faite du papier filtre. Il a

été remarqué que le sang ne se solubilisait pas sur ce support, inhibant alors son transfert et engendrant une

absence de coloration. En ne considérant pas ce support, cette méthode offre un taux de spécificité de 95,00%

et un taux de sensibilité de 97,50%. Ces taux sont largement acceptables dans la vision d’une utilisation de ce

protocole sur des lieux afin de différencier les sources de traces de sang.

Une étude supplémentaire a permis de détecter l’antigène A dans des traces de sang de groupe A âgées de plus

d’un mois. Bien que les intensités observées soient moins prononcées, une coloration est tout de même visible

pour des traces de sang âgées de 371 jours. Il semblerait tout de même qu’il faille augmenter le volume d’eau

pour favoriser la solubilisation des traces de sang avant leur transfert.

Afin de soustraire le biais lié à l’utilisation du logiciel ImageJ pour quantifier l’intensité d’un résultat, des pho-

tographies de papiers filtres ont été transmises à différentes personnes afin qu’elles les analysent sans connaître

la source des traces de sang. Les six personnes ont correctement indiqué les résultats dans 87,50% des cas. Ce

taux élevé tend à montrer que l’interprétation des papiers filtres est relativement aisée. L’un des principaux

retours des participant-e-s a été la difficulté de dissocier le bruit de fond de la zone où les traces de sang ont été

transférées, indiquant donc l’importance de connaître la zone où la trace de sang a été transférée.

Pour évaluer l’expérience et l’habitude de travailler avec ce type de papier filtre, il a été demandé à une tierce

personne de déposer des traces de sang afin que les résultats soient interprétés en situation à l’aveugle. Les

résultats visuels ont été correctement interprétés dans 83% des cas lorsque le support engendrant systématique-

ment de faux négatifs a été enlevé (le support étant du tissu). Les faux négatifs rencontrés sur le papier filtre,

support des traces de sang, s’expliquent du fait que la surface poreuse du papier ne permettait pas le transfert

de la trace de sang sur le papier filtre imbibé d’anticorps primaires. Pour favoriser le transfert, il serait possible

d’augmenter le volume d’eau utilisé pour solubiliser la trace de sang, d’augmenter le temps de solubilisation ou

de transfert, voire même de changer de solution de solubilisation.

Ces expériences montrent une certaine limite de la méthode proposée quant au support sur lequel se situe une

trace de sang. Pour les supports poreux (papier filtre, tissu en viscose), la solubilisation des traces de sang n’est

pas optimale ; le transfert de la trace sur le papier filtre imbibé d’anticorps est donc fortement réduit. Outre le

fait de montrer que l’étape du transfert de la trace de sang semble être l’étape la plus influente de la méthode,

ces résultats amènent une réflexion sur la solubilisation des traces de sang sur des supports difficiles, qui peuvent

se retrouver sur des lieux. Des perspectives de recherches peuvent être entreprises pour trouver pas exemple une

autre solution de solubilisation.

La méthode a pu être testée deux fois sur des cas réels. Ces opportunités ont montré que la méthode est

transportable sur des lieux et que la durée d’application de trente minutes est réaliste. Sur les quatre traces

de sang testées, une coloration noire a été observée, indiquant vraisemblablement la présence de l’antigène A

161


(trois traces de sang confirmées sur les quatre). Après réception des informations relatives aux groupes sanguins

des personnes, et des profils génétiques des traces de sang, il a pu être déterminé que les résultats observés

sont de vrais positifs. Lors de l’application de la technique, il a été remarqué qu’obtenir le plus tôt possible le

groupe sanguin des personnes susceptibles d’être à la source des traces de sang est une réelle plus-value car cette

information permet d’une part de confirmer le résultat du test (positif ou négatif), et d’autre part, de mieux

établir la liste de priorité des prélèvements biologiques à envoyer en analyse génétique.

162

Septième partie

Discussion générale

et Conclusion

163

Décider ... à quelle étape ?

« Le but de la discussion ne doit pas être la victoire, mais l’amélioration. »

Joseph Joubert

SommaireDécider ... à quelle étape ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

Développement de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

Choix du nombre d’antigènes sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

Création du papier filtre comme médium d’anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

Protocole d’immunodétection des antigènes A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

Application de la méthode sur des lieux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Conditionnement du matériel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Informations aidant à la prise de décision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Adaptation du protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172

Volume minimal des traces de sang ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173

Contrôles de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

Expansion de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

Combinaison de la méthode avec des analyses génétiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177

Prélèvement des traces de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177

Risques de contamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177

Impact de la méthode sur l’ADN et stratégie de prélèvement des traces de sang . . . . . . . 177

Quid des appareils d’analyse ADN rapide ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

Coût d’une analyse et sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179

Résumé des points forts et des limites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

Points forts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

Limites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

Synthèse des perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

Décider ... à quelle étape ?

L’exploitation d’une scène d’investigation comportant des traces de sang n’est jamais une démarche simple. En

ne considérant que les traces de sang, l’approche sur des lieux implique plusieurs étapes. En prenant le cas

simple, où les traces de sang sont visibles à l’œil nu et que les mélanges de sang sont écartés, les étapes suivantes

doivent être considérées.

La documentation des traces de sang doit être effectuée. Cette étape se réalise par une prise de notes, pouvant

comprendre la réalisation de croquis, la plus exhaustive possible et par un enregistrement photographique des

traces. Lorsque plusieurs motifs de traces de sang sont visibles, ces derniers sont initialement enregistrés et

codifiés par zone, par exemple en numérotant les motifs avec des cavaliers. Les différents motifs de traces de

sang sont identifiés par les spécialistes en morpho-analyse. Ensuite, des photographies de détails sont effectuées

pour les traces de sang à l’intérieur du motif. Dans l’optique où ces spécialistes sont appelés sur une scène

d’investigation sanglante, une première décision est prise quant à l’identification des motifs et quant à leur

numérotation. Là, la formation est privilégiée et nécessaire pour reconnaître et identifier un motif de traces de

sang. Cependant, l’appel aux spécialistes de traces de sang n’est pas systématique et relève le plus souvent de

l’accord du procureur.

165

Partie VII : Discussion générale et conclusion

Lorsqu’une morpho-analyse est réalisée, il est possible d’identifier l’évènement à l’origine de la formation des

traces de sang. En se basant sur l’hypothèse que les motifs de traces de sang sont formés par des évènements

différents, cet examen peut révéler la possibilité de traces de sang provenant de différentes personnes. Par

exemple, si une accumulation de sang et que des traces de sang provenant d’un goutte-à-goutte sont observées,

alors deux hypothèses d’écoulements sanguins, correspondant à des actions distinctes, peuvent être supposées ;

ce qui peut suggérer la possibilité de sources différentes. Néanmoins, cette hypothèse est à évaluer en fonction

de la localisation des motifs de traces de sang et plusieurs modèles peuvent être issus d’une source commune.

Lors de discussions avec Philippe Espérança 124, l’une des possibilités, qui est d’ailleurs intégrée au protocole

de la gendarmerie française lorsqu’une morpho-analyse est mandatée, est d’effectuer un prélèvement biologique

à l’intérieur de chaque motif de sang identifié. Par la suite, une priorité est affectée à chaque prélèvement pour

les analyses génétiques. Aussi, le prélèvement biologique est effectué sur une seule trace de sang, comprise dans

le motif identifié. Il est important de concentrer le prélèvement sur une seule trace pour éviter la contamination

de plusieurs traces de sang sur un seul écouvillon, et donc d’éviter un mélange de sources.

De plus, il est important de signaler que la morpho-analyse est fondée sur une hypothèse primordiale, à savoir

que l’étude des traces se base sur du sang humain. Il est ensuite nécessaire de confirmer cette hypothèse en

effectuant un test indicatif au sang sur les traces analysées. Les prélèvements biologiques effectués ne sont donc

envoyés qu’en cas de confirmation de cette hypothèse. Il est donc nécessaire de confirmer la nature des traces.

Parmi les traces de sang visibles, de quelle trace faut-il confirmer la nature ? Une décision doit donc être prise.

Les principaux tests indicatifs utilisés par les investigateurs ne permettent que de tester les traces de sang

individuellement, ou très localement. De ce fait, il n’est pas possible de toutes les tester. Théoriquement, si une

trace supposée sanglante est testée et que la nature du fluide est confirmée à l’aide d’un test indicatif comme

étant du sang, alors un prélèvement biologique devrait être effectué sur la trace de sang. En choisissant cette

trace de sang particulière à tester pour confirmer la nature du fluide, l’investigateur lui a attribué une priorité,

peut-être inconsciemment, et une pertinence plus haute que pour d’autres traces de sang.

Si plusieurs traces de sang sont testées, une seconde décision doit être entreprise : quelle trace de sang, parmi

celles qui ont été confirmées, doit être prélevée ? C’est là qu’intervient l’application de la méthode. En différen-

ciant des traces de sang à partir de leur source, alors le choix du prélèvement est simplifié.

La méthode de discrimination de traces de sang sur la base de la présence ou non de l’antigène A a pour but

de pouvoir définir le nombre minimum de sources composant l’ensemble des traces de sang présentes sur une

scène d’investigation. Du fait que la méthode développée ne possède pas un pouvoir discriminatoire de 100%

et que des faux positifs et faux négatifs peuvent exister, la décision finale n’est toujours pas aisée. Deux traces

de sang de sources différentes peuvent engendrer un résultat identique. Quel est le risque que l’investigateur

considère le résultat comme absolument correct et ne prélève qu’une trace de sang sur les deux, ou n’envoie qu’un

prélèvement sur les deux ? Même si la méthode développée peut constituer une information utile, la décision

de quelles traces prélever demeure complexe et doit être conditionnée par la prise en compte de facteurs autres

que le seul résultat d’un test indicatif. Ainsi, la question de savoir s’il faut prélever deux traces ayant donné une

même réponse au test de l’antigène A demeure pertinente.

C’est pour cela que les résultats obtenus par la méthode ne doivent pas être considérés comme une vérité absolue.

Les taux de faux positifs, de faux négatifs et le pouvoir discriminatoire de la méthode doivent être communiqués.

Cette méthode ne doit pas remplacer toutes les bases sur lesquelles se fondent les investigateurs pour décider

de leurs prélèvements. Elle doit être considérée comme un outil complémentaire. Pour rappel, le taux de faux

positif de la méthode testée sur des traces âgées jusqu’à quatre semaine, déposées sur cinq supports différents,

est de 4,00%. Le taux de faux négatif est relativement élevé en tenant en compte tous les supports, à savoir

20%. Cependant, certains supports ont donné systématiquement des faux négatifs, tels que les supports trop

poreux comme le papier filtre. En ne prenant pas compte de ce support, le taux de faux négatif chute à 2,50%.

124. Expert criminalistique en morpho-analyste agréé par la Cour de Cassation française.

166

Développement de la méthode

Toutefois, la détection d’un nombre de sources de traces de sang sur des lieux est déjà une information pertinente

qui apporte une plus-value considérable aux investigateurs. Cette technique apporte une information quant au

nombre minimum de sources de traces de sang présentes sur des lieux. Sans décider quels prélèvements sont à

effectuer, l’information transmise par les résultats de la méthode permet d’orienter l’enquête et les hypothèses.

Dans les cas plus complexes, où les traces de sang sont latentes, il faut considérer les étapes supplémentaires

liées à leur détection qui se fait typiquement en pulvérisant une solution chimique (par exemple le luminol).

Il conviendrait alors de vérifier la compatibilité de la technique de détection employée avec la méthode décrite

dans cette thèse, pour vérifier si des incompatibilités existent. Par ailleurs, la pulvérisation de luminol dilue

fortement les traces de sang latentes ; la limite de détection de la méthode doit donc être réévaluée.


Dans le but d’apporter un soutien scientifique aux investigateurs, une méthode permettant de différencier les

sources des traces de sang sur des lieux a été développée. Afin de répondre aux contraintes spatio-temporelles

liées à l’investigation d’une scène d’investigation, le protocole établi doit pouvoir être appliqué sur des lieux,

rapidement, sans encombrement, et être peu onéreux.

En présence d’une scène d’investigation sanglante, des lieux peuvent être séquestrés par mandat d’un procureur.

Les investigateurs ont dès lors le temps d’effectuer toute l’investigation de la scène d’investigation. La méthode

proposée peut être effectuée lors de la première investigation ou ultérieurement. Il n’est pas rare que des prélève-

ments de traces soient effectués après coup, lorsque des lieux ont été scellés. Il est également possible d’effectuer

des prélèvements de traces de sang lorsque des spécialistes en morpho-analyse sont mandatés par un procureur.

En effet, dans le processus d’investigation de scène d’investigation sanglante, les experts en morpho-analyse sont

les derniers intervenants. Comme tous les motifs, voire traces de sang, sont enregistrés et notés, les analyses

sont longues et peuvent prendre plusieurs jours. De ce fait, du temps pour appliquer le protocole est disponible.

Il existe cependant des cas où il n’est pas possible de conserver des lieux pendant plusieurs jours. Par exemple,

lorsque les traces de sang sont trouvées dans un lieu en extérieur. Bien qu’un dispositif puisse être monté pour

conserver des lieux (mise en place d’une tente par exemple), la durée de l’investigation et de conservation des

lieux se retrouve très fortement réduite. Les méthodes applicables sur des lieux doivent répondre à de telles

contraintes. La durée de l’analyse est un facteur important à considérer. La méthode développée dans cette

recherche dure trente minutes, ce qui semble approprié pour de telles circonstances.

Choix du nombre d’antigènes sanguins

La méthode se base sur la détection des antigènes sanguins de type A, du groupe ABO, dans les traces de sang.

Cette méthode a un pouvoir discriminatoire de 50% dans la population caucasienne, ce qui permet de différencier

deux traces de sang différentes dans 50% des cas. D’autres antigènes sanguins possèdent un haut pouvoir

discriminatoire, comme par exemple l’antigène S (groupe MNS). Dans l’optique de développer le protocole, et

sans littérature existante, l’attention s’est portée dans un premier temps sur la détection d’un seul antigène

sanguin. Par la suite, il serait très intéressant d’optimiser la méthode en analysant plusieurs antigènes.

En combinant plusieurs antigènes sanguins, le pouvoir discriminatoire de la méthode augmente. Pour rappel,

pour discriminer deux personnes différentes avec la méthode proposée dans la population caucasienne, dix

antigènes sanguins doivent être analysés : A, S, FY1, C, E, LE2, N, JK1, JK2 et LE1. Cependant, le but

de la méthode n’est pas d’atteindre un tel niveau de discrimination, mais d’informer la décision relative à la

sélection des traces de sang sur des lieux. Les difficultés techniques doivent également être prises en compte pour

obtenir un protocole facile d’application et rapide, sur des lieux. De plus, les analyses génétiques permettent

167


déjà d’obtenir des degrés de discrimination beaucoup plus importants. Des informations pertinentes peuvent

déjà être obtenues avec cette méthode en analysant un seul antigène.

Combiner des antigènes sanguins demande d’une part de s’assurer de la détection des antigènes sanguins supplé-

mentaires dans des traces de sang, et d’autre part, de trouver une méthode pouvant les analyser successivement,

ou simultanément. Un protocole similaire à celui proposé avec le dot blot peut facilement être repris et adapté à

un autre antigène sanguin. Comme ces antigènes sanguins sont classés en systèmes, ils sont très bien connus et

étudiés dans le domaine de la médecine transfusionnelle. Il existe dès lors un grand choix d’anticorps pour les

détecter. Par ailleurs, s’il est possible d’acheter des anticorps primaires de type IgM, d’espèce de souris, alors les

mêmes anticorps secondaires que ceux utilisés dans cette recherche peuvent être utilisés. La première étape de

vérification dans des conditions optimales de l’accessibilité et de la détection des antigènes sanguins concernés

semble être aisément réalisable. La base du protocole a été développée lors du chapitre 9, qui peut être reprise

quasiment à l’identique ; la seule modification serait de modifier les anticorps primaires.

La difficulté majeure entrevue concerne l’application de plusieurs anticorps simultanément. Là, au moins deux

procédés pourraient être entrepris, à savoir d’une part l’étude successive des antigènes présents dans les traces

de sang par l’application de plusieurs papiers filtres, chacun étant imbibé d’anticorps primaires spécifiques ; et

d’autre part, la combinaison de plusieurs anticorps primaires sur un seul papier filtre permettant la détection

des différents antigènes sanguins simultanément.

La première approche semble plus facilement réalisable et interprétable. En effet, cela permettrait d’appliquer

plusieurs papiers filtres successivement sur les traces de sang solubilisées. Après l’application du papier filtre

source sur le sang solubilisé, tout le sang ne se transfère pas, laissant de la matière sur le support étudié (pour

des traces de sang constituées de 20 µL). Pour favoriser le transfert de la trace de sang, il semble nécessaire de

solubiliser le sang pour chaque transfert successif. Le nombre de transfert possible est limité par la taille de la

trace de sang et par la quantité de sang sur la trace, à savoir si le sang est plus ou moins dilué. En appliquant

deux papiers filtres sur la même trace de sang, le pouvoir discriminatoire augmenterait dans une population

caucasienne à 0,75 en étudiant les antigènes A et S (système MNS) 125.

La seconde approche, bien plus complexe, serait de mélanger les différents anticorps primaires sur un seul

papier filtre, pour conserver une seule application sur les traces de sang. La difficulté perçue ici concerne la

différenciation des réponses colorimétriques obtenues sur le papier filtre après les étapes d’immunodétection.

