la réparation des cassures double brin de l'adn chez les

UNIVERSITE PARIS XI

FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUDN° attribué par la bibliothèque

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS X I

Spécialité : Radiobiologi e

Présentée et soutenue publiquemen t

par

Fabien DELACOTE

1e 21/11/02

Titre

La réparation des cassures double brin de l'ADN chez lesmammifères : intervention séquentielle de la Recombinaison

Non Homologue puis de la Recombinaison Homologue .

Directeur de thèse M. Bernard S. Lopez

JURY

Pr. Jean-Marc Cosset

Président

Dr. Dora Papadopoulo

Rapporteur

Dr. Martine Defais

Rapporteur

Dr. Dietrich Averbeck

Examinateur

Dr. Bernard S . Lopez

Directeur de thèse

Ce travail a été réalisé dans le laboratoire d'étude des mécanismes de la régulation d ela recombinaison homologue (LMR), dirigé par le Dr. Bernard S . Lopez, au sein de l'unit émixte CEA/CNRS (UMR 217), au CEA de Fontenay-aux-Roses .

Je tiens à remercier les membres du Jury :

Le Pr . Jean-Marc Cosset d'avoir bien voulu présider ce jury ,Les Dr. Martine Defais et Dr . Dora Papadopoulo d'avoir aimablement accepté d'êtrerapporteur de cette thèse ,

Le Dr. Dietrich Averbeck d'avoir cordialement accepté d'être examinateur de cett e

thèse .

Je remercie également Bernard S . Lopez de m'avoir accueilli dans son laboratoire e t

d'avoir dirigé cette thèse . Je te remercie pour toutes nos conversations scientifiques et autres .

Elles m'ont permis de clarifier mon esprit et surtout de percevoir différemment le monde et l a

culture scientifique .

Je tiens à témoigner ma reconnaissance à tous les membres actuels du laboratoire :

Pascale Bertrand (bon courage pour ta nouvelle vie de mère chercheuse), Anne et Fayza (j e

vous fais confiance pour la suite), David (merci pour toutes tes aides), François (bonne chass e

aux protéines), Josée (vive le NHEJ au sein du LMR) et enfin Yannick (welcome back) . Je

remercie également les membres passés du LMR : Sarah (tu es toujours ma collègu e

préférée), Olivier (que la recherche soit avec toi), Sylvie Huck (que la vie italienne t'apporte

ce que tu recherches), Brigitte (tu as intérêt à être là le jour J), Franck et Thierry (promis j e

passerai à Evry), Patrick et Stéphane (les SC comme moi), Hugues (fais gaffe à mon doigt) ,

Guillaine et Elodie (bonne chance dans la vie professionnelle) .

A tous, je tiens à vous dire que j'ai apprécié nos relations techniques, pratiques (surtou t

le douloureux thème des commandes), scientifiques mais surtout nos relations humaines trè s

amicales malgré les difficultés d'une vie en huit clos dans un laboratoire .

Je tiens à remercier Jozo Delic pour m'avoir accueilli chaleureusement et de si bonn e

humeur dans le laboratoire de Laure Sabatier et pour m'avoir initié au test de la DNA-PK .

remercie également Ludo, Michèle et Luis pour leur disponibilité et leur gentillesse .

Merci également à Francis Fabre qui a eu la patience et la gentillesse de répondr e

mes questions parfois tortueuses . Bien que ces réponses ne m'aient pas forcément éclairé su r

le moment, elles m'ont véritablement servi à ma réflexion . Je remercie tous les membre s

anciens et actuels de son laboratoire Serge, Xavier, Eric, Christine, Laurence, Laurent ,

Thomas et Delphine pour leur accueil et leurs conseils scientifiques et surtout informatiques .

Je témoigne mon extrême reconnaissance à tous ceux qui ont contribué à mon bo n

équilibre moral lors de cette thèse . Je pense très fortement à mes amis rencontrés au CE ASarah et Pierrot (je vous serai éternellement reconnaissant de m'avoir fait rencontrer m a

moitié), Fabrice (merci de ta sincère amitié), Marie (j'ai toujours grand plaisir de discuter avec

toi), Olivier (merci pour les concerts partagés), Thierry et Amandine (quand est-ce qu'on s e

voit?), Anne (j'ai apprécié ta terrasse), Marco (à bientôt sur Toulouse), Yoyo (vive le hackisacet vogue la galère), Laurence (j'apprécie ton soutien), Flo (toujours aussi charmante) .

Spécial dedikas aux potes de Rennes : Bass & Cendrine, Loïc & Maloulou, Romain ,

Yaya, Vince, Tycoon, Roswell, Loblaze, Francky, Norton, Clint & Poche, Titi & Zaza &

Alice, Papy & Mumu, K1000 & Aymeric . . .

Un grand merci à ma famille. Stéphane je te remercie de m'avoir laissé to n

appartement à ma disposition . Pierre-Yves, mille mercis pour la voiture qui m'a ét é

indispensable pour ce travail . Merci à mon père, à ma mère et à nouveau à mes frères d'avoi r

cru en moi jusqu'au bout et d'avoir su me motiver à chaque instant de ma vie où cela étai t

nécessaire .

Enfin, je tiens tout particulièrement à remercier Anne Lise du fond de mon coeur qu i

lui est entièrement dévoué . Grâce à toi, j'ai pu gagner en force, en confiance et en patience .

Merci de me soutenir dans mes moments de doute et d'être tout simplement à mes côtés .

Liste des abréviations .000000 60 00000e00000000006 .00 .s . . .000060 . . . .o .ao 0 .e . .s . . .e . . . . 00 1

Avant-propos : les dommages de l'ADN 3

INTRODUCTION

7

A/ Les modèles de réparation des cassures double brin 8

1 . LES MODÈLES DU NHEJ 8

II LES MODÈLES DE LA RH 1 0

1. Conversion génique et crossing over 1 1

2. Le modèle de Szotack 1 1

3. Le SDSA (pour Synthetis-Dependent Strand Annealing) 1 3

4. Le BIR (pour Break-Induced Replication) 1 3

5. Le SSA (pour Single Strand Annealing) 1 .5

B/ Contrôle génétique des mécanismes de réparation des cassures double brin 17

1 . CONTRÔLE GÉNÉTIQUE DU NHEJ 1 7

1. Le complexe DNA-PK 1 7

1 .1 . L'hétérodimère Ku 1 7

1 .1 .1 . L'hétérodimérisation 1 8

1 .1 .2 . La fixation à l'ADN 1 9

1 .1 .3 . Le recrutement de la DNA-PKcs 2 0

1 .1 .4 . Le recrutement du complexe XRCC4 / Ligase IV 2 1

1 .1 .5 . Autres propriétés de Ku 2 1

1 .2 . La DNA-PKcs 2 3

1 .2 .1 . Une serine/thréonine kinase de la famille des PI-3 kinases 2 3

1 .2 .3 . Les fonctions de l'activité kinase dans le mécanisme du NHEJ 24

2. Le complexe Xrcc4/ligase IV 2 4

2 .1 . Les protéines Xrcc4 et LigaselV 25

2 .2 . Structure et propriété du complexe 26

3. Les autres protéines impliquées dans le NHEJ 2 6

3 .1 . Les protéines impliquées dans le NHEJ dépendant des complexes DNA-PK et XRCC4/ligaseIV 2 7

3 .1 .1 . Le complexe Mrel l /Rad50/Nbs l (Xrs2) 2 7

3 .1 .2 . La protéine WRN 2 8

3 .2 . Un mécanisme NHEJ indépendant des complexes DNA-PK et Xrcc4/Ligase IV 2 9

II CONTRÔLE GÉNÉTIQUE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE 3 0

1. Le groupe d ' épistasie Rad52 30

2. Rad52 : la protéine directrice 3 1

2 .1 . Implication dans la Recombinaison Homologue 3 1

2 .2 . Propriétés biochimiques de Rad52 3 1

2 .3 . Interactions protéiques 3 2

3. Rad51 : la protéine

de la conversion génique 3 4

3 .1 . Implication dans le mécanisme de recombinaison homologue

3 .2 . Rad51 et la réaction d'invasion et d'échange de brin 3 4

3 .3 . Interactions protéiques de Rad5 1 3 5

4. Les paralogues de Rad51 3 6

4 .1 . Rad55 et Rad57 3 7

4 .2 . Xrcc2, Xrcc3 et Rad51 B-D 3 7

5. Rad54 et son homologue 38

5 .1 . Implication dans le mécanisme de recombinaison homologue 3 8

5 .2 . Rad54 membre de la famille des protéines SWF2/SW12 39

6. Le complexe MRN(X) : maturation des cassures et stabilisation des chromatides 40

7.Autres protéines impliquées dans la Recombinaison Homologue 4 1

7 .1 . Des protéines de la réparation par excision de nucléotides et des mésappariemments sont impliquées dans le

mécanisme du SSA 4 1

7 .2 . La migration et la résolution des jonctions de Holliday 4 1

C/ Régulation des mécanismes de réparation des cassures double brin 43

I . LE CHOIX DES MÉCANISMES DE RÉPARATION 4 3

1. Le type d'organisme 4 3

1 .1 . La levure et la recombinaison homologue 44

1 .2 . Les cellules de mammifères et le NHEJ 44

1 .3 . Le cas particulier des cellules DT40 de poulet 45

2. Le stade de développement chez les mammi res 45

3. Les protéines orientant la réparation 46

3 .1 . La compétition entre Ku et Rad52 46

3 .2 .Orientation par le complexe MRN(X) 4 6

4. Le cycle cellulaire 47

4 .1 . La Recombinaison Homologue et la phase fin de S/G2 47

4.2 . Le NHEJ et la phase G 1/début de S chez les vertébrés 4 8

II LES RÉPONSES AUX RADIATIONS IONISANTES 49

1. Les senseurs des cassures double brin 49

1 .1 . Implication d'ATM dans la signalisation des cassures double brin 4 9

1 .2 . Autres protéines impliquées dans la signalisation 5 1

1 .2 .1 . La protéine ATR 5 1

1 .2 .2 . DNA-PKcs : réparation et/ou signalisation ? 5 2

2. Les arrêts du cycle cellulaire 5 3

2 .1 . Le point de contrôle GI/S : un des rôles de p53 5 3

2 .2 . Le point de contrôle intra-S : deux mécanismes parallèles 5 4

2 .3 . Le point de contrôle G2/M 5 4

3. Modifications post-traductionnelles des protéines de réparation 56

3 .1 . Phosphorylations des protéines de réparation 5 6

3 .1 .1 . La phosphorylation de Rad5l : activation ou inhibition de la RH ? 5 6

3 .1 .2. La phosphorylation de la DNA-PKcs 5 7

3 .1 .3 . Brcal : une protéine â de multiple facettes 57

3 .1 .4. Le complexe MRN(X) 5 8

3 .2 . Re-localisation en foyer des protéines de réparation 59

3 .2 .1 . Les foyers Rad51 59

3 .2 .2. Les foyers MRN 6 0

3 .3 Dégradation des protéines de réparation 6 2

3 .3 .1 . Dégradation de RadS l par apoptose et par ubiquitination 6 2

3 .3 .2 . Dégradation des protéines du NHEJ 6 3

4 Conclusions 63

D/ Rôles biologiques des facteurs et des mécanismes de réparation des CDB 64

I ROLES BIOLOGIQUES VARIÉS 4

1. Le développement 64

1 .1 . Le développement embryonnaire

1 .2 . Le développement neuronal embryonnaire 66

1 .3 . Le développement lymphocytaire 6 8

1 .4 . La croissance 6 8

2. Le maintien et la structure des télomères 6.9

2.1 . Rôle de la recombinaison homologue 6 9

2.2 . Rôle des protéines du NHEJ et la structure des télomères 7 0

2 .3 . Rôle du complexe MRN 71

3. La réplication " . .' .' . .' .' . ." ." ." ." .' .' ." ." .' .' . .' ." .' . . . .' " ." ." ." ." ." ." ." ." ." 7/3 .1 . La recombinaison homologue et la réplication deux processus étroitement liés 7 \

3 .2 . Ku et les origines de réplication " ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." 7 33 .3 . aroal et les arrêts de réplication 7 s

3 .4 . Le rôle du complexe MRN dans la réplication : prévenir des cassures 7 4

4. La réparation des dommages induits par les radiations UV 744 .1 . La tolérance aux dommages UV : Recombinaison homologue et Synthèse truoulénioonoUc 74

4 .2 . Inhibition du NER par les protéines du NHEJ 78

5. La rnav^c,ip r ion ' ' . . . .' ' " ." .' 77

II. LA RÉPARATION DES CASSURES DOUBLE BRIN : DIVERSITÉ GÉNÉTIQUE ET INTÉGRITÉ GÉNOMIQUE 70

1 . LA DIVERSITÉ GÉNÉTIQUE ' . . ." . . ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." . ." . ." .' ." .' . . . .' 7 0

1 .1 . La recombinaison V(D)J et le NHEJ " . .' .' . . ." . ." ." ." ." ." .' ." ." ." . ." ." . ." . . . ." 7 8

!z La recombinaison méiotique et la mn 8 2

2 . L'intégrité génomique .' connexion entre réparation des cassures double brin et cancer 8 42 .1 . Le NHEJ et la mo contribuent au maintien de l'intégrité du geoomc 84

2 .1 .1 . Remaniements génomiques 8 4

2 .1 .2 . Implication du NHEJ ' . . ." . . ." . . ." ' . ." .' ." .' . . ." ' 8 42 .1 .3 . Implication de la nn 8 62 .1 '4 . Les protéines impliquées dans la ne et le NHEJ 8 72 .1 .5 . Les mécanismes de réparation sources de remaniements génétiques 8 8

2 .2 . Cancer et dérégulation des mécanismes de réparation des CDB 8 B

22.1 . L 'Ataxie télangiectasie ~ augmentation ou altération de la nn ? 8 9

2 .2 .2 . p53 et la réparation des CDB " ' . . . ." .' ." . . . ." ." .' . . . ." ' . . . .' o y

2 .2 .3 . Bcr-Abl : augmentation de la mn et inhibition du NHEJ o0

Problématiques ~~~~~ ~ . .~~0000~~~~ .~ . .~~~ . . . .~~~. .~ ~ . .~~~ . . . .~~.~ ~~ . . 0 ~~~~~. . .~ . .00~ .93

RESULTATS

94

Al Un défaut du NHEJ augmente l m RH induite spécifiquement par les cassures double

brin ~. .~~. . .~.. ..^~~. .0 .~^^~~~~~^^~~`^^^^~~^~~^~^~ . .~^^^~~^^~~~^^~~^^~ ~~~^~ .~ ..~.. ..~~ ~95

l . STRATÉGIE ' ' . .' g 5

I . Mesures de la réparation dictée par l'homologie 95! . ! . Substrat permettant de mesurer les fréquences de la nn 9 5

1 .2 . Formation des foyers mad5 1 g 0

2 . Inactivation du mécanisme de 8@9/J 98

2 .1 . Utilisation de lignées déficientes pour xrue4 9 0

2 .2 . Utilisation de la Woumuomn æ o

2 . 3 . Avantages de cette stratégie 9 9

II . UN DÉFAUT DU NHEJ AUGMENTE LA B8 INDUITE PAR LES RADIATIONS IONISANTES 10 0

/ . Un défaut de Xrcc4 augmente la RH induite par les y 100

2. Un traitement à la Wortmannin augmente la RB induite par les y 10 1

3. Les effets de la délétion du gène XRCC4 et de la Wortmannin sur la RH induite par les radiation s

ionisantes sont épistatiques ' . ." . . . ." . ." . .' ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." ." .' ." ." ." ." ." . . ." 1 89

DLETUDE DE L 'EFFET DE L ' INACTIVATION DU NHEJ SUR LES DIFFÉRENTS VOIES DE LA RBoRÂCE À LA

STRATÉGIE I-SCEI ' . . . .' ' 104

J . L 'altération de la protéine Xrcc4 augmente la RB induite par 1-Scel /04

2. L 'absence de la protéine Xrcc4 stimule la RH induite par 1 -Scel à un niveau moléculaire 10 6

3. Un traitement à la Wortmannin n 'a pas d'effet sur la RB induite pa, 1 08

IV. L 'INVALIDATION DU GÈNE XRCC4 NE STIMULE NI LA RH SPONTANÉE NI LA RH INDUITE PAR LES

1 . Un défaut de Xrcc4 ne stimule pas la R/{ spontanée 10 9

2 . Un défaut de Xrcc4 n 'affecte pas le RH induite par les DV 11 0

V. L 'INACTIVATION DU NHEJ STIMULE LA FORMATION DES FOYERS RADS 1 APRÈS UN STRESS CRÉANT DE S

CDB U !

1. Un défaut de Xrcc4 stimule la formation des foyers Rad5l induits par y 11 2

2. Un traitement ù la Wortmannin augmente la fréquence d exfoyers Rad5l induits par y 11 3

3. Une déficience de Xrcc4 ne stimule pas la formation des foyers Rad5l après une irradiation UV 11 4

BI Un défaut du NHEJ conduit h la réparation en G2 par la RH des CDB induites en G 1

~~,,~~,,,,,~,,~~,~~,,~~,~~~~~,~~~~,,~~~~~~~~ ~ .~ ..~~~~ ~~ .~~~~~~.~~~~~ . . . .~ .~~~.8 16

[LES FOYERS RADS lsE FORMENT EN FIN DE S/G2 APRÈS EXPOSITIONS AUX RAYONNEMENT S RAYONNEMENTS y SUR DES

CELLULES ASYNCHRONES ) l b

1. Un défaut du NHEJ conduit ù un arrêt prolongé du ü2 après irradiation aux y //6

2. Corrélation entre la fin de S/G2 et la formation des foyers Rad5l 118

3. Les foyers Rad5l apparaissent en fin de 3YC2 120

D . LES CDB NON RÉPARÉES EN G} STIMULENT LA RB INDUITE PAR LES RADIATIONS IONISANTES 122

III . LES CDB NON RÉPARÉES EN G1 STIMULENT LA FORMATION DES FOYERS RADS i æmO2 !24

J . Les foyers Rad5l se forment lorsque les cellules sont en G2 12 4

2. Les foyers Rad5l sont induits plus tardivement lorsque les CM sont induites en G1 125

I . STRATÉGIE 127

I . Le choix de la sur-expression de Rad52 pour stimuler la RD 127

2 . Clonage du RAD52 de hamster et lignées de sur-expression 127

3 . Mesure du NH5J 128

0L RAD52-V5 NE STIMULE PAS LA RH INDUITE PAR LES CDB 120

DISCUSSION

135

1. La nature des cassures double brin, le stade du développement et l'accessibilité de /'ADN 13 6

2. Les effets de la Woxtnonnin .' inhibition d 'A T M et/ou de DNA-PKcs 137

3. Les inactivations des différentes étapes du NHEJ stimulent-elles la RH induite par une seule cassure ?

'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' 13 8

4. La DNA-PKcs est-elle nécessaire pour la réparation d'une seule cassure double brin ? 13 9

5. La stimulation de la RH par un défaut du NHEJ est-elle spécifique des cassures double brin . ? 13 9

BI Réparation des cassures double brin et cycle cellulaire ^ .~ .^ ~ . .~ . . .~ ~ . . .~ 140

1. La B/f dépendante de Rad5l a lieu uniquement en fin de S/G2 chez les vertébrés 140

2. Le NHEJ est-il en compétition avec la RH en G2 ? /*V

3. Stimulation de la R /fpx, un défaut du NHEJ et un défaut de la transition G//S 14 2

4. Efficacité des mécanismes de répmxzdon 14 3

5. Modèle : une réparation séquentielle des cassures double brin i44

C/ Une stimulation de la RH inhibe-4-01e le NHEJ ? 146

Dl Conclusions ~~^~~~~~^~~^~~^~`^^^ . .^~~^~~^^^^~^~~ . .~~ ~ . .~ . .~ .~~~~ .~ 0* .~ ~ ~ U4 7

MATERIELS ET METHODES

148

A/ Techniques de biologie moléculaire et de biochimie 149

1 . LES CLONAGES DE GÈNES

149

1. Le clonage du gène HsXRCC4 149

2. Le clonage du gène HsXRCC4-V5 15 0

3. Le clonage de RAD52-V5 15 1

II. LA TECHNIQUE DE WESTERN BLOT 15 1

III. LE TEST D 'ACTIVITÉ DE LA DNA-PK 15 2

1. Préparation des extraits protéiques 152

2. Activité DNA-PK enrichie (ou "pull down assay") 153

BI Techniques de culture cellulaire 154

1 . LIGNÉES CELLULAIRES UTILISÉES 154

1. Lignées établies et conditions de culture 154

2. Etablissement de clones stables 155

II . MESURE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE 156

1. La recombinaison spontanée : le test de fluctuation 156

1 .1 . Principe du test de fluctuation 15 6

1 .2 . Test de fluctuation de la recombinaison 15 7

2. Recombinaison induite par des agents génotoxiques 15 8

2 .1 . Principe 15 8

2 .2 . Exposition aux radiations ionisantes 15 8

2 .3 . Exposition aux UV 15 8

3. Recombinaison induite par l'endonucléase 1-Scel 159

3 .1 . Mesure de la RH par la fréquence des clones résistants 15 9

3 .2 . Mesure de la RH et du NHEJ au niveau moléculaire 160

III . TRAITEMENTS LORS DE LA CULTURE CELLULAIRE 16 0

1. Traitement à la Wortmannin 161

2. Traitement au 1irdU 161

III . MARQUAGE PAR IMMUNOFLUORESCENCE

1. Localisation cellulaire des protéines fusionnée à l'épitope V5 162

2. Les foyers Rad51 162

2 .1 . Marquage unique de Rad51 16 3

2 .2 . Co-marquage Rad51 et BrdU 1 3

3. Montage et observation des lames 164

IV. SYNCHRONISATION ET ANALYSE DU CYCLE CELLULAIRE 164

1. Analyse du cycle cellulaire 164

2. Synchronisation des cellules 165

BIBLIOGRAPHIE 166

ARTICLES 202

Liste des abréviations

8-oxoG 8-Oxoguanine

aa : acide aminé

ADN : acide désoxyribonucléiqu eADNc : ADN codant

ALT : Alternative Lengthening of TelomeresA-T : Ataxie Télangiectasi e

ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated

ATP : adénosine triphosphat e

ATPase : activité de dégradation de FATP

ATR : Ataxia Telangiectasia Rad3 related

BASC : Brcal-Associated genome Surveillance Complex

BER : réparation d'une base (Base Excision Repair)

BIR : réplication induite par une cassure (Break Induced Replication )

BLM : maladie Bloom ou gène muté dans cette maladi e

BRCA : gène de prédisposition aux cancers du sein (Breast Cancer Associated)BRCT : séquence d'aa identifiée dans la partie C terminale de Brcal définissant un domained'association entre protéines (BRCA1 C Terminal )

BrdU : Bromodéoxyuridin e

CHO : cellule d'ovaire de hamster chinois (Chinese Hamster Ovarian )

CDB : Cassure Double Bri nCG : Conversion Génique

CS : Complexe Synaptonémal

db : double bri n

DNA-PK : protéine kinase dépendante de l'ADN

DNA-PKcs : sous unité catalytique de la DNA-PK

DSBR : réparation des cassures double brin (Double Strand Break Repair)

EJ : activité de ligature des extrémités d'une CDB (End Joining)

ES : cellules souches embryonnaires (Embryonic Stern )

FA : Fanconi Anemia

IP6 : inositol hexakisphosphat e

JC : Joint Codant

1

JS : Joint Signa l

kb : kilobases

kDa : kilodalton

LigIV : gène codant la Ligase IV

MEPS : longueur d'homologie minimum pour avoir de la RH efficace (Minimal EfficientProcessing Segment)

MJ : Molécule Jointe

MMR : réparation des mésappariements (MisMatch Repair )

MRN(X) : complexe Mre 11 Rad5O Nbsl (Xrs2) chez les mammifères (chez S. cerervisiae )

Nbsl : protéine mutée dans le syndrome de Nijmegen

NER : réparation par excision de nucléotide (Nucleotide Excision Repair )

NHEJ : réparation par ligature des extrémités d'une CDB (Non Homologous End Joining)

pb : paire de base s

PI3-kinase : phosphatidylinositol 3 - kinase

RH : Recombinaison Homologue

RI : Radiations Ionisantes

RPA : protéine de réplication A (Replication Protein A)

RSS : Séquences signales de recombinaison (Recombination Signal Sequences)

sb : simple brin

SDSA : Synthèse dépendante de l'hybridation (Synthetis-Dependent Strand Annealing )

SCE : Echange entre chromatides soeurs (Sister Chromatide Exchange )

SCID : phénotype de défaut immunitaire sévère (Severe Combined Immuno Defiency)

SSA : dégradation hybridation (Single Strand Annealing )

TLS : Synthèse d'ADN translésionnelle (TransLesion Synthesis )

UDS : synthèse d'ADN non programmée (Unschedule DNA Synthesis )

UV : Ultra Viole t

WRN : maladie Werner ou gène muté dans cette maladi e

XRCC : X-Ray Cross Complementation

2

Avant-propos :les dommages de l'AD N

La molécule d'ADN est perpétuellement soumise à des dommages . Ceux-ci peuvent

être engendrés par des agents exogènes mais également de manière endogène (spontanémen t

ou induits lors de processus physiologiques) . Plusieurs types de dommages de l'ADN existent :

des mésappariements (bases non complémentaires appariées), des pontages (liaison entre

bases) inter- ou intra-brins, des sites abasiques (perte d'une base), des modifications de base ,

des liaisons covalentes entre protéine et ADN, des cassures simple brin, des dommage s

multiples localisées sur les deux brins (constitués à la fois de bases modifiées, de site s

abasiques et de cassures simples brin) et enfin des cassures double brin qui ont fait l'objet de

cette étude .

La réparation de ces dommages est essentielle au bon fonctionnement de la vie

cellulaire. Tous ces dommages sont réparés par différents mécanismes qui sont généralemen t

spécialisés pour un (ou plusieurs) type(s) de dommages . Quatre voies de réparation de l'AD N

corrigent ces dommages : la réparation par excision de nucléotide (NER pour Nucleotide

Excision Repair), la réparation par excision de base (BER pour Base Excision Repair), la

réparation des mésappariements (MMR pour MisMatch Repair) et enfin la réparation des

cassures double brin (DSBR pour Double Strand Break Repair) .

Il est important de signaler que ces mécanismes de réparation sont distincts de pa r

leurs facteurs (protéines) impliqués . Cependant, le NER, le BER et le MMR utilisent des

étapes moléculaires présentant des similitudes (excision, synthèse) . De plus en plus d'étude s

3

montrent que certains facteurs impliqués dans des mécanismes différents interagissent, ce qu i

suggère que ces mécanismes de réparation sont probablement très intriqués .

Les dommages peuvent être induits de manière spontanée par le métabolisme même d e

l'ADN . Par exemple, lors de la réplication, la polymérase peut commettre des erreur s

conduisant à des mésappariements . Les bases peuvent également être modifiées ou perdue s

spontanément par différents processus biologiques comme par exemple la dépurination, l a

dépyrimidination, ou la déamination . De plus, le métabolisme énergétique de la cellul e

conduit à la formation de produits hautement réactifs vis-à-vis de l'ADN : les radicaux libres .

Ces derniers créent plusieurs types de dommages dont des changements de bases et des

cassures simple brin .

Les dommages peuvent également être induits par des agents exogènes comme le s

radiations ionisantes (naturelles, accidentelles ou radiothérapie), les radiations UV, ou de s

agents chimiques (fumée de cigarette, chimiothérapie) . Les effets des radiations aux UV- C

(254 nm) et des radiations ionisantes seront présentés dans cet avant-propos puisque ces deu x

types de stress ont été utilisés dans cette étude .

L'unité de mesure des radiations UV correspond à une énergie de 1 joule déposée su r

une surface de 1 m 2 (Jlm2 ) . Les radiations aux UV-C créent plusieurs types de dommages don t

essentiellement des dimères de pyrimidine cyclobutane et des photoproduits (6-4) (tout deu x

constitués de deux bases pyrimidiques qui se lient de manière covalente) . Les radiations U V

induisent également des liaisons covalentes ADN-protéines et des cassures simple brin . Une

4

différence majeure entre les radiations UV et ionisantes est que ces dernières produisen t

directement des cassures double brin .

L'unité de mesure des radiations ionisantes est le Gray (Gy) qui correspond un e

énergie de 1 Joule absorbée par kilogramme de matière . Les radiations ionisantes agissent su r

l'ADN de deux façons : directement sur la molécule d'ADN ou indirectement par les radicau x

libres formés par ionisation de la molécule d'eau . Comme cet élément est le constituant

majoritaire de la cellule, ce mode d'action indirect est prédominant . Les radiations ionisante s

induisent un large spectre de lésions qui ont été quantifiées (cf . tableau 1) . Les cassure s

double brin sont supposés être les lésions létales majeures bien qu'elle ne soient pas les plu s

fréquentes .

Tableau 1 : Estimation des dommages de l'ADN induits par les radiations ionisantes pour unecellule de mammifère (d'après Pouget et al ., 1999 ; Ward, 1990)

Type de lésion

Nombre de lésions/cellule/Gy

Cassures simple brin

Dommages de bases

Liaisons covalentes ADN-protéine

150

Cassures double brin

40

1000

500

5

Les cassures double brin (CDB) sont réparées par deux mécanismes considéré s

comme distincts :

• La Recombinaison Homologue (RH) qui nécessite l'utilisation d'une molécul e

d'ADN homologue à la molécule lésée .

▪ La ligature des extrémités de la cassure n'utilisant pas ou peu d'homologie d e

séquences (NHEJ) .

L'objectif de cette étude est d'étudier la balance entre ces deux mécanismes de

réparation distincts .

L'introduction de cette thèse est divisée en quatre partie . La première présente le s

modèles moléculaires de réparation des cassures double brin permettant de comprendr e

comment les molécules d'ADN sont utilisées pour être réparées . Par la suite, les protéines

catalysant ces deux mécanismes de réparation seront présentées . La troisième partie aborde l a

régulation des voies de réparation des CDB . Enfin, la dernière partie montre les différentes

implications biologiques des systèmes de réparation des CDB : la diversité génétique e t

l'intégrité génomique .

6

INTRODUCTION

Al Les modèles de réparation des cassure s

double brin

I . Les modèles du NHEJ

Ce mécanisme consiste à ligaturer les extrémités des cassures double brin de l'ADN .

En fonction de la nature de ces dernières, il est possible de distinguer plusieurs mécanismes

(cf. figure 1). Les systèmes de réparation in vitro et in vivo de plasmides linéarisés ont permi s

d'élaborer ces modèles (pour revue Labhart, 1999 Smith et al., 2001) .

Lorsque les extrémités sont cohésives ou à bouts francs (figure 1A) la réparatio n

consiste en une ligature de ces extrémités .

Si les extrémités sont de même polarité mais non complémentaires le mécanisme d e

NHEJ peut consister à hybrider de petites séquences homologues situées sur les extrémité s

sortantes puis de remplir par polymérisation les brèches créés (figure 1B) .

Si les extrémités ne sont pas de la même orientation (figure 1C) une synthèse d'ADN à

partir d'une extrémité 3' suivie d'une ligature permet la réparation . Ce modèle suppose que le s

extrémités doivent être rapprochées et alignées .

Enfin quelles que soient les extrémités, des produits du NHEJ montrent l'utilisation de

microhomologies situées au-delà des extrémités . Ces évènements peuvent provenir d'un e

dégradation de l'ADN (les deux polarités étant possible) . Les microséquence s

complémentaires sont alors libérées, s'hybrident puis les extrémités non hybridées son t

excisées .

8

A

5' 3'

Nature des extrémités Activité s

enzymatiques

Cohésive

Ligature5 '3 '

5' 3'Bouts francs

3' 5 '

B5 , 3' 3'n' ou 575' Hybridatio n

non cohésives synthèse5 '3 ,

C5' 3'

ligature

3'15' Alignement des

extrémité s5 '3 '

5' 3'synthèse

bout franc/3' ou 5' ligature

3' 5

D

5'

3'Dégradation

ou déroulement de l'ADN

3'

5' hybridatio n

5'

3'

toutes extrémités excisions

(synthèse)

41-ligature

3'

Figure 4 : Les différents modèles du NHEJ en fonction du type des extrémités à

liguerLes différentes possibilités d'extrémités engendrées par des enzymes de restriction ains i

que les activités enzymatiques nécessaires pour ligaturer ces extrémités sont présentées .

9

Si la dégradation de l'ADN est prolongée au-delà des microséquences une synthèse est alor s

nécessaire (figure 1D), enfin l'étape de ligature achève la réparation . Il est possible qu'au lieu

d'une dégradation, la recherche des microséquences se fasse par une activité hélicase . Dans c e

cas, aucune synthèse d'ADN n'est requise et quatre excisions seront nécessaires avant l'étape

de ligature .

Dans le cas d'une cassure créée par une enzyme de restriction, les évènements d e

réparation par NHEJ peuvent être fidèles . Cependant après exposition aux radiation s

ionisantes, les extrémités peuvent présenter des sucres ou des bases ouvertes, nécessitant leu r

dégradation pour permettre leur ligature . C'est pourquoi le mécanisme de NHEJ est considér é

comme infidèle .

II Les modèles de la R H

Cette réparation nécessite l'utilisation d'une molécule homologue et est efficace ave c

une longueur d'homologie minimum (MEPS pour Minimal Efficient Processing Segment )

comprise entre 200 et 300 paires de bases (pb) chez les mammifères . La RH peut être

subdivisée en quatre modèles : i) le modèle de Szostak qui a longtemps été considéré comme

le modèle unique de la Recombinaison Homologue, ii) le modèle de synthèse dépendante de

l'hybridation (SDSA pour Synthetis-Dependent Strand Annealing), iii) le modèle d e

réplication induite par une cassure double brin (BIR pour Break-Induced Replication) et enfin

iv) le modèle de dégradation suivie d'une hybridation (SSA pour Single Strand Annealing) .

10

1 . Conversion génique et crossing over

Dans trois modèles de la RH, la molécule d'ADN homologue utilisée transfère so n

information génétique à la molécule endommagée . Ce transfert d'information génétique no n

réciproque est appelé conversion génique et la molécule d'ADN homologue intacte ser a

nommée molécule donneuse . Le crossing over correspond à un transfert réciproque d e

l'information génétique . La conversion génique peut être associée ou non à un crossing over .

2. Le modèle de Szostak

Dans ce modèle, la molécule d'ADN présentant la cassure double brin est tout d'abor d

soumise à une dégradation de polarité 5' vers 3', libérant ainsi des extrémités 3' sortante s

(figure 2A) . Une de ces extrémités envahit la molécule donneuse et s'apparie au brin qui lu i

est complémentaire, une première jonction de Holliday est alors formée . L'autre brin de l a

molécule donneuse est déplacé et s'apparie sur la molécule lésée . A partir de ces extrémités 3 '

hybridées, une synthèse d'ADN s'effectue en utilisant la molécule donneuse comme matric e

(figure 2B). Les extrémités 3' des brins synthétisés sont alors ligaturés aux extrémités 5' de l a

molécule lésée, formant ainsi une deuxième jonction de Holliday (figure 2C) . La résolution d e

ces jonctions permet alors d'obtenir deux types d'évènements : les séquences adjacentes son t

échangées (figure 2D) ou non (figure 2E) . Ces évènements sont donc des conversion s

geniques associées ou non à un crossing over .

11

Activités enzymatique s

A .

5'

3 '

3'

5 '

5 '

3 '

3 '

5'

Exonucléase 5' vers 3 '

B.

5

3 '.3'

5 '

5'

3'

AppariementEchange de brin

Synthèse d'ADN

C

5'

3'

Ligature

Résolution des jonction s

de Holliday

D.

Avec crossing over

Sans crossing over

5' 3' 5' 3 '

3' 5' 3' 5 '

3' 5' 3' 5 '

5' 3' 5' 3'

Figure 2 : Le modèle de Szostak (Szostak et al., 1983 )

Les orientations des molécules d'ADN ainsi que les activités enzymatiques sont présentées .

1 2

Ce modèle a été établi à partir des résultats d'intégration de plasmides obtenus dans l a

levure (Orr-Weaver et al ., . 1981 et 1983) et également des évènements de recombinaiso n

homologue observés lors de la méiose .

3. Le SDSA (pour Synthetis-Dependent Strand Annealing)

Dans ce modèle, les premières étapes du modèle de Szostak sont conservées : l a

dégradation de polarité 5' vers 3' (dégradation), l'envahissement de la molécule donneuse pa r

une extrémité 3' (invasion de brin), la synthèse d'ADN (cf . figure 3A) . Le brin néo-synthétis é

se dissocie de la molécule donneuse et s'hybride au brin de la molécule endommagée . Une

nouvelle synthèse d'ADN ainsi que deux ligatures sont nécessaires pour terminer l a

réparation .

Ce modèle permet d'expliquer le fait que la plupart des évènements de recombinaiso n

homologue lors de la mitose ne sont pas associés à des crossing over . Cependant il existe

d'autres modèles de SDSA tenant compte des crossing over (pour revue Pâques et Haber ,

1999) .

4. Le BIR (pour Break-Induced Replication)

Comme pour le SDSA, les premières étapes du modèle de Szostak sont conservée s

(dégradation, invasion de brin) . Une seule extrémité 3' sert d'amorce à la synthèse . Cette

structure formée constitue une véritable fourche de réplication qui permet la synthèse d u

deuxième brin qui s'étend sur tout le chromosome (cf . figure 3B) .

Exonucléase (5' vers 3' )

Appariement et échange de bri n

-1/

A. SDSA B . BIR

Synthèse d'ADN

Synthèse "réplicative" de l'ADN

/1.

Hybridation

Ligature

44I

Nouvelle synthèse et ligature 1n•Il .11111110.

1 ININI

Modèle sans crossing over

Figure 3 : Présentation des modèles du SDSA et du BIRLes premières étapes (dégradation et invasion de brin) sont communes à ces modèles .

Les activités enzymatiques sont précisées .

14

Le BIR permet d'expliquer de longs évènements de conversion génique qui ont pu êtr e

observés chez la levure (Malkova et al., 1996) .

En résumé, ces trois modèles (Szostak, SDSA et BIR) nécessitent plusieurs activité s

enzymatiques : une dégradation de l'ADN, un appariement et un échange de brin, une

synthèse de réparation, une ligature et pour certains d'entre eux une résolution des jonction s

de Holliday . Ils permettent de restaurer l'information génétique perdue au site de la cassure, c e

sont donc des mécanismes de réparation fidèles . Cependant, si la molécule donneuse utilisé e

est située sur le chromosome homologue, la Recombinaison Homologue peut conduire à de la

perte d'hétérozygotie . Si la molécule donneuse est dispersée dans le génome (recombinaiso n

ectopique), la RH conduit à de l'instabilité génétique .

5. Le SSA (pour Single Strand Annealing)

Ce modèle de réparation (proposé par Lin et al., 1984 et 1985) ne peut s'effectuer que

dans deux cas particuliers : il faut soit deux séquences répétées en orientation directe avec un e

cassure située entre ou sur l'une de ces répétitions (cf . figure 4) soit deux séquence s

homologues ectopiques mais avec une cassure dans chacune de ces séquences (Richardson e t

Jasin, 2000b) . Une dégradation 5' vers 3' libère des zones complémentaires qui sont alor s

capable de s'hybrider . Les extrémités 3' non complémentaires sont alors excisées et un e

ligature des extrémités achève la réparation (cf . figure 4) .

15

Le SSA diffère en de nombreux points avec les autres modèles de la Recombinaiso n

Homologue puisque (i) il ne peut avoir lieu que dans deux cas bien particulier (ii) il n e

nécessite pas d'activité d'invasion de brin (iii) dans le cas des répétitions en orientatio n

directe, la séquence entre les deux répétitions (intragénique) est obligatoirement perdue. Ce

mécanisme est donc non conservatif.

Cassure double brin entre séquences répétées en orientation directe

-11111.11111--4k -111111=11---EllMIE111-- -1111111•1111--

Dégradation des cassures libérant des extrémités 3' sortante s

--1111111.1-

Hybridation des séquences complémentaires et excision des séquences non hybridée s

-11•111111111T/Ell-

Ligature des extrémités

Figure 4 : Modèle de réparation par SSA

Les différentes activités nécessaires pour ce mécanisme sont précisées .

N.B . : Les modèles présentés ici sont initiés par une cassure double brin, mais il e n

existe d'autres où la recombinaison homologue est induite par une ou deux cassures simpl e

brin (Holliday, 1964 ; Meselson et Radding, 1975) .

op.

16

B/ Contrôle génétique des mécanismes de

réparation des cassures double brin

I . Contrôle génétique du NHEJ

Les gènes impliqués dans le NHEJ ont été tout d'abord identifiés chez les mammifère s

grâce à l'étude des mutants de hamster sensibles aux radiations ionisantes et déficients pour l a

recombinaison V(D)J . Les gènes humains qui corrigent les phénotypes de ces mutants ont été

identifiés et quatre d'entre eux participent au NHEJ : XRCC4 à XRCC7 (pour X Ray Cross

Complementation) .

Les gènes XRCC5, XRCC6 et XRCC7 codent respectivement les protéines déj à

connues Ku80, Ku70 et DNA-PKcs (Smider et al ., 1994 ; Taccioli et al ., 1994, Boubnov et

al., 1995 ; Blunt, 1995). Ces protéines forment un complexe nommé DNA-PK (pour DNA-

dependent Protein Kinase) . Le gène XRCC4 ne code aucun gène déjà connu, la protéine ser a

donc nommée Xrcc4 et cette dernière forme un complexe avec la ligase IV (Critchlow et al . ,

1997 ; Grawunder 1997) .

1 . Le complexe DNA-PK

1 .1 .L'hétérodimèreKu

Ku a été identifié pour la première fois comme étant la cible d'anticorps de patient s

présentant la maladie auto-immune : le lupus érythémateux (Mimori et ai ., 1981) . Ku est

constitué de deux sous unités d'environ 70 et 80 kDa (nommée Ku70 et Ku80 ou Ku86) . Les

17

deux principales fonctions de Ku dans le mécanisme du NHEJ sont : (i) de se fixer à l'ADN e t

de rapprocher les extrémités (ii) de recruter les autres protéines impliquées dans le mécanism e

du NHEJ .

1 .1 .1 . L'hétérodimérisation .

Dans les cellules de mammifères inactivées pour l'une des deux sous-unités, l'autre

sous-unité n'est pas détectable (Gu et al., 1997, Nussenzweig et al., 1996) :

l'hétérodimérisation est donc nécessaire à la stabilité de ces protéines . Cependant, il es t

possible de détecter la présence de protéines Ku70 mutantes qui n'interagissent pas avec Ku80

(Jin et Weaver, 1997) .

La translocation de Ku70 et Ku80 dans le noyau peut se faire par leur signal de

localisation nucléaire (NLS) mais également par hétérodimérisation (Koike et al., 2001) .

Certaines études montrent que les protéines Ku70 et Ku80 seules ne se lient pas à

l'ADN (Wu et Lieber, 1996 ; Ochem et al., 1997) : l'hétérodimérisation est égalemen t

nécessaire à l'activité de fixation à l'ADN . Cependant des tests d'immunoprécipitation d e

l'ADN et de Southwestern blot démontrent que la protéine Ku70 seule est capable de se fixe r

à l'ADN (cité dans Wang et al., 1998a) .

De manière plus générale, la présence de l'hétérodimère est indispensable pour l e

mécanisme de réparation par NHEJ (Jin et Weaver, 1997) .

De nombreuses études ont identifié les régions responsables pour cette interaction ,

cependant les résultats restent controversés pour la protéine Ku70 . En effet, les différentes

parties impliquées dans l'interaction sont : la partie C terminale de 20 kDa (Wu et Lieber ,

18

1996) ; une partie centrale (acide aminé 263 à 430 ; Jin et Weaver, 1997) ; deux parties, une N

terminale (aa 1 à 115) et une centrale (aa 430 à 482) (Wang et al ., 1998a) . Pour la protéin e

Ku80, les résultats semblent tous impliquer une partie centrale de la protéine (Wu et Lieber,

1996 ; Osipovitch et al ., 1999 ; Cary et al., 1998 Wang et al ., 1998b) .

1 .1.2. La fixation à l'ADN

Ku est la principale protéine qui se lie à des extrémités d'ADN double brin . Cette

affinité est indépendante de la structure ou de la séquence des extrémités (Mimori et Harding ,

1986 ; Paillard et Strauss, 1991 ; Pang et al., 1997) . Ku se lie également à de l'AD N

présentant des discontinuités mais pas à de l'ADN circulaire fermé (pour revue Dynan et Yoo,

1998) . De nombreuses études ont suggéré que Ku se lie spécifiquement à certaines séquence s

dont des éléments régulateurs de la transcription . Il semblerait que certains de ces résultat s

soient des artéfacts (Bliss et al., 1997 ; pour revue Dynan et Yoo, 1998) .

La fixation de Ku à l'ADN double brin se déroule en deux étapes : Ku se fixe

premièrement aux extrémités puis glisse le long de la molécule d'ADN (deVries et al., 1989 ;

Paillard et Strauss, 1991). La structure de Ku montre que cette translocation se fait pa r

glissement le long de l'ADN puisque 1'hétérodimère possède une région en forme d'anneau où

se loge la molécule d'ADN (Walker et al., 2001 et voir figure 5) .

Une des propriétés de Ku, accrochée aux extrémités de l'ADN, est de les rapprocher e t

de les aligner . Cette propriété a été démontrée par microscopie en force atomique (Cary et al. ,

1997) ainsi que par l'analyse des produits de réparation dans un contexte Ku80 -i- (Kabotyanski

et al., 1998 ; Feldmann et al., 2000) . De plus, Ku stimule l'activité de plusieurs ligase s

19

eucaryotes in vitro (Ramsden et Gellert, 1998) ce qui tend à montrer que cette propriét é

d'alignement a un rôle fonctionnel dans la réparation des cassures double brin .

Ku70 possède deux sites de fixation à l'ADN, un en N terminal qui est dépendant de l a

présence de Ku80 et le deuxième situé en C terminal qui est indépendant de Ku80 (Wang et

al., 1998a) . Les mêmes auteurs montrent que Ku80 ne possède qu'un seul site de fixatio n

l'ADN situé de l'acide aminé (aa) 179 à 510 (Wang et al., 1998b) . Cependant une autre étud e

montre que les régions nécessaires pour l'interaction avec l'ADN se situent dans les parties C

terminales de 40 kDa (aa 254 à 609) et 45 kDa (aa 334 et 732) pour respectivement Ku70 e t

Ku80 (Wu et Lieber, 1996) .

1 .1 .3. Le recrutement de la DNA-PKcs

Ku est considéré comme le facteur de fixation à l'ADN de la DNA-PK qui permet

l'activité kinase de la DNA-PKcs (Gottlieb et Jackson, 1993) . Cette hypothèse est renforcé e

par le fait que les cellules déficientes pour Ku80 ne présentent pas d'activité DNA-PK (Finnie

et al., 1995) . De plus, une forte corrélation entre un hétérodimère Ku fonctionnel et l'activit é

DNA-PK a été démontrée (Jin et Weaver, 1997) . Néanmoins, le complexe Ku/DNA-PKc s

n'est observé que sur des molécules d'ADN en microscopie en force atomique (Yaneva et al . ,

1997) . De plus, en l'absence de Ku, la DNA-PKcs peut se lie à l'ADN et être active . L'ajout de

Ku stabilise la DNA-PKcs sur la molécule d'ADN et stimule son activité kinase (Hammarsten

et Chu, 1998 ; West et al ., 1998) .

20

Le modèle proposé est que Ku se fixe à l'ADN et recrute la DNA-PKcs formant ains i

le complexe DNA-PK . Cette interaction Ku/ADN/DNA-PKcs stabilise la DNA-PKcs sur l a

molécule d'ADN et stimule ainsi son activité kinase (cf figure 5) .

La partie C terminale de 178 aa de Ku80 est impliqué dans l'interaction entre Ku e t

DNA-PK (Singleton et al., 1999) .

1.1.4. Le recrutement du complexe XRCC4 /Ligase IV

Ku interagit également avec le complexe XRCC4/Ligase IV et cette interactio n

stimule d'un facteur 20 la réaction de NHEJ in vitro. I1 a été proposé que Ku recrute

XRCC4ILigase IV aux sites des cassures (Nick McElhinny et al., 2000) .

1 .1 .5 . Autres propriétés de Ku

Ku possède une activité hélicase dépendante de FATP, ce qui lui a valu l'appellatio n

d'HDH II (pour Human DNA Helicase II, Tujeta et al ., 1994) . Cette activité réside uniquement

dans la protéine Ku70 (Ochem et al., 1997). Il serait tentant de postuler que cette activit é

serait responsable pour les évènements de réparation nécessitant les microhomologies (cf . A

I.), mais aucune donnée ne permet de l'affirmer .

L'inositol hexakisphosphate (IP6) se lie, in vitro, à Ku (Ma et Lieber, 2002) et stimul e

la réparation des cassures double brin par NHEJ in vitro (Hanakahi et al ., 2000). La fonction

de cette interaction dans le mécanisme de NHEJ reste à élucider .

21

A

B

c

D

Figure 5 : Modèle de réparation par NHEJ

Aprês formation de la cassure double brin (A) l'hétérodimère Ku (bleu) se fixe au x

extrémités et permet leur rapprochement (B) . Le complexe DNA-PK est formé auxextrémités de l'ADN, activant le domaine kinase de la DNA-PKcs (blanc, C). Si l a

DNA-PKcs s'est autophosphorylée, elle se détache du complexe (D à droite) . Kurecrute le complexe XRCC4 (rouge) / Ligase IV (vert) aux extrémités permettant leu rligature (D) .Il semblerait que l'hétérodimère Ku reste piégé sur la molécule d'ADN réparée, ce qu i

nécessite un mécanisme supplémentaire de dissociation (Walker et al ., 2001) .

22

1 .2 . LaDNA-PKc s

La DNA-PKcs est essentielle au mécanisme de réparation par NHEJ chez le s

mammifères . Chez Saccharomyces cerevisiae, il n'existe pas d'homologue structural ,

cependant il n'est pas exclus que la DNA-PKcs ait un homologue fonctionnel encore no n

identifié . Chez les mammifères, les cellules inactivées pour la DNA-PKcs (par mutation o u

délétion) sont sensibles aux radiations ionisantes et présentent un défaut de réparation des

cassures double brin (Peterson et al ., 1995b ; Kurisama et al ., 1999) . De plus, DNA-PKcs es t

nécessaire à la réaction de NHEJ in vitro (Baumman et West, 1998) . L'utilisation de drogu e

inhibant l'activité kinase de la DNA-PKcs (par exemple la Wortmannin) ainsi que de s

protéines mutées dans le domaine kinase, ont démontré que l'activité kinase de la DNA-PKc s

est essentielle au NHEJ (Kurimasa et al., 1999a ; Baumman et West, 1998) .

1 .2 .1 . Une serine/thréonine kinase de la famille des PI-3 kinases

La DNA-PKcs est une serine/thréonine kinase de poids moléculaire d'environ 47 0

kDa. Elle est constituée d'un seul polypeptide d'environ 4000 acides aminés . Le domaine

kinase est situé dans la partie C terminale (--500 aa) et appartient à la famille des

phosphatidylinositol 3 (PI3)-kinase . Cependant, la DNA-PKcs présente uniquement un e

activité kinase pour les protéines (Hartley et al ., 1995 Poltorasky et al ., 1995 ; Smith et al . ,

1999) . L'activité kinase n'est présente que si la DNA-PKcs est en contact avec l'ADN ce qu i

suggère qu'une fois accrochée la DNA-PKcs subit un changement de conformation libéran t

ainsi son site d'activité kinase . La DNA-PK semble posséder un motif cible d e

23

phosphorylation nommé motif "SQ" (serine ou thréonine suivie immédiatement par une

glutamine) . Cependant certains substrats in vitro de la DNA-PKcs ne sont pas phosphorylés

sur ce motif.

1 .2 .3 . Les fonctions de l'activité kinase dans le mécanisme du NHEJ

Cette fonction n'est pas encore élucidée . La DNA-PKcs phosphoryle in vitro plusieurs

protéines du NHEJ : XRCC4 , Ku et elle même. La phosphorylation de XRCC4 a lieu dan s

une région de la protéine qui n'est pas requise pour la fonction de réparation (Leber et al. ,

1998) . Ku70 est phosphorylée sur une seule serine (aa 6) et Ku80 est phosphorylée sur le s

serines 577 et 580 et sur la thréonine 715 (Chan et al., 1999) . L'implication de ce s

phosphorylations dans le mécanisme du NHEJ n'est pas connue . Enfin, Fautophosphorylation

de la DNA-PKcs résulte en une inactivation de son activité kinase et à sa séparation d u

complexe DNA-PK (Chan et Lees Miller, 1996) . Cette autorégulation suggère une fonction d e

régulation dans le mécanisme du NHEJ .

L'activité kinase de la DNA-PKcs permet le glissement du complexe DNA-PK le lon g

de la molécule d'ADN . Si le complexe reste aux extrémités de l'ADN le processus de ligatur e

n'est pas poursuivi (Calsou et al ., 1999) .

2. Le complexe Xrcceligase I V

Ce complexe catalyse l'étape finale du mécanisme du NHEJ en ligaturant le s

extrémités . L'implication de Xrcc4 dans le mécanisme du NHEJ a été démontrée par de s

études génétiques et biochimiques (Li et al ., 1995 ; Baumman et West, 1998) . Le rôle de l a

24

ligase IV dans le NHEJ fut tout d'abord supposé par le fait qu'elle forme un complexe ave c

Xrcc4 et que ce dernier stimule l'activité ligase in vitro (Grawunder et al., 1997 ; Critchlow et

al., 1997) . De plus, l'homologue de la Ligase IV de la levure S. cerevisiae (Dn14) est impliqué

dans le mécanisme de NHEJ (Wilson et al., 1997) . Enfin, la Ligase IV est indispensable pour

la réaction de NHEJ in vitro (Baumman et West, 1998).

2 .1 . Les protéinesXrcc4etLigaselV

Xrcc4 est une petite phosphoprotéine de 344 aa qui ne contient aucun motif connu .

Lorsque cette protéine est surexprimée dans des cellules d'insecte, elle est trouvée sous form e

d'homodimère lié par des ponts disulfures, elle peut être également présente en de larg e

multimères (Leber et al ., 1998) . L'étude cristallographique montre que la partie N terminale

forme une tête globulaire, que la partie C terminale est constituée d'une hélice allongée e t

que les protéines Xrcc4 forment plutôt un tetramère (Junop et al ., 2000). Dans des lignée s

inactivées pour le gène XRCC4, la protéine ligase IV n'est pas détectable, ce qui démontre

que Xrcc4 stabilise la ligase IV (Bryans et al ., 1999) . In vitro, Xrcc4 augmente l'activité de

fixation à l'ADN de la ligase IV et de Ku (Modesti et al ., 1999 ; Leber et al ., 1998) .

La ligase IV est une protéine de 911 aa possédant un domaine caractéristique de s

ligases d'ADN et en C terminal deux domaines BRCT (pour BRCA1 C Terminal) . Son

interaction avec Xrcc4 se fait grâce un domaine situé entre ces deux domaines (Grawunde r

et al ., 1998) .

25

2.2 . Structure et propriété du complexe

L'étude par cristallographie semble montrer que le complexe est constitué de deu x

molécules Xrcc4 et d'une molécule Ligase IV accrochée sur l'hélice de Xrcc4 (Sibanda et

al ., 2001) . De manière contradictoire, les analyses par gel filtration et par fixation aux U V

montrent que le complexe est un tetramère constitué de 2 copies de chaque protéine (Lee et

al., 2000b) .

In vitro, l'activité ligase est augmentée lorsque les protéines Ku et DNA-PKcs son t

présentes (Lee et al ., 2000b Chen et al., 2000) . Le complexe a une faible affinité de fixatio n

à l'ADN in vitro (Nick McElhinny et al., 2000), ce qui montre l'importance de so n

recrutement aux cassures par Ku. Cependant, le complexe est capable de se lier au x

extrémités des cassures et de les rapprocher. Cette liaison à l'ADN est également observée e n

présence de Ku ou de DNA-PKcs (Chen et al., 2000) . Cette propriété suggère que l e

complexe est capable de rapprocher et d'aligner les extrémités de l'ADN . L'analyse des

produits de réparation par NHEJ dans un contexte XRCC4 -'- semble montrer que Xrcc4 (e t

donc par extrapolation le complexe Xrcc4/Ligase IV) a un rôle d'alignement des extrémité s

(Kabotyanski et al., 1998) .

3. Les autres protéines impliquées dans le NHEJ

Il est clairement défini que les protéines présentées ci-dessus sont impliquées dans l e

mécanisme du NHEJ, mais il n'est pas exclu que d'autres protéines interviennent dans c e

26

mécanisme. Il est possible également qu'il existe un (ou plusieurs) autre(s) mécanisme(s) de

réparation des cassures double brin par ligature des extrémités .

3 .1 . Les protéines impliquées dans leNHEJdépendant des complexesDNA-PKet

XRCC4/ligaselV

3.1 .1 . Le complexe Mrell/Rad5O/Nbsl(Xrs2 )

Ce complexe est constitué de 2 protéines Mre 11, 2 protéines Rad5O et une protéin e

Nbsl (Xrs2 chez la levure S . cerevisiae) . La protéine Mrel 1 possède des activités exonucléas e

de polarité 3' vers 5', endonucléase, d'hybridation de séquences complémentaires (pour revu e

d'Amours et Jackson, 2002) . Le complexe MRN(X) se lie aux extrémités de l'ADN, et perme t

leur rapprochement (de Jager et al ., 2001b ; Chen et al., 2001). Cette propriété pourrait être

due à la protéine Rad5O qui possède une structure typique des protéines maintenant l a

structure des chromosomes (SMC pour Structure Maintenance Chromosome) . De plus, Rad5O

stimule l'activité exonucléasique de Mrel 1 et est responsable de l'accrochage de 1'ATP . La

protéine Nbsl (Xrs2) est nécessaire aux activités de Mrel 1 dépendantes de la présence d'AT P

et permet au complexe de dérouler des molécules d'ADN double brin (Paull et Gellert, 1999) .

Chez S . cerevisiae, le complexe MRX permet la ligature entre deux molécules d'AD N

par le complexe Lifl/DnI4 (l'homologue de Xrcc4/Ligase IV) et Hdfl/Ildf2 (l'homologue d e

Ku) stimule cette ligature (Chen et al., 2001) . De plus, des études génétiques ont clairemen t

démontré que le complexe MRX est impliqué dans la voie du NHEJ (Moore et Haber, 1996 ;

Tsukamoto et al ., 1997) .

27

Chez les mammifères, l'activité exonucléase de Mre 11 est inhibée si les extrémité s

ainsi créées présentent des homologies de séquence (Pauli et Gellert, 2000). De plus, Mre 1 1

possède une activité d'hybridation de séquences complémentaires (de Jager et al., 2001a) . Ces

données supposent que Mrel 1 (par extrapolation le complexe MRN) est impliqué dans la voi e

de NHEJ utilisant des microhomologies (cf . 1 .1 .) . De plus, une étude récente démontr e

l'implication du complexe MRN dans le mécanisme de NHEJ in vitro (Huang et Dynan 2002) .

Cependant, dans la lignée DT40 de poulet, les études par délétion de gènes montrent qu e

Mre 11 et Ku70 ne participent pas à la même voie de réparation des cassures double bri n

(Yamaguchi-Iwai et al., 1999) .

3.1 .2. La protéine WRN

Le syndrome de Werner est une maladie autosomale récessive caractérisé par u n

vieillissement accéléré . Le gène défectueux responsable de cette maladie est Werner (WRN) .

La protéine WRN issu de ce gène possède une activité hélicase 3' vers 5' et une activit é

exonucléase 3' vers 5' . WRN interagit avec l'hétérodimère Ku et cette interaction stimul e

l'activité exonucléase de WRN même sur de l'ADN porteur de 8-oxoG qui habituellemen t

bloque cette activité (Cooper et al., 2000 ; Orren et al ., 2001) . WRN forme un complexe

stable sur l'ADN avec les protéines Ku et DNA-PKcs . De plus, WRN est un substrat in vivo e t

in vitro de la DNA-PK et les lignées déficientes pour WRN présentent une légère sensibilité

aux radiations ionisantes (Yannone et al ., 2001). Toutes ces données tendent à prouver qu e

WRN est impliquée dans la voie du NHEJ . Il faut remarquer toutefois que la protéine WRN

est également impliquée dans des étapes tardives de la RH (cf . II .7 .2) .

28

3 .2. Un mécanisme NHEJ indépendant des complexes DNA-PK et Xrcc4/Li,ase IV

La cinétique de réparation des cassures double brin créées par des radiations ionisantes

présente une courbe biphasique . La première phase est une réparation rapide de la majeure

partie des cassures . La deuxième phase est beaucoup plus lente et ne répare qu'un faibl e

nombre de cassures . Ces deux phases peuvent refléter deux mécanismes distincts d e

réparation (DiBiase et al ., 2000) . Ces deux mécanismes seraient attribués au NHEJ puisqu e

les mutants déficients dans la RH ne présentent pas de cinétique différente à celle de s

sauvages (Wang et al ., 2001) .

La première phase est dépendante de l'activité kinase de la DNA-PKcs et de la Ligase

IV (DiBiase et al ., 2000 ; Wang et al ., 2001) et a été nommé D-NHEJ (pour NHEJ dépendan t

de la DNA-PK) . Les auteurs proposent que ce mécanisme soit une forme accélérée d u

deuxième mécanisme nommé B-NHEJ (pour Basic NHEJ) .

Fanconi Anemia (FA) est une maladie génétique associée à une instabilité génétique e t

une prédisposition au cancer . Huit gènes (FANC) sont impliqués dans cette maladie . Les

produits de réparation d'une cassure à bout franc, présentent de large délétions dans de s

cellules déficientes du gène FANC-C (Escarceller et al., 1998) . De plus, un test in vitro de

ligature de plasmide montre que les lignées déficientes des gènes FANC-A, FANC-D e t

FANC-C ont une activité de ligature, indépendante de la voie DNA-PK et Xrcc4/Ligase IV ,

réduite d'un facteur 3 à 9 (Lundberg et al., 2001) . Toutefois, le rôle putatif des gènes FANC

dans la réparation des cassures double brin par ligature des extrémités reste à être confirmé e t

le mécanisme biochimique à être élucidé .

29

Il Contrôle génétique de la Recombinaison Homologu e

L'étude de la levure S . cerevisiae a très largement contribué à l'identification des gène s

impliqués dans cette voie de réparation . Chez les mammifères, ces gènes ont pu êtr e

identifiés grâce aux homologies de séquences .

1. Le groupe d'épistasie Rad52

L'étude des mutants sensibles aux radiations ionisantes et non aux radiations UV a

permis d'identifier les gènes impliqués dans la Recombinaison Homologue . Ces gènes ont été

classés dans le groupe d'épistasie de RAD52 . Une simple mutation de rad52 confère la mêm e

radiosensibilité qu'une double mutation de rad52 et un autre gène du même groupe d'épistasie .

Une dizaine de gènes ont ainsi été identifiés dont RAD50, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 ,

RAD57, TID1/RDH54 MRE11 et XRS2 . En plus du défaut de réparation des cassures doubl e

brin, la majorité de ces mutants présentent un défaut de méiose montrant le rôle de la RH dan s

ce processus physiologique (cf. D . 11 .1 .2 .) .

L'étude génétique de ces mutants a permis de montrer que ces gènes ne sont pas impliqués d e

la même manière dans les mécanismes de recombinaison homologue . De plus les activité s

biochimiques des protéines codées par ces gènes ont permis de les classer en deux groupes :

- le groupe Rad5O, Mre 11 et Xrs2 qui est impliqué dans la dégradation des cassures de

polarité 5' vers 3' ,

- le groupe Rad51, Rad52, Rad54, Rad55 et Rad57 qui est impliqué dans l'étap e

d'appariement et d'échange des brins homologues .

30

2 . Rad52 : la protéine directrice

2 .1 . Implication dans la Recombinaison Homologu e

Chez S. cerevisiae, la délétion du gène RAD52 confère le phénotype le plus fort vis-à -

vis de la RH, par exemple la recombinaison mitotique est inhibée d'un facteur variant de 100 à

1000. Le gène RAD52 est requis pour tous les événements de RH et est impliqué dans tous le s

modèles : Szostak, BIR, SDSA et SSA (pour revue Pâques et Haber, 1999) .

Chez les mammifères, la délétion de RAD52 conduit à un phénotype beaucoup moin s

marqué : le ciblage de gène (phénomène qui reflète la RH) est diminué de 30 à 40%, le s

cellules ne sont pas sensibles aux radiations ionisantes et enfin les souris ne présentent pas d e

défaut du processus de méiose puisqu'elles sont fertiles (Rijkers et al., 1998) . Il semble donc

que la protéine Rad52 de mammifère ait perdu sa fonction primordiale dans le mécanisme d e

RH . Cependant, la sur-expression de Rad52 confère aux cellules de mammifères un e

augmentation de la RH et de la résistance aux radiations ionisantes (Park et al ., 1995 ; Liu et

Maizels, 2000) . Ces derniers résultats suggèrent que Rad52 est impliquée dans le mécanism e

de RH chez les mammifères .

2 .2 . Propriétés biochimiques de Rad5 2

Les protéines ScRad52 et HsRad52 possèdent des propriétés biochimiques similaires .

Elles se fixent à de l'ADN simple brin et hybride des séquences complémentaires (Mortesen et

al., 1996 ; Reddy et al., 1997) . Cette activité est stimulée par la protéine de réplication A

31

(RPA) (Shinohara et al., 1998 ; Sugiyama et al., 1998) . Ces propriétés biochimiques

expliquent l'implication de Rad52 dans le mécanisme de SSA .

HsRad52 se lie aux extrémités de l'ADN avec une affinité plus grande pour de s

simples brins sortants . Les extrémités sont alors protégées des attaques nucléasiques et son t

rapprochées (Van Dyck et al ., 1999) . Cette propriété suggère que Rad52 fixe les cassures e t

soit réalise le mécanisme de SSA, soit recrute, par ses interactions protéiques, les facteur s

nécessaire à l'initiation de la conversion génique .

2 .3 . Interactions protéiques

La protéine Rad52 interagit avec elle même formant un complexe heptamérique e n

forme d'anneau (Van Dyck et al., 1998 ; Shinohara et al., 1998). La protéine Rad52 interagi t

avec Rad51 et cette interaction est indispensable pour la RH (pour revue Pâques et Haber ,

1999 ; Shen et al ., 1996a) . Enfin, la protéine Rad52 interagit avec la protéine de réplication A

(RPA) . Cette interaction stimule la recombinaison homologue (RH) (Park et al., 1996 pou r

revue Pâques et Haber, 1999) .

Le modèle proposé est qu'après la libération d'extrémités 3' sortantes, celles-ci son t

reconnues par la protéine RPA qui a une forte affinité pour de l'ADN simple brin . La protéine

Rad52 permet de retirer RPA et recrute Rad51 qui catalyse la réaction d'invasion et l'échang e

de brin (cf. figure 6A) .