En considérant la possibilité que les mêmes anticorps secondaires soient utilisés, comment associer une réponse

colorimétrique à la présence d’un antigène sanguin, ou d’une combinaison d’antigènes sanguins ? Cela semble

peu réaliste si les mêmes anticorps secondaires sont utilisés, surtout lorsque la réaction chimique, due à l’activité

enzymatique, engendre la même coloration. Il serait donc nécessaire d’associer plusieurs anticorps secondaires,

entraînant plusieurs colorations, ce qui est théoriquement possible grâce aux anticorps conjugués à des sondes

fluorescentes, qui peuvent émettre différentes longueurs d’ondes. Reste à savoir si la combinaison d’anticorps

secondaires peut être effectuée dans un seul bain ou si plusieurs immersions sont nécessaires. Aussi, si des

sondes fluorescentes sont utilisées, des sources de lumières et des filtres doivent être amenés sur des lieux. En

utilisant, comme dans cette recherche, des anticorps conjugués à une activité enzymatique, la coloration est

directement visible. Par ailleurs, utiliser plusieurs anticorps secondaires oblige également à varier les espèces

animales à l’origine des anticorps primaires et secondaires. Or, augmenter le nombre d’espèces animales risque

d’accroître les phénomènes de réaction croisée (cross reaction), où des anticorps secondaires peuvent réagir avec

des anticorps primaires d’une espèce proche à celle escomptée. Cette visée de recherche présente donc plusieurs

limitations, qui rend leur développement opérationnel peu probable.

125. En considérant que les antigènes S du système MNS soient détectables dans les traces de sang dans les mêmes conditions quepour les antigènes A.

168


Création du papier filtre comme médium d’anticorps

Lors de la création du papier filtre source, une seule immersion du papier filtre dans la solution d’anticorps

primaires anti-A est suffisante. L’immersion est rapide, il est juste nécessaire que le papier filtre soit entièrement

immergé quelques secondes ; un temps maximum d’immersion de cinq secondes est estimé. Le papier filtre est

ensuite déposé sur une surface en verre (typiquement dans un plat en Pyrex®) pour éviter le transfert et la

diffusion de la solution d’anticorps sur une autre surface 126. Le papier filtre imbibé, est alors séché pendant

une heure à 37°C puis est conservé dans un environnement sec. Ces conditions ont été reprises de protocoles à

l’origine du développement des tests immunochromatographiques, avec l’emploi de membranes en nitrocellulose.

Ces conditions de préparation sont rapides et demandent très peu d’étapes. Le papier filtre peut être conservé

pendant huit jours au moins dans l’environnement sec, typiquement dans un dessiccateur ; laissant donc la

possibilité de stocker plusieurs papiers filtres sur une semaine sans une perte significative de l’efficacité. Lors du

développement de la méthode, les papiers filtres, d’ordinaires circulaires, ont été découpés en quarts afin de se

rapprocher de la taille des supports étudiés. Il est toutefois possible d’augmenter la taille du médium du papier

filtre ; plusieurs formats de papiers filtres existant.

Augmenter la taille du papier filtre est très facilement réalisable. Si la taille du papier filtre est augmentée, il

est alors nécessaire de vérifier que les antigènes primaires se déposent de manière homogène sur le médium. Des

mesures ciblées sur plusieurs endroits du papier filtre par HPCL permettraient par exemple de comparer les

concentrations en anticorps primaires et de vérifier l’homogénéité des concentrations. Immerger plusieurs fois le

papier filtre ou ou augmenter la durée de l’immersion dans la solution d’anticorps primaire pourrait permettre

d’assurer une répartition homogène des anticorps.

Augmenter la taille du papier filtre permettrait d’analyser plus rapidement et concomitamment plusieurs traces

de sang en une seule manipulation. Il a déjà été montré qu’il est possible d’analyser plusieurs traces provenant de

plusieurs sources (quatre dans l’expérience décrite à la page 126). Les réponses relatives à la présence d’antigène

A dans le sang se visualisent sur le papier filtre à l’endroit où les traces de sang ont été transférées. Analyser

plusieurs traces de sang en même temps est donc envisageable avec cette technique.

Le matériel à disposition est toutefois un facteur limitant dans l’expansion de la méthode sur du papier filtre

de plus grande taille. La taille des bacs les contenant, de l’étuve nécessaire pour sécher les papiers filtres et du

dessiccateur sont de facteurs limitants.

Pour optimiser le transfert des traces de sang sur le papier filtre, il est nécessaire d’augmenter les zones de contact

et de pression. En augmentant la taille du papier filtre, les zones de contact doivent donc être augmentées pour

homogénéiser le transfert sur l’ensemble du papier filtre. Autre que les mains, pour effectuer la pression, des

poids pourraient être utilisés si la surface du papier filtre est trop grande.

Protocole d’immunodétection des antigènes A

Les anticorps adsorbés sur le papier filtre sont des anticorps primaires anti-A. Le papier filtre est apposé sur

les traces de sang solubilisées préalablement avec de l’eau, pour les transférer. Le transfert est rapide, car une

pression de dix secondes suffit. Suite au transfert de liquide (traces de sang solubilisées), le papier filtre est séché

à l’air libre pendant quinze minutes. Afin de détecter les anticorps primaires, ces derniers sont ciblés par des

anticorps secondaires anti-anticorps primaires. Des complexes composés de l’antigène A, d’anticorps primaires

et d’anticorps secondaires se forment. Cette étape s’effectue par immersion du papier filtre dans la solution

d’anticorps secondaires pendant huit minutes. Enfin, les complexes sont révélés lors de l’immersion du papier

filtre dans la solution de révélation ECL-AP, pendant trois-quatre minutes. La présence d’antigène A se visualise

par une coloration noire du papier filtre à l’endroit où la trace de sang a été transférée.

126. Tout support empêchant la diffusion des anticorps primaires peut être utilisé, tel qu’un bac en plastique ou une feuilled’aluminium.

169


L’exécution du protocole ne dure que trente minutes. L’étape la plus longue est celle du séchage du papier filtre

une fois que les traces de sang solubilisées ont été transférées ; quinze minutes à l’air libre. Ce temps est jugé

raisonnable pour une application sur des lieux.

La première étape de solubilisation des traces de sang peut s’effectuer soit localement, par dépôt de gouttes

d’eau stérile, soit par zone, à l’aide d’un spray. L’ajout d’eau stérile est un procédé qui s’effectue déjà pour

les analyses génétiques et qui ne pose pas de problème. En effet, pour effectuer un prélèvement à l’aide d’un

écouvillon de trace biologique, ou de contact, il est nécessaire de l’humidifier dans quasiment tous les cas 127

avant de récolter le fluide. Lors de l’utilisation d’écouvillons, de petites fioles plastiques contenant l’eau stérile

sont jointes au kit de prélèvement.

La seconde étape consiste au transfert du sang solubilisé sur le papier filtre. Les résultats du plan d’expérience

avaient montré que la force appliquée sur le papier filtre jouait un rôle significatif. Une pression considérée

comme normale 128 pendant dix secondes doit être appliquée pour transférer suffisamment de sang. L’étape du

transfert de la trace de sang est primordiale, car sans transfert de la trace solubilisée, aucune coloration du

papier filtre n’est possible. Une absence de coloration, signe d’un résultat négatif, est considéré comme tel si

et seulement si le transfert du sang a eu lieu. Si du sang contenant les antigènes sanguins A ne se transfère

pas, alors aucune coloration ne sera visible, un résultat négatif sera évalué. Or, ce résultat résulte d’un faux

négatif. Le protocole mis en place ne contient pas de contrôles positif et négatif permettant d’assurer le bon

fonctionnement du test.

L’étape de séchage du papier filtre est nécessaire car l’absence de séchage entraîne une variation significative et

négative, sur les résultats obtenus. L’immersion directe du papier filtre dans la solution d’anticorps secondaire

sans attendre que le papier filtre sèche, solubilise le sang transféré. Pour un protocole rapide, un temps d’attente

de quinze minutes est suffisant. Cependant, suivant les contraintes temporelles de l’investigateur, ce temps peut

être augmenté. Lors du plan d’expérience, un temps de trente minutes avait été testé, avec des résultats positifs.

Lorsque le test avait été appliqué sur le premier cas réel (chapitre 14.1), un temps d’attente d’une heure avait été

fixé, et un résultat positif a été observé. Il serait également intéressant d’évaluer si le temps d’attente de séchage

peut s’étendre sur plusieurs heures, d’une part pour permettre aux investigateurs de continuer en parallèle

l’investigation des lieux et d’autre part, pour donner la possibilité de continuer le protocole en laboratoire.

Lorsque des résidus de tirs sont prélevés à l’aide d’un papier filtre, bien souvent le prélèvement s’effectue sur

des lieux, puis l’analyse à l’aide des solutions chimiques se fait en laboratoire.

Un tel protocole pourrait être envisagé au cas par cas. Même si le but premier est de développer une méthode

rapide, applicable sur des lieux, il peut être envisagé d’effectuer le transfert des traces de sang sur le papier

filtre, puis de le conserver et de l’analyser plus tard en laboratoire. Dans ce cas, le processus de décision

change. Il ne s’agit plus de différencier des traces de sang de sources différentes sur des lieux pour aiguiller des

prélèvements biologiques, mais d’aiguiller la pertinence des prélèvements biologiques en laboratoire. En effet,

cela suppose qu’après l’application du test, les traces de sang testées soient toutes prélevées et conservées. En

fonction des résultats du test de la détection des antigènes en laboratoire, la liste de priorité des prélèvements

serait ainsi évaluée. Lors de notre seconde intervention, la demande des inspecteurs de police allait dans ce sens.

En effet, parmi tous les prélèvements effectués par leur soin (plus de 70), les enquêteurs voulaient une méthode

permettant de différencier au plus tôt, et avant les analyses génétiques, les deux sources des traces de sang 129.

Cette volonté était principalement due au coût des analyses génétiques. Obtenir une information quant à la

source des prélèvements biologiques effectués aurait permis d’obtenir une information pertinente, de prioriser

l’envoi des prélèvements, et donc de réduire les coûts des analyses génétiques.

127. Exception faite lors des prélèvements biologiques sur des tissus, où il n’est pas recommandé d’humidifier la trace avant.128. Pression normale estimée = 11,9 ± 1,5 N.129. Pour rappel, dans cette affaire, la police concluait à un huis-clos, permettant d’exclure raisonnablement l’intervention d’unetierce personne. Dans ce cas, seul le sang des deux personnes concernées est présent sur la scène d’investigation.

170

Application de la méthode sur des lieux

Enfin, viennent les deux immersions successives du papier filtre dans les bains d’anticorps secondaires et d’im-

munodétection ECL-AP. Le temps d’immersion dans le bain d’anticorps secondaire a été fixé à huit minutes

et donne de bons résultats. Le temps d’immersion dans la solution d’immunodétection ECL-AP a également

été fixé à huit minutes pour obtenir des résultats optimaux et comparables. Cependant, visuellement, la colo-

ration noire, signe d’un résultat positif, s’observe dès trois-quatre minutes. Il est donc possible de réduire les

huit minutes théoriques à l’instant choisi dès qu’une coloration est visible. Aussi, dans le but de conserver les

papiers filtres, ces derniers ont été lavés par une immersion de deux minutes dans de l’eau. Cette étape n’est

pas obligatoire et n’apporte aucune plus-value pour une utilisation sur des lieux ; elle peut être omise dès que

les résultats sont visibles.

D’autres recherches peuvent être entreprises afin d’optimiser le facteur de dilution, la concentration de la so-

lution d’anticorps secondaires pour réduire les temps d’immersions. Aussi, comme cela a été remarqué lors de

l’application de la méthode sur des lieux, l’agitation de la solution d’immersion semble favoriser les réactions

chimiques, ce qui influence la coloration. En optimisant les concentrations, les durées d’immersions et l’agitation,

le protocole pourrait être amélioré pour réduire la durée totale de la méthode.


Conditionnement du matériel

Lors de l’application de la méthode sur les deux cas réels, la préparation et le conditionnement du matériel ont

été améliorés. La préparation du matériel en laboratoire prend environ une heure trente minutes.

Par ailleurs, pour simplifier l’utilisation de l’eau avec les pipettes pour solubiliser les traces de sang, il serait

possible d’utiliser des fioles d’eau stérile en plastique similaires à celles fournies dans les kits de prélèvements

biologiques. L’apport de blocs de glace congelés permet de conserver efficacement les produits au frais, cela

pendant plusieurs heures. Aussi, il est primordial d’entourer les tubes contenant la solution d’immunodétection

ECL-AP d’une feuille d’aluminium afin d’éviter toute réaction déclenchée par la lumière.

Lors de la première intervention, un agitateur orbital avait été apporté sur des lieux et le conditionnement du

matériel n’était pas optimal, car la méthode était en cours de développement. Lors de la seconde intervention,

tout le protocole avait été mis en place, aucun agitateur orbital n’a été transporté et le matériel a été organisé

dans différents sacs en plastique. Ce conditionnement permet d’organiser et de transporter le tout aisément

dans un sac à dos.

Informations aidant à la prise de décision

Lors des applications in situ sur les deux scènes d’investigations sanglantes, il a été remarqué que deux infor-

mations sont pertinentes à la prise de décision.

Premièrement, la morpho-analyse des traces de sang permet d’orienter les tests. En effet, en décrivant et en

différenciant les modèles de traces de sang, il est plus aisé de cibler les traces de sang à tester. Afin d’être

systématique, un test d’immunodétection devrait être effectué par modèle de trace de sang, tout comme un

prélèvement biologique pour les analyses génétiques. Les résultats du test d’immunodétection permettraient

alors de renseigner sur le nombre de source-s minimum et de prioriser les prélèvements biologiques.

Secondement, connaître les groupes sanguins des personnes concernées (victime-s, auteur-s, si connu-s) est une

réelle plus-value pour interpréter les résultats et pour différencier les sources sur des lieux. Si le groupe sanguin

des personnes est connu, cela permet également de savoir s’il est nécessaire d’appliquer la méthode ou non, car

si toutes les personnes possèdent l’antigène A, alors aucune discrimination ne sera faite sur ce critère. Il est

171


possible d’obtenir ces informations par l’intermédiaire du médecin traitant des personnes, si elles sont identifiées.

Il est également possible de vérifier dans les portefeuilles si les personnes ont une carte de don du sang, dans

le téléphone portable de la personne, voire de demander aux proches. Cette information, qui ne permet pas

d’identifier la source d’une trace de sang, peut toutefois permettre de trier les prélèvements biologiques et

d’orienter leurs niveaux de priorité, surtout s’il s’agit d’un huis clos et que l’intervention d’une tierce personne

peut être raisonnablement exclue.

Adaptation du protocole

Solubilisation des traces de sang

Le volume des traces de sang n’est pas connu sur des lieux. Le volume d’eau à ajouter pour solubiliser le sang

est donc à estimer en fonction de la quantité de sang et de la taille de la trace. Le volume d’eau peut être ajusté

en utilisant une pipette en plastique ou un spray. Un juste milieu doit être trouvé pour solubiliser le sang sans

réduire la concentration en sang : le sang doit être solubilisé pour obtenir une texture ni trop visqueuse, ni trop

liquide. Par exemple, lors de la deuxième intervention sur des lieux, la trace sanglante #2 était moins concentrée

que les deux autres traces, c’est pourquoi le volume d’eau ajouté était d’environ 30 µL, contre environ µL pour

les deux autres.

Influence du support

Par rapport à une application sur les lieux, il est intéressant de noter que certains supports de traces peuvent

être problématiques. En effet, comme observé lors des expériences en laboratoire, les supports trop poreux

peuvent inhiber le transfert des traces de sang sur le papier filtre. Il serait intéressant d’effectuer des tests

supplémentaires afin de déterminer si augmenter le volume d’eau nécessaire à la solubilisation de la trace de

sang serait bénéfique. Aussi, il est possible que pour les supports poreux, une autre solution aqueuse, voire un

solvant, pourrait être nécessaire.

Les surfaces poreuses testées dans cette recherche étaient du papier filtre, du tissu et du bois. Sur le bois et le

tissu en coton, le transfert des traces de sang a toujours été efficace. Sur le tissu en viscose et sur le papier filtre,

le transfert de la trace de sang n’a pas été optimal, rendant dès lors impossible la détection de l’antigène A par

le biais du protocole mis en place.

Sur des lieux d’investigation, lorsque des traces de sang sont détectées sur des tissus, il semble donc important

de vérifier la composition, le maillage et la densité du tissu. Ces variables peuvent en effet augmenter l’affinité du

sang pour le tissu et inhiber son transfert. En fonction de celles-ci, une adaptation du protocole de solubilisation

des traces de sang peut alors être opérée.

Par rapport au papier filtre support des traces de sang, il ne semble pas courant d’observer un tel support

sur des lieux. Cependant, ce support est similaire au papier peint, ce qui peut alors poser des difficultés pour

transférer des traces de sang à partir du papier peint. Outre que le support en lui-même, le papier peint est

généralement retrouvé sur des surfaces verticales et non horizontales. Or toutes les traces de sang déposées et

analysées dans cette recherche se trouvaient sur des supports horizontaux.

Sur les surfaces verticales se posent également la problématique de la solubilisation des traces de sang à l’aide

de l’eau. En se solubilisant sur une surface verticale, les traces de sang vont couler, ce qui risque d’engranger des

mélanges et d’augmenter la difficulté d’interprétation des résultats. La procédure de solubilisation des traces

de sang peut également être adaptée sur de tels supports afin d’éviter au maximum les coulures. Il existe

par exemple des sprays permettant de pulvériser très finement de l’eau (tel que le spray Ecospray vendu par

Bluestar® Forensic(Forensic, 2019)). L’utilisation de tels sprays pourrait être testée.