32

B

C

AFixation des extrémités 3' sortantes par RPA

RPA RPA RPA RPA

Délogement de RPA par Rad52, ScRad55157 ou BCDX2 et/ou Xrcc3/Rad51 C

RPA

Formation du filament Rad5 1 sur les extrémité s

RPA

Légende :

Rad57

Rad55Xrcc3 Rad51 C

Rad51C

Rad5 1 D

Xrcc2

Rad5 1 B

Figure 6 : (A) Formation du filament nucléoprotéique Rad5l sur les extrémités del'ADN. RPA se fixe sur les extrémités d'ADN, les protéines Rad52 (bleu), Rad55 et Rad5 7

chez S . cerevisiae et les complexes BCDX2 et/ou Rad51 C/Xrcc3 chez les mammifère spermettent la formation du filament Rad5 1 notamment en délogeant RPA .

Interactions protéiques de Rad5l chez S. cerevisiae (B) et chez les mammifères (C )

33

3 . Rad5l : la protéine pivot de la conversion géniqu e

3 .1 . Implication dans le mécanisme de recombinaison homologu e

Chez S. cerevisiae, l'invalidation de RADS 1 conduit à une sensibilité accrue aux RI e t

un défaut de recombinaison mitotique et méiotique . Contrairement à RAD52, le gène RAD5 1

n'est pas requis pour tous les événements de recombinaison mitotique : le SSA et une partie

du BIR sont dépendants de ScRad52 et indépendants de ScRad5 1 (pour revue Pâques e t

Haber, 1999) .

Chez les mammifères, l'invalidation du gène RAD51 conduit à la létalité des cellule s

embryonnaires (pour plus de détails cf . DI 1 .) . Ces cellules embryonnaires remises en culture

présentent une perte accrue de chromosomes après exposition aux radiations ionisantes (Lim

et Hasty, 1996) . Ce phénotype pourrait suggérer un rôle dans la réparation des cassure s

double brin, mais cette stratégie d'invalidation ne permet pas de savoir si Rad51 est impliqu é

dans la RH et dans quelles voies de ce mécanisme . La sur-expression de Rad5 1 stimule la R H

spontanée (Vispe et al., 1998). De plus, les sur-expressions de Rad5l et d'un dominant négati f

ont permis de démontrer que Rad5 1 est impliqué dans les évènements de conversion géniqu e

mais n'influe pas le mécanisme du SSA (Lambert et Lopez, 2000) .

3 .2 . Rad5 1 et la réaction d'invasion et d'échange de bri n

La protéine Rad51 est l'homologue de RecA, la protéine bactérienne responsable de

l'étape centrale de la RH . Comme RecA, Rad5l fixe et hydrolyse l'AIT ce qui lui permet d e

former un filament protéique sur de l'ADN simple brin et de catalyser, in vitro, l'appariemen t

34

(recherche et invasion de la séquence homologue) et l'échange de brins entre séquence s

homologues . L'ATP a deux rôle, c'est un effecteur allostérique et une source d'énergie .

L'hydrolyse de l'ATP par Rad5 1 n'est pas indispensable pour l'appariement et l'échange d e

brin (Morrison et al., 1999) . Une différence entre HsRad5 1 et ScRad5 1 est que la formatio n

du filament est indépendante de la présence d'ATP chez l'homme (de Zutter et al., 1999 ;

Namsaraev et al., 1998 Zaitseva et al., 1999). L'échange de brin est beaucoup moins efficac e

si les séquences d'ADN contiennent de nombreux nucléotides G ou C (Gupta et al., 1999) e t

l'activité d'échange de brin de HsRad5l est moindre que celle de ScRad51 ou de RecA . Le

rôle d'HsRad5l serait limité à la recherche et à l'invasion de brin . Cependant la réaction

d'appariement et d'échange de brin est stimulée par d'autres protéines comme HsRad52 e t

HsRPA. De plus, HsRad5 1 interagit avec de nombreuses protéines qui pourraient égalemen t

stimuler son activité .

La partie N terminale de Rad51 contient le domaine d'interaction avec l'ADN (Aihar a

et al., 1999) .

3 .3 . Interactions protéiques deRad51

Rad51 interagit avec de nombreuses protéines et ces interactions facilitent l'activit é

d'invasion et d'échange de brin (cf. figure 6B et 6C) .

L'interaction avec Rad52 est indispensable pour que Rad51 puisse former un filamen t

sur les extrémités 3' sortantes recouvertes par RPA . De plus, la protéine humaine Rad5 1

interagit directement mais faiblement avec HsRPA (Golub et al., 1998) .

35

Rad51 interagit avec certains de ses paralogues qui sont Rad55 chez S . cerevisiae, et

XRCC3 et Rad5lC chez les mammifères . Rad5l s'associe également avec Rad54 et son

homologue Rad54B . Le rôle de ces interactions sera décrit ultérieurement .

La protéine humaine Rad51 interagit également avec des protéines qui ne possèden t

pas d'homologue structuraux dans la levure : les suppresseurs de tumeurs Brca 1, Brca 2

(Mizuta et al ., 1997 ; Scully et al ., 1997 ; Sharan et al., 1997 ; Wong et al ., 1997 ; Chen et al . ,

1998 ; Katagiri et al ., 1998) et p53 (Sturzbecher et al ., 1996 ; Bucchop et al ., 1997) . Le rôle

de Brca2 serait de transporter Rad5 1 dans le noyau et de moduler l'activité de fixation à

l'ADN de Rad5 1 (Davies et al ., 2001) . In vitro, la protéine p53 inhibe l'activité d'échange d e

brin catalysée par RecA et donc probablement celle de Rad5 1 (Bucchop et al., 1997) . De plus ,

p53 inhiberait l'invasion de brin lorsque des mésappariements sont présents entre la molécul e

donneuse et la molécule endommagée (Susse et al., 2000) . La fonction de Brcal serait d e

reconnaître et de signaler les cassures double brin (cf . C 11 .3 .1 .2 .) .

4. Les paralogues de Rad5 l

Les paralogues de Rad51 sont des protéines qui partagent des homologies d e

séquences avec Rad5l . Chez S. cerevisiae, ces paralogues sont Rad55, Rad57 et la protéin e

spécifique à la méiose Dmcl . Chez les mammifères, Rad5l possèdent six paralogues : Dmcl ,

XRCC2, XRCC3 et Rad5lB-D .

36

4.1 . Rad55 et Rad5 7

Ces protéines forment un hétérodimère et ont pour fonction d'aider Rad5 1 à former u n

filament sur les extrémités simples brins recouvertes par RPA (Sung, 1997) . Ils possèden t

donc le même rôle que Rad52, mais contrairement à cette dernière, ils ne sont pa s

indispensables au mécanisme de recombinaison homologue (pour revue Pâques et Haber ,

1999) .

4 .2 .Xrcc2, Xrcc3etRad5lB-D

Les gènes XRCC2 et XRCC3 ont été identifiés par complémentation de lignée s

sensibles aux radiations ionisantes . Ces deux gènes sont impliqués dans la Recombinaiso n

Homologue (Johnson et al., 1999 ; Pierce et al., 1999) . Les protéines Rad5 1B-D ont ét é

identifiées sur la base de leurs homologies de séquences . Dans les lignées DT40 de poule t

tous les paralogues sont impliqués dans la RH (Takata et al., 2000 et 2001) .

Les paralogues interagissent avec un ou plusieurs autre(s) paralogue(s), mais aucu n

n'interagit avec lui-même (pour revue Thompson et Schild, 2000) . Ces interactions conduisent

à la formation de plusieurs complexes qui ont des activités biochimiques propres . Le

complexe Rad5lB/C (Masson et al., 2001 ; Sigurdsson et al., 2001) se lie à de l'ADN simpl e

brin (sb) et lève partiellement la compétition entre Rad51 et RPA sur 1'ADNsb (Sigurdsson et

al ., 2001) . Les complexes Rad5IC/Xrcc3 et Rads ID/Xrcc2 peuvent catalyser la réactio n

d'appariement de brin et Rad5lD/Xrcc2 forme un filament sur de I'ADNsb (Kurumizaka et

al., 2001 Kurumizaka et al., 2002) . Rad5IC interagit in vivo simultanément avec la protéin e

37

Rad5lB et le complexe Rad5lD/Xrcc2 formant ainsi le complexe Rad51 BlCID/Xrcc 2

(BCDX2 Masson et al., 2001 ; Liu et al., 2002) . BCDX2 se lie à des régions d'ADNs b

(Masson et al ., 2001) . Seul le complexe Rad5lC/Xrcc3 interagit avec Rad5l (Liu et al . ,

2002) .

Seule la protéine Rad5lB a été purifiée et caractérisée, elle possède une activité kinas e

et phosphoryle plusieurs protéines comme p53, la cycline E, Cdk2 (Havre et al., 2000) . Elle

interagit in vitro avec p53, PCNA et Cdc2 (pour revue Thompson et Schild, 2000) .

La fonction de ces paralogues dans le mécanisme de RH n'est pas entièremen t

déterminée . Ils auraient des fonctions similaires à celles de Rad55 et Rad57 : faciliter la

formation du filament sur les extrémités simples brins et augmenter l'activité de Rad5 1 dans l a

réaction d'appariement et d'échange de brin (cf . figure 6) . Ils pourraient remplacer Rad5 1 dan s

les tissus oià cette dernière n'est pas présente (par exemple le cerveau Kurumikaza et al . ,

2001) .

5. Rad54 et son homologue

5 .1 .Implication dans le mécanisme de recombinaison homologu e

La protéine ScRad54 est impliquée dans la recombinaison homologue mitotique, dan s

la même voie que ScRad51, mais implique spécifiquement des évènements de recombinaiso n

homologue entre chromatides soeurs (Arbel et al., 1999) .

Chez les mammifères, la délétion du gène RAD54 confère un phénotype de

radiosensibilité aux radiations ionisantes et inhibe le ciblage de gène dans les cellule s

38

embryonnaires souches (ES) (Essers et al., 1997) . Comme pour S . cerevisiae, Rad54 particip e

à la recombinaison homologue entre chromatides soeurs (Dronckert et al ., 2000) .

5 .2 . Rad54 membre de la famille des protéines SWF2/SW 1 2

La séquence de Rad54 contient un domaine consensus d'hélicase qui la place dans l a

famille des protéines SWF2/SW12. Comme les autres membres de cette famille, Rad5 4

possède une activité ATPase dépendante essentiellement d'ADN double brin (db) .

Rad54 stimule la réaction d'appariement et d'échange de brin catalysée par Rad51 . La

purification de Rad54 a permis d'établir ses activités biochimiques afin d'expliquer son rôle

stimulateur. Rad54 ne possède pas d'activité hélicase, mais est capable de modifier l a

topologie de l'ADN . Cette activité est dépendante de l'activité ATPase (Tan et al ., 1999 ;

Petukhova et al ., 1999) . Ces résultats suggèrent que Rad54 est capable de "dérouler" l'ADN .

La protéine Rad54 possède un homologue Rad54B pour les mammifères et Tid1lRdh 4

pour S. cerevisiae . Tout comme Rad54, ces homologues sont de la famille des protéine s

SWF2ISW12, sont impliquées dans la RH (Klein, 1997 ; Shinohara 1997b Miyagawa et al . ,

2002) et interagissent avec Rad5l (Shinohara 2000 ; Tanaka et al., 2000) . Ils pourraient avoi r

des rôles recouvrant ceux de Rad54, mais également des rôles spécifiques puisque leur mutan t

présente des différences phénotypiques à ceux de Rad54 (pas de sensibilités aux radiation s

ionisantes, évènements entre chromatides soeurs non affectés) .

39

6. Le complexe MRN(X) : maturation des cassures et stabilisation des

chromatides

Chez S . cerevisiae, la délétion d'un des gènes du complexe conduit à un retard d e

l'activité de dégradation 5' vers 3' in vivo (Ivanov et al., 1994) . De manière surprenante, l a

protéine Mre 11 possède une activité exonucléase de polarité 3' vers 5' et non pas 5' vers 3' . Le

complexe MRX est donc impliqué dans la maturation des cassures double brin (dégradatio n

de l'ADN de polarité 5' vers 3'), mais d'autres activités nucléasiques sont nécessaire pour cette

réaction .

La mutation de l'un de ces gènes conduit à une inhibition de la RH entre chromatide s

soeurs et entre chromosomes homologues induites par les radiations ionisantes . Cette

inhibition est indépendante de l'activité nucléase de Mrel 1 (Bressan et ai., 1999) . De plus, ce s

mutants présentent une augmentation de la recombinaison hétéro-allélique spontané e

(Ajimura et al ., 1993) .

Toutes ces données suggèrent que le complexe est capable de stabiliser le s

chromatides, et plus particulièrement les chromatides soeurs, ce qui faciliterait le mécanism e

de recombinaison homologue .

Chez les mammifères, aucune démonstration directe ne permet d'affirmer que l e

complexe MRN est impliqué dans la recombinaison homologue . Cependant, l'activité

d'appariement de séquences homologues de Mre 11 pourrait impliquer cette dernière dans le s

mécanismes de SDSA et/ou de SSA qui nécessitent une étape d'hybridation de séquence s

complémentaires (voir A II 3 . et 4 .)

40

7. Autres protéines impliquées dans la Recombinaison Homologu e

Les protéines présentées ci-dessus ne sont impliquées que dans les premières étapes d e

la RH : c'est-à-dire la maturation des cassures et l'appariement et l'échange de brin (RH). Les

protéines impliquées dans les autres étapes sont présentées dans ce chapitre .

7 .1 . Des protéines de la réparation par excision de nucléotides et des

mésappariemmentssont impliquées dans le mécanisme duSSA

Le mécanisme de SSA nécessite l'excision des brins non homologues et non hybridé s

(cf . figure 4) . Chez S. cerevisiae, cette réaction est réalisée par les protéines Radl et RadI O

qui appartiennent au mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER) (Fishmann-

Lobel et al., 1992) . Ces protéines possèdent une activité endonucléase clivant les extrémités 3 '

non hybridées . Aucune autre protéine du NER n'est impliquée dans le SSA (Ivanov et Haber,

1995) . Le SSA dépend également des protéines Msh2 et Msh3 qui permettrait de stabiliser l a

structure et de recruter Radl/RadlO grâce à l'interaction entre Msh2 et Rad 1 (Sugawara et al . ,

1997 ; Bertrand et al ., 1998) .

7.2. La migration et la résolution des jonctions de Holliday

Chez Escherichia . coli, les réactions de migration et de résolution des jonctions d e

Holliday sont catalysées par le complexe RuvABC . Les protéines RuvA et RuvB son t

responsables de la migration des jonctions de manière dépendante de La protéin e

RuvC résout les jonctions . Ces activités sont retrouvées dans les cellules de mammifères e t

41

sont similaires à celles des procaryotes (Constantinou et al., 2001) . Cependant les protéines

permettant de catalyser ces réactions ne sont pas encore identifiées .

La protéine WRN permet in vitro la migration des jonctions de Holliday (Constantino u

et al., 2000) . Le syndrome de Bloom est une maladie autosomale récessive caractérisé

notamment à une prédisposition à de nombreux types de cancers (German, 1995) . Le gène

défectueux responsable de cette maladie est Bloom (BLM) . Comme WRN, la protéine BLM

est une hélicase de la famille RecQ impliquée dans la migration des jonctions de Holliday in

vitro (Karow et al., 2000) .

La protéine p53 module les activités des hélicases WRN et BLM et donc participerai t

à la régulation de la migration des jonctions de Holliday (Yang et al., 2002) . De plus, p53 fixe

des structures mimant les jonctions de Holliday et permettrait d'exposer des zones d'ADN

simple brin facilitant ainsi leur clivage par des endonucléases (Lee et al., 1997a) .

42

Cl Régulation des mécanismes de réparation de scassures double brin

La cellule dispose de deux mécanismes distincts pour réparer les cassures double brin :

la Recombinaison Homologue (RH) et la ligature des extrémités (NHEJ) . Ce chapitre présente

dans un premier temps les paramètres orientant la réparation vers un de ces mécanismes . La

deuxième partie détaille comment les cellules réagissent face à un stress créant des cassure s

double brin : les radiations ionisantes .

I . Le choix des mécanismes de réparatio n

Plusieurs paramètres déterminent ce choix . Ceux-ci n'orientent pas exclusivement mai s

favorisent la réparation par l'un de ces mécanismes .

1 . Le type d'organisme

Les organismes utilisent de manière différente les deux voies de réparation dont il s

disposent . Les bactéries réparent les cassures double brin essentiellement par recombinaison

homologue, elles ont largement contribué à la compréhension de ce mécanisme . Les activité s

biochimiques et les protéines permettant la recombinaison homologue ont d'ailleurs ét é

identifiées tout d'abord chez E. coli . Les eucaryotes présentent également des différences

d'utilisation des mécanismes de réparation .

43

1 .1 . La levure et la recombinaison homologue

Comme E. Coli, les levures et tout particulièrement S . cerevisiae répare les cassure s

double brin majoritairement par recombinaison homologue . Les mutants sensibles au x

radiations ionisantes ont permis d'identifier uniquement les gènes impliqués dans l a

Recombinaison Homologue (le groupe d'épistasie Rad52 cf . A III 1) . La levure dispos e

pourtant du mécanisme de NHEJ (cf . A II) mais pour révéler la sensibilité aux radiation s

ionisantes (RI) des mutants du NHEJ, la recombinaison homologue doit être inactivée (Sied e

et al., 1996 Boulton et Jackson, 1996 a et b) .

1 .2 . Les cellules de mammifères et leNHEJ

Contrairement aux levures et aux bactéries, les cellules de mammifères semblen t

utiliser principalement le mécanisme de NHEJ . Cette hypothèse vient du fait que le crible de s

mutants les plus sensibles aux radiations ionisantes a permis d'identifier les gènes impliqué s

dans le NHEJ (pour revue Jeggo 1998) . Cependant, des mutants sensibles aux RI ont permi s

également d'identifier des gènes impliqués dans la RH : XRCC2, XRCC3 et XRCC1 1

(BRCA2) . De plus, l'étude de la réparation d'une seule coupure (induite par une méganucléas e

1-Sc-el) ciblée dans un substrat permettant une réparation par les deux mécanismes montre qu e

la RH prend en charge 40 à 50 % des cassures (Liang et al., 1998). Il est important de

remarquer que dans cette étude la quantification des événements de réparation ne tient pa s

compte de la réparation fidèle par NHEJ (indétectable par cette stratégie) . La RH en est du

coup surestimée .

44

1 .3 . Le cas particulier des cellules DT40 de poule t

De nombreuses études sur la réparation des cassures double brin ont été réalisées dan s

des cellules B transformées de poulet (lignée DT40) par l'équipe de Takeda . Ces cellules

utilisent les deux mécanismes de réparation des CDB . En effet, les mutants du NHEJ comm e

les mutants de la RH (lorsqu'ils sont viables) sont extrêmement sensibles aux radiation s

ionisantes . Cependant le niveau de RH est plus élevé par rapport à des cellules d e

mammifères . Ce statut est caractérisé par un taux particulièrement élevé du ciblage de gèn e

(Buerstedde et Takeda, 1991 ; Takeda et al., 1992) qui permet aisément de générer de s

mutants. Toutefois, ce modèle présente des différences importantes avec les cellules d e

mammifères, notamment les lignées déficientes de Ku70 sont plus résistantes que les lignée s

sauvages à de fortes doses de radiations ionisantes .

2. Le stade de développement chez les mammifères

Les cellules de mammifères répondent différemment aux radiations ionisantes e n

fonction du stade de développement . En effet, les cellules souches embryonnaires (ES) et le s

embryons de souris déficients pour Rad54 (et donc pour la RH) sont sensibles aux RI ,

contrairement aux souris adultes (Essers et al., 2000). Des résultats opposés sont obtenus pou r

DNA-PKcs : les cellules ES DNA-PKc s-'- ne sont pas sensibles aux RI, alors que les adultes l e

sont (Biedermann et al., 1991 ; Gao et al ., 1998) . Ces résultats montrent que la RH es t

préférentiellement utilisée au stade embryonnaire, tandis que le NHEJ est utilisé au stad e

adulte. Ces résultats sont nuancés par le fait que les cellules ES ainsi que les souris adulte s

45

déficientes pour Ku sont sensibles aux radiations ionisantes (Gu et al ., 1997 ; Nussenzweig et

al., 1997) .

3. Les protéines orientant la réparatio n

Deux hypothèses sont émises sur les protéines qui orientent la réparation vers l'un de s

mécanismes . La première est une compétition entre les protéines impliquées dans une de s

voies . La seconde propose que le complexe MRN(X) détermine le mécanisme qui prend e n

charge la cassure .

3 .1 . La compétition entre Ku et Rad5 2

Ces deux protéines sont capables de fixer les extrémités des cassures et de le s

rapprocher. Elles sont donc impliquées dans les premières étapes de leur mécanisme respecti f

(voir A II et III) . Une compétition entre ces protéines déterminerait l'utilisation de la voie d e

réparation (Van Dyck et al., 1999) : Ku oriente la réparation vers le NHEJ tandis que Rad5 2

dirige la réparation soit vers le SSA soit vers la conversion génique (cf. figure 7) .

3 .2 . Orientation par le complexe MRN(X)

Ce complexe est capable de fixer les extrémités et de les rapprocher . Ces activité s

biochimiques favorisent les réactions de réparation dépendante de l'homologie et du NHEJ .

De manière plus générale chez S . cerevisiae, les gènes MRE11, RADS() et XRS2 son t

impliqués dans ces deux mécanismes . Le complexe MRN(X) pourrait donc avoir un rôle cle f

46

dans l'orientation de la réparation (Pauli et Gellert, 1999) . Cette hypothèse suppose que l e

complexe recrute des protéines impliquées dans un des mécanismes . Elle est donc renforcée

par le fait que Mre11 interagit avec Ku70 et RPA (Goedecke et al., 1999 Lee et al., 1998) .

Cassure double bri n

Rad5O/Mre11 /Nbs 1

Rad5O/Mre 1 1 /Nbs 1

Ku

Rad52

Réparation par NHEJ

Réparation par SSA Réparation par CG

Figure7 : Modèle d'orientation de la réparation : après formation de la cassure double bri n

les protéines Ku (bleu) et Rad52 (rouge) orientent vers leur mécanisme de réparatio nrespectif. Les protéines Rad50, Mre 1 1 et Nbs 1 soit interviennent avant l'orientation soi tparticipent à cette orientation .

4. Le cycle cellulaire

Les mécanismes de réparation agissent différemment en fonction de la phase du cycle .

4 .1 . La Recombinaison Homologue et la phase fin deS/G2

La RH utilise une molécule d'ADN donneuse intacte . Cette dernière peut être située

sur la chromatide soeur, sur le chromosome homologue ou sur un chromosome no n

homologue (recombinaison ectopique) . Quel que soit le type d'organisme, la recombinaiso n

47

homologue utilise préférentiellement la chromatide soeur comme substrat (Kadyk et Hartwell ,

1992 ; Johnson et Jasin, 2000) . La présence de la chromatide soeur implique que les cellule s

ont répliqué leur ADN (G2) ou sont en fin de réplication (fin S) . De manière concordante ,

l'expression de Rad5 1 et de Rad52 chez les mammifères, est régulée en fonction du cycl e

cellulaire . Elle débute en phase S pour atteindre un maximum en phase G2/M (Flygare et al . ,

1996 ; Yamamoto et al., 1996 ; Chen et al ., 1997) . Cependant, chez la levure S . cerevisiae, l a

RH peut avoir lieu et peut être inductible par les radiations ionisantes en G1, mais ce s

événements sont rares (Fabre, 1978) . Chez les lymphocytes B de poulet (DT40), la RH jou e

un rôle dominant dans la réparation des cassures double brin induites par les radiation s

ionisantes lors de la phase fin de S/G2 (Takata et al ., 1998) .

L'utilisation préférentielle de la chromatide soeur par la RH peut s'expliquer par le fai t

que cette dernière est proche de la cassure, facilitant ainsi la recherche de l'homologie .

4 .2 . Le NHEJ et la phase G1/début deSchez les vertébrés

Des cellules de mammifères déficientes pour la DNA-PKcs sont extrêmemen t

sensibles lorsqu'elles sont irradiées en Gl et ne le sont plus en G2 (Lee et al ., 1997b) . Ces

résultats suggèrent que le NHEJ est prépondérant en G 1 . Similairement, dans les lignée s

DT40, le NHEJ est essentiellement utilisé dans la réparation des cassures double brin induite s

par les radiations ionisantes lors de la phase G1/début de S (Takata et al ., 1998) .

En revanche, dans la levure S . cerevisiae, le NHEJ est beaucoup moins efficace en G 1

que dans les autres phases du cycle pour réparer une cassure induite (Moore et Haber, 1996) .

48

Les paramètres présentés ci-dessus permettent d'orienter la réparation majoritairemen t

vers un des mécanismes . Cependant, il est possible que ces mécanismes collaborent pour

réparer une cassure double brin . En effet, la réparation peut être initiée par la RH et achevée

par un mécanisme de NHEJ (Richardson et Jasin, 2000a) . Toutefois, il n'a pas été clairement

démontré, dans cette étude, que le mécanisme de NHEJ en question soit la voie métabolique

impliquant les complexes DNA-PK et Xrcc4/Ligase IV .

II Les réponses aux radiations ionisante s

Les radiations ionisantes créent plusieurs types de dommages de l'ADN dont de s

cassures double brin . Cette partie présente comment les cellules réagissent face à ce stress . La

cellule doit tout d'abord reconnaître et signaler la présence des cassures double brin afin d e

mettre en place différents mécanismes permettant de gérer ces cassures dont trois seron t

abordés : l'arrêt du cycle cellulaire, la réparation des cassures et l'apoptose .

1 . Les senseurs des cassures double brin

La protéine ATM est considérée comme un senseur principal des cassures double brin .

D'autres protéines comme ATR et la DNA-PKcs peuvent également jouer ce rôle chez les

mammifères .

1 .1 . Implication d'ATM dans la signalisation des cassures double brin .

L'inactivation du gène ATM. conduit à l'ataxie télangiectasie, un syndrome caractéris é

par de nombreux symptômes cliniques dont une prédisposition aux cancers . Les cellule s

49

déficientes pour ATM présentent de nombreux phénotypes qui suggèrent un rôle central dan s

la réponse aux radiations ionisantes (pour revue Rotman et Shiloh, 1999). La protéine ATM

est une protéine kinase de la famille des Pl-3 kinases (Savitsky et al ., 1995) qui est activée

spécifiquement par les cassures double brin (Banin et al ., 1998 ; Canman et al., 1998) .

Toutefois, le mécanisme de cette activation reste inconnu . Il est possible que le complexe

BASC (pour Brcal-Associated genome Surveillance Complex) soit responsable de la

reconnaissance des CDB (Wang et al., 2000) .

ATM phosphoryle de nombreuses protéines qui sont impliqués directement o u

indirectement dans les mécanismes apoptotiques et/ou d'arrêt cellulaire et/ou de réparation .

Ces cibles sont : Nbsl, p53, Mdm2, c-Abl, Brca 1 , Chkl et Chk2 (cf . figure 8) .

Cassure double bri n

ATM

Mdm2Chkl

Cycle cellulaire

Réparation

Apoptos e

Figure 8 : Rôle de la protéine ATM dans la signalisation des cassures double brin : après

formation de la cassure double brin, la protéine ATM est activée et phosphoryle d e

nombreuses cibles qui transmettent le signal permettant ainsi l'arrêt du cycle cellulaire, l a

réparation ou Fapoptose .

50

1 .2 . Autres protéines impliquées dans la signalisatio n

D'autres protéines sont également capables de signaler la présence des cassures double

brin . Les cibles d'ATM dans des lignées mutées pour cette dernière sont tout de mêm e

phosphorylées mais avec une cinétique réduite . Plusieurs protéines sont candidates pou r

expliquer ces phosphorylations indépendantes d'ATM, dont deux seront détaillées ci-dessou s

ATR et DNA-PKcs .

1 .2 .1. La protéine ATR

Tout comme ATM, ATR est une protéine kinase de la famille des PI-3 kinases . Elle

partage de nombreuses cibles communes avec ATM (Kim et al ., 1999) . Elle est indispensable

à l'activation de p53 face aux radiations UV ; elle semble donc impliquée dans la signalisatio n

de ce type de dommages . Ainsi, ATM et ATR seraient spécialisées dans la réponse à un type

de dommage spécifique. Toutefois ATR semble participer à la signalisation des radiation s

ionisantes . En effet, ATR est impliquée dans l'activation tardive de p53 en réponse aux RI

(Tibbetts et al., 1999) . De même la phosphorylation de Chk2 a lieu tardivement dans de s

lignées A-T et ATR en serait responsable . De plus, chez S . cerevisiae, la sur-expression de l a

protéine ATR, dans une lignée mutée pour MEC1 (homologue d'ATM), complémente l a

sensibilité aux RI (Bentley et al ., 1996) . Cependant, comme les RI ne produisent pas que de s

cassures double brin (cf . tableau 1), ATR pourrait signaler d'autres dommages que le s

cassures double brin .

51

1 .2 .2. DNA-PKcs : réparation et/ou signalisation ?

La DNA-PKcs appartient à la même famille kinase qu'ATM et ATR (cf. B I 1 .2 .1 .) .

Elle reconnaît les cassures double brin et est impliquée dans leur réparation . Elle phosphoryl e

in vitro certains substrats identiques à ceux d'ATM dont p53 (Lees Miller et al., 1992), Mdm2

(Mayo et al., 1997) et c-Abl (Kharbanda et al., 1997) .

La phosphorylation in vivo de p53 par la DNA-PK reste très controversée . Plusieur s

études montrent que p53 est activée dans des lignées mutées ou inactivées par délétion pour l a

DNA-PKcs (Gurley et Kemp, 1996 ; Burma et al ., 1999 Jimenez et al ., 1999 ; Jhappan et al . ,

2000) . De plus de nombreuses études montrent que ces lignées ne présentent pas de défaut d e

contrôle du cycle cellulaire (pour revue Smith et Jackson, 1999) . Cependant, une étud e

montre que DNA-PK est nécessaire, mais pas suffisante, pour l'activation de la fixation d e

p53 à des séquences spécifiques (Woo et al., 1998). Enfin, une étude montre que la DNA-

PKcs régule spécifiquement 1'apoptose dépendante de p53 mais pas l'arrêt du cycle cellulaire

(Wang et al ., 2000) .

L'activation par phosphorylation de c-Abl in vivo par la DNA-PK est égalemen t

controversée : les cellules déficientes pour la DNA-PKcs seraient en partie défectives pou r

l'activation de c-Abl (cité dans la revue Kharbanda et al., 1998) tandis qu'une étude montr e

que cette activation est uniquement dépendante d'ATM (Shangary et al., 2000) .

Tous ces résultats suggèrent que la DNA-PK n'est pas le senseur principal des cassure s

double brin . Elle pourrait néanmoins contribuer partiellement à la signalisation des cassure s

double brin en plus de son rôle dans leur réparation .

52

2. Les arrêts du cycle cellulaire

Un des mécanismes mis en place par la cellule pour gérer les cassures double brin es t

de bloquer les cellules dans les différentes phases du cycle . Ces contrôles de la progression d u

cycle cellulaire éviteraient la réplication de l'ADN endommagé (point de contrôle G 1/S et

intra-S) ou la ségrégation de chromosomes endommagés (point de contrôle G2/M) . Ces arrêt s

du cycle cellulaire donneraient donc le temps nécessaire pour effectuer la réparation . De plus ,

ils pourraient déterminer le choix des mécanismes de réparation .

2 .1 . Le point de contrôleGl/S:un des rôles dep53

Le contrôle de la transition de la phase G1 à la phase S est majoritairement réservé a u

suppresseur de tumeur p53 (cf. figure 9) . Après exposition aux RI, la quantité de protéin e

ainsi que l'activité transcriptionnelle de p53 sont augmentées . Ainsi, la protéine p21 es t

fortement exprimée et inhibe le complexe Cycline E/Cdk2 responsable de la transition G 1/S .

Toutefois, p53 peut agir sur ce point de contrôle indépendamment de p21, notamment via son

interaction avec c-Abl (Yuan et al., 1996) .

L'accumulation de p53 est liée aux phosphorylations des protéines Mdm2 et p53 sur

leur résidu Ser395 (Maya et al., 2001) et Ser2O respectivement. Mdm2 est directemen t

phosphorylée par ATM (Khosravi et al., 1999 ; de Toledo et al., 2000) tandis que p53 est

phosphorylée par Chk2 (Chehab et al., 2000 ; Hirao et al., 2000) elle même activée par AT M

(Matsuoka et al., 2000 ; Zhou et al., 2000). L'augmentation de l'activité de transactivation d e

53

p53 est due en partie à sa phosphorylation, directement dépendante d'ATM, sur le résid u

Ser15 (Siliciano et al., 1997) .

2 .2. Le point de contrôle intra-S: deux mécanismes parallèles

L'inactivation de l'arrêt en phase S, après une exposition aux RI, est caractérisée par

une synthèse d'ADN radio-résistante . La phosphorylation de Nbs 1 par ATM est un e

composante de l'arrêt en phase S (cf. figure 9) . Le mécanisme d'action passe par l a

phosphorylation de la protéine Smc 1 impliquée dans le maintien structurel des chromosome s

(Yazdi et al., 2002) .

En réponse aux RI, l'arrêt en phase S est corrélé à une diminution de l'activité du

complexe CyclineA/Cdk2 . La protéine Cdc25A est nécessaire à l'activité de ce complexe . Or ,

après irradiation, cette protéine est phosphorylée par ATM et Chk2 ce qui conduit à sa

dégradation et donc à l'arrêt en phase S (Falck et al., 2001) .

Ces deux mécanismes du contrôle de la phase S seraient indépendants et agiraient sur

des étapes différentes de la réplication (Falck et al., 2002) .

2 .3 . Le point de contrôle G2/M

L'entrée en mitose est contrôlée par le complexe Cycline B/Cdc2. Ce dernier doit êtr e

actif pour que se fasse la transition . L'activation de ce complexe nécessite l a

déphosphorylation de Cdc2 réalisée par la phosphatase Cdc25C . Après exposition au x

radiations ionisantes, cette dernière est dégradée suite à une phosphorylation, bloquant ains i

54

les cellules en G2 . Les kinases responsables de cette phosphorylation sont Chk 1 et Chk2 (cf.

figure 9). Ces dernières sont activées par ATM de manière directe pour Chk2 et probablement

indirecte pour Chkl .

ATM/ATR

Mdm2

Cdc25 .A. Cdc25C

Ci 2Gi

Cdk2

Cycline A

S

Cdc2

Cycline B

0- M

Figure 9 : Mécanismes d'actions conduisant aux différents arrêts du cycle cellulaire .Pour les commentaires voir le text e

Le suppresseur de tumeur p53 jouerait également un rôle dans ce point de contrôl e

(non représenté dans la figure 9) . En effet, l'activation de p53 résulte en une induction de

plusieurs gènes qui peuvent inhiber Cdc2 (Wang et al., 1999 ; Chan et al ., 2000). Elle peu t

également réprimer la transcription du gène CDC2 et se lier directement à Cdc2 inhibant ains i

son activité (Abaneh et al., 2001) .

55

3. Modifications post-traductionnelles des protéines de réparatio n

Après exposition aux radiations ionisantes, les cellules doivent mettre en place e t

réguler les mécanismes permettant de réparer les cassures double brin . Chez les mammifères ,

contrairement à la levure, peu de gènes de réparation sont induits suite à un stres s

génotoxique . Les protéines impliquées dans les mécanismes de réparation subissent de s

transformations post-traductionnelles qui sont responsables de leur activation et de leu r

régulation . Trois types de modifications sont observables : des phosphorylations, des re-

localisations sous forme de foyers et enfin une dégradation .

3 .1 .Phosphorylationsdes protéines de réparation

Plusieurs protéines impliquées directement ou indirectement dans les mécanismes d e

réparation sont phosphorylées après irradiation .

3.1 .1 . La phosphorylation de Rad5l : activation ou inhibition de la RH ?

Deux études montrent que Rad5l est phosphorylée par c-Abl in vitro et in vivo en

réponse aux RI (Yuan et al., 1998 ; Chen et al., 1999) . Les conséquences de ce s

phosphorylations semblent contradictoires . En effet, la phosphorylation de RadS 1 sur son

résidu tyrosine 54 conduit une inhibition de sa fixation à l'ADN et de son activité d'échang e

de brin . Cette modification conduirait donc à une inhibition de la RH (Yuan et al., 1998) . Par

contre, la phosphorylation sur le résidu tyrosine 315 stimule l'association de Rad51 à Rad5 2

ce qui favoriserait le mécanisme de RH (Chen et al., 1999) . En accord avec ce résultat, l a

phosphorylation de Rad5l sur la Tyr315 par Bcr-Abl (cf. D II 2.3 .3 .) est associée à un e

56

augmentation de la RH induite par une CDB (Slupianek et al., 2001) . Deux hypothèse s

pourraient réconcilier ces résultats contradictoires . La première est qu'en fonction du site d e

phosphorylation de Rad5 1 la RH serait activée ou inhibée . L'autre hypothèse est que ce s

phosphorylations permettent de recycler le complexe de la RH. En effet, la phosphorylatio n

sur la Tyr54 dissocie Rad5 1 de l'ADN pour permettre les étapes tardives de la RH tandis qu e

la phosphorylation sur la Tyr315 permettrait de retirer, en même temps que Rad51, les autre s

protéines initiatrices de la RH (dont Rad52) .

3 .1 .2 . La phosphorylation de la DNA-PKcs

La kinase c-Abl phosphoryle également la DNA-PKcs (Kharbanda et al ., 1997 ; Jin e t

al., 1997) . Cette phosphorylation conduit une inhibition de l'activité de la DNA-PK par

dissociation du complexe Ku/DNA-PKcs (Jin et al ., 1997) . Réciproquement, la .DNA-PKc s

phosphoryle in vitro c-Abl (voir 1 .2 .2.) ce qui suggère un mécanisme de rétrocontrôle négati f

de la DNA-PKcs . existerait donc deux voies pour réguler négativement l'activité de l a

DNA-PKcs : par auto-phosphorylation (cf . B I . 1 .2) et par rétrocontrôle négatif via c-Abl .

3.1 .3 . Brcal : une protéine à de multiple facettes

La protéine Brca 1 pourrait participer à la réparation des cassures double brin car ell e

interagit avec des protéines impliquées dans les deux mécanismes : Rad5l (Scully et al . ,

1997) et avec le complexe MRN (Zhong et al., 1999) . De plus une délétion du gène BRCA 1

conduit à une inhibition de la RH (Moynahan et ai ., 1999) . Brcal joue un rôle dans l e

mécanisme de NHEJ utilisant des microhomologies (Zhong et al ., 2002) . La mutation d'u n

57

seul allèle du gène BRCA1 conduit également à une diminution de la réparation fidèle pa r

NHEJ (Baldeyron et al., 2002) .

En plus de son rôle dans la réparation des cassures double brin, Brcal semble

participer à la reconnaissance et à la signalisation des cassures double brin (cf . C II 1 .1) .

Enfin, Brcal participe aussi à la régulation du cycle cellulaire en induisant CDKN 1 A

(p21/CIP1/WAF1) par des mécanismes dépendants et indépendants de p53 (Somasundaram et

al., 1997 Zhang et al ., 1998) .

La protéine Brcal est phosphorylée après irradiation par ATM, ATR et par Chk2

(Cortez et al ., 1999 ; Gatei et al., 2000 Lee et al., 2000a ; Tibbetts et al ., 2000) . Les

conséquences de ces phosphorylations sur les différents rôles de Brcal ne sont pas établies .

3.1.4. Le complexe MRN(X)

La protéine Mre 1 1 est hyper-phosphorylée tandis que Nbsl est phosphorylée aprè s

exposition aux RI . Ces phosphorylations sont dépendantes de la protéine ATM (pour revu e

d'Amours et Jackson, 2002) . La présence de Nbsl est nécessaire pour l'hyper-phosphorylatio n

de Mre 1 1 (Dong et al., 1999). Les conséquences biochimiques de ces phosphorylations ne

sont pas encore connues . Cependant, elles précèdent la re-localisation du complexe sou s

forme de foyers (Dong et al., 1999) .

58

3 .2 . Re-localisation en foyer des protéines de réparation .

Des analyses par immunofluorescence ont montré que les protéines de réparatio n

Rad51, Rad52 et le complexe MRN se localisent sous forme de foyer suite à une expositio n

aux RI .

3.2.1 . Les foyers Rad5l

Dans les cellules de mammifères, la protéine Rad5 1 est localisée dans le cytoplasme e t

majoritairement dans le noyau . En absence de stress, des foyers Rad5l sont observables dan s

les noyaux et sont spécifiques de la phase S (Tashiro et al., 1996) . Les radiations ionisante s

conduisent à une augmentation du nombre de cellules possédant des foyers Rad5 1 . Ces

derniers sont fréquemment associés à une synthèse d'ADN réparatrice ou non programmé e

(UDS pour Unschedule DNA Synthesis) . En effet, les foyers Rad5 1 co-localisent en parti e

avec un marquage hétérogène au BrdU (pour BromodéoxyUridine) représentatif de FUDS

(Haaf et al ., 1995) . De plus, les foyers Rad5l co-localisent avec de longues molécules d'ADN

simple brin induites par les radiations ionisantes (Raderschall et al., 1999) . Les foyers Rad5 1

sont recrutés aux zones endommagées du noyau (Tashiro et al ., 2000) . Tous ces résultat s

suggèrent fortement que les foyers Rad5 1 représentent des sites de réparation des CDB . En

outre, une étude montre que 24 heures après irradiation, les foyers Rad5 1 se situent dans des

micro noyaux (fragments d'ADN ou de chromosomes compartimentés à l'extérieur du noyau) .

Ces foyers Rad5l reflèteraient alors des CDB qui n'ont pu être réparées (Haaf et al ., 1999) .

De nombreuses études ont permis de comprendre quelles protéines sont associées aux

foyers Rad5l et/ou nécessaires à leur formation . Les foyers Rad51 co-localisent i) avec le s

59

protéines Rad54 et Rad54B (Tanaka et al., 2000 Tan et al., 1999) ii) avec les foyers RPA

(Golub et al., 1998 ; Raderschall et al ., 1999) iii) partiellement avec les foyers Rad52 (Liu et

Maizels, 2000) . Toutes ces interactions suggèrent que le foyer Rad51 reflète un complexe d e

réparation par recombinaison homologue . Les cellules souche embryonnaires (ES) invalidée s

pour Rad54 ne forme pas de foyers Rad5 1 (Tan et al ., 1999), cependant les lignées DT4 0

déficientes pour Rad54 présentent une augmentation de ces foyers (Takata et al ., 2000) . Ces

différences reflèteraient une différence du rôle de Rad54 dans le mécanisme de recombinaiso n

homologue en fonction de l'espèce et/ou du type cellulaire . Les paralogues de Rad51 jouen t

également un rôle déterminant dans la formation des foyers puisque les cellules ovariennes de

hamster chinois (CHO) déficientes pour XRCC3 ainsi que toutes les lignées DT40 déficiente s

pour un des paralogues de Rad5 1 ne présentent pas de foyers Rad5l (Bishop et ai., 1998 ;

Takata et al., 2000 ; Takata et al., 2001) . Aucune étude ne démontre si ces paralogues son t

présents dans les foyers Rad51 . Enfin, les protéines Brcal et Brca2 sont également impliquée s

dans la formation des foyers Rad5l . Les lignées ES de souris invalidées pour 13RCA 1 n e

forment plus de foyers Rad5 1 (Bhattacharyya et al., 2000), cependant les lignées tumorale s

humaines mutées pour BRCA1 forment des foyers Rad5 1 (Zhong et al ., 1999). La protéin e

Brca2 est nécessaire à la formation des foyers Rad5l (Yuan et al., 1999) .

3.2.2. Les ,foyers MRN

Les protéines Rad5O, Mre11 et Nbs 1 ont une localisation nucléaire et exclue d u

nucléole. Ces protéines forment des foyers uniquement après induction de cassures doubl e

brin (Maser et al., 1997). Ces foyers se localisent au niveau des sites des dommages dès 3 0

60

minutes après irradiation (Nelms et al., 1998) et reflèteraient des zones de réparation d e

l'ADN . Les foyers MRN ne co-localisent pas avec ceux de Rad5l, ce qui suggère que ce s

deux types de foyer représentent deux mécanismes distincts de réparation et/ou deux étape s

temporellement distinctes d'un même mécanisme : la recombinaison homologue. Cette

dernière hypothèse est renforcée par le fait que les foyers MRN co-localisent partiellemen t

avec les foyers Rad52 (Liu et al., 1999) .

La présence de Nbsl ainsi que sa phosphorylation est indispensable pour la formation

des foyers Mre 1 1 et Rad5O (Zhao et al., 2000). De plus, l'absence du domaine FHA (pour

Fork Head Associated) de la protéine Nbs 1 conduit à une disparition des foyers MRN . De

manière surprenante, cette perte des foyers MRN n'est pas accompagnée d'une sensibilité au x

radiations ionisantes (Tauchi et al., 2001). Ces résultats suggèrent que les foyers MRN ne

reflètent pas la réparation de l'ADN . Pour expliquer si les foyers MRN reflètent ou non l a

réparation de l'ADN, certains auteurs proposent que plusieurs types de foyers MRN son t

induits après irradiation, certains reflétant la réparation (d'Amours et Jackson, 2002) . La

protéine ATM est nécessaire à la formation des foyers MRN (Maser et al., 1997) ce qui

indique que ces foyers pourraient être impliqués dans la signalisation des cassures . Le rôle d e

la protéine Brca 1 dans la formation des foyers MRN est controversé puisqu'une étude montr e

qu'une lignée mutante pour le gène BRCA1 ne forme pas de foyers MRN (Zhong et al., 1999 )

alors qu'une autre étude utilisant la même lignée ne montre pas d'effet sur les foyers MR N

(Wang et al., 2000) .

61

3 .3 Dégradation des protéines de réparatio n

Un autre moyen pour réguler la réparation des CDB est de dégrader les protéine s

effectrices de la réparation . Plusieurs systèmes permettent de dégrader les protéines, dont u n

spécifiquement induit suite à un stress génotoxique : l'apoptose. Ce dernier est un mécanism e

conduisant à la mort de la cellule, ce qui permettrait d'éliminer les cellules n'ayant pu répare r

les dommages créés par le stress .

3.3.1 . Dégradation de Rad51 par apoptose et par ubiquitination

L'apoptose conduit l'activation des protéases appelées caspases qui dégradent de

nombreuses protéines . La protéine Rad5 1 est clivée par la caspase 3 conduisant à un fragmen t

de 21 kDa inactif pour le mécanisme de recombinaison homologue (Flygare et al., 1998 ;

Huang et al., 1999) . La sur-expression de Rad51 ou d'une protéine RadSl non clivable par l a

caspase 3 inhibe partiellement l'apoptose induite par les radiations ionisantes (Huang et al. ,

1999) . Ces résultats suggèrent que le clivage de Rad5l participe à l'apoptose .

La protéine Rad5 1 serait également dégradée par un mécanisme similair e

l'ubiquitination. En effet, la protéine Rad51 interagit (en test double hybride) avec la protéin e

Ubc9lUbe2l (Kovalenko et al ., 1996 ; Shen et al ., 1996b) . Cette dernière appartient à l a

famille des protéines pouvant conjuguer l'ubiquitine sur des protéines cibles . Rad5 interagit

également avec la protéine Ubll (pour ubiquitine-like protéine 1, Shen et al., 1996c). Comme

Ubc9/Ubel interagit avec Ubll, il est envisageable que Ubc9/Ube21 puisse conjuguer UN 1 à

Rad51 . De plus, la sur-expression d'Ubll inhibe la RH induite par une cassure double bri n

dans des lignées CHO (Li et al., 2000) . Tous ces résultats suggèrent que Rad51 es t

62

"ubiquitinée" par Ubll ce qui conduit à une inhibition de la RH . Cependant aucune forme d e

la protéine Rad5 1 associée à Ubll n'a pu être mise en évidence .

3.3.2. Dégradation des protéines du NHEJ

Deux protéines du NHEJ sont également dégradées par apoptose : la DNA-PKcs et

Xrcc4 . Elles sont toutes les deux clivées par des caspases de type 3 et 7 (Song et al., 11996 ;

Teraoka et al ., 1996 ; Han et al ., 1996 ; Matsumoto et al., 2000) générant ainsi un fragment d e

35 kDa pour Xrcc4 et deux fragments de 240 et 160 kDa pour la DNA-PKcs . Les

dégradations de DNA-PKcs et Xrcc4 ont la même cinétique et sont réalisées en même temp s

ou légèrement avant la fragmentation de l'ADN, marqueur tardif de l'apoptose (Matsumoto et

al., 2000) .

4 Conclusions

Suite à une exposition aux radiations ionisantes les cellules mettent en place au moin s

trois mécanismes pour faire face aux dommages créés : le contrôle du cycle cellulaire, l a

réparation des dommages et/ou Fapoptose . Ces mécanismes sont coordonnés et très intriqué s

puisque certaines protéines participent à plusieurs mécanismes . De nombreux points son t

encore à éclaircir à propos de ces mécanismes : la balance entre la réparation et Fapoptose, les

relations entre les arrêts du cycle cellulaire et 1'apoptose, la coordination entre les mécanisme s

de réparation, les relations entre les arrêts du cycle cellulaire et les mécanismes de réparation .

Ces deux derniers points ont fait l'objet de cette étude .

63

D/ Rôles biologiques des facteurs et des

mécanismes de réparation des CDB

Les mécanismes de réparation des cassures double brin ainsi que certaines protéine s

impliquées dans ces mécanismes peuvent intervenir dans différents processus métaboliques .

La première partie de ce chapitre présente ces multiples rôles biologiques .

Les cassures double brin sont générées de manière exogène comme par une expositio n

aux radiations ionisantes, mais également de manière endogène par des enzymes ou par le s

intermédiaires du métabolisme énergétique de la cellule . Les cellules peuvent utiliser le s

cassures double brin afin de générer de la diversité génétique . Cependant, si ces cassures son t

anormalement réparées, elles conduisent à une perte de l'intégrité génomique et ainsi à l a

formation de cancers . La deuxième partie de ce chapitre est axée sur les deux propriété s

majeures des mécanismes de réparation des cassures double brin : la diversité génétique et

l'intégrité du génome .

I Rôles biologiques varié s

1 . Le développement

La génération de souris invalidées pour les protéines de réparation ont permis d e

mettre en évidence leur rôle dans le développement embryonnaire, le développement neurona l

le développement des lymphocytes et la croissance (cf . tableau 1) .

64

1 .1 . Le développement embryonnaire

Plusieurs protéines de la réparation des CDB sont indispensables au développemen t

embryonnaire . Ces protéines sont impliquées dans la RH et/ou dans le NHEJ .

En effet, chez la souris, la délétion des gènes codant la protéine Rad5 1 ainsi que ce s

paralogues Rad5 1 B, Rad5l D et Xrcc2 conduisent à une létalité embryonnaire (Tsuzuki et al . ,

1996 ; Lim et Hasty, 1996 ; Shu et al ., 1999 ; Deans et al ., 2000 ; Pittman et Shimenti, 2000) .

Cependant les délétions des gènes RAD52 et RAD54 ne provoquent pas ce phénotyp e

(Rijkers et al., 1998 Tan et al., 1999) . Ces résultats suggèrent soit que Rad5 1 et se s

paralogues ont acquis une nouvelle fonction soit que le mécanisme de RH doit être fortemen t

inhibé pour créer ce phénotype .

La délétion du gène RAD50 conduit à une létalité embryonnaire et les cellules souche s

de ces souris ne sont pas viables (Luo et al ., 1999) . Le gène MRE11 est essentiel pour l a

prolifération des cellules ES (Xiao et Weaver, 1997) . De même, la délétion de l'intro 1 e t

l'exon 1 du gène NBS 1 conduit à une létalité embryonnaire (Zhu et al., 2001) . Cependant, l a

délétion de la partie N terminale (exon 2 et 3) de la protéine Nbsl ne conduit pas à une létalit é

embryonnaire, mais aux mêmes phénotypes que ceux des patients atteint du syndrome d e

Nijmegen (syndrome dû à une troncation du gène NBS1) (Kang et al ., 2002) .

La perte de la partie N terminale des protéines Brcal et Brca2 conduit également à l a

mort embryonnaire (Ludwig et al., 1997) . Cependant d'autres mutants Brca2 ne présenten t

qu'une diminution des naissances (Connor et al., 1997 Friedman et al., 1998 ; Patel et al . ,

1998) .

65

Les souris inactivées de leur gène codant Xrcc4 ou la ligase IV meurent également au

stade embryonnaire mais de manière plus tardive que pour Rad5 1 et ses paralogues et pou r

Mrel 1 ou Rad5O (Frank et al ., 1998 Gao et al ., 1998) .

De manière intéressante, l'inactivation des protéines ATM et p53 supprime la létalité

des délétions des gènes XRCC4 et LIGIV (Gao et al., 2000 ; Frank et al., 2000) .

L'inactivation de p53 prolonge également la survie des embryons RAD51 -'- , RAD51D -'- ,

BRCA1 -'- et BRCA2 -'- (Lim et Hasty, 1996 Hakem et al., 1997 ; Ludwig et al ., 1997 ; Shu et

al., 1999) . Ces résultats suggèrent que les protéines ATM et p53 sont impliquées dans la voie

conduisant la létalité .

12 . Le développement neuronal embryonnaire

Certaines protéines de réparation des CDB sont également impliquées dans l e

développement neuronal . En effet, les souris inactivées pour les gènes XRCC4 et LIGIV

présentent une apoptose massive des neurones générés lors de l'embryogenèse (Gao et al. ,

1998) . Cette mort neuronale pourrait être à l'origine de la létalité de ces embryons . Les

embryons déficients pour Ku70 et Ku80 mais pas pour DNA-PKcs présentent également un e

augmentation de la mortalité neuronale lors de la neurogenèse (Gu et al., 2000) . Ces résultat s

pourraient suggèrer que des cassures double brin sont générées lors du développemen t

neuronal et que le mécanisme de NHEJ est responsable de leur réparation .

66

Tableau 2 : Phénotypes des souris invalidées pour les différentes protéines impliquées

dans les mécanismes de réparations des CDB.

Protéines des mécanismes de réparation

Phénotypes des souris K .O .

Protéines de la RH

Létalité embryonnaire E7, 5

Instabilité chromosomique (accrue aprè sexposition aux RI )

Prolifération réduite------ _______

_____________________________________ _Viabl e

Défaut modéré de la R H________________________________ _Viable

__ ---------- -

Sensibilité IR des cellules E S

Défaut de la RH---------------------------------------------- ________ _

Lé 1abté embryonnaire ou néonatale

o_urooa\~n~uoo__ ___ si

Létalité embryonnaire entre E5,5 et E6, 5__—._— .~~~~~~____~c__ ._— _ .~- __ ._ . — . _ . _jtté embryonnaire entre l~05 ut El 1,5 ~~~__zc_~~ ._~_ _ . _~

Variable selon la délétion : létalité embryonnaire

E9,5 ou diminution des naissance s

Pro/é/nem du/Vf{E/

Viable

Arrêt du développement des lymphocytes B

Défaut de croissanc e_____________ __________ _________________________________ ______ __ ______________ ____ _

ViableArrêt du développement des lymphocytes B et T

Défaut de croissanc e

_______________________________________________________

_ _____

___________ _ _

Viable

Arrêt du développement des lymphocytes Bc1 T____________________________

_______________ __ ____________ _______ _

Létalité embryonnaire E1 6

Défaut de développement des lymphocytes Bet T

Apoptose neuronale massive

Protéines de/u RfJ et dy/VHE/

Létalité embryonnaire E6,5Rad5O

Prolifération réduit e

Mre 1 1.

Létalité dans les cellules E S .. .

Viable ou létale selon la délétio n

Sensible aux radiations ionisante s

Défaut de

dey _ — _ Bet T développement

Létalité embryonnaire E7,5

Prolifération réduit e

E(n) : n jours du stade embryonnaire

--------- -

_-------- ____ _

__________ _

__________ _

____________ _

DNA-PKcs

__________ -- -

Xrcc4 et Ligase IV

Cependant, ce même phénotype est observé lorsque la protéine Xrcc2 est inactivée pa r

délétion (Deans et al., 2000) . Le mécanisme de Recombinaison Homologue serait égalemen t

indispensable à la neurogenèse .

1 .3 . Le développement lymphocytaire

Toutes les souris inactivées pour une des protéines du NHEJ présentent des défauts d u

développement des lymphocytes . Cependant, ces défauts ne sont pas les mêmes en fonctio n

de la protéine inactivée. Dans les souris déficientes pour les protéines Ku80, DNA-PKcs ,

Xrcc4 et LigaseIV le développement des lymphocytes B et T est arrêté à un stade précoc e

(Nussenzweig et al., 1996 ; Zhu et al., 1996 ; Gao et al., 1998 ; Frank et al., 1998) .

Cependant, les souris déficientes pour Ku70 présentent un blocage complet du développemen t

des lymphocytes B, tandis que les lymphocytes T se développent mais en quantité réduite . Les

souris déficientes pour NBS1 présentent également un défaut du développement de s

lymphocytes B et T (Kang et al., 2002 )

1 .4 . La croissance

Les souris déficientes pour les protéines Ku70 et Ku80 ont un phénotype de nanism e

(Nussenzweig et al., 1996 ; Zhu et al., 1996 ; Gu et al., 1997 ; Ouyang et al., 1997) ce qui

indique que ces protéines sont impliquées dans le mécanisme de croissance . Cette fonction es t

indépendante des autres protéines du NHEJ, ce qui indique une nouvelle fonction de s

protéines Ku .

68

2. Le maintien et la structure des télomères

Les télomères sont des séquences d'ADN situées aux extrémités des chromosomes ,

constituées de répétitions TTAGGG double brin en tandem et terminées par de l'ADN simpl e

brin 3' sortant contenant également ces répétitions . Ces séquences télomériques peuvent

former une structure en boucle (t-loop) évitant ainsi que ces extrémités ne subissen t

d'éventuelles dégradations et ne soient reconnues en tant qu'extrémité d'une cassure doubl e

brin. La disparition de ces séquences télomériques limite la prolifération cellulaire et réduit l a

durée de vie de l'organisme (Autexier et Greider, 1996) . Ces séquences sont synthétisées, et

donc maintenues, par un mécanisme ne nécessitant pas de matrice, grâce à la téloméras e

(Greider et al., 1985) .

2 .1 . Rôle de la recombinaison homologue

Dans la levure S. cerevisiae, la délétion de la télomérase n'abolit pas entièrement l a

synthèse télomérique . La recombinaison homologue, et plus précisément le modèle du BIR ,

est un mécanisme qui, en absence de la télomérase, permet le maintien des télomère s

(Lundblad et Blackburn, 1993) . L'élongation des télomères par recombinaison homologue es t

exécutée par deux mécanismes distincts dépendant soit de Rad5 1 soit du complexe MRX ,

mais tous deux dépendant de Rad52 (Le et al., 1999) . Chez les mammifères, ce mécanisme d e

maintien des télomères en absence de la télomérase (ALT pour Alternative Lengthening o f

Telomeres) est conservé et fait également intervenir la recombinaison (Dunham et ai., 2000) .

69

De plus, il est possible que la structure en boucle des télomères (t-loop) soit réalisé e

par une (des) protéine(s) de la RH puisque cette structure ressemble à un intermédiaire de

recombinaison (l'invasion de brin cf . figure 2B) . En effet, la t-loop est constituée de l a

manière suivante : l'ADN simple brin 3' sortant envahit la séquence télomérique double brin .

Cependant aucune donnée ne permet d'affirmer que la RH est responsable de cette structur e

en boucle .

2 .2. Rôle des protéines duNHEJet la structure des télomères

La protéine Ku joue également un rôle déterminant dans le maintien des télomères .

Chez S . cerevisiae, sa délétion conduit à une diminution de la taille des télomères (Boulton et

Jackson, 1996a). En plus de ce rôle, la protéine Ku est également impliquée dans la répression

des gènes situés à proximité des séquences télomériques (Boulton et Jackson, 1998) et l a

localisation nucléaire des télomères (Gravel et al ., 1998) .

Chez les mammifères, la fonction de Ku dans le maintien des télomères rest e

contradictoire. En effet, une étude montre que différents types de cellules primaires de souri s

inactivées pour Ku70 ou Ku80 présentent une diminution de la taille des télomères (d'Adda d i

Fagagna et al ., 2001) tandis que une autre étude ne trouve pas ce phénotype (Samper et al . ,

2000). Cependant, les cellules déficientes pour Ku70, Ku80 ou pour la DNA-PKcs présenten t

des chromosomes fusionnés au niveau des télomères (Bailey et al ., 1999 ; Samper et al ., 2000

; Gilley et al., 2001) . De plus, les protéines Ku70 et Ku80 sont associées aux séquence s

télomériques (Hsu et al., 1999) mais aussi aux protéines Trfl et Trf2 toutes deux impliquées

70

dans la structure des télomères (Hsu et al., 2000 ; Song et al., 2000) . Tous ces résultat s

tendent à montrer que le complexe DNA-PK est impliqué dans la structure des télomères .

Les protéines Xrcc4 et Ligase IV ne semblent impliquées ni dans le maintien ni dan s

la structure des télomères (d'Adda di Fagagna et al., 2001), ce qui indique que le mécanisme

entier du NHEJ n'est pas nécessaire pour cette fonction .

2 .3. Rôle du complexeMRN

Le complexe MRN est clairement impliqué dans le maintien des télomères . En effet ,

les cellules déficientes pour le gène NBS 1 ont des télomères raccourcis et la complémentatio n

de ce défaut n'est possible qu'en exprimant à la fois, la protéine Nbs 1 et la sous-unit é

catalytique de la télomérase (Ranganathan et al., 2001) . De plus, le complexe MRN interagi t

avec la protéine Trf2. Le complexe MRN et Trf2 se localisent au niveau des télomères duran t

la phase S (Lombard et Guarente, 2000 Zhu et al., 2000). Tous ces résultats suggèrent que l e

complexe MRN "travaille" en association avec la télomérase pour le maintien des télomères .

3. La réplication

3 .1 . La recombinaison homologue et la réplication deux processus étroitement lié s

Chez la bactérie, la recombinaison homologue joue un rôle majeur dans le mécanism e

de réplication . En effet, les fourches de réplication peuvent être bloquées lorsqu'elle s

rencontrent des protéines accrochées à l'ADN, des séquences palindromiques ou des lésion s

71

de l'ADN. Les polymérases se détachent alors de la matrice . La RH est un mécanisme qu i

permet de ré-initier la réplication (pour revue Cox et al ., 2000 ; Michel et al., 2001) .

Dans la levure S . cerevisiae, la recombinaison homologue est également liée à la

réplication puisqu'une cassure double brin peut conduire à la réplication d'un bra s

chromosomique entier (modèle BIR cf . A II. 2 .1 .3 .) . De plus, un traitement à l 'hydroxyuré e

bloquant les fourches de réplication, stimule la recombinaison homologue (pour revu e

Aguilera et al., 2000) .

Chez les mammifères, le rôle de la recombinaison homologue dans le mécanisme de

réplication est également établi . Un traitement à 1'hydoxyurée conduit à des cassures doubl e

brin et stimule la recombinaison homologue . Ces CDB sont réparées séquentiellement par l e

NHEJ puis si les cassures persistent, par la RH dépendante de Rad51(Saintigny et al., 2001a) .

Il est possible de détecter à un niveau cytogénétique des échanges entre chromatides soeur s

(SCE pour sister chromatid exchange) . Les SCE sont intimement liés à la réplication

puisqu'ils ne sont observables qu'une fois la phase S traversée (Tucker et al., 1993). Dans la

lignée DT40, l'invalidation de RAD51 conduit à une diminution des SCE spontanés (Sonod a

et al., 1999) indiquant que la RH est responsable des ces échanges spécifiques à la réplication .

Cependant, chez les mammifères, Rad5 1 et Rad54 n'affectent pas ou peu les SCE spontané s

(Dronckert et al., 2000 ; Lambert et Lopez, 2001) suggérant qu'un (ou plusieurs )

mécanisme(s) alternatif(s) soi(en)t responsable(s) des SCE . Enfin, l'implication de la RH dan s

la réplication est également suggérée par le fait que les foyers Rad5 t spontanés son t

spécifiques de la phase S (Tashiro et al., 1996) .

72

Chez les mammifères comme chez la levure, la RH utilise préférentiellement l a

chromatide soeur comme substrat (Kadyk et Hartwell, 1992 ; Johnson et Jasin, 2000) ce qu i

implique que la RH est étroitement liée à la réplication .

3 .2 . Ku et les origines de réplicatio n

Plusieurs études montrent que l'hétérodimère Ku est impliqué dans le mécanisme de

réplication . En effet, ces protéines sont capables de s'associer à plusieurs origines d e

réplication (deVries et al ., 1989 ; Toth et al ., 1993 Ruiz et al ., 1999) . De plus, pour certaine s

origines de réplication, la fixation par Ku est augmenté avant la réplication . Enfin des tests i n

vitro montrent une diminution de la réplication en absence de Ku70 (Novae et al ., 2001) . Ces

résultats suggèrent que, chez les mammifères, Ku participe à la réplication en tant qu e

protéine se fixant aux origines de réplication . Ce rôle dans la réplication pourrait expliquer l e

phénotype de nanismes des souris déficientes pour les protéines Ku .

3 .3 . Brcal et les arrêts de réplication

Après un traitement à l'hydroxyurée, la protéine Brcal (impliquée à la fois dans la R H

et le NHEJ) est rapidement phosphorylée et se re-localise aux sites de réplication (Scully et

ai., 1997) . La protéine ATR est responsable de cette régulation (Tibbets et al ., 2000) . De plus ,

les protéines ATR et Brcal sont essentielles (Brown et Baltimore, 2000) . Une hypothèse

serait que Brcal et ATR participent la ré-initiation de la réplication, probablement e n

reconnaissant et en signalant la présence des arrêts de réplication .

73

3 .4. Le rôle du complexeMRNdans la réplication: prévenir des cassure s

Chez les vertébrés, l'activité du complexe MRN est également liée à la réplication . En

effet, l'ADN répliqué à partir d'extraits de xénope immuno-déplétés de Mre 11 présente d e

nombreuses cassures double brin (Costanzo et al ., 2001) . Ces résultats peuvent expliquer

pourquoi Mre 11 et Rad5O sont essentiels chez les vertébrés .

4. La réparation des dommages induits par les radiations UV

Les irradiations UV provoquent des dommages de l'ADN . Contrairement au x

radiations ionisantes, ces irradiations ne créent pas de cassures double brin mai s

majoritairement des dimères de pyrimidines cyclobutane et des photo-produits (6-4) . Ce s

dommages sont essentiellement réparés par le mécanisme d'excision de nucléotides (NER) qu i

consiste à exciser les nucléotides endommagés et à les remplacer par une synthèse d'ADN e n

utilisant la matrice non endommagée .

4 .1 . La tolérance aux dommages UV: Recombinaison homologue et Synthèse

translésionnelle

Si ces dommages ne sont pas réparés, ou s'ils surviennent lors de la réplication, il s

conduisent à des arrêts de la réplication . Deux mécanismes permettent d'achever la réplicatio n

tout en tolérant les dommages induits par les radiations UV : la recombinaison homologue e t

la synthèse translésionnelle (TLS pour TransLesion Synthesis) .