172


Autres facteurs

Toutes les étapes du protocole sont aisément réalisables sur des lieux. Bien qu’il ait été observé qu’une agitation

semblait nécessaire pour améliorer la réaction chimique, une agitation manuelle a donné de bons résultats,

rendant non obligatoire l’utilisation d’un agitateur orbital.

La coloration noire du papier filtre a également été observée en trois-quatre minutes, soit moins que les huit

minutes établies par le protocole. Cela confirme donc que la durée de la dernière étape peut être ajustée.

Volume minimal des traces de sang ?

Le paramètre lié au volume minimal de sang nécessaire pour détecter l’antigène A dans les traces de sang n’a

pas été évalué dans cette recherche de doctorat. La priorité a été mise sur l’influence de l’âge des traces de

sang et sur les différents supports. Il pourrait être très intéressant d’estimer ce volume minimal afin d’évaluer la

limite de détection de la méthode. Il peut cependant être remarqué que lors des étapes de contrôles réalisées 130,

des traces de sang inférieures à 20 µL avaient été déposées, et l’antigène A avait pu être détecté.

Considérer le volume de sang pose toutefois une dichotomie quant à la transposition d’une méthode développée

en laboratoire sur des lieux. Sur des scènes d’investigations, le résultat d’une action se perçoit par l’intermédiaire

d’une trace. Or, les traces de sang ne se mesurent pas en volume, mais par une taille. Cette observation questionne

donc sur le développement des méthodes : ne faudrait-il pas développer les méthodes et évaluer le seuil de

détection à partir de la taille des traces de sang, plutôt qu’à partir du volume de la goutte de sang ?

Actuellement, l’estimation du volume de la goutte de sang à l’origine de la trace de sang n’est pas effectuée

en routine sur des lieux. Plusieurs articles ont toutefois étudié l’estimation du volume d’une goutte de sang

à partir d’une trace de sang passive Bartz (2003); Hulse-Smith et al. (2005); Laan et al. (2014); Sant and

Fairgrieve (2012), ce qui ne prend donc pas en compte toutes les autres traces liées aux phénomènes passifs,

actifs, transférants et altérants (Esperança, 2019c). De ces études, il ressort que l’augmentation de la rugosité de

la surface réduit le diamètre de la trace de sang (Hulse-Smith et al., 2005). Aussi, par leur méthode d’analyse,

Sant and Fairgrieve (2012) ont démontré que plus le volume de la goutte de sang augmente, plus l’exactitude

de l’estimation du volume augmente. Par exemple, ils ont mesuré un taux d’erreur de 78 % pour un volume de

sang de 1 mL ; taux qui diminue à 7 % pour un volume de sang de 6 mL.

Lorsque les traces de sang s’évaporent, il a été décrit une ligne de front de gélification qui se formait (cf.

section 7.2.3, page 67). L’analyse de cette ligne de front a permis à Laan et al. (2016, 2019) de trouver des

caractéristiques permettant d’estimer le volume de sang d’une accumulation 131.

De plus, suivant les supports, l’angle d’impact et la hauteur de chute 132, une goutte d’un même volume de

sang engendrera des traces de sang de différentes dimensions. L’intra et l’inter-variabilité associées à la taille

des traces de sang semblent conséquentes.

Par rapport à la possibilité d’appliquer la méthode développée sur des traces de sang de petites tailles, deux

cas de figure se posent :

1. si les traces de sang font partie d’un même modèle ;

2. si la trace de sang est isolée.

Lorsque les traces font partie du même modèle, le même évènement est à l’origine des gouttes de sang ; l’hypo-

thèse d’une seule source unique est admise. Dans ce cas, il est possible d’envisager de solubiliser plusieurs traces

de sang appartenant au même modèle afin d’augmenter la concentration de sang à transférer. Si plusieurs mo-

130. Lors des traces de sang déposées à l’aveugle, page 146131. Ce modèle correspond à une quantité de sang liquide sur une surface non poreuse ou poreuse saturée (Esperança, 2019a).132. La hauteur est un facteur influençant la taille de traces de sang passives jusqu’à une certaine distance.

173


dèles de traces de sang sont superposés, il serait intéressant de cibler la solubilisation au niveau de la périphérie

des modèles afin d’éviter tout mélange de traces de sang provenant de modèles différents 133.

Si au contraire une seule trace de sang millimétrique est découverte, et qu’elle se trouve isolée de tout modèle,

alors la prudence est de mise. Dans ce cas présent, le prélèvement biologique de la trace de sang pour les analyses

génétiques est très fortement recommandé, sans qu’aucun test n’ait été effectué sur cette trace ; test indicatif

compris. En effet, en présence de traces de sang de très petite taille, un seul prélèvement suffit à collecter

toute la trace et/ou à dégrader le support, ne permettant alors pas d’autres prélèvements 134. Dans ces cas, le

prélèvement biologique de la trace de sang est nécessaire, au dépend de l’information relative à la caractérisation

de la trace de sang, et à la présence ou non de l’antigène A. Si une trace supposée sanglante est prélevée sans

test indicatif préalable, il est possible de demander au laboratoire d’analyse génétique d’effectuer le test indicatif

à partir du prélèvement biologique, et de l’analyser par la suite si le test indicatif au sang se révèle positif.

Contrôles de la méthode

Les tests indicatifs de fluides biologiques nécessitent des contrôles. Ces derniers peuvent être effectués au sein

du test (par exemple avec une bande réactionnelle supplémentaire intégrée, comme pour les tests immunochro-

matographiques), ou réalisés en parallèle en testant un standard. Le support peut également être testé pour

obtenir un contrôle négatif. Dans le cas présent, il faudrait inclure un contrôle pour le transfert de la trace de

sang solubilisée, un contrôle du fonctionnement des couplages biochimiques et un contrôle du support étudié.

L’introduction d’un contrôle lié au transfert du sang est délicate. En effet, lors de l’intervention, l’âge de la trace

de sang et son évolution en fonction des conditions environnementales ne sont pas connus. Il est dès lors difficile

d’établir un contrôle du transfert de la trace de sang qui convienne à toutes les situations.

Bien que non optimal, le test en lui-même permet tout de même de contrôler le transfert de sang et le support

étudié. En effet, le papier filtre étant de couleur bleue, le transfert de sang se voit à l’œil nu par la coloration du

papier filtre en rouge ; signe d’un transfert de sang. Aussi, lors de l’application du papier filtre sur la trace de

sang, le support entre également en contact avec le papier filtre. Il peut être émis l’hypothèse selon laquelle les

molécules présentes à la surface de ce support se transfèrent également sur le papier filtre. Lors de la coloration

du papier filtre, il est possible d’estimer où la coloration est attendue, à savoir les zones où du sang s’est transféré.

En dehors de ces zones, aucune coloration, autre que le bruit de fond, n’est attendue. Si une coloration s’effectue,

alors un faux positif lié au support peut être présumé.

L’instauration d’un contrôle aurait une réelle plus-value lorsque les traces de sang sont sur des supports poreux,

tels que du tissu, du papier filtre ou du papier peint. Les résultats observés en laboratoire ont effectivement

montré que ces supports ne permettent pas de transférer efficacement les traces de sang sur le papier filtre.

Outre le transfert du sang sur le papier filtre, un contrôle du fonctionnement des couplages biochimiques entre les

anticorps primaires, secondaires et l’antigène pourrait être envisagé. Ce contrôle permettrait de vérifier que les

anticorps secondaires se fixent aux complexes antigènes-anticorps primaires lors de l’immersion du papier filtre

dans la solution d’anticorps secondaires. Comme les résultats ont montré que la coloration noire est spécifique

aux complexes formés par l’antigène A, les anticorps primaires et secondaires, ce contrôle permet également

de vérifier que l’antigène A est bien fixé aux anticorps primaires. En théorie, il serait possible de constituer

par recombinaison génétique des antigènes A. Les protéines recombinantes sont par ailleurs utilisées comme

contrôle lors de certaines techniques biologiques comme les western blots et dot blots 135. Pour le contrôle, il serait

133. La même réflexion peut être faite à propos du prélèvement biologique, où plusieurs traces de sang peuvent être prélevéesensemble lorsqu’elles proviennent d’un même modèle.134. Ce cas de figure peut se présenter par exemple lorsqu’une trace de sang millimétrique se situe sur du papier, le prélèvementde la trace dégrade fortement le support du fait de l’humidification et du frottement nécessaires.135. L’utilisation d’antigène A « recombiné » n’a pas été considérée comme contrôle lors de cette recherche, car ce produit n’a pasété trouvé en vente. Toutefois, la protéine Band 3 existe sous forme recombinante. Il serait dès lors possible de synthétiser l’antigèneA à partir de celle-ci en y ajoutant un N-acétyl-galactosamine sur l’asparagine en position 642, comme présenté à la figure 6.7.

174

Expansion de la méthode

alors possible de déposer très localement des antigènes A « recombinés » sur le papier filtre imbibé d’anticorps

primaires. Lors de l’immersion du papier filtre dans la solution d’anticorps secondaires, une coloration noire est

attendue au niveau de la zone du dépôt de l’antigène A « recombiné ». Cette coloration permettrait alors de

vérifier le bon fonctionnement des anticorps primaires et secondaires.

Une possibilité envisageable pour contrôler le fonctionnement de la méthode sur des lieux avec les réactifs est

de la tester sur des traces de sang « contrôles » de groupe A (contrôle positif) et de groupe O (contrôle négatif).

C’est ce qui a été effectué lors de la deuxième intervention sur des lieux. Lors de la préparation du matériel

en laboratoire, deux traces de sang de ces deux groupes sanguins 136 ont été créées, transportées sur les lieux,

puis testées. Bien que les volumes et les temps de séchage de ces deux traces de sang soient connus et donc non

représentatifs des traces de sang sur les lieux, ces contrôles permettent d’attester du bon fonctionnement des

réactifs et de l’absence de contamination des produits. Toutefois, des précautions sont à prendre pour ne pas

contaminer les traces de sang de la scène d’investigation avec le sang rapporté pour tester le protocole. Cela

peut aisément être fait en étant vigilant à la zone de travail, c’est-à-dire en travaillant dans une zone, pièce

séparée si cela est possible, et en déposant le sang rapporté dans des boîtes de Petri pour supprimer tout contact

entre ce sang et les traces de sang des lieux.

Expansion de la méthode

Pour couvrir plusieurs traces de sang en une seule fois, il faut se pencher sur l’expansion de la méthode afin

d’augmenter son pouvoir couvrant. Ce dernier varie en fonction de la méthode d’application :

• application individuelle : par grattage individuel de la trace de sang au moyen d’un écouvillon ou d’un

bâtonnet, comme pour les tests indicatifs (chimiques et immunochromatographiques) ;

• application localisée : par application d’un papier filtre sur la zone d’intérêt, pour la détection de salive

ou de résidus de tirs sur des tissus ;

• application globale : au moyen d’un spray en pulvérisant une solution chimique, typiquement avec le

luminol pour la détection de traces de sang latentes.

À ce stade, la faisabilité d’une approche localisée a été démontrée. Bien que le pouvoir couvrant de la méthode se

limite à la surface du papier filtre, ce dernier peut être adapté aux circonstances. Le transfert du sang solubilisé

sur le papier filtre permet de travailler sur des zones plus ou moins grandes, et une fois les traces de sang

transférées, le risque de mélange est amoindri. L’application de cette technique semble être un bon compromis

entre le choix des traces de sang à tester pour les prélèvements biologiques, les limites liées à la zone d’analyse

des traces de sang, et les risques de mélanges de sang.

Le chemin vers une application globale de discrimination de sources de traces de sang constitue une étape de

recherche bien plus avancée et une réelle innovation technologique est requise. Dans l’optique où un procédé non

destructif est envisagé (scanner, caméra hyperspectrale) pour identifier une molécule présente dans une trace de

sang, toute la méthode d’analyse serait différente. Les molécules cibles seraient également sûrement différentes.

Il faudrait alors évaluer si des spectres peuvent être isolés des traces de sang, et différenciés d’autres traces de

sang de sources différentes. Il serait dans ce cas présent, très important d’évaluer l’intravariabilité des spectres

obtenus, en vérifiant l’uniformité des spectres sur des traces de sang d’un même donneur, à des conditions de

séchage du sang différentes (durée, température, humidité), et sur des supports différents. Les spectres issus

des caméras hyperspectrales se basant sur une analyse de la lumière réfléchie, prennent également en compte le

support sur lesquels sont déposées les traces ; ils ne doivent de ce fait pas influencer les spectres obtenus.

Si un pulvérisateur est envisagé pour détecter de manière globale des antigènes sanguins, alors la réponse

engendrée diffèrera de celle vue dans cette recherche. Une agglutination cellulaire pourrait être envisagée, mais

136. Comme la préparation des papiers filtres nécessite une heure de séchage dans une étuve, il est possible de préparer tout lematériel et les contrôles en parallèle.

175


d’après des tests effectués au sein de cette recherche, les résultats se sont rapidement montrés non conclusifs 137.

Deux raisons peuvent peut-être expliquer cela :

1. la dégradation des cellules sanguines lorsque le sang sèche inhibe l’agglutination,

2. la solubilisation non homogène du sang par une solution aqueuse forme des agrégats 138.

Une autre approche pourrait être envisagée, à savoir une coloration cellulaire par la détection des antigènes A.

Afin de réduire le nombre de pulvérisation, et donc de limiter la dilution des traces de sang, l’idéal serait de ne

pulvériser qu’une seule fois une solution chimique. Le domaine de la chimie logique (molecular switches) permet

d’obtenir une réponse colorimétrique différente selon que le ligand cible soit présent ou non.

L’utilisation d’un spray a également des inconvénients. La principale limite étant qu’en pulvérisant une solution

aqueuse sur du sang sec, celui-ci se solubilise et se dilue localement. Avec des traces de sang juxtaposées, le

risque de mélange est accru ; principalement si les traces de sang sont situées sur des surfaces obliques ou

verticales. La dégradation des traces de sang est inévitable, même si la destruction des traces peut ne pas être

considérée comme problématique car toutes les traces de sang doivent impérativement être fixées et enregistrées

préalablement à l’application de techniques destructives. La compatibilité d’une telle technique avec la suite

du processus forensique, principalement avec les analyses génétiques est également importante à vérifier. Si

toutes les traces de sang sont recouvertes par un produit chimique (par exemple les solutions d’anticorps et

d’immunodétection ECL-AP), il faut être sûr que cela ne dégrade pas l’ADN présent et donc n’altère pas les

analyses génétiques subséquentes. Aussi, sans parler de dégradation d’ADN, si des molécules luminescentes sont

utilisées pour détecter les antigènes sanguins, il faut vérifier que ces dernières n’interfèrent pas avec les sondes

luminescentes utilisées lors des étapes d’amplification et d’électrophorèse capillaire 139.

L’utilisation du pulvérisateur peut également être optimisée. Il pourrait être envisagé de pulvériser directement

la solution aqueuse d’anticorps dilué sur les traces de sang pour les solubiliser en même temps. Il faudrait alors

vérifier que le transfert de celles-ci sur le papier filtre engendre les complexes antigènes, anticorps primaires

et secondaires. Aussi, au lieu d’immerger le papier filtre dans des solutions d’anticorps secondaires et de la

solution d’immunodétection ECL-AP, il peut être envisagé de pulvériser ces deux solutions sur le papier filtre.

Cela permettrait de travailler avec des papiers filtres de plus grande taille, et supprimerait la limitation due à

la taille des bacs utilisés pour les immersions.

L’utilisation d’un papier filtre pour transférer les traces de sang n’est finalement pas si contraignante, d’autant

plus que l’optimisation de ce protocole est prometteuse. Afin de réduire le temps d’une analyse en utilisant un

papier filtre, deux voies de recherche sont possibles :

1. réduire la durée des immersions ; cela passe donc par l’optimisation des réactions chimiques. Il est par

exemple envisageable d’augmenter les concentrations en anticorps ou d’ajouter des catalyseurs.

2. augmenter la surface du médium du papier filtre. Comme précisé auparavant, en augmentant la taille du

papier filtre, l’homogénéité de la répartition des anticorps primaires sur le papier filtre doit être vérifiée.

Aussi, en augmentant la taille du papier filtre, une adaptation du matériel à disposition est à prévoir :

• les bacs nécessaires pour immerger les papiers filtres doivent être changés 140 ;

• le volume des solutions chimiques (anticorps secondaires et immunodétection ECL-AP) doivent être

augmentés pour s’assurer que le papier filtre est complètement immergé.

Le conditionnement du matériel doit donc être modifié, ce qui risque d’augmenter l’encombrement. En fonction

de tous ces facteurs limitants, un papier filtre de format A4 paraît de fait être la dimension limite.

137. Les tests avaient consisté en l’application d’anticorps primaires anti-A permettant d’agglutiner les cellules sur du sang secd’au moins cinq heures ; aucune agglutination n’a été observée.138. L’utilisation de tampons favorisant l’agglutination cellulaire, tels que le tampon LISS (Low Ionic Strength Solution), nesemble pas non plus favoriser ces observations.139. Bien que des étapes de purifications peuvent être effectuées pour réduire ces artéfacts, les protocoles actuels mis en place dansles laboratoires de génétique forensique sont automatisés et ne permettent pas de variation du protocole.140. Il est à noter que la taille des boîtes utilisées dans cette thèse est de 8x8 cm, limitant alors le papier filtre à cette dimension.