74

L'arrêt de la réplication conduit à la formation d'une brèche simple brin dans le bri n

néo-synthétisé . Cette cassure simple brin peut initier la RH (Meselson et Radding, 1975) o u

peut être comblée par une polymérase pouvant synthétiser de l'ADN face à une lésion (cf .

figure 10) . Plusieurs polymérases permettant cette synthèse ont été caractérisées et pour l a

plupart, présentent à la fois une faible efficacité et une faible fidélité de la synthèse (pou r

revue Lehmann, 2000) .

A

RH

TLS

1

VII II II II

V

Figure 10 : Modèles de tolérance aux dommages induits par les UV . Les dommage sinduits par les UV conduisent à l'arrêt de la réplication (A) les traits gras représentent les brin s

néosynthétisés . La synthèse est soit ré-initiée par la RH soit achevée par une des polymérase s

qui peuvent synthétiser de l'ADN face à la lésion (B) . La réparation par RH peut conduire ou

non à un crossing over tandis que la synthèse translésionnelle peut conduire des mutation s

(C) . Le dommage n'est pas éliminé .

Plusieurs études démontrent l'implication de la recombinaison homologue dans l a

réparation post-réplicative des dommages UV chez les mammifères . Premièrement, le s

B

C

75

radiations UV stimulent la recombinaison homologue (Wang et al., 1988) . De plus, le s

dommages induits par les UV avant la réplication sont présents à la fois sur les brins

parentaux et sur les brins néo-synthétisés (Fornace, 1983) .

Enfin, une forme dominante négative de Racl .5 1 conduit à une inhibition de la RH mai s

également à une augmentation de la mutagenèse toutes deux induites par les UV (Lambert e t

Lopez, 2002). Ces résultats suggèrent que dans les lignées CHO il existe une balance entre l a

RH et la TLS et que cette dernière est un mécanisme mutagène .

4.2. Inhibition du NER par les protéines du NHEJ

Des tests in vitro et in vivo de réparation par NER ont démontré que les molécule s

d'ADN endommagées (substrats) linéaires sont moins efficacement réparés que les substrat s

circulaires (Legerski et al., 1987 ; Hoeijmakers et al., 1990) . Cette inhibition est la

conséquence d'une diminution à exciser le substrat linéaire . La protéine Ku est responsable de

cette inhibition . En effet, elle se lie aux extrémités et sa translocation à l'intérieur de l a

molécule d'ADN empêcherait alors les protéines du NER d'exciser les dommages (Calsou e t

al., 1996) . De plus, les cellules déficientes pour les protéines Ku mais également pour l a

DNA-PKcs sont sensibles aux radiations UV (facteur 2 à 2,5) et ont une activité NER in vivo

et in vitro réduite (Muller et al., 1998) . Cependant, la DNA-PK n'est pas impliquée dans l e

mécanisme de NER et le mécanisme d'action de cette inhibition du NER n'est pas établi .

76

5 . La transcription

Seul le complexe DNA-PK a été impliqué dans le mécanisme de transcription . I l

permettrait la régulation de la transcription réalisée par l'ARN polymérase II . En effet, l a

DNA-PKcs phosphoryle in vitro et interagit avec YARN polymérase II (Peterson et al. ,

1995a) . De plus, la DNA-PK interagit avec les complexes de pré-initiation (Peterson et al . ,

1992) . Enfin, les tests de transcription in vitro démontrent que l'absence des protéines Ku70 ,

Ku80 et DNA-PKcs ne permet pas de relancer la transcription . Ce phénotype est plus for t

pour Ku, suggérant que ce défaut, en plus de celui de la réplication, pourrait expliquer l e

phénotype de nanisme (Woodard et al., 1999) .

En résumé, les mécanismes et/ou les protéines de réparation des cassures double bri n

participent à de nombreux processus biologiques impliquant le métabolisme de l'ADN . Il fau t

signaler que certains de ces processus (le développement, la réplication) peuvent implique r

des cassures double brin . Mais il est clair que pour les télomères, les dommages induits par le s

UV et la transcription, aucune cassure double brin n'est en cause . Il est égalemen t

remarquable que, dans la majorité de ces processus, les deux mécanismes de réparation, o u

certaines de leurs protéines, sont impliqués en même temps .

77

IL La réparation des cassures double brin : diversité

génétique et intégrité génomique

Les cellules peuvent induire des cassures double brin afin de les utiliser pour créer d e

la diversité génétique . La recombinaison V(D)J et la recombinaison méiotique sont les deux

processus physiologiques utilisant les mécanismes de réparation pour engendrer cett e

diversité .

La réparation des CDB est essentielle pour le maintien de l'intégrité génomique . S i

cette réparation n'est pas efficace ou mal régulée, elle peut donc conduire à la mort cellulair e

ou à des remaniements génétiques profonds favorisant le développement de cancers . Certains

cancers ou maladies prédisposant aux cancers présentent soit une dérégulation soit un défau t

des mécanismes de réparation des cassures double brin .

1 . La diversité génétiqu e

La recombinaison V(D)J et méiotique sont toutes deux initiées par une cassure doubl e

brin et utilise respectivement le NHEJ et la RH pour les réparer et créer de la diversit é

génétique .

1 .1 . La recombinaison V(D)J et le NHEJ

La recombinaison V(D)J est un processus de recombinaison site spécifique qui perme t

de générer la diversité des anticorps du système immunitaire. Elle consiste à réarranger de s

séquences géniques (ou segments) qui, une fois assemblées, coderont la région reconnaissan t

78

les antigènes des anticorps produits par les lymphocytes B et des récepteurs des lymphocyte s

T. Trois types de segments sont impliqués : les segments Variables (V), Diversité (D) et Joint

(J) . Les segments D et J sont assemblés dans une première étape, ensuite le segment V est

joint au segment DJ . Les sites de recombinaison sont signalés par des séquences spécifiques

(RSS pour recombination signal sequences) situées en 3' des segments V, de part et d'autre

des segments D et en 5' des segments J (cf. figure Il) . Les segments forment une synapse ,

puis les RSS sont reconnues par les protéines Rag 1 et Rag2 qui initient le mécanisme e n

créant deux cassures double brin . Chaque cassure est située entre le segment et la RSS . Les

nucléotides situés aux extrémités des segments sont liés de manière covalente formant ains i

des structures en épingle à cheveux . Les segments sont ligaturés formant un joint codant et le s

RSS sont également ligaturés formant un joint signal (cf . figure Il) .

Le mécanisme de NHEJ intervient dans l'étape de ligature des extrémités puisqu'e n

absence de Ku8O les cassures à bouts francs des RSS et à extrémités en épingle à cheveux de s

segments s'accumulent (Zhu et al., 1996 ; Gu et al., 1997 ; Han et al., 1997) . Ces résultat s

suggèrent également que Ku ne soit pas requis pour la protection des intermédiaires d e

recombinaison V(D)J .

De plus, les souris déficientes pour une des sous-unités formant la DNA-PK ont u n

phénotype d'immunodéficience sévère (SCID pour Severe Combined Immuno Defiency) .

Cependant, les effets sur les joints codant (JC) et les joints signaux (IS) sont variables e n

fonction de la délétion. L'inactivation d'une des deux unités Ku conduit à un défaut d e

formation de JC et de JS (Pergola et al., 1993 ; Zhu et al., 1996 ; Nussenzweig et al., 1996

79

Gu et al., 1997 ; Ouyang et al., 1997), tandis que la délétion de DNA-PKcs condui t

uniquement à un défaut des JC (Gao et al ., 1998 ; Taccioli et al., 1998) . Il semble toutefoi s

que la DNA-PKcs intervienne dans la formation des joints signaux mais de manière non

essentielle (Bogue et al ., 1998 et les références citées) . Le complexe Xrcc4/Ligase I V

participe également au mécanisme de recombinaison V(D)J puisque les cellules déficiente s

pour Xrcc4, et donc à priori pour Ligase IV, sont incapables de former aucun type de joint (L i

et al., 1995) .

Une nouvelle protéine nommée Artemis participe au mécanisme de recombinaiso n

V(D)J (Moshous et al., 2001) dans la même voie que le NHEJ . Elle est associée e t

phosphorylée par la DNA-PKcs et serait responsable de l'ouverture des structures en épingle à

cheveux lors du mécanisme de V(D)J (Ma et al., 2002) . Les protéines Mre 1 1 et Rad5 O

pourraient également avoir le même rôle qu'Artemis puisque Mre 1 1 est capable d'ouvrir le s

extrémités en épingle à cheveux in vitro (Paull et Gellert, 1998) ce qui permettrait l e

mécanisme de NHEJ de prendre en charge ces cassures . Cependant aucune donnée génétiqu e

ne permet de le démontrer .

80

A

Segments V

Segments D

Segments J

NIIEINLEII >4iI1:»/V D.—<

J —J

B

Formation d 'une synaps e

Clivage par Ragl et Rag2

Structure en épingle à cheveux de ssegments

C

D

D

Joint codant

Joint signa l

Figure 11 : Mécanisme de la recombinaison V(D)J .

Un exemple de répartition des segments V(D)J est représenté en A . Les carrés

représentent les séquences codant la région de reconnaissance aux antigènes et le s

triangles gris représentent les séquences RSS (cf . texte) .

Deux segments forment une synapse (B), les séquences RSS sont reconnues et perme t

le clivage par les protéines Rag 1 et Rag2 . Les nucléotides situés aux extrémités de s

segments sont liés de manières covalentes formant une structure en forme d'épingle à

cheveux (C) . Les cassures sont ligaturées par le mécanisme de NHEJ générant ains i

des joints codant et des joints signaux (D) .

81

1 .2 . La recombinaison méiotique et la R H

La méiose est le processus qui permet à une cellule diploïde de générer quatre cellule s

haploïdes ou gamètes . La méiose fait appel à deux divisions cellulaires . La première division ,

dite réductionnelle, sépare les chromosomes homologues et est suivie par la divisio n

équationnelle qui sépare les chromatides soeurs . La RH est indispensable au mécanism e

méiotique puisqu'elle permet une ségrégation correcte des chromosomes homologues lors d e

la division réductionnelle . En plus de ce rôle indispensable, la RH permet également u n

brassage de l'information génétique grâce à la conversion génique, associée (ou non) à de s

crossing over, entre les chromosomes homologues .

La recombinaison méiotique a très largement été étudiée chez la levure S. cerevisiae ,

elle est initiée par des cassures double brin, localisées à des sites spécifiques (appelés "ho t

spot") et générées par la protéine Spo 1 1 (pour revue Haber, 1997) . Les protéines Rad5O,

Mre 11 et Xrs2, en plus de leur rôle de maturation des cassures, participent à leur formation e t

permettent également de retirer la protéine Spo 1 1 (pour revue Haber, 1998) . Ces cassures son t

ensuite prises en charge par la RH, puisqu'elles sont transformées en intermédiaires d e

recombinaison homologue (deux jonctions de Holliday, Schwacha et Kleckner, 1995) . La

formation de ces molécules jointes (Mi) fait intervenir les protéines classiques de l a

recombinaison homologue : Rad5l, Rad52, Rad55, Rad57, et RPA . Cependant, d'autre s

protéines sont impliquées dans cette formation de MJ mais spécifiquement lors de la méios e

comme, par exemple la protéine Dmcl, homologue de Rad5l (Bishop et al., 1992 ; Shinohara

et al., 1997a) et la protéine Tid1/Rdh54 homologue de Rad54 (Klein, 1997 ; Shinohara et ai . ,

82

1997b) . Ces protéines spécifiques de la recombinaison méiotique (Spol 1, l)oocl et

Tidl/Rdh54) ont également été identifiées chez les mammifères .

Lors de la prophase de la division réductionnelle, les chromosomes homologues son t

appariés en formant une synapse. Un complexe synaptonémal (C8), constitué de protéine s

permettant cet appariement, est situé entre les chromosomes homologues . La RH semble

participer à cet appariement puisque la protéine Rad5 1 qui permet l'appariement de séquence s

homologues, est localisée dans le CS lors de la prophase de la division réductionnelle abat' et

al., 1995) .

Les particularités de la recombinaison méiotique, comparée à la recombinaiso n

homologue mitotique, sont qu'elle permet la conversion génique essentiellement entre de s

chromosomes homologues (Schwacha et Kleckner, 1997) . et que cet échange génétique est

fréquemment associé ùdcs crossing over (Storlazzi et al ., 1995) .

Chez les mammifères, lors des premières étapes de la prophase réductionnell e

(leptotène et zygotène), le niveau protéique de Ku7O est considérablement réduit tandis qu e

celui de Mre il ey1 augmenté (Goedecke et al ., 1999) . Ces résultats suggèrent que, pendant l a

méiose, le mécanisme de NHEJ est inactivé pour laisser place à la RH .

83

2. L'intégrité génomique : connexion entre réparation des cassures doubl e

brin et cancer

Les deux mécanismes de réparation des CDB maintiennent l'intégrité du génome. Sans

ces derniers, la molécule d'ADN présente des altérations qui conduisent soit à la mor t

cellulaire soit à l'apparition et/ou au développement de cancer .

Certaines maladies ou syndromes qui prédisposent aux cancers sont souvent associés à

une dérégulation des mécanismes de réparation des cassures double brin .

2 .1 . LeNHEJet la RH contribuent au maintien de l'intégrité du génom e

2.1 .1 . Remaniements génomiques

Une mauvaise réparation des CDB peut conduire à des remaniements génomqiue s

des amplifications, des délétions, des inversions ou des translocations . De tels remaniements

peuvent contribuer au développement de cancers, notamment les translocations . Une (ou

plusieurs) cassure(s) double brin sont à l'origine de ces translocations et les mécanisme s

réparant ces dommages sont impliqués dans la création mais également dans la prévention de s

translocations (pour revue Ferguson et Alt, 2001) .

2 .1 .2 . Implication du NHEJ

Le rôle du NHEJ dans le maintien de l'intégrité du génome a été démontré par le fai t

qu'une délétion d'un des composants de ce mécanisme conduit à l'apparition spontanée e t

fréquente de cassures chromosomiques et chromatidiennes (Bailey et al., 1999 ; Karanjawala

84

et al., 1999) . De plus, les fibroblastes déficients pour le NHEJ présentent des translocation s

spontanées (Difilippantonio et al., 2000 ; Ferguson et al., 2000 ; Gao et al., 2000) .

L'implication du NHEJ dans le maintien de l'intégrité du génome est renforcée par l e

fait que l'inactivation de Ku70 ou de la DNA-PKcs conduit à la formation de lymphomes (L i

et al., 1998 Jhappan et al., 1997). Une autre étude montre que l'inactivation de la DNA-PKc s

conduit à la dysplasie et à l'hyperplasie de la muqueuse intestinale (Kurimasa et al ., 1999b) .

De plus, les délétions d'un des composants du NHEJ et de p53 conduisent à une apparition

importante des lymphomes qui sont associés à une translocation entre locus de la chaîn e

lourde des immunoglobulines (IgH) et celui de l'oncogène c-myc (Coleman et al., 1999

Vanasse et al., 1999 ; Gao et al., 2000) . Le développement de ces lymphomes a deux cause s

une inaptitude à réparer les CDB générées lors de la recombinaison V(D)J (défaut du NHEJ )

et une inaptitude à éliminer les cellules ne pouvant réparer les CDB (défaut dû à p53) . Enfin ,

le lien entre NHEJ et cancer est également établi par l'identification d'un patient extrêmemen t

sensible aux radiations ionisantes et atteint d'une leucémie due à une mutation située dans l a

séquence codant le site actif de la Ligase IV . De manière surprenante, ce patient ne présentai t

pas de défaut du système immunitaire . Ces résultats suggèrent donc qu'un défaut du NHEJ

permet la viabilité chez l'homme mais prédispose au développement de leucémies (Riballo et

al., 1999) . Quatre autres patients, présentant une immunodéficience et une sensibilité aux

radiations ionisantes de leurs cellules mises en culture, sont également mutés pour le gèn e

codant la ligase IV. Cependant aucun de ces patients ne présente de prédisposition au x

cancers (O'Driscoll et al., 2001) .

85

2.1.3. Implication de la RH

L'implication de la recombinaison homologue dans le maintien de l'intégrité d u

génome a été établie d'après les études réalisées dans les lignées DT40 de poulet . En effet,

l'inactivation de Rad51, de ses paralogues ou de Rad54 conduit à l'apparition de nombreuse s

cassures chromosomiques et chromatidiennes spontanées (Sonoda et al., 1998 ; Takata et al . ,

2000 et 2000) . Les cellules de mammifères invalidées pour Xrcc2 présentent ce mêm e

phénotype (Deans et al., 2000) . Cependant, les études de mutation dans les différents type d e

cancers ne montrent pas de mutations fréquentes des gènes de la recombinaison homologu e

excepté pour BRCA2 . Les altérations observées, dans une très faible proportion de cancers ,

sont des pertes d'hétérozygotie ou des substitutions au niveau des gènes RAD5 1 et RAD5 4

(pour revue cf. Thompson et Schild, 2000) .

Un lien direct entre la RH et les cancers provient des études portant sur la protéin e

Brca2. Cette protéine est impliquée dans le mécanisme de RH puisqu'elle interagit et modul e

l'activité de Rad51 (cf . A III 3.3) . Elle est nécessaire à la re-localisation de Rad5l en foye r

après exposition aux radiations ionisantes (cf. B II 3 .2 .2.) et l'inactivation du gène BRCA 2

inhibe la RH sans affecter le NHEJ (Moynahan et al ., 2001 ; Xia et al., 2001) . Brca2 es t

impliquée dans le maintien de l'intégrité du génome . En effet, les cellules inactivées pour l a

partie C terminale de cette protéine présentent des anormalités chromosomiques dont des

cassures et des structures radiales (Connor et al ., 1997 ; Fatel et al ., 1998) . Les lignées

déficientes pour Brca2 présentent également des translocations, des fusions entre plusieur s

chromosomes et des délétions (Yu et al., 2000) . De plus, des mutations dans le gène BRCA 2

86

conduisent à une augmentation du risque des cancers du sein et de l'ovaire et 10 % de s

cancers pancréatiques sont mutés pour ce gène (Goggins et al., 1996) . La mutation de BRCA 2

n'initierait pas directement la tumorigenèse, mais permettrait soit l'inactivation d e

suppresseurs de tumeur comme p53 soit l'activation d'oncogènes . Enfin, une mutation du gèn e

BRCA2 augmente les événements de délétion induits par le mécanisme de SSA (Tutt et al . ,

2001 Larminat et al., 2002) .

2.1 .4. Les protéines impliquées dans la RH et le NHEJ

La protéine Brca 1 est impliquée dans la RH, mais aussi dans le NHEJ (cf. Il 3 .2 .2 .) .

Comme pour BRCA2, la mutation du gène BRCA1 augmente le risque du cancer du sein et d e

l'ovaire en inactivant des suppresseurs de tumeurs ou en activant des oncogènes . Chez la

souris, son inactivation conduit également à la formation de tumeur associée à un e

translocation impliquant le chromosome 11 (Xu et al ., 1999) . I1 faut cependant remarquer qu e

Brcal joue d'autres rôles dont la reconnaissance des cassures, le contrôle du cycle cellulair e

(cf. Il 3.2 .2 .) et la réparation couplée à la transcription (pour revue Venkitaraman, 2001) e t

que ces défauts peuvent également contribuer au développement de cancers .

Le complexe MRN est également impliqué dans les deux mécanismes de réparatio n

des CDB . L'inactivation de ce complexe conduit à une perte de l'intégrité du génom e

caractérisée soit par la présence de cassures soit par des maladies prédisposant aux cancers .

En effet, l'inactivation de Mre 1 1 dans les lignées DT40 conduit à de nombreuses cassure s

spontanées (Yamaguchi-Iwai et al., 1999) . Des mutations des gènes MRE1 1 et NBS 1

conduisent à des syndromes équivalents à celui de l'ataxie télangiectasie (Stewart et al., 1999 )

87

et associés à une prédisposition aux cancers (pour revue Shiloh, 1997). De plus, le gène

MRE1 1 est retrouvé mutés dans des cancers dus à l'inactivation du mécanisme de réparatio n

des mésappariements (Giannini et al., 2002) . Ce dernier résultat suggère que l'inactivation d e

MRE 1 1 contribue au développement des cancers .

2 .1 .5. Les mécanismes de réparation sources de remaniements génétiques

Les deux mécanismes de réparation des CDB préviennent des remaniement s

génétiques . Cependant, ils sont également capables de générer de tels remaniements . En effet ,

il a été démontré que l'induction de deux cassures double brin (par Fendonucléase 1-Scel) peu t

conduire à l'apparition de translocations générées par les mécanismes de SSA et de NHEJ

(Richardson et Jasin, 2000b) . La conversion génique est également capable de générer de s

remaniements génétiques . Elle peut conduire à des pertes d'hétérozygotie et si elle est associée

à un crossing over, elle peut aboutir à des inversions de séquences, des délétions, des

duplications et des translocations (pour revue Rossignol, 1990) .

2 .2 . Cancer et dérégulation des mécanismes de réparation desCDB

Les cancers ou les maladies prédisposant aux cancers peuvent avoir pour conséquenc e

une dérégulation des mécanismes de réparation . Les gènes qui sont affectés dans ces

pathologies ne sont pas directement impliqués dans les mécanismes de réparation des cassure s

double brin .

88

2.2.1 . L 'Ataxie télangiectasie : augmentation ou altération de la RH ?

Ce syndrome est dû à la mutation du gène ATM . La protéine issue de ce gène es t

impliquée dans la signalisation des CDB (cf. B II 1 .1) . La réparation dans les lignées A-T es t

particulièrement infidèle car elle est accompagnée de délétions (Dar et al., 1997) . De plus, l a

recombinaison homologue mesurée à l'aide d'un substrat intra-chromosomique est fortement

sttimulée (Meyn et al ., 1993 ; Bishop et al., 2000). Enfin, l'apparition des foyers Rad5 1 aprè s

exposition aux radiations ionisantes est plus tardive mais plus abondante (Maser et al ., 1997) .

Tous ces résultats suggèrent qu'en absence de la protéine ATM, la recombinaison homologu e

est augmentée . Cependant, dans les lignées DT40 inhibées pour ATM, le ciblage de gène es t

réduit ce qui démontrerait que la recombinaison homologue est inhibée (Takao et al ., 1999) .

De plus, l'étude génétique des lignées DT40, montrent qu'un défaut d'ATM conduit à un e

altération de la RH . Ces résultats suggèrent donc aux auteurs que le gène ATM est impliqu é

dans la RH (Morrison et al., 2000) .

2.2.2 . p53 et la réparation des CDB

La protéine p53 est un suppresseur de tumeur puisqu'elle est trouvée mutée dans 50 %

des cancers et que son invalidation chez les souris conduit à une prédisposition tumoral e

(Hollstein et al ., 1991 ; Levine et al ., 1991 ; Donehower et al., 1992) . La protéine p53 est un

transmetteur de la signalisation des CDB et intervient dans les mécanismes de réparation, d e

cycle cellulaire et d'apoptose en réponse aux dommages de l'ADN (cf . figure 8) .

Cette protéine agit de plusieurs manières sur la réparation des CDB . Premièrement ,

elle est responsable de l'arrêt en G1/S des cellules favorisant ainsi le mécanisme du NHEJ .

89

Des résultats contradictoires sont observés entre le statut de p53 et l'activité de ligature de s

extrémités (EJ pour "end joining") . Une étude montre que la présence de p53 sauvage

augmente l'activité EJ induite par radiations ionisantes par rapport à des lignées ne possédan t

pas de p53 (Tang et al., 1999) . Cependant, une autre étude montre que les lignées n e

possédant pas de p53, contrairement à la lignée sauvage, stimulent leur activité EJ aprè s

exposition aux radiations ionisantes (Mallya et Sikpi, 1999) . Enfin, une étude montre que l a

protéine sauvage p53 inhibe l'activité EJ et que le mutant mimant p53 phosphorylée aprè s

irradiation, stimule l'activité EJ (Okorokov et al., 2002). Ce dernier résultat suggère que de

manière spontanée p53 inhibe le mécanisme de NHEJ tandis qu'après irradiation p53 stimule

le NHEJ .

Enfin, p53 inhibe la RH spontanée (Wiesmuller et al., 1996 ; Bertrand et al., 1997) e t

induite par les radiations ionisantes indépendamment de son rôle dans le point de contrôl e

G1/S (Saintigny et al ., 1999) . Cette inactivation de la RH est également indépendante de so n

activité de trans-activation transcriptionnelle (Dudenhoffer et al ., 1999) . Cette inhibition peu t

être expliquée entre autre par le fait que l'interaction entre p53 et Rad5l inhibe la réactio n

d'échange de brin (cf. A III . 3 .3) .

2.2.3 . Bcr-Abl : augmentation de la RH et inhibition du NHEJ

La translocation entre le gène c-ABL sur chromosome 9 et le gène BCR sur le

chromosome 22 conduit à la formation d'un nouveau gène codant la protéine fusion Bcr-Abl .

Cette translocation est retrouvée chez les patients atteints de leucémie myéloïde chronique o u

90

de leucémie lymphoïde aiguë . La protéine Bcr-Abl possède une activité tyrosine kinase qu i

confère une résistance aux agents thérapeutiques .

L'expression de cette protéine augmente l'expression et donc le niveau protéique d e

Rad5l et de ces paralogues Rad5lB, Rad5lD et Xrcc2 . De plus, Ber-AN agit sur l a

modification post-traductionnelle de Rad5l en la phosphorylant sur son résidu Tyr315 et en

inhibant la caspase 3 qui clive Rad51 lors de l'apoptose . Tous ces résultats concordent avec

l'augmentation de la recombinaison homologue intra-chromosomique (Slupianek et al., 2001) .

L'expression de Bcr-Abl inhibe la quantité protéique et donc ainsi l'activité de l a

DNA-PKcs . Cette diminution de la protéine DNA-PKcs serait due à une dégradation par l e

protéasome, mais le lien entre Bcr-Abl et cette dégradation n'est pas élucidé (Deutsch et al . ,

2001) . Le mécanisme de NHEJ serait donc inhibé .

La protéine Bcr-Abl semble donc jouer sur l'équilibre entre les mécanismes d e

réparation des CDB en inhibant le NHEJ et en augmentant le mécanisme de RH .

2 .2 .4. La sur-expression de Belt inhibition de la RH ?

Le gène BCL2 est sur-exprimé dans les lymphomes folliculaires des cellules B suite à

une translocation entre les chromosomes 14 et 18 . La protéine Bcl2 est une protéine anti-

apoptotique (Adams et Cory, 1998) . Dans des lignées CHO, Bcl2 inhibe la recombinaiso n

homologue induite par une cassure double brin sans affecter le mécanisme de SSA. Cette

protéine inhibe également la RH induite par les radiations ionisantes et les UV . De plus, l a

sur-expression d'un mutant Bcl2 qui ne protège plus de Fapoptose conduit également à ce s

inhibitions de la RH, suggérant que les fonctions anti-apoptotique et anti-recombinante son t

91

séparées . Enfin, la sur-expression de Bc12 modifie les charges de la protéine Rad5 1 par un

mécanisme encore non élucidé (Saintigny et al., 2001b) . Cependant, une autre étude sur de s

cellules lymphoïdes démontre que la sur-expression de la protéine Bcl-xL (de la même famill e

que Bcl2 et ayant les mêmes propriétés anti-apoptotiques) stimule la RH (Wiese et al ., 2002) .

Le rôle de cette protéine est très intéressant . En effet, bien qu'elle soit impliquée dan s

le mécanisme de l'apoptose, elle est capable d'agir sur d'autres mécanismes dont la réparation

des CDB mais également sur d'autres voies de réparation comme le NER et le BER (Liu et

al ., 1997 ; Kuo et al ., 1999) .

92

Problématiques

Une dérégulation des mécanismes de réparation des cassures double brin peut conduir e

à des cancers ou à des maladies prédisposant aux cancers . Bien que les protéines qu i

participent à la régulation des mécanismes de réparation des CDB aient été identifiées ,

certains aspects de la régulation ne sont pas encore connus . Notamment, la balance entre l a

RH et le NHEJ n'avait jamais été étudiée lorsque cette étude a débuté . Il est important d e

savoir si et comment ces deux mécanismes de réparation sont coordonnés . La stratégi e

utilisée, pour étudier cette balance, consiste à inhiber le mécanisme de NHEJ afin de mesurer

les effets sur la RH . Ces derniers ont été mesurés à un niveau cellulaire (fréquence d e

recombinaison) mais également moléculaire (molécule d'ADN issue d'un évènement de RH)

et protéique (formation de foyers Rad5 1) . Comme le montre la troisième partie d e

l'introduction, les mécanismes de réparation des CDB sont connectés au cycle cellulaire . J'a i

donc étudié la balance des mécanismes de réparation en fonction du cycle cellulaire . Enfin ,

j'ai également essayé de stimuler la RH afin d'en mesurer les effets sur le NHEJ .

93

RESULTATS

Al Un défaut du NHEJ augmente la RH induit e

spécifiquement par les cassures double brin .

Pour étudier l'équilibre entre les deux mécanismes de réparation des cassures doubl e

brin, j'ai analysé les effets d'une inactivation du NHEJ sur différents aspects de l a

recombinaison homologue .

I . Stratégie

1 . Mesures de la réparation dictée par l'homologie

1 .1 . Substrat permettant de mesurer les fréquences de la R H

Pour mesurer la RH, nous avons utilisé un substrat génétique inséré en copie uniqu e

dans le génome de différentes lignées . Ce substrat (cf . figure 12A) est constitué de deu x

cassettes inactives en orientation directe codant pour le gène de résistance à la néomycine .

Ces cassettes sont séparées par un gène de résistance fonctionnel l'hygromycine . La

séquence de la cassette S2Néo (situé en 5') est interrompue par une insertion du site d e

restriction de 18 pb reconnu par l'endonucléase I-Scel . La cassette 3'Néo (située en 3') es t

inactive à cause de l'absence d'une séquence promotrice et du codon de départ du gène de

résistance à la néomycine .

Ce substrat permet de mesurer les balances entre la RH et le NHEJ et également entre

les mécanismes de SSA et de conversion génique . En effet, après induction d'une cassure dan s

le substrat par I-Scel, le mécanisme de RH, contrairement au NHEJ, permet de restaurer u n

95

gène de résistance fonctionnel à la néomycine (Néo ' ) . Ainsi la fréquence des évènement s

Néo n mesure la RH . De plus, les évènements conduisant à une double résistance (Néo R -

Hygro R) ne sont obtenus que par un mécanisme de conversion génique (CG) . Ainsi, la

fréquence des évènements Néo R-HygroR permet une estimation de la CG . Cependant un

mécanisme de conversion génique associé à un crossing-over peut aboutir à une simpl e

résistance à la néomycine (NéoR -Hygros ). En effet, le produit réciproque obtenu par ce

mécanisme est un cercle contenant les cassettes hygromycine fonctionnelle et néomycine no n

fonctionnelle. Si ce cercle est dégradé le phénotype sera donc Néo R-Hygros et s'il est intégré

au hasard dans le génome le phénotype sera Néo R-Hygro R . La mesure de la résistance l a

néomycine (NéoR), correspond à la fois aux simples et aux doubles résistances (Néo R-Hygro R

et Néo R-Hygros ) . C'est pourquoi le rapport Néo R-Hygro R/Néo R estime la part de la CG dan s

l'ensemble des mécanismes de la RH (SSA + CG) et donc permet d'évaluer la balance entr e

les mécanismes de SSA et de CG .

Il faut noter que le modèle présenté ici est basé uniquement sur une réparation intra-

chromatidienne . Or, la RH et plus particulièrement le mécanisme de CG peut utilise r

également la chromatide soeur comme substrat . Dans ce cas, l'obtention d'un gène fonctionne l

résistant à la néomycine fait intervenir un échange inégal (ou décalé) entre chromatide soeur .

Les produits moléculaires issus d'un CG associée à un crossing over sont différents de ceux

qui sont obtenus pour le modèle intra-chromatidien. En effet, le produit réciproque obten u

n'est plus un cercle mais une triplication conférant le phénotype Né o R-Hygros (cf. figure 12B) .

96

En outre, les produits issus d'une conversion génique non associée à un crossing over sont

identiques de ceux qui sont obtenus avec le modèle intra-chromatidien .

I-Sce l

S2 Neo Hygro 3' Neo

16b,évènements de réparation

A

SSA CG

RHNHEJ

NéoS

crossing over

sans crossing ove r-4

PR —

-MW

1, R

Neo -Hygro S

-

crossing over

\\ sans crossing over

P Réliminé

P Rréintegré

,=

i.T- Reo _HygmR,-.,:- -

B

-KOW111r.

-'FeMl///L .111-L__I--11111•111-

---WNMIC

'ii.11111---f- -1-111.1111111-

Néo R-Hygro SR

Neo -Hygro

Figure 12 : Réparation d'une cassure double brin ciblée dans le substrat de

recombinaison. A/ Modèle de réparation utilisant la chromatide où a eu lieu la CDB . PR

(également appelé POC pour "Pop Out Circle") correspond au produit réciproque issu d'u n

évènement de conversion génique associé à un crossing over. B/ Modèle de réparation par

recombinaison homologue utilisant la chromatide soeur pour réparer la CDB .

97

1 .2 . Formation des foyers Rad5 l

Ces foyers représenteraient des zones de réparation des CDB par le mécanisme de l a

RH. Si tel est le cas, la quantification du nombre de cellule possédant ces foyers donnerait un e

estimation des évènements de RH .

2. Inactivation du mécanisme de NHEJ

Deux stratégies ont été utilisées pour inactiver le NHEJ : une approche génétique où

un gène codant un facteur du mécanisme du NHEJ est absent et une approch e

pharmacologique ou le traitement par une drogue permet d'inhiber l'activité d'un des facteur s

du NHEJ .

2 .1 . Utilisation de lignées déficientes pourXrcc4

L'équipe de Dr. M. Jasin a intégré le substrat de recombinaison homologue dans deu x

lignées ovariennes de hamster chinois (CHO) : dans la lignée XR- 1 déficiente pour le gène

XRCC4 (lignée XD17) dans la lignée parentale 4364 (lignée 4D22) . A partir des XI) 17, j'ai

construit deux lignées contrôles supplémentaires : la lignée X4C sur-exprimant la protéin e

humaine Xrcc4 (HsXrcc4) et la lignée X4V sur-exprimant la protéine humaine Xrcc 4

fusionnée à l'épitope (HsXrcc4-V5) . Ces lignées complémentées sont des contrôle s

nécessaires puisqu'elles permettent de mesurer la RH au même locus en fonction du statut d e

Xrcc4 .

98

2.2. Utilisation de laWortmannin

La Wortmannin est une drogue qui inhibe les P13-kinases (Powis et al ., 1994). J'a i

donc utilisé cette drogue afin d'inhiber l'activité kinase de la DNA-PKcs sur la lignée CHO-KI

possédant le substrat de recombinaison homologue : CHO-DRA10 (Liang et al ., 1998) .

Cependant, il est important de noter ici que la Wortmannin inhibe également les PI3-kinase s

ATM et ATR .

2.3 . Avantages de cette stratégi e

Ces deux types d'inactivation (génétique et pharmacologique) présentent l'avantage d e

pouvoir combiner facilement les deux en même temps, c'est-à-dire de traiter la lignée XD1 7

avec la Wortmannin . Cette combinaison permet de vérifier si les effets sur la RH de ces deu x

types d'inactivations sont épistatiques .

Cette stratégie présente également l'avantage d'étudier l'inhibition à deux étape s

différentes du NHEJ . En effet, la protéine Xrcc4 est responsable de l'étape finale du NHEJ

c'est-à-dire la ligature des extrémités tandis que l'activité de la DNA-PKcs est impliquée dan s

une étape plus précoce . Il est important de signaler que les inactivations du NHEJ utilisée s

dans cette étude n'altèrent pas l'accrochage des extrémités (étape initiale du NHEJ) pa r

l'hétérodimère Ku. Or c'est à cette étape que la réparation des CDB est, en théorie, orienté e

vers le NHEJ au détriment de la RH (cf . introduction C I 3.1) .

99

II . Un défaut du NHEJ augmente la RH induite par le s

radiations ionisantes

J'ai étudié la RH induite par les radiations ionisantes, en irradiant à différentes dose s

aux rayonnements y les cellules déficientes pour Xrcc4 etlou traitées à la Wortmannin .

1 . Un défaut de Xrcc4 augmente la RH induite par les y

La lignée XD17 est plus sensible aux radiations ionisantes que les lignées parentale s

ou complémentées (cf . figure 13A). Ces résultats démontrent que les protéines HsXrcc4 et

C

cl)

o ps: 13 5cts

. —• a,

o 85

‘,cl)c.J

35

\c.)

3

6

;Io▪

- 1 5

Dose (Gy)

D 4 Gy

a 6 G y

A

o

XD1 7 (Xrcc4- / -)25 pg-----

_+_ 4D22 (sauvage) XD17 4D22 X4V

_A_ X4C (complémentée)

'11001t. *OOOW-_ 0_ X4V (complémentée)

50 pgPM

XD17 4D22 X4 V

,foosmiiaie','000000e-4

Actine

Rad5 1

Figure 13 : Effet de la délétion du gène XRCC4 sur la survie (A) et la RH induite par le s

radiations ionisantes (B) et sur la quantité protéique de Rad51(C) .

100

HsXrcc4-V5 sont fonctionnelles . Dans les lignées XD17 par rapport à la lignée parental e

4D22, la RH est stimulée 3 et 26 fois à 4 et 6 Gy respectivement . Les lignées X4C et X4 V

présentent les mêmes fréquences de RH induites à 4 et 6 Gy que la lignée parentale 4D22 (cf.

figure 13B) . Ces résultats démontrent que l'absence de Xrcc4 est responsable de la stimulatio n

de la RH induite par les radiations ionisantes . De manière intéressante, l'expression de l a

protéine HsXrcc4 complémente partiellement le phénotype de survie aux radiations ionisante s

et similairement cette expression inhibe partiellement la RH induite par les radiation s

ionisantes .

Il a été démontré que la sur-expression de Rad5 1 stimule la RH induite par le s

radiations ionisantes (Lambert et Lopez, 2000) . J'ai donc vérifié si l'absence de Xrcc4 n e

serait pas compensée spontanément par une expression plus importante de Rad5 1 conféran t

ainsi ce phénotype de stimulation de la RH (hyper-rec) . Le Western Blot présenté dans l a

figure 13C révèle que le niveau protéique de Rad5l dans les lignées XD17, 4D22 et X4V es t

identique . Ainsi, l'absence de Xrcc4 ne conduit pas à une augmentation spontanée de l a

protéine Rad51 .

2. Un traitement à. la Wortmannin augmente la RH induite par les y

L'effet de la Wortmannin sur la sensibilité et la RH induite par les y a été étudié sur la

lignée CHO-DRA10 . Ces cellules traitées à la Wortmannin présentent une sensibilité accru e

aux rayonnements y (cf . figure 14A) et une stimulation de 7 et 9 fois de la RH induite à 2,5 e t

5 Gy respectivement (cf. figure 14B). Les doses utilisées ici présentent l'avantage de pouvoir

101

comparer la RH à survie égale . En effet, la survie des cellules traitées à la Wortmannin et

irradiées à 2,5 Gy est équivalente à la survie des cellules non traitées et irradiées à 5 Gy (cf .

figure 14A) . A survie égale, la RH induite par les y est stimulée d'un facteur 4 par u n

traitement à la Wortmannin (cf . figure 14B) . Ces résultats démontrent que l'augmentation d e

la RH induite par l'irradiation est bien due au traitement à la Wortmannin et non pas l a

sélection d'une sous-population hyper-rec et résistante aux rayonnements .

A

B

Dose (Gy)

—A— 0 ptlVl Wortmannin

20 y.M Wortmannin

0 yM

20 ptYl

Wortmannin

D 2,5 Gy II 5 Gy

0,10

2,5;Io

5

Figure 14 : Effets d'un traitement à la Wortmannin sur la survie (A) et la RH (B)

induites par les radiations ionisantes .

102

3. Les effets de la délétion du gène XRCC4 et de la Wortmannin sur la RH

induite par les radiations ionisantes sont épistatique s

La Wortmannin inhibe la DNA-PKcs mais aussi les kinases ATM et ATR . Il a été

démontré que l'inactivation d'ATM conduit à un phénotype hyper-rec (Meyn et al., 1993 ;

Bishop et al., 2000) . Il est donc important de savoir si les effets de la Wortmannin sur la RH

sont bien dus à une inactivation de la DNA-PKcs . Pour réponde à cette question, j'ai traité l a

lignée XD17 avec la Wortmannin et mesuré les effets sur la radiosensibilité et sur la R H

induite par les y . J'ai également mesuré les effets de la Wortmannin sur la lignée parental e

4D22 .

A

B

100 -

.p.•q

el)

ccl

4D22 : sauvage XD17 : Xrcc4

5 0

12, 5

Dose (Gy)

--+- XD17 + 0 jiM Wortmannin4D22 + 0 piM Wortmanni n

-A.- XD17 + 20 pN4 Wortmannin--o. - 4D22 + 20 jM Wortmannin

0 pM 20 pM 0 yM 20 I,tM

Wortmannin

0 2,5 Gy

n 5 Gy

Figure 15 : Effets de la Wortmannin sur la survie (A) et la RH (B) induites par les

radiations ionisantes sur la lignée déficiente pour Xrcc4 et la lignée parentale .

103

La Wortmannin sensibilise la lignée 4D22 à un même niveau que la lignée XD17 non

traitée et augmente la RH induite par les y avec un effet moindre que dans la lignée CHO -

DRA 10 . En effet, les stimulations ne sont que de 2 et 4 fois pour les doses de 2,5 et 5 G y

respectivement . Ces résultats démontrent que les effets de la Wortmannin sont reproductible s

dans deux lignées CHO . Le traitement des XD17 à la Wortmannin n'augmente ni leur

sensibilité ni la RH induite par les y (cf . figure 15) . Les effets de la Wortmannin et de l a

délétion du gène XRCC4 sur la RH induite par les radiations ionisantes sont don c

épistatiques . Cette stimulation de la RH passe par un mécanisme commun qui doit êtr e

l'inactivation du mécanisme de NHEJ . Ces résultats suggèrent que dans nos conditions (dos e

de Wortmannin et lignées CHO) la Wortmannin affecte majoritairement la DNA-PKcs .

III . Etude de l'effet de l'inactivation du NHEJ sur les

différentes voies de la RH grâce à la stratégie I-Sce I

L'induction d'une seule cassure dans le substrat de recombinaison permet d'affine r

l'étude des balances entre les voies de réparation puisqu'il est possible de mesurer la balanc e

entre deux mécanismes de recombinaison homologue : le SSA et la conversion génique .

1. L'altération de la protéine Xrcc4 augmente la RH induite par I-SceI

La RH est mesurée par la fréquence de clone résistant à la néomycine (Néo ') après

transfection des lignées XD17, 4D22 et X4V par le vecteur d'expression l-SceI . Les taux de

transfection de ces lignées ont été vérifiés par transfection du vecteur d'expression de la GF P

104

(pour Green Fluorescent Protein) . La fréquence de Néo R est augmentée d'un facteur 4 et 3

dans la lignée XD17 comparée à la lignée parentale 4D22 et à la lignée complémentée X4V

respectivement (cf. figure 16A) . Le ratio Néo R-HygorR/Néo R x 100 estime le pourcentage de s

évènements de recombinaison homologue qui ont été réalisés par conversion génique (CG) .

Ce pourcentage de CG est très légèrement augmenté dans les lignées XD17 comparée au x

lignées 4D22 ou X4V . Cette différence est à la limite de la signification puisque les écart s

types entre les XD17 et les 4D22 se "recoupent" (cf . figure 16B) . Il semble donc que la

délétion de XRCC4 n'affecte pas ou peu la balance entre les mécanismes de SSA et de CG .

L'altération de la protéine Xrcc4 conduit donc à une augmentation des deu x

mécanismes de la RH : le SSA et la CG.

A

B

50

XD17

4D22

X4V

XD17

4D22

NéoR .NéoR-Hygm R

Figure 16 : Effet de la délétion du gène XRCC4 sur la RH induite par I-Scel . A/

Fréquence des simple et double résistance en fonction du statut de Xrcc4 . Une seule

expérience a été réalisée pour la lignée X4V . BI Détermination de la part de la CG dans l e

mécanisme de la RH induite par une seule CDB .

40

105

2. L'absence de la protéine Xrcc4 stimule la RH induite par I ..SceI A un

niveau moléculaire .

Pour mesurer l'effet de la protéine Xrcc4 sur les évènements issus de la RH et d u

NHEJ à un niveau moléculaire, l'équipe du Dr . Jasin a utilisé des lignées cellulaires contenant

un substrat de recombinaison légèrement différent (cf . figure 17A) . Ce substrat permet de

s'affranchir des évènements issus du SSA . La mesure des évènements de réparation à u n

niveau moléculaire est réalisée par un test PCR (Liang et al., 1998) qui consiste à amplifier l a

cassette S2Néo après réparation d'une cassure engendrée par 1-Sen Les produits de PCR,

issus d'un évènement de RH, ont un site Nco I, provenant de la cassette 3'Néo, remplaçant l e

site I-Scel (Ncol+ ) . Les produits de PCR, issus d'un évènement de NHEJ infidèle, perdent leu r

site I-Scet (I-SceI - et Ncol . Ainsi, la simple digestion par Nco I et la double digestion par

Nco III-Scel permettent de distinguer les évènements issus de la RH et du NHEJ infidèle . Ces

produits de digestion sont détectés et quantifiés par la technique de Southern Blot en utilisan t

une sonde reconnaissant la cassette S2Néo (cf . figure 17B) .

Plusieurs expériences ont été réalisées sur les lignées déficientes pour Xrcc4 et sur le s

lignées sauvages . Les quantifications des évènements de réparation par RH et par NHE J

montrent que dans la lignée sauvage, les pourcentages de réparation issus de la RH et d u

NHEJ sont équivalents . Dans la lignée déficiente pour Xrcc4, la réparation NHEJ es t

diminuée d'un facteur 3 par rapport à la lignée sauvage, tandis que la réparation par RH es t

prédominante (plus de 80 % des évènements de réparation, cf . figure 17C). Enfin les produit s

de la simple digestion I-Scel sont diminués dans la lignée déficiente pour Xrcc4, ce qui es t

106

traduit par une diminution du pourcentage de rétention du site I-Scel (cf. figure 17D) . C e

dernier résultat peut être dû à une diminution du mécanisme de NHEJ fidèle (qui restaure u n

site I-Scel intact) .

A

3' Néo

Hygro R

r--* S2 Né o

SCNéo

NcoI 21 I-Scel 2

B

Coupure et réparation in viv oExtraction d'ADN génomiqueAmplification par PCR

RH

Ncol

NHEJ

A ou +

non digéré I-Scel

NcoI+I-SceINcol

kb

Sauvage0,4 --0,3 —

0 4 48 0 4 48

0 4 48Temps (h) aprèséléctroporation0 4 48

NHE J

RH

XrCe4-_0 ,

0,4 —0,3 ] RH

: NHEJ

C100 i

1

D60 -

oCi)

50.1,80 .

60 .

40

20

0

•nL

NHEJ

RH

NHEJ

RH

Sauvage Xrcc4 -/-Sauvage

Xrcc4 -1-

Figure 17 : Effets de la délétion de Xrcc4 sur les évènements moléculaires issus de la RH

et du NHEJ. A/ Principe du test de PCR. B/ Exemple des produits de digestions obtenu s

après Southern Blot . C/ Quantification de la réparation par NHEJ et par RH dans les lignée s

déficientes pour Xrcc4 et sauvages . Dl Quantification de la rétention du site I-Scel .

107

Ces résultats confirment, à un niveau moléculaire, qu'un défaut de Xrcc4 stimule l a

réparation d'une CDB par le mécanisme de RH .

3 . Un traitement A la Wortmannin n'a pas d'effet sur la RH induite par 1 -

Sul

De manière surprenante, le traitement à la Wortmannin ne stimule ni la fréquence de s

évènements Néo R représentant la RH ni la fréquence des évènements Néo R-Hygro R

représentant la CG (cf. figure 18A) . J'ai donc vérifié si la Wortmannin inhibe bien l'activité d e

la DNA-PKcs, dans nos conditions expérimentales, à l'aide d'un test d'activité in vitro . Ce tes t

a été réalisé à partir d'extrait de cellules traitées ou non à la Wortmannin, mais égalemen t

irradiées ou non à 5 Gy. Un traitement la Wortmannin de cellules inhibe bien l'activité de la

DNA-PK, mais une activité résiduelle est toujours présente (cf . figure 18B) . Ces résultat s

suggèrent que ces traces d'activités sont suffisantes pour que le mécanisme de NHEJ prenn e

en charge une seule cassure engendrée par 1-Sen

IV . L'invalidation du gène XRCC4 ne stimule ni la RH

spontanée ni la RH induite par les radiations UV .

L'inactivation de la protéine Xrcc4 stimule la RH induite par une seule CDB et par le s

radiations ionisantes impliquant plusieurs CDB . J'ai donc vérifié si cette stimulation étai t

spécifique aux CDB . Pour cela, les évènements de RH spontanée et induite par les radiation s

UV ont été quantifiés car ces deux évènements n'impliquent pas ou peu de CDB .

108

A

B

Wortmannin

Dose

Temps après irradiation

Wortmannin 04M )

1-S peptide p5 3

Néo R

0 Neo n -Hygm R

O Gy

5Gy

5Gy

45 min 90 mi n

0 20 0 20 0 20

OuM

20 1.I M

Figure 18 : La Wortmannin n'affecte pas la RH induite par 1-Sc& A/ Effet de la

Wortmannin sur les simples et doubles résistances . B/ Activité de la DNA-PK en fonction

d'un traitement à la Wortmannin et d'une irradiation .

1. Un défaut de Xrcc4 ne stimule pas la RH spontanée.

Le test de fluctuation a permis de mesurer le taux de recombinaison par locus et pa r

génération dans les lignées XD17, 4D22, X4C et X4V (cf. tableau 3) . La recombinaison

spontanée est augmentée de manière significative dans la lignée XD 17 comparée à la ligné e

parentale 4D22. Cependant, la recombinaison spontanée entre ces deux lignées n'est pa s

mesurée au même locus . La recombinaison spontanée est équivalente ou légèrement diminué e

entre la lignée XD17 et la lignée X4C et X4V respectivement . Ces résultats démontrent que

l'absence du gène XRCC4 ne stimule pas la RH spontanée . Le positionnement du substrat d e

recombinaison pourrait expliquer la différence observée entre la lignée XD17 et 4D22 .

109

Toutefois, d'autres raisons peuvent être à l'origine de cette différence, puisqu'il a été démontr é

que le positionnement du substrat influe peu la RH spontanée (Hellgren et al., 1989) .

Tableau 3 : Recombinaison spontanée en fonction du statut de Xrcc4 .

Lignéescellulaires

Nombre de culture s

indépendantes

Nombre de

cellules x

Nombre de

clones Néo R

Luria & Delbruck

Taux I locus I

génération x

XD17 14 12,7 560 11,8 ± 7,5

4D22 17 25,8 351 3,4 ± 0,9

X4C 8 9,8 512 11,8 ± 6,0

X4V 8 8,1 816 21 ± 5,5

2. Un défaut de Xrcc4 n'affecte pas le RH induite par les UV .

Les radiations UV ont été utilisées pour plusieurs raisons . Les radiations UV créent un

stress génotoxique comme les radiations ionisantes mais ne créent pas directement de CDB .

De plus, ce stress stimule fortement le mécanisme de RH .

La survie et la RH induite par les UV sont identiques entre les lignées XD17 et X4 V

(cf. figure 19). Un défaut de Xrcc4 ne conduit donc pas à une stimulation de la RH induite par

les radiations UV .

Le fait que ni la recombinaison spontanée ni la recombinaison induite par le s

radiations UV ne soient stimulées en l'absence de Xrcc4 suggère que la stimulation de la R H

due à l'inactivation du NHEJ est spécifique aux cassures double brin .

110

o 201 0

Dose (si/m2 )

XD17 (Xrce4 -l- )

X4V (complémentée)

10 J/m 2

20 Jlm 2

XD 17 (Xrcc4 "fi

II X4V (complémentée)

Figure 19 : Effet de la délétion du gène XRCC4 sur la survie (A) et la RH induite (B) par

les radiations aux UV.

V. L'inactivation du NHEJ stimule la formation de s

foyers Rad5l après un stress créant des CDB .

L'inactivation du NHEJ stimule la RH induite par les radiations ionisantes et stimule l a

RH induite par une seule cassure . Ces deux processus sont dépendants de la protéine Rad5 1

(Lambert et Lopez, 2000) . De plus la protéine Rad51 forme des foyers après une expositio n

aux radiations ionisantes (Haaf et al., 1995) . Ces foyers refléteraient des zones de réparatio n

par le mécanisme de RH . C'est pourquoi, les effets des inactivations du NHEJ sur la cinétiqu e

de formation de ces foyers Rad51 ont été mesurés .

111

1 . Un défaut de Xrcc4 stimule la formation des foyers Rad5l induits par y

La cinétique d'apparition des foyers Rad5 1 a été mesurée dans les lignées XD17 ,

4D22, X4C et X4V après une irradiation à 4 Gy . Le pic d'apparition des foyers Rad5 1 dans

les lignées parentales et complémentées se situe aux alentours de 6 heures, ce pic es t

beaucoup plus important et décalé de 6h dans la lignée XD17 (cf . figure 20A) . De plus, dan s

la lignée XD17, les foyers Rad5 1 persistent 24 heures après irradiation dans 27 % des

cellules . Enfin, les photos de la figure 20B montrent que les foyers Rad5 1 par cellule son t

plus nombreux dans les cellules déficientes pour Xrcc4 que dans les cellules parentales .

A

Temps (h) après une irradiation â 4 Gy

--a—XD17

4D22 - - - X4C--e--X4V

o 6

12

18

24

B

4D22, 4Gy, 6h XD17, 4Gy, 6h

Figure 20 : Effets de la délétion du gène XRCC4 sur la formation des foyers Rad5 l

induits par les y. A/ Cinétiques d'apparition des foyers Rad5 1 après une irradiation à 4 Gy . B/

Exemples de foyers Rad51 .

112

2. Un traitement A la Wortmannin augmente la fréquence des foyers Rad5 l

induits par y

La cinétique d'apparition des foyers Rad5l a été mesurée dans les lignées CHO-

DRA10 traitées ou non à la Wortmannin et irradiées à 5 Gy . Quel que soit le traitement, le pic

d'apparition des foyers Rad5 1 se situe aux alentours de 6 heures . Le traitement Wortmanni n

augmente la fréquence des foyers Rad5 1 mais uniquement aux alentours de ce pic d'apparition

(cf. figure 21A) . En effet, à la différence de la délétion de XRCC4, cette augmentation n'es t

pas persistante : les cellules traitées à la Wortmannin ont un nombre de cellules possédant de s

foyers Rad51 équivalant aux cellules non traitées 12 heures après irradiation .

60

40

20 -

A

0 6 12 18

24

B

Temps (h) après une irradiation à 5 G y

0 yM Wortmannin

-As— 20 pM Wortmanni n

0 yNl Wortmannin

20 uM Wortmanni n

Figure 21 : Effets de la Wortmannin sur la formation des foyers Rad51 induits par les y .

A/ Cinétiques d'apparition des foyers Rad51 induits par une irradiation à 5 Gy . Bi Photos de

cellules possédant des foyers Rad51 .

113

Comme pour les lignées déficientes pour Xrcc4, le nombre de foyers Rad5 1 par cellul e

semble être plus élevé avec un traitement à la Wortmannin (cf . figure 21B) .

3. Une déficience de Xrcc4 ne stimule pas la formation des foyers Rad5l

après une irradiation UV .

L'inactivation du NHEJ, par délétion du gène XRCC4, stimule la RH induit e

spécifiquement par une ou des CDB. Cette inactivation augmente également le nombre de

cellules possédant des foyers Rad5 1 après une exposition aux radiations ionisantes . J'ai donc

vérifié si l'inactivation du NHEJ a un effet sur la formation des foyers Rad5 1 après un e

irradiation aux UV .

Pour cela, la cinétique d'apparition des foyers Rad5 1 a été mesurée dans les lignée s

XD17 et 4D22 après une exposition aux UV. Les cinétiques sont identiques aussi bien dans l e

temps que dans la fréquence des foyers Rad5l (cf. figure 22) .

9

6

12

18

2 4

Temps (h) après une irradiation â 20 J/m 2

-f– XD 17 –,f!t– 4D22

Figure 22 : La délétion du gène XRCC4 n'affecte pas la formation des foyers Rad5 l

induits par les UV. Cinétique d'apparition des foyers Rad5 1 induits par une irradiation à 2 0

J/m 2 dans les lignées XD17 et 4D22 .

o

114

Seul le point 3h, semble montrer une augmentation de la fréquence de formation des foyer s

Rad51 . Plusieurs expériences seraient nécessaires pour démontrer si cette différence es t

significative. Il faut également remarquer que la cinétique après UV est différente comparée à

celle après y (augmentation jusqu'à 24h pour les UV comparé à un pic situé dans les 24 heure s

post y) .

Tout comme pour la stimulation de la RH, l'augmentation de la fréquence des foyers

Rad5 1, due à un défaut du NHEJ, pourrait être spécifique aux cassures double brin .

L'ensemble de ces résultats montrent que l'inhibition d'une étape tardive du NHE J

(délétion du gène XRCC4) conduit à une stimulation de la RH induite spécifiquement par le s

cassures double brin . Une hypothèse pour expliquer ces résultats serait que la fixation de K u

aux extrémités de la CDB (première étape du NHEJ) soit efficace mais si les étapes tardive s

du NHEJ ne peuvent s'effectuer alors Ku se dissocie des extrémités et laisse place au x

protéines de la RH . Il est également envisageable que l'absence de Xrcc4 inhibe la fixation d e

Ku à l'ADN, favorisant ainsi le mécanisme de RH pour la prise en charge des CDB .

115

B/ Un défaut du NHEJ conduit A la réparation en G2 par

la RH des CDB induites en Gi

Cette partie détaille les relations entre les mécanismes de réparation des CDB et le

cycle cellulaire . Dans un premier temps, nous verrons que les foyers Rad5 1 induits par les y s e

forment en fin de S/G2 . Par la suite, les fréquences de réparation par Recombinaiso n

Homologue ainsi que les cinétiques de formation des foyers Rad5 1 ont été analysées e n

fonction du statut de Xrcc4 et de la phase du cycle où sont induites les CDB .

I . Les foyers Rad5l se forment en fin de S/G2 aprè s

expositions aux rayonnements Y sur des cellule s

asynchrone s

1 . Un défaut du NHEJ conduit A un arrêt prolongé du G2 après irradiation

aux y

Le cycle des cellules, inactivées ou non pour le NHEJ, a été mesuré par la techniqu e

de cytométrie de flux à différents temps après exposition aux radiations ionisantes . Le s

cellules non inactivées pour le NHEJ sont bloquées en G2, 6 heures après irradiation . En effet ,

la majorité de ces cellules sont dans cette phase du cycle et presque aucune cellule ne s e

trouve en G 1 . Douze heures après irradiation des cellules sont observées en G 1 montrant l a

fin de cet arrêt en G2 . Enfin les cellules retrouvent un cycle normal (équivalent à celui de s

cellules non irradiées) 24 heures après irradiation . L'inactivation du NHEJ par la délétion du

116

gène XRCC4 ou par un traitement à la Wortmannin conduit également à un blocage en G2, 6

heures après irradiation, mais celui-ci est persistant jusqu'à au moins 24 heures aprè s

irradiation (cf . figures 23) .

A

4D22 (parentale) XD '1.7 (Xrcc4-1-)

2 4

1 2

6

3

o

2

Q

0

Temps (h) après irradiation 4 G yContenu en AD N

B0 11M Wortmannin 20 [IM Wortmannin

24

1 8

1 2

6

3

o

IO- Temps (h) après irradiation 5 Gy

Contenu en ADN

Figure 23 : Une inactivation du NHEJ conduit à un blocage prolongé en G2 . Al Effet de

la délétion du gène XRCC4 sur la cinétique du cycle cellulaire après une irradiation à 4 Gy .

B/ Effet d'un traitement à la Wortmannin sur la cinétique du cycle cellulaire après un e

irradiation à 5 Gy .

117

Quel que soit le statut du NHEJ, les cellules ne sont pas bloquées en G1 aprè s

irradiation. Ce dernier phénotype est dû à une mutation de p53 (Hu et al., 1999 ; Tzang et al . ,

1999) .

2. Corrélation entre la fin de S/G2 et la formation des foyers Rad5l

Les cinétiques d'apparition des foyers Rad5 1 et du cycle cellulaire ont été réalisées en

même temps . J'ai donc analysé la corrélation entre les foyers Rad5 1 induits par les y et le s

différentes phases du cycle . Pour les lignées XD17, 4D22, X4C et X4V, les cellules ave c

foyers Rad51 ont une corrélation positive avec les cellules en phase fin de S/G2 (cf . figure

24A) et une corrélation négative avec les cellules en phase G1/début de S (cf. figure 24B). De

plus, les coefficients de corrélation sont proches de 1 ce qui tend à montrer que les foyer s

Rad5 1 se forment en fin de S/G2 (cf. figure 24C) .

Pour la lignée CHO-DRA10 traitée à la Wortmannin, les cellules sont bloquées en G2 ,

6 heures après irradiation ce qui correspond bien au pic d'apparition des foyers Rad5 1

(comparer les figures 21 et 23) . Les foyers Rad5 1 semblent donc bien apparaître en fin d e

S/G2 . Cependant, alors que les cellules restent bloquées en G2 (cf. figure 23) les foyers

Rad51 disparaissent (cf. figure 21) .

118

Sauvage et complémentées XRCC4 1

100 ,

cfD 60=

'40 ~

v 20

o

6 0

40

2 0

00

10

20

30

0

% cellules avec des foyers Rad5 1

80 ------------

5

7 0

ci) 70

6 0,L)

5 0C"q

4 0

30

_

40

_

60 -

--7 03 5

20

30

o0

% cellules avec des foyers Rad5 1

XD 17 •41.22 A X4C o X4V

Coefficients de corrélation

lignées cellulaires

Coefficient de corrélation entre la phase fin de S/G 2et les foyers Rad5l induits après y

XD1.7 0,9 1

4D22 0,99

X4C 0,9 8

X4V 0,99

Figure 24 : Corrélations entre les foyers Rad5l et le cycle cellulaire . Al Corrélatio n

positive entre les cellules possédant des foyers Rad5 1 avec les cellules en fin de S/G2 dans le slignées 4D22, X4C X4V (panel de gauche) et également XD17 (panel de droite) . B/

Corrélation négative entre les cellules possédant des foyers Rad51 avec les cellules en phas eG1/début S . Cl Coefficient de corrélation entre les foyers Rad5l et la phase fin SIG2 .

3. Les foyers Rad5l apparaissent en fin de SIG2

Pour montrer plus directement que les foyers Rad5 1 apparaissent en fin de S/G2, j'ai

réalisé des co-marquages de Rad5 1 et du BrdU après exposition aux radiations ionisantes dans

la lignée X4V . Le BrdU marque les cellules qui synthétisent de l'ADN et la phase S

correspond à un marquage homogène dans tout le noyau . Les foyers Rad5 1 et la phase S n e

sont pas corrélés (cf. figure 25B, comparer l'histogramme et la courbe) . La majorité de s

cellules qui possèdent des foyers Rad5 1 induits par les radiations ionisantes ne sont pas en

phase S (cf . figure 25B, comparer les histogrammes) . Enfin, les cellules en phase S qu i

possèdent des foyers Rad5 1 ont un marquage BrdU faible ce qui correspondrait à des cellule s

en fin de phase S .

Le marquage au BrdU peut également révéler de la synthèse d'ADN non programmée .

Dans ce cas, le marquage BrdU est tacheté (ou en "patch") dans le noyau . Certaines cellule s

qui possèdent ce type de marquage possèdent également des foyers Rad5 1 (cf . figure 25A) .

Ces co-marquages ne sont observés qu'au pic d'apparition des foyers Rad5 1 (6h aprè s

irradiation) . Toute fois à l'intérieure d'une même cellule, le marquage en "patch" du BrdU e t

les foyers Rads 1 co-localise rarement .

En conclusion, les foyers Rad51. se forment en fin de S/G2 et peuvent être associés à

une synthèse non programmée qui refléterait la synthèse de réparation .

120

A

B16 — 70

>, D12 —

0

3

6

12

24

Temps (h) après une irradiation à 4 Gy

Figure 25 Co-marquages Rad5l et BrdU dans la lignée X4V. A/ Exemple de co-

marquage Rad51 (vert) et BrdU (rouge) . Les flèches indiquent des cellules avec des foyersRad51 et du marquage BrdU tacheté (blanche), avec des foyers Rad51 sans marquage BrdU

(noire), avec des foyers Rad51 et un marquage BrdU faible (rouge), un marquage BrdU fort

sans foyer Rad51 (jaune) et un marquage sans foyer Rad51 et sans BrdU (bleu) . BI

Quantification des cellules possédant des foyers Rad5 1 et/ou en phase S en fonction du temps

après irradiation .

121

II® Les CDB non réparées en G1 stimulent la RH induit e

par les radiations ionisante s

Les cellules déficientes pour Xrcc4 ainsi que les complémentées X4V ont ét é

synchronisées en G1/début de S ou en fin de S/G2 (noté G1 et G2) par un double bloque

thymidine puis irradiées à 4 et 6 Gy .

La lignée XD17 irradiée en G1 est extrêmement plus sensible aux radiations ionisante s

que la lignée X4V . Par contre, irradiées en G2, les XD17 ne sont pas plus sensibles que le s

X4V (différence non significative) . La lignée XD17 semble également plus sensible après un e

irradiation en G1 qu'en G2 . Par contre, la lignée X4V ne présente pas de différence d e

sensibilité quelle que soit la phase du cycle où sont induites les irradiations (cf. figure 26A) .

Après une irradiation en G1, la RH induite à 4 et 6 Gy dans la lignée XD17, comparée

à la lignée X4V, est stimulée d'un facteur 10 et 15 respectivement . Inversement, la RH induite

après une irradiation en G2 n'est pas affectée par le statut de Xrcc4 . La RH induite à 4 et 6 G y

est augmentée respectivement d'un facteur 3 et 4 dans les XD 17 irradiées G1 par rapport à un e

irradiation en G2 . A l'opposé, lorsque les X4V sont irradiées en G2, par rapport à un e

irradiation en Gl, la RH induite par les radiations ionisantes est augmentée également d'u n

facteur 3 . (cf. figure 26B) .

Ces résultats démontrent premièrement que la sensibilité accrue aux radiation s

ionisantes des XD17 est due aux cassures double brin induites en G1/début de S .

Deuxièmement, ces mêmes cassures sont responsables de la stimulation de la RH dans la

122

lignée XD17. Il semble donc que les CDB non réparées en G 1 (due à l'absence de Xrcc4) soi t

responsable de la sensibilité et de la stimulation de la RH radio-induite .