176

Combinaison de la méthode avec des analyses génétiques

Il serait également possible de développer un papier filtre conditionnée pour une application locale. Ce type

d’application peut être intéressante lorsque très peu de traces de sang sont présentes sur des lieux ou sur une

pièce transmise pour des analyses en laboratoire. Pour tester localement une trace de sang, la dimension du

papier filtre peut être fortement réduite. Un kit pourrait alors être développé pour associer le papier filtre et les

deux solutions nécessaires, à savoir celle des anticorps secondaires et celle de l’immunodétection ECL-AP. Un

test indicatif de ce format existe pour les stupéfiants (Touch&Know, 2020), dans lequel la poudre est prélevée

à l’aide d’une languette, puis insérée dans un boîtier plastique. Des ampoules peuvent alors être brisées pour

déverser les solutions contenues. La transparence du plastique du kit permet de visualiser les résultats.

Combinaison de la méthode avec des analyses génétiques

Prélèvement des traces de sang

Comme précisé avant, les résultats obtenus par l’application de la méthode proposée dans cette thèse trans-

mettent une information sur un nombre minimum de sources à l’origine des traces de sang. Sans effectuer les

prélèvements biologiques, cette information représente déjà une plus-value par rapport à la situation initiale.

Cependant, l’un des buts est bien évidemment d’aiguiller les investigateurs à prélever les traces de sang de

sources différentes. La méthode doit donc être compatible avec les analyses génétiques subséquentes. Lors des

expérimentations effectuées dans cette recherche, tout le sang solubilisé (volume initial de la trace de sang de

20µL) ne se transférait pas sur les papiers filtres imbibés d’anticorps primaires, permettant dès lors de prélever

le reste du sang à l’aide d’un écouvillon. Avec des traces de sang de volume supérieur à 20µL, les mêmes attentes

sont présumées. Avec des traces de sang de volume inférieur, il est nécessaire de chercher la limite à partir de

laquelle tout le sang se transfère sur le papier filtre.

Risques de contamination

L’utilisation d’eau stérile pour solubiliser les traces de sang est compatible avec les analyses génétiques, étant

déjà utilisée pour humidifier les écouvillons de prélèvement. Cependant, le volume d’eau ajouté pour solubiliser

la trace de sang est à prendre en compte car un trop grand volume entraîne une forte dilution de la trace de

sang, ce qui risque de diminuer la concentration en sang pour le transfert et le prélèvement biologique.

L’un des risques majeurs de contamination est donc lié à l’utilisation du papier filtre et des anticorps primaires

anti-A fixés dessus. Les fabricants de ces deux produits ne précisent pas les conditions de production. Il peut tout

de même être supposé que pour la production des anticorps, les conditions sont stériles du fait qu’ils sont utilisés

pour la recherche in vitro. Concernant le papier filtre, une étude pourrait être réalisée afin de déterminer le bruit

de fond relatif à la présence d’ADN dessus. L’étape la plus risquée pouvant entraîner une contamination reste

la conception du papier filtre imbibé des anticorps primaires anti-A 141. Cette préparation doit être rigoureuse

afin de réduire tout risque de contamination, c’est-à-dire que le matériel utilisé doit être stérile et manipulé avec

les précautions d’usage.

Impact de la méthode sur l’ADN et stratégie de prélèvement des traces de sang

Une étude plus poussée devrait être réalisée afin d’évaluer si les réactifs et le papier filtre ont un effet délétère

sur la procédure de profilage génétique des traces de sang. Même si ce fluide biologique est considéré comme un

fluide riche en ADN, les traces de sang peuvent être dégradées selon les conditions environnementales.

141. Le point #14 des expériences préliminaires de la section 13.4.1 avait montré l’absence d’ADN sur une seule analyse d’unpapier filtre vierge de tout anticorps.

177


Suite à l’application du protocole sur des traces de sang, trois possibilités de prélèvement sont envisagées :

1. le prélèvement de la trace de sang sur son support, après l’application du papier filtre. Selon la quantité

de sang initiale, il devrait rester assez de matière à disposition sur le support pour la prélever.

2. le prélèvement de la zone d’intérêt sur le papier filtre, après l’immunodétection. Ce prélèvement pourrait

être effectué que la zone soit noire (présence de l’antigène A ou faux positif) ou non (absence de l’antigène

A ou faux négatif).

3. le découpage de la zone d’intérêt sur le papier filtre, après l’immunodétection.

Des tests évaluant la limite de détection de la méthode peuvent être effectués pour vérifier le volume limite de

sang nécessaire pour obtenir un profil génétique interprétable.

L’étude préliminaire menée sur l’influence des anticorps primaires, des autres réactifs et du protocole d’immu-

nodétection (cf. page 148) a montré une dégradation des profils. Toutefois, il semblerait possible d’extraire, à

partir du papier filtre, un profil génétique exploitable des fins de comparaison avec la banque de données CODIS.

La possibilité d’analyser la zone de transfert de la trace de sang sur le papier filtre, directement après le protocole

d’immunodétection est extrêmement intéressante. Dès lors, il faudrait vérifier plus profondément la compatibilité

du protocole avec les analyses génétiques. Si le papier filtre peut être conservé puis analysé, cela simplifierait

la réflexion relative au transfert de la trace de sang sur le papier filtre, au volume d’eau stérile déposé pour la

solubiliser, et la taille de la trace de sang.

Il peut également être pertinent d’analyser le papier filtre après le processus d’immunodétection si un résultat

positif serait perçu sur le papier filtre, dans une zone où aucune trace de sang visible, n’a été préalablement vue.

Dans cette situation, le papier filtre ferait office de technique de détection, voire de test indicatif au sang 142

Cela pourrait alors permettre d’extraire un profil génétique sur le papier filtre, dans le cas où aucune trace de

sang visible n’avait été observée sur le support.

Enfin, il est intéressant de rappeler que le protocole d’immunodétection peut également être utilisé pour prioriser

les prélèvements biologiques effectués sur des traces de sang. Comme mentionné lors du deuxième cas réel (cf.

page 155), les tests avaient pu être effectués sur des traces de sang déjà prélevées. L’un des buts avait été

d’apporter une aide dans la sélection de ces prélèvements en les groupant dans deux catégories : ceux contenant

l’antigène A et ceux ne le possédant pas. Comme les trois tests avaient donné les mêmes résultats, aucune

catégorisation n’a pu être établie ; ne permettant dès lors pas de prioriser les prélèvements.

Quid des appareils d’analyse ADN rapide ?

Comme vu précédemment, plusieurs appareils permettant d’extraire et de fournir un profil génétique ont été

développés dans une optique d’utilisation sur des lieux. Le pouvoir discriminatoire est bien supérieur à celui de

la méthode développée dans cette thèse du fait que plusieurs caractéristiques sont analysées. Une discrimination

plus pertinente pourrait donc être faite entre plusieurs traces de sang.

Cependant, la principale différence vient du processus forensique appliqué lors d’une investigation. Pour utiliser

les appareils d’analyse génétique rapides, il faut avoir prélevé une trace pour l’analyser. Cela sous-entend donc

d’avoir choisi quelle trace doit être prélevée. L’IRCGN (Institut de Recherche Criminelle de la Gendarmerie

Nationale française) dispose d’un tel dispositif (IRCGN, 2019), le LABADN. Il s’agit d’un laboratoire génétique

mobile dans un fourgon, pouvant être accompagné de deux extensions modulables sous forme de tentes. Des

analyses génétiques complètes peuvent être effectuées dans ce laboratoire mobile, sur des lieux. Les vingt-et-un

premiers profils génétiques peuvent être obtenus en deux heures, et les suivants toutes les trente minutes.

142. En considérant que le résultat soit un vrai positif, et non dû à une coloration du papier filtre ou d’une molécule engendrantun faux positif.

178

Coût d’une analyse et sécurité

Le concept de ce laboratoire de génétique mobile diffère de celui de cette thèse. L’IRCGN peut amener ce

laboratoire sur des lieux de grandes catastrophes, ou sur des scènes d’investigation très complexes, pour obtenir

les profils génétiques des traces prélevées et analysées, qui ne sont pas nécessairement du sang. La technique

développée dans cette thèse se concentre sur l’étape précédant le prélèvement de la trace de sang. Elle est ainsi

complémentaire aux analyses génétiques, qu’elles soient effectuées sur des lieux, ou en laboratoire.

Coût d’une analyse et sécurité

Le tableau 14.1 présente le coût du matériel consommable nécessaire à la mise en œuvre de la méthode déve-

loppée ; les prix à l’achat et pour une analyse étant présentés. Pour appliquer un papier filtre de 8x8 cm, le coût

de l’analyse est de CHF 14.60. Pour le matériel non consommable, du matériel de laboratoire est suffisant :

• une étuve chauffante ;

• des boîtes en plastique (type boîte de Pétri) pour immerger les papiers filtres dans les bains d’anticorps

secondaires et d’immunodétection ECL-AP ;

• un dessiccateur, ou tout autre moyen permettant de conserver les papiers filtres dans un environnement

sec, pauvre en humidité.

Matériel Volume/

Quantité

Prix à l’achat

(CHF)

Prix pour une

analyse (CHF) Produit Nom Fournisseur # référence

Papier

filtre

Whatman grade

595 – diamètre

15mm

Sigma-Aldrich

(Merck) WHA10311612 100 feuilles 21.60

0.22

une feuille

Anticorps

primaires

Bioscot® Anti-A

from clone

BIRMA 1, Murine

IgM

Merck

Millipore TL-10x10ML-U 10x10 mL 60.60

0.61

1 mL

Anticorps

secondaires

Rabbit anti-

Mouse IgM

secondary

antibody (alkaline

phosphatase)

Novus

biologicals NBP1-72685

1 mg

(1 mL)

379.00

3.80

10 uL

Tampon

TBS

10X Tris-

Buffered-Saline Bio-Rad 1706435 1 L 100.00

1.00

10 mL

Tween 20 Tween® 20

viscous liquid Sigma-Aldrich

(Merck) P1379-100ML 100 mL 28.90

0.14

0.5 mL

ECL-AP Novex™ AP

Chromogenic

Substrate

(BCIP/NBT)

ThermoFisher

Scientific

WP20001 250 mL 221.00

8.84

10 mL

Total 811.10 14.60

Tableau 14.1 – Tarifs du matériel consommable nécessaire

Les fiches de sécurité (FDS) des produits chimiques indiquent les informations suivantes (cf. annexe O) :

• les anticorps primaires ne présentent aucun danger particulier ;

• les anticorps secondaires contiennent des azotures de sodium (0,1% à 0,5 %) qui sont toxiques et dangereux

pour le milieu aquatique ;

179


• le Tween® 20 n’est pas dangereux ;

• le TBS contient du chlorure de sodium et du trométamol qui provoquent une irritation cutanée et une

sévère irritation des yeux ;

• la solution d’immunodétection ECL-AP contient de l’acide maléique provoquant des allergies cutanées.

Une utilisation stricte dans les conditions recommandées est nécessaire pour éviter tout risque. Comme ces

solutions ne sont pas pulvérisées, les risques d’ingestion ou de contact avec les muqueuses (bouches, yeux) sont

fortement réduits. Les principaux risques existent lors de la conception en laboratoire des papiers filtres et des

solutions d’anticorps secondaires.

En cas d’utilisation d’un pulvérisateur, le port d’un masque adapté est de rigueur. Des lunettes sont également

indispensables pour éviter toute projection des solutions dans les yeux.

La solution d’immunodétection ECL-AP peut réagir à la lumière, c’est pourquoi il est recommandé d’éviter tout

contact avec la lumière du jour. La bouteille commerciale étant opaque, les risques sont limités. Si la solution

est transvasée dans d’autres contenants, il est conseillé de les enrouler d’une feuille de papier d’aluminium.

Résumé des points forts et des limites

Points forts

La méthode développée a pu être transposée d’un développement en laboratoire pour une application sur des

lieux d’investigation. La méthode permet de détecter l’antigène A dans des traces de sang. La présence de

l’antigène A se perçoit par une coloration noire du papier filtre.

La préparation du protocole, qui peut s’effectuer la veille de l’application, dure entre une heure et une heure

trente minutes. Chaque application complète dure trente minutes ; plusieurs papiers filtres pouvant être appliqués

en parallèle. Le protocole développé permet de détecter l’antigène A dans des traces de sang âgées d’un mois,

sur différents supports, poreux et non poreux La méthode a pu être appliquée sur deux scènes d’investigation et

l’antigène A a pu être détecté. Les traces de sang étaient âgées d’une semaine lors de la première intervention,

et de trois jours lors de la seconde.

L’interprétation du résultat visuel est aisée car la présence d’antigène A dans la trace de sang transférée entraîne

une coloration noire sur le papier filtre. Même si le contraste entre cette coloration et le papier filtre peut être

amélioré, le fait que plus de 80 % des personnes ayant interprété correctement des résultats à l’aveugle semble

soutenir cette observation.

La méthode développée permet d’analyser plusieurs traces en une seule application d’un papier filtre ; la taille

du papier filtre étant le facteur limitant principal. Comme illustré dans ce manuscrit de thèse, il a par ailleurs

été possible d’analyser la présence de l’antigène A dans quatre traces de sang en une seule application (cf. page

126). Cette opération a permis de distinguer les traces de sang contenant l’antigène A et celles ne le contenant

pas ; un taux de discrimination des traces de sang de 50 % a pu être atteint.

Aucune autre méthode permettant de différencier la source de traces de sang avec un pouvoir discriminatoire de

50 % dans la population caucasienne, en trente minutes, et applicable sur plusieurs traces de sang en une seule

manipulation n’a été trouvée dans la littérature. La méthode, basée sur l’immunodétection de l’antigène A dans

des traces de sang par application d’un papier filtre directement sur des traces de sang, est de ce fait innovante

et originale. Elle permet d’entrevoir des développements prometteurs, toujours centrés sur une application sur

des lieux d’investigation.

180

Synthèse des perspectives

Limites

Le taux du pouvoir discriminatoire de la méthode est de 50%. La méthode proposée permet de différencier des

traces de sang sur la base de la détection des antigènes sanguins A ; cela permet donc de différencier les traces

de sang de groupes A et AB des traces de sang des groupes B et O. Les quatre groupes sanguins du système

ABO ne peuvent être différenciés, tout comme deux personnes de groupes A et AB. Une réponse positive au

test pouvant être entraînée par une trace de sang de groupe A ou de groupe AB. Bien que le taux soit de 50%,

il s’agit tout de même d’une information majeure à considérer car actuellement aucune méthode n’est proposée

et, aucune n’a été trouvée dans la littérature, qui puisse être déployée sur des lieux en trente minutes.

La taille du papier filtre est un facteur limitant, car toutes les traces de sang sur une scène d’investigation ne

peuvent pas être traitées. Il est nécessaire de choisir quelle trace de sang doit être testée, voire prélevée. Aussi,

bien qu’acceptable, la technique nécessite trente minutes. Il pourrait être intéressant de réduire cette durée

pour accélérer le processus de détection de l’antigène A dans des traces de sang. Là réside l’importance et la

complémentarité de la morpho-analyse des traces de sang afin d’identifier les différents modèles de traces de

sang. En connaissant la localisation et le nombre de modèles de trace de sang, la méthode peut être appliquée

sur chaque modèle, limitant dès lors le nombre de tests et de prélèvements biologiques.

Sur certains supports poreux, comme du tissu, ou du papier filtre, la méthode ne donne pas de résultat concluant,

certainement du fait de l’insuffisance de transfert de la trace de sang sur le médium du papier filtre. Cette carence

de transfert est le résultat de la diffusion de l’eau au sein du support, ne permettant pas de solubiliser le sang. La

technique doit donc être prioritairement utilisée sur des supports non poreux, bien que sur du bois, des résultats

positifs aient été observés. Certains supports trop poreux pouvant être rencontrés sur des lieux, tels que du

papier peint, ou des supports verticaux peuvent avoir un impact négatif sur une application opérationnelle.

Synthèse des perspectives

La technique peut être optimisée pour augmenter son pouvoir discriminatoire. Pour cela, il conviendrait de tester

l’application de plusieurs papiers filtres contenant chacun des anticorps primaires différents. Cela suppose d’avoir

vérifié que les antigènes associés demeurent détectables dans le temps. L’accumulation de tous les anticorps

primaires sur un seul papier filtre reste théoriquement possible, mais serait extrêmement complexe à mettre en

œuvre. Les futures recherches peuvent se baser sur le chapitre 9 pour évaluer le taux de détection des antigènes

dans des traces de sang. Si ces derniers répondent aux attentes, alors le même protocole de conception du papier

filtre avec de nouveaux anticorps peut également être envisagé.

Une étude devrait être menée pour déterminer le seuil de détection (volume minimal, taille minimale d’une trace

de sang) pour lequel l’antigène sanguin A peut être détecté dans des traces de sang. Travailler avec des traces

de plus petites tailles pose une difficulté par rapport à la dilution des traces de sang lors de leur solubilisation.

Dans d’autres circonstances, les traces de sang peuvent déjà avoir été diluées, par exemple intentionnellement

dans une tentative de nettoyage des traces. Cette étude montre que le protocole mis en place donne de bons

résultats avec des traces de sang sèches et non avec du sang encore liquide. Il serait dès lors intéressant d’étudier

l’impact d’une dilution important des traces de sang.

Une étude pourrait être faite en augmentant la taille du papier filtre immergé d’anticorps primaires. Cette

recherche permettrait d’analyser l’homogénéité de la concentration en anticorps primaires sur le papier filtre, et

permettrait également d’évaluer la taille maximale d’un papier filtre.

Enfin, il serait intéressant de poursuivre l’étude préliminaire faite sur les analyses génétiques à partir du papier

filtre. Cela permettrait d’évaluer concrètement l’impact des réactifs du protocole sur les analyses génétiques et

si les profils génétiques obtenus à partir des papiers filtres peuvent être exploités.

181


Conclusion

Le sujet de cette thèse en lien avec la sélection des traces de sang sur des lieux d’investigation a permis de

développer une méthode permettant d’aider la prise de décision pour effectuer les prélèvements biologiques

sanguin par la détection de l’antigène A dans ces dernières.

De par les aspects temporels, économiques et techniques, il n’est pas possible de prélever et d’analyser toutes

les traces de sang sur une scène d’investigation. Une décision doit être prise pour choisir quelle trace de sang il

est nécessaire de prélever, et quel prélèvement doit être envoyé en priorité en analyse génétique. Ce choix peut

être facilité en discriminant sur des lieux les sources des traces de sang. Le choix de la méthode développé s’est

basé sur la détection de l’antigène sanguin A du groupe ABO dans les traces de sang.

L’antigène A possède un haut pouvoir discriminatoire ; de 50% dans la population caucasienne. Un protocole

de base (dot blot) a été établi pour étudier l’accessibilité de cet antigène dans des traces de sang âgées jusqu’à

quatre semaines. Ce protocole est facilement modifiable si d’autres antigènes devaient être étudiés.

Le protocole du dot blot a ensuite été adapté pour une application sur le terrain. Cette méthode consiste en

l’élaboration d’un papier filtre imbibé d’anticorps primaires anti-A. Après solubilisation de la trace de sang à

tester, le papier filtre est apposé dessus pour la transférer. Après une immersion du papier filtre dans une solution

d’anticorps secondaires anti-anticorps primaires, l’immunodétection permet de détecter les complexes formés par

l’antigène A, les anticorps primaires et secondaires. Le résultat s’observe visuellement en un noircissement de

la zone du papier filtre où la trace de sang a été transférée.

Ce protocole a également été appliqué sur des traces de sang âgées jusqu’à quatre semaines. Les résultats ont

montré que l’antigène A est détectable dans les traces de sang de groupe A et AB. Pour un donneur de sang de

groupe B, des résultats « faux positifs »ont été observés, mais pas pour les autres donneurs de sang ne possédant

pas l’antigène A. Aussi, certains support trop poreux inhibent le transfert du sang sur le papier filtre, inhibant

alors l’immunodétection.

La méthode a pu être appliquée sur deux cas réels. Sur les traces de sang testées, les résultats observés concordent

avec l’hypothèse de la présence de l’antigène A dans ces dernières. Pour certaines des traces, il a pu être confirmé

par des informations médicales, que les personnes à l’origine de ces traces possédaient l’antigène A.

La méthode développée a répondu aux critères et objectifs attendus. En effet, les résultats observés indiquent que

la méthode est rapide d’utilisation (trente minutes), transportable sur des lieux, relativement facile d’application

et possède un pouvoir discriminatoire de 50% dans la population caucasienne.

Le processus décisionnel relatif à l’exploitation des traces de sang illustré dans cette thèse a montré toute la

complexité des décisions auxquelles font faces les investigateurs. Quelle trace de sang tester ? Quelle trace de

sang prélever ? Où ? Combien ? Quel prélèvement est prioritaire par rapport à un autre ? Pourquoi prélever

une trace de sang si elle n’est pas analysée ? Au final, ne pourrait-il pas exister une méthode qui combine

le tout ? Ou du moins plusieurs décisions ? Comme par exemple caractériser la nature de la trace et la

discrimination des sources ? Ou ne serait-il pas envisageable de tester l’ensemble des traces en une seule

étape ? En augmentant les pouvoirs couvrant des méthodes, typiquement des tests indicatifs ?

182

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192

Annexes

I

A – Sucres terminaux des antigènes ABH

O OH

N

OH

CH2OH

HO

C

OH3C

(a) déterminant A :β-N-acetylgalactosamine

O OH

OH

OH

CH2OH

HO

(b) déterminant B :β-D-galactose

OOH

HO

OH

CH3

HO

(c) déterminant H :β-L-fucose

III

B – Traces de sang créées avec différents anticoagulants

Sur du bois – grossissement 2x





V

Annexes

Sur du papier filtre – grossissement 2x





VI

B – Traces de sang créées avec différents anticoagulants

Sur du plastique – grossissement 2x

(a) t0 – frais (b) t0 – EDTA (c) t0 –héparine

(d) t20 – frais (e) t20 –EDTA

(f) t20 –héparine

(g) t30 – frais (h) t30 –EDTA

(i) t30 –héparine

(j) t90 – frais (k) t90 –EDTA

(l) t90 –héparine

VII

Annexes

Sur du tissu – grossissement 2x





VIII

C – Protocoles issus des fournisseurs

Kit MDmulticards®, Grifols

EASYMDmulticard® uses a very simple, straightforward

procedure requiring very little manipulation; it does not

require expert knowledge in immunohematology,

and no instrumentation is needed, so the test can be

carried out anywhere.

Four simple steps:

1 Prepare a red blood cell suspension with

1 drop (50 µl) of whole blood

and 4 drops (200 µl) of Diluent F.

2 Dispense 2 drops (100 µl) of this suspension

to the application zone.

3 After 30 seconds, add 6 drops (300 µl) of Diluent F.

4 Wait 5 minutes read and record the results.

MDmulticard® has a long shelf-life at room temperature,

and requires only a small bench-top space for processing,

making logistics and handling absolutely effortless.

1

3

2

4

IX

Annexes

Kit ID-Antigen Profile, Bio-Rad

X


Activation des membranes LF-PVDF

XI

Annexes

Kit Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction

XII


XIII

D – Distribution des antigènes sanguins dans la population

expérimentale

Indiv

idu

AB

D(V

I+)

D(V

I-)C

cE

eK

(KE

L1)

k

(KE

L2)

Kp

a

(KE

L3)

Kp

b

(KE

L4)

Jk

a

(JK1)

Jk

b

(JK2)

P1

Lea

(LE

1)

Leb

(LE

2)

Lu

a

(LU

1)

Lu

b

(LU

2)

M

(MN

S1)

N

(MN

S2)

S

(MN

S3)

s

(MN

S4)

Fy

a

(FY

1)

Fy

b

(FY

2)

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43+

++

++

+-

+-

+-

++

++

-+

-+

+-

++

+-

44+

-+

++

+-

+-

+-

++

++

-+

++

+-

++

++

45+

-+

++

--

+-

+-

++

++

-+

-+

+-

++

++

46+

-+

++

+-

+-

+-

++

-+

-+

-+

++

-+

++

47-

--

--

+-

+-

+-

++

++

-+

-+

+-

-+

+-

48-

-+

++

--

+-

+-

++

--

-+

-+

-+

-+

++

49-

++

+-

++

+-

+-

++

-+

-+

++

++

++

-+

50-

-+

++

+-

+-

+-

++

-+

--

++

+-

++

-+

51-

-+

++

--

+-

+-

++

-+

-+

-+

+-

-+

+-

52+

--

--

+-

+-

+-

+-

++

-+

-+

-+

-+

++

XV

E – Photos des traces de sang déposées pour étudier la

détection des antigènes A par dot blot


(a) Groupe A (b) Groupe B (c) Groupe AB (d) Groupe O

XVII

Annexes

Sur du carrelage – grossissement 1x

(a) Groupe A (b) Groupe B

(c) Groupe AB (d) Groupe O

XVIII

E – Photos des traces de sang déposées pour étudier la détection des antigènes A par dot blot

Sur du papier filtre – grossissement 0,8x



XIX

Annexes

Sur du tissu – grossissement 0,8x



XX

E – Photos des traces de sang déposées pour étudier la détection des antigènes A par dot blot

Sur du verre – grossissement 0.8x



XXI

F – Membranes LF-PVDF après dot blot

Groupe A – grossissement 0.8x

(a) bois (b) céramique

(c) papier filtre (d) tissu

(e) verre

XXIII

Annexes

Groupe AB – grossissement 0.8x



(e) verre

XXIV

F – Membranes LF-PVDF après dot blot

Groupe B – grossissement 0.8x



(e) verre

XXV

Annexes

Groupe O – grossissement 0.8x



(e) verre

XXVI

G – Sang dilué liquide vs. sec

Sang dilué liquide – grossissement 0,5x

(a) 0x (b) 2x (c) 5x (d) 10x

(e) 50x (f) 100x (g) 500x (h) 1’000x

(i) 5’000x (j) 10’000x

XXVII

Annexes

Sang dilué sec – grossissement 0,5x

(a) 0x (b) 2x (c) 5x

(d) 10x (e) 50x (f) 100x

(g) 500x (h) 1’000x (i) 5’000x

(j) 10’000x

XXVIII

H – Script ImageJ

Soustraction du bruit de fond

(a) résultat positif (A) – originale (b) rayon (pixel) : 0

(c) rayon (pixel) : 10 (d) rayon (pixel) : 20

(e) rayon (pixel) : 30 (f) rayon (pixel) : 40

(g) rayon (pixel) : 50 (h) rayon (pixel) : 60

(i) rayon (pixel) : 70 (j) rayon (pixel) : 80

(k) rayon (pixel) : 90 (l) rayon (pixel) : 100

Influence du rayon (en pixel) sur la soustraction du bruit de fond – contrôle positif

XXIX

Annexes

(a) résultat négatif (O) – originale (b) rayon (pixel) : 0

(c) rayon (pixel) : 10 (d) rayon (pixel) : 20

(e) rayon (pixel) : 30 (f) rayon (pixel) : 40

(g) rayon (pixel) : 50 (h) rayon (pixel) : 60

(i) rayon (pixel) : 70 (j) rayon (pixel) : 80

(k) rayon (pixel) : 90 (l) rayon (pixel) : 100

Influence du rayon (en pixel) sur la soustraction du bruit de fond – contrôle négatif

XXX

H – Script ImageJ

Seuil de niveau de gris

(a) résultat positif (A) – originale (b) 0-10 (c) 0-30

(d) 0-50 (e) 0-70 (f) 0-90

(g) 0-110 (h) 0-130 (i) 0-150

(j) 0-170 (k) 0-190 (l) 0-210

(m) 0-230 (n) 0-240 (o) 0-250

Influence du seuil de niveau de gris établi – contrôle positif

XXXI

Annexes

(a) résultat négatif (O) – originale (b) 0-10 (c) 0-30

(d) 0-50 (e) 0-70 (f) 0-90

(g) 0-110 (h) 0-130 (i) 0-150

(j) 0-170 (k) 0-190 (l) 0-210

(m) 0-230 (n) 0-240 (o) 0-250

Influence du seuil de niveau de gris établi – contrôle négatif

XXXII

H – Script ImageJ

Split channels

(a) originale (b) split blue

(c) split green (d) split red

Illustration de la commande split channel qui supprime les composantes bleue, rouge et verte d’une image

XXXIII

I – Tableau du plan d’expérience

Pan d’expérience réalisée à l’aide du logiciel Unscrambler® X10.1

(64-bit) pour évaluer les facteurs

#exp.nombre

Ac I(fois)

dessic-cateur(jour)

solubili-sation(min.)

forcecontact

(sec.)fixation(min.)

dilutionAc II

Ac II(min.)

ECL(min.)

1 8 1 2 -1 30 0 2’000 15 22 1 8 8 -1 2 0 2’000 15 153 8 8 2 1 2 0 500 15 24 1 1 2 -1 2 0 500 2 155 8 8 8 -1 30 0 500 2 26 1 1 8 -1 30 30 2’000 2 27 8 1 8 1 2 0 2’000 2 28 1 1 8 -1 30 30 2’000 2 29 4 4 5 0 16 15 1’000 8.5 8.510 8 8 2 1 2 0 500 15 211 4 4 5 0 16 15 1’000 8.5 8.512 4 4 5 0 16 15 1’000 8.5 8.513 8 1 2 1 30 30 500 2 1514 8 1 8 1 2 0 2’000 2 215 8 1 8 -1 2 30 500 15 1516 8 8 2 -1 2 30 2’000 2 1517 8 8 8 -1 30 0 500 2 218 1 1 2 1 2 30 2’000 15 219 1 8 8 -1 2 0 2’000 15 1520 1 1 2 -1 2 0 500 2 1521 1 8 8 1 2 30 500 2 222 8 1 8 -1 2 30 500 15 1523 1 1 8 1 30 0 500 15 1524 1 1 8 1 30 0 500 15 1525 1 8 2 1 30 0 2’000 2 1526 1 8 8 1 2 30 500 2 227 8 1 2 1 30 30 500 2 1528 1 8 2 -1 30 30 500 15 229 4 4 5 0 16 15 1’000 8.5 8.530 8 1 2 -1 30 0 2’000 15 231 1 1 2 1 2 30 2’000 15 232 4 4 5 0 16 15 1’000 8.5 8.533 8 8 2 -1 2 30 2’000 2 1534 1 8 2 1 30 0 2’000 2 1535 8 8 8 1 30 30 2’000 15 1536 8 8 8 1 30 30 2’000 15 1537 1 8 2 -1 30 30 500 15 2

XXXV

J – Traces de sang déposées pour l’application de la mé-

thode développée


(a) Groupe A (b) Groupe B (c) Groupe AB (d) Groupe O

XXXVII

Annexes

Sur du papier filtre – grossissement 0,5x



XXXVIII

J – Traces de sang déposées pour l’application de la méthode développée

Sur du plastique – grossissement 1x



XXXIX

Annexes

Sur du tissu – grossissement 0,8x



XL

J – Traces de sang déposées pour l’application de la méthode développée

Sur du verre – grossissement 0,8x



XLI

Annexes

Traces de sang de groupe B supplémentaire – grossissement 1x

(a) Bois (b) Papier filtre

(c) Plastique (d) Tissu

(e) Verre

XLII

K – Papiers filtres pour les traces de sang âgées d’un mois

Groupe A – bois – grossissement 0,5x

(a) 5 heures (b) 1 semaine (c) 2 semaines

(d) 3 semaines (e) 4 semaines

XLIII

Annexes

Groupe A – papier filtre – grossissement 0,5x



Groupe A –plastique – grossissement 0,5x



XLIV


Groupe A – tissu – grossissement 0,5x



Groupe A – verre – grossissement 0,5x



XLV

Annexes

Groupe AB – bois – grossissement 0,5x



Groupe AB – papier filtre – grossissement 0,5x



XLVI


Groupe AB – plastique – grossissement 0,5x



Groupe AB – tissu – grossissement 0,5x



XLVII

Annexes

Groupe AB – verre – grossissement 0,5x



XLVIII


Groupe B – bois – grossissement 0,5x



Groupe B – papier filtre – grossissement 0,5x



XLIX

Annexes

Groupe B – plastique – grossissement 0,5x



Groupe B – tissu – grossissement 0,5x



L


Groupe B – verre – grossissement 0,5x



Groupe B – donneurs supplémentaires – grossissement 0,5x

(a) bois (b) papier filtre (c) plastique

(d) tissu (e) verre

LI

Annexes

Groupe O – bois – grossissement 0,5x



Groupe O – papier filtre – grossissement 0,5x



LII


Groupe O – plastique – grossissement 0,5x



Groupe O – tissu – grossissement 0,5x



LIII

Annexes

Groupe O – verre – grossissement 0,5x



LIV

L – Traces de sang âgées de plus d’un mois

Grossissement 0.8xLes traces de sang datées de 235 jours ont été déposées sur du verre ; toutes les autres ont été déposées sur du plastique.

LV

M – Traces de sang déposées à l’aveugle

Photos des traces de sang déposées à l’aveugle – grossissement 1x

(a) #1 : plastique

(b) #2 : verre

(c) #3 : verre

LVII

Annexes

(d) #4 : tissu

(e) #5 : tissu

LVIII


(f) #6 : bois

(g) #7 : bois

(h) #8 : bois

LIX

Annexes

(i) #9 : bois

(j) #10 : tissu

LX


(k) #11 : plastique

(l) #12 : verre

(m) #13 : tissu

LXI

Annexes

(n) #14 : verre

(o) #15 : plastique

(p) #16 : bois

LXII


Conditions expérimentales des traces de sang déposées à l’aveugle

Numéro Support Nombre de traces Groupe sanguin Volume (µL) Jour de séchage

#1 plastique 21. B 25 162. A 25 16

#2 verre 21. AB 20 142. B 50 14

#3 verre 21. O 15 152. A 25 15

#4 tissu 21. A 65 142. O 10 14

#5 tissu 21. B 40 162. O 30 16

#6 bois 21. A 20 142. A+B 20+30 14

#7 bois 31. AB 10 172. A 25 173. A 5 17

#8 bois 31. B 40 152. AB 30 153. A 50 15

#9 bois 31. O 40 92. A 40 93. B 10 9

#10 tissu 21. A 80 102. AB 60 10

#11 plastique 21. A 40 102. O 30 10

#12 verre 31. A 10 12. O 50 13. AB 60 1

#13 tissu 4

1. AB 10 12. B 70 13. AB 10 14. O 50 1

#14 verre 21. B 50 102. AB 15 10

#15 plastique 21. A+B 10+60 92. AB 30 9

#16 bois 31. A 50 12. O+B 50+30 13. A 30 1

Tableau M1

LXIII

Annexes

Résultats de l’analyse des traces de sang déposées à l’aveugle

Numéro du support Support Groupe sanguin Réponse donnée

#1 plastique1. B +2. A +

#2 verre1. AB +2. B –

#3 verre1. O –2. A +

#4 tissu1. A n.d.

2. O n.d.

#5 tissu1. B n.d.