Ces résultats impliquent deux hypothèses :

• soit les CDB induites en G 1/début de S traversent la phase S afin d'être réparées e n

fin de S/G2 par le mécanisme de RH,

• soit la RH est stimulée en G1 .

A

B

0

3 6 X4V XD17 X4V XD17

Dose (Gy )

- -El- - X4V G1

X4V G2

_ XD17G1 -* XD17 G2

Figure 26 : Effets sur la survie (A) et sur la RH induite (B) des radiations ionisantes

induites en G1/début de S ou fin de S/G-2 sur des cellules inactivées ou non pour le gène

XRCC4. Les termes G 1 et G2 correspondent à une exposition aux radiations ionisantes e n

G1/début de S et fin de S/G2 respectivement .

4 Gy Il 6 Gy

123

III . Les CDB non réparées en G1 stimulent la formation

des foyers Rad5l en G 2

Deux arguments favorisent la deuxième hypothèse . Premièrement, les foyers Rad5 1

induits par les radiations ionisantes se forment en fin de S/G2, ce qui indiquerait que la RH a

lieu en G2 . Deuxièmement, les protéines Rad5 1 et Rad52 de mammifères sont exprimées e n

fin de S/G2 et ne sont pas inductibles par les radiations ionisantes . Pour confirmer cette

hypothèse, j'ai donc étudié la cinétique du cycle cellulaire et de la formation des foyers Rad5 1

après irradiation en G1/début de S (G 1) ou en fin de S/G2 (G2) .

1. Les foyers Rad5l se forment lorsque les cellules sont en G 2

Dans un premier temps, j'ai vérifié dans quelle phase du cycle se forment les foyer s

Rad5l lorsque les cellules sont synchronisées et irradiées à 4 Gy en G1 ou en G2 .

Quelle que soit la phase du cycle où sont irradiées les cellules, les foyers Rad5l .

induits par ce stress sont corrélés avec la phase fin S/G2 (cf. figure 27) . Les coefficients de

corrélation sont relativement proches de 1 . Il semble donc que les foyers Rad5 1 induits par le s

irradiations se forment en fin de S/G2 quelle que soit la phase du cycle au moment d e

l'irradiation .

124

A

B

Irradiation en G1 Irradiation en G 2

A

g A

80 -

A60

A40 -

20 -

o

200

40

60

0

1

—0

20

30

40

% de cellules avec des foyers Rad5 1

XD17

A X4 V

C

Lignées cellulairesPhase du cycle où sont induites

Coefficient de corrélation entr eles radiations ionisantes

fin de SIG2 et les foyers Rad5 1

G1

0,8 3

G2

0,78

G1

0,90

G2

0,9 3

Figure 27 : Corrélation entre les foyers Rad51 et le G2 . Corrélation positive entre le s

cellules en G2 et les cellules possédant des foyers Rad5 1 induits par des radiations ionisante s

en G1 (A) ou en G2 (B) . C/ Valeurs des coefficients de corrélation.

2 . Les foyers Rad5l sont induits plus tardivement lorsque les CDB sont

induites en Gi .

Si les foyers Rad5 1 se forment en G2 quel que soit le moment de l'irradiation, l a

cinétique de formation des foyers des cellules irradiées en G 1 devrait être décalée par rappor t

à celle des cellules irradiées en G2 .

X4 V

XD 1 .7

125

La comparaison des cinétiques de formation des foyers Rad5 1 entre une irradiation à 4

Gy en G1 ou en G2 montre qu'effectivement les foyers Rad5 1 se forment plus tardivemen t

lorsque les cellules sont irradiées en G1 . Ce retard de formation est plus marqué dans la ligné e

XD17 (cf. figure 28). De plus, même lorsque les irradiations sont induites en G2, l'absence d e

Xrcc4 stimule la formation des foyers Rad51 . Toutefois, cette stimulation est moin s

importante que lorsque les cellules sont irradiées en G 1 . Enfin, les foyers Rad5l apparaissent

plus rapidement lorsque les cellules sont irradiées en G2, ce qui suggère que les CDB induite s

en G2 sont directement prises en charge par la RH .

o lo 20 3 0

Temps (h), après une irradiation à 4 Gy

--e-- V5 G1 .

-A

V5 G2

--a-- XD17G1 --- - XD1.7G2

Figure 28 Cinétique d'apparition des foyers RadS 1 dans les lignées XD17 (triangle) o u

X4V (carré), après une irradiation à 4 Gy en Gl (trait discontinu) ou en G2 (trai t

continu) .

126

CI Etude de l'effet de la sur-expression de Rad52

L'altération du NHEJ conduit à une stimulation de la RH induite par une (des )

cassure(s) double brin . Il est donc important de savoir si cette propriété est réciproque, c'est-à -

dire si une stimulation de la RH conduit à une inhibition du NHEJ .

I . Stratégie

1. Le choix de la sur-expression de Rad52 pour stimuler la RH

La protéine Rad52 a été choisie pour deux raisons majeures : sa sur-expression stimule

la RH spontanée et induite par les radiations ionisantes (Park, 1995), Rad52 est supposé e

orienter la réparation des cassures double brin vers la RH (Van Dyck et al., 1999) . Cette

dernière propriété m'a fait choisir la sur-expression de Rad52 plutôt que celle de Rad51 . De

plus, la sur-expression de Rad5 1 n'affecte pas (ou peu) la balance entre NHEJ et RH, mais

joue essentiellement sur la balance entre le SSA et la CG (Lambert et Lopez, 2000) .

2. Clonage du RAD52 de hamster et lignées de sur-expressio n

L'ADNc de RAD52 de hamster a tout d'abord été cloné puis inséré dans un vecteur

d'expression de mammifère en fusion avec le gène codant l'épitope V5 . Cette fusion es t

nécessaire pour pouvoir détecter facilement, avec l'anticorps anti-V5, la protéine Rad52 . Tous

ces travaux ont été réalisés au laboratoire par le Dr . Huck.

127

J'ai introduit ce vecteur d'expression dans deux lignées cellulaires CHO : la lignée

CHO-DRA 10 (ligné CHO-KI contenant le substrat de recombinaison homologue décrit dan s

la figure 12) et la lignée XD 17 (déficiente pour le gène XRCC4 et contenant le même substra t

de recombinaison) .

3. Mesure du NHEJ

La mesure du NHEJ peut se faire avec le substrat de recombinaison par la technique d e

PCR développé par l'équipe du Dr . Jasin (cf. III 3 et figure 29) . Cette technique permet d e

quantifier les évènements de réparation issus de la RH ainsi que du NHEJ .

—s. I-SceI22

NHEJ

1

Coupure et réparation in vivo

Extraction d'ADN génomiqu e

Amplification par PC R

HR

Nco I

Dou +

Figure 29 Principe du test PCR permettant de mesurer au niveau moléculaire le s

évènements issus du NHEJ et de la RH. Après induction de la cassure par I-SceI, l'ADN

génomique des cellules est extrait et une PCR est réalisée avec les oligonucléotides 1 et 2 . Les

évènements issus de la RH donnent des produits de PCR digérables par Nco I, tandis que les

évènements issus du NHEJ produisent des fragments ni digérables par Nco I ni par I-SceI

1.28

IL Rad52-V5 ne stimule pas la RH induite par les CD B

Avant de mesurer l'effet de la sur-expression de Rad52-V5 sur le NHEJ, j'ai vérifié s i

l'expression de ce transgène stimulait la RH induite par les radiations ionisantes . De manière

inattendue, l'expression de Rad52-V5 dans la lignée CHO-DRA10 ne confère ni un e

radiorésistance ni une stimulation de la RH induite à 6 Gy (cf . figure 30) . A 4 Gy, le clone

DRA52#7 semble stimuler la RH. Cependant, ce clone n'augmente ni la survie à 4 Gy et ni l a

RH induite à 6 Gy . Des expériences supplémentaires seraient nécessaires pour confirmer cette

stimulation .

A

B

100 a)

1 2

1

0

3

DRAa

DRA52#7 DRA52#1 3Dose (Gy )

--ie.--- DRAa

- -e– DRA52#7

o4Gy s6Gy

DRA52#1 3

Figure 30 : Rad52-V5 n'augmente ni la survie (A) ni la RH induite (B) par les radiations

ionisantes . La lignée DRAa correspond à la lignée CHO-DRA10 transfectée par le vecteur

d'expression vide . Les lignées DRA52#7 et DRA52#13 sont deux clones sur-exprimant l a

protéine Rad52-V5. Trois expériences ont été réalisées pour la survie et 2 expériences pour l a

RH induite à 4 et 6 Gy .

129

La protéine Rad52-V5 ne semble donc pas stimuler la RH induite par les radiation s

ionisantes . J'ai donc mesuré les effets de cette protéine sur les différentes voies de réparatio n

par RH (SSA versus CG) grâce à la stratégie I-Scel . La présence de cette protéine n'affect e

pas les fréquences Néo R et NéoR-HygroR (cf . figure 31) . Ces résultats confirment ceux qui on t

été obtenus pour les radiations ionisantes : la sur-expression de la protéine Rad52-V5 n e

stimule pas la RH induite par une (des) cassure(s) double brin dans la lignée CHO-DRA10 .

DRAa

DRA52#7

DRA52#13

NéoR

NéoR-HygroR

Figure 31 : Rad52-V5 ne stimule ni le SSA ni la CG. Une seule expérience a été réalisée .

L'effet de la sur-expression de la protéine Rad52-V5 sur la RH induite par le s

radiations ionisantes a également été mesurée dans la lignée XDI7 . Le clone R52X#8 sembl e

stimuler la RH quelle que soit la dose . Cependant ce clone n'augmente pas la survie au x

différentes doses d'irradiation. De plus, un autre clone, R52X#2, ne stimule ni la survie ni l a

RH induite après un traitement aux radiations y . Des expériences supplémentaires seraient

12

130

nécessaires pour déterminer si la stimulation du clone R52X#8 est bien significative (le s

valeurs présentées sont les moyennes de deux expériences indépendantes) .

A

B

-4-- XD1 7

- -e- - R52X#2

–

- R52X#8

O 2 Gy

O 4 Gy

II 6 G y

Figure 32 : La protéine Rad52 ne stimule ni la survie (A) ni la RH induite (B) par lesradiations ionisantes dans la lignée déficiente pour le gène XRCC4 . Deux clones sur -exprimant la protéine Rad52-V5 ont été utilisés . Trois et deux expériences ont été réalisée spour la survie par clonogénicité et la RH induite par les radiations ionisantes respectivement .

Deux hypothèses peuvent expliquer ces différences entre clones : la première est que

la protéine Rad52-V5 ne soit fonctionnelle que dans un le clone R52X#8, l'autre hypothèse es t

que cette différence ne soit due qu'à un effet clonal .

Ill . La protéine Rad52-V5 est-elle fonctionnelle ?

Afin de comprendre pourquoi la protéine Rad52-V5 ne stimule pas la RH, j'ai étudié l e

marquage de cette protéine par immunofluorescence . Cette technique permet de détecter l a

131

protéine d'intérêt au niveau cellulaire et ainsi de savoir si toutes les cellules expriment l a

protéine et de connaître sa localisation cellulaire . Comme contrôle positif, j'ai marqué l a

lignée X4V, car cette lignée sur-exprime la protéine HsXrcc4-V5 qui est fonctionnelle .

Ce contrôle présente un marquage homogène et la localisation d'HsXrcc4-V5 es t

exclusivement nucléaire (cf . figure 33) . Tous les clones positifs pour la protéine Rad52-V5

présentent un marquage hétérogène c'est-à-dire que seule une fraction des cellules est positiv e

pour le marquage . De plus, dans cette fraction positive la localisation cellulaire de Rad52-V 5

est majoritairement cytoplasmique . Toutefois, certaines cellules des lignées R52X#8 e t

DRA52#7 possèdent également un marquage nucléaire de la protéine Rad52-V5 (cf. figure

33) .

La localisation exclusivement cytoplasmique, dans les clones DRA52#13 et R52X#2 ,

est en accord avec l'absence d'effet sur la survie et la RH induite par les radiations ionisantes .

La localisation nucléaire, dans certaines cellules des clones DRA52#7 et R52X#8,

pourrait expliquer les phénotypes de ces cellules (augmentation de la RH induite par le s

radiations ionisantes) .

1.32

Marquage de l'ADN(DAPI)

Marquage du transgèn e(anti-V5) Superposition

X4V

CloneDRA52#7

CloneDRA52#13

CloneR52X#2

CloneR52X#8

Figure 33 : L'expression de la protéine Rad52-V5 est hétérogène et cytoplasmique. Les

clones exprimant Rad52-V5 dans la lignée CHO-DRA 10 (DRA52#7 et DRA52#13) et dan s

la lignée XD17 (R52X#2 et R52X#8), ainsi que la lignée X4V exprimant la protéin e

HsXrcc2-V5 ont été marqués par immunofluorescence avec l'anticorps dirigé contre l'épitope

V5 (rouge, 2" colonne) . Le noyau des cellules est marqué par le DAPI (bleu, 1 ère colonne) .

La superposition des images (3 ème colonne) montre bien que contrairement à HsXrcc4-V5, l a

protéine Rad52-V5 est exprimée de façon hétérogène et est majoritairement localisée dans l e

cytoplasme.

1.33

La localisation cytoplasmique est probablement due à l'ajout de l'épitope V5 qui soi t

entraînerait une configuration spatiale de la protéine empêchant sa localisation dans le noyau ,

soit inhiberait une interaction de Rad52 avec un de ces partenaires responsable de l a

localisation nucléaire de Rad52 .

134

DISCUSSION

A/ Inhibition du NHEJ et stimulation de la RH

1 . La nature des cassures double brin, le stade du développement e t

l'accessibilité de l'ADN

Cette étude montre qu'un traitement à la Wortmannin ou que l'altération génétique d e

Xrcc4 conduit à une sensibilité accrue aux radiations ionisantes et à une stimulation de la R H

radio-induite. L'inactivation du NHEJ, aussi bien à des étapes tardives (altération de Xrcc4)

qu'à des étapes précoces (inhibition de l'activité de la DNA-PK), stimule donc la réparation ,

par RH, des CDB engendrées par irradiation. Il a également été démontré par d'autre s

laboratoires que l'inhibition du NHEJ stimule la RH (Pierce et al ., 2001 ; Allen et al ., 2002) .

Toutefois, ces études n'ont porté que sur la RH induite par [-Sen Il est important de signale r

que l'induction d'une cassure par I-Scel est très différente d'une exposition aux radiation s

ionisantes . En effet, la cassure engendrée par I-Scel génère des extrémités 3'OH e t

5'Phosphate qui peuvent être directement ligaturées . Quant aux radiations ionisantes, elle s

génèrent des extrémités pouvant contenir des bases ou des sucres ouverts qui nécessitent un e

dégradation de ces extrémités avant de pouvoir ligaturées .

De plus, les résultats de Pierce ont été obtenus dans des lignées embryonnaires, tandi s

que mon travail a été réalisé dans des cellules adultes . Cette différence est d'une importance

majeure puisque les mécanismes de NHEJ et de RH sont utilisés différemment selon le stad e

du développement . En effet, le NHEJ est majoritairement utilisé au stade adulte tandis que l a

RH est plus active au stade embryonnaire (cf . introduction C . 1 .2 .) .

136

Enfin, mon étude est la seule à montrer que l'inhibition du NHEJ conduit à un e

augmentation des foyers Rad51 induits spécifiquement par les CDB . Ce résultat nous condui t

à une notion importante : l'accessibilité de l'ADN par les protéines de la réparation .

L'inhibition de différentes étapes du NHEJ augmente donc l'accès des protéines de la RH au x

extrémités des cassures double brin de l'ADN .

2. Les effets de la Wortmannin : inhibition d'ATM et/ou de DNA-PKc s

La Wortmannin peut également inhiber une autre PI3-kinase : ATM . Or une altération

d'ATM conduit à une stimulation de la RH spontanée (Meyn et al ., 1993) . Il est donc

important de savoir si la stimulation de la RH, par la Wortmannin, passe par une inhibitio n

d'ATM et/ou de la DNA-PK. Le fait qu'un traitement à la Wortmannin sur les cellules

déficientes pour Xrcc4 n'augmente ni la radiosensibilité, ni la RH radio-induite montre que les

effets de la Wortmannin et de la délétion de Xrcc4 passent par un mécanisme commun :

l'inhibition du NHEJ .

Deux hypothèses découlent de ces résultats :

- dans les conditions utilisées (dose de Wortmannin et lignée CHO), la Wortmanni n

inhiberait majoritairement la DNA-PK ,

- dans la lignée CHO, ATM serait impliquée majoritairement dans le mécanisme du NHEJ .

La protéine ATM est impliquée dans la signalisation des cassures double brin (cf .

introduction C II 1 .1) . La dernière hypothèse impliquerait donc que ce mécanisme d e

signalisation induit majoritairement le NHEJ comme voie de réparation. Cependant, il a ét é

137

démontré que dans des lignées DT40, ATM est impliqué dans le mécanisme de RH (Morrison

et al., 2000). De plus, la Wortmannin peut augmenter la sensibilité aux radiations ionisante s

des lignées scid (déficientes pour la DNA-PKcs) et des lignées A-T (déficientes pour ATM )

(Hosoi et al., 1998) . Tous ces résultats suggèrent que la protéine ATM est impliquée de faço n

significative dans des processus différents du NHEJ .

3. Les inactivations des différentes étapes du NHEJ stimulent-elles la R H

induite par une seule cassure ?

Ce travail démontre que l'altération de Xrcc4 est capable de stimuler fortement la R H

induite par I-Scel . Cette stimulation de la RH est due à la fois à l'augmentation de l a

conversion génique et du SSA . La protéine Xrcc4 est donc impliquée dans la balance entre l e

NHEJ et la RH, mais ne joue pas de rôle dans la balance entre la conversion génique et l e

SSA . L'équipe du Dr . Jasin a également démontré que, dans des lignées ES, l'inactivation d u

NHEJ conduit à une augmentation de la RH induite par 1-Sen Cependant, cette stimulatio n

de la RH est particulièrement marquée lorsque Ku est inhibé . L'absence de Xrcc4 ne stimule

que faiblement la RH induite par I-Scel (Pierce et al., 2001) . De manière surprenante, cette

même équipe a démontré, quelques années auparavant, que la RH n'est pas modifiée dans le s

lignées CHO déficiente pour Ku80 (xrs6, Liang et al., 1996) . Ce dernier résultat pourrait êtr e

expliqué de la manière suivante : lorsque Ku est absent, les extrémités de la cassure engendrée

par I-Scel ne seraient plus protégées des attaques endonucléasiques, le substrat d e

recombinaison serait alors dégradé et ainsi un événement de RH ne pourrait être détecté . Cette

138

hypothèse impliquerait que la dégradation des extrémités des CDB est plus efficace dans la

lignée xrs6 que dans les cellules ES dépourvues de Ku .

4. La DNA-PKcs est-elle nécessaire pour la réparation d'une seule cassur e

double brin ?

Bien que l'activité de la DNA-PKcs soit diminuée, la Wortmannin n'a aucun effet su r

la RH induite par I-Scel . Les traces d'activité de la DNA-PKcs sont donc peut-être suffisantes

pour assurer la réparation d'une seule cassure . Il a été montré qu'une délétion de la DNA-

PKcs, abolissant totalement l'activité de la DNA-PKcs, conduit à une augmentation de la R H

induite par I-Scel (Allen et al., 2002) . L'ensemble de ces résultats montre que :

- la DNA-PKcs est indispensable pour la réparation d'une seule cassure double brin ,

- l'activité à l'état de trace (traitement à la Wortmannin) est suffisante pour prendre e n

charge une CDB unique (1-Scel) mais est insuffisante pour réparer des cassures multiple s

(irradiation aux 'y) .

5. La stimulation de la RH par un défaut du NHEJ est-elle spécifique de s

cassures double brin ?

Puisque la Wortmannin n'affecte pas la RH induite par I-Scel et n'inhibe pa s

spécifiquement la DNA-PKcs, dans la suite de cette étude, seule l'inactivation du NHEJ par

délétion du gène XRCC4 a été étudiée . Cette inhibition du NHEJ ne stimule ni la R H

spontanée, ni la RH induite par les UV et ni la formation des foyers Rad5 1 induits par les UV .

139

Ce résultat suggère que les stimulations de la RH et de la formation des foyers Rad5 1 son t

spécifiques aux cassures doubles brin . Toutefois, il a été démontré que la délétion de la DNA -

PKcs stimule la RH spontanée (Allen et al., 2002) . Ce résultat pourrait être dû à la présenc e

de CDB spontanées dans leur lignée et dans leur condition de culture .

B/ Réparation des cassures double brin et cycle cellulaire

Après exposition aux radiations ionisantes, les cellules de mammifères mettent e n

place de nombreux mécanismes permettant de gérer ce stress génotoxique . Parmi ces

réponses, deux sont fortement liées : le contrôle du cycle cellulaire et la réparation des

cassures double brin . Il a été démontré que le cycle cellulaire a une influence sur l'orientatio n

de la réparation des cassures double brin (cf . introduction C 4). Il a donc été essentiel de

savoir comment la compétition peut se faire en fonction du cycle cellulaire : la stimulation de

la RH, due à un défaut du NHEJ, a-t-elle lieu en G1 ou en G2 ?

1. La RH dépendante de Rad5l a lieu uniquement en fin de S/G2 chez le s

vertébrés

Les foyers Rad5 1 induits par les radiations ionisantes se forment en fin de S/G2 (not é

G2) . Ces résultats sont renforcés par le fait que les foyers Rad5 1 sont localisés sur les CDB e t

sur la chromatine post-réplicative (Tashiro et ai., 2000) . Ces résultats tendent à prouver que l a

RH, dépendante de Rad5 1 et induite par les radiations ionisantes, est active en G2 . Cette

hypothèse est renforcée par les résultats obtenus dans des lignées DT40 . Les lignée s

140

déficientes pour la RH présentent une augmentation des aberrations chromosomique s

lorsqu'elles sont irradiées en G2. Ces résultats ont suggéré aux auteurs que la RH es t

préférentiellement utilisée G2 (Takata et al., 1998) . De plus, les protéines Rad5 1 et Rad52 on t

un pic d'expression en G2 (Flygare et al ., 1996 Yamamoto et al ., 1996 Chen et al., 1997) .

Toutefois, chez S . cerevisiae, la RH dépendante de Rad5l peut être induite en G1 (Fabre ,

1978) . Ce résultat peut être expliqué par le fait que le gène RADS 1 est inductible chez l a

levure tandis que chez les mammifères le gène RADS 1 (et RAD52) n'est pas inductible mai s

son expression dépend du cycle cellulaire .

Les foyers Rad5 1 peuvent être associés à une synthèse d'ADN non programmée

(UDS) . Ce résultat diffère légèrement de ceux obtenus dans des lignées humaines où la quas i

totalité des cellules possédant des foyers Rad5 1 sont associés à de FUDS (Haaf et al., 1995) .

Il est donc probable que la synthèse d'ADN non programmée reflète la synthèse réparatrice d e

la RH. Cependant, il est important de signaler que l'incorporation du BrdU n'est pas effectué

au niveau des foyers Rad5 1 (cf . cellules désignées par les flèches blanches de la figure 25B) .

Deux hypothèses permettent d'expliquer ce résultat . La première est que le mécanisme de R H

est séquentiel, c'est-à-dire que Rad5 1 effectue l'invasion de brin, puis Rad5 1 est décoché d e

l'ADN laissant place aux protéines effectuant la synthèse réparatrice .

2. Le NHEJ est-il en compétition avec la RH en G2 ?

Les cellules inactivées pour Xrrc4 et irradiées en G2 présentent ni une sensibilit é

accrue ni une stimulation de la RH radio-induite comparée à la lignée complémentée . Il

141

semble donc que le NHEJ ne soit pas en compétition avec la RH dans cette phase du cycle .

Toutefois, il n'est pas exclus que le NHEJ prenne en charge une partie des CDB en G2 . En

effet, une irradiation en G2 dans la lignée déficiente pour Xrcc4, augmente la fréquence de s

foyers Rad5 1 comparée à la lignée complémentée . Cependant, cette augmentation n'est pa s

corrélée à une stimulation de la RH mesurée par la fréquence de clones Néo R . Cette

contradiction peut être due à une différence de sensibilité entre les deux techniques de mesur e

de la RH. Enfin, il a été démontré que des événements de réparation peuvent être initiés pa r

un mécanisme de RH et achevés par un mécanisme de NHEJ (Richardson et Jasin, 2000) . Ce

résultat pourrait impliquer que le NHEJ soit actif en G2 .

3e Stimulation de la RH par un défaut du NHEJ et un défaut de la

transition Gl/S

L'altération de Xrcc4 conduit à une radiosensibilité accrue et à une stimulation de l a

RH et des foyers Rad5 1 uniquement lorsque les irradiations sont induites en G1 . Ce résultat

est rationnel avec le fait que le NHEJ est le mécanisme de réparation prédominant dans cett e

phase du cycle. Les cassures non réparées en G1, à cause d'un défaut du NHEJ, sont donc

responsables de la stimulation de la RH et des foyers Rad5 1 induits par les y . L'irradiation e n

G1, comparée à une irradiation en G2, de la lignée déficiente pour Xrrc4 présente u n

décalage, de plusieurs heures, du pic d'apparition des foyers Rad51 . De plus, les foyers Rad5 1

se forment en G2 quelle que soit la phase du cycle où sont induites les radiations ionisantes .

Ce décalage de cinétique des foyers Rad51 suggère donc que les CDB non réparées en G 1

142

traversent la phase S (créant ce décalage) et sont réparées en G2 par le mécanisme de RH . De

manière importante, les cassures double brin ne peuvent traverser la phase S uniquement si l e

contrôle de la transition G 1/S est altéré . Les lignées CHO ne possèdent plus ce contrôle de

cycle (Hu et al., 1999 ; Tzang et al., 1999) . Il serait intéressant de savoir si la RH induite pa r

les radiations ionisantes ou par I-Scel est toujours augmentée dans un contexte où le NHEJ est

inhibé mais où le contrôle de la transition Gl/S est fonctionnelle .

La lignée complémentée irradiée en G1 est capable d'induire des événements de RH e t

le pic d'apparition des foyers Rad5 1 induits par les irradiations en Gl est également décalé pa r

rapport à une irradiation en G2 . Il semble donc que, bien que le mécanisme de NHEJ soi t

efficace, il n'est pas le temps de prendre en charge toutes les cassures induites en G 1

(probablement à cause du défaut de contrôle G US) . Les CDB sont donc réparées en G2 parl a

RH .

4. Efficacité des mécanismes de réparatio n

Les cellules complémentées ne présentent pas de différence de sensibilité entre un e

irradiation en G1 et en G2 . Ces résultats laissent supposer que les mécanismes de RH et d e

NHEJ en G2 sont aussi efficaces pour la survie, mesurée par la clonogénicité, que le NHEJ e n

Gl . Néanmoins, la lignée déficiente pour Xrcc4 irradiée en G2 ne présente pas de sensibilit é

significativement différente à la lignée complémentée . Ce dernier résultat suppose que si l e

NHEJ participe à la réparation en G2, son action est minoritaire par rapport à la RH dans cett e

phase du cycle .

143

Il a été publié qu'après une cassure I-Scel dans une lignée CHO, les événements issus

de la RH sont aussi nombreux que les événements issus du NHEJ (Liang et al., 1998 et figure

17) . Cependant, le NHEJ est sous estimé, puisque seuls les événements de NHEJ infidèles on t

été mesurés. En revanche, la RH pourrait être surestimée . En effet, une transfection ou une

électroporation pourrait conduire à des arrêts de cycle, principalement en G2 puisque l a

transition Gl/S est abolie dans la lignée CHO . Selon mes résultats, ce blocage en G 2

avantagerait la réparation de la CDB par la RH .

5 . Modèle : une réparation séquentielle des cassures double bri n

Il a été proposé que les protéines Ku et Rad52 sont en compétition pour la fixation des

extrémités des CDB . Une fois associées à l'ADN, elles orientent la réparation vers le NHE J

(Ku) ou vers la RH (Rad52, Van Dyck et al., 1999). Le fait que l'inactivation d'une étap e

tardive du NHEJ (par la délétion du gène XRCC4) est capable de stimuler la RH induit e

spécifiquement par les CDB suppose deux modèles :

- Ku est capable de se fixer aux extrémités des cassures, mais ces dernières ne pouvant êtr e

ligaturées par NHEJ sont prises en charge par le mécanisme de RH ,

- l'inactivation de cette étape tardive du NHEJ altère l'activité de l'hétérodimère Ku .

Le premier modèle implique que si la ligature est inefficace, Ku se dissocie de l'AD N

et laisse place aux protéines de la RH . Les deux mécanismes de réparation prennent donc e n

charge les cassures double brin de manière séquentielle . Ce modèle est affiné par les résultat s

obtenus avec le cycle cellulaire qui tendent à prouver que le NHEJ et la RH dépendante de

144

Rad5 1 sont actifs en G1 et G2 respectivement (cf. figure 34). Il est important de signaler que

notre modèle n'exclu pas qu'en G2 le mécanisme de NHEJ soit actif. Par contre, notre modèl e

tend à montrer que la RH dépendante de Rad5 1 a lieu uniquement en G2 .

CDB

Figure 34 : Modèle de réparation séquentielle des cassures double brin . Le NHEJ et la

RH prennent en charge les CDB en G1/début de S et en fin de S/G2, respectivement . Si le

NHEJ et le contrôle de la transition G 1/S ne sont pas fonctionnels, les CDB induites en G 1

traversent la phase S et sont réparées en G2 par le mécanisme de RH .

Le deuxième modèle est renforcé par le fait que la protéine Xrcc4 stimule in vitro

l'accrochage à l'ADN de 1'hétérodimère Ku (Leber et al., 1998) . Cependant, aucune étude n' a

montré que l'absence de Xrcc4 affecte l'activité d'accrochage à l'ADN de Ku . Pour vérifier c e

modèle, il faudrait comparer l'activité d'accrochage à l'ADN de Ku dans la lignée déficiente

145

pour Xrcc4 et dans la lignée complémentée . Il serait également intéressant de vérifier cett e

activité après un traitement à la Wortmannin .

C/ Une stimulation de la RH inhibe-t-elle le NHEJ ?

Les deux premières parties des résultats démontrent que l'inhibition du NHEJ stimule

la RH induite par les CDB . Cette stimulation est due aux CDB non réparées en G1 qu i

traversent la phase S et qui sont réparées en G2 par la RH . Il est donc légitime de se demander

si cette balance est réciproque, c'est-à-dire si une stimulation de la RH est capable d'inhiber l e

NHEJ.

Pour stimuler la RH et avoir éventuellement un effet sur le NHEJ, il faut sur-exprimer

une protéine qui est impliquée dans la balance entre le NHEJ et la RH . Il a été proposé que

Rad52 participe à cette balance (Van Dyck et al., 1999) . La sur-expression de la protéine

Rad52 en fusion avec l'épitope V5 n'a hélas pas permis de répondre à cette question . En effet,

l'expression de cette protéine ne permet pas de stimuler la RH probablement à cause d e

l'épitope V5 qui confèrerait une localisation majoritairement cytoplasmique de la protéine .

Cependant, certaines équipes ont réussi à exprimer une protéine Rad52 fonctionnelle .

Ils ont démontré que cette protéine augmente la survie et la RH induite par les radiation s

ionisantes (Park, 1995 ; Liu et Maizels, 2000) . Ces résultats sont en accord avec notre modèl e

de réparation séquentielle des CDB . En effet, si Rad52 stimule le mécanisme entier de la RH

(SSA et CG) en G2, elle ne devrait pas inhiber la réparation par le NHEJ en G1 . Ainsi, la

réparation globale des CDB (NHEJ plus RH) serait augmentée ce qui conduirait à un e

146

diminution de la radiosensibilité . Il serait donc très intéressant d'analyser, par le test PCR, les

événements de réparation induit par I-Scel, afin de vérifier que la sur-expression de Rad5 2

stimule effectivement la RH sans affecter le NHEJ .

D/ Conclusions

Les mécanismes de NHEJ et de RH sont en compétition pour la réparation de s

cassures double brin . Cette compétition est séquentielle : le NHEJ et la RH prennent e n

charge les CDB en G1/début de S et fin de S/G2, respectivement . Cette compétition

temporelle expliquerait pourquoi lorsque l'un des mécanismes est altéré, l'autre ne peu t

compenser la sensibilité aux radiations ionisantes . La compétition temporelle pourrai t

expliquer également pourquoi, chez les vertébrés, le NHEJ est le mécanisme prédominant de

la réparation des CDB. En effet, la majorité des cellules d'un organisme se trouvent en phas e

GO ou en G 1 lorsqu'elles prolifèrent .

Approximativement 70 % des cancers sont traités par radiothérapie (cité dans Martin ,

2001) . Un des objectif des radiothérapeutes est de d'augmenter l'efficacité de ce traitement

afin de diminuer la dose d'irradiation . Cet objectif consiste donc à inhiber, dans les cellule s

cancéreuses, la réparation des dommages induits par les radiations ionisantes . Pour cel a

plusieurs stratégies sont envisageables : inhiber les mécanismes de réparation de l'ADN ,

inhiber les contrôles du cycle cellulaire ou augmenter l'apoptose . Cette étude montre qu'une

autre stratégie est envisageable : inhiber un des mécanismes de réparation des cassures doubl e

brin et bloquer les cellules dans la phase du cycle ou ce mécanisme est prédominant .

147

MATERIELS ET METHODES

A/ Techniques de biologie moléculaire et de biochimi e

I . Les clonages de gènes

Trois clonages de gènes ont été réalisés lors de cette étude : le gène humain XRCC 4

(HsXRCC4), le gène HsXRCC4 fusionné à la séquence de l'épitope V5 (HsXRCC4-V5) e t

enfin le gène RAD52 également fusionné à la séquence de l'épitope V5 (RAD52-V5) . Ces

clonages ont tous été réalisés dans le vecteur d'expression de mammifère pcDNA 6

(Invitrogen) .

L Le clonage du gène HsXRCC 4

Le plasmide pBiuscript SK (Stratagene) contenant ce gène a été aimablement fourn i

par le Dr Jeggo . HsXRRC4 a été cloné dans le vecteur pcDNA6 sans être fusionné à l a

séquence de l'épitope V5 . Pour cela les deux plasmides sont digérés par les enzymes EcoR I et

Not I (1 U/pg de plasmide) pendant 3h à 37°C . Après purification sur gel à l'aide d'un ki t

(Macherey Nagel), les produits de digestions (le gène HsXRRC4 et le plasmide pcDNA6)

sont ligaturés dans les conditions suivantes : 3 fois plus d'insert (HsXRRC4) que de plasmid e

(en nombre de molécules), dans un volume final de 15 pl, pendant une nuit à 16°C . Les

produits de ligature sont mélangés aux bactéries Xl- 1 blue (Stratagene) pendant 10 min 4°C ,

puis les bactéries sont électroporées (200 S2, 2,5 kV et 25 pF) . Les bactéries ains i

transformées sont amplifiées (37°C sous agitation pendant 1h) puis étalées sur boîte L B

ampicilline (à 50 jug/ml) . Après une nuit à 37°C, les clones isolés sont cultivés pour vérifier l e

149

plasmide intégré dans ces bactéries . L'ADN plasmidique de chaque clone est extrait (ki t

Promega) et vérifié par une digestion Hindlll qui doit donner deux fragments à 6,2 kb et 650

pb .

2. Le clonage du gène HsXRCC4-V5

Pour réaliser cette construction, le plasmide pBluscriptSK contenant HsXRCC4 a serv i

de matrice pour amplifier ce gène avec deux oligonucléotides :

- le premier contenant le début de la séquence d'HsXRCC4 (sui-ligné) et le site d e

restriction (italique) de l'enzyme Xho I (CCGCTCGAGAATGGAGAGAAAAAGCAG) ,

- le deuxième contenant la fin d'HsXRCC4 (excepté le codon "stop") et le site d e

restriction à l'enzyme Sac II (TCCCCGCGGAATCTCATCAAAGAGGTCTTC) .

Plusieurs PCR sont réalisées dans les conditions suivantes : un faible nombre de cycle

(11), une polymérase fidèle : la Pfu DNA Polymerase (Promega), une températur e

d'hybridation de 55°C . Les produits des différentes PCR sont mélangés, purifiés sur gel e t

précipités à l'acétate d'ammonium . Les culots sont repris dans le tampon pour effectuer l a

digestion par Xho I et Sac II. Le plasmide pcDNA6-B a été choisi afin de fusionner le gène

HsXRCC4 avec la séquence codant l'épitope V5. Le plasmide est donc également digéré par

Xho I et Sac II puis purifié sur gel . Enfin, les produits de PCR digérés sont précipités à

l'acétate d'ammonium, puis mélangés au plasmide pcDNA6 digéré et purifié pour effectuer l a

ligature (mêmes conditions que précédemment) . Les produits de la ligature sont utilisés pou r

transformer les bactéries Xl-1 blue de la même manière que précédemment. Les clones isolés

150

sont vérifiés avec la digestion par Pme I qui doit donner deux fragments à 1 kb (correspondant

à l'insert) et à 5,8 kb (correspondant au plasmide pcDNA6) .

3. Le clonage de RAD52-V5

Ce travail a exclusivement été réalisé par le Dr . Huck . Brièvement, le gène RAD52 d e

hamster a été cloné par PCR à partir d'ARNm de cellules CHO-DRA10 et en utilisant deu x

oligonucléotides . Le premier reconnaît le début de la séquence du gène RAD52 humain et d e

souris, le deuxième oligonucléotide dégénéré reconnaît la fin de RAD52 humain et de souris .

L'ADNc a été vérifié par séquençage et a ensuite été cloné dans différents vecteur s

notamment dans le pcDNA6 en fusion avec la séquence codant l'épitope V5 .

II . La technique de Western Blot

Les extraits protéiques sont préparés partir de cellules en culture qui, après un lavage

au PBS, sont incubées avec le tampon de lyse suivant : Tris-HCl pH 7,5 25mM, EDTA 5mM,

NaCl 600mM, DTT 1mM, NP40 0,5 %, Leupeptine 5 pg/ml, Pepstatine 2tM, PMSF 1mM .

Après 45 min d'incubation à 4°C, les cellules sont centrifugées à 13000 g pendant 40 min et

4°C. Le surnageant est récupéré et dosé par la méthode de Bradford (Biorad) . Les protéines

sont alors dénaturées en présence de tampon Laemmli (Tris pH 6,8 0,5mM, SDS 2 % ,

Glycérol 110 %, 2-mercaptoéthanol 100mM) pendant 5 min 95°C . Les échantillons son t

déposés sur un gel d'acrylamide 10 % en condition dénaturante (SDS-PAGE pour Sodium

Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) . Après migration (35 à 45mA), le s

151

protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose par électrotransfert semi-sec (1 h à

300mA et 20V) . La membrane est alors saturée en présence de TBS-T et de lait 5 % (une nui t

à 4°C). Les protéines d'intérêt sont révélées après incubation d' 1 h avec les anticorps primaires

spécifiques. Les anticorps polyclonaux commerciaux anti-Rad5 1 (Oncogene) et anti-actin e

(Sigma) sont dilués au 1000 `me dans du TBS-T, l'anticorps monoclonal anti-V5 (Invitrogen )

est dilué au 1000ème dans du TBS-T et du lait 5 % . Les anticorps primaires sont ensuite révélé s

à l'aide d'un anticorps secondaire couplé à la peroxydase et spécifique de l'espèce dont est issu

l'anticorps primaire . La révélation est effectuée par chimioluminescence (kit ECL d e

Pharmacia-Amersham) .

III . I.e test d'activité de la DNA-P K

Ce test d'activité a été publié par Finnie et al., 1995 .

1 . Préparation des extraits protéique s

Après récupération et rinçage au TBS, 10 ' cellules sont mélangées à 100 il de tampo n

de lyse composé de 50mM de NaF, 20mM d'HEPES pH 7,8, 450mM NaCl, 0,2mM d'EDTA ,

25 % vol/vol de glycérol, 0,5µM de DTT et d'un cocktail inhibiteur de protéase (Roche) .

Trois incubations successives dans l'azote liquide puis à 30°C permet d'extraire les protéines .

Les extraits sont récupérés (surnageant) après une centrifugation pendant 45 min, à 4°C et à

15000 g, puis dosés par la méthode de Bradford .

152

2. Activité DNA-PK enrichie (ou "pull down assay" )

L'enrichissement de l'activité DNA-PK est basé sur le fait que cette protéine possèd e

une activité kinase uniquement en présence d'ADN double brin . C'est pourquoi, avant l a

réaction kinase, les extraits sont mélangés avec de l'ADN cellulose double brin (Sigma) . Cet

ADN est prétraité successivement 1 fois dans le tampon Z' 0,05 puis 2 fois dans le tampon Z'

0,4 et enfin 3 fois avec à nouveau le tampon Z' 0,05 . La composition de ces tampons est l a

suivante : 25mM d'HEPES pH 7,5, 50mM (pour Z' 0,05) et 400mM (pour Z'0,4) de KCl ,

110mM de MgC12, 0,1 % de NP40, 11_tM de DTT et 20 % (vol/vol) de glycérol . L'extrait

protéique (20 pl) est complété 100 1.11 avec du tampon Z' 0,05 et est incubé pendant 30 min à

4°C sous agitation en présence de 5 mg de cet ADN cellulose double brin prétraité . Après

incubation, l'ADN cellulose et les extraits sont lavés 3 fois avec du tampon Z' 0,05 . La

réaction de kinase a lieu pendant IO min, à 30°C, dans 20 pl de la solution constituée de Z'

0,05 avec 0,2mM du peptide p53 (substrat de la DNA-PK), 0,2[tM d'ATP froid, et 0,5!_tCi

d'ATP 'y-"'P . La réaction est arrêtée en ajoutant 5 pl de tampon tricine 5X (Tris-HCl pH 6, 1

500mM, SDS 5 %, Glycérol 60 %, bleu de Commassie 0,1 %, 2-Mercaptoéthanol 0,3 %) et e n

dénaturant 5 min à 95°C. Après centrifugation (1 min à 1000 tr/min), le surnageant (contenan t

le peptide p53 marqué par la DNA-PK) est prélevé (conservé à -20°C) . La moitié de l a

réaction (12,5 vl) migre sur un gel tricine 18 % pendant plusieurs heures (minimum 3h) à

120V . Le gel est ensuite fixé dans une solution à 10 % d'acide acétique et 40 % de méthanol ,

puis séché 2h à 85°C . Enfin, le gel est analysé par autoradiographie et quantifié avec u n

phosphoimager Storm (Molecular Dynamics) .

153

B/ Techniques de culture cellulair e

1 . Lignées cellulaires utilisée s

1 . Lignées établies et conditions de cultur e

Toutes les lignées cellulaires utilisées dans cette étude sont des cellules cancéreuses d e

hamster chinois (CHO). La lignée CHO-DRA10 dérive de la lignée CHO-KI (Liang et al . ,

1998) tandis que les lignées 4D22 et XD17 dérivent respectivement des lignées 4364 et XR-1 .

La lignée XR-1 est dépourvue du gène XRCC4 (Bryans et al., 1999) et la lignée 4364

correspond à la lignée parentale des XR-1 . Toutes ces lignées (CHO-DRA1O, 4D22 et XD17)

possèdent dans leur génome le substrat de recombinaison homologue (cf . figure 12) en copi e

unique .

Les cellules sont cultivées à 37°C, 5 % de CO 2 et 95 % d'humidité dans du milie u

DMEM (Dulbecco's Modeified Eagle Medium) pour la lignée CHO-DRA10 et dans du milieu

DMEM sans pyruvate de sodium pour les lignées XD17 et 4D22 . Tous les milieux son t

complémentés avec 2mM de glutamine, 100U/ml de pénicilline, 100 pg/ml de streptomycine

et 10 % de sérum de veau foetal .

154

2. Etablissement de clones stables

Plusieurs lignées stables ont été créées : les lignées X4C et X4V correspondent à la

lignée XD17 complémentée respectivement par le gène HsXRCC4 et HsXRRC4-V5 . Les

lignées DRA52#7 ; #13 et R52X#2 #8 correspondent à deux clones stables exprimant la

protéine Rad52-V5 dans les lignées CHO-DRA10 et XD17 respectivement .

Les vecteurs d'expression mammifère contenant les gènes HsXRCC4, HsXRCC4-V5

et RAD52-V5 ont été digérés par l'enzyme de restriction Fsp I (1 à 2 U/pg de plasmide

pendant 3h à 37°C) . Cette enzyme a été choisie car son site de restriction est situé en dehor s

des régions nécessaires pour l'expression du transgène et du marqueur de sélection eucaryote .

En effet, Fsp I a un site de restriction unique, pour les trois plasmides, situé dans le gène de

résistance à l'ampicilline . 6 Iug de plasmide linéarisé sont alors utilisés pour transfecter 10 5

cellules (XD17 ou CHO-DRA10) avec 18 pl du liposome Transfast TM (Promega) . Vingt-

quatre heures après transfection, la sélection composée de 5 µg/ml de blasticidine (marqueur

de sélection du transgène transfecté) et de 500 pg/rnl d'hygromycine (marqueur de sélectio n

du substrat de recombinaison) est ajoutée au milieu de culture . Une à deux semaines aprè s

l'ajout de la sélection, les clones résistant cette sélection sont isolés, amplifiés puis testé s

pour l'expression du transgène .

L'expression des protéines HsXrcc4-V5 et Rad52-V5 a été vérifiée par Western Blo t

en utilisant l'anticorps anti-V5 . Ne possédant pas d'anticorps dirigé contre la protéin e

HsXrcc4, le seul test disponible pour vérifier l'expression de cette protéine dans la lignée

XD17 fut la survie par clonogénicité après exposition aux rayons y . En effet, la lignée XD1 7

155

est extrêmement sensible aux radiations ionisantes, dû à l'absence de Xrcc4 . Ainsi ,

l'expression d'HsXrcc4 doit diminuer cette sensibilité . Pour cela 3 x 100 et 3 x 1000 cellules

ont été irradiées à 0 et 6 Gy (irradiation au "'Cs à un débit de dose 0,7 Gy/min) . Une semaine

après irradiation, les clones résistants aux radiations ionisantes ont été fixés et colorés par u n

mélange Giemsa (Sigma) et méthanol (50 % vol/vol) .

II . Mesure de la recombinaison homologu e

1 . La recombinaison spontanée : le test de fluctuation

1 .1 . Principe du test de fluctuatio n

La mesure du taux de recombinaison spontanée d'une lignée cellulaire est analysé e

selon la méthode de Luria et Delbrück (Luria et Delbrück, 1943) . Ces auteurs ont été le s

premiers à décrire une méthode permettant de mesurer un taux de mutation spontanée grâce à

l'équation :

r = aN t ln(CaN t )

Dans cette équation, a est le taux de mutation / locus I génération, r représente le

nombre de mutants, Nr et C représentent respectivement le nombre de cellules par échantillo n

et le nombre d'échantillon . Grâce à un programme informatique, aimablement fourni par l e

Dr. Green, il est possible d'obtenir la valeur a en possédant les autres valeurs .

156

Cependant, cette analyse du taux de mutation par cette méthode doit répondre à deu x

critères importants :

• le nombre de cellules ensemencées au départ doit être suffisamment faible pou r

limiter la probabilité d'ensemencer un événement de mutation ou qu'un événement

de mutation ne survienne au cours de la première génération ,

• les conditions d'ensemencement et de culture cellulaire doivent êtres homogène s

d'une culture à une autre .

1 .2 . Test de fluctuation de la recombinaiso n

Dix milles cellules sont ensemencées par culture indépendante . Lorsque les cellules

sont à confluences, elles sont trypsinées et comptées puis réparties en deux fractions :

- l'une sert déterminer l'efficacité de clonage ,

- l'autre est réensemencée et 24h après est mise en sélection à 1 mg/ml de généticine

(équivalent de la Néomycine) afin de mesurer le nombre de recombinant .

Sept jours après, les clones de l'efficacité de clonage sont fixés et colorés par l e

mélange Giemsalméthanol permettant ainsi d'obtenir le nombre de cellules mises en sélection ,

pondéré par l'efficacité de clonage (Nt ) . 10 à 15 jours après la sélection, les clone s

recombinants (r) sont également fixés et colorés . Ainsi, avec le nombre de culture s

indépendantes réalisées (C), il est possible d'en déduire le taux de recombinaison spontanée /

locus / génération .

157

2 . Recombinaison induite par des agents génotoxiques

2.1 . Principe

10 6 cellules sont ensemencées au moins 48 heures avant le traitement génotoxique afi n

d'obtenir une population en phase exponentielle de croissance lors du traitement . Les cellules

sont ensuite trypsinées, comptées et divisées en deux fractions 24 heures après le traitement :

- une fraction sert à mesurer la survie cellulaire par clonogénicité ,

- le reste est réensemencé . 24h après, la sélection des recombinants (géniticine à 1 mg/ml) est

ajoutée au milieu de culture .

Après 7 et 10 à 15 jours, les clones de la survie et de la recombinaison respectivemen t

sont fixés et colorés par le mélange Giemsa/méthanol .

2 .2 . Exposition aux radiations ionisantes

La source utilisée au cours de ce travail est du "'cs . Le débit de dose utilisé pou r

mesurer la RH induite par les radiations ionisantes est de 0,7 Gy/min .

Les cellules sont irradiées dans du PBS, puis remises en culture avec du milieu frais .

2 .3 . Exposition aux UV .

La longueur d'onde des radiations UV utilisées dans cette étude est de 254 nm

(irradiation aux UV-C) . Le débit de la lampe est mesuré après le préchauffage (environ 2 0

min) et est de 0,8 Joules/m 2 /s . Les cellules sont irradiées avec un mince filet de PBS (500 p l

158

pour une surface d'environ 75 cm2 ) . Les cellules sont remises en culture avec du milieu frai s

juste après l'irradiation .

3 . Recombinaison induite par l'endonucléase I-Scel

Deux types de tests ont été utilisés pour mesurer la RH induite par I-Scel . La première

mesure la RH par la fréquence de clones résistant à la néomycine ou doublement résistant à la

néomycine et à l'hygromycine . Cette technique présente l'avantage de pouvoir discerner le s

événements issus de la conversion génique et du SSA . La seconde permet de mesurer la RH ,

mais également le NHEJ, à un niveau moléculaire .

3 .1 . Mesure de la RH paria fréquence des clopes résistant s

3 10 5 cellules sont ensemencées dans une surface d'environ 75 cm 2. Les cellules sont

transfectées 24h après ensemencement avec 2 pg du vecteur contenant I'ADNc d e

l'endonucléase I-Scel (pCMV3xnls-i-SceI, Liang et al., 1998) et 6 pl du liposome TransfastT M

dans 5 mi de milieu de culture . Une heure après la transfection, 5 ml de milieu frais son t

ajoutés . Deux sélections sont ajoutées 36 à 40h post-transfection : la généticine (Promega) à 1

mg/ml et la généticine et l'hygromycine (Roche) 1 mg/mi et 500 µg/ml respectivement . 10 à

15 jours après sélection, les clones sont fixés et colorés .

159

3 .2. Mesure de la RH et du NHEJ au niveau moléculair e

Ces expériences ont été intégralement réalisées par l'équipe du Dr. Jasin (Liang et al. ,

1998) . Brièvement, 1,6 1 0' cellules sont électroporées avec 30 µg de pCMV3xnls-I-SceI . Les

cellules sont alors cultivées dans un milieu de culture non sélectif . A différents temps aprè s

électroporation, l'ADN génomique des cellules est extrait et sert de matrice pour amplifier ,

par PCR, la cassette S2Néo (cf. résultats figure 17) . Les oligonucléotides permettant cette

amplification sont situés à 410 pb en amont du site de restriction d'I-SceI (CTGTCCGGTGC -

CCTGAATGAA) et à 312 pb en aval de ce site (CGGGATCCGAACAAACGACCCAA) .

Les produits de PCR sont digérés (Nco I ou I-SceI ou Nco I et I-SceI) . Les produits des

digestions migrent sur gel d'agarose puis sont transférés sur membrane et enfin sont révélé s

par une sonde (fragment reconnaissant entièrement la cassette S2Néo) . Les produits d e

digestions de NcoI (NcoI+) reflètent des événements issus de la RH. Les produits non digéré s

par Nco I et I-SceI proviennent d'un événement de NHEJ infidèle (NcoI - et I-SceI - ) .

III . Traitements lors de la culture cellulair e

Deux traitements de culture cellulaire ont été utilisés lors de cette étude : un

permettant d'inactiver le mécanisme du NHEJ par la Wortmannin et l'autre permettant d e

marquer les cellules en phase S grâce au BrdU .

160

1. Traitement A la Wortmannin

La Wortmannin (Sigma) est un inhibiteur des PI-3-kinases . La solution stock de

Wortmannin est préparée à 10mM dans du diméthyle sulfoxide (DMSO) et conservée à

-20°C . Les cellules sont pré-incubées avec 20[tM de Wortmannin dans le milieu de culture 1 h

avant l'irradiation aux rayons 7 ou la transfection par le plasmide codant 1-Sen Le traitemen t

à la Wortmannin est maintenu 24h ou 36 à 40h après irradiation ou transfection ,

respectivement. Les cellules non traitées à de Wortmannin subissent les même s

traitements avec uniquement du DMSO .

2. Traitement au BrdU

Le Bromodéoxyuridine (BrdU) est un analogue de la thymidine qui s'incorpore dan s

l'ADN lors d'une synthèse permettant ainsi de marquer les cellules en phase S . La solution

stock est à 30mM et est conservée ă -20°C. Les cellules sont incubées pendant 15 à 20 mi n

avant leur prélèvement avec 10pM de BrdU dans le milieu de culture. Ce traitement permet

donc de marquer les cellules en phase S au moment du prélèvement .

Ill . Marquage par immunofluorescenc e

Deux types de marquages ont été réalisés lors de cette étude : un permettant de

visualiser la localisation des protéines Xrcc4 et Rad52 fusionnées avec l'épitope V5, l'autr e

permettant de visualiser les foyers Rad5 1 induits par des agents génotoxiques .

161

1. Localisation cellulaire des protéines fusionnée à l'épitope V5

Les cellules sont cultivées sur des lamelles de verre pendant 24h, fixées au méthanol à

-20°C pendant 15 à 20 min, traitées 10 s à l'acétone et rincées 3 fois 5 min dans du PBS . Les

cellules sont alors incubées pendant 30 min à température ambiante avec l'anticorp s

monoclonal dirigé contre l'épitope V5 (Invitrogen), dilué au 100''" dans une solution de PBS -

BSA 0,5 % . Les cellules sont rincées 3 fois 5 min dans du PBS et sont incubées 30 min à

température ambiante et dans l'obscurité avec l'anticorps couplé à la Rhodamine (TRIT C

couleur rouge), dirigé contre les anticorps de souris (Jaskson) et dilué au 400 'iii` dans du PBS .

Toujours dans l'obscurité et à température ambiante, les cellules sont rincées 3 fois 5 min dan s

du PBS puis sont incubées 5 min avec du DAPI (10 ng/ml) .

2. Les foyers Rad5l

Comme pour le marquage V5, les cellules sont cultivées sur des lamelles de verre e t

24h après leur ensemencement, subissent le traitement désiré (irradiations aux 'y ou aux UV) .

Les lamelles sont récupérées à différents temps après le traitement . Les cellules sont fixées au

méthanol/acétone de la même manière que précédemment . Deux types de marquages pa r

immunofluorescence ont été réalisés pour détecter les foyers Rad5 1 : un marquage unique de

Rad51, ou un co-marquage Rad5 1 et BrdU .

162

2.1 . Marquage unique deRad51

La technique de marquage unique de Rad5 1 est identique à celle de 1'épitope V5 . Les

anticorps utilisés sont l'anticorps polyclonal Rad5 1 (Oncogene) dilué au 100" et l'anticorp s

couplé au CYTM2 (couleur verte), dirigé contre les anticorps de lapin (Jackson) et dilué a u

400' .

2 .2. Co-marquage Rad5 1 et BrdU

Après fixation au méthanol/acétone, les cellules sont traitées 8 à 10 min (temp s

optimal pour avoir un co-marquage) avec de 1'HC1 2N . Cette solution est neutralisée par

rinçages successifs dans de la soude 0,02N pendant quelques secondes puis dans du TBE D(

(pH 8) pendant 5 min et enfin dans du PBS pendant 5 min . Ces traitements sont nécessaire s

pour révéler l'incorporation du BrdU . Les cellules sont alors incubées 30 min à températur e

ambiante avec les anticorps Rad5 1 et BrdU (SERA-LAB) dilués respectivement au oo'n' e et

au 20ème dans une solution de PBS BSA 5 % . Après trois rinçage au PBS, les cellules sont

incubées 30 min à température ambiante et dans l'obscurité en présence de deux anticorp s

secondaires : l'un couplé au CYTM2 (couleur verte) et dirigé contre les anticorps de lapin

reconnaissant ainsi l'anticorps Rad5 1 et l'autre couplé au TRITC (couleur rouge) et dirig é

contre les anticorps de rat reconnaissant ainsi l'anticorps BrdU . Enfin le marquage au DAPI se

fait de la même manière que précédemment .

1.63

3. Montage et observation des lame s

Après l'incubation du DAPI, les lamelles, contenant les cellules marquées, sont rincée s

quatre fois dans du PBS, puis lavées à l'eau pendant quelques secondes . Après un rapid e

séchage, les lamelles sont montées sur lames à l'aide d'une goutte de Glycergel (DAKO) . Les

cellules se situent entre lame et lamelle . Enfin, 24 heures après le montage, les cellule s

peuvent être observées au microscope à fluorescence (Olympus) en utilisant les différent s

filtres permettant de visualiser les différents marquages .

IV . Synchronisation et analyse du cycle cellulaire

1 . Analyse du cycle cellulaire

Le cycle cellulaire a été mesuré par la technique de cytométrie de flux . Les cellules

sont trypsinées et lavées au PBS (centrifugation à 1500 tr/min pendant 10 min) puis re -

suspendues dans de l'éthanol froid à 70 % . Les cellules ainsi fixées et perméabilisées son t

conservées à -20°C pendant une nuit . Les échantillons sont lavés au PBS (centrifugation à

1500 tr/min pendant 10 min) puis incubés 30 min à 37°C et à l'obscurité dans du PBS e n

présence d'iodure de propidium (25 pg/ml) et de RNase A (50 µg/ml) . Les cellules, dont

l'ADN est marqué, sont alors analysées à l'aide d'un FACScalibur r4 (Becton Dickinson) et le

cycle cellulaire est mesuré grâce au logiciel CellQuest TM (Becton Dickinson) .

2. Synchronisation des cellules

La synchronisation des cellules a été réalisée par la technique du blocage thymidin e

qui perturbe les stocks de nucléotides libres et bloque ainsi les cellules en phase S . La solution

stock de thymidine est préparée avant chaque expérience dans une solution de PBS à un e

concentration de 200mM et en l'incubant 15 à 20 min à 37°C pour une dissolution complète .

Les cellules sont ensemencées 48 heures avant la synchronisation, puis sont incubées e n

présence de thymidine à une concentration de 2mM ajoutée dans le milieu de culture pendant

18 heures . Les cellules sont ensuite rincées au PBS et cultivées dans du milieu de cultur e

dépourvu de thymidine pendant 7 à 9 heures . Un deuxième blocage par la thymidine es t

réalisé pendant 17 heures . Les cellules sont alors à nouveau rincées au PBS et cultivées dan s

du milieu de culture sans thymidine :

- pendant 3 heures pour que les cellules soient en fin de S/G2 ,

- pendant 9 à 10 heures pour que les cellules soient en G1/début de S .

165

BIBLIOGRAPHIE

Ababneh, M., Gotz, C., and Montenarh, M. (2001) . Downregulation of the cdc2/cyclin Bprotein kinase activity by binding of p53 to p34(cdc2) . Biochem Biophys Res Commun 283 ,507-12 .

Adachi, N., Ishino, T ., Ishii, Y., Takeda, S ., and Koyama, H . (2001) . DNA ligase IV -deficient cells are more resistant to ionizing radiation in the absence of Ku70 : Implications forDNA double-strand break repair . Proc Natl Acad Sci U S A 98,12109-13 .

Adams, J . M., and Cory, S . (1998) . The Bcl-2 protein family : arbiters of cell survival .Science 281, 1322-6 .

Aguilera, A ., Chavez, S ., and Malagon, F. (2000) . Mitotic recombination in yeast : elementscontrolling its incidence . Yeast 16, 731-54 .

Aihara, H., Ito, Y., Kurumizaka, H ., Yokoyama, S ., and Shibata, T. (1999) . The N-terminal domain of the human Rad51 protein binds DNA : structure and a DNA bindin g

surface as revealed by NMR . J Mol Biol 290, 495-504 .

Ajimura, M ., Leem, S . H., and Ogawa, H. (1993) . Identification of new genes required for

meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 133, 51-66 .

Allen, C., Kurimasa, A., Brenneman, M. A., Chen, D. J ., and Nickoloff, J . A. (2002) .

DNA-dependent protein kinase suppresses double-strand break-induced and spontaneou s

homologous recombination . Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3758-63.

Arbel, A., Zenvirth, D ., and Simchen, G. (1999) . Sister chromatid-based DNA repair i s

mediated by RAD54, not by DMC1 or TID 1 . Embo J 18, 2648-58 .

Autexier, C., and Greider, C. W. (1996). Telomerase and cancer: revisiting the telomer e

hypothesis. Trends Biochem Sci 21, 387-91 .

Bailey, S . M., Meyne, J., Chen, D. J ., Kurimasa, A., Li, G . C ., Lehnert, B. E ., and

Goodwin, E . H. (1999) . DNA double-strand break repair proteins are required to cap the end s

of mammalian chromosomes . Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14899-904 .

Baldeyron, C ., Jacquemin, E., Smith, J ., Jacquemont, C., De Oliveira, I ., Gad, S. ,

Feunteun, J ., Stoppa-Lyonnet, D., and Papadopoulo, D . (2002) . A single mutated BRCA !

allele leads to impaired fidelity of double strand break end-joining . Oncogene 21, 1401-10 .

Banin, S., Moyal, L., Shieh, S., Taya, Y ., Anderson, C . W., Chessa, L., Smorodinsky, N .

L, Prives, C., Reiss, Y., Shiloh, Y., and Ziv, Y . (1998) . Enhanced phosphorylation of p53 b y

ATM in response to DNA damage . Science 281,1674-7 .

167

Baumann, P ., and West, S . C . (1998) . DNA end-joining catalyzed by human cell-fre e

extracts . Proc Nall Acad Sci U S A 95, 14066-70 .

Bentley, N. J., Holtzman, D. A., Flaggs, G., Keegan, K. S., DeMaggio, A., Ford, J . C . ,

Hoekstra, M., and Carr, A . M. (1996) . The Schizosaccharomyces pombe rad3 checkpoin t

gene. Embo J 15, 6641-51 .

Bertrand, P., Rouillard, D ., Boulet, A., Levalois, C ., Soussi, T., and Lopez, B . S. (1997) .

Increase of spontaneous intrachromosomal homologous recombination in mammalian cell s

expressing a mutant p53 protein . Oncogene 14, 1117-22 .

Bertrand, P., Tishkoff, D. X., Filosi, N., Dasgupta, R., and Kolodner, R . D. (1998) .

Physical interaction between components of DNA mismatch repair and nucleotide excisio n

repair . Proc Natl Acad Sci U S A 95, 14278-83 .

Bhattacharyya, A ., Ear, U. S., Koller, B . H., Weichselbaum, R . R., and Bishop, D . K.

(2000) . The breast cancer susceptibility gene BRCA1 is required for subnuclear assembly o f

Rad5l and survival following treatment with the DNA cross-linking agent cisplatin . J Biol

Chem 275, 23899-903 .

Biedermann, K . A., Sun, J . R., Giaccia, A. J ., Tosto, L. and Brown, J . M. (1991) . scid

mutation in mice confers hypersensitivity to ionizing radiation and a deficiency in DNA

double-strand break repair . Proc Natl Acad Sci S A 88, 1394-7 .

Bishop, A. J ., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A . J., and Schiestl, R . H. (2000). Atm

deficiency causes an increased frequency of intrachromosomal homologous recombination i n

mice. Cancer Res 60, 395-9 .

Bishop, D. K., Ear, U., Bhattacharyya, A ., Calderone, C ., Beckett, M., Weichselbaum, R .

R., and Shinohara, A . (1998) . Xrcc3 is required for assembly of Rad5 I complexes in vivo . J

Biol Chem 273, 21482-8 .

Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., and Kleckner, N . (1992) . DMC1 : a meiosis-specific yeas t

homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, an d

cell cycle progression . Cell 69, 439-56 .

Bliss, T . M., and Lane, D . P. (1997) . Ku selectively transfers between DNA molecules wit h

homologous ends . Biol Chem 272, 5765-73 .

Blunt, T ., Finnie, N. J ., Taccioli, G . E., Smith, G . C ., Demengeot, J., Gottlieb, T .

Mizuta, R., Varghese, A . J., Alt, F. W., Jeggo, P. A., and et al. (1995) . Defective DNA -

168

dependent protein kinase activity is linked to V(D)J recombination and DNA repair defect s

associated with the murine scid mutation . Cell 80, 813-23 .

Bogue, M. A., Jhappan, C ., and Roth, D . B. (1998) . Analysis of variable (diversity) joinin g

recombination in DNAdependent protein kinase (DNA-PK)-deficient mice reveals DNA-PK -

independent pathways for both signal and coding joint formation . Proc Natl Acad Sci U S A

95, 15559-64 .

Boubnov, N. V., Hall, K. T., Wills, Z ., Lee, S. E., He, D. M., Benjamin, D. M., Pulaski, C .

R., Band, H ., Reeves, W., Hendrickson, E. A., and et al . (1995) . Complementation of th e

ionizing radiation sensitivity, DNA end binding, and V(D)J recombination defects of double -

strand break repair mutants by the p86 Ku autoantigen . Proc Natl Acad Sci U S A 92, 890-4 .

Boulton, S. J., and Jackson, S . P. (1998) . Components of the Ku-dependent non -

homologous end-joining pathway are involved in telomeric length maintenance and telomeri c

silencing . Embo J 17,1819-28 .

Boulton, S. J., and Jackson, S . P. (1996a) . Identification of a Saccharomyces cerevisiae

Ku80 homologue: roles in DNA double strand break rejoining and in telomeric maintenance .

Nucleic Acids Res 24, 4639-48 .

Boulton, S . J., and Jackson, S . P. (1996b) . Saccharomyces cerevisiae Ku70 potentiate s

illegitimate DNA double-strand break repair and serves as a barrier to error-prone DNA repai r

pathways . Embo J 15, 5093-103 .

Bressan, D. A., Baxter, B. K., and Petrini, J. H. (1999). The Mre 11-Rad50-Xrs2 protei n

complex facilitates homologous recombination-based double-strand break repair i n

Saccharomyces cerevisiae . Mol Cell Biol 19, 7681-7 .

Brown, E . J ., and Baltimore, D. (2000) . ATR disruption leads to chromosomal

fragmentation and early embryonic lethality . Genes Dev 14, 397-402 .