2. O n.d.

#6 bois1. A +

2. A+B –

#7 bois1. AB –2. A +3. A +

#8 bois1. B –

2. AB –3. A +

#9 bois1. O –2. A +3. B –

#10 tissu1. A –

2. AB –

#11 plastique1. A +2. O –

#12 verre1. A +2. O –

3. AB +

#13 tissu

1. AB n.d.

2. B –3. AB n.d.

4. O n.d.

#14 verre1. B –

2. AB +

#15 plastique1. A+B +2. AB +

#16 bois1. A +

2. O+B –3. A –

Tableau M2Dans la colonne « réponse donnée », le + signifie que l’interprétation de la réponse colorimétrique observée sur le papier filtre a été

attribuée à une réponse positive, soit à la présence de l’antigène A ; le – signifie une réponse négative ; n.d. signifie « non déterminée » ;la couleur verte de la cellule indique que l’interprétation de la coloration est correcte ; la couleur rouge indique qu’elle est erronée.

LXIV


Papiers filtres des traces de sang déposées à l’aveugle –

grossissement 0,5x

(a) #1 (b) #2 (c) #3 (d) #4

(e) #5 (f) #6 (g) #7 (h) #8

(i) #9 (j) #10 (k) #11 (l) #12

(m) #13 (n) #14 (o) #15 (p) #16

LXV

N – Conditionnement du kit pour des lieux

(a) matériel de base : eau déionisée (manquante sur la photo), pince, pipettes plastiques, poubelle

(b) papiers filtres imbibés d’anticorps primaires avec billes de silice

(c) tubes contenant la solution d’anticorps secondaires

LXVII

Annexes

(d) tubes contenant la solution d’immunodétection ECL-AP

(e) blocs de glace

(f) ensemble du kit

LXVIII

O – Fiches de données de sécurité

Anticorps primaires

Merck KGaA - Frankfurter Stra�e 250 - 64293 Darmstadt - Germany -

Merck KGaA

Frankfurter Stra�e 250 � 64293 Darmstadt

PO-Box � 64271 Darmstadt

Phone. +49 6151 72-0 / Fax +49 6151 72-2000

www.merck.de

Partnership limited by shares

Commercial Register AG Darmstadt HRB 6164

Registered Office: Darmstadt

Chairman of the Supervisory Board: Wolfgang

B�chele

Executive Board and General Partners :

Stefan Oschmann (Chairman),

Bel�n Garijo, Udit Batra, Walter Galinat, Kai

Beckmann, Marcus Kuhnert

Date: 29.03.2017

Division/Dept. EQ-R Safety Data

Care of: Carlos Nussbaum

Phone: +49615172-2775

Fax: +49615172-90775

E-Mail: [email protected]

Code produit 619553

Nom du produit TL, Anti-A Reagent 10x10mL UNLABELLED

Ce produit n'est pas une substance dangereuse et elle ne contient pas d'ingr�dients dangereux, pas de

substances avec des valeurs limites d'exposition communautaires europ�ennes au poste de travail ni de

substances extr�mement pr�occupantes (SVHC) en quantit�s sup�rieures � leurs valeurs limites respectives de

d�claration. Donc une fiche de donn�es de s�curit� n'est pas exig�e conform�ment au R�glement (CE) No.

1907/2006 (REACH) et dans ce cas aucune n'est disponible.

Les informations ont �t� g�n�r�es par EDP et elles ne portent pas de signature.

LXIX

Safety Datasheet Product Name: Rabbit anti-Mouse IgM Antibody [Alkaline Phosphatase] Reviewed on: 3/16/15

NBP1-72685

1. Identification of Substance:

� Other means of identification: Catalog Number NBP1-72685

0.1% Sodium Azide � GHS product identifier: Rabbit anti-Mouse IgM Antibody [Alkaline Phosphatase] � Application of the substance / the preparation: For Research Use Only � Manufacturer/Supplier:

Novus Biologicals, LLC. 8100 Southpark Way, A-8 Littleton, CO 80120 USA

1-888-506-6887 � For product related questions call: 1-888-506-6887. In Europe call: +44(0)1235-529449. � Emergency information: In case of a chemical emergency, spill, leak, fire, or accident call CHEMTREC at 1-800-424-9300

(US or Canada). Outside USA and Canada: +1 703-527-3887 (collect calls accepted).

2. Hazards Identification:

� Classification: Regulation (EC) No. 1272/2008 [CLP/GHS]: Sodium Azide

Acute Tox. 2, Oral Aquatic Acute 1 Aquatic Chronic 1

� Signal Word: DANGER

� Hazard Statement(s): H300: Fatal if swallowed. H410 Harmful to aquatic life with long lasting effects. � Precautionary Statement(s): P264: Wash hands thoroughly after handling. P270: Do not eat, drink or smoke when using this

product. P273: Avoid release to the environment. � Response:

IF SWALLOWED: Immediately call a POISON CONTROL Center or physician. See specific treatment in this SDS. Rinse mouth. IF ON SKIN: Remove immediately all contaminated clothing. Wash contaminated clothing before reuse. Call a POISON CONTROL center or physician. IF INHALED: Remove victim to fresh air and keep at rest in a position comfortable for breathing. Call a POISON CONTROL center or physician. COLLECT SPILLAGE.

� Classification according to Directive 67/548/EEC: T+: Very toxic. N: Dangerous for the environment. � R-phrases: R28: Very toxic if swallowed. R32: Contact with acids liberates very toxic gas. R50/53 Very toxic to aquatic organisms,

may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. � S-phrases: S1/2: Keep locked up and out of reach of children. S28: After contact with skin, wash immediately with plenty of water.

S45: In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately (show the label where possible). S60: This material and its container much be disposed of as hazardous waste. S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/safety data sheet.

� Other Hazards: Contact with acids liberates very toxic gas.

3. Information on Ingredients:

Contains EINECS CAS No. Content %

Sodium Azide 247-852-1 26628-22-8 0.1% to 0.5%

4. First Aid Measures:

Safety Datasheet Product Name: Rabbit anti-Mouse IgM Antibody [Alkaline Phosphatase] Reviewed on: 3/16/15 � After inhalation: Supply fresh air; consult doctor in case of

complaints. � After skin contact: Immediately wash with water and soap and rinse thoroughly. Generally the product does not irritate the skin. � After eye contact: Rinse opened eye for several minutes under running water. Then consult a doctor. � After swallowing: Rinse mouth with water. Immediately seek medical attention and appropriate follow-up.

5. Fire Fighting Measures:

� Suitable extinguishing agents: Any means suitable for extinguishing the surrounding area. � Specific hazards arising from the chemical: Dangerous decomposition is not anticipated. � Protective equipment: Wear appropriate protective clothing and a self-contained breathing apparatus if necessary.

6. Accidental Release Measures:

� Person-related safety precautions: Avoid breathing vapors, mist or gas. Ensure adequate ventilation. � Measures for environmental protection: Prevent further spillage or leakage if safe to do so. Do not let product enter drains.

Discharge into the environment must be avoided. � Measures for containment and cleaning: Absorb liquid components with inert liquid-binding material. Pick up mechanically.

Dispose contaminated material as waste according to item 13.

7. Handling and Storage:

� Precautions for safe handling: Store in a well ventilated place. Keep container tightly closed. � Information about protection against explosions and fires: Normal measures for preventive fire protection. � Conditions for safe storage: Keep locked up. Store in a cool place. Keep container tightly closed in a dry and well ventilated

place.

8. Exposure Controls and Personal Protection:

� Components: Sodium Azide UK. EH40 WEL- Workplace Exposure Limits: Value: STEL 0.3 mg/m

3 (15 min. ). TWA 0.1 mg/m

3; UK.

� Appropriate engineering controls: Follow usual standard laboratory practices. The following personal protection is

recommended: Respiratory Protection: Respiratory Protection not required. For nuisance exposures use respirators and components

approved under appropriate government standards. Hand Protection: Handle with gloves. Dispose of contaminated gloves after use in accordance with applicable laws

and good laboratory practices. Eye Protection: Use equipment for eye protection tested and approved under appropriate government standards. Skin and Body Protection: Use impervious clothing. The type of protective equipment must be selected according to the

concentration and amount of the dangerous substance at the specific workplace. Hygiene Measures: Handle in accordance with good industrial hygiene and safety practice. Wash hands before breaks

and at the end of the workday.

9. Physical and Chemical Properties:

� Appearance: Lyophilized white powder or clear liquid. Upper/lower flammability or explosive limits: Not available. � Odor: Little to none Vapor pressure/density: Not available. � Odor threshold: Not available Relative Density: Not available. � pH: Not available Solubility in/Miscibility with Water: Not available. � Melting point/freezing point: Not available. Partition coefficient: noctanol/water: Not available � Boiling point/Boiling range: Not available. Auto igniting: Product is not self igniting. � Flash point: Not available. Decomposition temperature: Not available. � Evaporation rate: Undetermined. Viscosity: Not available. � Flammability: Not available.


10. Stability and Reactivity:

� Reactivity: Sodium Azide can form explosive compounds with heavy metals which, with repeated contact with lead and copper

commonly found in plumbing drains may result in the buildup of shock sensitive compounds. � Chemical Stability: Stable under normal ambient and storage and handling temperatures. � Thermal: decomposition/conditions to be avoided: No decomposition if used according to specifications. � Incompatible materials to be avoided: Metals and metallic compounds. � Hazardous decomposition products: Hazardous decompositions formed under fire conditions. No dangerous decomposition

products known.

11. Toxicological Information:

� Acute toxicity: Oral LD50 Oral: 27 mg/kg (mouse and rat); Inhalation LD50: 32 mg/m3 (mouse) and 37 mg/m3

(rat); Skin LD50: 20 mg/kg (rabbit) and 50 mg/kg (rat)

� Skin corrosion / irritation: May be harmful if absorbed through the skin. May cause skin irritation. � Serious eye damage / irritation: May cause eye irritation. � Respiratory or skin sensitization: No sensitizing effects known. � Germ cell mutagenicity: No effect known. � Carcinogenicity: No effect known. � Reproductive toxicity: No toxic effect known. � STOT-single exposure: Data not available � STOT-repeated exposure: Data not available. � Aspiration hazard: May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation.

� Additional Information: RTECS: Not available

12. Ecological Information:

� Ecotoxicity: Harmful to aquatic life. LC50, 96 Hrs, Fish Lepomis macrochirus - 0.68 mg/L; EC50, 48 Hrs, Daphnia pulex - 4.2

mg/L � Persistence and degradability: No data available � Bioaccumulative potential: No data available� Mobility in soil: Sodium azide is soluble in water. � Other adverse effects: Sodium azide is toxic to aquatic organisms and may cause long term adverse effects in the aquatic

environment.

13. Disposal Considerations:

� Disposal methods: Dispose of waste in accordance to applicable national, regional, or local regulations. � Contaminated packaging: Dispose in the same manner as unused product. � Special precautions: Dispose of small amounts of spilled material as described in section 6. Large spills must be dealt with

separately by qualified disposal personnel. Avoid dispersal of spilt material to soil, waterways, drains and sewers.

14. Transport Information:

� ADR/RID ADN/ADNR IMDG IATA/DOT ADR/DOT/: UN Number: UN3082 RID Proper Shipping Name: Environmentally hazardous substance, liquid, n.o.s. (Sodium Azide) Hazard class: 9 Packing group: III

IATA: UN Number: UN3082 Proper Shipping Name: Environmentally hazardous substance, liquid, n.o.s. (Sodium Azide) Hazard class: 9 Packing group: III


IMDG: UN Number: UN3082 Proper Shipping Name: Environmentally hazardous substance, liquid, n.o.s. (Sodium Azide)

Hazard class: 9 Packing group: III

Marine Pollutant: No

15. Regulations:

� US Federal and State Regulations TSCA (Toxic Substances Control Act): Sodium Azide is listed. SARA 313: Sodium Azide is listed. SARA 311/312 Hazards: Acute Health Hazard CERCLA Reportable Quantity: 1000 lbs.

California Proposition 65: Sodium Azide is not listed on California’s listing of known or potential carcinogens.

16. Other Information:

� R-phrases: R28: Very toxic if swallowed. R32: Contact with acids liberates very toxic gas. R50/53 Very toxic to aquatic organisms,

may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. � S-phrases: S1/2: Keep locked up and out of reach of children. S28: After contact with skin, wash immediately with plenty of water.

S45: In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately (show the label where possible). S60: This material and its container much be disposed of as hazardous waste. S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/safety data sheet.

� Other Hazards: Contact with acids liberates very toxic gas.

� Notice to reader: To the best of our knowledge, the information contained herein is accurate. However, neither the above-named

supplier, nor any of its subsidiaries, assumes any liability whatsoever for the accuracy or completeness of the information contained herein. Final determination of suitability of any material is the sole responsibility of the user. All materials may present unknown hazards and should be used with caution. Although certain hazards are described herein, we cannot guarantee that these are the only hazards that exist.

Annexes

Anticorps secondaires

LXX

Sigma-Aldrich- P1379 Page 1 de 7 The life science business of Merck operates as MilliporeSigma in the US and Canada

FICHE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ conformément au Règlement (CE) No. 1907/2006

Version 6.1 Date de révision 29.01.2019

Date d'impression 11.05.2019 RUBRIQUE 1: Identification de la substance/du mélange et de la société/l'entreprise

1.1 Identificateurs de produit Nom du produit : TWEEN® 20

Code Produit : P1379 Marque : Sigma-Aldrich No REACH : Pas de numéro d'enregistrement disponible pour cette

substance car cette substance ou ses usages sont exempts d'enregistrement, le tonnage annuel ne nécessite pas d'enregistrement ou bien l'enregistrement est prévu pour une date ultérieure

No.-CAS : 9005-64-5

1.2 Utilisations identifiées pertinentes de la substance ou du mélange et utilisations déconseillées

Utilisations identifiées : Substances chimiques de laboratoire, Fabrication de substances

1.3 Renseignements concernant le fournisseur de la fiche de données de sécurité

Société : Sigma-Aldrich Chemie GmbH Industriestrasse 25 CH-9471 BUCHS

Téléphone : +41 81 755 2511 Fax : +41 81 756 5449

1.4 Numéro d'appel d'urgence

Numéro d'Appel d'Urgence

: +41 43-508-2011 (CHEMTREC) +41 44-251-5151 (Tox-Zentrum) 145(CH)

RUBRIQUE 2: Identification des dangers

2.1 Classification de la substance ou du mélange N'est pas une substance ni un mélange dangereux conformément au règlement (CE) No. 1272/2008.

2.2 Éléments d'étiquetage

N'est pas une substance ni un mélange dangereux conformément au règlement (CE) No. 1272/2008.

2.3 Autres dangers - aucun(e)


RUBRIQUE 3: Composition/informations sur les composants

3.1 Substances Synonymes : Polyoxyethylenesorbitan monolaurate

Polyethylene glycol sorbitan monolaurate

Formule : C58H114O26

No.-CAS : 9005-64-5 No.-CE : 500-018-3 Conformément à la réglementation, il n'est pas nécessaire de mentionner tous les composants.

RUBRIQUE 4: Premiers secours

4.1 Description des premiers secours

En cas d'inhalation En cas d'inhalation, transporter la personne hors de la zone contaminée. En cas d'arrêt respiratoire, pratiquer la respiration artificielle.

En cas de contact avec la peau Laver au savon avec une grande quantité d'eau.

En cas de contact avec les yeux Rincer les yeux à l'eau par mesure de précaution.

En cas d'ingestion Ne jamais rien faire avaler à une personne inconsciente. Se rincer la bouche à l'eau.

4.2 Principaux symptômes et effets, aigus et différés Les principaux symptômes et effets connus sont décrits sur l'étiquetage (voir section 2.2) et/ou section 11

4.3 Indication des éventuels soins médicaux immédiats et traitements particuliers nécessairesDonnée non disponible

RUBRIQUE 5: Mesures de lutte contre l'incendie

5.1 Moyens d'extinction

Moyens d'extinction appropriés Pulvériser de l'eau ou utiliser de la mousse résistant à l'alcool, de la poudre sèche ou du dioxyde de carbone.

5.2 Dangers particuliers résultant de la substance ou du mélange

5.3 Conseils aux pompiers Porter un appareil de protection respiratoire autonome pour la lutte contre l'incendie, si nécessaire.

5.4 Information supplémentaire Donnée non disponible


RUBRIQUE 6: Mesures à prendre en cas de dispersion accidentelle

6.1 Précautions individuelles, équipement de protection et procédures d'urgence Éviter de respirer les vapeurs, les brouillards de pulvérisation ou les gaz. Équipement de protection individuel, voir section 8.

6.2 Précautions pour la protection de l'environnement Pas de précautions spéciales pour l'environnement requises.

6.3 Méthodes et matériel de confinement et de nettoyage Conserver dans des récipients adaptés et fermés pour l'élimination.

6.4 Référence à d'autres rubriques Pour l'élimination, voir section 13.

RUBRIQUE 7: Manipulation et stockage

7.1 Précautions à prendre pour une manipulation sans danger Pour les précautions, voir section 2.2

7.2 Conditions d'un stockage sûr, y compris d'éventuelles incompatibilités Entreposer dans un endroit frais. Tenir le récipient bien fermé dans un endroit sec et bien aéré.

7.3 Utilisation(s) finale(s) particulière(s) Hormis les utilisations mentionnées à la section 1.2, aucune autre utilisation spécifique n'est prévue

RUBRIQUE 8: Contrôles de l'exposition/protection individuelle

8.1 Paramètres de contrôle

Composants avec valeurs limites d'exposition professionnelleNe contient pas de substances avec des valeurs limites d'exposition professionnelle.