Bryans, M., Valenzano, M. C ., and Stamato, T. D. (1999). Absence of DNA ligase IV

protein in XR-1 cells : evidence for stabilization by XRCC4 . Mutat Res 433, 53-8 .

Buchhop, S., Gibson, M. K., Wang, X . W ., Wagner, P., Sturzbecher, H. W ., and Harris ,

C. C. (1997) . Interaction of p53 with the human Rad51 protein . Nucleic Acids Res 25, 3868 -

74 .

Buerstedde, J . M., and Takeda, S . (1991) . Increased ratio of targeted to random integratio n

after transfection of chicken B cell lines . Cell 67, 179-88 .

169

Burma, S., Kurimasa, A ., Xie, G., Taya, Y., Araki, R., Abe, M., Crissman, H. A. ,

Ouyang, H., Li, G. C., and Chen, D . J . (1999) . DNA-dependent protein kinase-independentactivation of p53 in response to DNA damage . J Biol Chem 274, 17139-43 .

Calsou, P., Frit, P., Humbert, O ., Muller, C., Chen, D . J., and Salles, B. (1999) . TheDNA-dependent protein kinase catalytic activity regulates DNA end processing by means o f

Ku entry into DNA . J Biol Chem 274, 7848-56 .

Calsou, P., Frit, P., and Salles, B. (1996) . Double strand breaks in DNA inhibit nucleotid e

excision repair in vitro . J Biol Chem 271, 27601-7 .

Canman, C. E., Lim, D. S ., Cimprich, K. A., Taya, Y., Tamai, K., Sakaguchi, K . ,

Appella, E., Kastan, M. B., and Siliciano, J . D. (1998) . Activation of the ATM kinase by

ionizing radiation and phosphorylation of p53 . Science 281, 1677-9 .

Cary, R. B., Chen, F., Shen, Z., and Chen, D . J . (1998) . A central region of Ku80 mediate s

interaction with Ku70 in vivo . Nucleic Acids Res 26, 974-9 .

Cary, R. B., Peterson, S . R., Wang, J ., Bear, D. G., Bradbury, E . M., and Chen, D. J .

(1997). DNA looping by Ku and the DNA-dependent protein kinase . Proc Natl Acad Sci U S

A 94, 4267-72 .

Chan, D. W ., and Lees-Miller, S. P. (1996) . The DNA-dependent protein kinase is

inactivated by autophosphorylation of the catalytic subunit . J Biol Chem 271, 8936-41 .

Chan, D. W., Ye, R., Veillette, C . J ., and Lees-Miller, S. P. (1999) . DNA-dependent protein

kinase phosphorylation sites in Ku 70/80 heterodimer . Biochemistry 38,1819-28 .

Chan, T. A., Hwang, P. M., Hermeking, H., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B . (2000) .

Cooperative effects of genes controlling the G(2)/M checkpoint . Genes Dev 14,1584-8 .

Chehab, N. H., Malikzay, A., Appel, M., and Halazonetis, T . D. (2000) . Chk2/hCds 1

functions as a DNA damage checkpoint in G(1) by stabilizing p53 . Genes Dev 14, 278-88 .

Chen, F., Nastasi, A ., Shen, Z., Brenneman, M., Crissman, H ., and Chen, D. J. (1997) .

Cell cycle-dependent protein expression of mammalian homologs of yeast DNA double -

strand break repair genes Rad51 and Rad52 . Mutat Res 384, 205-11 .

Chen, G., Yuan, S . S ., Liu, W., Xu, Y., Trujillo, K., Song, B., Cong, F ., Goff, S. P., Wu,

Y., Arlinghaus, R ., Baltimore, D., Gasser, P . J., Park, M. S., Sung, P ., and Lee, E. Y.

(1999) . Radiation-induced assembly of Rad51 and Rad52 recombination complex require s

ATM and c-Abl . J Biol Chem 274, 12748-52 .

170

Chen, L., Trujillo, K., Ramos, W., Sung, P., and Tomkinson, A . E. (2001) . Promotion ofDn14-catalyzed DNA end-joining by the Rad5O/Mre11/Xrs2 and Hdfl/Hdf2 complexes . Mol

Cell 8, 1105-15 .

Chen, L., Trujillo, K., Sung, P ., and Tomkinson, A . E. (2000) . Interactions of the DNA

ligase IV-XRCC4 complex with DNA ends and the DNA-dependent protein kinase . J Bio l

Chem 275, 26196-205 .

Chen, P. L., Chen, C. F., Chen, Y., Xiao, J ., Sharp, Z . D., and Lee, W. H. (1998). The

BRC repeats in BRCA2 are critical for RAD51 binding and resistance to methy l

methanesulfonate treatment . Proc Natl Acad Sci U S A 95, 5287-92 .

Coleman, W. B., Ricketts, S. L., Borchert, K. M., Presnell, S . C., Esch, G . L. ,

McCullough, K. D., Weissman, B . E., Smith, G. J., and Grisham, J . W. (1999) . Induction

of rat WTI gene expression correlates with human chromosome 11 p 11 .2-p 12-mediated

suppression of tumorigenicity in rat liver epithelial tumor cell lines . Int J Oncol 14, 957-63 .

Connor, F ., Bertwistle, D ., Mee, P. J., Ross, G. M., Swift, S ., Grigorieva, E., Tybulewicz ,

V. L ., and Ashworth, A. (1997) . Tumorigenesis and a DNA repair defect in mice with a

truncating Brca2 mutation . Nat Genet 17, 423-30 .

Constantinou, A ., Tarsounas, M., Karow, J . K., Brosh, R. M., Bohr, V . A., Hickson, I .

D., and West, S. C. (2000). Werner's syndrome protein (WRN) migrates Holliday junction s

and co-localizes with RPA upon replication arrest . EMBO Rep 1, 80-4 .

Cooper, M. P., Machwe, A., Orren, D. K., Brosh, R. M., Ramsden, D., and Bohr, V . A.

(2000) . Ku complex interacts with and stimulates the Werner protein . Genes Dev 14, 907-12 .

Cortez, D., Wang, Y ., Qin, J ., and Elledge, S. J. (1999) . Requirement of ATM-dependen t

phosphorylation of brcal in the DNA damage response to double-strand breaks . Science 286 ,

1162-6 .

Costanzo, V., Robertson, K., Bibikova, M ., Kim, E., Grieco, D., Gottesman, M., Carroll ,

D ., and Gautier, J. (2001) . Mre 11 protein complex prevents double-strand brea k

accumulation during chromosomal DNA replication . Mol Cell 8, 137-47 .

Cox, M . M., Goodman, M. F., Kreuzer, K. N., Sherratt, D. J., Sandler, S. J ., and

Marians, K. J . (2000) . The importance of repairing stalled replication forks . Nature 404, 37 -

41 .

Critchlow, S. E., Bowater, R. P., and Jackson, S . P. (1997) . Mammalian DNA double-

strand break repair protein XRCC4 interacts with DNA ligase IV . Curr Biol 7, 588-98 .

171

d'Adda di Fagagna, F., Hande, M. P., Tong, W. M., Roth, D., Lansdorp, P. M., Wang, Z .Q., and Jackson, S. P. (2001) . Effects of DNA nonhomologous end-joining factors o ntelomere length and chromosomal stability in mammalian cells . Curr Biol 11,1192-6 .

D'Amours, D., and Jackson, S. P. (2002). The mre 11 complex: at the crossroads of dn arepair and checkpoint signalling . Nat Rev Mol Cell Biol 3, 317-27 .

Dar, M. E., Winters, T. A ., and Jorgensen, T . J. (1997) . Identification of defectiv e

illegitimate recombinational repair of oxidatively-induced DNA double-strand breaks i n

ataxia-telangiectasia cells . Mutat Res 384, 169-79 .

Davies, A. A ., Masson, J . Y., McIlwraith, M. J., Stasiak, A . Z ., Stasiak, A. ,

Venkitaraman, A . R., and West, S. C. (2001). Role of BRCA2 in control of the RAD5 1

recombination and DNA repair protein . Mol Cell 7, 273-82 .

de Jager, M., Dronkert, M. L., Modesti, M., Beerens, C . E., Kanaar, R., and van Gent ,

D. C. (2001 a) . DNA-binding and strand-annealing activities of human Mre 11 : implications

for its roles in DNA double-strand break repair pathways . Nucleic Acids Res 29,1317-25 .

de Jager, M., van Noort, J., van Gent, D . C., Dekker, C ., Kanaar, R., and Wyman, C .

(2001b) . Human Rad50/Mre11 is a flexible complex that can tether DNA ends . Mol Cell 8 ,

1129-35 .

de Toledo, S. M., Azzam, E . I ., Dahlberg, W. K., Gooding, T . B., and Little, J . B . (2000) .

ATM complexes with HDM2 and promotes its rapid phosphorylation in a p53-independen t

manner in normal and tumor human cells exposed to ionizing radiation . Oncogene 19, 6185-

93 .

de Vries, E ., van Driel, W., Bergsma, W . G., Arnberg, A . C ., and van der Vliet, P . C.

(1989). HeLa nuclear protein recognizing DNA termini and translocating on DNA forming a

regular DNA-multimeric protein complex . J Mol Biol 208, 65-78 .

De Zutter, J . K., and Knight, K. L. (1999) . The hRad5 1 and RecA proteins show significan t

differences in cooperative binding to single-stranded DNA . J Mol Biol 293, 769-80 .

Deans, B., Griffin, C . S., Maconochie, M ., and Thacker, J . (2000) . Xrcc2 is required for

genetic stability, embryonic neurogenesis and viability in mice . Embo J 19, 6675-85 .

Deutsch, E ., Dugray, A., AbdulKarim, B., Marangoni, E ., Maggiorella, L., Vaganay, S . ,

M'Kacher, R., Rasy, S . D., Eschwege, F., Vainchenker, W ., Turhan, A . G., and Bourhis ,

J. (2001) . BCR-ABL down-regulates the DNA repair protein DNA-PKcs . Blood 97, 2084-90 .

172

DiBiase, S . J., Zeng, Z. C., Chen, R., Hyslop, T., Curran, W. J., Jr., and Iliakis, G .

(2000) . DNA-dependent protein kinase stimulates an independently active, nonhomologous ,

end-joining apparatus . Cancer Res 60, 1245-53 .

Difilippantonio, M . J., Zhu, J ., Chen, H . T., Meffre, E., Nussenzweig, M. C., Max, E. E. ,

Ried, T ., and Nussenzweig, A . (2000) . DNA repair protein Ku80 suppresses chromosoma l

aberrations and malignant transformation . Nature 404, 510-4 .

Donehower, L . A., Harvey, M., Slagle, B . L., McArthur, M. J., Montgomery, C. A., Jr . ,

Butel, J . S., and Bradley, A . (1992) . Mice deficient for p53 are developmentally normal bu t

susceptible to spontaneous tumours . Nature 356, 215-21 .

Dong, Z., Zhong, Q ., and Chen, P. L. (1999) . The Nijmegen breakage syndrome protein i s

essential for Mre 1 1 phosphorylation upon DNA damage . J Biol Chem 274, 19513-6 .

Dronkert, M. L., Beverloo, H. B., Johnson, R. D., Hoeijmakers, J. H., Jasin, M., and

Kanaar, R. (2000) . Mouse RAD54 affects DNA double-strand break repair and siste r

chromatid exchange . Mol Cell Biol 20, 3147-56 .

Dudenhoffer, C ., Kurth, M., Janus, F., Deppert, W., and Wiesmuller, L. (1999) .

Dissociation of the recombination control and the sequence-specific transactivation functio n

of P53 . Oncogene 18, 5773-84 .

Dunham, M. A., Neumann, A . A., Fasching, C . L., and Reddel, R . R. (2000). Telomere

maintenance by recombination in human cells . Nat Genet 26, 447-50 .

Dynan, W. S., and Yoo, S . (1998) . Interaction of Ku protein and DNA-dependent protei n

kinase catalytic subunit with nucleic acids . Nucleic Acids Res 26, 1551-9 .

Escarceller, M., Buchwald, M ., Singleton, B . K., Jeggo, P . A., Jackson, S. P., Moustacchi ,

E., and Papadopoulo, D . (1998) . Fanconi anemia C gene product plays a role in the fidelit y

of blunt DNA end-joining . J Mol Biol 279, 375-85 .

Essers, J ., Hendriks, R. W ., Swagemakers, S . M., Troelstra, C., de Wit, J ., Bootsma, D . ,

Hoeijmakers, J . H., and Kanaar, R. (1997) . Disruption of mouse RAD54 reduces ionizin g

radiation resistance and homologous recombination . Cell 89, 195-204 .

Essers, J ., van Steeg, H ., de Wit, J ., Swagemakers, S . M., Vermeij, M., Hoeijmakers, J .

H., and Kanaar, R. (2000) . Homologous and non-homologous recombination differentiall y

affect DNA damage repair in mice . Embo J 19, 1703-10 .

173

Fabre, F. (1978) . Induced intragenic recombination in yeast can occur during the GI mitoti c

phase. Nature 272, 795-8 .

Falck, J., Mailand, N., Sy1juasen, R. G., Bartek, J., and Lukas, J . (2001) . The ATM-

Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis . Nature 410,

842-7 .

Falck, J ., Petrini, J . H ., Williams, B. R., Lukas, J ., and Bartek, J . (2002) . The DNA

damage-dependent intra-S phase checkpoint is regulated by parallel pathways . Nat Genet 30,

290-4 .

Feldmann, E., Schmiemann, V., Goedecke, W., Reichenberger, S., and Pfeiffer, P .

(2000). DNA double-strand break repair in cell-free extracts from Ku80-deficient cells :

implications for Ku serving as an alignment factor in non-homologous DNA end joining .


Ferguson, D . O., and Alt, F . W. (2001) . DNA double strand break repair and chromosoma l

translocation : lessons from animal models . Oncogene 20, 5572-9 .

Ferguson, D . O., Sekiguchi, J . M., Chang, S ., Frank, K. M., Gao, Y., DePinho, R. A., and

Alt, F. W. (2000) . The nonhomologous end-joining pathway of DNA repair is required fo r

genomic stability and the suppression of translocations . Proc Nat], Acad Sci U S A 97, 6630-3 .

Finnie, N. J., Gottlieb, T. M., Blunt, T., Jeggo, P. A ., and Jackson, S . P. (1995) . DNA-

dependent protein kinase activity is absent in xrs-6 cells : implications for site-specifi c

recombination and DNA double-strand break repair . Proc Natl. Acad Sci U S A 92, 320-4 .

Fishman-Lobell, J ., and Haber, J . E. (1992) . Removal of nonhomologous DNA ends i n

double-strand break recombination : the role of the yeast ultraviolet repair gene RAD1 .

Science 258, 480-4 .

Flygare, J ., Armstrong, R . C ., Wennborg, A ., Orsan, S ., and Hellgren, D. (1998) .

Proteolytic cleavage of HsRad51 during apoptosis . FEBS Lett 427, 247-51 .

Flygare, J ., Benson, F., and Hellgren, D. (1996) . Expression of the human RAD5 1 gen e

during the cell cycle in primary human peripheral blood lymphocytes . Biochim Biophys Acta

1312, 231-6 .

Fornace, A. J., Jr . (1983). Recombination of parent and daughter strand DNA after UV -

irradiation in mammalian cells . Nature 304, 552-4 .

174

Frank, K. M., Sekiguchi, J . M ., Seidl, K. J., Swat, W., Rathbun, G. A., Cheng, H . L. ,Davidson, L., Kangaloo, L ., and Alt, F . W. (1998) . Late embryonic lethality and impaire dV(D)J recombination in mice lacking DNA ligase IV . Nature 396, 173-7 .

Frank, K. M., Sharpless, N. E., Gao, Y., Sekiguchi, J . M., Ferguson, D . O., Zhu, C. ,Manis, J . P., Horner, J ., DePinho, R. A., and Alt, F. W. (2000) . DNA ligase IV deficienc y

in mice leads to defective neurogenesis and embryonic lethality via the p53 pathway . Mol

Cell 5, 993-1002 .

Friedman, L. S., Thistlethwaite, F. C., Patel, K. J ., Yu, V. P., Lee, H., Venkitaraman, A .

R., Abel, K. J., Carlton, M. B., Hunter, S . M., Colledge, W. H., Evans, M. J., and

Ponder, B. A. (1998) . Thymic lymphomas in mice with a truncating mutation in Brca2 .Cancer Res 58, 1338-43 .

Fukushima, T., Takata, M., Morrison, C ., Araki, R., Fujimori, A ., Abe, M., Tatsumi, K. ,Jasin, M., Dhar, P . K., Sonoda, E., Chiba, T ., and Takeda, S. (2001). Genetic analysis o f

the DNA-dependent protein kinase reveals an inhibitory role of Ku in late S-G2 phase DN Adouble-strand break repair . J Biol Chem 276, 44413-8 .

Gao, Y., Chaudhuri, J ., Zhu, C ., Davidson, L., Weaver, D. T., and Alt, F . W. (1998) . A

targeted DNA-PKcs-null mutation reveals :DNA-PK-independent functions for KU in V(D) Jrecombination. Immunity 9, 367-76 .

Gao, Y., Ferguson, D. O., Xie, W., Manis, J . P., Sekiguchi, J ., Frank, K. M., Chaudhuri,

J., Horner, J ., DePinho, R. A., and Alt, F. W. (2000) . Interplay of p53 and DNA-repai rprotein XRCC4 in tumorigenesis, genomic stability and development . Nature 404, 897-900 .

Gao, Y., Sun, Y., Frank, K. M., Dikkes, P ., Fujiwara, Y., Seidl, K. J., Sekiguchi, J . M . ,Rathbun, G. A., Swat, W., Wang, J ., Bronson, R. T., Malynn, B. A., Bryans, M., Zhu, C . ,Chaudhuri, J., Davidson, L ., Ferrini, R., Stamato, T., Orkin, S . H., Greenberg, M. E. ,

and Alt, F. W. (1998) . A critical role for DNA end-joining proteins in both lymphogenesi s

and neurogenesis . Cell 95, 891-902 .

Gatei, M., Scott, S . P., Filippovitch, I ., Soronika, N ., Lavin, M. F., Weber, B., and

Khanna, K. K. (2000) . Role for ATM in DNA damage-induced phosphorylation of BRCA 1 .

Cancer Res 60, 3299-304 .

German, J. (1995) . Bloom's syndrome . Dermatol Clin 13, 7-18 .

Giannini, G., Ristori, E., Cerignoli, F ., Rinaldi, C., Zani, M ., Viet, A., Ottini, L . ,

Crescenzi, M., Martinotti, S., Bignami, M., Frati, L., Screpanti, I., and Gulino, A. (2002) .

Human MRE1 1 is inactivated in mismatch repair-deficient cancers . EMBO Rep 3, 248-54 .

175

Gilley, D., Tanaka, H., Hande, M. P., Kurimasa, A ., Li, G. C ., 0shimura, M ., and Chen ,

D. J. (2001) . DNA-PKcs is critical for telomere capping . Proc Natl Acad Sci U S A 98 ,

15084-8 .

Goedecke, W., Eijpe, M., Offenberg, H . H., van Aalderen, M., and Heyting, C . (1999) .

Mre 11 and Ku70 interact in somatic cells, but are differentially expressed in early meiosis .

Nat Genet 23, 194-8 .

Goggins, M., Schutte, M ., Lu, J ., Moskaluk, C. A., Weinstein, C. L., Petersen, G. M . ,

Yeo, C. J., Jackson, C. E., Lynch, H. T., Hruban, R. H., and Kern, S . E. (1996) . Germline

BRCA2 gene mutations in patients with apparently sporadic pancreatic carcinomas. Cancer

Res 56, 5360-4 .

Golub, E. I., Gupta, R. C., Haaf, T ., Wold, M. S ., and Radding, C . M. (1998) . Interactio n

of human rad51 recombination protein with single-stranded DNA binding protein, RPA .


Gottlieb, T. M., and Jackson, S . P. (1993) . The DNA-dependent protein kinase : requirement

for DNA ends and association with Ku antigen . Cell 72,131-42 .

Gravel, S ., Larrivee, M., Labrecque, P ., and Wellinger, R . J . (1998) . Yeast Ku as a

regulator of chromosomal DNA end structure. Science 280, 741-4 .

Grawunder, U., Wilm, M., Wu, X., Kulesza, P., Wilson, T . E., Mann, M., and Lieber, M .

R. (1997) . Activity of DNA ligase IV stimulated by complex formation with XRCC4 protei n

in mammalian cells . Nature 388, 492-5 .

Grawunder, U ., Zimmer, D., and Leiber, M. R. (1998) . DNA ligase IV binds to XRCC 4

via a motif located between rather than within its BRCT domains . Curr Biol 8, 873-6 .

Greider, C . W., and Blackburn, E . H. (1985) . Identification of a specific telomere termina l

transferase activity in Tetrahymena extracts . Cell 43, 405-13 .

Gu, Y., Jin, S., Gao, Y ., Weaver, D. T., and Alt, F . W. (1997) . Ku70-deficient embryoni c

stem cells have increased ionizing radiosensitivity, defective DNA end-binding activity, an d

inability to support V(D)J recombination . Proc Natl Acad Sci U S A 94, 8076-81 .

Gu, Y., Sekiguchi, J ., Gao, Y., Dikkes, P ., Frank, K ., Ferguson, D., Hasty, P., Chun, J . ,

and Alt, F. W. (2000) . Defective embryonic neurogenesis in Ku-deficient but not DNA -

dependent protein kinase catalytic subunit-deficient mice . Proc Natl Acad Sci U S A 97 ,

2668-73 .

176

Gupta, R. C., Folta-Stogniew, E ., O'Malley, S., Takahashi, M., and Radding, C. M.

(1999). Rapid exchange of A :T base pairs is essential for recognition of DNA homology b y

human Rad5 1 recombination protein . Mol Cell 4, 705-14 .

Gurley, K . E., and Kemp, C. J . (1996) . p53 induction, cell cycle checkpoints, and apoptosi s

in DNAPK-deficient scid mice . Carcinogenesis 17, 2537-42 .

Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C . M., and Ward, D . C. (1995) . Nuclear foc i

of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and it s

localization in synaptonemal complexes . Proc Natl Acad Sci U S A 92, 2298-302 .

Haaf, T., Raderschall, E ., Reddy, G., Ward, D. C., Radding, C. M., and Golub, E . I .

(1999) . Sequestration of mammalian Rad51-recombination protein into micronuclei . J Cel l

Biol 144, 11-20 .

Haber, J . E. (1998) . The many interfaces of. Mre 11 . Cell 95, 583-6 .

Haber, J . E. (1997) . A super new twist on the initiation of meiotic recombination . Cell 89,

163-6 .

Hakem, R., de la Pompa, J . L., Ella, A., Potter, J ., and Mak, T . W. (1997) . Partial rescue

of Brca1(5-6) early embryonic lethality by p53 or p21 null mutation . Nat Genet 16, 298-302 .

Hammarsten, O., and Chu, G. (1998) . DNA-dependent protein kinase : DNA binding an d

activation in the absence of Ku . Proc Natl Acad Sci U S A 95, 525-30 .

Han, J . O., Steen, S. B., and Roth, D. B . (1997) . Ku86 is not required for protection o f

signal ends or for formation of nonstandard V(D)J recombination products . Mol Cell Biol 17 ,

2226-34 .

Han, Z ., Malik, N., Carter, T ., Reeves, W. H., Wyche, J . H., and Hendrickson, E. A.

(1996). DNA-dependent protein kinase is a target for a CPP32-like apoptotic protease . J Bio l

Chem 271, 25035-40 .

Hanakahi, L . A., Bartlet-Jones, M., Chappell, C ., Pappin, D., and West, S. C. (2000) .

Binding of inositol phosphate to DNA-PK and stimulation of double-strand break repair . Cel l

102, 721-9 .

Hartley, K . O., Gell, D., Smith, G. C., Zhang, H., Divecha, N ., Connelly, M. A., Admon,

A ., Lees-Miller, S . P., Anderson, C . W., and Jackson, S . P. (1995) . DNA-dependent

protein kinase catalytic subunit : a relative of phosphatidylinositol 3-kinase and the ataxi a

telangiectasia gene product . Cell 82, 849-56 .

177

Havre, P . A., Rice, M., Ramos, R., and Kmiec, E . B . (2000) . HsRec2/Rad5lL1, a proteininfluencing cell cycle progression, has protein kinase activity . Exp Cell Res 254, 33-44 .

Hellgren, D., Luthman, H., and Lambert, B . (1989) . Induced recombination betwee nduplicated neo genes stably integrated in the genome of CHO cells . Mutat Res 210, 197-206 .

Hirao, A., Kong, Y. Y., Matsuoka, S ., Wakeham, A., Ruland, J ., Yoshida, H., Liu, D. ,Elledge, S . J ., and Mak, T. W. (2000) . DNA damage-induced activation of p53 by thecheckpoint kinase Chk2 . Science 287, 1824-7 .

Holliday, R. (1964) . A mechanism for gene conversion in fungi . Genet . Res . 5, 282-30 6

Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Harris, C . C. (1991) . p53 mutations inhuman cancers . Science 253, 49-53 .

Hosoi, Y., Miyachi, H., Matsumoto, Y., Ikehata, H., Komura, J ., Ishii, K., Zhao, H . J . ,

Yoshida, M., Takai, Y ., Yamada, S ., Suzuki, N., and Ono, T . (1998) . Aphosphatidylinositol 3-kinase inhibitor wortmannin induces radioresistant DNA synthesis and

sensitizes cells to bleomycin and ionizing radiation . Int J Cancer 78, 642-7 .

Hsu, H. L., Gilley,

Blackburn, E. H., and Chen, D. J. (1999) . Ku is associated with the

telomere in mammals . Proc Natl Acad Sci U S A 96, 12454-8 .

Hsu, H . L., Gilley, D., Galande, S. A ., Hande, M. P., Allen, B., Kim, S. H., Li, G. C. ,

Campisi, J ., Kohwi-Shigematsu, T., and Chen, D. J. (2000). Ku acts in a unique way at the

mammalian telomere to prevent end joining . Genes Dev 14, 2807-12 .

Hu, T., Miller, C . M., Ridder, G. M., and Aardema, M. J. (1999) . Characterization of p5 3

in Chinese hamster cell lines CHO-K1, CHO-WBL, and CHL : implications for genotoxicity

testing . Mutat Res 426, 51-62 .

Huang, J., and Dynan, W. S. (2002) . Reconstitution of the mammalian DNA double-stran d

break end-joining reaction reveals a requirement for an Mre 1 1/Rad5O/NBS 1-containin g

fraction. Nucleic Acids Res 30, 667-74 .

Huang, Y ., Nakada, S., Ishiko, T., Utsugisawa, T., Datta, R., Kharbanda, S., Yoshida, K. ,

Talanian, R . V., Weichselbaum, R., Kufe, D., and Yuan, Z. M. (1999) . Role for caspase-

mediated cleavage of Rad51 in induction of apoptosis by DNA damage . Mol Cell Biol 19,

2986-97 .

178

Ivanov, E . L., Sugawara, N., White, C . I ., Fabre, F., and Haber, J . E. (1994) . Mutations inXRS2 and RAD50 delay but do not prevent mating-type switching in Saccharomycescerevisiae . Mol Cell Biol 14, 3414-25 .

Ivanov, E. L., and Haber, J . E. (1995) . RAD 1 and RADIO, but not other excision repai rgenes, are required for double-strand break-induced recombination in Saccharomyces

cerevisiae . Mol Cell Biol 15, 2245-51 .

Jeggo, P. A. (1998) . Identification of genes involved in repair of DNA double-strand break s

in mammalian cells . Radiat Res 150, S80-91 .

Jhappan, C., Morse, H. C., 3rd, Fleischmann, R. D., Gottesman, M. M., and Merlino, G .

(1997). DNA-PKcs : a T-cell tumour suppressor encoded at the mouse scid locus . Nat Genet

17, 483-6 .

Jhappan, C., Yusufzai, T. M., Anderson, S ., Anver, M. R., and Merlino, G. (2000) . The

p53 response to DNA damage in vivo is independent of DNA-dependent protein kinase. Mol

Cell Biol 20, 4075-83 .

Jimenez, G. S., Bryntesson, F., Torres-Arzayus, M . I ., Priestley, A., Beeche, M., Saito, S . ,

Sakaguchi, K., Appella, E ., Jeggo, P. A., Taccioli, G . E., Wahl, G. M., and Hubank, M .

(1999) . DNA-dependent protein kinase is not required for the p53-dependent response t o

DNA damage. Nature 400, 81-3.

Jin, S., Kharbanda, S ., Mayer, B ., Kufe, D., and Weaver, D. T. (1997) . Binding of Ku and

c-Abl at the kinase homology region of DNA-dependent protein kinase catalytic subunit . J

Biol Chem 272, 24763-6 .

Jin, S., and Weaver, D. T . (1997) . Double-strand break repair by Ku70 require s

heterodimerization with Ku80 and DNA binding functions . Embo J 16, 6874-85 .

Johnson, R. D., and Jasin, M. (2000) . Sister chromatid gene conversion is a prominen t

double-strand break repair pathway in mammalian cells . Embo J 19, 3398-407 .

Johnson, R . D., Liu, N., and Jasin, M . (1999) . Mammalian XRCC2 promotes the repair o f

DNA double-strand breaks by homologous recombination . Nature 401, 397-9 .

Junop, M. S., Modesti, M., Guarne, A., Ghirlando, R ., Gellert, M., and Yang, W . (2000) .

Crystal structure of the Xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining . Embo J

19, 5962-70 .

179

Kabotyanski, E. B., Gomelsky, L., Han, J. O., Stamato, T . D., and Roth, D. B. (1998) .Double-strand break repair in Ku86- and XRCC4-deficient cells . Nucleic Acids Res 26, 5333 -42 .

Kadyk, L. C., and Hartwell, L. H. (1992) . Sister chromatids are preferred over homologs a ssubstrates for recombinational repair in Saccharomyces cerevisiae . Genetics 132, 387-402 .

Kang, J ., Bronson, R. T., and Xu, Y. (2002) . Targeted disruption of NBS1 reveals its role sin mouse development and DNA repair . Embo J 21, 1447-55 .

Karanjawala, Z . E., Grawunder, U., Hsieh, C. L., and Lieber, M. R. (1999). Th enonhomologous DNA end joining pathway is important for chromosome stability in primaryfibroblasts. Curr Biol 9, 1501-4.

Karow, J. K., Constantinou, A., Li, J. L., West, S. C., and Hickson, I. D. (2000) . TheBloom's syndrome gene product promotes branch migration of holliday junctions . Proc Nat iAcad Sci U S A 97, 6504-8 .

Katagiri, T., Saito, H., Shinohara, A., Ogawa, H., Kamada, N., Nakamura, Y ., and Miki ,

Y. (1998) . Multiple possible sites of BRCA2 interacting with DNA repair protein RAD51 .

Genes Chromosomes Cancer 21, 217-22 .

Kharbanda, S., Pandey, P ., Jin, S., Inoue, S ., Bharti, A ., Yuan, Z. M., Weichselbaum, R . ,

Weaver, D., and Kufe, D. (1997). Functional interaction between DNA-PK and c-Abl i n

response to DNA damage . Nature 386, 732-5 .

Kharbanda, S., Yuan, Z. M., Weichselbaum, R ., and Kufe, D . (1998) . Determination o f

cell fate by c-Abl activation in the response to DNA damage . Oncogene 17, 3309-18 .

Khosravi, R., Maya, R., Gottlieb, T., Oren, M., Shiloh, Y ., and Shkedy, D. (1.999) . Rapid

ATM-dependent phosphorylation of MDM2 precedes p53 accumulation in response to DN A

damage. Proc Nati Acad Sci U S A 96, 14973-7 .

Kim, S. T., Lim, D. S ., Canman, C. E., and Kastan, M . B . (1999) . Substrate specificitie s

and identification of putative substrates of ATM kinase family members . J Biol Chem 274 ,

37538-43 .

Klein, H. L. (1997) . RDH54, a RAD54 homologue in Saccharomyces cerevisiae, is require d

for mitotic diploid-specific recombination and repair and for meiosis . Genetics 147, 1533-43 .

Koike, M., Shiomi, T., and Koike, A . (2001) . Dimerization and nuclear localization of k u

proteins . J Biol Chem 276, 11167-73 .

180

Kovalenko, O. V., Plug, A. W., Haaf, T., Gonda, D. K., Ashley, T ., Ward, D. C . ,

Radding, C . M., and Golub, E . L (1996) . Mammalian ubiquitin-conjugating enzyme Ubc 9

interacts with Rad5 1 recombination protein and localizes in synaptonemal complexes . Proc

Natl. Acad Sci U S A 93, 2958-63 .

Kuo, M. L., Shiah, S. G., Wang, C. J ., and Chuang, S . E. (1999) . Suppression of apoptosi s

by Bcl-2 to enhance benzene metabolites-induced oxidative DNA damage and mutagenesis : A

possible mechanism of carcinogenesis . Mol Pharmacol 55, 894-901 .

Kurimasa, A ., Kumano, S ., Boubnov, N . V., Story, M . D., Tung, C . S., Peterson, S. R. ,

and Chen, D. J. (1999) . Requirement for the kinase activity of human DNA-dependen t

protein kinase catalytic subunit in DNA strand break rejoining . Mol Cell Biol 19, 3877-84 .

Kurimasa, A., Ouyang, H., Dong, L. J ., Wang, S., Li, X., Cordon-Cardo, C ., Chen, D. J . ,

and Li, G. C. (1999). Catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase : impact o n

lymphocyte development and tumorigenesis . Proc Natl Acad Sci U S A 96, 1403-8 .

Kurumizaka, H., Ikawa, S ., Nakada, M., Eda, K., Kagawa, W., Takata, M., Takeda, S . ,

Yokoyama, S., and Shibata, T . (2001) . Homologous-pairing activity of the human DNA-

repair proteins Xrcc3 .Rad51C . Proc Natl. Acad Sci U S A 98, 5538-43 .

Kurumizaka, H ., Ikawa, S ., Nakada, M., Enomoto, R ., Kagawa, W., Kinebuchi, T . ,

Yamazoe, M., Yokoyama, S ., and Shibata, T . (2002). Homologous pairing and ring and

filament structure formation activities of the human Xrcc2*Rad51 D complex . J Biol Chem

277, 14315-20 .

Labhart, P. (1999) . Nonhomologous DNA end joining in cell-free systems . Eur J Bioche m

265, 849-61 .

Lambert, S., and Lopez, B . S. (2000) . Characterization of mammalian RAD51 double strand

break repair using non-lethal dominant-negative forms . Embo J 19, 3090-9 .

Lambert, S ., and Lopez, B . S . (2002). Inactivation of the RAD51 recombination pathwa y

stimulates UV-induced mutagenesis in mammalian cells . Oncogene 21, 4065-9 .

Lambert, S ., and Lopez, B. S. (2001) . Role of RAD51 in sister-chromatid exchanges i n

mammalian cells. Oncogene 20, 6627-31 .

Larminat, F ., Germanier, M., Papouli, E., and Defais, M. (2002) . Deficiency in BRCA 2

leads to increase in non-conservative homologous recombination . Oncogene 21, 5188-92 .

181

Le, S., Moore, J . K., Haber, J . E., and Greider, C. W. (1999) . RAD50 and RAD51 defin etwo pathways that collaborate to maintain telomeres in the absence of telomerase . Genetic s152, 143-52 .

Leber, R., Wise, T. W., Mizuta, R., and Meek, K. (1998) . The XRCC4 gene product is a

target for and interacts with the DNA-dependent protein kinase . J Biol Chem 273, 1794-801 .

Lee, J. S ., Collins, K. M., Brown, A. L., Lee, C. H., and Chung, J . H. (2000a) . hCds 1 -

mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response . Nature 404, 201 -4 .

Lee, K. J., Huang, J., Takeda, Y ., and Dynan, W. S. (2000b) . DNA ligase IV and XRCC 4

form a stable mixed tetramer that functions synergistically with other repair factors in a cell -

free end-joining system . J Biol Chem 275, 34787-96 .

Lee, S., Cavallo, L ., and Griffith, J . (1997a) . Human p53 binds Holliday junctions strongly

and facilitates their cleavage . J Biol Chem 272, 7532-9 .

Lee, S . E., Mitchell, R. A., Cheng, A., and Hendrickson, E. A. (1997b) . Evidence fo r

DNA-PK-dependent and -independent DNA double-strand break repair pathways i n

mammalian cells as a function of the cell cycle . Mol Cell Biol 17, 1425-33 .

Lee, S. E., Moore, J. K., Holmes, A., Umezu, K., Kolodner, R. D., and Haber, J . E.

(1998) . Saccharomyces Ku70, mrell/rad50 and RPA proteins regulate adaptation to G2/M

arrest after DNA damage . Cell 94, 399-409 .

Lees-Miller, S . P., Sakaguchi, K ., Ullrich, S . J ., Appella, E., and Anderson, C . W. (1992) .

Human DNA-activated protein kinase phosphorylates serines 15 and 37 in the amino-terminal

transactivation domain of human p53 . Mol Cell Biol 12, 5041-9 .

Legerski, R . J., Penkala, J . E., Peterson, C . A., and Wright, D. A. (1987) . Repair of UV -

induced lesions in Xenopus laevis oocytes . Viol Cell Biol 7, 4317-23 .

Lehmann, A. R. (2000) . Replication of UV-damaged DNA : new insights into links between

DNA polymerases, mutagenesis and human disease . Gene 253,1-12 .

Levine, A . J., Momand, J ., and Finlay, C. A . (1991) . The p53 tumour suppressor gene .

Nature 351, 453-6 .

Li, G . C., Ouyang, H., Li, X., Nagasawa, H., Little, J . B ., Chen, D. J., Ling, C . C., Fuks,

Z ., and Cordon-Cardo, C . (1998). Ku70: a candidate tumor suppressor gene for murine T

cell lymphoma. Mol Cell 2, 1-8 .

182

Li, W., Hesabi, B ., Babbo, A., Pacione, C ., Liu, J ., Chen, D. J., Nickoloff, J . A., and Shen,

Z. (2000) . Regulation of double-strand break-induced mammalian homologous recombination

by UBL1, a RAD51-interacting protein . Nucleic Acids Res 28,1145-53 .

Li, Z., Otevrel, T ., Gao, Y., Cheng, H. L., Seed, B ., Stamato, T . D., Taccioli, G. E., andAlt, F. W. (1995) . The XRCC4 gene encodes a novel protein involved in DNA double-stran dbreak repair and V(D)J recombination . Cell 83, 1079-89 .

Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., and Jasin, M. (1998) . Homology-directed repair i s

a major double-strand break repair pathway in mammalian cells . Proc Natl Acad Sci U S A

95, 5172-7 .

Liang, F., Romanienko, P. J., Weaver, D . T., Jeggo, P. A., and Jasin, M. (1996).Chromosomal double-strand break repair in Ku80-deficient cells . Proc Natl Acad Sci U S A

93, 8929-33 .

Lim, D. S., and Hasty, P. (1996) . A mutation in mouse rad5l results in an early embryoni c

lethal that is suppressed by a mutation in p53 . Mol Cell Biol 16, 7133-43 .

Lin, F. L ., Sperle, K., and Sternberg, N . (1984). Model for homologous recombination

during transfer of DNA into mouse L cells : role for DNA ends in the recombination process .

Mol Cell Biol 4, 1020-34 .

Liu, N., Schild, D., Thelen, M. P., and Thompson, L. H. (2002) . Involvement of Rad51C i n

two distinct protein complexes of Rad51 paralogs in human cells . Nucleic Acids Res 30,

1009-15 .

Liu, Y., Li, M., Lee, E . Y., and Maizels, N . (1999) . Localization and dynamic relocalization

of mammalian Rad52 during the cell cycle and in response to DNA damage . Curr Biol 9, 975-

8 .

Liu, Y., and Maizels, N . (2000) . Coordinated response of mammalian Rad51 and Rad52 t o

DNA damage . EMBO Rep 1, 85-90 .

Liu, Y., Naumovski, L ., and Hanawalt, P. (1997). Nucleotide excision repair capacity i s

attenuated in human promyelocytic HL60 cells that overexpress BCL2 . Cancer Res 57, 1650 -

3 .

Lombard, D. B., and Guarente, L . (2000) . Nijmegen breakage syndrome disease protei n

and MRE11 at PML nuclear bodies and meiotic telomeres . Cancer Res 60, 2331-4 .

183

Ludwig, T ., Chapman, D . L., Papaioannou, V. E ., and Efstratiadis, A . (1997) . Targeted

mutations of breast cancer susceptibility gene homologs in mice : lethal phenotypes of Brcal ,

Brca2, Brcal/Brca2, Brcal/p53, and Brca2lp53 nullizygous embryos . Genes Dev 11, 1226 -

41 .

Lundberg, R ., Mavinakere, M ., and Campbell, C. (2001) . Deficient DNA end joinin g

activity in extracts from fanconi anemia fibroblasts . J Biol Chem 276, 9543-9 .

Lundblad, V., and Blackburn, E. H. (1993) . An alternative pathway for yeast telomer e

maintenance rescues est1- senescence. Cell 73, 347-60 .

Luo, G., Yao, M. S., Bender, C. F., Mills, M., Bladl, A. R., Bradley, A ., and Petrini, J . H.

(1999). Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryoni c

development, and sensitivity to ionizing radiation . Proc Natl Acad Sci U S A 96, 7376-81 .

Ma, Y., and Lieber, M. R. (2002) . Binding of inositol hexakisphosphate (IP6) to Ku but no t

to DNA-PKcs . J Biol Chem 277, 10756-9 .

Ma, Y., Pannicke, U ., Schwarz, K., and Lieber, M. R. (2002) . Hairpin opening and

overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex i n

nonhomologous end joining and V(D)J recombination . Cell 108, 781-94 .

Malkova, A., Ivanov, E. L., and Haber, J . E. (1996) . Double-strand break repair in the

absence of RAD51 in yeast : a possible role for break-induced DNA replication . Proc Nat l

Acad Sci U S A 93, 7131-6 .

Mallya, S . M., and Sikpi, M. O. (1999) . Requirement for p53 in ionizing-radiation-inhibitio n

of double-strand-break rejoining by human lymphoblasts . Mutat Res 434,119-32 .

Martin, N. M. (2001) . DNA repair inhibition and cancer therapy . J Photochem Photobiol B

63, 162-70 .

Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., and Petrini, J . H. (1997) . hMre 11 and hRadS O

nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks .

Mol Cell Biol 17, 6087-96 .

Masson, J . Y., Tarsounas, M . C., Stasiak, A. Z., Stasiak, A., Shah, R., Mcllwraith, M . J . ,

Benson, F. E ., and West, S . C . (2001) . Identification and purification of two distinct

complexes containing the five RAD51 paralogs . Genes Dev 15, 3296-307 .

Matsumoto, Y., Suzuki, N ., Namba, N., Umeda, N., Ma, X. J., Morita, A ., Tomita, M. ,

Enomoto, A ., Serizawa, S., Hirano, K., Sakaia, K., Yasuda, H., and Hosoi, Y. (2000) .

184

Cleavage and phosphorylation of XRCC4 protein induced by X-irradiation . FEBS Lett 478 ,

67-71 .

Matsuoka, S., Rotman, G., Ogawa, A., Shiloh, Y., Tamai, K., and Elledge, S . J. (2000) .

Ataxia telangiectasia-mutated phosphorylates Chk2 in vivo and in vitro . Proc Natl. Acad Sci U

S A 97, 10389-94 .

Maya, R., Balass, M., Kim, S . T., Shkedy, D., Leal, J. F., Shifman, O ., Moas, M. ,

Buschmann, T., Ronai, Z ., Shiloh, Y., Kastan, M. B., Katzir, E., and Oren, M. (2001) .

ATM-dependent phosphorylation of Mdm2 on serine 395 : role in p53 activation by DN A

damage . Genes Dev 15, 1067-77 .

Mayo, L. D., Turchi, J. J ., and Berberich, S . J. (1997) . Mdm-2 phosphorylation by DNA -

dependent protein kinase prevents interaction with p53 . Cancer Res 57, 5013-6 .

Meselson, M. S., and Radding, C . M. (1975) . A general model for genetic recombination .

Proc Natl. Acad Sci U S A 72, 358-61 .

Meyn, M. S . (1993) . High spontaneous intrachromosomal recombination rates in ataxia -

telangiectasia . Science 260, 1327-30 .

Michel, B., Flores, M. J., Viguera, E ., Grompone, G ., Seigneur, and Bidnenko, V .

(2001). Rescue of arrested replication forks by homologous recombination . Proc Natl. Acad

Sci U S A 98, 8181-8 .

Mimori, T., Akizuki, M ., Yamagata, H., Inada, S., Yoshida, S., and Homma, M . (1981) .

Characterization of a high molecular weight acidic nuclear protein recognized by

autoantibodies in sera from patients with polymyositis-scleroderma overlap . J Clin Invest 68 ,

611-20 .

Mimori, T., and Hardin, J . A. (1986) . Mechanism of interaction between Ku protein an d

DNA. J Biol Chem 261, 10375-9 .

Miyagawa, K ., Tsuruga, T ., Kinomura, A., Usui, K., Katsura, M., Tashiro, S., Mishima,

H., and Tanaka, K. (2002). A role for RAD54B in homologous recombination in huma n

cells . Embo J 21, 175-80 .

Mizuta, R., LaSalle, J. M., Cheng, H . L., Shinohara, A., Ogawa, H., Copeland, N . ,

Jenkins, N. A., Lalande, M., and Alt, F . W . (1997) . RAB22 and RA13163/mouse BRCA2 :

proteins that specifically interact with the RAD51 protein . Proc Natl. Acad Sci U S A 94 ,

6927-32 .

185

Modesti, M., Hesse, J . E., and Gellert, M . (1999) . DNA binding of Xrcc4 protein i s

associated with V(D)J recombination but not with stimulation of DNA ligase IV activity .

Embo J 18, 2008-18 .

Moore, J . K., and Haber, J . E. (1996) . Cell cycle and genetic requirements of two pathways

of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae .

Mol Cell Biol 16, 2164-73.

Morrison, C ., Shinohara, A ., Sonoda, E., Yamaguchi-Iwai, Y ., Takata, M . ,

Weichselbaum, R. R., and Takeda, S. (1999) . The essential functions of human Rad5l ar e

independent of ATP hydrolysis . Mol Cell Biol 19, 6891-7 .

Morrison, C., Sonoda, E., Takao, N., Shinohara, A ., Yamamoto, K., and Takeda, S .

(2000). The controlling role of ATM in homologous recombinational repair of DNA damage .

Embo J 19, 463-71 .

Mortensen, U . H., Bendixen, C., Sunjevaric, I ., and Rothstein, R . (1996) . DNA strand

annealing is promoted by the yeast Rad52 protein . Proc Nati Acad Sci U S A 93, 10729-34 .

Moshous, D., Callebaut, I ., de Chasseval, R., Corneo, B., Cavazzana-Calvo, M ., Le Deist ,

F., Tezcan, I., Sanal, O., Bertrand, Y., Philippe, N., Fischer, A., and de Villartay, J. P.

(2001) . Artemis, a novel DNA double-strand break repair/V(D)J recombination protein, i s

mutated in human severe combined immune deficiency . Cell 105, 177-86 .

Moynahan, M . E., Chiu, J . W ., Koller, B . H., and Jasin, M . (1999) . Brca l control s

homology-directed DNA repair . Mol Cell 4, 511-8 .

Moynahan, M. E., Pierce, A. J., and Jasin, M . (2001) . BRCA2 is required for homology -

directed repair of chromosomal breaks . Mol Cell 7, 263-72 .

Muller, C., Calsou, P., Frit, P., Cayrol, C ., Carter, T., and Salles, B . (1998). U V

sensitivity and impaired nucleotide excision repair in DNA-dependent protein kinase mutant

cells. Nucleic Acids Res 26, 1382-9 .

Namsaraev, E . A ., and Berg, P . (1998) . Binding of Rad51 p to DNA . Interaction of Rad51 p

with single- and double-stranded DNA . J Biol Chem 273, 6177-82 .

Nelms, B. E., Maser, R. S ., MacKay, J . F., Lagally, M. G., and Petrini, J . H. (1998) . In

situ visualization of DNA double-strand break repair in human fibroblasts . Science 280, 590-

2 .

186

Nick McElhinny, S . A., Snowden, C . M., McCarville, J ., and Ramsden, D. A. (2000) . Ku

recruits the XRCC4-ligase IV complex to DNA ends . Mol Cell Biol 20, 2996-3003 .

Novae, O ., Matheos, D., Araujo, F. D., Price, G. B., and Zannis-Hadjopoulos, M . (2001) .

In vivo association of Ku with mammalian origins of DNA replication . Mol Biol Cell 12 ,

3386-401 .

Nussenzweig, A., Chen, C., da Costa Soares, V., Sanchez, M., Sokol, K., Nussenzweig, M .

C ., and Li, G . C. (1996) . Requirement for Ku80 in growth and immunoglobulin V(D) J

recombination . Nature 382, 551-5 .

Nussenzweig, A ., Sokol, K., Burgman, P., Li, L., and Li, G . C. (1997) . Hypersensitivity of

Ku80-deficient cell lines and mice to DNA damage : the effects of ionizing radiation o n

growth, survival, and development . Proc Natl. Acad Sci U S A 94, 13588-93 .

O'Driscoll, M., Cerosaletti, K. M., Girard, P. M., Dai, Y., Stumm, M., Kysela, B ., Hirsch,

B., Gennery, A., Palmer, S . E., Seidel, J ., Gatti, R. A., Varon, R., Oettinger, M. A. ,

Neitzel, H., Jeggo, P. A., and Concannon, P. (2001) . DNA ligase IV mutations identified i n

patients exhibiting developmental delay and immunodeficiency . Mol Cell 8, 1175-85 .

Ochem, A. E., Skopac, D ., Costa, M ., Rabilloud, T ., Vuillard, L ., Simoncsits, A., Giacca ,

M., and Falaschi, A. (1997) . Functional properties of the separate subunits of human DNA

helicase IIIKu autoantigen. Biol. Chem 272, 29919-26 .

Okorokov, A. L., Warnock, L ., and Milner, J . (2002) . Effect of wild-type, S15D an d

R175H p53 proteins on DNA end joining in vitro : potential mechanism of DNA double -

strand break repair modulation. Carcinogenesis 23, 549-57 .

Orr-Weaver, T. L., and Szostak, J . W. (1983) . Yeast recombination : the association

between double-strand gap repair and crossing-over . Proc Natl. Acad Sci U S A 80, 4417-21 .

Orr-Weaver, T. L., Szostak, J . W., and Rothstein, R . J. (1981) . Yeast transformation : a

model system for the study of recombination . Proc Natl. Acad Sci U S A 78, 6354-8 .

Orren, D. K., Machwe, A., Karmakar, P ., Piotrowski, J ., Cooper, M. P., and Bohr, V . A .

(2001) . A functional interaction of Ku with Werner exonuclease facilitates digestion o f

damaged DNA. Nucleic Acids Res 29, 1926-1934 .

Osipovich, O ., Duhe, R. J., Hasty, P., Durum, S . K., and Muegge, K. (1999) . Defining

functional domains of Ku80 : DNA end binding and survival after radiation . Biochem Biophy s

Res Commun 261, 802-7 .

1.87

Ouyang, H., Nussenzweig, A., Kurimasa, A., Soares, V. C., Li, X., Cordon-Cardo, C ., Li ,

W., Cheong, N ., Nussenzweig, M ., Iliakis, G., Chen, D. J ., and Li, G. C. (1997) . Ku70 i s

required for DNA repair but not for T cell antigen receptor gene recombination In vivo . J Exp

Med 186, 921-9 .

Paillard, S., and Strauss, F . (1991) . Analysis of the mechanism of interaction of simian K u

protein with DNA. Nucleic Acids Res 19, 5619-24 .

Pang, D., Vidic, B ., Rodgers, J ., Berman, B. L., and Dritschilo, A . (1997) . Atomic force

microscope imaging of DNA and DNA repair proteins : applications in radiobiologica l

research. Radiat Oncol Investig 5, 163-9 .

Paques, F., and Haber, J. E. (1999) . Multiple pathways of recombination induced b y

double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63, 349-404 .

Park, M. S . (1995) . Expression of human RAD52 confers resistance to ionizing radiation i n

mammalian cells . J Biol Chem 270, 15467-70 .

Park, M. S., Ludwig, D. L., Stigger, E., and Lee, S . H. (1996) . Physical interaction between

human RAD52 and RPA is required for homologous recombination in mammalian cells .

Biol Chem 271, 18996-9000 .

Patel, K. J., Yu, V. P., Lee, H., Corcoran, A., Thistlethwaite, F . C., Evans, M. J . ,

Colledge, W. H., Friedman, L. S., Ponder, B . A ., and Venkitaraman, A . R. (1998) .

Involvement of Brca2 in DNA repair . Mol Cell 1, 347-57 .

Paull, T . T., and Gellert, M. (1998) . The 3' to 5' exonuclease activity of Mre 11 facilitates

repair of DNA double-strand breaks . Mol Cell 1, 969-79 .

Paull, T . T., and Gellert, M . (2000) . A mechanistic basis for Mre 11-directed DNA joining a t

microhomologies . Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6409-14 .

Paull, T. T., and Gellert, M . (1999) . Nbs 1 potentiates ATP-driven DNA unwinding an d

endonuclease cleavage by the Mrell/Rad5O complex . Genes Dev 13, 1276-88 .

Pergola, F., Zdzienicka, M . Z., and Lieber, M . R. (1993) . V(D)J recombination i n

mammalian cell mutants defective in DNA double-strand break repair . Mol Cell Biol 13 ,

3464-71 .

Peterson, S. R., Dvir, A., Anderson, C . W., and Dynan, W. S . (1992) . DNA bindin g

provides a signal for phosphorylation of the RNA polymerase II heptapeptide repeats . Genes

Dev 6, 426-38 .

188

Peterson, S . R., Jesch, S . A., Chamberlin, T . N., Dvir, A., Rabindran, S . K., Wu, C., and

Dynan, W . S. (1995a). Stimulation of the DNA-dependent protein kinase by RN A

polymerase II transcriptional activator proteins . J Biol Chem 270, 1449-54 .

Peterson, S . R., Kurimasa, A ., 4shimura, M ., Dynan, W. S., Bradbury, E . M., and Chen ,

D. J. (1995b) . Loss of the catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase in DN A

double-strand-break-repair mutant mammalian cells . Proc Nati Acad Sci U S A 92, 3171-4 .

Petukhova, G., Van Komen, S ., Vergano, S ., Klein, H., and Sung, P . (1999) . Yeast Rad5 4

promotes Rad51-dependent homologous DNA pairing via ATP hydrolysis-driven change i n

DNA double helix conformation . J Biol Chem 274, 29453-62 .

Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., and Jasin, M. (2001 a) . Ku DNA end-binding

protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells . Genes Dev

15, 3237-42 .

Pierce, A. J., and Jasin, M. (2001 b) . NHEJ deficiency and disease . Mol Cell 8, 1160-1 .

Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., and Jasin, M. (1999) . XRCC3 promotes

homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells . Genes Dev 13, 2633-8 .

Pittman, D. L., and Schimenti, J. C. (2000) . Midgestation lethality in mice deficient for th e

RecA-related gene, Rad5ld/Rad5113 . Genesis 26, 167-73 .

Poltoratsky, V. P., Shi, X., York, J . D ., Lieber, M. R., and Carter, T . H. (1995) . Human

DNA-activated protein kinase (DNA-PK) is homologous to phosphatidylinositol kinases . J

Immunol 155, 4529-33 .

Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Douki, T., Richard, M. J., and Cadet, J . (1999) .

Measurement of DNA base damage in cells exposed to low doses of gamma-radiation :

comparison between the HPLC-EC and comet assays . Int J Radiat Biol 75, 51-8 .

Powis, G., Bonjouklian, R., Berggren, M. M., Gallegos, A ., Abraham, R., Ashendel, C. ,

Zalkow, L ., Matter, W. F., Dodge, J ., Grindey, G., and et al . (1994) . Wortmannin, a poten t

and selective inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase . Cancer Res 54, 2419-23 .

Raderschall, E ., Golub, E. I., and Haaf, T . (1999). Nuclear foci of mammalia n

recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DN A

damage. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 1921-6 .

189

Ramsden, D. A., and Gellert, M. (1998) . Ku protein stimulates DNA end joining by

mammalian DNA ligases : a direct role for Ku in repair of DNA double-strand breaks . Embo J

17, 609-14 .

Ranganathan, V., Heine, W. F., Ciccone, D. N., Rudolph, K . L., Wu, X., Chang, S., Hai ,

H., Ahearn, I . M., Livingston, D. M., Resnick, I ., Rosen, F., Seemanova, E., Jarolim, P. ,

DePinho, R. A., and Weaver, D. T. (2001) . Rescue of a telomere length defect of Nijmege n

breakage syndrome cells requires NBS and telomerase catalytic subunit . Curr Biol 11, 962-6 .

Reddy, G ., Golub, E . I., and Radding, C. M. (1997) . Human Rad52 protein promote s

single-strand DNA annealing followed by branch migration . Mutat Res 377, 53-9 .

Riballo, E., Critchlow, S. E., Teo, S . H., Doherty, A. J., Priestley, A., Broughton, B . ,

Kysela, B., Beamish, H., Plowman, N ., Arlett, C. F., Lehmann, A. R., Jackson, S. P., and

Jeggo, P. A. (1999) . Identification of a defect in DNA ligase IV in a radiosensitive leukaemi a

patient. Curr Biol 9, 699-702 .

Richardson, C., and Jasin, M . (2000a) . Coupled homologous and nonhomologous repair of

a double-strand break preserves genomic integrity in mammalian cells . Mol Cell Biol 20 ,

9068-75 .

Richardson, C ., and Jasin, M. (2000b) . Frequent chromosomal translocations induced b y

DNA double-strand breaks . Nature 405, 697-700 .

Rijkers, T., Van Den Ouweland, J ., Morolli, B ., Rolink, A. G., Baarends, W. M., Van

Sloun, P. P., Lohman, P. H., and Pastink, A . (1998) . Targeted inactivation of mous e

RAD52 reduces homologous recombination but not resistance to ionizing radiation . Mol Cel l

Biol 18, 6423-9 .

Rossignol, J. L., (1990) . La recombinaison homologue : mécanismes et conséquence s

Médecine I Science 6, 4-9

Rotman, G ., and Shiloh, Y. (1999) . ATM: a mediator of multiple responses to genotoxi c

stress . Oncogene 18, 6135-44 .

Ruiz, M. T., Matheos, D., Price, G. B ., and Zannis-Hadjopoulos, M . (1999) . OBA/Ku86:

DNA binding specificity and involvement in mammalian DNA replication . Mol Biol Cell 10 ,

567-80 .

Saintigny, Y., Delacote, F ., Vares, G., Petitot, F ., Lambert, S ., Averbeck, D., and Lopez ,

B. S. (2001 a) . Characterization of homologous recombination induced by replication

inhibition in mammalian cells . Embo J 20, 3861-70 .

190

Saintigny, Y., Dumay, A., Lambert, S., and Lopez, B . S . (2001b) . A novel role for the Bcl -

2 protein family: specific suppression of the RAD51 recombination pathway . Embo J 20,

2596-607 .

Saintigny, Y., Rouillard, D., Chaput, B ., Soussi, T ., and Lopez, B . S. (1999) . Mutant p53

proteins stimulate spontaneous and radiation-induced intrachromosomal homologou s

recombination independently of the alteration of the transactivation activity and of the G 1

checkpoint . Oncogene 18, 3553-63 .

Samper, E ., Goytisolo, F. A., Slijepcevic, P., van Buul, P. P., and Blasco, M . A. (2000) .

Mammalian Ku86 protein prevents telomeric fusions independently of the length o f

TTAGGG repeats and the G-strand overhang . EMBO Rep 1, 244-52 .

Savitsky, K ., Bar-Shira, A., Gilad, S ., Rotman, G ., Ziv, Y., Vanagaite, L., Tagle, D. A. ,

Smith, S., Uziel, T ., Sfez, S., and et al. (1995) . A single ataxia telangiectasia gene with a

product similar to PI-3 kinase . Science 268, 1749-53 .

Schwacha, A ., and Kleckner, N. (1995) . Identification of double Holliday junctions as

intermediates in meiotic recombination . Cell 83, 783-91 .

Schwacha, A., and Kleckner, N . (1997) . Interhomolog bias during meiotic recombination :

meiotic functions promote a highly differentiated interhomolog-only pathway . Cell 90, 1123 -

35 .

Scully, R., Chen, J ., Plug, A ., Xiao, Y., Weaver, D., Feunteun, J ., Ashley, T., and

Livingston, D . M. (1997). Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells .

Cell 88, 265-75 .

Shangary, S ., Brown, K. D., Adamson, A. W., Edmonson, S ., Ng, B., Pandita, T. K . ,

Yalowich, J ., Taccioli, G. E., and Baskaran, R. (2000) . Regulation of DNA-dependen t

protein kinase activity by ionizing radiation-activated abl kinase is an ATM-dependen t

process. J Biol Chem 275, 30163-8 .

Sharan, S. K., Morimatsu, M ., Albrecht, U ., Lim, D. S., Regel, E., Dinh, C ., Sands, A. ,

Eichele, G., Hasty, P., and Bradley, A . (1997) . Embryonic lethality and radiatio n

hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2 . Nature 386, 804-10 .

Shen, Z., Cloud, K. G., Chen, D. J., and Park, M. S. (1996a) . Specific interactions between

the human RAD51 and RAD52 proteins . J Biol Chem 271,148-52 .

191

Shen, Z ., Pardington-Purtymun, P. E., Comeaux, J . C., Moyzis, R. K., and Chen, D . J .

(1996b) . Associations of UBE2I with RAD52, UBL1, p53, and RAD51 proteins in a yeas t

two-hybrid system . Genomics 37, 183-6 .

Shen, Z., Pardington-Purtymun, P. E., Comeaux, J . C., Moyzis, R. K., and Chen, D. J .

(1996ca) . UBL1, a human ubiquitin-like protein associating with human RAD51/RAD5 2

proteins . Genomics 36, 271-9 .

Shiloh, Y. (1997) . Ataxia-telangiectasia and the Nijmegen breakage syndrome : related

disorders but genes apart . Annu Rev Genet 31, 635-62 .

Shinohara, A ., Gasior, S ., Ogawa, T ., Kleckner, N ., and Bishop, D. K. (1997a) .

Saccharomyces cerevisiae recA homologues RAD51 and DMC1 have both distinct an d

overlapping roles in meiotic recombination . Genes Cells 2, 615-29 .

Shinohara, M., Shita-Yamaguchi, E ., Buerstedde, J . M., Shinagawa, H ., Ogawa, H., and

Shinohara, A. (1997b) . Characterization of the roles of the Saccharomyces cerevisia e

RAD54 gene and a homologue of RAD54, RDH54/TID1, in mitosis and meiosis . Genetics

147, 1545-56 .

Shinohara, A., Shinohara, M., Ohta, T ., Matsuda, S ., and Ogawa, T . (1998) . Rad52 form s

ring structures and co-operates with RPA in single-strand DNA annealing . Genes Cells 3 ,

145-56 .

Shinohara, M., Gasior, S . L., Bishop, D. K., and Shinohara, A. (2000) . Tidl/Rdh54

promotes colocalization of rad51 and dmc 1 during meiotic recombination . Proc Nati Acad Sc i

U S A 97,10814-9 .

Shu, Z., Smith, S., Wang, L., Rice, M. C ., and Kmiec, E . B. (1999) . Disruption of

muREC2/RAD51L1 in mice results in early embryonic lethality which can Be partiall y

rescued in a p53(-/-) background. Mol Cell Biol 19, 8686-93 .

Sibanda, B . L., Critchlow, S . E., Begun, J ., Pei, X. Y., Jackson, S . P., Blundell, T . L., and

Pellegrini, L. (2001) . Crystal structure of an Xrcc4-DNA ligase IV complex . Nat Struct Bio l

8, 1015-9 .

Siede, W., Friedl, A . A., Dianova, I ., Eckardt-Schupp, F ., and Friedberg, E . C . (1996) .

The Saccharomyces cerevisiae Ku autoantigen homologue affects radiosensitivity only in th e

absence of homologous recombination . Genetics 142, 91-102 .

192

Sigurdsson, S ., Van Komen, S ., Bussen, W., Schild, D., Albala, J . S., and Sung, P. (2001) .

Mediator function of the human Rad51B-Rad51C complex in Rad51/RPA-catalyzed DN A

strand exchange . Genes Dev 15, 3308-18 .

Siliciano, J . D., Canman, C. E., Taya, Y., Sakaguchi, K ., Appella, E., and Kastan, M. B.

(1997). DNA damage induces phosphorylation of the amino terminus of p53 . Genes Dev 11 ,

3471-81 .

Singleton, B. K., Torres-Arzayus, M . I ., Rottinghaus, S . T ., Taccioli, G. E., and Jeggo, P .

A. (1999). The C terminus of Ku80 activates the DNA-dependent protein kinase catalytic

subunit . Mol Cell Biol 19, 3267-77 .

Slupianek, A., Schmutte, C., Tombline, G., Nieborowska-Skorska, M., Hoser, G. ,

Nowicki, M. O., Pierce, A. J., Fishel, R ., and Skorski, T . (2001) . BCR/ABL regulate s

mammalian RecA homologs, resulting in drug resistance . Mol Cell 8, 795-806 .

Smider, V., Rathmell, W. K., Lieber, M. R., and Chu, G. (1994) . Restoration of X-ray

resistance and V(D)J recombination in mutant cells by Ku cDNA . Science 266, 288-91 .

Smith, G. C., Divecha, N., Lakin, N. D., and Jackson, S . P . (1999) . DNA-dependen t

protein kinase and related proteins . Biochem Soc Symp 64, 91-104 .

Smith, G . C ., and Jackson, S . P. (1999) . The DNA-dependent protein kinase . Genes Dev 13 ,

916-34 .

Smith, J., Baldeyron, C ., De Oliveira, I., Sala-Trepat, M., and Papadopoulo, D . (2001) .

The influence of DNA double-strand break structure on end-joining in human cells . Nucleic

Acids Res 29, 4783-92 .

Somasundaram, K., Zhang, H., Zeng, Y. X., Houvras, Y., Peng, Y., Wu, G. S., Licht, J .

D., Weber, B. L., and El-Deiry, W. S. (1997) . Arrest of the cell cycle by the tumour -

suppressor BRCA1 requires the CDK-inhibitor p21 WAF 1 /CiP l . Nature 389, 187-90 .

Song, K., Jung, D., Jung, Y., Lee, S . G., and Lee, I. (2000) . Interaction of human Ku7 0

with TRF2. FEBS Lett 481, 81-5 .

Song, Q., Lees-Miller, S . P., Kumar, S., Zhang, Z., Chan, D. W., Smith, G. C., Jackson,

S . P., Alnemri, E . S ., Litwack, G., Khanna, K. K., and Lavin, M. F . (1996) . DNA-

dependent protein kinase catalytic subunit : a target for an ICE-like protease in apoptosis .

Embo J 15, 3238-46 .

193

Sonoda, E., Sasaki, M. S ., Buerstedde, J . M., Bezzubova, O ., Shinohara, A., Ogawa, H . ,

Takata, M., Yamaguchi-Iwai, Y., and Takeda, S. (1998) . RadS l-deficient vertebrate cell s

accumulate chromosomal breaks prior to cell death . Embo J 17, 598-608 .