8.2 Contrôles de l'exposition

Contrôles techniques appropriés Pratiques générales d'hygiène industrielle.

Équipement de protection individuelle

Protection des yeux/du visage Utilisez un équipement de protection des yeux, testé et approuvé selon normes gouvernementales en vigueur, telles que NIOSH (US) or EN 166(EU).

Protection de la peau Manipuler avec des gants. Les gants doivent être contrôlés avant l'utilisation. Utiliser une technique de retrait des gants appropriée afin d'éviter que la peau entre en contact avec le produit (i.e. sans toucher la surface extérieure du gant ). Jeter les gants contaminés après l'utilisation conformément aux lois en vigueur et aux bonnes pratiques de laboratoire. Laver et Sécher les mains. Les gants de protection sélectionnés doivent satisfaire aux spécifications de la Directive 2016/425 (UE) et à la norme EN 374 qui en dérive. Contact total Matériel: Caoutchouc nitrile épaisseur minimum: 0,11 mm Délai de rupture: 480 min Matériel testé :Dermatril® (KCL 740 / Aldrich Z677272, Taille M) Contact par éclaboussures


Matériel: Caoutchouc nitrile épaisseur minimum: 0,11 mm Délai de rupture: 480 min Matériel testé :Dermatril® (KCL 740 / Aldrich Z677272, Taille M) Source des données: KCL GmbH, D-36124 Eichenzell, Téléphone +49 (0)6659 87300, e-mail [email protected], Methode test: EN374 En cas d'utilisation en solution ou en mélange avec d'autres substances, et dans des conditions qui diffèrent de la norme EN 374, contacter le fournisseur des gants homologués CE. Cette recommandation est purement consultative et doit être évaluée par un responsable hygiène et sécurité, familiarisé avec la situation spécifique de l'utilisation prévue par nos clients. Ceci ne doit pas être interprété comme une approbation dans un quelconque scenario d'utilisation. Protection du corps Vêtements étanches, Le type d'équipement de protection doit être sélectionné en fonction de la concentration et de la quantité de la substance dangereuse au lieu de travail.

Protection respiratoire Protection respiratoire non exigée. Cartouches respiratoires conseillées en cas d'exposition: type OV/AG (US) ou de type ABEK (EU EN 14387). Utiliser du matériel testé et approuvé par des normes telles que NIOSH (US) ou CEN (EU).

Contrôle de l'exposition de l'environnement Pas de précautions spéciales pour l'environnement requises.

RUBRIQUE 9: Propriétés physiques et chimiques

9.1 Informations sur les propriétés physiques et chimiques essentielles

a) Aspect Forme: visqueux

b) Odeur Donnée non disponible

c) Seuil olfactif Donnée non disponible

d) pH 7

e) Point de fusion/point de congélation

Donnée non disponible

f) Point initial d'ébullition et intervalle d'ébullition

> 100 °C

g) Point d'éclair > 110 °C - coupelle fermée

h) Taux d'évaporation Donnée non disponible

i) Inflammabilité (solide, gaz)


j) Limites supérieure/inférieure d'inflammabilité ou d'explosivité


k) Pression de vapeur < 1,00 mmHg

l) Densité de vapeur Donnée non disponible

m) Densité relative 1,095 g/mL à 25 °C


Tween® 20

LXXI


n) Hydrosolubilité soluble

o) Coefficient de partage: n-octanol/eau


p) Température d'auto-inflammabilité


q) Température de décomposition


r) Viscosité Donnée non disponible

s) Propriétés explosives Donnée non disponible

t) Propriétés comburantes


9.2 Autres informations concernant la sécurité Donnée non disponible

RUBRIQUE 10: Stabilité et réactivité

10.1 Réactivité Donnée non disponible

10.2 Stabilité chimique Stable dans les conditions recommandées de stockage.

10.3 Possibilité de réactions dangereuses Donnée non disponible

10.4 Conditions à éviter Donnée non disponible

10.5 Matières incompatibles Oxydants forts

10.6 Produits de décomposition dangereux Des produits de décomposition dangereux se forment en cas de feu. - Oxydes de carbone Autres produits de décomposition - Donnée non disponible En cas d'incendie : voir section 5

RUBRIQUE 11: Informations toxicologiques

11.1 Informations sur les effets toxicologiques

Toxicité aiguë DL50 Oral(e) - Rat - 40.554,0 mg/kg

Corrosion cutanée/irritation cutanée Peau - Humain Résultat: Irritation légère de la peau - 3 jr

Lésions oculaires graves/irritation oculaire Donnée non disponible

Sensibilisation respiratoire ou cutanée Donnée non disponible

Mutagénicité sur les cellules germinales Donnée non disponible


Cancérogénicité Donnée non disponible

IARC: Aucun composant de ce produit présent à des concentrations plus grandes que ou égales à 0,1% n'a été identifié comme cancérigène probable, possible ou reconnu pour l'homme par IARC.

Toxicité pour la reproduction Donnée non disponible

Toxicité spécifique pour certains organes cibles - exposition unique Donnée non disponible

Toxicité spécifique pour certains organes cibles - exposition répétée Donnée non disponible

Danger par aspiration Donnée non disponible

Information supplémentaire RTECS: TR7400000 ��complètement étudiées.

RUBRIQUE 12: Informations écologiques

12.1 Toxicité Toxicité pour les poissons

CL50 - autre poisson - 350 mg/l - 24 h

12.2 Persistance et dégradabilité Donnée non disponible

12.3 Potentiel de bioaccumulation Donnée non disponible

12.4 Mobilité dans le sol Donnée non disponible

12.5 Résultats des évaluations PBT et vPvB L'évaluation du caractère PBT / vPvB n'est pas disponible car l'évaluation de la sécurité chimique n'est pas requise / n'est pas menée

12.6 Autres effets néfastes Donnée non disponible

RUBRIQUE 13: Considérations relatives à l'élimination

13.1 Méthodes de traitement des déchets

Produit Remettre les excédents et les solutions non recyclables à une entreprise d'élimination des déchets agréée.

Emballages contaminés Eliminer comme produit non utilisé.


RUBRIQUE 14: Informations relatives au transport

14.1 Numéro ONU ADR/RID: - IMDG: - IATA: -

14.2 Désignation officielle de transport de l'ONU ADR/RID: Marchandise non dangereuse IMDG: Not dangerous goods IATA: Not dangerous goods

14.3 Classe(s) de danger pour le transport ADR/RID: - IMDG: - IATA: -

14.4 Groupe d'emballage ADR/RID: - IMDG: - IATA: -

14.5 Dangers pour l'environnement ADR/RID: non IMDG Polluant marin: non IATA: non

14.6 Précautions particulières à prendre par l'utilisateur Donnée non disponible

RUBRIQUE 15: Informations relatives à la réglementation

15.1 Réglementations/législation particulières à la substance ou au mélange en matière de sécurité, de santé et d'environnement

Cette fiche de données de sécurité est conforme aux exigences du Règlement (CE) No. 1907/2006.

15.2 Évaluation de la sécurité chimique Pour ce produit, aucune évaluation de la sécurité chimique n'a été réalisée

RUBRIQUE 16: Autres informations

Information supplémentaire Copyright 2018 Sigma-Aldrich Co. LLC. Copies en papier autorisées pour usage interne uniquement. Les informations ci-dessus ont été préparées sur la base des renseignements disponibles les plus sûrs. Elles ne prétendent pas être exhaustives et devront être considerées comme un guide. Le groupe Sigma-Aldrich, ne pourra être tenu responsable des dommages résultant de l'utilisation ou de tout contact avec le produit sus-mentionné. Voir verso de la facture ou du bulletin de livraison pour nos termes et conditions de vente. La marque présente en en-tête et/ou en pied de page de ce document peut différer visuellement de celle figurant sur le produit acheté, car nous sommes en phase de mise ��document qui concernent le produit demeurent inchangées et correspondent au produit commandé. Pour de plus amples informations, veuillez contacter [email protected].

Annexes

LXXII

Page : 1/6

Fiche de données de sécuritéselon 1907/2006/CE, Article 31

Date d'impression : 11.06.2015 Révision: 11.06.2015

40.1.5

SECTION 1: Identification de la substance/du mélange et de la société/l'entreprise

· 1.1 Identificateur de produit

· Nom du produit 10X TBS

· Code du produit 1706435, 9702901, 1706435EDU, 9703155· 1.2 Utilisations identifiées pertinentes de la substance ou du mélange et utilisations déconseilléesPas d'autres informations importantes disponibles.· Emploi de la substance / de la préparation Produits chimiques pour laboratoires

· 1.3 Renseignements concernant le fournisseur de la fiche de données de sécurité· Producteur/fournisseur :Bio-Rad Laboratories AGPra Rond 23CH-1785 CressierSwitzerland phone: +41-(0)26 674 55 05/06 fax: +41 26 674 52 19

· Service chargé des renseignements :Département sécurité du [email protected]· 1.4 Numéro d'appel d'urgence: 41-61-719555

* SECTION 2: Identification des dangers

· 2.1 Classification de la substance ou du mélange· Classification selon le règlement (CE) n° 1272/2008Skin Irrit. 2 H315 Provoque une irritation cutanée.

Eye Irrit. 2 H319 Provoque une sévère irritation des yeux.

· 2.2 Éléments d'étiquetage· Etiquetage selon le règlement (CE) n° 1272/2008 Le produit est classifié et étiqueté selon le règlement CLP.· Pictogrammes de danger

GHS07

· Mention d'avertissement Attention· Mentions de dangerH315 Provoque une irritation cutanée.H319 Provoque une sévère irritation des yeux.· Conseils de prudenceP280 Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/du

visage.P264 Se laver soigneusement après manipulation.P305+P351+P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes.

Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées.Continuer à rincer.

P362 Enlever les vêtements contaminés et les laver avant réutilisation.P332+P313 En cas d'irritation cutanée: consulter un médecin.P337+P313 Si l'irritation oculaire persiste: consulter un médecin.· 2.3 Autres dangers· Résultats des évaluations PBT et vPvB· PBT: Non applicable.

(suite page 2)

CH/FR

Page : 2/6



Nom du produit 10X TBS

(suite de la page 1)

40.1.5

· vPvB: Non applicable.

SECTION 3: Composition/informations sur les composants

· 3.2 Caractérisation chimique: Mélanges· Description : Mélange effectué à partir des matériaux mentionnés ci - après et avec des additifs non dangereux

· Composants contribuant aux dangers:CAS: 7647-14-5EINECS: 231-598-3

chlorure de sodium Skin Irrit. 2, H315; Eye Irrit. 2, H319 20-35%

CAS: 77-86-1EINECS: 201-064-4

trométamol Eye Irrit. 2, H319 1,0-2,5%

· Indications complémentaires : Pour le libellé des phrases de risque citées, se référer au chapitre 16.

* SECTION 4: Premiers secours

· 4.1 Description des premiers secours· après inhalation : Donner de l'air frais, consulter un médecin en cas de troubles.· après contact avec les yeux : Lavage avec de l'eau en écartant les paupières plusieurs minutes.· après ingestion : Faire vomir et demander d'urgence une assistance médicale· 4.2 Principaux symptômes et effets, aigus et différés Pas d'autres informations importantes disponibles.· 4.3 Indication des éventuels soins médicaux immédiats et traitements particuliers nécessairesPas d'autres informations importantes disponibles.

* SECTION 5: Mesures de lutte contre l'incendie

· 5.1 Moyens d'extinction·Moyens d'extinction:CO2, poudre d'extinction ou eau pulvérisée. Combattre les foyers importants par de l'eau pulvérisée ou de la mousserésistant à l'alcool.· 5.2 Dangers particuliers résultant de la substance ou du mélange Pas d'autres informations importantes disponibles.· 5.3 Conseils aux pompiers· Equipement spécial de sécurité : Aucune mesure particulière n'est requise.

SECTION 6: Mesures à prendre en cas de dispersion accidentelle

· 6.1 Précautions individuelles, équipement de protection et procédures d'urgencePorter un vêtement personnel de protection· 6.2 Précautions pour la protection de l'environnement: Aucune mesure particulière n'est requise.· 6.3 Méthodes et matériel de confinement et de nettoyage:Recueillir les liquides à l'aide d'un produit absorbant (sable, kieselguhr, neutralisant d'acide, liant universel, sciure).· 6.4 Référence à d'autres sectionsAfin d'obtenir des informations sur une manipulation sûre, consulter le chapitre 7Afin d'obtenir des informations sur les équipements de protection personnels, consulter le chapitre 8Afin d'obtenir des informations sur l'élimination, consulter le chapitre 13

CH/FR

(suite page 3)

Page : 3/6





40.1.5

* SECTION 7: Manipulation et stockage

· 7.1 Précautions à prendre pour une manipulation sans danger Aucune mesure particulière n'est requise.· Préventions des incendies et des explosions: Aucune mesure particulière n'est requise.

· 7.2 Conditions d'un stockage sûr, y compris d'éventuelles incompatibilités· Stockage :· Exigences concernant les lieux et conteneurs de stockage : selon désignation produit· Indications concernant le stockage commun : non nécessaire· Autres indications sur les conditions de stockage : néant· 7.3 Utilisation(s) finale(s) particulière(s) Pas d'autres informations importantes disponibles.

* SECTION 8: Contrôles de l'exposition/protection individuelle

· Indications complémentaires pour l'agencement des installations techniques : Sans autre indication, voir point 7.

· 8.1 Paramètres de contrôle· Composants présentant des valeurs-seuil à surveiller par poste de travail :Le produit ne contient pas en quantité significative des substances présentant des valeurs-seuil à surveiller par poste detravail.· Indications complémentaires : Le présent document s'appuie sur les listes en vigueur au moment de son élaboration.

· 8.2 Contrôles de l'exposition· Equipement de protection individuel :· Mesures générales de protection et d'hygiène : Se laver les mains avant les pauses et en fin de travail.· Protection respiratoire : non nécessaire.· Protection des mains : Gants de protection.· Matériau des gants Gants en caoutchouc synthétique· Temps de pénétration du matériau des gantsLe temps de pénétration exact est à déterminer par le fabricant des gants de protection et à respecter.· Protection des yeux : Lunettes de protection.

SECTION 9: Propriétés physiques et chimiques

· 9.1 Informations sur les propriétés physiques et chimiques essentielles· Indications générales.· Aspect:

Forme : liquideCouleur : incolore

· Odeur : Inodore· Seuil olfactif: Non déterminé.

· valeur du pH: Non déterminé.

· Modification d'étatPoint de fusion : non déterminéPoint d'ébullition : non déterminé

· Point d'éclair : non applicable

· Inflammabilité (solide, gazeux) : Non applicable.

(suite page 4)

CH/FR

Page : 4/6





40.1.5

· Température d'inflammation :

Température de décomposition : Non déterminé.

· Auto-imflammation : Le produit ne s'enflamme pas spontanément.

· Danger d'explosion : Le produit n'est pas explosif.

· Limites d'explosion :inférieure : Non déterminé.supérieure : Non déterminé.

· Pression de vapeur à 20 °C: 23 hPa

· Densité à 20 °C: 1,17958 g/cm³· Densité relative. Non déterminé.· Densité de vapeur. Non déterminé.· Vitesse d'évaporation. Non déterminé.

· Solubilité dans/miscibilité avecl'eau : entièrement miscible

· Coefficient de partage (n-octanol/eau) : Non déterminé.

· Viscosité :dynamique : Non déterminé.cinématique : Non déterminé.

· Teneur en solvants :solvants organiques 0,0 %eau : 68,4 %

Teneur en substances solides : 31,6 %· 9.2 Autres informations Pas d'autres informations importantes disponibles.

SECTION 10: Stabilité et réactivité

· 10.1 Réactivité· 10.2 Stabilité chimique· Décomposition thermique / conditions à éviter : Pas de décomposition en cas d'usage conforme.· 10.3 Possibilité de réactions dangereuses Aucune réaction dangereuse connue· 10.4 Conditions à éviter Pas d'autres informations importantes disponibles.· 10.5 Matières incompatibles: Pas d'autres informations importantes disponibles.· 10.6 Produits de décomposition dangereux: Pas de produits de décomposition dangereux connus

* SECTION 11: Informations toxicologiques

· 11.1 Informations sur les effets toxicologiques· Toxicité aiguë :· Effet primaire d'irritation :· de la peau : Irrite la peau et les muqueuses.· des yeux : Effet d'irritation.

(suite page 5)

CH/FR


TBS – Tris-Buffred Saline

LXXIII

Page : 5/6





40.1.5

· Sensibilisation : Aucun effet de sensibilisation connu.

SECTION 12: Informations écologiques

· 12.1 Toxicité· Toxicité aquatique : Pas d'autres informations importantes disponibles.· 12.2 Persistance et dégradabilité Pas d'autres informations importantes disponibles.· 12.3 Potentiel de bioaccumulation Pas d'autres informations importantes disponibles.· 12.4 Mobilité dans le sol Pas d'autres informations importantes disponibles.· Autres indications écologiques :· Indications générales : En général non polluant· 12.5 Résultats des évaluations PBT et VPVB· PBT: Non applicable.· vPvB: Non applicable.· 12.6 Autres effets néfastes Pas d'autres informations importantes disponibles.

SECTION 13: Considérations relatives à l'élimination

· 13.1 Méthodes de traitement des déchets· Recommandation :Remettre à la collecte de déchets toxiques ou apporter à la déchetterie pour déchets dangereux.Ne doit pas être évacué avec les ordures ménagères. Ne pas laisser pénétrer dans les égouts.

· Emballages non nettoyés :· Recommandation : Evacuation conformément aux prescriptions légales.