Sonoda, E., Sasaki, M. S., Morrison, C ., Yamaguchi-Iwai, Y., Takata, M., and Takeda ,

S . (1999) . Sister chromatid exchanges are mediated by homologous recombination i n

vertebrate cells . Mol Cell Biol 19, 5166-9 .

Stewart, G. S., Maser, R. S., Stankovic, T ., Bressan, D. A., Kaplan, M. I., Jaspers, N . G. ,

Raams, A., Byrd, P . J., Petrini, J . H., and Taylor, A. M. (1999) . The DNA double-stran d

break repair gene hMRE11 is mutated in individuals with an ataxia-telangiectasia-lik e

disorder . Cell 99, 577-87 .

Storlazzi, A ., Xu, L ., Cao, L., and Kleckner, N . (1995) . Crossover and noncrossover

recombination during meiosis : timing and pathway relationships . Proc Natl Acad Sci U S A

92, 8512-6 .

Sturzbecher, H. W., Donzelmann, B., Henning, W., Knippschild, U., and Buchhop, S .

(1996) . p53 is linked directly to homologous recombination processes via RAD51/RecA

protein interaction . Embo J 15,1 .992-2002 .

Sugawara, N., Paques, F., Colaiacovo, M., and Haber, J . E. (1997) . Role of

Saccharomyces cerevisiae Msh2 and Msh3 repair proteins in double-strand break-induce d

recombination. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 9214-9 .

Sugiyama, T., New, J. H., and Kowalczykowski, S . C . (1998) . DNA annealing by RAD5 2

protein is stimulated by specific interaction with the complex of replication protein A an d

single-stranded DNA . Proc Natl Acad Sci U S A 95, 6049-54 .

Sung, P. (1997) . Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with

replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase . Genes Dev

11, 1111-21 .

Susse, S., Janz, C ., Janus, F., Deppert, W., and Wiesmuller, L . (2000) . Role of

heteroduplex joints in the functional interactions between human Rad51 and wild-type p53 .

Oncogene 19, 4500-12 .

Szostak, J . W., Orr-Weaver, T . L., Rothstein, R. J., and Stahl, F . W. (1983) . The double-

strand-break repair model for recombination . Cell 33, 25-35 .

Taccioli, G. E., Amatucci, A . G., Beamish, H. J., Gell, D., Xiang, X. H., Torres Arzayus ,

M. I ., Priestley, A ., Jackson, S . P., Marshak Rothstein, A ., Jeggo, P. A., and Herrera, V .

194

L. (1998) . Targeted disruption of the catalytic subunit of the DNA-PK gene in mice confer s

severe combined immunodeficiency and radiosensitivity . Immunity 9, 355-66 .

Taccioli, G. E ., Gottlieb, T. M., Blunt, T., Priestley, A., Demengeot, J ., Mizuta, R . ,

Lehmann, A. R., Alt, F. W., Jackson, S . P., and Jeggo, P . A. (1994) . Ku80 : product of th e

XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination . Science 265, 1442-5 .

Takao, N., Kato, H ., Mori, R., Morrison, C ., Sonada, E ., Sun, X., Shimizu, H., Yoshioka ,

K., Takeda, S ., and Yamamoto, K . (1999) . Disruption of ATM in p53-null cells cause s

multiple functional abnormalities in cellular response to ionizing radiation . Oncogene 18 ,

7002-9 .

Takata, M., Sasaki, M. S., Sonoda, E., Fukushima, T ., Morrison, C., Albala, J . S . ,

Swagemakers, S . M., Kanaar, R., Thompson, L. H., and Takeda, S . (2000) . The Rad5 1

paralog Rad51B promotes homologous recombinational repair . Mol Cell Biol 20, 6476-82 .

Takata, M ., Sasaki, M. S., Sonoda, E ., Morrison, C., Hashimoto, M ., Utsumi, H. ,

Yamaguchi-Iwai, Y ., Shinohara, A., and Takeda, S . (1998) . Homologous recombinatio n

and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair hav e

overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells . Embo J 17 ,

5497-508 .

Takata, M., Sasaki, M. S ., Tachiiri, S., Fukushima, T ., Sonoda, E ., Schild, D . ,

Thompson, L . H., and Takeda, S. (2001) . Chromosome instability and defectiv e

recombinational repair in knockout mutants of the five Rad51 paralogs . Mol Cell Biol 21 ,

2858-66 .

Takeda, S., Masteller, E . L., Thompson, C. B., and Buerstedde, J . M. (1992) . RAG-2

expression is not essential for chicken immunoglobulin gene conversion . Proc Natl Acad Sc i

U S A 89, 4023-7 .

Tan, T. L., Essers, J ., Citterio, E ., Swagemakers, S . M., de Wit, J ., Benson, F . E. ,

Hoeijmakers, J . H., and Kanaar, R. (1999) . Mouse Rad54 affects DNA conformation an d

DNA-damage-induced Rad51 foci formation . Curr Biol 9, 325-8 .

Tanaka, K., Hiramoto, T ., Fukuda, T ., and Miyagawa, K . (2000) . A novel human rad54

homologue, Rad54B, associates with Rad51 . J Biol Chem 275, 26316-21 .

Tang, W., Willers, H., and Powell, S. N. (1999) . p53 directly enhances rejoining of DN A

double-strand breaks with cohesive ends in gamma-irradiated mouse fibroblasts . Cancer Re s

59, 2562-5 .

195

Tashiro, S., Kotomura, N ., Shinohara, A ., Tanaka, K., Ueda, K ., and Kamada, N . (1996) .

S phase specific formation of the human Rad5l protein nuclear foci in lymphocytes .

Oncogene 12, 2165-70 .

Tashiro, S ., Walter, J ., Shinohara, A., Kamada, N., and Cremer, T. (2000) . Rad5 l

accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin . J Cell Biol 150, 283-

91 .

Tauchi, H., Kobayashi, J., Morishima, K., Matsuura, S ., Nakamura, A., Shiraishi, T . ,

Ito, E., Masnada, D., Delia, D., and Komatsu, K. (2001) . The forkhead-associated domai n

of NBS1 is essential for nuclear foci formation after irradiation but not essential fo r

hRAD50[middle dot]hMRE11 [middle dot]NBS 1 complex DNA repair activity. J Biol Chem

276, 12-5 .

Teraoka, H., Yumoto, Y ., Watanabe, F ., Tsukada, K., Suwa, A., Enari, M., and Nagata ,

S . (1996) . CPP32/Yamalapopain cleaves the catalytic component of DNA-dependent protei n

kinase in the holoenzyme . FEBS Lett 393, 1-6 .

Thompson, L . H., and Schild, D. (2001) . Homologous recombinational repair of DNA

ensures mammalian chromosome stability . Mutat Res 477,131-53 .

Tibbetts, R. S., Brumbaugh, K. M., Williams, J . M., Sarkaria, J . N., Cliby, W. A., Shieh ,

S . Y., Taya, Y ., Prives, C ., and Abraham, R. T. (1999) . A role for ATR in the DN A

damage-induced phosphorylation of p53 . Genes Dev 13, 152-7 .

Tibbetts, R. S., Cortez, D., Brumbaugh, K. M., Scully, R., Livingston, D ., Elledge, S . J . ,

and Abraham, R . T. (2000) . Functional interactions between BRCA1 and the checkpoin t

kinase ATR during genotoxic stress . Genes Dev 14, 2989-3002 .

Toth, E. C., Marusic, L ., Ochem, A ., Patthy, A., Pongor, S ., Giacca, M., and Falaschi, A .

(1993) . Interactions of USF and Ku antigen with a human DNA region containing a

replication origin . Nucleic Acids Res 21, 3257-63 .

Tsukamoto, Y., Kato, J., and Ikeda, H . (1997) . Budding yeast Rad50, Mre 11, Xrs2, an d

Hdfl, but not Rad52, are involved in the formation of deletions on a dicentric plasmid . Mol

Gen Genet 255, 543-7 .

Tsuzuki, T ., Fujii, Y., Sakumi, K., Tominaga, Y ., Nakao, K., Sekiguchi, M., Matsushiro,

A., Yoshimura, Y., and MoritaT (1996) . Targeted disruption of the Rad5l gene leads t o

lethality in embryonic mice . Proc Natl Acad Sci U S A 93, 6236-40 .

196

Tucker, J . D., Auletta, A., Cimino, M. C., Dearfield, K. L., Jacobson-Kram, D ., Tice, R .

R., and Carrano, A . V . (1993) . Sister-chromatid exchange : second report of the Gene-To x

Program. Mutat Res 297, 101-80 .

Tuteja, N., Tuteja, R., Ochem, A., Taneja, P ., Huang, N. W., Simoncsits, A., Susic, S . ,

Rahman, K., Marusic, L., Chen, J., and et al. (1994) . Human DNA helicase II : a nove l

DNA unwinding enzyme identified as the Ku autoantigen . Embo J 13, 4991-5001 .

Tutt, A., Bertwistle, D., Valentine, J ., Gabriel, A., Swift, S., Ross, G ., Griffin, C.,

Thacker, J., and Ashworth, A. (2001) . Mutation in Brca2 stimulates error-prone homology -

directed repair of DNA double-strand breaks occurring between repeated sequences . Embo J

20, 4704-16 .

Tzang, B. S., Lai, Y. C., Hsu, M., Chang, H. W., Chang, C. C., Huang, P. C., and Liu, Y.

C. (1999) . Function and sequence analyses of tumor suppressor gene p53 of CHO .K1 cells .

DNA Cell Biol 18, 315-21 .

Van Dyck, E., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., and West, S. C. (1998). Visualisation of

human rad52 protein and its complexes with hRad51 and DNA . J Mol Biol 284, 1027-38 .

Van Dyck, E., Stasiak, A. Z., Stasiak, A ., and West, S. C. (1999) . Binding of double-strand

breaks in DNA by human Rad52 protein . Nature 398, 728-31 .

Vanasse, G. J., Halbrook, J ., Thomas, S ., Burgess, A ., Hoekstra, M . F., Disteche, C. M. ,

and Willerford, D . M. (1999) . Genetic pathway to recurrent chromosome translocations in

murine lymphoma involves V(D)J recombinase . J Clin Invest 103, 1669-75 .

Venkitaraman, A. R. (2001) . Functions of BRCA1 and BRCA2 in the biological response t o

DNA damage. J Cell Sci 114, 3591-8 .

Vispe, S., Cazaux, C., Lesca, C., and Defais, M. (1998) . Overexpression of Rad51 protei n

stimulates homologous recombination and increases resistance of mammalian cells to ionizin g

radiation . Nucleic Acids Res 26, 2859-64 .

Walker, J . R., Corpina, R. A., and Goldberg, J. (2001) . Structure of the Ku heterodime r

bound to DNA and its implications for double-strand break repair . Nature 412, 607-14 .

Wang, H., Zeng, Z. C., Bui, T . A., Sonoda, E ., Takata, M., Takeda, S., and Iliakis, G .

(2001). Efficient rejoining of radiation-induced DNA double-strand breaks in vertebrate cell s

deficient in genes of the RAD52 epistasis group . Oncogene 20, 2212-24 .

197

Wang, J ., Dong, X., Myung, K., Hendrickson, E. A., and Reeves, W. H. (1998a) .

Identification of two domains of the p70 Ku protein mediating dimerization with p80 an d

DNA binding. J Biol Chem 273, 842-8 .

Wang, J ., Dong, X., and Reeves, W. H. (1998b) . A model for Ku heterodimer assembly an d

interaction with DNA . Implications for the function of Ku antigen . J Biol Chem 273, 31068 -

74 .

Wang, S., Guo, M., Ouyang, H., Li, X., Cordon-Cardo, C ., Kurimasa, A., Chen, D. J . ,

Fuks, Z., Ling, C . C., and Li, G . C. (2000) . The catalytic subunit of DNA-dependent protei n

kinase selectively regulates p53-dependent apoptosis but not cell-cycle arrest . Proc Natl Acad

Sci U S A 97, 1584-8 .

Wang, X. W., Zhan, Q., Coursen, J . D., Khan, M. A., Kontny, H. U., Yu, L., Hollander ,

M. C ., O'Connor, P . M., Fornace, A . J., Jr ., and Harris, C . C. (1999) . GADD45 induction

of a G2/M cell cycle checkpoint . Proc Natl Acad Sci U S A 96, 3706-11 .

Wang, Y., Cortez, D., Yazdi, P., Neff, N., Elledge, S. J ., and Qin, J. (2000) . BASC, a supe r

complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberran t

DNA structures . Genes Dev 14, 927-39 .

Wang, Y. Y., Maher, V. M., Liskay, R. M., and McCormick, J . J . (1988) . Carcinogens can

induce homologous recombination between duplicated chromosomal sequences in mouse L

cells . Mol Cell Biol 8, 196-202 .

Ward, J. F. (1990) . The yield of DNA double-strand breaks produced intracellularly b y

ionizing radiation : a review. Int J Radiat Biol 57, 1141-50 .

West, R. B., Yaneva, M., and Lieber, M. R. (1998) . Productive and nonproductiv e

complexes of Ku and DNA-dependent protein kinase at DNA termini . Mol Cell Biol 18 ,

5908-20.

Wiese, C., Pierce, A. J., Gauny, S. S., Jasin, M., and Kronenberg, A. (2002) . Gene

conversion is strongly induced in human cells by double-strand breaks and is modulated by

the expression of BCL-x(L) . Cancer Res 62, 1279-83 .

Wiesmuller, L., Cammenga, J ., and Deppert, W. W. (1996) . In vivo assay of p53 functio n

in homologous recombination between simian virus 40 chromosomes . J Virol 70, 737-44 .

Wilson, T. E ., Grawunder, U ., and Lieber, M. R. (1.997) . Yeast DNA ligase IV mediates

non-homologous DNA end joining . Nature 388, 495-8 .

198

Wong, A. K., Pero, R., Ormonde, P. A., Tavtigian, S . V., and Bartel, P. L. (1997) . RAD5 1

interacts with the evolutionarily conserved BRC motifs in the human breast cance r

susceptibility gene brca2 . J Biol Chem 272, 31941-4 .

Woodard, R. L., Anderson, M. G., and Dynan, W. S. (1999) . Nuclear extracts lackin g

DNA-dependent protein kinase are deficient in multiple round transcription . J Biol Chem 274 ,

478-85 .

Wu, X., and Lieber, M. R. (1996) . Protein-protein and protein-DNA interaction region s

within the DNA end-binding protein Ku70-Ku86 . Mol Cell Biol 16, 5186-93 .

Xia, F., Taghian, D. G., DeFrank, J . S., Zeng, Z. C ., Willers, H., Iliakis, G., and Powell ,

S. N. (2001) . Deficiency of human BRCA2 leads to impaired homologous recombination bu t

maintains normal nonhomologous end joining . Proc Nall Acad Sci U S A 98, 8644-9 .

Xiao, Y., and Weaver, D. T. (1997) . Conditional gene targeted deletion by Cre recombinas e

demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre 1 1 protein in murin e

embryonic stem cells . Nucleic Acids Res 25, 2985-91 .

Xu, X., Wagner, K. U., Larson, D., Weaver, Z ., Li, C ., Ried, T., Hennighausen, L . ,

Wynshaw-Boris, A ., and Deng, C . X. (1999) . Conditional mutation of Brea I in mammary

epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation . Nat Genet 22 ,

37-43 .

Yamaguchi-Iwai, Y ., Sonoda, E ., Sasaki, M. S., Morrison, C., Haraguchi, T., Hiraoka ,

Y ., Yamashita, Y . M., Yagi, T ., Takata, M., Price, C., Kakazu, N., and Takeda, S. (1999) .

Mre 11 is essential for the maintenance of chromosomal DNA in vertebrate cells . Embo J 18 ,

6619-29.

Yamamoto, A., Taki, T., Yagi, H., Habu, T ., Yoshida, K ., Yoshimura, Y ., Yamamoto, K. ,

Matsushiro, A., Nishimune, Y., and Morita, T . (1996) . Cell cycle-dependent expression of

the mouse Rad5l gene in proliferating cells . Mol Gen Genet 251, 1-12.

Yaneva, Kowalewski, T ., and Lieber, M. R. (1997) . Interaction of DNA-dependen t

protein kinase with DNA and with Ku : biochemical and atomic-force microscopy studies .

Embo J 16, 5098-112 .

Yang, Q., Zhang, R., Wang, X. W., Spillare, E . A., Linke, S . P., Subramanian, D .,

Griffith, J . D., Li, J . L., Hickson, I . D ., Shen, J . C., Loeb, L . A., Mazur, S. J ., Appella, E . ,

Brosh, R. M., Jr., Karmakar, P ., Bohr, V. A., and Harris, C. C. (2002) . The Processing of

Holliday Junctions by BLM and WRN Helicases Is Regulated by p53 . J Biol Chem 277 ,

31980-31987 .

199

Yannone, S. M., Roy, S., Chan, D. W., Murphy, M. B., Huang, S., Campisi, J ., and Chen ,

D. J. (2001) . Werner syndrome protein is regulated and phosphorylated by DNA-dependen t

protein kinase . J Biol Chem 276, 38242-8 .

Yazdi, P. T., Wang, Y., Zhao, S ., Patel, N., Lee, E. Y., and Qin, J. (2002) . SMC 1 is a

downstream effector in the ATM/NBS 1 branch of the human S-phase checkpoint . Genes De v

16, 571-82 .

Yu, V. P., Koehler, M ., Steinlein, C ., Schmid, M., Hanakahi, L . A., van Gool, A . J., West,

S. C., and Venkitaraman, A . R. (2000) . Gross chromosomal rearrangements and geneti c

exchange between nonhomologous chromosomes following BRCA2 inactivation . Genes De v

14, 1400-6 .

Yuan, S. S ., Lee, S . Y., Chen, G., Song, M., Tomlinson, G. E., and Lee, E. Y. (1999) .

BRCA2 is required for ionizing radiation-induced assembly of RadS l complex in vivo .

Cancer Res 59, 3547-51 .

Yuan, Z. M., Huang, Y., Fan, M. M., Sawyers, C ., Kharbanda, S ., and Kufe, D . (1996) .

Genotoxic drugs induce interaction of the c-Abl tyrosine kinase and the tumor suppresso r

protein p53 . J Biol Chem 271, 26457-60 .

Yuan, Z. M., Huang, Y., Ishiko, T., Nakada, S ., Utsugisawa, T ., Kharbanda, S., Wang ,

R., Sung, P., Shinohara, A ., Weichselbaum, R ., and Kufe, D . (1998) . Regulation of Rad5 1

function by c-Abl in response to DNA damage . J Biol Chem 273, 3799-802 .

Zaitseva, E . M., Zaitsev, E . N ., and Kowalczykowski, S . C. (1999) . The DNA bindin g

properties of Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein . J Biol Chem 274, 2907-15 .

Zhang, H., Somasundaram, K., Peng, Y., Tian, H., Bi, D., Weber, B. L., and El-Deiry ,

W. S . (1998) . BRCA1 physically associates with p53 and stimulates its transcriptiona l

activity . Oncogene 16,1713-21 .

Zhao, S., Weng, Y . C ., Yuan, S . S ., Lin, Y. T., Hsu, H. C., Lin, S. C., Gerbino, E., Song,

M. H., Zdzienicka, M . Z., Gatti, R. A., Shay, J . W., Ziv, Y., Shiloh, Y., and Lee, E. Y.

(2000) . Functional link between ataxia-telangiectasia and Nijmegen breakage syndrome gen e

products . Nature 405, 473-7 .

Zhong, Q., Chen, C . F., Chen, P. L., and Lee, W . H. (2002) . BRCA 1 Facilitate s

Microhomology-mediated End Joining of DNA Double Strand Breaks . J Biol Chem 277 ,

28641-7 .

200

Zhong, Q., Chen, C. F., Li, S ., Chen, Y., Wang, C. C., Xiao, J., Chen, P. L., Sharp, Z. D. ,

and Lee, W. H. (1999) . Association of BRCA1 with the hRad50-hMre l l -p95 complex an d

the DNA damage response . Science 285, 747-50 .

Zhou, B . B., Chaturvedi, P ., Spring, K., Scott, S. P., Johanson, R. A., Mishra, R . ,

Mattern, M. R., Winkler, J. D., and Khanna, K. K. (2000) . Caffeine abolishes themammalian G(2)/M DNA damage checkpoint by inhibiting ataxia-telangiectasia-mutate d

kinase activity . J Biol Chem 275, 10342-8 .

Zhu, C., Bogue, M. A., Lim, D. S., Hasty, P., and Roth, D . B. (1996) . Ku86-deficient mice

exhibit severe combined immunodeficiency and defective processing of V(D)J recombinatio n

intermediates . Cell 86, 379-89 .

Zhu, J ., Petersen, S., Tessarollo, L ., and Nussenzweig, A . (2001) . Targeted disruption of

the Nijmegen breakage syndrome gene NBS 1 leads to early embryonic lethality in mice . Curr

Biol 11,105-9 .

Zhu, X. D., Kuster, B ., Mann, M ., Petrini, J . H., and Lange, T. (2000) . Cell-cycle-

regulated association of RAD50/MRE11/NBS 1 with TRF2 and human telomeres . Nat Genet

25, 347-52 .

201

ARTICLES

3454—3463 Nucleic Acids Research, 2002, Vol . 30 No. 15

© 2002 Oxford University Pres s

An xrcc4 defect or Wortmannin stimulateshomologous recombination specifically induced bydouble-strand breaks in mammalian cell sFabien Delacôte, Mingguang Han l , Thomas D. Stamato2, Maria Jasin l and

Bernard S . Lopez*

UMR CEA/CNRS 217, CEA, DSV, DRR, 60–68 Avenue du Général Leclerc, F-92265 Fontenay aux Roses Cedex ,

France, 'Sloan-Kettering Institute and Cornell University Graduate School of Medical Sciences, 1275 York Avenue ,New York, NY 10021, USA and 2The Lankenau Medical Research Center, 100 Lancaster Avenue, Wynnewood ,PA 19096, USA

Received March 11, 2002 ; Revised May 10, 2002 ; Accepted June 7, 2002

ABSTRACT

Non-homologous end joining (NHEJ) and homolo-gous recombination (HR) are two alternative/com-petitor pathways for the repair of DNA double-stran dbreaks (DSBs) . To gain further insights into the regu-lation of DSB repair, we detail here the different H Rpathways affected by (i) the inactivation of DNA-P Kactivity, by treatment with Wortmannin, and (ii) amutation in the xrcc4 gene, involved in a late NHEJstep, using the XR-1 cell line . Here we have analyze dnot only the impact of NHEJ inactivation on recombi-nation induced by a single DSB targeted to th erecombination substrate (using I-Scel endonuclease )but also on y-ray- and UV-C-induced and spontan-eous recombination and finally on Rad5l foci forma -tion, i .e. on the assembly of the homologou srecombination complex, at the molecular level . Theresults presented here show that in contrast t oembryonic stem cells, the xrcc4 mutation strongl ystimulates I-Scel-induced HR in adult hamster cells .More precisely, we show here that both single stran dannealing and gene conversion are stimulated . Incontrast, Wortmannin does not affect I-Scel-induce dHR. In addition, y-ray-induced recombination i sstimulated by both xrcc4 mutation and Wortmanni ntreatment in an epistatic-like manner. In contrast,neither spontaneous nor UV-C-induced recombina -tion was affected by xrcc4 mutation, showing tha tthe channeling from NHEJ to HR is specific to DSBs .Finally, we show here that xrcc4 mutation o rWortmannin treatment results in a stimulation ofRad5l foci assembly, thus that a late NHEJ step i sable to affect Rad5l recombination complexassembly . The present data suggest a model accord-ing to which NHEJ and HR do not simply compet efor DSB repair but can act sequentially : a defect in a

late NHEJ step is not a dead end and can make DS Bavailable for subsequent Rad5l recombination com-plex assembly .

INTRODUCTION

Faithful genome transmission requires the cooperation of anetwork of pathways, including the cell cycle checkpoint ,DNA replication, repair and recombination . The differentDNA repair pathways must also be coordinated as a functionof the type of damage, the cell cycle and differentiation . DN Adouble-strand breaks (DSBs) can be generated by physio -logical cell processes such as meiosis and V(D)J recombin-ation . Accidental highly toxic DSBs can also be produced b ygenotoxic stresses such as ionizing radiation and replicatio ninhibition (1—3) . Two major classes of processes can repai rDSBs : non-homologous end joining (NHEJ) and homologou srecombination (HR) . NHEJ involves two protein complexes :(i) the heterodimer Ku80—Ku70 associated with DNA-PKcs i nmammalian cells and (ii) ligase IV with its co-factor Xrcc4 .Ku80—Ku70 binds the DNA ends and recruits the other NHEJcomponents, then, in a second step, Xrcc4/ligaselV reseals th eDNA ends . HR takes advantage of a homologous sequence torepair the DSB and includes non-conservative single-stran dannealing (SSA) and conservative gene conversion associatedor not with crossing-over . The Rad52 protein can be involvedin SSA as well as in gene conversion (4—6), but the twoprocesses are different since SSA is RAD51-independentwhereas gene conversion is RAD51-dependent, in yeast a swell as in mammalian cells (7,8) .

In yeast, HR is prominent in repair of DSBs and radiatio nsensitivity of mutants for the Ku homologs can be revealed i fthe HR pathway is inactivated (9—11) . The NHEJ pathway i soften considered as the main pathway for DSB repair i nmammalian cells . Mouse embryonic stem (ES) cells defectivefor NHEJ show increased HR. induced by a single DS Btargeted to the recombination substrate by the rare-cuttingendonuclease I-Seel . This effect is essentially observed in nullmutants for Ku proteins involved in early NHEJ steps ,whereas an xrcc4 defect, i .e . in a late NHEJ step, show s

*To whom correspondence should be addressed. Tel : +33 1 46 54 88 35 ; Fax : +33 1 46 54 89 55 : Email : [email protected] .fr

Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30 No . 15 3455

very little effect on HR (12) . It has been proposed tha tcompetition for binding to the DNA ends between theKu80—Ku70 heterodimer (involved in NHEJ) and Rad52protein (involved in HR) would allow channeling of DS Brepair to one or the other pathway (6) . However, the effect o fxrcc4 inactivation on the different HR pathways (SSA andgene conversion) and the effects on spontaneous and radi-ation-induced recombination have not been addressed .Moreover, this model should be carefully examined sinc edifferent cell situations can modify the relative implication o fNHEJ and HR in DSB repair. First, the stage of embryoni cmouse development is important since HR is mainly involvedin ES cells whereas NHEJ is prominent in adult mice (13) .Second, cell cycle can affect the choice of the DSB repai rmechanism . In chicken cells NHEJ is prominent in G 1 /early Sphase and HR in late S/G 2 phase (14) . In mammalian cells, th esister chromatid is a preferred substrate for HR (15) . In linewith this, the Rad5 1 and Rad52 proteins, involved i nhomologous recombination, are mainly expressed in lat eS/G2 phase (16—18) . Third, depending on the persistence and /or accumulation of DSBs, cells may sequentially use NHE Jthen HR (3) . In addition, HR and NHEJ can also cooperate i nDSB repair (19), indicating that the two pathways can coexist ,despite cell cycle or developmental regulation .

In order to detail the regulation of DSB repair, we have her estudied the impact of alteration of late NHEJ steps on HR, i .e .in adult differentiated hamster CHO cells . We used two meansof NHEJ inactivation . One is treatment with Wortmannin ,which inhibits phosphatidylinositol-3 (PI-3) kinases, includ-ing DNA-PK, involved in NHEJ (20,21) . Treatment wit hWortmannin increases radiation sensitivity of the cells, bu tdoes not specifically act on DNA-PK and can affect otherpathways . Thus, we also used an xrcc4-deleted cell line (XR-1), which exhibits enhanced radiation sensitivity . Xrcc4protein acts as a co-factor of ligase IV, in a late phase ofNHEJ (22,23) . This strategy also allows easy combination o fboth inactivations (xrcc4 and DNA-PKcs) by treatment of theXR-1 cells with Wortmannin . Importantly, the inactivation ofNHEJ studied here acts on late steps of the process, which ar enot supposed to directly reflect the competition between Kuproteins and Rad52 protein . However, Xrcc4 facilitates th ebinding of Ku to DNA, thus indirectly affecting the compe-tition between NHEJ and HR (24) . We show here that xrcc4mutation results in a strong increase in I-SceI-induced HR i nadult CHO hamster lines, compared to ES cells . We alsoanalyzed the impact of Wortmannin treatment on I-SceI -induced HR. In the present paper, we have more precisel yanalyzed the impact not only on the balance between NHEJand HR but also on the balance between SSA and gen econversion . Indeed, the strategy depicted in Figure 1 allows u sto analyze these two balances . In addition, we have hereanalyzed the impact of xrcc4 inactivation and Wortmanni ntreatment on homologous recombination induced by 1' rays, a nefficient DSB inducer, in comparison with the effect o nspontaneous HR and UV-induced HR, both of which induceDSBs poorly . Finally, since it has been proposed that Kuproteins may impair access of other enzymes, such asnucleases and recombination proteins, to DNA (6,25,26), th epresent paper shows the impact of xrcc4 deletion andWortmannin treatment on intranuclear Rad51 foci assemblyafter ionizing radiation . The present data suggest a model

according to which NHEJ and HR do not simply compete bu tcan sequentially act for DSB repair .

MATERIALS AND METHODS

DNA manipulation s

All DNA manipulations were performed as describe dpreviously (27,28) .

Cell s

Cell lines were cultured at 37°C with 5% CO2 in Dulbecco' smodified Eagle's medium (DMEM) for CHO-DRA 10 cellsand DMEM without sodium pyruvate for XR-1 (xrcc4 mutan tcell line), 4364 (the corresponding wild-type) and comple-mented cell lines (X4C and X4V) . All media were supple-mented with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine and200 IU/ml penicillin .

The X4C and X4V cell lines correspond to XR-1 comple-mented with HsXRCC4 and V5-tagged HsXRCC4 cDNAcloned in pcDNA6 (InVitrogen), respectively .

Measurement of recombination

Survival and recombination frequency after ionizing or UV- Cradiation. Cells were irradiated in phosphate-buffered saline(PBS), using either a 137Cs source (0 .7 Gy/min) or 254 nmUV-C light at the dose indicated . After irradiation, cells wereincubated in their respective medium at 37°C for 24 h . Cell swere then trypsinized, counted and divided into two fractions .The first fraction was used to calculate the viability by cloningefficiency . The second fraction was plated under 1 mg/mlG418 selection to measure recombination frequency .

Recombination after induction of a single DSB by 1-Scel . Atotal of 3 X 105 cells were plated and transfected with 2 stgI-SceI expression vector (pCMV I-Scel) . Between 36 and 40 hpost-transfection, G418 (1 mg/ml) or G418 (1 mg/ml) +hygromycin (500 µg/ml) selection was applied .

PCR recombination assay. The PCR recombination assay swere performed as previously described (29,30) . Cells wereelectroporated with the I-SceI expression vector and grown innon-selective medium for 0, 4 or 48 h after electroporation .Genomic DNA was then isolated and subjected to PCR wit hprimers that flank the I-SceI cleavage site . The 5 ' primer i slocated 410 bp upstream of the cleavage site and the 3 ' primer302 bp downstream. With this set of primers, imprecise NHE Jproducts with small deletions and insertions in the locus areamplified, as are the gene conversion products .

Wortmannin treatment . Cells were preincubated with 20 p MWortmannin 1 h before y-irradiation or I-SceI transfection .Wortmannin treatment was maintained for 24 h (irradiation) o r36—40 h (I-SceI) after treatment.

Spontaneous recombination . Spontaneous recombination wa smeasured by fluctuation analysis as previously describe d(8,31) . For each cell line analyzed, several independen tcultures were plated and cultured to confluence . Cells werethen trypsinized, counted and one fraction was used toestimate plating efficiency . The remaining cells were plated

3456 Nucleic Acids Research, 2002, Vol . 30 No . 1 5

under G418 selection . The resulting number of NeoR clone sallowed us to calculate the recombination frequency . The rateof recombination per cell per generation was calculated usin gthe Luria and Delbrück fluctuation test (32) .

Western blot analysis and Rad5l foci kinetics

All extract preparation steps were performed at 4°C . Afte rwashing with PBS, cells were suspended in lysis buffe r(25 mM Tris, pH 7 .5, 1 mM EDTA, 600 mM NaCl, 0 .5% NP -40, 5 µ,g/ml leupeptin, 2µM pepstatin, 1 mM phenylmethyl-sulfonyl fluoride) and incubated for 45 min on ice . Extract swere centrifuged at 15 000 g for 30 min, the supernatant wa sretrieved and the protein concentration was determined usin gthe Bio-Rad Protein Assay . Boiled protein extract (25—50 µg )was loaded on a 10% polyacrylamide—SDS gel for electro -phoresis . After migration, the proteins were electrotransferre dto nitrocellulose membrane and probed with specific anti -bodies : anti-Rad5l (Oncogene Research) and anti-acti n(Sigma) antibodies . Antibodies were visualized using theECL detection kit (Amersham) . The Rad5l foci were analyze das described (33) using the anti-Rad5l antibody .

DNA-PK `pull-down' assa y

All extract preparation steps were performed at 4°C . Afte rwashing with Tris-buffered saline, 10' cells were suspended i nlysis buffer [50 mM NaF, 20 mM HEPES pH 7 .8, 450 m MNaCl, 0 .2 mM EDTA, 25% v/v glycerol, 0 .5 µM dithiothreitoland protease inhibitors cocktail (Roche)] and then frozen inliquid nitrogen and thawed at 37°C three times . Aftercentrifugation for 15 min at 15 000 g, the supernatant wa sstored at -70°C . An aliquot of 20 .tl of protein extract wa sincubated for 30 min at 4°C with 5 mg of double-strande d(ds)DNA—cellulose (Sigma) in a 100 µl total volume of Z ' 0 .0 5buffer (34) . The extract plus dsDNA—cellulose was washe dthree times with 1 ml of Z ' 0 .05 buffer and resuspended i nZ'0 .05 with 0 .2 mM p53 peptide, 0 .2 tM cold ATP and 0 .5 µC i[y- 32P]ATP (20 tl total volume) . The kinase assay wasperformed for 10 min at 30°C . The reaction was stopped byadding 5 µl of tricine sample buffer and boiling for 4 min . Hal fof the volume (12 .5 µl) was loaded on an 18% tricine gel .After migration, the gel was fixed (10% acetic acid, 40 %methanol) and dried (85°C for 1—2 h) and then analyzed byautoradiography or quantified with a Storm phosphorimage r(Molecular Dynamics) .

RESULTS

Cell lines used

The cell lines used contained the recombination substrat edepicted in Figure lA integrated in their genome . Thi ssubstrate is made of direct repeats of two inactive cassettes o fthe neomycin resistance gene (Neo) separated by thehygromycin resistance gene (Hyg) . Recombination reconsti-tutes a functional Neo gene leading to resistance to G418 (29) .

One recipient is the hamster CHO-DRA10 cell line, alreadydescribed (29) . The other recipients are the X-ray-sensitiv eXR-1, deleted for the xrcc4 gene (35), and the correspondingwild-type 4364 cell lines . The lines carrying the marker areXD17 (XR-1 with the recombination marker) and 4D22 (4364with the recombination marker) .

We also devised two other control cell lines, correspondin gto XD17 complemented with the human HsXRCC4 cDNA(named X4C) or with V5-tagged HsXRCC4 cDNA (cell lin eX4V) . The different cell lines are summarized in Figure 1B .

A defect in xrcc4 or treatment with Wortmanninstimulates radiation sensitivity and radiation-induce dHR by a common pathway

We first measured the radiation sensitivity of the XR-1 (xrcc4deletion) and X4C and X4V cell lines (XR-1 cell linesexpressing HsXRCC4 cDNA) to verify the efficiency o fcomplementation by the XRCC4 cDNA . As expected, th exrcc4-deleted cells showed a higher sensitivity to ionizin gradiation than the control cell lines . Interestingly, expressio nof the XRCC4 cDNA restored radiation resistance in both theX4C and X4V cell lines, indicating that it is functional(Fig . 2A) . Radiation-induced recombination was measured i nparallel . Recombination was induced by y -rays at a higherlevel in the xrcc4-deleted cell line than in the control (Fig . 2B) .At a dose of 6 Gy, recombination was 26-fold higher in th exrcc4-'- cell than in the control lines . Interestingly, expressio nof XRCC4 cDNA lowered the level of radiation-induce drecombination to the level of the control cell line . Remarkably,radiation resistance complementation was slightly les sefficient in the X4C line than in the X4V line, despite thepresence of the V5 tag (Fig . 2A) . This may be due to potentialdifferences in the expression level of the exogenous XRCC 4cDNA. Consistently, radiation-induced recombination wasmore efficiently repressed in the X4V cell line than in the X4 Cline . Taken together, these results show that the stimulation o fradiation-induced recombination in the XD17 line actuall yresults from the xrcc4 defect and that recombination repres-sion is linked to the level of XRCC4 activity for radiatio nresistance . In addition, since the level of Rad5l protein ha sbeen shown to modify the efficiency of radiation-induce drecombination (8), we measured by western blotting theamount of Rad5l protein in the different cell lines (Fig . 2C)and found it to be similar in the different lines, i .e . xrcc 4deletion was not compensated by an increase in the amount o fRad5l protein .

Wortmannin inhibits PI-3 kinases, among them ATM an dDNA-PK . Since DNA-PK and Xrcc4 act in the same pathway,we addressed the question of whether treatment wit hWortmannin can affect radiation-induced recombination, i na similar way to xrcc4 inactivation . As expected, treatment o fthe CHO-DRA10 cell line with Wortmannin increasedradiation toxicity (Fig . 3A) . In parallel, Wortmannin strongl ystimulated radiation-induced recombination (Fig . 3B) . At adose of 5 Gy, recombination was 9-fold higher inWortmannin-treated cells than in untreated cells . At a 10%equivalent cell viability (i .e . 2 .5 Gy for treated cells and 5 G yfor untreated cells), recombination was 4-fold higher i nWortmannin-treated than in untreated cells . These result sshow that recombination actually results from Wortmanni ntreatment rather than selection of a highly recombination -prone cell sub-population resistant to radiation . In addition ,these results show that the recombination stimulation byNHEJ inactivation acts in a second type of CHO cell line .

Wortmannin acts on both ATM and DNA-PK an dinactivation of ATM leads to high level homologou srecombination (36) . Thus Wortmannin may stimulate

A

B

it

1 O

!~4

t :

3

6

Dose (y)

0 4Gy

II 6 Gy

_,_wLtIsOmo

—Liar..

X.D 1

4 .D2 .2

X44C

X4V

1 85r

j3

Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30 No. 15 3457

A

I -Sce l

S2 Neo Hyg 3' Neo

+ I -Sce l

repair event s

NHEJ

H R

BName cell line Genotype4D22 4364 WT

XD17 XR -1 xrcc4 /- derived from 436 4

X4C XR-1 complemented by HsXRCC 4

X4V XR-1 complemented by V5-tagged HsXRCC4

CHO-DRA10 CHOKI WT

Figure 1 . Substrates to measure homologous recombination and cell lines . (A) Cells carry in their genome a single copy of the recombination substrat edepicted in the figure as already described . This substrate contains direct repeats of two inactive copies of the neomycin resistance gene (S2neo and 3 ' neo )separated by the hygromycin resistance gene . The cells are thus sensitive to G418 and resistant to hygromycin (Neon-Hyg R ) . 3 ' neo is not expressed becaus eof the absence of a promoter and of the first amino acids . A promoter drives S2neo but an I-Seel restriction site interrupts the coding sequence . Expression o fthe I-Seel rare-cutting endonuclease cleaves the S2neo cassettes . The cut can be repaired by either NHEJ or HR (29) . NHEJ does not restore a functional Ne ogene and the cells are thus G418-sensitive (Neo n ). HR restores a functional Neo gene and all such HR events are thus G418-resistant (Neo R ). Gene conversio nwithout associated crossing-over keeps the hygromycin sequence and the recombinant cell becomes resistant to both G418 and hygromycin (Neo n-HygR) .When associated with a crossing-over, if the reciprocal product (POC) is eliminated, cells are Neo R -Hygs , but if the POC is re-integrated, cells are Neo R-HygR (8). Thus, single G418 resistance (Neo R ) monitors all HR events and double G418 + hygromycin (Neo R -HygR ) resistance gives an estimation specific t ogene conversion . This substrate also allows measurement of spontaneous and radiation-induced recombination resulting in G418 resistance . (B) The cell lineused .

O)1 ' (x:rcc4-/- )

4022 (wild type)

.... X4C (comWef.i entcd)

X4V (complemented)

50 q

xtD17 4022 Xc~f

X017 4D.22 X4V

Figure 2 . Effects of xrcc4 deletions on (A) radiation sensitivity, (B) radiation-induced recombination and (C) expression of RadS 1 protein . The names an dphenotypes of the cell lines are indicated in the figure . The values correspond to the mean of three independent experiments .

3458 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30 No. 15

B

O uM

20 p MWortmanni n

2, 5Dose (Gy)

5

10

--A- 0 pM Wortmanni n

-f- 20 pM Wortmanni n

2,5

5Dose (Gy)

p 2,5 Gy n 5 Gy

OuM

20uM

Op M

Wortmannin

20 p M

-:- XD1 7 + 0 pM Wortmannin -A- XD17 + 20 pM Wortmannin-•- 4D22 + 0 pM Wortmannin -o- 4D22 + 20 uM Wortmanni n

Figure 3 . Effects of Wortmannin treatment on radiation survival of the CHO-DRA10 cell line (A) and radiation-induced recombination of CHO-DRA10 (B) .

Effects of both Wortmannin treatment and xrcc4 deletion on radiation survival (C) and radiation-induced recombination (D) . The names and phenotypes o f

the cell lines are indicated in the figure . The values correspond to the means of three independent experiments .

Table L Effect of xrcc4 deletion on spontaneous homologous recombination

Cell line Genotype No . of independent No . of cells No . of Neo R Luria and Delbruck tes tcultures (X107 ) clones (rate/locus/generation X 107 )

XD17 xrcc4-'- 14 12.7 560 11 .8 ± 7 .5X4C Complemented 8 9 .8 512 11 .8 ± 6 .0

D 2,5 Gy n 5 G y

recombination by inhibiting either ATM andlor DNA-PK . Inorder to check whether Wortmannin and Xrcc4 act onrecombination via the same pathway, we treated the xrcc4 -deleted cell line with Wortmannin . Treatment of the wild-typ e4D22 line with Wortmannin significantly increased radiatio nsensitivity (Fig . 3C) and radiation-induced recombination, b y2-fold at 2 .5 Gy and 4-fold at 5 Gy (Fig . 3D) . Although theeffect is less pronounced than in CHODRA10 cells, this show sthat Wortmannin also acts in this cell line . Treatment of thexrcc4-1- cell line with Wortmannin increased neither radiatio n

toxicity (Fig . 3C) nor radiation-induced recombination

(Fig . 3D) . These results suggest that Wortmannin and Xrcc 4act on recombination via the same pathway : this pathway mustbe NHEJ inactivation .

A defect in xrcc4 does not stimulate spontaneous andUV-induced recombination

One may ask whether the NHEJ defect stimulates al lhomologous recombination events or whether it is specific t osome genotoxic stresses, as would be predicted by th echallenge for DSB repair between the two pathways . It isthus essential to verify the impact of NHEJ inhibition onrecombination in the absence of strong DSB induction .

We first measured the impact of xrcc4 inactivation o nspontaneous recombination measured by fluctuation analysi s(Table 1) . We compared the xrcc4-deleted XR- I cell line to a nXR-1 line complemented with XRCC4 cDNA, because thi sallows measurement of recombination at the same locus . Th erate of spontaneous recombination is similar in the xrcc4 -defective line and the complemented lines . This result show sthat the defect in xrcc4 requires a genotoxic stress to stimulaterecombination . We then used UV-C, a genotoxic stres sdifferent from y -rays . UV-C induces DSBs poorly but strongl ystimulates recombination in mammalian cells (37,38) . Wethus measured whether xrcc4 alteration affects UV sensitivityand UV-induced recombination . Both UV-C resistance andUV-C-induced recombination were at similar levels in xrcc4 -defective lines and in a complemented line (Fig . 4), showingthat a defect in NHEJ does not stimulate UV-inducedrecombination.

Effect of an xrcc4 defect and of Wortmannin on a singl eDSB targeted to the recombination substrat e

Transfection of an expression vector encoding the rare-cuttin gendonuclease I-Seel produced a DSB targeted to the corres-ponding site in the recombination substrate (see Fig . I A) . DSB


A

B

10 0

120

10 J/m 2 20 J/m20

1 0Dose (J/m2 )

XD1 7 (xrcc4 -/-)

X4V (complemented )

Figure 4 . (A) UV-C sensitivity . (B) UV-C induced recombination . The UV-C doses and names and phenotypes of the different lines are indicated in th e

figure . The values correspond to the means of three independent experiments .

repair can be promoted by NHEJ or HR, comprising gen econversion associated or not with crossing-over and SSA .

Resistance to G418 (Neo R ) monitors all HR DSB repair event s(SSA plus gene conversion) and reflects the balance betwee n

NHEJ and HR . Double resistance to G418 and hygromycin

(NeoR-Hyg R ) monitors only gene conversion (29) . The Neo R-

Hyg R /NeoR ratio gives an estimation of the balance betwee nSSA and gene conversion (see Fig . IA) .

We measured the impact of xrcc4 on these two balances .We first verified that the transfection efficiency was similar i n

the different cell lines (data not shown) . The frequencies o fboth HR (NeoR) and gene conversion (Neo R-HygR ) were,

respectively, 4 .5- and 7-fold higher in the xrcc4 deletion lin ethan in the control and complemented lines (Fig . 5A) .Consequently, the NeoR-HygRiNeo R ratio, corresponding tothe SSA versus gene conversion balance, is not or is onlyslightly (to the limit of significance) increased in xrcc4-/- cells .These results indicate that xrcc4 deletion affects the NHE Jversus HR balance but not, or very moderately, the SSA versu s

gene conversion balance .We also repeated similar experiments in CHO-DRA10 cell s

after treatment with Wortmannin (Fig . 5B) . Whereas treat-ment with Wortmannin enhanced radiation sensitivity an dradiation-induced recombination, it did not modify the NHE Jversus HR balance after cleavage by I-SceI . To check whetherWortmannin was actually efficient, we measured the DNA-PK

activity with an in vitro assay (Fig . 5C) . Wortmanni n

significantly decreased the DNA-PK kinase activity, but

traces of kinase activity were still detectable (Fig . 5C) .In order to verify the effect of the xrcc4 defect on th e

NHEJ versus HR balance and to gain further insigh tinto recombination mechanisms, we used other cell line scontaining a slightly different substrate, SCneo (Fig . 6A) ,and we measured NHEJ and gene conversion at the

molecular level . This new strategy does not monitor

SSA. Since the status of xrcc4 does not substantially

affect the SSA versus gene conversion balance, wecould compare NHEJ and HR without the complication ofSSA using this new substrate . We examined NHEJ ,in conjunction with homologous repair, with the SCne osubstrate using a PCR assay (Fig . 6B; 29) . Resultsfrom one experiment are shown in Figure 6B . The hom-ologous repair products were NcoI-' and the NHEJ productswere I-SceI- and also NcoI- . In the control wild-type cell line ,both homologous and NHEJ products were readily detected .I-SceI cleavage of the amplified product indicated that aportion of the cells had retained the cleavage site, eithe rbecause the genome was never cleaved or because it wa scleaved but then precisely repaired to retain the site . Thexrcc4-1- cell line also showed both homologous and NHE Jrepair products, although there was a shift in the proportion ofthe two products . The homologous repair product wa ssubstantially more prominent than the NHEJ product, incontrast to the wild-type cells in which the two products weremore similar in intensity . There was also a visibly lowe ramount of the I-SceI+ band .

Several such experiments were performed using tw odifferent SCneo-containing cell lines and the bands wer equantified (Fig . 6C and D) . In the parental wild-type cell line sthe relative proportion of the homologous and NHEJ repai rproducts was similar, as has been reported previously (29,30) .In the XR-1 cell lines (xrcc4-1- cell lines) there was an -3-fol dreduction in the NHEJ product and an increase in thehomologous product (Fig . 6C) . There was also a reproducibl edecrease (27%) in the amount of amplified product with anintact I-SceI site (Fig . 6D) . Since the imprecise NHEJ produc tis reduced, the reduction in this I-5'M + band in the mutantsuggests that precise rejoining of a cleaved I-SceI site is alsoreduced .

These results confirm at a molecular level that the defect inxrcc4 results in increased homologous recombination repair o fa single DSB .

3460 Nucleic Acids Research, 2002, Vol . 30 No. 1 5

A

B

C

0

/ G C

NeoR -HIygR/ Neo R

pk4 / , 7 ¢ 6, 6

2 0pM :15,7 . C3

0pl

0 .p M

Wortmannin

% G C

t c 44yg R/ Nrroo

x31 f : 3,4_ ± G,8..~+{{ 3 ' .

2,3 ± J , 9

. ! I 3

XD 17

4D22

X4 V(xrcc4-/1

(wild type) (cornplentet ted )

Neo R

Neo R H Yg R

Gy

5 6y

: Gy45 min

90 minDose

Time post radiatio n

Wort mannin

p53 peptid

Figure 5 . Recombination induced by a single DSB in the recombination substrate produced by I-Seel . Effect of xrcc4 deletion (A) and Wortmannin treatmen t

(B) on single and double recombination resistances . The names and phenotypes of the cell lines are indicated in the figure . The values correspond to th e

means of three independent experiments . (C) In vitro DNA-PK activity in cell extracts treated or not with Wortmannin .

A defect in xrcc4 or treatment with Wortmanni nstimulates radiation-induced Rad5l foc i

It has been suggested that the binding of Ku proteins t oDNA ends impairs the access of other enzymes such a sexonucleases or Rad5 I to form the nucleoprotein filament .We here address the question of whether xrcc4 deletion orWortmannin treatment may also affect intranuclear Rad5 lfoci assembly . Rad5l protein is involved in radiation-induced recombination and in I-SceI-induced gene conver-sion in mammalian cells (8) . In addition, Rad5l protei nhas been shown to relocalize in nuclear foci afte rgenotoxic stress (33) . Since NHEJ alteration stimulate sboth radiation-induced recombination and I-SceI gen econversion, two Rads 1-dependent processes, we measuredwhether the frequency of Rad5l foci formation wa scorrelated with the recombination stimulation observed i n

NHEJ-defective situations . Examples of Rad5l foci inxrcc4-defective cells or in Wortmannin-treated cells are

shown (Fig . 7A and B) . The number of Rad5l foci percell appears higher in NHEJ-inactivated cells (see Fig . 7Aand B). In addition, the frequency of Rad5l foci i ssignificantly higher in xrcc4-defective cell lines thanin control and complemented cell lines (Fig . 7C) .Similarly, treatment with Wortmannin enhanced Rad5 lfoci formation after treatment with ionizing radiation

(Fig . 7D). Thus, in NHEJ-defective situations, Rad5 lfoci formation is correlated with recombination stimula-

tion . This suggests that a functional NHEJ process reduce sthe frequency of Rad5l foci assembly and homologou srecombination and that even late NHEJ steps are involve d

in such regulation .

DISCUSSION

The results presented here show that deletion of the XRCC4gene or inhibition of the PI3 kinases (Wortmannin) results i nan increase in y-ray-induced recombination . Wortmannin hasbeen shown to affect the DNA-PK-dependent NHEJ pathway ,which includes Xrcc4, both for radiation resistance an dfor rejoining of DSBs (39-43) . However, the effect o fWortmanninn on HR has never been addressed . Importantly ,Wortmannin also inhibits ATM . Since ATM inactivationincreases homologous recombination (36), it is thus question -able whether Wortmannin stimulates recombination b yinhibiting DNA-PK and/or ATM . Since Wortmannin treat-ment of the xrcc4-deleted line does not further increas eradiation-induced cell sensitivity and HR, this indicates tha tthe inhibition of a common pathway is responsible for the

recombination stimulation . This pathway must be NHEJ . I n

contrast, xrcc4 deletion does not stimulate spontaneousrecombination and UV-C-induced recombination, showin gthat the stimulatory effect of NHEJ inactivation is specific t oDSBs . On a single DSB targeted to the recombinationsubstrate, it has been shown that deletion of the xrcc4 gen eresults in a low stimulation of HR in ES cells (12), whereas w ehere show a strong HR stimulation in adult hamster cells . I naddition we show here that xrcc4 deletion stimulates th efrequency of HR but has no or very little effect on the geneconversion/SSA ratio . This consistently indicates that, unlikeRad5l (8), Xrcc4 mainly participates in the NHEJ versus HRbalance and not significantly in the SSA versus gen econversion balance . In contrast, although DNA-PK activit ywas substantially decreased, Wortmannin had no stimulatory

Nucleic Acids Research, 2002, Vol . 30 No. 15 3461

S2 Neo

1

-See 2

ufi

"

cloavaae & repair

jr

HR

or f

NH E J

N

0 4 48 4 48

4 48

time 00 pos telectoporatgr

NHFJ

400bafto,

B UrItIT,i t

0 4 48

Wild . ype

0 .7 ---,,

XPX,4-"" - 0 ,

03 —HR

H R

Wild 'typeEJ

HR .

XrCC4-I- Wild type xrcc4 -1 -

D.6 0

S O

4 0

3 0

20

10

0

C

20

Figure 6. Molecular detection of repair events at a single DSB induced by a single I-Scel cut . (A) Strategy of the PCR assay to detect DSB repair (29,30) .(B) PCR products (digested or non-digested) were resolved by agarose gel electrophoresis . The digestion and phenotypes of the cell lines are indicated in th efigure . (C) Quantification of the DSB repair products from several experiments . (D) Fraction of I-Scel site retention indicating the absence of cleavage or th eaccuracy of DSB repair.

effect on HR after I-Scel cleavage . However, DNA-PKactivity was not completely abolished and the residual trace sof activity may have been enough to ensure repair of a singl eDSB. In this context, a fully active DNA-PK would b erequired to repair multiple DSBs produced by ionizin gradiation . Another hypothesis is that DNA-PKcs would notbe required to repair a single DSB and/or that alternativ epathways are active in the absence of this kinase activity .During the reviewing process of the present paper, it has bee nshown that spontaneous recombination and I-Scel-induce drecombination were both increased in DNA-PKcs mutant celllines (44) .

The present results show that a xrcc4 defect stimulates al lDSB-induced HR events, including gene conversion an dradiation-induced recombination, two Rad5l-dependent pro -cesses (8) . The impact of a late NHEJ step such as Xrcc4 o nRad5l foci assembly, i .e . an early homologous recombinatio nstep, has never been addressed . We show here that radiation -induced RadS 1 foci assembly is increased in xrcc4-delete dlines, indicating that the Rad5 1 pathway is stimulated in th eNHEJ-defective cells . However, the Rad5l -independent SS Apathway also appeared to be increased .

When bound to the DNA, Ku proteins can block the acces sof nucleases preparing the DNA for HR and/or blocksRad51 recombination-nucleoprotein filament formation .It has been proposed that Ku proteins (NHEJ) compet ewith Rad52 protein (HR) in binding the DSB and activatetheir respective pathways (Fig . 8) . Ku protein is veryefficient in such competition (12) . Ku acts upstream o fthe other components of NHEJ and the present result sshow that inactivation of a late step of NHEJ (xrcc4deletion) stimulates DSB-induced recombination . Either th eabsence of Xrcc4 protein destabilizes the whole NHEJcomplex or some key components, as described (24), or th eKu heterodimer can bind the DSB but, in a second step, couldbe replaced by the alternative HR, when NHEJ fails . Thismodel implies : (i) that the competition between NHEJ and H Rdoes not simply involve Ku70–Ku80 versus Rad52 but thateven a component of a late NHEJ step can affect the choice o fDSB repair; (ii) that the two pathways can act sequentially .Then, depending on the structure of the recombining mol-ecules (for example, direct repeats) and on the intracellula rlevel of Rad5 1 protein (8), HR can be channeled to SSA o rgene conversion (Fig . 8) .

3462 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30 No . 1 5

A B

'l7 (xrcc4'lt

0 pM Wortrrtannin 20 im Wortmanni n

0oi 6 12 18 2 4

Time post radiation (h )xD1 7 {x1-m4-II

4)22 (wild type).. X4C (complemented )

X4 VV (complemented)

20 pM Wortm :aanir

0 ciM Wort mannin

Figure 7 . Rad5l foci formation induced by radiation . (A and B) Example of Rad5l foci . (C) Effects of xrcc4 deletion on the frequency of radiation-induce d

Rad5l foci at different times (h) after radiation (4 Gy) . The names and phenotypes of the different cell lines are indicated in the figure . (D) Effect of

Wortmannin treatment of CHO-DRA10 cells on radiation-induced Rad5l foci at different times (h) after radiation (5 Gy) .

DSB

y_~—~ Ku. 70! (Ku7o1~..—

~~Ku80) (Ku 8O )

Functional NHEJ

Non functional NHEJ

y

r

VHR

000 Rad 5 1

=A'Figure 8. The sequential double competition model for DSB repair, NHE Jversus HR and SSA versus gene conversion . First, NHEJ and HR competefor DSB via the binding of heterodimer Ku70–Ku80 or Rad52, respectivel y

(6). A defect in the binding of Ku70–Ku80 should favor HR (12) . Our dataindicate that even in the presence of Ku proteins a defect in the late ligatio n

NHEJ step, i .e . a xrcc4 defect, can favor DSB repair via HR, stimulatingboth SSA and gene conversion . Then, depending on the structure of the sub -strates and on the amount of Rad5 I (8), HR can be channeled to SSA o rgene conversion .

DSB is a highly toxic lesion and can generate genom erearrangement . DSB repair thus appears essential for cel lviability, to maintain genome integrity and so to preventneoplastic development . It is therefore important to unrave lhow the alternative DSB repair pathways cooperate and/orcompete to elucidate whether and how they can protect agains t

tumors .

ACKNOWLEDGEMENT S

Thanks are due to Dr J . Delic for the in vitro DNA-PK activit yassay protocol and Dr P . Jeggo for providing the HsXRCC4cDNA. We thank Drs P . Bertrand and D . Marsh for helpfu ldiscussions and critical reading of the manuscript. F .D . i ssupported by a fellowship from ARC . This work wassupported by Electricité de France and ARC (9822) .

REFERENCE S

1. Jeggo,P.A ., Taccioli,G .E . and Jackson,S .P. (1995) Menage a trois :double strand break repair, V(D)J recombination and DNA-PK .Bioessays, 17, 949–957 .

2. Rothstein,R ., Michel,B . and Gangloff,S . (2000) Replication fork pausin gand recombination or `gimme a break' . Genes Dev ., 14, 1–10.

3. Saintigny,Y., Delacote,F ., Vares,G., Petitot,F., Lambert,S ., Averbeck,D.and Lopez,B .S . (2001) Characterization of homologous recombinationinduced by replication inhibition in mammalian cells . EMBO J., 20 ,

3861–3870 .4. Fishman-Lobell,J., Rudin,N . and Haber,J .E . (1992) Two alternative

pathways of double-strand break repair that are kinetically separable and

independently modulated. Mol. Cell. Biol., 12, 1292–1303 .5. Mortensen,U .H ., Bendixen,C ., Sunjevaric,I . and Rothstein,R . (1996)

DNA strand annealing is promoted by the yeast Rad52 protein . Proc .

Nail Acad. Sci. USA, 93, 10729–10734.6. Van Dyck,E ., Stasiak,A .Z ., Stasiak,A. and West,S .C . (1999) Binding o f

double-strand breaks in DNA by human Rad52 protein . Nature, 398,

728–731 .7. Ivanov,E .L ., Sugawara,N ., Fishman-Lobell,J . and Haber,J .E. (1996 )

Genetic requirements for the single-strand annealing pathway of double -strand break repair in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 142 ,

693--704 .8. Lambert,S . and Lopez,B .S . (2000) Characterization of mammalian

RAD51 double strand break repair using non lethal dominant negativ e

forms . EMBO J., 19, 3090--3(99 .

v

GeneConversion


9. Siede,W ., Friedl,A.A ., Dianova,I ., Eckardt-Schupp,F . and Friedberg,E .C .(1996) The Saccharomyces cerevisiae Ku autoantigen homologue affect sradiosensitivity only in the absence of homologous recombination .Genetics, 142, 91-102 .

10. Boulton,S .J. and Jackson,S .P . (1996) Identification of a Saccharomyce s

cerevisiae Ku80 homologue : roles in DNA double strand break rejoinin gand in telomeric maintenance. Nucleic Acids Res., 24, 4639-4648 .

11. Boulton,S .J . and Jackson,S .P. (1996) Saccharomyces cerevisiae Ku70

potentiates illegitimate DNA double-strand break repair and serves as abarrier to error-prone DNA repair pathways . EMBO J ., 15, 5093-5103 .

12. Pierce,A.J ., Hu,P ., Han,M ., Ellis,N . and Jasin,M. (2001) Ku DNA end -binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks i nmammalian cells . Genes Dev., 15, 3237-3242.

13. Essers,J., van Steeg,H., de Wit,J ., Swagemakers,S .M ., Vermeij,M .,Hoeijmakers,J .H . and Kanaar,R. (2000) Homologous and non-homologous recombination differentially affect DNA damage repair i nmice . EMBO J., 19, 1703-1710 .

14. Takata,M ., Sasaki,M .S ., Sonoda,E ., Morrison,C ., Hashimoto,M . ,Utsumi,H ., Yamaguchi-Iwai,Y ., Shinohara,A . and Takeda,S . (1998 )Homologous recombination and non-homologous end-joining pathway sof DNA double-strand break repair have overlapping roles in th emaintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells . EMBO J ., 17 ,

5497-5508 .15. Johnson,R .D . and Jasin,M . (2000) Sister chromatid gene conversion is a

prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells.EMBO J ., 19, 3398-3407 .

16. Flygare,J ., Benson,F . and Hellgren,D. (1996) Expression of the huma nRAD51 gene during the cell cycle in primary human peripheral bloodlymphocytes . Biochirn . Biophys . Acta, 1312, 231-236 .

17. Yamamoto,A., Taki,T., Yagi,H ., Habu,T., Yoshida,K ., Yoshimura,Y. ,Yamamoto,K., Matsushiro,A., Nishimune,Y . and Morita,T . (1996) Cel lcycle-dependent expression of the mouse RadSI gene in proliferatin gcells . Mol . Gen. Genet ., 251, 1-12 .

18. Chen,F ., Nastasi,A ., Shen,Z ., Brenneman,M ., Crissman,H . and Chen,D .J.(1997) Cell cycle-dependent protein expression of mammalian homolog sof yeast DNA double-strand break repair genes Rad51 and Rad52 . Mutai.

Res ., 384, 205-211 .19. Richardson,C. and Jasin,M . (2000) Coupled homologous an d

nonhomologous repair of a double-strand break preserves genomi cintegrity in mammalian cells. Mol . Cell . Biol ., 20, 9068-9075 .

20. Boulton,S ., Kyle,S ., Yalcintepe,L . and Durkacz,B .W . (1996)Wortmannin is a potent inhibitor of DNA double strand break but no tsingle strand break repair in Chinese hamster ovary cells .Carcinogenesis, 17, 2285-2290 .

21. Rosenzweig,K .E ., Youmell,M .B ., Palayoor,S .T . and Price,B .D . (1997 )Radiosensitization of human tumor cells by the phosphatidylinositol3 -kinase inhibitors wortmannin and LY294002 correlates with inhibition o fDNA-dependent protein kinase and prolonged G2-M delay . Clin . Cance r

Res., 3, 1149-1156 .22. Critchlow,S .E ., Bowater,R .P . and Jackson,S .P . (1997) Mammalian DNA

double-strand break repair protein XRCC4 interacts with DNA ligase 1V .

Curr. Biol., 7, 588-598 .23. Grawunder,U ., Zimmer,D ., Kulesza,P . and Lieber,M .R . (1998 )

Requirement for an interaction of XRCC4 with DNA ligase IV for wild -type V(D)J recombination and DNA double-strand break repair in vivo .

J. Biol. Chem ., 273, 24708-24714 .24. Leber,R., Wise,T .W., Mizuta,R . and Meek,K . (1998) The XRCC4 gene

product is a target for and interacts with the DNA-dependent protei n

kinase. J . Biol . Chem., 273, 1794-1801 .25. Liang,F . and Jasin,M . (1996) Ku80-deficient cells exhibit exces s

degradation of extrachromosomal DNA . J. Biol. Chem ., 271 ,

14405-14411 .

26. Smith,G .C . and Jackson,S .P . (1999) The DNA-dependent protein kinase .Genes Dev., 13, 916-934 .

27. Sambrook,J ., Fritsch,E .F . and Maniatis,T. (1989) Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press ,Cold Spring Harbor, NY.

28. Ausubel,F., Brent,R., Kingston,R., Moore,D ., Seidman,J., Smith,J . andStruhl,K. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, Vols 1-4. JohnWiley & Sons, Boston, MA .

29. Liang,F ., Han,M ., Romanienko,P .J . and Jasin,M . (1998) Homology -directed repair is a major double-strand break repair pathway i nmammalian cells. Proc . Natl Acad. Sci . USA, 95, 5172-5177 .

30. Johnson,R.D ., Liu,N . and Jasin,M . (1999) Mammalian XRCC2 promote sthe repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination .Nature, 401, 397-399 .

31. Saintigny,Y ., Rouillard,D ., Chaput,B ., Soussi,T. and Lopez,B .S . (1999)Mutant p53 proteins stimulate spontaneous and radiation-inducedintrachromosomal homologous recombination independently of thealteration of the transactivation activity and of the G1 checkpoint .Oncogene, 18, 3553-3563 .

32. Luria,S .E. and Delbruck,M . (1943) Mutations of bacteria from viru ssensitivity to virus resistance . Genetics, 28, 491-511 .

33. Haaf,T., Golub,E .I ., Reddy,G ., Radding,C .M . and Ward,D .C . (1995 )Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cell safter DNA damage and its localization in synaptonemal complexes . Proc.

Natl Acad. Sci. USA, 92, 2298-2302 .34. Finnie,N.J ., Gottlieb,T .M ., Blunt,T., Jeggo,P.A . and Jackson,S .P . (1995 )

DNA-dependent protein kinase activity is absent in xrs-6 cells :implications for site-specific recombination and DNA double-stran dbreak repair. Proc . Natl Acad. Sci . USA, 92, 320-324 .

35. Bryans,M ., Valenzano,M .C. and Stamato,T.D . (1999) Absence of DNAligase IV protein in XR-1 cells : evidence for stabilization by XRCC4 .

Mutat . Res., 433, 53-58.36. Meyn,M .S . (1993) High spontaneous intrachromosomal recombination

rates in ataxia-telangiectasia . Science, 260, 1327-1330 .37. Wang,Y .Y ., Maher,V,M ., I iskay,R.M. and McCorrnick,J .J. (1988 )

Carcinogens can induce homologous recombination between duplicate dchromosomal sequences in mouse L cells. Mol . Cell . Biol., 8, 196-202.