SECTION 14: Informations relatives au transport

· 14.1 No ONU· ADR, ADN, IMDG, IATA néant

· 14.2 Nom d'expédition des Nations unies· ADR, ADN, IMDG, IATA néant

· 14.3 Classe(s) de danger pour le transport

· ADR, ADN, IMDG, IATA· Classe néant

· 14.4 Groupe d'emballage· ADR, IMDG, IATA néant

· 14.5 Dangers pour l'environnement:· Polluant marin : Non

· 14.6 Précautions particulières à prendre par l'utilisateur Non applicable.

· 14.7 Transport en vrac conformément à l'annexe II de laconvention Marpol 73/78 et au recueil IBC Non applicable.

(suite page 6)

CH/FR

Page : 6/6





40.1.5

· "Règlement type" de l'ONU: -

* SECTION 15: Informations réglementaires

· 15.1 Réglementations/législation particulières à la substance ou au mélange en matière de sécurité, de santé etd'environnement

· Prescriptions nationales :

· Classe de pollution des eaux : En général non polluant· 15.2 Évaluation de la sécurité chimique: Une évaluation de la sécurité chimique n'a pas été réalisée.

SECTION 16: Autres informationsCes indications sont fondées sur l'état actuel de nos connaissances, mais ne constituent pas une garantie quant auxpropriétés du produit et ne donnent pas lieu à un rapport juridique contractuel.

· Service établissant la fiche technique : Environmental Health and Safety.· Contact :If a Diagnostic Group product. If a Life Science Research product.Environmental Health and Safety Environmental Health and Safety4000 Alfred Nobel Drive 2000 Alfred Nobel DriveHercules, CA 94547, USA Hercules, CA 94547, USA1(510) 724-7000 1(510) 741-1000· Acronymes et abréviations:

ADR: Accord européen sur le transport des marchandises dangereuses par RouteIMDG: International Maritime Code for Dangerous GoodsIATA: International Air Transport AssociationGHS: Globally Harmonised System of Classification and Labelling of ChemicalsEINECS: European Inventory of Existing Commercial Chemical SubstancesELINCS: European List of Notified Chemical SubstancesCAS: Chemical Abstracts Service (division of the American Chemical Society)Skin Irrit. 2: Skin corrosion/irritation, Hazard Category 2Eye Irrit. 2: Serious eye damage/eye irritation, Hazard Category 2

· * Données modifiées par rapport à la version précédente CH/FR

Annexes

LXXIV

FICHE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ(Conformément au RÈGLEMENT DE LA COMMISSION (EU) No 453/2010)

________________________________________________________________________________________________________________

��

Identificateur de produit

Code du produit WP20001Nom du produit Novex® AP Chromogenic Substrate (BCIP/NBT)

Nom chimique Sans objetNuméro d'enregistrementREACH

La/les substance(s) de ce mélange ne comporte(nt) pas de numérod'enregistrement dans la mesure où la quantité importée est inférieure à 1tonne/an ou bien que la période de transition pour son enregistrement selonl'Article 23 du règlement REACH n'a pas encore expiré.

Utilisations identifiées pertinentes de la substance ou du mélange et utilisations déconseillées

Utilisez le Code descriptif SU22 - Domaine public (administration, éducation, loisirs, services, artisanat),PROC15 - Utilisation comme réactif de laboratoire, PC21 - Substances chimiquesde laboratoire, SU24 - Recherche scientifique et développement

Utilisations déconseillées Impropre à la consommation.

Renseignements concernant le fournisseur de la fiche de données de sécurité

Manufacturer/Supplier

24 hour Emergency Response for Hazardous Materials[or Dangerous Goods] Incident. Spill, Leak, Fire,Exposure, or Accident. Call CHEMTREC

Within the USA + Canada: 1-800-424-9300 and +1703-527-3887Outside the USA + Canada: +1 703-741-5970

Country specific Emergency Number (if available):

Relevant identified uses Utilisation en recherche uniquement

LIFE TECHNOLOGIES EUROPE BVKWARTSWEG 22665 NN BLEISWIJKNETHERLANDS31-(0)180 392 400Email: [email protected]

CHEMTREC Switzerland (Zurich)CHEMTREC Belgium (Brussels)CHEMTREC LuxembourgCHEMTREC France

+(41)-435082011 (la langue de voeux : allemand, français et italien)+(32)-28083237 (La langue de voeux: français, flamand, allemand)+(352)-20202416 (La langue de voeux: français, allemand,luxembourgeois)+(33)-975181407 (Salutations Langue: Français)

________________________________________________________________________________________________________________

Date de révision 22-nov.-2016 Page 1 / 10Code du produit WP20001 Nom du produit Novex® AP Chromogenic Substrate (BCIP/NBT)

www.thermofisher.com

S E C T I O N 2 : I d e n t i f i c a t i o n d e s d a n g e r s

Classification de la substance ou du mélange

Classification selon le règlement (EC) n° 1272/2008 [CLP]

Dangers pour la santéSensibilisant cutané Catégorie 1

��Non dangereux

Additional informationTexte intégral des phrases R : voir section 16

��

Étiquetage selon le règlement (EC) n° 1272/2008 [CLP]

Pictogrammes de danger

mention d'avertissementATTENTION

mentions de dangerH317 - Peut provoquer une allergie cutanée

conseils de prudence

PréventionP261 - Éviter de respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosolsP272 - Les vêtements de travail contaminés ne devraient pas sortir du lieu de travailP280 - Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/du visage

Response��P363 - Laver les vêtements contaminés avant réutilisation

StorageSans objet

ÉliminationP501 - Éliminer le contenu/récipient dans une usine d'élimination des déchets homologuée

Autres dangers

Dangers physiquesNon dangereux

________________________________________________________________________________________________________________



Ce mélange ne contient pas aucune substance évaluée comme étant une substance PBT ou vPvB

S E C T I O N 3 : C o m p o s i t i o n/i n f o r m a t i o n s s u r l e s c o m p o s a n t s

Component No.-CAS No.-EINECS Pour cent en poids Numérod'enregistrement

REACH

Classificationaccording to

Regulation (EC) No1272/2008 [CLP]

Acide maléique 110-16-7 ( <=0.4 )

110-16-7 203-742-5 <=0.4 01-2119488705-25-XXXX

Acute Tox. 4 - H302

Eye Irrit. 2 - H319

STOT SE 3 - H335

Skin Irrit. 2 - H315

Skin Sens. 1 - H317

S E C T I O N 4 : P r e m i e r s s e c o u r s

Description des premierssecours

Contact avec la peau Rincez abondamment à l'eau. Il n'est pas nécessaire de consulter immédiatementun médecin.

Contact oculaire ��lentilles, retirez-les dans la mesure où cela est possible.

INGESTION Ne devrait pas présenter de risque significatif en cas d'ingestion dans lesconditions prévues d'utilisation normale. En cas de malaise, consulter un médecin.

Inhalation Ne devrait pas présenter de risque en cas d'inhalation dans les conditions prévuesd'utilisation normale de ce produit. Au besoin, consulter un médecin.

Notes au médecin Traiter les symptômes.

Principaux symptômes et effets, aigus et différésH317 - Peut provoquer une allergie cutanée.

Indication des éventuels soins médicaux immédiats et traitements particuliers nécessaires��

��

��

�� Jet d'eau. Dioxyde de carbone (CO2). Mousse. Agentchimique sec.

�� Aucune information disponible.

Dangers particuliers résultant de la substance ou dumélange

Non connu.

Conseils aux pompiers Procédure standard pour les incendies d'origine chimique.

________________________________________________________________________________________________________________



S E C T I O N 6 : M e s u r e s à p r e n d r e e n c a s d e d i s p e r s i o n a c c i d e n t e l l e

��Mettre en place une ventilation adaptée. Toujours porter l'équipement de protection personnelle recommandé. Utiliserun équipement de protection individuelle. Voir la section 8 pour plus de détails.

��Pas de précautions spéciales pour l'environnement requises. Dans la mesure du possible, éviter les rejets dans leségouts et les cours d'eau.

Méthodes et matériel de confinement et de nettoyageEnlever avec un matériau absorbant inerte.

��Voir la section 8 pour plus d'informations.

S E C T I O N 7 : M a n i p u l a t i o n e t s t o c k a g e

Précautions à prendre pour une manipulation sans danger��

��Conserver au sec, dans un endroit frais et bien ventilé. À conserver dans des conteneurs dûment étiquetés.

Utilisation(s) finale(s)particulière(s)

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Utilisation en recherche uniquement.


Immunodétection ECL-AP

LXXV

��

Paramètres de contrôle

Nom chimique EU OEL (TWA) EU OEL (STEL) EU Skin NotationAcide maléique

110-16-7Aucun(e) Aucun(e) Aucun(e)

Nom chimique Autriche Belgium (TWA) Denmark (TWA) Finland OEL (TWA)Acide maléique

110-16-7Aucun(e) Aucun(e) Aucun(e) Aucun(e)

Nom chimique France OEL (VME) Germany OEL (TWA) Ireland (TWA) Italy OEL (TWA)Acide maléique


Nom chimique Sweden - OccupationalExposure Limits - TLVs

(LLVs)

Netherlands OEL (MAC) Spain OEL (TWA) Royaume Uni

Acide maléique 110-16-7

Aucun(e) Aucun(e) Aucun(e) Aucun(e)

Nom chimique Union européenne France OEL (VME) Germany OEL (TWA)Acide maléique

110-16-7Aucun(e) Aucun(e) Aucun(e)

Nom chimique Italy OEL (TWA) Portugal Netherlands OEL (MAC) Finland OEL (TWA)Acide maléique


Nom chimique Autriche Danemark Pologne SuisseAcide maléique


Nom chimique Irlande Norvège Lithuania OEL (TWA) Spain OEL (TWA)Acide maléique


Mesures d'ingénierie Mettre en place une ventilation adéquate, en particulier dans les zones confinées.

��

Équipement de protection individuelle

Protection respiratoire En cas d'aération insuffisante, porter des respirateurs et des composants testés etapprouvés suivant les normes gouvernementales appropriées.

Protection des mains Porter des gants appropriés Matériau de gant : gants de protection contre lesproduits chimiques compatibles.

Protection des yeux Lunettes de sécurité étanches.

Protection de la peau et ducorps

Porter un vêtement de protection approprié.

Mesures d'hygiène Manipuler conformément aux bonnes pratiques industrielles d'hygiène et desécurité.

��

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S E C T I O N 9 : P r o p r i é t é s p h y s i q u e s e t c h i m i q u e s

Informations sur les propriétés physiques et chimiques essentielles

aspect LiquideOdeur aucune donnée disponiblepH Le mélange n' a pas été testépH 9.0-10.0

Taux d'évaporation aucune donnée disponibleinflammabilité (solide, gaz) aucune donnée disponibleLimite supérieure d'explosivité Le mélange n' a pas été testéLimite inférieure d'explosivité Le mélange n' a pas été testépression de vapeur Le mélange n' a pas été testéDensité relative Le mélange n' a pas été testéDensité aucune donnée disponibleSolubilité aucune donnée disponibleCoefficient de partage :n-octanol/eau

aucune donnée disponible

Propriétés explosives Le mélange n' a pas été testé

AUTRES INFORMATIONS aucune donnée disponible

S E C T I O N 1 0 : S t a b i l i t é e t r é a c t i v i t é

Réactivité Aucun(e) connu(e).

Stabilité chimique Stable dans les conditions normales.

Possibilité de réactionsdangereuses

Une réaction dangereuse n'a pas été signalée.

Conditions à éviter Aucune information disponible.

Matières incompatibles Aucune réaction dangereuse connue dans des conditions normales d'utilisation.

Produits dangereux résultant dela décomposition

aucune donnée disponible.

Point/intervalle de fusion °C Le mélange n' a pas été testé °F Le mélange n' a pas été testéPoint / intervalle d'ébullition °C Le mélange n' a pas été testé °F Le mélange n' a pas été testé�� °C Le mélange n' a pas été testé °F Le mélange n' a pas été testéTempérature��

°C Le mélange n' a pas été testé °F Le mélange n' a pas été testé

température de décomposition °C Le mélange n' a pas été testé °F Le mélange n' a pas été testé

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S E C T I O N 1 1 : I n f o r m a t i o n s t o x i c o l o g i q u e s

Informations sur les effets toxicologiques

Nom chimique LD50 (oral,rat/mouse) LD50 (dermal,rat/rabbit) LC50 (inhalation,rat/mouse)Acide maléique = 708 mg/kg (Rat) aucune donnée disponible >720mg/m3(Rat)

Principales voies d'exposition,

Irritation Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

corrosivité Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

sensibilisation Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau

STOT - exposition unique Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

STOT - exposition répétée Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

Cancérogénicité Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

Mutagénicité Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

toxicité pour la reproduction Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

Danger par aspiration Concluant mais pas suffisamment pour établir une classification

S E C T I O N 1 2 : I n f o r m a t i o n s é c o l o g i q u e s

Toxicité

Nom chimique Freshwater AlgaeData

Water Flea Data Freshwater FishSpecies Data

Microtox Data log Pow

Acide maléique aucune donnéedisponible

Daphnia magnaEC50250 - 400 mg/L

(48 h)

aucune donnéedisponible

aucune donnéedisponible

logPow-0.79 - 0.32

Persistance et dégradabilité Aucune information disponible.

Potentiel de bioaccumulation Aucune information disponible.

Résultats des évaluations PBT et vPvBCe mélange ne contient pas aucune substance évaluée comme étant une substance PBT ou vPvB.

Autres effets néfastes Aucune information disponible.

��

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Méthodes de traitement des déchetsDans la mesure du possible, la production de déchets doit être évitée ou réduite à un minimum. Les récipients videsou garnitures peuvent retenir des résidus de produit. Ce produit et son récipient doivent être mis au rebutconformément à la technique de mise au rebut approuvée. La mise au rebut de ce produit, de ses solutions ou den'importe quels sous-produits doit respecter les exigences de toutes les réglementations locales, régionales ounationales/fédérales applicables.

S E C T I O N 1 4 : I n f o r m a t i o n s r e l a t i v e s a u t r a n s p o r t

IATA / ADR / DOT-US / IMDGNot regulated in the meaning of transport regulations.

Numéro ONU Sans objet

��unies

Sans objet

Transport hazard class(es) Sans objet

�� Sans objet

�� Sans objet

Précautions particulières à��

Sans objet

________________________________________________________________________________________________________________



�� Sans objet.

Annexes

LXXVI

S E C T I O N 1 5 : I n f o r m a t i o n s r é g l e m e n t a i r e s

Réglementations/législation particulières à la substance ou au mélange en matière de sécurité, de santé et��

Substances extrêmement préoccupantesAucun(e).

Substances réglementées en vertu du code EC 1907/2006, Annexe XVIIAucun(e).

Substances répertoriées selon l'Annexe I de la Réglementation (CE) No 689/2008Aucun(e).

Substances à utilisation restreinte selon l'Annexe V de la Réglementation (CE) No 689/2008Aucun(e).

Substances suivant la Réglementation (CE) No 850/2004 du Parlement européen et du Conseil du 29 avril2004 relative aux polluants organiques persistants et la Modification de Directive 79/117/CEEAucun(e).

Classification allemande de pollution des eaux (Wassergefährdungsklassen)

Nom chimique Pour cent en poids Allemagne : classificationdes eaux (VwVwS) -Annexe 1

Allemagne : classificationdes eaux (VwVwS) -Annexe 2 Catégories depollution des eaux

Allemagne : classificationdes eaux (VwVwS) -Annexe 3

Acide maléique <=0.4 hazard class 1 - low hazardto waters

Autres inventairesinternationaux

Nom chimique EINECS (Unioneuropéenne)

ELINCS (Listeeuropéenne des

substanceschimiquesnotifiées)

ENCS (Japon) PICCS (Philippines)

Acide maléique Listed - Listed Listed

Nom chimique AICS (Australie) Corée du Sud(KECL)

Canada (DSL) NDSL

Acide maléique Listed Listed Listed -

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Évaluation de la sécurité chimiqueAucune évaluation de sécurité chimique n'a été réalisée.

S E C T I O N 1 6 : A u t r e s i n f o r m a t i o n s

Motif de la révision Mise à jour conformément au Règlement de la Commission (EU) No 453/2010.Numéro de révision 3Date de révision 22-nov.-2016

References��

Classification et procédure utilisées pour établir la classification des mélanges conformément à la régulation(CE) 1272/2008 [CLP] :

Les informations qui précèdent ont été recueillies par recherche et/ou contrôle diligents et les recommandations sontbasées sur une application prudente d'un jugement professionnel. Ces informations ne doivent pas être considéréescomme exhaustives et doivent être utilisées uniquement à titre indicatif. Tous les produits et mélanges peuventprésenter des risques inconnus et doivent être utilisés avec précaution. Étant donné que la Société ne peut pascontrôler les méthodes, volumes ou conditions réels d'utilisation, la Société ne sera tenue responsable d'aucundommage ou perte résultant de la manipulation du produit décrit ici ou d'un contact avec celui-ci.LES INFORMATIONS FIGURANT DANS LA PRÉSENTE FICHE SIGNALÉTIQUE DE SÉCURITÉ DE PRODUIT NECONSTITUENT PAS UNE GARANTIE, EXPRESSE OU IMPLICITE, Y COMPRIS TOUTE GARANTIE IMPLICITE DEQUALITÉ MARCHANDE OU D'ADÉQUATION À TOUTE FIN PARTICULIÈRE

Sensibilisant cutané Catégorie 1 Méthode de calcul

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LXXVII

la sélection des traces de sang sur des lieux d’investigation

Documents