38. Saintigny,Y ., Dumay,A ., Lambert,S . and Lopez,B .S . (2001) A novel rol efor the Bel-2 protein family : specific suppression of the RADS 1recombination pathway . EMBO J ., 20, 2596-2607 .

39. Baumann,P . and West,S .C . (1998) DNA end-joining catalyzed by huma ncell-free extracts . Proc. Nail Acad. Sci. USA, 95, 14066-14070 .

40. Matsumoto,Y ., Susuki,N ., Namba,N ., Umeda,N ., Ma,X .J ., Morita,A .,Tomita,M ., Enomoto,A ., Serizawa,S ., Hirano,K ., Sakaia,K ., Yasuda,H .and Hosoi,Y . (2000) Cleavage and phosphorylation of XRCC4 protei ninduced by X-irradiation . FEBS Lett ., 478, 67-71 .

4I . Wang,H ., Zeng,Z.C ., Rerrault,A.R ., Cheng,X ., Quin,W . and Iliakis,G.(2001) Genetic evidence for the involvement of DNA ligase IV in th eDNA-PK-dependent pathway of non-homologous end joining i n

mammalian cells . Nucleic Acids Res., 29, 1653-1660 .42. Daniel,R ., Katz,R .A., Merkel,G., Hittle,J .C ., Yen,T .J . and Skalka,A .M .

(2001) Wortmannin potentiates integrase-mediated killing o flymphocytes and reduces the efficiency of stable transduction b yretroviruses . Mol. Cell. Biol., 21, 1164-1172 .

43. Lundberg,R ., Mavinakere,M. and Campbell,C . (2001) Deficient DN Aend joining activity in extracts from Fanconi anemia fibroblasts . J . Biol .Chem., 276, 9543-9549 .

44. Allen,C ., Kurimasa,A ., Brenneman,M .A ., Chen,D .J . and Nickoloff,J .A.(2002) DNA-dependent protein kinase suppresses double-strand break -induced and spontaneous homologous recombination . Proc . Nail Acad.

Sci. USA, 99, 3758-3763 .

ARTICLE IN PRES S

ELSEVIER Cellular Signalling 5598 (2002) xxx—xxx

CELLULAR

SIGNALLING

www.elsevier.com/locatelcellsig

1

2

3

4

5

6

r8

Review articl e

DNA double-strand break repair signalling : the case of

RAD51 post-translational regulation

Fayza Daboussi, Anne Dumay, Fabien Delacôte, Bernard S . LopezUMR CEA/CNRS 217, CEA, Div des Sciences du Vivant, DRR, 60—68 Avenue du Général Leclerc ,

92265, Fontenay-aux-Roses, Cedex, Franc e

Received 6 March 2002 ; accepted 27 May 200 2

9

Abstract

10

DNA double-strand breaks (DSBs) are the major lethal lesion induced by ionizing radiation or by replication block . However, cells can11 take advantage of DSB-induced recombination in order to generate genetic diversity in physiological processes such as meiosis and V(D) J

12 recombination . Two main alternative pathways compete for DSB repair : homologous recombination (HR) and non-homologous end joinin g

13 (NHEJ) . This review will briefly present the mechanisms and the enzymatic complex for HR and NHEJ . The signalling of the DSB through

14 the ATM pathway will be presented . Then, we will focus on the case of the RAD51 protein, which plays a pivotal role in HR and is conserve d

15 from bacteria to humans . Post-translational regulation of RAD51 is presented . Two contrasting situations are discussed : one with up -16 regulation (expression of the oncogene BCRIABL) and one with a down-regulation (expression of the oncogene BCL-2) of RAD51 ,

1.7 associated with apoptosis inhibition and tumour predisposition.

19 © 2002 Elsevier Science Inc . All rights reserved.2 021 kern orris: RAD51 ; BCRIABL ; BCL-2 ; Double-strand break repair ; Homologous recombination ; Non-homologous end-joinin g

25

Faithful genome transmission requires the co-ordinatio n26 of a network of pathways such as cell cycle checkpoint ,

27 DNA replication, DNA repair/recombination and pro -

28 grammed cell death . In response to DNA damage, cells

29 arrest their cell cycle progression, thus providing time fo r30 repair, or activate programmed cell death—both response s

31 preventing transmission of genetic instability. DNA dou-32 ble-strand breaks (DSBs) are the major lethal lesio n33 induced by ionizing radiation and can be efficiently

34 repaired by DNA homologous or non-homologous recom -

35 bination [1-3] . However, cells can take advantage o f

36 DSB-induced recombination in order to generate geneti c

Abbreviations : DSB, double-strand break; NHEJ, non-homologous end -

joining ; HR, homologous recombination ; SSA, single-strand annealing ;

STAT, signal transducer and activation transcription ; SH, src homology ;

ATM, ataxia telangiectasia mutated; NBS, Nijmegen breakage syndrome ;

CHO, Chinese hamster ovary .Corresponding author. Tel .: +33-1-46-54-88-35 ; fax : +33-1-46-54-

91-80 .E-mail address : [email protected] .fr (B .S . Lopez).

diversity in physiological processes such as meiosis [4,5 ]and V(D)J recombination [6] . In these cases, DSBs ar eproduced by endogenous cellular enzymes and the cellthen largely uses the same recombination repair machiner yas that used to repair radiation-induced DSB .

In contrast with microorganisms, in mammalian cells ,most of the genes coding for DSB repair protein are poorl ytranscriptionally inducible by genotoxic stresses . Indeed ,most regulations of DSB repair act at a post-translationallevel . DNA damage signalling appears to be essential tocoordinate DSB repair pathways with the associated path -ways (cell cycle, apoptosis) . The consequences are : phos-phorylation, sub-cellular re-localization, assembly into newcomplexes, degradation .

In the present article, we review the alternative DSB repai rpathways and their regulation through the ATM phosphor-ylation pathway . We then focus on the RAD51 protein thatplays a pivotal role in homologous recombination . Indeed,this protein is a good example of post-translational regulatio nsince it has been found to be phosphorylated and re-localize dafter genotoxic stresses . In addition, RAD51 can bind ubiq-uitin-conjugating enzyme or can be cleaved during apoptosis .Moreover, interactions with other proteins have been

2 2

.P 1 . Introductio n

0898-6568102/5 - see front matter © 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved .

PII : S0898-6568(02)00052-9

ARTICLE IN PRESS2

F. Daboussi et al. / Cellular Signalling 5598 (2002) xxx–xxx

60 described to affect RAD51 activity : (i) BRCA2 allows the61 translocation of RAD51 into the nucleus [7] ; (ii) p53 protein62 has been described to inhibit or to revert the RAD51 DNA63 strand exchange process [8] . In addition, RAD51 protein is64 modified after expression of the oncogenic proteins BCR /65 ABL or BCL-2, leading to cancer predisposition .

66 2. DNA double-strand break repai r

67

Two main alternative/competitor pathways can repair68 DSBs : non-homologous end joining (NHEJ) or homologou s69 recombination (HR) (see Fig . 1) .70

NHEJ ligates the two broken DNA ends and does no t71 require extensive sequence homologies between the tw o72 recombining DNA molecules (Fig . lA) . During the process,73 limited degradation of the DNA ends or DNA capture can74 lead to deletion or insertion of nucleotides or DNA frag -75 ments ; it is thus a potentially error-prone process . NHEJ is76 also involved in V(D)J recombination [6] .'77

HR takes advantage of large sequence homologies to78 repair DSBs. These homologous sequences can be found79 on the sister chromatid after DNA replication, on th e80 homologous chromosome or in DNA repeats . HR refers to81 several processes, the two most documented in mamma-82 lian cells being single-strand annealing (SSA) and gene83 conversion associated or not with crossing over. SSA act s84 between direct repeats and leads to the deletion of th e85 intervening sequence ; it is a non-conservative process [9 ]86 (Fig. IB). Homologous recombination re quires a homol-87 ogous intact sequence and results in gene conversio n

Al NHEJ

associated or not with crossing over [10] (Fig . 1 C) . Gene 8 8conversion is a conservative, generally error-free process, 8 9although it can also generate genetic variability . Gene 90conversion is involved in meiosis and molecular evolu- 9 1tion.

9 2Different cell conditions can modify the choice between 93

NHEJ and HR for DSB repair. First, the stage of embryonic 94mouse development : HR is mainly involved in embryonic 9 5ES cells whereas NHEJ is prominent in adult mice [11] . 96Second, the cell cycle : in chicken DT40 cell lines, NHEJ is 97prominent in G1/early S phase and HR in late S/G2 phase 9 8[12] . In mammalian cells, the sister chromatid present after 99replication is a preferred substrate for HR [13] . In addition, 100RAD5 1 and RAD52 proteins ; which are involved in HR, are 10 1mainly expressed in late S/G2 phase [14-16] . Third, 102depending on the persistence and/or the accumulation of 10 3DSB, NHEJ then HR can act sequentially [171 . Defects in 104NHEJ are compensated by increased DSB-induced HR in 10 5ES cells [18] . However, NHEJ and HR. can also cooperate, 10 6indicating that the two pathways can co-exist, despite cell 10 7

cycle or development regulation [] 9] . All these data indicate 10 8the complex regulation and intricacy of the different path- 10 9ways involved in DSB repair .

110The protein complexes involved in DSD repair are 11 1

summarized in Fig. 2 . Many of the components of these 11 2

complexes are conserved from yeast to human . The 11 3

RAD501MRE11/NBS1 complex could operate in NHEJ 11 4and in HR. Defects in MRE11 or NBS1 (Nijmegen 1.1 5

Breakage Syndrome) respectively result in the AT-like 11 6

and AT variant syndromes [20,211 because of phenotypes 11 7

shared with ataxia telangiectasia (AT) syndrome : radiation 118

Homology Directed Repai r

Ell SS A

0 KU tletero.dirne r

DNA-PKcs

r,

RAD52

xRcc4

'"' RA D5and LIGASE IV

1

Non crossin g over even t

Crossing over even t

for -A

Fig. 1 . DSB repair pathways. Two alternative processes may act : NHEJ (A) or homologous recombination (HR), comprising SSA (B) and homologous

recombination (C). (A) NHEJ rejoins the DNA ends and, on some occasions, can lead to small DNA deletions or insertions . In HR, resection of the DS B

generates single-strand tails. (B) If two complementary strands are generated, the annealing initiates repair by SSA (single-strand annealing) . Between tandemrepeat sequences, this pathway can only act on direct repeats and is non-conservative since it leads to the deletion of the sequences between the repeats . This

pathway is RAD51-independent . (C) Homologous recombination is RAD51-dependent . The single-strand tails invade homologous intact DNA . This reaction

can be performed between sister-chromatids or between repeated homologous sequences . RAD51 controls this strand invasion reaction . The DSB can be seale d

after polymerization and ligation resulting in intermediate cruciform junctions (named Holliday junctions) . The resolution of the Holliday junctions leads to a

crossing-over or to a non-crossing-over event, depending on the type of resolution.

ARTICLE IN PRESSF. Daboussi et al. / Cellular Signalling 5598 (2002) xxx-xxx 3

Fig . 2 . Protein complexes involved in DSB repair : NHEJ and HR. Thecomplex RAD50/MRE11/NBS1 can be involved in both NHEJ and HR.NHEJ : KU binds the DSB and DNA-PKcs is activated . XRCC4 and ligas eN resealed the DNA . Gene conversion : the strand exchange reaction i scatalyzed by RAD51 and is facilitated by RAD52 . RAD54 also activatesRAD51 activity. The types of interactions with the RAD51 paraloguesremain to be fully characterized . Nevertheless, there is a direct interactio nbetween XRCC3 and RAD51 ; RAD51C interacts with XRCC3 and withRAD51B . KU80, KU70, XRCC4, ligase N, RAD50, MRE11, RAD5I (andits paralogues), RAD52, RAD54 have yeast homologues . NBS 1 is afunctional homologue of the yeast XRS2 without presenting structuralhomologies .

119 sensitivity and tumour predisposition [22] . In NHEJ,120 DSBs are recognized by the DNA protein kinas e

121 (DNA-PK) comprising the KU80/KU70 heterodinler and122 the catalytic sub-unit DNA-PKcs . The ligase IV with its123 co-factor XRCC4, then promotes the ligation of the DNA124 ends [23,24] . Mutant cells for each of these genes are125 highly sensitive to radiation . The HR machinery seem s126 far more complex and the different types of. interactions

are still not definitely determined . The pivotal component 12 7could be RAD51 and its paralogues (XRCC2, XRCC3, 12 8RAD51B, RAD51C, RAD51D). RAD51 is homologous 12 9to the bacterial RecA and the yeast RAD51 recombina- 13 0tion proteins [25,26] . In yeast, RAD51 exhibits sequence 13 1homologies with RAD55 and RAD57, thus . defining the 13 2yeast RAD51 paralogues [27,28] . Thus, the mammalian 13 3

RAD51 paralogues could refer to the yeast RAD55 and 13 4

RAD57 . The mammalian HR machinery gains in com- 13 5plexity since the breast cancer suppressor proteins 136BRCA1 and BRCA2 interact with RAD51 and their 13 7

inactivation affects HR-dependent DSB repair [29-34] . 138In addition, p53 interacts with BRCA1, BRCA2 and 139RAD51 [32,35-381 and down-regulates HR in a Gl/S 140checkpoint-independent manner [39-41] . Moreover, the 14 1tyrosine kinase cABL also interacts with RAD51 and 14 2could regulate HR activity [42,43] .

14 3

3 . Signalling of DSBs

14 4

In response to ionizing radiation, the ATM (ataxia 14 5telangiectasia mutated) pathway acts close to the DSB 14 6

(Fig . 3) . efccts in ATM lead tc) high sensitivity to 14 7ionizing radiation, genetic instability and tumour predis- 14 8position [44] . ATM protein shares homologies with phos- 149phatidyl-inositol 3-kinase (PI-3K) and is a member of the 15 0PIKK (PI-3 kinase related kinase) family comprising 15 1

DNA-PKcs, ATR and TRRAP. ATM activation is a very 15 2early response to DSBs and activates cell cycle check- 153point, DNA repair, stress response genes, and apoptosis, 154through transduction cascades to a series of downstream 15 5effector molecules (Fig . 3) . ATM and ATR (AT-related 15 6

[APOPTOSI S

..- . {,^ RAD51

ti BA X;` IRNA PK ':f ''

-

RADSO4

TGt

CDC25A ) . .CDC25C `p53 )-

pal

STRES S RESPONS E

IR ~ }H132AXri' -

CHROMAU'1 N

MODIFICATIO N

Fig . 3 . The ATM pathway in response to ionizing radiation 9R) .

ARTICLE IN PRESS4

F Daboussi et al. / Cellular Signalling 5598 (2002) xxx—xx x

157 proteins) show some overlapping substrate specificitie s158 and ATR over-expression can complement one atm - / -

159 phenotype such as radioresistant DNA synthesis [45] .160 However, in the current model the ATM and ATR act161 in parallel on overlapping pathways but respond t o162 different primary DNA lesions : for example, ionizing163 radiation for ATM, ultraviolet radiation for ATR . Interest-164 ingly for the following part of the present review, ATM165 defective cell lines show increased radiation sensitivit y166 and an elevated level of spontaneous HR [46] . The167 central step of gene conversion (DNA homologous pair -168 ing and strand exchange) is performed by RAD51 protei n169 [47] . We therefore chose to focus on the regulation o f170 RAD51 protein .

171 4 . The case of RAD5 117 2173 4.1 . The mammalian RAD51 protein

174

Mammalian RAD51 protein is a structural, biochem-175 ical and genetic homologue of the bacterial RecA and o f176 the yeast RAD51~

^1~Arecombination proteins . Interestingly,

177 over- cnpre~>ve+~ n ssi o1/~~n of

5 1~t 1, 1, Îl~ ~ alone,- i syns sufficient 4 ntc stimulate,ove r

178 gene conversion in mammalian cells [48-51] . In contrast ,179 expression of dominant negative forms of RAD51 i s180 enough to abolish almost totally gene conversion betwee nI.8 :1 tandem repeat sequences [511 These data suggest tha t182 RAD51 plays a pivotal role in gene conversion regula -183 tion .184

In vitro, RAD51 protein promotes DNA homologous185 pairing and strand exchange, in association with othe r186 proteins of the gene conversion complex [52,53] . In187 cultured mammalian cells, RAD51 is involved in sponta-188 neous gene conversion as well as in HR induced by -y -189 rays [51], alkylating agents [54], UVC [55], replication190 elongation inhibitors [17] . More precisely, RAD51 con-191 trois DSB repair via gene conversion leading to gene192 conversion associated or not with crossing over [51 1193 Finally, RAD51 partly participates in induced sister194 chromatid exchange in mammalian cells [54] . These role s195 of mammalian RAD51 in gene conversion are very196 similar to the roles of yeast RAD51 . However, ther e197 are important differences between yeast and vertebrat e198 RAD51 . Whereas the RSCA and the yeast RAD51 are no t199 essential genes, the vertebrate RAD51 is essential sinc e200 its inactivation leads to embryonic lethality in mouse [56 ]201 and to cell death in the chicken DT40 lymphoma B-cel l202 line [57] . However, expression of the RAD51 dominan t203 negative form strongly inhibits gene conversion withou t204 affecting cell viability [51,54,55] . In contrast with yeast205 RAD51, the mammalian RAD51 gene does not appear t o206 be substantially induced by genotoxic stresses [16,48] .207 Finally, mammalian RAD51 protein has been reported t o208 interact with partners that do not possess yeast structural209 homologues (see Fig . 2 and corresponding text) .

4 .2 . Post-translational regulation of mammalian RAD51 21 @protein

21 2

RAD51 is subject to different post-translational regula- 21 3tions (Fig . 4) . Using a two-hybrid screen, RAD51 has been 21 4

found to interact with UBC9/UBE2I, a protein belonging to 21 5

the family of ubiquitin-conjugating enzymes [58,59] . 21 6

RAD51 has also been found to interact with UBL1 (ubiq- 21 7

uitin-like protein 1) [60] also called PIC1 (PML-interacting 21 8clone 1), GMP 1 (GAP modifying protein 1), SUMO-1 21 9(small ubiquitin-related modifier 1), and sentrin . UBL1 22 0

and UBC9 interact in two-hybrid systems suggesting that 22 1

UBC9 is able to conjugate RAD51 to UBL1 [59] . Over- 22 2

expression of UBL1 down-regulates DSB-induced HR in 223

CHO cells and reduces resistance to ionizing radiation in 224

HT 1080 cells [61] . However, a mutant UBL1 that is 22 5

incapable of being conjugated retains the RAD51 binding 22 6

and the HR repression activities . The author points out that 22 7

the precise role of endogenous levels of UBL1 in regulating 22 8

HR remains unclear [61] .

22 9

During apoptosis response, RAD51 can be degraded by 23 0

caspase 3 [50,62] and the cleavage products fail to exhibit 23 1recombination activity [50] . Moreover, over-expression of a 23 2

mutant. a T1 A T 1LADS

[1 form, whichL.is resistant t oresistant to cleavage by 23 3l~J _

23 3caspase 3, abrogates in part apoptosis induced by ionizing 23 4

radiation [50] .

235

One general response of RAD51 protein to genotoxic 236stresses can be visualized at a cytological level [63] . In 237response to DNA-damaging agents or replication inhib- 23 8itors, RAD51 protein is re-localized in nuclear foci that 23 9

are thought to represent DNA repair foci (for example, 24 0

see Fig. 4). In the absence of stress, RAD51 molecules 24 1

are localized in both the nucleus and the cytoplasm 24 2

[7,64] . However, RAD51 molecules are largely cytoplas- 24 3

mic in BRCA2-defective cells suggesting that they are 24 4

translocated into the nucleus by BRCA2 protein, in 24 5

response to a genotoxic stress [7] . In human SV40 24 6

.

.fi his afterrays(6Gy)

Fig . 4, Post-translational modification of RAD51 protein in mammalia n

cells .

ARTICLE IN PRESSF. Daboussi et al. / Cellular Signalling 5598 (2002) xxx—xxx 5

247 transformed cells, defective for ATM, RAD51 foci for -248 mation is markedly increased, whereas in contras t249 RAD50-MRE11 foci formation is strongly reduced [65] .250 These data agree with high level of HR between direc t251 repeat sequences found in ATM-defective human cell

252 lines [46] . In contrast, in the chicken DT40 B-cell line ,253 the level of RAD51 foci is not increased but the time -254 course is altered in ATM -1- cells [66] .

255

Phosphorylation could be very important for these differ -

256 ent regulations . ATM can indirectly affect the regulation of257 RAD51 either by BRCA1 or by the kinase cABL (see Fig .

258 3) . BRCA1 has been shown to interact with RAD51 protein

259 [29], probably via the interaction with BRCA2 (see Fig . 2) .260 BRCA1 is required for RAD51 nuclear foci formation i n261 mouse embryonic fibroblast [67] but not in the HCC 193 7262 cell line [68] . RAD51 also interacts physically with cAB L263 [42], in a complex containing ATM [43] . However, dis -264 ruption of cABL does not affect the RAD51 foci induced by265 ionizing radiation in the DT40 cell lines [66] .266

The cABL tyrosine kinase is activated by differen t

267 genotoxic treatments, including ionizing radiation . Treat -268 ment with ionizing radiation induces cABL-dependen t

269 phosphorylation of RAD51 [43] . The Tyr-phosphorylation

270 of P 1.D 3of n /~ ~[ I loads to ., . +all_ a.,v,paicnt-~lnrnn± -paradoxnrn ~ n . On oneri one hand,- in

271 vitro cABL-dependent phosphorylation of Tyr54 of

272 HsRAD51 or ScRAD51 inhibits their binding to single -

273 strand DNA. It also inhibits the in vitro strand exchange

274 activity of ScRAD51 [42] . These data suggest that phos-275 phorylation of RAD51 inhibits its recombination activity,

276 and since RAD51 is a limiting factor for gene conversion, it

277 should thus inhibit the whole recombination process . On th e

278 other hand, Tyr315-phosphorylation of RAD51 depends on279 both ATM and cABL and enhances the complex formatio n

280 between RAD51 and RAD52, suggesting that it facilitate s

281 the gene conversion complex assembly and potentially the

282 gene conversion process [43] . Several hypotheses coul d283 reconcile these apparently challenging results . For example,284 one hypothesis could be that depending on the phosphor -285 ylation site of RAD51, HR could be stimulated or inacti -286 vated . Another hypothesis is that the inhibition of the DNA -

287 binding activity would help the turnover of the protein whe n

288 strand exchange is accomplished. Increasing the binding

289 with the partners would help to recycle the whole complex .290 In addition, removing the complex in charge of initiation of291 HR would make room for the proteins in charge of th e292 processing of the intermediates . A third hypothesis take s293 into account the fact that physical and functional interac-

294 tions between DNA-PK and cABL have been reporte d

295 [69,70] . Since DNA-PK and HR represent two alternative ,

296 potentially competing DSB repair pathways, the activatio n

297 of cABL would help the cell to choose and to channel DS B

298 repair, avoiding any conflict between alternative DSB repai r

299 pathways . These hypotheses are speculative and furthe r

300 studies are required . A recent study with the oncogeni c301 fusion protein BCRIABL has addressed these question s302 [64] . Finally, high levels of Tyr-phosphorylated RAD51

are observed in MEF cABL -/-, but not in Tyr315, 30 3suggesting that other kinases can phosphorylate RAD51 at 30 4a site other than Tyr315 [43] .

30 5

5 . RAD51 post-translational modification and cancer 30 6predisposition

30 7

Besides the p53 and BRCA connections, there are other 308situations associating RAD51 regulation and cancer predis- 30 9position. These situations could act at a post-translational 31 0level . Here are two contrasting examples, one with slim- 31 1ulation and the other with decrease in HR .

31 231 3

5.1 . Effect of the BCR/ABL translocation on RAD51

31 4

BCRIABL derives from the translocation of the cABL 31 5gene from chromosome 9 to the BCR gene locus on 31 6

chromosome 22 : Philadelphia chromosome t(9 :22) 317[71,721 This translocation is present in chronic myeloge- 31 8nous leukemia (CML) patients and in many acute lympho- 31 9cytic leukemia patients . The BCRIABL fusion-produced 32 0proteins (p230, p210 or p185) exhibit constitutive tyrosine 32 1

kinas e.nnnc+ activity. T l, n F, : n4n„ n1csisLanccn n o1 t

to

32 2 322Th oDNA damage induced by therapeutic drugs depends on 32 3the kinase activity of the fusion protein . The expression of 32 4BCRIABL has been shown to increase the intracellular level 32 5of RAD51 protein by combined mechanisms [64] . First, 326signalling from the BCRIABL src homology-3 (S1-I3) and 32 7SH2 domains stimulates RAD51 transcription via the acti- 328vation of the signal transducer and activation transcription 5 32 9(STATS) . The transcription of the paralogues RADS1B, 33 0RAD51D and XRCC2 is also stimulated whereas transcrip- 33 1

tion of RADS 1 C and XRCC3 is decreased . Second, BCR/ 332ABL inhibits the caspase 3 activation and thus RAD51 33 3protein degradation . Consequently, BCRIABL stimulates 33 4

HR between tandem repeat sequences . In addition, BCR/ 33 5ABL interacts with RAD51 and results in high levels of 33 6constitutive of mainly Tyr315-phosphorylation . This 33 7

Tyr315-phosphorylation and RAD51-dependent HR seem 33 8to control resistance to cisplatin and mitomycin C [64]. 339BCRIABL expression inhibits DNA-PK activity [73] . This 340suggests that the regulation of the balance between HR and 34 1NHEJ can be modified by BCRIABL .

34 2Beside these effects on RAD51 protein, connected to 34 3

drug resistance, cells expressing BCRIABL also over- 34 4express the error-prone polymerase leading to an 34 5increased mutagenesis [74] . This additional phenotype also 34 6confers predisposition to tumorigenesis .

34 734 8

5 .2 . Effect of .BCL-2 over-expression on RAD51 activity

349

BCL-2 is an oncogene over-expressed in follicular B-cell 35 0

lymphomas resulting from a t(14 :18) translocation [75--77] . 35 1BCL-2, as well as other members of its family such as BCL- 35 2

XL , has anti-apoptotic activity. The oncogenic role of BCL- 353

ARTICLE IN PRESS6

F. Daboussi et al. / Cellular Signalling 5598 (2002) ..u_x—xxx

354 2 is generally attributed to the inhibition of a variety o f

355 apoptotic deaths [78] . A new role of BCL-2 has recently

356 been described in CHO hamster cells and in mouse L-cells :357 the inhibition of the RAD51 recombination pathway withou t

358 affecting the mutagenic SSA pathway [79] . This inhibitio n

359 does not act on spontaneous gene conversion but on HR

360 induced by 'y-rays, UVC or expression of mutant p53 .

361 Moreover, a BCL-2 mutant which does not protect agains t

362 apoptosis, inhibits gene conversion, showing that anti -

363 apoptosis and anti-HR are two separable roles of BCL-2 .

364 Over-expression of BCL-2 modifies neither the amount o f

365 intracellular RAD51 nor its localization . Two-dimensional

366 gel electrophoresis analysis has revealed a modification o f

367 the pattern of the RAD51 protein isoforms, differing by thei r

368 charges, in BCL-2 over-expressing cell extracts . This sug-

369 gests a post-translational regulation although the exac t

370 process remains to be elucidated [79] .

371

BCL-2 has also been shown to affect other DNA repai r

372 systems, also by unknown mechanisms . First, BCL-2 over-373 expression leads to an attenuation of nucleotide excisio n

374 repair (NER), involved in UV damage repair [80] . Second ,

375 BCL-2 stimulates mutagenesis induced by oxidative dam-

376 age, suggesting a defect in base excision repair (BER) [81] .

--3-7-7--

cr .^ n•

•oli.•••vc« s . nion, l~ ~ and BERBER arc,-errorr iwnn .DÎi~T~~Y

repaiArnr~n~~+~TE.LR

ale

fruc

378 systems [82] ; since BCL-2 over-expressing cells are mor e

379 resistant to DNA damage, one hypothesis implies that thes e

380 deficiencies are compensated for by error-prone DNA repai r

381 processes . Indeed, BCL-2 over-expression leads to an382 increase in mutagenesis induced by-rays [79,83] as wel l383 as by UV-C or by expression of mutant p53 p roteins [79] .384 Consequently, BCL-2 over-expression results in a mutator385 phenotype, which is also by itself a cancer-prone phenotype .

386 Remarkably, BCL-2 exercises its mutator phenotype i n387 response to a large variety of genotoxic stresses : UV, ion -

388 izing radiation, oxidative damage .389

One important future objective will be to determine th e

390 molecular mechanisms responsible for the general alteratio n

391 of the error-free DNA repair sy stems leading to mutagenesis .

392 6. Concluding remark s

393

HR must be carefully regulated, and impaired or increased

394 HR has been associated with cancer predisposition . For

395 example, increased spontaneous HR has been described in

396 ATM [46] and in p53-defective cells [39,40,84-86] . Alter-

397 ation of p53 also results in stimulation of -y-ray-induced HR ,

398 but independently of its role in the Gl/S checkpoint [39] .

399 Moreover, cells expressing the oncogenic kinase BCRIAB L400 show increased DSB-induced HR, associated with resistanc e

401 to cisplatin or mitomycin C [64] . Excess HR can lead to402 genome rearrangements . Gene conversion between two het -403 eroalleles may lead to loss of heterozygosity at a poin t404 mutation level [87,88] . In addition, recombination betwee n405 homologous dispersed sequences may lead to profoun d406 genome rearrangements such as inversions, deletions, ampli -

fications, and translocations [89] . Moreover, excess HR may 40 7

lead to resistance to therapeutic drugs .

40 8Defective gene conversion has been described in cells 40 9

affected for BRCA1 or BRCA2 genes [33,34] and in cells 41 0over-expressing the BCL-2 oncogene [79] . Defective HR 41 1

could result in genome instability . Gene conversion is an 41 2acute DNA repair process and mammalian cells defective 41 3for RAD51-dependent recombination show increased muta- 41 4

genesis [55] . Defective HR could also lead to chromosome 41 5breaks and rearrangements, may affect chromosome segre- 41 6

gation and could alter the checkpoints associated with DNA 41 7

repair [57,90] . Importantly, since RAD51 participates in 418genome maintenance and as it interacts with the tumour 41 9protectors p53, BRCA1 and BRCA2, it is thus believed that 42 0

RAD51 may participate in tumour prevention . However, in 42 1the absence of animal models and of mutations clearly 42 2

associated with tumours, direct demonstration of a tumour 42 3protector role for RAD51 has yet to be documented .

42 4

A recent series of findings established a connection 425between apoptosis, HR regulation and tumorigenesis . Reg- 426ulation of RAD51 activity appears to be essential in these 42 7regulation networks. It is questionable whether other kinases 42 8

or signalling processes can affect RAD51 regulation . These 42 9

daehuu+an , s-houid„

general mac

-4 VÛ-

L1r111 ncc -C11 dcrs Landing 111 c

o cchanisms controlling genome stability, their connections with 43 1cell cycle control, apoptosis regulation and more generally 43 2

predisposition to tumour development .

43 3

Acknowledgements

434

We thank Pascale Bertrand and Sarah Lambert for 43 5helpful discussion and criticisms . F. Daboussi is supported 43 6

by a fellowship from INSTN ; A. Dumay by a fellowship 43 7

INSTN/EDF and F. Delacâte by a fellowship from ARC .

43 8

References

43 9

[1] Kanaar R, Hoeijmakers JH, van Gent DC . Trends Cell Biol 1998 ;8 : 440

483-9 . 44 1[2] Karran P. Curr Opin Genet Dev 2000 ;10 :144—50 . 44 2

[3] Khanna KK, Jackson SP. Nat Genet 2001 ;27 :247–54 . 44 3

[4] Roeder GS . Trends Genet 1990;6 :385–9 . 44 4

[5] Kleckner N . Proc Natl. Acad Sci U S A 1996 ;93 :8167–74 . 44 5

[6] Smith GC, Jackson SP. Genes Dev 1999 ;13 :916–34, 44 6

[7] Davies AA, Masson JY, McIlwraith MJ, Stasiak AZ, Stasiak A, Ven- 44 7

kitaraman AR. West SC Mol Cell 2001 ;7 :273–82 . 44 8[8] Susse S, Janz C, Janus F, Deppert W, Wiesmuller L . Oncogene 449

2000 ;19 :4500–12 . 45 0[9] Lin FL, Sperle K, Sternberg N. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 45 1

1984 ;49 :139–49 . 452

[10] Szostak JW, Orr-Weaver TL, Rothstein RJ, Stahl FW. Cell 1983 ; 453

33 :25–35 . 454

[11] Essers J, van Steeg H, de Wit J, Swagemakers SM, Vermeij M, Hoeij- 45 5

makers JH, et al . EMBO J 2000 ;19 :1703–10 . 45 6[12] Takata M, Sasaki MS, Sonoda E, Morrison C, Hashimoto M, Utsurni 45 7

H, et al, EMBO J 1998 ;17 :5497–508 . 45 8

[13] Johnson RD, Jasin M . EMBO J 2000 ;19 :3398–407 . 45 9

[14] Flygare J, Benson F, Hellgren D . Biochim Biophys Acta 1996 ;1312 : 46 0

231–6 . 461

AR ICLE IN PRESSF. Daboussi et al. / Cellular Signalling 5598 (2002) xxx-xxx

7

462 [15] Yamamoto A, Taki T, Yagi H, Habu T, Yoshida K, Yoshin-ura Y, et al . [55] Lambert S, Lopez BS . Oncogene 2000, in press. 52 9

463 Mol Gen Genet 1996 ;251 :1-12 . [56] Tsuzuki T, Fujii Y, Sakurai K, Tominaga Y, Nakao K, Sekiguchi M, 53 0

464 [16] Chen F, Nastasi A, Shen Z, Brenneman M, Crissman P, Chen DJ . et al . Proc Natl Acad Sci U S A 1996 ;93 :6236-40 . 531.

465 Mutat Res 1997 ;384 :205-11 . [57] Sonoda E, Sasaki MS, Buerstedde JM, Bezzubova 0, Shinohara A, 532

466 [17] Saintigny Y, Delacote F, Vares G, Petitot F, Lambert S, I,verbeck D, Ogawa H, et al . EMBO J 1998 ;17 :598-608 . 53 3

467 et al . EMBO J 2001 ;20 :3861-70 . [58] Kovalenko OV, Plug AW, Haaf T, Gonda DK, Ashley T, Ward DC, et 53 4

468 [18] Pierce AJ, Hu P, Han M, Ellis N, Jasin M . Genes Dew 2001 ;15 : al . Proc Natl. Acad Sci U S A 1996 ;93 :2958-63 . 53 5

469 3237-42 . [59] Shen Z, Pardington-Purtymun PE, Comeaux JC, Moyzis RK, Chen 53 6

470 [19] Richardson C, Jasin M . Mol Cell Biol 2000 ;20 :9068-75 DJ . Genomics 1996 ;37 :183-6 . 53 7

471 [20] Carney JP, Maser RS, Olivares H, Davis EM, Le Beau 14, Yates III [60] Shen Z, Pardington-Purtymun PE, Comeaux JC, Moyzis RK, Chen 53 8

472 JR, et al . Cell 1998 ;93 :477-86 . DJ . Genomics 1996;36 :271-9 . 539

473 [21] Stewart GS, Maser RS, Stankovic T, Bressan DA, KaplanMI, Jaspers [61] Li W, Hesabi B, Babbo A, Pacione C, Liu J, Chen DJ, et al . Nucleic 54 0

474 NG, et al . Cell 1999 ;99 :577-87 . Acids Res 2000 ;28 :1145-53 . 54 1

475 [22] Shiloh Y. Annu Rev Genet 1997 ;31 :635-62 . [62] Flygare J, Armstrong RC, Wennborg A, Orsan S, Hellgren D . FEBS 54 2

476 [23] Grawunder U, Zimmer D, Kulesza P, Lieber MR . J Biol Chem Lett 1998 ;427 :247-51 . 54 3

477 1998 ;273 :24708-14 . [63] Haaf T, Golub EI, Reddy G, Radding CM, Ward DC. Proc Natl. Acad 54 4

478 [24] Bryans M, Valenzano MC, Stamato TD . Mutat Res 1999 ;433 :53-8 . Sci U S A 1995 ;92 :2298-302 . 545

479 [25] Morita T, Yoshimura Y, Yamamoto A, Murata K, Mori M .: Yamamoto [64] Slupianek A, Schmutte C, Tombline G, Nieborowska-Skorska M, 546

480 H, et al . Proc Natl Acad Sci U S A 1993 ;90 :6577-80 . Hoser G, Nowicki MO, et al . Mol Cell 2001 ;8 :795-806 . 547

481 [26] Shinohara A, Ogawa H, Matsuda Y, Ushio N, Ikeo K, Ogawa T. Nat [65] Maser RS, Monsen KJ, Nelms BE, Petrini m. Mol Cell Biol 1997 ; 54 8

482 Genet 1993 ;4 :239-43 . 17 :6087-96 . 54 9

483 [27] Lovett ST. Gene 1994 ;142 :103-6 . [66] Takao N, Mori R, Kato H, Shinohara A, Yamamoto K . J Biol Chem 55 0

484 [28] Kans JA, Mortimer RK . Gene 1991 ;105 :139-40. 2000;275 :725-8 . 55 1

485 [29] Scully R, Chen J, Plug A, Xiao Y, Weaver D, Feunteun s, et al . Cell [67] Bhattacharyya A, Ear US, Koller BH, Weichselbaum RR, Bishop DK . 55 2

486 1997 ;88 :265-75 . J Biol Chem 2000 ;275 :23899-903 . 55 3

487 [30] Minuta R, LaSalle JM, Cheng HL, Shinohara A, Ogawa H, Copeland [68] Zhong Q, Chen CF, Li S, Chen Y, Wang CC, Xiao J, et al . Science 55 4

488 N, et al . Proc Natl. Acad Sci U S A 1997 ;94 :6927-32 . 1999 ;285 :747-50 . 55 5

489 [31] Wong AK, Pero R, Ormonde PA, Tavtigian SV, Bartel , PL. J Biol [69] Kharbanda S, Pandey P, Jin S, Inoue S, Bharti A, Yuan ZM, et al . 556

490 Chem 1997 ;272 :31941-4 . Nature 1997 ;386:732-5 . 557

491 [32] Marmorstein LY, Ouchi T, Aaronson SA. Proc Natl Aca(i se' U S A[70] Shangary S, Brown KD, Adamson AW, Edmonson S, Ng B, Pandita 55 8

492 1998 ;95 :13869-74 . TK, et al . J Biol Chem 2000 ;275 :30163-8 . 55 9

493 [33] Moynahan ME, Chiu JW, Koller BIT, Jasin M . Mol Cell 1999 ;4 : [71] Shtivelman E, Lifshitz B, Gale RP, Roe BA, Canaani E . Cell 1986; 56 0

494 511-8 . 47 :277-84 . 56 1

495 [34] Moynahan ME, Pierce AJ, Jasin M . Mol Cell 2001 ;7 :261- 72, 172] Clark SS, McLaughlin J, Timmons M, Pendergast AM, Ben-Neriah Y, 56 2

496 [35] Ouchi T, Monteiro AN, August A, Aaronson SA, IlanafusaH . Prbc Dow LW, et al . Science 1988 ;239:775 -7 . 563

497 Natl Acad Sci U S A 1998 ;95 :2302-6 . [73] Deutsch E, Dugray A, AbdulKarim B, Marangoni E, Maggiorella L, 564

498 [36] Zhang I-I, Somasundaram K, Peng Y, Tian H, Bi D, Weber BL, et al . Vaganay S, et al. Blood 2001 ;97 :2084-90 . 56 5

499 Oncogene 1998 ;16:1713-21 . [74] Canitrot Y, Lautier D, Laurent G, Frechet M, Ahmed A, Turhan AG, 56 6

500 [37] Sturzbecher HW, Donzelmann B, Henning W, Knippschild U, Buch - et al . Oncogene 1999 ;18 :2676-80 . 56 7

501 hop S . EMBO J 1996 ;15 :1992-2002 . [75] Bakhshi A, Jensen JP, Goldman P, Wright JJ, McBride OW, Epstein 56 8

502 [38] Buchhop S, Gibson MK, Wang XW, Wagner P, Sturz5echer HW, AL, et al . Cell 1985 ;41 :899-906 . 56 9

503 Harris CC. Nucleic Acids Res 1997 ;25 :3868-74. [76] Cleary ML, Sklar J . Proc Natl. Acad Sci U S A 1985 ;82 :7439--43 . 57 0

504 [39] Saintigny Y, Rouillard D, Chaput B, Soussi T, Lopez BS . Oncogene [77] Tsujimoto Y, Cossman J, Jaffe E, Croce CM . Science 1985 ;228 : 57 1

505 1999 ;18 :3553-63 . 1440--3 . 572

506 [40] Dudenhoffer C, Kurth M, Janus F, Deppert W, Wiesmuller L . Onco-,

[78] Adams JM, Cory S . Science 1998 ;281 :1322-6 . 573

507 1999 ;18 :5773-84, [79] Saintigny Y, Dumay A, Lambert S, Lopez BS . EMBO J 2001 ;20 : 574

508gen e

[41] Willers H, McCarthy EE, Wu B, Wunsch H, Tang W, 1aghian DG, 2596-607 . 57 5[80] Liu Y, Naumovski L, Hanawalt P. Cancer Res 1997 ;57 :1650-3 . 57 6509

et al . Oncogene 2000;19 :632-9 .

510

[42] Yuan ZM, Huang Y, Ishiko T, Nakada S, Utsugisawa T, Kharbanda S, [81] Kuo ML, Shiah SG, Wang CJ, Chuang SE . Mol Pharmacol 1999 ; 57 7

511

et al . JBiol Chem 1998 ;273 :3799-802 . 55 :894-901 . 57 8

512

[43] Chen G, Yuan SS, Liu W, Xu Y, Trujillo K, Song B, et al .

Biol Chem [82] Friedberg EC, Walker GC, Siede W. Washigton, DC: ASM Press ; 57 9

513

1999 ;274 :12748-52 . 1995 . 58 0

514

[44] Khanna KK, Lavin MF, Jackson SP, Mulhern TD . Cell Death Differ [83] Cherbonnel-Lasserre C, Gauny S, Kronenherg A . Oncogene 1996 ;13 : 58 1

515

2001 ;8 :1052-65 . 1489-97 . 58 2

516

[45] Cliby WA, Roberts CJ, Cimprich KA, Stringer CM ; Lamb JR, [84] Wiesmuller L, Cammenga J, Deppert WW. J Virol 1996 ;70 :737-44 . 583

517

Schreiber SL, et al. EMBO J 1998 ;17 :159-69 . [85] Bertrand P, Rouillard D, Boulet A, Levalois C, Soussi T, Lopez BS . 584

518

[46] Meyn MS . Science 1993 ;260 :1327-30 . Oncogene 1997 ;14 :1117-22 . 58 5

519

[47] Baumann P, Benson FE . West SC Cell 1996 ;87 :757-66, [86] Mekeel KL, Tang W, Kachnic LA, Luo CM, DeFrank JS, Powell SN . 58 6

520

[48] Vispé S, Cazaux C, Lesca C, Defais M . Nucleic Acid$ Res 1998 ; Oncogene 1997 ;14 :1847-57 . 58 7

521

26 :2859--64. [87] Cavenee WK, Dryja TP, Phillips RA, Benedict WF, Godbout R, Gallie 58 8

522

[49] Arnaudeau C, Helleday T, Jenssen D . J Mol Biol 1999;2;89 :1231-8 . BL, et al . Nature 1983 ;305 :779-84. 58 9

523

[50] Huang Y, Nakada S, Ishiko T, Utsugisawa T, Datta R, Kharbanda S, [88] Xia F, Amundson SA, Nickoloff JA, Liber HL . Mol Cell Biol 1994 ; 59 0

524

et al . Mol Cell Biol 1999 ;19 :2986-97 . 14 :5850-7 . 59 1

525

[51] Lambert S, Lopez BS . EMBO J 2000 ;19 :3090-9 . [89] Bollag RJ, Waldman AS, Liskay RM . Annu Rev Genet 1989 ;23 : 59 2

526

[52] Baumann P, West SC . Trends Biochem Sci 1998 ;23 :2471-51 . 199-225 . 59 3

527

[53] Benson FE, Baumann P, West SC . Nature 1998 ;391 :401-4, [90] Griffin CS, Simpson PJ, Wilson CR, Thacker J . Nat Cell Biol 2000; 59 4

528

[54] Lambert S, Lopez BS . Oncogene 2001 ;20 :662731 . 2 :757-61 . 595

The EMBO Journal Vol . 20 No . 14 pp . 3861-3870, 200 1

Characterization of homologous recombinatio ninduced by replication inhibition in mammalian cell s

Yannick Saintign 1 ' 2 , Fabien Delacôte l - 2,Guillaume Varès ! , Fabrice Petitot2,Sarah Lambert- 2, Dietrich Averbeck3 andBernard S .Lopez1,2,4

1 UMR217 CNRS-CEA and 2CEA, Direction des Sciences du Vivant,

Département de Radiobiologie et Radiopathologie, 60–68 avenue d uGénéral Leclerc, 92 265 Fontenay aux Roses cedex, and 3 UMR 2027CNRS-Institut Curie, Section de recherche, Centre Universitaire

Bat. 110, 91 405, Orsay cedex, Franc e

4 Corresponding autho re-mail : [email protected]

To analyze relationships between replication an dhomologous recombination in mammalian cells, w eused replication inhibitors to treat mouse and hamste rcell lines containing tandem repeat recombinationsubstrates. In the first step, few double-strand breaks(DSBs) are produced, recombination is slightl yincreased, but cell lines defective in non-homologou senC!, -jU+ g (lo .~. ~ NHEJ) diLC(~Le(!. in f~llo0 ~

~(xrso or xr. c ~~.l1

r(XR-1) genes show enhanced sensitivity to replicatio ninhibitors . In the second step, replication inhibitio nleads to coordinated kinetics of DSB accumulation ,Rad5l foci formation and RAD51-dependent gene con-version stimulation. In xrs6 as well as XR-1 cell lines ,Rad51 foci accumulate more rapidly compared withtheir respective controls . We propose that replicationinhibition produces DSBs, which are first processedby the NHEJ; then, following DSB accumulation,RAD51 recombination can act.Keywords: double-strand breaks/homologou srecombination/non-homologous recombination!Rad51 freplication inhibition

Introductio n

Faithful genome transmission requires the association o fseveral mechanisms including replication and recombin-ation . Replication forks are routinely arrested by a broa dvariety of stresses (for review see Hyrien, 2000; Rothsteinet al ., 2000) . In bacteria, homologous recombination is anefficient process helping to reactivate a replication forkthat has been blocked (for review see Kuzminov, 1995 ;Cox et al ., 2000) . Replication blocks have also been show nto induce DNA double-stranded breaks (DSBs) in recB Cmutants (Bieme et al., 1997 ; Seigneur et al ., 1998) . Inyeast, DNA polymerase mutants accumulate Hollida yjunctions at the rDNA locus, a molecular intermediate o fhomologous recombination (Zou and Rothstein, 1997) .Moreover, repair of lesions during replication ofteninvolves recombination between sister chromatids (Fabreet al ., 1984; Kadyk and Hartwell, 1992) . Replication forkpausing occurs from bacteria to humans, but very little is

© European Molecular Biology Organization

known of the relationships between replication andrecombination in mammalian cells (Cox et al., 2000 ;Hyrien, 2000; Rothstein et al ., 2000) . This link may be ofcrucial importance for genome stability and has bee ndiscussed in the case of cancer predisposition (Scully et al. ,2000) . However, the mechanisms and molecular charac-teristics of the connection between replication andrecombination have yet to be elucidated in mammaliancells .

In order to study the precise impact of replication arreston recombination, we used replication inhibitors to treatmammalian cell lines carrying intrachromosomal tande mrepeat recombination substrates . We used a set of drug sthat are well characterized and commonly used in cellsynchronization experiments . These drugs specificall yinhibit either the initiation (mimosine, ciclopirox olamine )or the elongation (hydroxyurea, aphidicolin) of replication(Levenson and Hamlin, 1993) . Moreover, these replicatio ninhibitors have been shown to induce DNA single-stran dbreaks and sister clrroaiaiid exchange (SCE) (ishli .: andBender, 1980 ; Fram and Kufe, 1982 ; Caligo et al., 1988) .Different pathways can promote SCE . In the transformedchicken DT40 B-cell line, RAD51 is involved in spontan-eous SCE (Sonoda et al., 1999), whereas in mammaliancells, rnRAD51 and the mouse RAD54 gene do not affectspontaneous SCE and partially control induced SCE(Dronkert et al ., 2000 ; S .Lambert and B .S .Lopez, submit-ted) . This suggests that alternative pathways should exist .For instance, it has been suggested that topoisomerases areinvolved in SCE formation in mammalian cells (Dillehayet al ., 1989) . Thus, the effects of replication inhibition onhomologous recombination and the pathways involve dhave yet to be clearly elucidated in mammalian cells .

In the present work, we measured and characterize dmolecular and genetic recombination events occurring i nresponse to replication inhibition in mammalian cells .

Results

Replication inhibitors stall cell cycle progression inlate G, and in S phase sCells were treated with different drugs known to inhibi treplication reversibly in mammalian cells . Two of the m(mimosine and ciclopirox olamine) inhibit the initiatio nstep of the replicons and two others (aphidicolin andhydroxyurea) inhibit elongation of the replicon s(Levenson and Hamlin, 1993) .

The consequences for the cell cycle after different time sof contact with two different concentrations of aphidicoli nare shown in Figure lA . Similar results were obtained withmouse L-cells as well as with hamster CHO cells (data no tshown) . After 6 h of contact with the drug, the peak o fcells in the G2 phase completely disappeared whilst a G 1 -

like peak and the S plateau were still present . This result

3861

Y .Saintigny et al.

A

c6mtzol Hy0to. *oit

Fig . 1 . Arrest of cell cycle progression by replication inhibitors, measured by flow cytometry analysis . The cell cycle phases are determined by th e

DNA content measured by flow cytometry [5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) incorporation being inhibited by the drug] . (A) Effect of different times of

contact with two different concentrations of aphidicolin . The aphidicolin concentrations are indicated on the left and the different times of contact ar e

indicated at the top of the figure. (B) Cell cycle distribution after 24 h of treatment with the different drugs . Concentrations were : 200 p.M mimosine;

1 mM hydroxyurea; 20 µ.M ciclopirox olamine ; 6

aphidicolin.

shows that cells in the G2 phase proceed through mitosis t oreach the G1 phase, but that cells in the S phase are blocke dand can not reach the G2 phase. This is consistent with theinhibition of replication leading to the arrest of the cellcycle in lat e14LLV G . u the V.Iil.l~ to ~ at the entry t o the S phase, and in theVcycle inS phase .

In the present work we used a set of different replicatio ninhibitors . We checked the cell cycle profiles after 24 h ofcontact with the different drugs (Figure 1B) . The disap-pearance of G2-phase cells was observed with all th edrugs, and is consistent with a block in late G 1 and S phase swith all the replication inhibitors .

Thus, as expected, treatment with the different replica-tion inhibitors blocked the progression in the S phase .Taking into account the DNA content, cells arrested in theS phase should have accumulated stalled replicatio nintermediates . This strategy allowed us to address thequestion of whether the stalling of the replication fork sactually results in DNA breaks and in stimulation ofhomologous recombination in mammalian cells .

Replication inhibitors induce DNA breaksArrest of replication fork progression should lead to th eaccumulation of single-strand nicks resulting from un -sealed Okasaki fragments, or single-strand gaps betweentwo replicons . Additionally, these nicks and single-stran dgaps could also be processed into double-stranded breaks .First, we measured the induction of DNA breaks using th eCOMET assay under alkaline conditions, which allo wdetection of both single- and double-stranded breaks, i naddition to alkali labile sites . The distribution of th eclasses of comet tail moments after treatment with eithe rhydroxyurea or mimosine is shown in Figure 2A . Bothhydroxyurea and mimosine induced DNA breaks, bu thydroxyurea was much more efficient (Figure 2A) . Othe rdrugs such as aphidicolin also led to the accumulation o fbreaks in the DNA (data not shown) .

DSBs induced by hydroxyurea treatment were specif-ically analyzed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)

(Figure 2B) . The smears indicate an accumulation of DSB sas a function of the time of replication block . DSB smearswere slightly detectable after 6 h of blockage and werethen clearly visible for 12, 18 and 24 h of blockage .However, it is possibl eis possible thatthat lowlow. avid undett i _~. ._

et, i ia ile amoulris

of DSB were produced during the 3 h treatment .Nevertheless, this result indicates that increasing th etime of replication block leads to an accumulation of DSB .

Recombination is stimulated by replicatio nelongation inhibitors in replicating S phase cellsWe compared the efficiency of replication initiatio ninhibitors and elongation inhibitors for the stimulation ofrecombination. Recombination was measured in the CHO-DRA10 line (Liang et al ., 1998) using the strategydepicted in Figure 3A. Two different inhibitors of replico ninitiation (mimosine and ciclopirox olamine) moderatel yinduced homologous recombination . In contrast, twodifferent replicon elongation inhibitors (aphidicolin an dhydroxyurea) strongly stimulated homologous recombina -tion (Figure 3B) . In the CHO-DRA10 line, inhibition o freplication elongation stimulates recombination 15- t o25-fold more efficiently than inhibition of replicationinitiation .

The inhibitors used here'are generally considered to b ehighly specific for replication inhibition . Nevertheless, weverified whether they act specifically on replicating cells i nthe S phase . We measured whether they actually act on acommon pathway for stimulation of recombination, bytreating the cells with a combination of two inhibitors . Ifthey act on two different pathways, the combination of tw odrugs should stimulate recombination more efficientl ythan each drug alone . In contrast, if the two drugs act onthe same pathway, the two-drugs combination shoul dstimulate recombination as efficiently as one drug alone, ina kind of `pharmacological epistasis' . Figure 3B show sthat hydroxyurea and aphidicolin in tandem stimulate drecombination as efficiently as hydroxyurea or aphidicoli nalone . Thus, they stimulate recombination by acting on a

3862

Recombination induced by replication inhibitio n

A

Dur t c of' aiment

Fig . 2. DNA breaks induced by replication inhibitors . (A) The COMETassay measures single- and double-strand breaks . The amount o fbreaks is estimated by the tail moment : fraction of the DNA in thetail X distance between the mass center of the head and the mas scenter of the tail. The histograms correspond to the tail moments after24 h of treatment with the replication inhibitors (indicated on the top sof the histograms) . The bars correspond to the number of cells with thevalue of tail moment. The amount of breaks is correlated with the tai lmoment values . The curves (gray squares) indicate the cumulativ epercentage of cells . (B) PFGE detects the DSBs . The different times ofcontact with hydroxyurea are indicated on the top of the gel .

common pathway, i .e . the inhibition of replication elonga -tion . Similarly the ciclopirox olamine/mimosine combin-ation stimulated recombination to the same extent a sciclopirox olamine or mimosine alone . Finally, the com-bination of an initiation inhibitor (mimosine) with on eelongation inhibitor (hydroxyurea or aphidicolin), on non-synchronized cells, stimulated recombination as efficientl yas hydroxyurea or aphidicolin alone, i .e . the most efficientinductor (Figure 3B) . These results show that the drug sstimulate recombination by a pathway common to all ofthem; this pathway must be the inhibition of replication .

If the recombination stimulation is correlated with th eblock of the replication, it should specifically act o nS phase cells . To verify this interpretation, we synchro -

nized the hamster CHO-DRA10 line cells before treatin gthem with hydroxyurea.

Synchronization by double thymidine block is shown inFigure 3C . An asynchronous population contains 30–40 %of cells in the S phase . Synchronization resulted in70–90% of cells in the S phase depending on the time afterthe thymidine block release, i .e . a 2- to 3-fold increase inthe number of S phase cells (Figure 3D) .

Double thymidine block treatment only poorly inducedrecombination compared with treatment with hydroxyure a(Figure 3D) . Hydroxyurea was then added at differenttimes after the release of the thymidine block an dmaintained for 24 h . Hydroxyurea induced recombinatio n2–3 times more efficiently in cells synchronized in th eS phase compared with non-synchronized cells . Thisfactor corresponds to the increase in the frequency of cellsin the S phase in a synchronized population (compar eFigure 3C and D) . Remarkably, the extent of recombina-tion stimulation was linearly correlated with the percent -age of cells in the S phase, i .e. the time between the blockrelease and the hydroxyurea treatment (Figure 3E) . Thes eresults suggest that the homologous recombination wasmore efficient during the progression in the S phase .

Taken together, the results show that the drugs stimulatehomologous recombination via the inhibition of replica -tion (mainly elongation) in mammalian cells .

Stimulation of homologous recombination byaphidicolin as a function of the time of blockageWe then analyzed the recombination stimulation a tdifferent times of contact with aphidicolin, i .e . differenttimes of replication inhibition . We first measured recom-bination induced by replication inhibitors (RIRI) in mous eL-cells (i) to verify the phenomenon in another cell lin etype and (ii) because a couple of mouse L-cells provide dthe opportunity to measure the RIRI with direct or inverte drepeat recombination substrates (Figure 4A) . Direc trepeats and inverted repeats do not monitor exactly th esame recombination pathways (for review see Klein ,1995) : direct repeats monitor gene conversion as well a ssingle-strand annealing (SSA) events . Inverted repeats cannot measure SSA but mainly monitor gene conversion plu snon-SSA alternative pathways . As observed for the cel lcycle arrest, the two different concentrations of aphidico-lin stimulate recombination in a similar range (Figure 4Band C) . Aphidicolin stimulated recombination as a func-tion of the duration of the treatment, i .e . of replicationinhibition . But two phases of stimulation were observable :the recombination increase was linear but modest fo rtimes of contact between 6 and 18 h, even though(i) fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysi sindicated a replication block for these times of treatmen tand (ii) PFGE showed the appearance of DSB at 6 h .Recombination was then strongly stimulated for times o fcontact with aphidicolin comprised between 18 and 24 h(Figure 4B) . Similar results were obtained with direc trepeats (Figure 4B) and with inverted repeat recombina -tion substrates (Figure 4C) . Interestingly, the kinetic of therecombination process per se was correlated with thekinetics of DSB accumulation (compare Figures 2B and4) . Moreover, comparison of these two kinetics highlight sthe fact that a huge amount of DSBs is required t ostimulate homologous recombination efficiently . This may

Tl:morrer~t

3863

Y .Saintigny et al.

D À1 (dira repea, )

ti c-

$S' AC 1rt7 ~~f }

Syhr:D

Synch ::,? - ~tÿnhWhj

Syrhro E ::~t~',

1 ,

14Qa

fOO :Indu,ccd Ret ',Want "p er 1

t'I tells

ynchra f ;+.4,1Nt ,

nz, ~éti,m3ph s :°

Fig. 3 . Induction of recombination by elongation inhibitors in S phase . (A) The cell line used is hamster CHO-DRA10 containing the recombinatio n

substrate drawn and described elsewhere (Liang et al ., 1998). This substrate contains a direct repeat of two inactive neomycin-resistant (NEO) genes ;

parental cells are sensitive to G418 . Recombination restores a functional NEO gene ; recombinants are resistant to G418 . The frequency of spontaneousrecombination is 6 X 10-7 . (B) Induced recombinant corresponds to the number of G418-resistant clones for 10 7 viable treated cells subtracted fromthe number of G418-resistant clones in 107 non-treated viable cells . Cells were treated for 24 h with the drugs or the combinations indicated below th e

bars . Concentrations were : 200 µM mimosine ; 1 mM hydroxyurea; 20 µM ciclopirox olamine; 0 .6 µM aphidicolin . (C) Synchronization (indicated as

`synchro' in the figure) by double thymidine block . The DNA content is measured by FACS at different times after the release of the second

thymidine block. H+Oh: 0 h after the thymidine block release; H+lh: 1 h after the thymidine block release ; H+2h : 2 h after the thymidine block

release ; H+3h : 3 h after the thymidine block release . The percentage of cells in the S phase is indicated on the histogram . (D) Induced recombinan t

under the different conditions . Synchro : synchronization by double thymidine block ; HU: treatment with hydroxyurea for 24 h. H+ 0, 1, 2 or 3 hindicates the moment of hydroxyurea addition after the thymidine block release . (E) HU-induced recombinant as a function of the percentage of cell s

in the S phase at the beginning of the HU treatment . These values correspond to the progression in S phase (see Figure 3C) .

reflect the probability of introducing one DSB in the

with the hamster CHO-DRAW line treated with hydro -recombination substrate . Similar kinetics were observed

xyurea (see below, Figure 5C) .

3864


4.

Fig . 4. Treatment with aphidicolin induces recombination as a function of the time of contact with the drug. (A) The cell lines derive from mous e

L-cells . The recombination substrates are depicted on the figure and have been described elsewhere (Liskay et af, 1984) . The cell line pJS3-10contains direct repeat recombination substrates (on the left) . The cell line pJS4-7-1 contains inverted repeat recombination substrates (on the right) .(B) Induction of recombination between direct repeats (pJS3-10, on the left) or between inverted repeats (pJS4-7-1, on the right) . The duration o ftreatment and the aphidicolin concentrations are indicated in the figure . (C) Example of Southern blotting of recombinant clones (probed with a T K

sequence) . On the left panel is the restriction map of the direct repeats substrate . After triple digestion (Hindlll, BamHI, XhoI), a deletion event will

produce a 6 kb (Hindlll–BamHI) fragment. Gene conversion will produce either 5, 1 .8 and 1 kb bands or 6, 1 .3 and 0.5 kb bands ; however, the 0 .5 kbbands are usually hard to detect in these kinds of gels (Liskay et al ., 1984) . On the right is one example of Southern blotting for gene conversionevents. The numbers on the top correspond to different clones double-resistant HAT R(Tk+)/G418 R(Neo) ; nr: non-recombinant parental line (pJS3-10) .The sizes of the restriction fragments are indicated on the left side of the panel .

Experiments with the inverted repeat substrate sugges tthat gene conversion (which is an important pathway wit hsuch a substrate) may arise . With direct repeats, gen econversion, without associated crossing over, should lea dto a double HAT R/G418 R -resistant clone. Deletion event sresulting from either gene conversion associated withcrossing over or SSA lead to clones that are resistant t oHATR but sensitive to G418 (Figure 4C) . After 24 h oftreatment with aphidicolin, 50% of the recombinant clone swere HATR/G418 R, suggesting a high proportion of gen econversion events . To demonstrate the occurrence of gen econversion events, we studied the molecular structure o fdouble HATR/G418 R-resistant recombinants by Southernblotting . Figure 4C shows an example of six double HAT R/

G418 R clones, demonstrating the existence of the tw opredicted classes of gene conversion events . Thus, inhib -

ition of replication by aphidicolin results in a highproportion (at least 50%) of gene conversion stimulation .

Role of RAD51 in RIR1The mammalian Rad51 protein is homologous to the yeas trecombination protein ScRad5l (Morita et al ., 1993 ;Shinohara et al ., 1993) and is involved in gene conversionassociated with DSB repair (Lambert and Lopez, 2000) .Since replication inhibitors stimulate gene conversion, w etested whether RIRI was affected by RADS] .

The Rad51 protein has been described as re-localizin gin nuclear foci after a genotoxic stress (Haaf et al ., 1995) .These foci are generally interpreted as DNA repair foci .We analyzed the kinetic of RadSl foci formation durin gtreatment with hydroxyurea (Figure 5A and B) . Amoderate increase in foci formation was observed for

3865

Y .Saintigny et al.

Fig . 5 . Role of RAD51 in the induction of recombination by hydroxyurea . (A) and (B) Rad5l foci accumulation during hydroxyurea treatment .

(A) Example of Rad5l foci . (B) Percentage of cells with Rad5l foci as a function of the time of contact (h) with hydroxyurea . The percentage of

cells in the S phase for each time of contact with hydroxyurea is indicated in the figure. (C) and (D) Effect of the status of RAD5.1 on the RIRI.(C) Recombination induction as a function of the duration of treatment. (D) Survival (cloning efficiency) as a function of the duration of treatment .

The duration of treatment is indicated in the figure . The names of the cell lines are indicated in the figure . The values correspond to the mean of three

independent experiments . Error bars are omitted to avoid overloading the figure since the percentages of survival are not significantly different . CHO-

DRA10 is the parental cell line; C2 is CHO-DRA10 transfected with the empty vector. These two lines are control lines . F1 .4 .1 and F1 .4.2 are tw o

independent lines expressing the RAD51 dominant-negative form (hypo-rec) . Rm2 and Rm4 are two independent lines over-expressing MmRAD51

(hyper-rec).

6 h of treatment, then a strong accumulation of Rad5 1 foc iwas recorded for times of contact of 12 and 18 h . Thesefoci do not correspond to S phase foci because thefrequency of cells with Rad5l foci varies greatly, eventhough the percentage of S phase cells is comparable i neach condition. In addition, the kinetics of Rad5l foc iformation are superimposable on the kinetics of DS Baccumulation. Moreover, the kinetics of DSB and fociaccumulation are strongly consistent with the kinetics o frecombination stimulation . Taken together, these result sargue for an involvement of Rad5 1 in the cellular respons eto replication inhibition, but at a late stage .

We then tested genetically the involvement of RAD51 i nthe RIRI and whether this pathway was essential for cel lviability . We have devised CHO-DRA10 derivative line sexpressing either the mouse MmRAD51 cDNA or achimera SMRAD51 corresponding to the fusion ofthe 55 N-terminal amino acids from the yeast SCRAD51to MmRAD51 . MmRAD51 stimulates recombination ,whereas SMRAD51 inhibits spontaneous as well as DSB -induced ('y-rays, I-Scel) recombination in CHO-DRA10lines, without affecting cell viability (Lambert et al .,

1999) . Thus, we tested whether the expression of thesedifferent forms of RAD51 affects the RIRI .

The expression of the different RAD51 forms affectedthe two recombination phases of the RIRI differentl y(Figure 5C) . RAD51 has no effect on the early phase butspecifically affected the second phase of recombinationstimulation . For replication block lower than 12 h nosignificant differences were observed between the linesexpressing the different RAD51 forms . When replicationinhibition was prolonged for longer than 12 h, recombina-tion was strongly increased . These times of blockag ecorrespond to the accumulation of DSB (Figure 2) and o fRad5l foci (Figure 5B) . The recombination increase wa s4- to 5-fold stimulated by the expression of the wild-typeMmRAD51, whilst expression of the dominant-negativeSMRAD51 inhibited the RIRI 6- to 8-fold, for 24 h ofreplication inhibition (Figure 5C) . Thus, RAD51 especiall yaffects the second phase of the cell response to replicatio ninhibition . This second phase corresponds to the accumu-lation of DSBs and to the actual stimulation of recombina -tion . However, treatment with hydroxyurea led to the sam etoxicity in the different lines, showing that the expressio n

3866


6

12

1 8

Time of contact (hours)

-4— XR 1 (xrcc4)

--O--4364 (wild-type)

q X4C (xrcc4 complemented )

1 X4V (xrcc4 complemented )

9

1 2

Time of contact (hours )

24

C

Time of contact (hours )

Fig. 6. Sensitivity of the ku86 mutant xrs6 line (A) and of the xrcc4- mutant XR-1 line (B), or the XR-1 line complemented with the XRCC4cDNA (C), as a function of the duration of treatment with hydroxyurea . The names and phenotypes of the cell lines are indicated in the figure . X4 Cand X4-V are two independent XR-1 deriving clones, complemented with the XRCC4 cDNA .

of the different RADS1 forms does not affect cellularsensitivity to replication inhibition (Figure 5D) . Thes eresults also show that it is possible to decrease theefficiency of this pathway compared with control celllines, without affecting cell viability compared wit hcontrol cell lines .

NHEJ is involved in resistance to replicatio ninhibitors in the early respons eThe treatment with replication inhibitors was toxic in th eearly cell response, but induced DSB formation an dstimulated homologous recombination in the late cellresponse . One hypothesis is that an alternative DSB repairpathway acts in the early response . NHEJ is a goodcandidate for such an early pathway (Siede et al ., 1996 ;Takata et al ., 1998 ; Essers et al ., 2000) . We used twomutant cell lines affected in two different genes involve din NHEJ : xrs6 is mutated in ku86, and XR-1 is mutated i nxrcc4 . These mutant cell lines derive from differen tparental lines (CHO-Kl for xrs6 and 4364 for XR-1) an dthey are maintained in different media (see Materials an dmethods) . Thus, they should be compared with theirrespective controls .

A significantly higher sensitivity to hydroxyurea wasobserved in the NHEJ-defective cell lines (both in xrs6 an din XR-1) during the early response (Figure 6A and B) .Differences in sensitivity were still measurable after 6, 1 2and 18 h of treatment, but increasing the time of contactwith hydroxyurea reduced these differences . Ku86 protei nis involved in DNA ends recognition, whereas Xrcc 4protein is a cofactor of the ligase 4 and is thus involved in alate step of NHEJ . To verify that the sensitivity tohydroxyurea, observed in the early step, corresponds to anactual defect in NHEJ, we complemented the XR-1 lin ewith the XRCC4 cDNA . In two independent comple-mented cell lines (namely X4C and X4V) the expression o fthe XRCC4 cDNA restored the sensitivity to the level o fthe control 4364 line (Figure 6C) .

Taken together, these results suggest that followin greplication inhibition, DSBs are accumulated . NHEJwould take place first, then when NHEJ became over-whelmed by DSB accumulation, homologous recombina -

tion would act efficiently in the late stage . To test thisinterpretation, we measured the kinetics of Rad5l foc iformation after treatment with hydroxyurea in the xrs6 an dthe XR-1 mutant cell lines compared with their respectiv econtrol cell lines and with XR-1 deriving lines comple-mented with XRCC4 cDNA (Figure 7) . The kinetics showthat the' maximum of foci accumulation was reachedb9 and 12 h after the beginning of treatrn ent in th ebetween~~ri

xrs6 . The plateau of Rad5l foci accumulation was delayedfor several hours in the corresponding CHO-Kl controlline (Figure 7A) . It could be argued that the difference inthe kinetics could be due not to a defect in NHEJ but to anabnormal high level of Ku86 protein in the CHO-Kl cellline, resulting in competition on the DSB and in a delay o fRad5l foci formation. Thus, we tested the kinetics ofRad5l foci formation induced by hydroxyurea in th exrcc4-defective line . Similarly to the xrs6 line, the plateaulevel of Rad5l foci was reached between 9 and 12 h o ftreatment in the XR-1 line, whereas this plateau wa sdelayed in the wild-type 4364 control line (Figure 7B) .Interestingly, in two independent clones complemente dwith the XRCC4 cDNA, the kinetic of Rad5l fociformation became similar to that of the wild-type 436 4control cell line (Figure 7B) . Thus, the functional NHEJdelays the occurrence of Rad5l foci induced by replicatio ninhibitors .

After treatment with hydroxyurea, a defect in NHEJ ,either due to Ku86 protein inactivation or XRCC4mutation, results in an increased sensitivity in the earlysteps associated with an accelerated kinetic of Rad5l fociformation .

Discussio n

In the present report, we show that replication inhibitor sstimulate recombination of cells in the replicating S phase .Prolonged treatments with replication inhibitors result i naccumulation of DSBs . The strategy used here gave us theopportunity to compare the kinetics of DSB accumulation ,Rad5l foci formation, and stimulation of the homologou srecombination process per se . We observed a strikin gcorrelation between these three kinetics . In addition, thes e

3867

Y.Saintigny et al.

O CHC-K1 (wild-type )

XRS -6 (ku86)


--e— XR-1 (xrcc4 )

--o-- 4364 (wild-type )

-0— X4C (xrcc4 complemented)

- X4V (xrcc4 complemented )


Fig. 7 . Kinetics of Rad5l foci accumulation in the ku86- xrs6 line (A)or the xrcc4- XR-1 line and its derivatives (B) . The values indicatethe percentage of cells with Rad5l foci, as a function of the time o fcontact with hydroxyurea. At least 300 cells were counted per point.The names and phenotypes of the cell lines are indicated in the figure .X4C and X4V are two independent XR-1 deriving clones ,complemented with the XRCC4 cDNA.

data afford additional evidence on the putative role ofRad5l foci in DSB repair .

The extent of RIRI is directly correlated with progres-sion in S phase . This result is consistent with th eexpression pattern of Rad5l protein in the S and G2phases (Yamamoto et al ., 1996 ; Chen et al ., 1997 ; Visp éet al., 1998) . In addition, the combination of differentinhibitors stimulates recombination as efficiently as treat -ment with only one inhibitor in a kind of `pharmacologicalepistasis' . These results show that the different inhibitor sact on recombination via a common target, i .e . replicationinhibition .

We used two categories of well characterized drug slmown to inhibit either replicon initiation or elongation . I neach category, the results are extremely homogeneou ssince the two drugs of each category provoke the sameeffect: the two elongation inhibitors strongly stimulat erecombination whereas the two initiation inhibitors showmoderate effects on recombination . These results ar econsistent with the fact that elongation inhibitors produce

more DNA breaks than initiation inhibitors . The results arealso consistent with the synchronization experimentsshowing that cells in late S phase, which should presentmore elongated replicons, are more proficient for the RIRI .

Replication inhibition stimulates recombination be-tween both direct repeats and inverted repeat recombina -tion substrates . Recombination between direct repeats use sgene conversion as well as RAD51-independent SS Apathways ; inverted repeat recombination mainly uses th egene conversion pathway plus alternative non-SSA path -ways (for review see Klein, 1995 ; Rattray and Symington ,1995) . Since RIRI acts on both types of substrate, thes eresults indicate that RIRI involves a common pathway, i .e .the gene conversion pathway . We confirm molecularly bySouthern blotting the occurrence of gene conversionevents . Moreover, treatment with hydroxyurea leads t oRad5l foci formation with kinetics consistent with thoseof DSB accumulation and recombination stimulation .Finally, over-expression of the wild-type MmRAD5 1stimulates RIRI, whereas expression of the trans-domin-ant-negative SMRAD51 impairs RIRI. Taken together ,these results demonstrate the involvement of RAD51 inRIRI . RAD51 is an essential gene in vertebrates (Tsuzukiet al ., 1996 ; Sonoda et al., 1998) . In chicken DT40transformed cell line, it has been suggested that th eessential role of RAD51 is to repair spontaneous lesionduring replication by using the sister chromatid (Sonod aet al ., 1999) . Since RAD51 is also essential in mammaliancells, the hypothesis is commonly extrapolated fro mchicken to mammalian cells . Our results show tha tRAD51-dependent recombination is stimulated by repli -cation arrest but in the late response to replicationinhibitors . Moreover, the use of a trans-dominant-negativeform of RAD51 has shown that it is possible to substan-tially decrease spontaneous as well as DSB-inducedrecombination without affecting viability of the hamsterCHO cells (Lambert and Lopez, 2000) . In addition, w eshow here that the RAD51 trans-dominant-negative formalso significantly inhibits the RIRI without affecting cel lviability . However, it can not be excluded that a low levelof recombination could be sufficient to ensure cellviability . Nevertheless, it is possible to substantiallydecrease RIRI without affecting cell viability.

The time-course of replication elongation inhibitio nshows two steps in the cell response . The first stepcorresponds to the time of blockage between 0 and 12 h .During this period the toxicity is correlated with the timeof contact with the drug, but homologous recombination i sonly moderately increased . Two different NHEJ-defectiv ecell lines, affected in two different genes (ku86 or xrcc4) ,show an enhanced sensitivity to elongation inhibitor sduring this early step . These results suggest that NHEJpreferentially acts during this step, compared withhomologous recombination. The second step correspond sto prolonged arrest (>12 h) . During this step DSB saccumulate, the toxicity reaches a maximum and th esensitivity of the NHEJ-defective cells reaches that of th econtrol line . Moreover, Rad5l foci accumulate during thi sphase . In addition, homologous recombination is strongl ystimulated during this second step and this pathway i saffected by the status of the exogenous RAD51 expressed .These results indicate that the second step corresponds to aRAD51-dependent pathway and that a huge amount of

2s

0

A

B

21 241 81 5O 9

1 2

3868

Duration of arrest

DSB

DSS accumulation


Cells and Rad5l fociCHO-DRA10, mouse pJS3-10 and pJS4-7-1 cell lines were cultured at37°C with 5% CO2 in Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) . xrs6 (ku86 mutant cellline) and CHO-Kl (the corresponding wild-type cell line) were culturedin a-MEM supplemented with 10% FBS . XR-1 (xrcc4 mutant cell line)and 4364 (the corresponding wild type) were cultured in DMEM withou tpyruvate sodium. The Rad5l foci were analyzed as described (Raaf et al .,1995) using an anti-Rad5l antibody (Oncogene research) .

inefficient/' \ NHEJ

NHEJEfficient

Early response

Fig. 8 . NHEJ and homologous recombination on DSB induced b y

replication inhibitors. Replication arrest creates DSBs. In the earlyresponse, DSBs are mainly processed by NHEJ and homologou s

recombination is marginally involved. A defect in NHEJ leads t o

hypersensitivity to replication inhibitors . Prolonged arrest (late

response) leads to the accumulation of DSBs . NHEJ would beoverwhelmed and homologous recombination can act efficiently .

DSBs is required to stimulate homologous recombination.Remarkably, in the present experiments we observed agood correlation between the kinetics of DSB production,Rad5l foci formation and recombination . Taken together ,these results suggest that NHEJ and RAD51 recombinationact in a temporal sequence. One model could be propose d(Figure 8) : (i) in the early phase, replication arrest leads t oDSB formation. NHEJ and homologous recombinatio ncould compete for the DSBs (Haber, 1999 ; Van Dyc ket al ., 1999), but NHEJ would be much more efficient . Adefect in NHEJ results in an increased sensitivity toreplication inhibitors . (ii) In the late phase, DSBs areaccumulated and could saturate the NHEJ machinery ,resulting in DSBs accessible to the homologous recom-bination machinery . The fact that stimulating or inhibitin gthe RAD51 recombination pathway does not modify th ecell sensitivity agrees with the hypothesis of NHEJsaturation. Alternatively, NHEJ and homologous recom-bination would not compete, but their action would b eregulated and coordinated by the cell in a tempora lsequence: (1) NHEJ for most of the damage to ensure cellviability, then (2) homologous recombination for theresidual damage . These models are supported by the factthat in the absence of a functional NHEJ pathway (defec tof either Ku86 or Xrcc4), Rad5l foci accumulate faste rcompared with control cell lines or XR-1 lines comple-mented with the XRCC4 cDNA .

The processes described here may have various import -ant biological consequences . The control of genomeintegrity is essential to prevent neoplastic development .The data presented here detail the genetic and molecula rconnections between two essential processes of genomemaintenance in mammalian cells : replication and homo-logous recombination .

Materials and method s

DNA manipulation sAll DNA manipulations were performed as described (Sambrook et al . ,

1989 ; Ausubel et a1 .,1999) .

Measurement of recombinatio nStrategies and cell lines used to measure recombination . The pJS3-10 andpJS4 .7 .1 lines are sensitive to the HAT selective medium . Recombinan tTK+ clones were selected in HAT medium (100 µM hypoxanthine, 21 .tMaminopterin, 15 sM thymidine) as described (Liskay et al., 1984) . CHO-DRA10 and lines Rm2, Rm4, F1-4 .1, F1-4 .2 derived from CHO-Kl ,contain a recombination substrate (Liang et al ., 1998) and expres sdifferent Rad5l forms (Lambert and Lopez, 2000) . NEOR recombinantswere selected with 500 µg/ml G418 . The frequency of recombination i sgiven by the ratio of the number of HAT-resistant clones or G41 8(NEO R)-resistant clones to the total number of viable cells .

Recombination frequency after replication inhibitors. Cells were incu-bated at the concentration and for the time indicated, and were thentrypsinized and divided into two fractions . The first fraction was used tocalculate the viability by measuring the plating efficiency . The secondfraction was plated under HAT or G418 selection to measure thefrequency of TK+ or NEOR clones . The recombination frequency wa sestimated by the ratio : number of TK+ or NEO R clones to the total numberof surviving clones.

COMET assayThe protocol for the alkaline COMET assay was adapted from thatinitially reported (Singh et al ., 1988) . Cells were suspended in Cat+ - andT~-r+ frr..cc p~

, Lu4io._ Lvuffc i. .r~ _ .]

' o (P TIS),

i.,i,~

wJ.(!i !r

1 .1

1o .Th_cu

;

m

,,w -

melting-point agarose (Type VII; Sigma) maintained at 37°C, in orderto obtain a final concentration of 0 .5% agarose and -5 X 145 cells/ml.One hundred and fifty microlitres of this cell suspension were loaded on anon-frosted slide pre-coated with 0 .5% air-dried agarose . After 5 minover ice, the slides were placed in freshly prepared lysis buffer for 1 h30 min at 4°C [2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris pH 10, 1 %sodium sarcosinate, 1% Triton X-100, 1% dimethylsulfoxide (DMSO)] .Slides were then transferred to a horizontal electrophoresis unit filled wit hfresh alkaline buffer (300 mM NaOH, 1 mM Na 2EDTA pH 13) at roo mtemperature. The slides were left for 25 min to allow the DNA to unwin dand then electrophoresis was conducted for 25 min at 21 V and 300 mA .After electrophoresis, the slides were drained, rinsed twice for 5 min wit h0 .4 mM Tris pH 7 .5 and once with double-distilled water . The slides wer edried for 30 min at 40°C, dehydrated in a 100% ethanol bath, drie dthoroughly at 37°C and stored at room temperature until the analysis .Before analysis, the slides were re-hydrated and stained for 30 min in a5 sg/ml propidium iodide solution and covered with a coverslip fo rimmediate analysis. A total of 800 cells on three slides were observed a t200X magnification using an epifluorescence microscope (LEICADMLB) equipped with an excitation filter of 515—560 nm, a 50 Wmercury lamp, and a barrier filter at 590 nm . Comets were captured an danalyzed with the fully automated system Morphostar Cornet (IMSTARs .a.) . Tail moment (Olive et al., 1990) was measured.

Pulsed-field gel electrophoresisCells were prepared for PFGE as described (Gunderson and Chu, 1991 ;Dhermain et al ., 1995) . For PFGE, we used a CHEF Mapper' with acooling Module (Mini Chiller Model 1000) (Bio-Rad Hercules, C A94547) containing permanently circulating 1 X TAE buffer [4 .84 g Tris-base (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), 1 .14 ml glacial acetic acidand 2 nil 0 .5 M EDTA in 1 1 deionized water] . We included molecularweight markers of chromosomal DNA of Hansenula wingei andSchizosaccharomyces pombe (Bio-Rad) in the PFGE agarose gel . CHEFelectrophoresis was continued for a total . migration time of 74 h at 2 V/cmwith an angle of reorientation of ±53° (106°) and a pulse time of 35 min .The temperature was maintained at 14°C by a minichiller (Bio-Rad) .

Flow cytometry analysisFor each point, 1 0 6 cells were plated in DMEM and incubated for 48 h at37°C . Cells were then incubated with replication inhibitors under th eindicated conditions, in DMEM + 10% FCS at 37°C . Cells were thentrypsinized, collected by centrifugation (5 min at 2000 g), re-suspende d

Lethsllty

Homologousrecombination

Late response

3869

Y .Saintigny et al.

in 500 kI of PBS and fixed by adding 1 .5 ml of cold ethanol . The DNAcontent was estimated by propidium iodide fluorescence and DNA flo w

cytometry (Becton FACScalibur) .

Acknowledgements

We thank D .Rouillard (Institut Curie, Paris) for FACS expertise . We are

grateful to Drs D .Marsh, F .Fabre and C .White for critical reading of the

manuscript . Thanks are due to Drs M.Jasin, P .Jeggo and M .Liskay forproviding us with CHO-DRA10, XR-1, xrs 6 and pJS3-10 cell lines ,

respectively . Y .S . was supported by an INSTN/EDF, then a FR M

fellowship. S .L . and F .D . are supported by an INSTN fellowship . Thiswork was supported by Electricité de France, ARC (9822 and 9238) .

ReferencesAusubel,F ., Brent,R ., Kingston,R., Moore,D ., Seidman,J ., Smith,J . and

Struhl,K. (1999) Current Protocols in Molecular Biology . Vols 1--4.

John Wiley & Sons, Inc ., Boston, MA .Bierne,H., Ehrlich,S .D. and Michel,B . (1997) Deletions at stalle d

replication forks occur by two different pathways . EMBO J., 16 ,

3332-3340 .Caligo,M.A., Piras,A. and Rainaldi,G. (1988) Time course of sister

chromatid exchanges and gene amplification induced b y1-3-D-arabinofuranosylcytosine in V79-AP4 Chinese hamster cells .

Chromosoma, 96, 306-310 .

Chen,F., Nastasi,A ., Shen,Z., Brenneman,M., Crissman,H. and Chen,D .J .(1997) Cell cycle-dependent protein expression of mammalia nhomologs of yeast DNA double-strand break repair genes Rad5 l

and Rad52 . Mutat. Res., 384, 205-211 .

Cox,M .M., Goodman,M .F., Kreuzer,K.N., Sherratt,D .J ., Sandler,S .J. an d

Marians,K.J . (2000) The importance of repairing stalled replicatio n

forks . Nature, 404, 37-41 .D1'11.h_

_cr

. ._ . .,

.i_n,1

Tl,. .-,1_14,

.adalhon,Iv11 .Tl., Q /',, . _uci_i,ic.-c_.,ir! . a

. , ]

nd

~A-vc1_t ccl1- ,DT\ . (,~ 1995 )~ n nG'\

rna 7" ., i7 - ..Induction of double-strand breaks in Chinese hamster ovary cells a t

two different dose rates of 'y-irradiation . Mutat . Res., 336, 161-167 .

Dillehay,L .E., Jacobson-Kram,D . and Williams,J .R. (1989) DN Atopoisomerases and models of sister-chromatid exchange . Mutat.

Res ., 215, 15-23 .Dronkert,M.L ., Beverloo,H.B ., Johnson,R .D ., Hoeijmakers,J .H . ,

Jasin,M . and Kanaar,R. (2000) Mouse RAD54 affects DNA double -strand break repair and sister chromatid exchange . Mol. Cell. BioI., 20 ,

3147-3156 .Essers,J., van Steeg,H ., de Wit,J., Swagemakers,S .M., Vermeij,M. ,

Hoeijmakers,J .H . and Kanaar,R. (2000) Homologous and non-homologous recombination differentially affect DNA damage repai r

in mice . EMBO J., 19, 1703-1710 .Fabre,F ., Boulet,A. and Roman,H . (1984) Gene conversion at differen t

points in the mitotic cycle of Saccharomyces cerevisiae . Mol. Gen.Genet., 195, 139-143.

Fram,R .J. and Kufe,D .W. (1982) DNA strand breaks caused by

inhibitors of DNA synthesis: 1-P-D-arabinofuranosylcytosine and

aphidicolin. Cancer Res., 42, 4050-4053 .Gunderson,K. and Chu,G. (1991) Pulsed-field electrophoresis o f

megabase-sized DNA. Mol. Cell. Biol ., 11, 3348-3354 .

Haaf,T ., Golub,E.I ., Reddy,G ., Radding,C .M. and Ward,D .C . (1995 )Nuclear foci of mammalian Rad5l recombination protein in somaticcells after DNA damage and its localization in synaptonema l

complexes. Proc . Natl Acad . Sci. USA, 92, 2298-2302 .Haber,J .E. (1999) DNA repair. Gatekeepers of recombination. Nature ,

398, 665-667 .Hyrien,O. (2000) Mechanisms and consequences of replication for k

arrest . Biochimie, 82, 5-17 .Ishii,Y . and Bender,M .A . (1980) Effects of inhibitors of DNA synthesi s

on spontaneous and ultraviolet light-induced sister-chromatidexchanges in Chinese hamster cells . Mutat. Res., 79, 19-32 .

Kadyk,L.C. and Hartwell,L.H . (1992) Sister chromatids are preferredover homologs as substrates for recombinational repair inSaccharomyces cerevisiae . Genetics, 132, 387-402 .

Klein,H.L. (1995) Genetic control of intrachromosomal recombination .

BioEssays, 17, 147-159 .Kuzminov,A. (1995) Collapse and repair of replication forks i n

Escherichia coli . Mol. Microbial,, 16, 373-384 .Lambert,S . and Lopez,B .S . (2000) Characterization of mammalia n

RAD51 double strand break repair using non lethal dominantnegative forms . EMBO J., 19, 3090-3099 .

Lambert,S ., Saintigny,Y ., Delacote,F., Amiot,F ., Chaput,B . ,Lecomte,M., Huck,S ., Bertrand,P . and Lopez,B .S . (1999) Analysi sof intrachromosomal homologous recombination in mammalian cell ,using tandem repeat sequences . Mutat. Res ., 433, 159-168 .

Levenson,V . and Hamlin,J.L . (1993) A general protocol for evaluatin gthe specific effects of DNA replication inhibitors . Nucleic Acids Res . ,21, 3997-4004 .

Liang,F ., Han,M ., Romanienko,P .J. and Jasin,M . (1998) Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway i nmammalian cells . Proc. Nail Acad. Sci. USA, 95, 5172-5177 .

Liskay,R .M ., Stachelek,J .L . and Letsou,A . (1984) Homologousrecombination between repeated chromosomal sequences in mous ecells . Cold Spring Harb. Symp . Quant. Biol ., 49, 183-189 .

Morita,T ., Yoshimura,Y ., Yamamoto,A., Murata,K ., Mori,M . ,Yamamoto,H. and Matsushiro,A. (1993) A mouse homolog of theEscherichia coli recA and Saccharomyces cerevisiae RAD51 genes .Proc. Natl Acad. Sci . USA, 90, 6577-6580 .

Olive,P .L., Banath,J .P . and Durand,R.E . (1990) Heterogeneity inradiation-induced DNA damage and repair in tumor and norma lcells measured using the ` comet' assay . Radiat. Res., 122, 86-94 .

Rattray,A .J. and Symington,L.S

. (1995) Multiple pathways forhomologous recombination in Saccharomyces cerevisiae . Genetics,139, 45-56 .

Rothstein,R., Michel,B . and Gangloff,S . (2000) Replication fork pausin gand recombination or ` gimme a break ' . Genes Dev., 14, 1-10 .

Sambrook,J ., Fritsch,E .F . and Maniatis,T. (1989) Molecular CIoning: ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col dSpring Harbor, NY .

Scully,R ., Puget,N . and Vlasakova,K. (2000) DNA polymerase stalling ,sister chromatid recombination and the BRCA genes . Oncogene, 19 ,6176-6183 .

Seigneur,M ., Bidnenko,V ., Ehrlich,S .D . and Michel,B . (1998) RuvABacts at arrested replication forks . Cell, 95, 419-430 .

Shinohara,A., O,gawa,H., Matsuda.Y. . Ushin .N . ; Tkeo.K. and Ogawa ; T(1993) Cloning of human, mouse and fission yeast recombinationgenes homologous to RAD51 and recA [published erratum appears inNature Genet., 1993, 5, 312] . Nature Genet ., 4, 239-243 .

Siede,W ., Friedl,A .A ., Dianova,I., Eckardt-Schupp,F . and Friedberg,E .C .(1996) The Saccharomyces cerevisiae Ku autoantigen homologu eaffects radiosensitivity only in the absence of homologou srecombination . Genetics, 142, 91-102 .

Singh,N.P ., McCoy,M .T., Tice,R.R. and Schneider,E .L. (1988) A simpletechnique for quantitation of low levels of DNA damage in individua lcells . Exp. Cell Res ., 175, 184-191 .

Sonoda,E., Sasaki,M.S ., Buerstedde,J.M ., Bezzubova,0 ., Shinohara,A . ,Ogawa,H., Takata,M ., Yamaguchi-Iwai,Y. and Takeda,S . (1998 )Rad5l-deficient vertebrate cells accumulate chromosomal break sprior to cell death. EMBO J., 17, 598-608 .

Sonoda,E ., Sasaki,M .S ., Morrison,C ., Yamaguchi-Iwai,Y., Takata,M .and Takeda,S . (1999) Sister chromatid exchanges are mediated b yhomologous recombination in vertebrate cells . Mol . Cell. Biol ., 19 ,5166-5169 .

Takata,M ., Sasaki,M .S ., Sonoda,E., Morrison,C ., Hashimoto,M. ,Utsumi,H ., Yamaguchi-Iwai,Y ., Shinohara,A. and Takeda,S . (1998)Homologous recombination and non-homologous end joinin gpathways of DNA double-strand break repair have overlapping rolesin the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells.EMBO J., 17, 5497-5508 .

Tsuzuki,T ., Fujii,Y ., Sakumi,K ., Tominaga,Y., Nakao,K ., Sekiguchi,M .,Matsushiro,A ., Yoshimura,Y . and Morita,T . (1996) Targeteddisruption of the Rad5l gene leads to lethality in embryonic mice .Proc. NatI Acad. Sci . USA, 93, 6236-6240 .

Van Dyck,E ., Stasiak,A .Z ., Stasiak,A. and West,S .C . (1999) Binding o fdouble-strand breaks in DNA by human Rad52 protein. Nature, 398 ,728-731 .

Vispé,S ., Cazaux,C ., Lesca,C . and Defais,M. (1998) Overexpression o fRad5l protein stimulates homologous recombination and increase sresistance of mammalian cells to ionizing radiation . Nucleic AcidsRes., 26, 2859-2864.

Yamamoto,A . et al . (1996) Cell cycle-dependent expression of themouse Rad5l gene in proliferating cells . Mol . Gen. Genet., 251, 1-12 .

Zou,H . and Rothstein,R. (1997) Holliday junctions accumulate i nreplication mutants via a RecA homolog-independent mechanism .Cell, 90, 87-96 .

Received March 22, 2001 ; revised and accepted May 25, 2001

3870

Mutation Research 433 (1999) 159–16 8ELSEVIERDNA Repair

Review

Analy sis of intrachromosomal homologous recombination inJ

mammalian cell, using tandem repeat sequence susing

S . Lambert 1 , Y. Saintigny 1 , F. Delacote, F. Amiot, B . Chaput, M . Lecomte, S . Huck ,P. Bertrand, B .S . Lopez

UMR 217 CNRS, CEA, DSV, DRR, 60-68 Ar . du Général Leclerc RP6 92 265 Fontenay au. Roses, Cedex, Franc e

Received 6 January 1998 ; received in revised form 25 January 1999 ; accepted 10 February 199 9

Abstrac t

In all the organisms, homologous recombination (HR) is involved in 'fundamental processes such as genome diversifica-tion and DNA repair. Several strategies can be devised to measure homologous recombination in mammalian cells_ W e

–present here thë interëst -of using intrachromosomal tandem repeat sequences to measure HR in mammalian cells and w ediscuss the differences with the ectopic plasmids recombination . The present review focuses on the molecular mechanisms ofHR between tandem repeats in mammalian cells . The possibility to use two different orientations of tandem repeats (direct o rinverted repeats) in parallel constitutes also an advantage . While inverted repeats ,measure only events arising by strandexchange (gene conversion and crossing over), direct repeats monitor strand exchange events and also non-conservativ eprocesses such as single strand annealing or replication slippage . In yeast . these processes depend on different pathways ,most of them also existing in mammalian cells . These data permit to devise substrates adapted to specific questions abou tHR in ► Mammalian cells . The effect of substrate structures (heterologies, insertions/deletions, GT repeats, transcription) an dconsequences of DNA double strand breaks induced by ionizing radiation or endonuclease (especially the rare-cuttin gendonuclease ISce-I) on. HR are discussed . Finally, transgenic mouse models using tandem repeats are briefly presented .© 1999 Elsevier Science B .V . All rights reserved .

Keywords: Homologous recombination ; Mammalian cells ; Tandem repeat sequence s

1 . Introduction

Homologous recombination (HR) , plays a centra lrole in various fundamental processes determinin ggenome organization and rearrangement such a smolecular evolution [I,2] mating type switching i n

Corresponding author . Tel . :

lax : + 33 -I-46-54-91-80; i ;-mail : lnpe/:@, lsvidi .ccc .i. r

l ;yua< cnntrihutinn .

yeast (for review, see Ref. [3]), antigenic variation ofthe trypanosome (for review, see Ref. [4]), or fo r

diversification of immunoglobulin genes in chicke n[5] or in rabbit [6], faithful chromosomal segregatio nduring meiosis in yeast (for review, Refs . [7,8]), an dDNA repair (for review, see Ref. [9]) .

On one hand, HR is involved in the maintenanc eof genome integrity by repairing damaged DNA ; o nthe other hand, it may also contribute to gen()nn cinstability since recombination between harnoloa )l l

0u2I-5777/u)/'i - wc frnut emitter

I T) cY) I ;ikcvicr Science N .V . All rig1u rc,cr,ed .Pll : q ilo_2 I -8777( c)a)O000 t-X

160

S . Lan :ber: et al,/Mutation Research 433 (1999) 159—16 8

repeated sequences dispersed through the genom emay lead to duplications, inversions, deletions ,translocations [10] . Moreover, gene conversion withpseudogenes can inactivate a functional allele [11] .Finally, several lines of evidences connect HR wit hcancer predisposition or prevention . First, carcino-gens stimulate intrachromosomal HR [12-15] . Sec-ond, intrachromosomal HR is elevated in DNA re-

pair deficient cell lines, in Ataxia telangiectasia cel l

lines or p53 defective cells lines, all of these pheno-types being associated with cancer predisposition

[16-20] . Third, Rads 1, a putative recombination pro-tein in mammalian, cells, has been shown to interac t

with the products of the tumor suppressor gene s

p53, BRCA1, BRCA2 [21--25] .The use of intrachromosomal tandem repeat rep -

resents a good strategy to measure HR in mam-malian cells and has been often used because (i) it i s

the easiest way to introduce the two partners o frecombination in a broad variety of cells and in on e

round of cell transfection, (ii) these systems permi tefficient measure of HR and (iii) it allows to selectfor gene conversion or crossover and deletion events ;(iv) depending on the orientation of the two markers ,it can measure recombination arising by differen tmechanisms such as strand exchange (SE), singlestrand annealing (SSA) or replication slippage [26] .These mechanisms involving different pathways i nyeast, it is thus essential to be able to distinguis hbetween them in mammalian cells also . Here wepresent mechanisms of HR deduced from the knowl-edge in yeast, and also some molecular character-istics of HR between tandem repeat in mammaliancells . These data aid in the design of substrate sadapted to more specific questions about the regula-tion of HR in mammalian cells .

and lead either to gene conversion or to crossin gover (Fig . 1) . Gene conversion between both DR an dIR leaves intact the general structure of the locus .Depending on the orientation of the substrates, cross-ing over results in different structures : crossing overbetween IR leads to the inversion of the intervenin gsequence (Fig . 1B, Fig . 2A) ; crossing over betweenDR leads to the deletion of the intervening sequenc eeither by an unequal sister chromatid exchange or b yan intrachromatid exchange (Fig . 2B,C) . In additionto SE recombination, direct repeats (DR) permit als o

to monitor deletion events arising by RAD51 inde-

pendent mechanisms such as single strand annealin g(SSA) (Fig . 3), replication slippage and other mecha-nisms [26]. Because of their orientation, inverted

repeats measure neither SSA nor replication slip -page .

Extensive studies in yeast have determined gene s

involved in the control of HR . SE and SSA represen t

the main pathways using homologous sequences t oachieve double strand break (DSB) repair . Beside sDSB repair, replication slippage involved pathway sdifferent from those required for SE and SSA. (,?.6] . T n

Saccharomyces cerevisiae, the SE mechanism is de-pendent on the RAD52 epistasis group includin gRAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57 genes ,whereas SSA does not involve these genes . SSA i sdependent upon SRS2, on the nucleotide excisionrepair proteins Rad1 and Rad10 and on the mismatc h

repair proteins Msh2 and Msh3 [27,28] . Homologue s

to most of these genes have been described in mam-malian cells (Table 1) . Clearly, the study of HR i nmammalian cells would benefit from the comple-mentary use of the two kinds of substrates (DR an d

IR) .

1 .1 . Mechanisms and pathways of homologous re -combination between tandem repeat : ,the knowledgefrom Saccharomyces cerevisia e

Two different orientations of the tandem repeat

recombination substrate can be used : direct repea t

(DR) or inverted repeat (IR) . In bacteria and yeast ,

RecA/Rad5 1 protein promotes strand exchange (SE) .SE recombination can act on DR as well as on IR

1 .2 . Molecular events of intrachromosomal recom-bination between duplicated sequences in m anl-

malian cell s

Two kinds of substrates have been used . One use dtwo LAC Z sequences, recombinant cells being de-tected by the blue coloration . The second type o f

substrates used selectable genes (herpes simplex viru s

TK gene in tk cells, neomycin resistance gene ,hygromycin resistance gene . . . ), recombinant cells

S. Lambert et al ./Mutation Research 433 (1999) 159–168

16 1

Al R + BI S + R+

RECOMBINANT R +, S'

DELETION(Crossing Over, SSA ,replication slippage ,

--~--p ►R`

S+

R' -,

PARENTAL ; R', S .

zRECOMBINANT : R + , S +

CROSSING-OVER

-4--S+

R '

a

z

aA

PARENTAL : R', S+

GENE CONVERSION

GENE CONVERSION

iRECOMBINANT : R + , S+

R +

RECOMBINANT : R +, S +

R-

R+

.nom-. .

CI

OR

R+ R -

a

zOR

z

R+

R°

c +

PARENTAL : R', S +

RECOMBINANT : R+ , S '

Fig . I . Principle of the strategy to measure intrachromosomal homologous recombination between tandem repeat sequences . (A) Directrepeats, (B) inverted repeats (the letters a and z show the orientation of the intergenic sequence), (C) truncated repeats . The parentalconstruction contains two inactive copies of a reporter gene (hatched boxes) . This reporter gene can confer resistance to selective media . Analternative strategy uses the f3-galactosidase gene whose expression can be monitored by histochemistry . In the parental form the two copiesare inactivated (R – ) by a mutation, a deletion or an insertion (black boxes) located at different positions on each copy . An alternativ estrategy uses two truncated but overlapping regions (C) black boxes . In most of the systems, another selection gene (white boxes) is inserte dbetween the two copies . The expression of the selection gene (S + or S – ) is used (i) to selgct the transfected cells with the recombinatio nsubstrate, (ii) to analyze the distribution of recombination events (deletion or gene conversion) . Recombination between the duplicatedsequences creates a functional gene (R + ) either by gene conversion (a conservative event) or by deletion of the intergenic sequenc e(non-conservative event) . Gene conversion can occur with direct as well as with inverted repeat sequences . Deletions can only occur withdirect repeat sequences by crossing over after strand exchange (SE), by single strand annealing (SSA) or other events such as replicatio nslippage . Crossovers between the inverted repeat sequences do not lead to deletion but to inversion of the intervening sequence . With tw otruncated copies, a deletion creates a functional gene (R ± ) .

forming clones when the selection was applied . Ad-ditionally, DSB repair has been studied following i nvivo endonucleases treatment.

1 .2 .1 . Spontaneous intrachromosomal recombinatio niS a conservative mechanis m

Analysis of the structure of recombinants ha srevealed that spontaneous intrachromosomal recom-bination is mainly a conservative mechanism in

mouse L-cells with gene conversion representing ap-proximately 80% of the recombination events [29] .This was observed using direct repeat or inverte drepeat sequences [30] . The majority of the event sgiving rise to crossover products involved unequall ypaired of sister chromatids after DNA replicatio n(see Fig . 2) [3I] . These results contrast with those o fextrachromosomal recombination which follow anon-conservative mechanism in mouse L-cells [32–

162 S . La1nbert et a1 . /Mutations Research 433 (1999) 159–168

. — -- a 2 2 1

B .

-

C .

X

Unequal SCE

Reciprocal intrachromati dexchang e

Fig . 2 . Models for crossing-over events after SE. (A) Crossing over between two inverted repeats leads to the inversion of the intervenin g

sequence . The arrows indicate he orientation of the two copies, ( X ) symbolizes the exchange and the numbers are here to orient th e

intergenic sequence . (B) and (C) recombination between two direct repeats (hatched boxes) . The arrows indicate the orientation of the tw o

copies . The lines represent the duplex DNA . (B) Recombination between two mispaired chromatids . (C) Intrachromatid recombination . Th e

two copies (hatched boxes) are paired . After the exchange ( X ), the resolution of the Holliday )unction can lead to gene conversion (see Fig :

1) or to a crossing over event . In (B), the crossing over leads to the formation of a unique active gene and to the deletion of the intergeni c

sequence on one chromatid and to,..'a triplication on the other chromatid . In (C), the crossing over leads to the maintenance of only one copyon the chromosome and one loop that can be eliminated . In some cases, the loop can he integrated elsewhere in the genome . (D) Crossove r

between two truncated copies . The black box represents the overlapping sequence . (A, C, D) correspond to reciprocal intrachromati d

exchanges .

D.

34] . It cannot be' excluded that these ratios may diffe r

in other cell types .

1 .2 .2 . Hetereduplex formatio nThe different models for HR involved intermedi-

ate structures in which DNA-strand exchanges creat e

hybrids and heteroduplex DNA between the tw o

recombining molecules [35-37] . Biochemical studies

of nlitotically dividing mammalian cells indicate that

exchange between sister chromatids involved inter -strand transfer of DNA [38,39] . In addition, het-eroduplex formation' during HR promoted by huma nnuclear extracts was observed in a cell free syste m[40] . The analysis of the intrachromosomal recom-bination products between tandem repeats has show nthat recombinant colonies result from unrepaired het-croduplex I)NA [31,41] . Since particular structure smay affect the l *orivatit)n, the stability or the resolu-

S. LcunLhert et al./Mutation Research 433 (1999) 159—168

16 3

---p-

1)

ture (insertions or deletions leading to loops forma -tion into the heteroduplex molecule the homolog yrequirements . . . ) have been studied .

4)

t .

Fig . 3 . The single strand annealing model [32] . The two comple-

mentary strands of the duplex DNA are drawn here . The heavy

lines symbolized the homologous repeat sequences and the arrow s

the orientation of the two repeats . (1) A double strand break ca n

occur even in the non-homologous intervening sequence . (2) Afte r

degradation by a single strand exonuclease, single stranded tail s

(ss-tails) are created . If the repeats are in a direct orientation ,

complementary ss-tails are created . (3) Annealing of the tw o

complementary single stranded regions results in a structure lead-

ing to the deletion of the intervening sequence after the resolutio n

of this structure . (4) SSA is exclusively a non conservativ e

mechanism If the repeats are in an inverted orientation . th e

ss-tails (step 2) are identical but not complementary and SS A

cannot act .

tion of the heteroduplex recombination intermedi-ates, the effect on recombination of the DNA struc -

1 .2 .3 . Effect of the sequence structure . insertions ,

deletions, sequence homology requirements, mi-crosatellites, transcription

1 .2 .3.1 . Insertions and deletions . The molecular na-

ture of insertion or deletion mutations (correspond-ing to the black boxes in Figs . 1 and 2) in the copie sof the duplication can influence the efficiency of HR .DNA strand exchange is able to propagate throughheterologous sequences forming heteroduplex DN Abearing loops . The resolution of such intermediate sleads more frequently to the excision of the loopwith an efficiency correlated to the size of the loo p

[42] .

1 .2 .3 .2 . Homology requirements. Two alternative

strategies can be drawn to address the question o f

how much homology is required for HR in mam-malian cells . The first uses two truncated molecule s

with different lengths of overlapping of uninter-rupted homology (Fig . 2D) . When the two interact-ing molecules share length of homologies betwee n295 bp and 1 .8 kb, the rate of gene conversion i s

3 )

Table 1Comparison between strand exchange (SE) and single strand annealing (SSA)

Process Products orientation of the Pathway in Homologues i n

substrates S . cerevisiae human cell s

Strand exchange }'‘Gene conversion Direct repeat RAD51" HsRAD51 "

Inverted repeat RAD52 '' HsRAD52

RAD54 HsRAD54

Crossing over RAD55 " see : "

Deletions Direct repeat RAD57" see : "

Inversions Inverted repeat RAD5 9

Single strand annealing Deletions Direct repeat RAD I XP-Fc

RADIO ERCC I

MSH2 HsMSH 2

MSH3 HsMSH3

SRS2

" In yeast RAD55 and RAD57 share homologies with RADS! . In mammalian cells, beside IIsRA!)51, lit last 6 other RAD5I homologue s

have been described : XRCCO, XRC'C3, RAI)5JB7IIR1;C2, RAD51I1.3, RAD5IC, RADSI!). Some of these homologues presu :ii :ihl y

correspond to RADS5 and to RAD57 ,

" Defines the epistasis group for homologous recombination in yeast .

` Xeroclornio l)iginenrosunl group F.

164

S. Lambert et al . /Mutation Research 433 (1999) 159—16 8

directly proportional to the length of uninterrupted

homology . This rate is reduced 7 fold with 200 b p

homology and 100 fold with 95 bp length of homol- .

ogy [43] .The second strategy uses two molecules of ap-

proximately the same size but containing sequenc e

polymorphism . Waldman and Liskay used a HSV-t k

duplication in which one TK copy came from HSVtype 1 and the other copy from HSV type2 (homeol-

ogous recombination) . These TK genes share 81% of

homology . The authors observed that with 19% di -

vergence, the rate of intrachromosomal HR was re-

duced 1000 fold . relative to the rate of HR between

two identical HSV1-tk sequences . In contrast, th e

rate of intramolecular or intermolecular extrachro-mosomal recombination was only reduced by a fac -

tor 3 to 15 [44] . These results also argue in favor o fdistinct mechanisms between extrachromosomal an d

intrachromosomal recombination . Moreover, if effi-

cient intrachromosomal recombination required aminimum of 134 to 232 bp of uninterrupted homol-

ogy, a single-nucleotide heterology in this minimalregion of homology was sufficient to inhibit efficient

recombination [45] . in addition, when recombinatio n

initiates in a perfectly homologous sequence, it i s

able in a second step to propagate through an adja-cent sequences exhibiting 19% heterologies [45] . Fi-

nally, Yang and Waldman [46] show that gene con-

version involved transfer of uninterrupted blocks o f

information from 35 to more than 330 bp . Taken

together, these results are consistent with the notion

that more than 200 bp of homology are required to

initiate efficient gene conversion in mammalian cells .

This has also been foundsin in vitro reactions in cel l

free systems [47] .

1 .2 .3.3 . Effect of GT repeats . A variety of DN Asequences may play direct or indirect roles in recom-bination by their effects on the DNA structures . Itwas proposed that GT and GC repeats, which' canform Z-DNA, may influence recombination [48] . I t

has been shown that GT, GC repeats and minisatel-lite repeats, stimulated extrachromosomal recombina -

tion of transfected DNA [49,50] . However, using a n

intrachromosomal assay, a (GT),, repeat has bee n

shown to be unable to stimulate recombination an d

to influence the distribution of the recombinatio n

events [51] .

1 .2 .3 .4 . Transcription . Transcription stimulates ho-mologous recombination in S. cerevisiae [52,53] .Stimulation by transcription of extrachromosomalrecombination [54] and intrachromosomal recom-bination [55] has been reported in CHO cells . Allelestranscribed at high levels recombined about 2 to7-fold more frequently than identical alleles tran-scribed at low level . In line with this, preferentia lrepair of UV damage has been shown to abolish th etranscription–stimulation of HR [56], Finally, tran-scription has no effect on recombination induced b ya DNA double strand break [57] .

1 .3 . Stimulation of homologous recombination byDNA double strand breaks

In different species, DNA-damaging agents wereshown to stimulate homologous recombination . DNAdouble strand breaks (DSB) are the main lesio ninvolved in the stimulation of homologous recom-bination in different organisms . It is used to initiaterecombination during meiosis in yeast S . cerevisia e(for review, see Refs . [7,8]) . The DSB is also one o fthe most genotoxic lesion induced by ionizing radia -tion and can be repaired by two general mechanisms :(i) non homologous end joining (NHEJ), which doe snot necessarily involve sequence homologies andpromote the end-joining of the broken extremities ;(ii) homology-directed repair which involves homol-ogous sequences and corresponds to SE and SS Amechanisms . Ionizing radiation stimulates interalleli crecombination in the endogenous TK locus in ahuman lymphoblast cell line [58] . However, the ef-fect of ionizing radiation on intrachromosomal HRbetween tandem repeat sequences varies according t othe cells and/or to the substrates used. Althoûgh ,HR between two LacZ sequences in CV-1 cells i sstimulated by ionizing radiation [59], it does • no tstimulate HR between HSV-TK sequences in mous eL-cells [12] . The fact that the cell lines used ar edifferent could explain this result . Another explana-tion could involved the differences in the substrates ,LacZ vs . TK sequences . In the former case, recombi-nant are scored by coloration (p-galactosidase activ-ity) some hours following the treatment . In contras t

TK ' recombination events can he scored on surviv-ing,' several weeks after the treatment . Thus,

S. Lambert et al ./Mutation Research 433 (1999) 159–168

16 5

in the former system, recombination events can b e

scored before the death of the cells generally arisin g

several days after exposure to radiation . In contrast ,

the second system scores only surviving colonies . .Another way to produce DSB in target DNA use s

nucleases . Restriction enzymes corresponding to sin-gle sites present in the target were electroporated

into CHO cells or human cells [42,60] . In these

cases, recombination was increased by more than

10-fold . Electroporation of the rare cutting yeas t

endonuclease PI-SceI also stimulated recombination

provided there -was a corresponding cleavage site in

the duplication [60] . The yeast endonuclease I-Sce I

has provided a useful tool to study targeted DSB i n

mammalian cells, as already reviewed [61] . I-SceI

recognizes a cleavage site of 18 bp long . Due to thi s

large restriction sequence, there is probably no I-Sce I

site in the mammalian genome and expression of th e

I-SceI enzyme in mammalian cells is not toxic .

However, when the I-SceI restriction site is presen t

in the duplication, at least 80% of the molecules are

cleaved after transfection of a plasmid expressin g

I-SceI enzyme [62] . Induction of a site-directed DS Binto the recombination substrates strongly stimulatesboth homologous and non homologous recombina -

tion [63,64,57] . HR is stimulated 100 times butnon-homologous recombination is stimulated 1000

times [64] . However, using a physical analysis, ho-

mology-directed repair of I-SceI-induced DSB's i s

found to account for 30—50% of the observed event s

[65] . ISce-I induced recombination produced mainl y

deletion events (80%), that are interpreted as a resul t

from SSA . Finally, in contrast with spontaneous HR ,

transcription does not stimulate DSB-induced recom-bination [57], although ,w _e cannot exclude that th e

efficiency of DSB-stimulation is so great that i t

would mask the effect of transcription .

1 .4. Transgenic mice models

The assay using duplicated repeats to measur e

intrachromosomal recombination can be envisione d

in vivo in transgenic mice . In that case, recombina -

tion can only be recorded using genes giving a

coloration such as the Ç3-galactosidase gene, but no t

with a gene conferring resistance to a drug . Two

models were developed to-measure recombination in

specific tissues . One model has been developed toanalyze the lineage of cells in the myotome ; thus, th eexpression of the recombination substrate was drivenby a promoter which confers expression specificallyto cells of this compartment : the promoter of th ea-subunit of acetylcholine receptor. The descendant s

of the recombinant cells are histochemically identi-fied, permitting the analysis of the lineage, of cells i nthe intact embryos [66] . It appears that the frequenc yof recombination in this tissue is similar to th efrequency measured in cultured cells : between 1 and2 X 10-6 [66] .

Another transgenic model also uses a duplicatio nof 3-galactosidase genes driven by a meiosis specifi cpromoter. Germ line gene conversion was analyzedin transgenic male gametes . Spermatids which un-dergo intrachromosomal gene conversion produc efunctional 3-galactosidase (lacZ + ), visualized b yhistochemical staining . Approximately 2% of thespermatids, produced by a combination of meioti cand mitotic conversion events, were LacZ + [67] .

2 . Conclusions

Numerous differences exist between intrachromo-somal and extrachromosomal HR. For example, in-trachromosomic recombination is conservative whils t

plasmid recombination is non-conservative in mous eL-cells ; in addition heterologies and GT repeats dif-ferently affected plasmid and intrachromosomal re -combination . Moreover, the number of plasmi dcopies is not controlled and it is well established tha tplasmids are submitted to extensive nuclease attac kafter transfection . Chromatin structure and the nu-clear organization may also account for the differ-ences observed between plasmid and intrachromoso-

mal recombination . Thus, we believe it is most suit -

able to measure HR between two intrachromosoma l

tandem repeat sequences .The other possibilities to measure HR betwee n

two intrachromosomal sequences are interallelic an dectopic recombination, which are however techni-

cally complicate to set up . Furthermore, interalleli cHR as well as ectopic HR are rather inefficient i n

mammalian cells [68,42,69] . Finally, the possibilit yof using two different orientations of tandem repeats

166

S . Lambert et al./Mutation Research 433 (1999) 159–16 8

(direct or inverted) and the use of the rare-cutting Referencesendonuclease ISce-I provide a set of complementar yapproaches to study HR in mammalian cells .

Using these of strategies, connections betwee n

HR and other fundamental cellular processes hav e

been described . Firstly, transcription stimulates HR

but not DSB-induced HR [57] . Connections with cel l

cycle control and DNA repair have also been stud-

ied: alteration of ATM or p53 functions lead to anincrease of HR [18--20] ; carcinogens and DNA dam -aging agents treatments stimulate both gene conver-sion and deletion [12] . More generally, thé efficienc yof repair of DNA damages diminishes the stimula -tion of recombination [17,56] ; finally, inhibition ofPoly(ADP-ribose)polymerase (PARP) by 3-methoxy-benzamide increases recombination between 3 an d4-fold in mouse L-cells [70] .

Very little is known on the genetic control o fhomologous recombination in mammalian cells .

Overexpression of human RAD52 stimulates recom-bination between two lacZ direct repeats about 3-fold ,

in monkey cells and confers resistance to ionizing

radiation [59] . The Rad-52 stimulation acts via tii c

single stranded DNA binding protein RpA which i salso involved in replication and DNA excision repair[71] . One question would be to understand ho w

overexpression of only one component of a multipro-tein complex can stimulate the whole process, i .e . ,homologous recombination . One explanation coul dbe that Rad52 is the limiting factor of the complex .However, it has recently been shown that overex-pression of the Hamster Rad5l protein into CHO,also confers resistance to ionizing radiation and stim-ulates HR between direct repeat sequences [72] ; thisresult is not in accordance with this hypothesis . Thecombined analysis of HR between direct repeats ,between inverted repeats and of the DSB-induce dHR should afford essential information to understand

these process in mammalian cells .

Acknowledgement s

Thi~ work was supported by CEA, CNRS, ARC

(1366) and Electricité de France . We thank C . Whit e

and C . Ducray for helpful comments .

[1] S .A. Liebhaber, M . Goosens, Y .-K . Kan, Homology an d

concerted evolution at the al and a2 loci of human a-globin,

Nature 290 (1981) 26-29 .

[2] D . Baltimore, Gene conversion : some implications for im-

munoglobulin Genes, Cell 26 (1981) 295–296 .

[3] J .E . Haber, Mating type gene switching in Saccharomyce s

cerenisiae, TIG 8 (1992) 446–452 .

[4] L .H .T. Van der Ploeg, Antigenic variation in African try-

panosome, TIG 8 (1992) 452–457 .[5] C .A . Reynaud, V . Anquez, H . Grimai, J .-C . Weill, A hyper-

conversion mechanism generates the chicken light chain

preimmune repertoire, Cell 48 (1987) 379–388 .[6] R .S . Becker, K .L . Knight, Somatic diversification of

immunoglobulin heavy chain VDJ genes : evidence for so-

matic gene conversion in rabbits, Cell 63 (1990) 987–997 .[7] S .G . Roeder, Chromosome synapsis and genetic recombina -

tion, TIG 6 (1990) 385–389 .[8] N . Kleckner, Meiosis : how could it work?, Proc . Natl . Acad.

Sci . U .S .A . 93 (1996) 8167–8174.

[9] E .C . Friedberg, G .G . Walker, W. Siede, DNA Repair and

Mutagenesis, ASM Press, Washington, DC, 1995 .

[10] R .J. Bollag, AS . Waldman, R.M . Liskay, Homologous re -

combination in mammalian cells, Annu . Rev . Genet . 2 3

(1989) 199–225 .

[1 1] M . Amor, L .K . Parker, H . Globerrnan, M .L. New, P .C .

White, Mutation in the CYP21B gene (Ile-172-Asn) cause s

steroid 21-hydroxylase deficiency, Proc . Natl; Acad . Sci .

U .S .A . 85 (1988) 1600-1604 .

[12] Y . Wang, V .M . Maher, R .M. Liskay, J .J . Mc-Cormick ,

Carcinogens can induce homologous recombination betwee n

duplicated chromosomal sequences in mouse t. cells, Mol .

Cell . Biol . 8 (1988) 196-202 .

[13] D . Hellgren, Mutagen-induced recombination in mammalia n

cells in vitro, Mut .• Res . 284 (1992) 37–51 .

[14] D .L. Ludwig, J .R . Stringer, Spontaneous and induced homol-

ogous recombination between lacZ chromosomal direct re-peats in CV-1 cells, Somat. Cell . Mol . Genet . 20 (1994 )

11–25 .

[15] H. Zhang, T . Tsujimura, N .P . Bhattacharyya, V .M . Maher,

J .J . McCormick, 06-methylguanine induces intrachromoso-

mal homologous recombination in human cells, Carcinogene-

sis 17 (1996) 2229–2235 .[16] T . Tsujimura, V .M . Maher, A .R . Godwin, R .M . Liskay, J .J .

McCormick, Frequency of intrachromosomal homologous

recombination induced by UV radiation in normally repairin g

and excision repair-deficient human cells, Proc . Natl . Acad .

Sci . U .S .A . 87 (1990) 1566–1570 .

[17] N .P . Bhattacharyya, V .M . Maher, J .J . McCormick, Effect o f

nucleotide excision repair in human cells on intrachromoso-

i:u:l hoinologoiis rccombiinnion induced by UV and 1-nitro-

sohvrene, Mol . Cell . Biol . 10 (1990) 3945-3951 .[ 1 S] S .M . Mevn . High .tihnnl :Leeous int rilchromosoinal recombina -

tion rifles in iltaxiii — telangirdtasia, Science 26(11199?) 1327 -

1330 .

5 . Limbert et al ./Mutation Research 433 (1999) 159—168 16 7

[19] P . Bertrand, D . Rouillard, A. Boulet, C. Levalois, T . Soussi ,

B .S . Lopez, Increase of spontaneous intrachrornosomal ho-

mologous recombination in iammalian cells expressing . a

mutant p53 protein, Oncogene 14 (1997) 117—1122 .

[201 K .L . Mekeel, W. Tang, LA. Kachnic, C .-M . Luo, J .S .DeFrank, S .N . Powell, Inactivation of p53 results in highrates of homologous recombination, Oncogene 14 (1997 )1847—1857 .

[21] H.-W . Sturzbecher, B . Donzelmann, W . Henning, U . Knipp-schild, S . Buchhop, p53 is linked directly to homologou srecombination processes via RADS I /RecA protein interac-

tion, EMBO J . I5 (1996) 1992—2002 .

[22] S . Buchhop, M .K. Gibson, X .W . Wang, P . Wagner, H .-W .Sturzbecher, C .C . Harris, Interaction of p53 with the huma nRad51 protein, Nucleic Acids Res . 25 (1997) 3868—3874 .

[23] R. Scully, J . Chen, A . Plug, Y . Xiao, D . Weaver, J. Feun-teun, T . Ashley, D .M . Livingston, Association of BRCA 1with Rad51 in mitotic and meiotic cells, Cell 88 (1997 )265—275 .

[24] R . Mizuta, J .M . LaSalle, H .-L. Cheng, A . Shinohara, H .Ogawa, N . Copeland, N .A . Jenkins, M . Lalande, F.W . Alt ,RAB22 and RAB 163/mouse BRCA2 : proteins that specifi-

cally interact with the RAD51 protein, Proc . Natl . Acad . Sci .

U.S .A . 94 (1997) 6927-6932 .

[25] L.Y . Marmorstein, T . Ouchi, S .A. Aaronson, The BRCA2gene product functionally interacts with p53 and RAD51 ,

Proc . Natl . Acad . Sci . U .S .A . 95 (1998) 13869-13874 ,

[26] LL. Klein, Cent:tic control of illuacilfoillosotl,ai recombina -tion, BioEssays 17 (1995) 147—159 .

[27] E .L. Ivanov, N . Sugawara, J . Fishman-Lobell, J .E . Haber ,Genetic requirements for the single-strand annealing pathwa yof double-strand break repair in Saccliarornvices cerec'isicie ,

Genetics 142 (1996) 693-704 .

[28] N . Sugawara, F. Pâques, M . Colaiàcovo, J .E. Haber, Role o fMsh2 and Msh3 repair proteins in double-strand break in-

duced recombination, Proc . Natl . Acad . Sci . U .S .A . 94 (1997 )9214-9219 .

,29] R .M . Liskay, J .L. Stachelek, A . Letsou, Homologous recom-bination between repeated chromosomal sequences in mous ecells, Cold Spring Harbor Svmp . Quant . Biol . 49 (1984 )183—189 .

' 30] R .J . Bollag, R .M . Liskay, Conservative intrachromosoma lrecombination between inverted repeats in mouse cells : asso-

ciation between reciprocal exchange and gene conversion ,Genetics 119 (1988) 1 61—169 -

31] A . Letsou, R .M. Liskay, Effect of the molecular nature o f

mutation on the efficiency of intrachromosomal gene conver-

sion in mouse cells, Genetics 117 (1987) 759-769 .321 F .L. Lin, K . Sperle, N . Sternberg, Model for homologou s

recombination during transfer of DNA into mouse E . cells :

role for DNA ends in the recombination process, Mol, Cell .Biol . 4 (1984) 1020-1034 .

33] S . Chakrabartt, M .M . Seidman, Intramolecular reco :ob :lllltlt) nbetween transl'ectcd sequences in i :a nmalian cells is non -conservative, Mol . Cell . 111 :0 . h (1986) 2520-2526 .

i4] F. Lin, K . Slerls, N . Sternberg, l ;xtrachminosoiii g I rcc coni-

hinatic)n in lluinlnrlliitn cells its studied v ïllt sin~lc

iiitcl

double stranded DNA substrates, Mol . Cell . Biol . 7 (1987 )129-140 .

[35] R . Holliday . A mechanism for gene conversion in fungi ,Genet . Res . 5 (1964) 282—306 .

[36] M .S . Meselson, C .M . Radding, A general model for geneti crecombination, Proc . Natl . Acd . Sci . U .S .A . 72 (1975)358-361 .

[37] J .W . Szostak, T .L. Orr-Weaver, R .J . Rothstein, F . Stahl, The

double-strand-break repair model for recombination, Cell 3 3(1983) 25—35 .

[38] J . Rommelaere, A . Miller-Faures, Detection by density equi-

librium centrifugation of recombinant-like DNA molecules i nsomatic mammalian cells, J . Mol .. Biol . 98 (1975) 195—218 .

[39] P .D . Moore, R . Holliday, Evidence for the formation o fhybrid DNA during mitotic recombination in Chinese ham-ster cells, Cell 8 (1976) 573-579 .

[40] B . Lopez, S . Rousset, J. Coppey, Homologous recombinatio nintermediates between two duplex DNA catalysed by huma ncell extracts, Nucleic Acids Res . 15 (1987) 5643—5655 .

[41] R .J . Bollag, U .R. Elwood, E .D . Tobin, A :R . Godwin, R .M .Liskay, Formation of heteroduplex DNA during mammalia nintrachromosomal gene conversion, Mol . Cell . Biol . 12(1992 )1546—1552 .

[42] A .R . Godwin, R .J . Bollag, D .M . Christie, R.M . Liskay ,Spontaneous and restriction enzyme-induced chromosoma lrecombination in mammalian cells, Proc . Natl . Acad . Sci .U .S .A . 91 (1994) 12554-12558 .

[431 K .M . Liskay, A . Letsou, J .L . Stachelek, Homology require-ments for efficient gene conversion between duplicated chro-

mosomal sequences in mammalian cells, Genetics 115 (1987 )161—167 .

[44] AS . Waldman, R .M . Liskay, Differential effect of base-pai r

mismatch on intrachromosomal versus extrachromosomal re -combination in mouse cells, Proc. Natl . Acad . Sci . U .S .A . 84(1987) 5340-5344.

[45] AS. Waldman, R .M . Liskay, Dependence of intrachronioso-

illal recombination in mammalian cells on uninterrupted ho-mology, Mol . Cell . Biol . 8 (1988) 5350-5357 .

[46] D . Yang, A .S . Waldman, Fine-resolution analysis of product sof intrachrotilosotltal homeologous recombination in mam-malian cells, Mol . Cell . Biol . 17 (1997) 3614—3628 .

[47] B .S . Lopez, P . Bertrand-Mercat, E . Corteggiani, J . Coppey ,

Directional recombination is initiated at a double strandbreak in human nuclear extracts, Nucleic Acids Res . 2 0(1992) 501-506 .

[48] J .A. Blaho, R .D . Wells, Left-handed Z-DNA and geneticrecombination, Prog . Nucleics Acid . Res . Mol . Biol . 3 7(1989) 107-126 .

[49] W .P . Welds, P .D . Moore, Homologous recombination en-h :utceillent conferred by the Z-DNA motif d(TG)30 is abro-

gated by Simian Virus 4() T antigen binding to adjacent DN Asequences . Mol . (0.11 . Biol . 1() (1990) 794-800 .

[50] W .P . Wiihis, 1 . .J . Wallas . P .D . Moore, Nyperviu iahl` win-

isatcllite 1)NA is a hotshot ha homologous rccoiuibiiullion i nhonour cells . ('cil O l ) (19901 95--103 :

[51] R .(1 . Sti 'ot . k .V Merl ihew . IZ . Nairn . (I . Adair, M . Mouth .1 .11 .

`~ f ils~~il .

lllc

lii((licitrc ~)f

il (( 1 " I ' ) 2 () nlicrrni+tc{liie ~c, .

168 S . Lambert et at. /Mutation Research 433 (1999) 159—16 8

quence on homologous recombination in the hamster adeninephosphoribosyl transferase gene, Nucleic Acids Res . 2 4(1996) 746-753 .

[52] B .J . Thomas, R . Rothstein, Elevated recombination rates i ntranscriptionally active DNA, Cell 56 (1989) 619—630 .

[53] K . Voelkel-Meiman, R.L. • Keil, G .S, Roeder, Recom-bination-stimulating sequences in Yeast Ribosomal DN Acorrespond to sequences regulating transcription by RNApolymerase I, Cell 48 (1987) 1071—1079 .

[54] J.A . Nickoloff, R.J. Reynolds, Transcription stimulates ho-mologous recombination in mammalian cells, Mol . Cell .Biol . 10 (1990) 4837-4845 .

[55] J.A . Nickoloff, Transcription enhances intrachromosomal ho-mologous recombination in mammalian cells, Mol . Cell .Biol . 12 (1992) 5311—5318 .

[56] W .P . Deng, J .A . Nickoloff, Preferential repair of UV damag ein highly transcribed DNA diminishes UV-induced intrachro-mosomal recombination in mammalian cells, Mol. Cell . Biol .14 (1994) 391-399 .

[57] D .G . Taghian, J .A. Nickoloff, Chromosomal double-stran dbreaks induce gene conversion at high frequency in mam-malian cells, Mol . Cell . Biol . 17 (1997) 6386—6393 . :

[58] M .B . Benjamin, J.B . Little, X-rays induce interallelic homol-ogous recombination at the human thymidine kinase gene ,Mol . Cell. Biol . 12 (1992) 2730—2738 .

[59] M .S . Park, Expression of human RAD52 confers resistanc eto ionizing radiation in mammalian cells, J . Biol . Chem . 27 0(tooç) 15AO'7 1 547 0

[60] M . Brenneman, F .S . Gimble, J .H . Wilson, Stimulation o fintrachromosomal homologous recombination in human cell sby electroporation with site-specific endonuclease, Proc . Natl .Acad. Sci . U .S .A. 93 (1996) 3608—3612 .

[61] M . Jasin, Genetic manipulation of genome with rare-cuttin gendonucleases, TIG 12 (1996) 224—228 .

[62] P . Rouet, M . Jasin, Introduction of double-strand breaks int othe genome of mouse cells by expression of a rare-cuttin gendonuclease, Mol . Cell . Biol . 14 (1994) 8096-8106 .

[63] P . Rouet, F. Sih, M . Jasin, Expression of a site-specifi cendonuclease stimulates homologous recombination in mam-malian cells, Proc, Natl . Acad. Sci . U .S .A. 91 (1994) 6064-6068 .

[64] G .R . Sargent, M .A. Brenneman, J .H. Wilson, Repair ofsite-specific double-strand breaks in à mammalian chromo -some by homologous and illegitimate recombination, Mol .Cell . Biol . 17 (1997) 267-277 .

[65] F. Liang, M . Han, P .J . Romanienko, M . Jasin, Homology-di-rected repair is a major double-strand break repair pathwayin mammalian cells, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S .A . 95 (1998 )5172—5177 .

[66] C . Bonnerot, J .-F. Nicolas, Clonal analysis in the intac tmouse embryo by intragenic homologous recombination, C .R . Acad. Sci . Paris 316 (1993) 1207—1217 .

[67] J .R . Murti, M. Bumbulis, J .C . Schimenti, High-frequenc ygerm line gene conversion in transgenic mice, Mol . Cell .Biol . 12 (1992) 2545—2552 .

[68] F .-L. Lin, N . Sternberg, Homologous recombination betwee noverlapping thymidine kinase gene fragments stably inte-grated into mouse cell genome, Mol. Cell . Biol . 4 (1984 )852-861 .

[69] M.J . Shulman, C . Collins, A. Connor, L.R . Read, M .D .Baker, Interchronsosomal recombination is suppressed i nmammalian somatic cells, 14 (1995) 4102-4107 .

[70] AS . Waldman, B .C . Waldman, Stimulation of intrachrmoso-mal homologous recombination in mammalian cells by in-hibitors of poty(:ADP-ribosylation), Nucleic Acids Res . 1 9(1991) 5943—5947 .

[71] M .S . Park, D .L. Ludwig, E . Stigger, S .-H. Lee, Physica linteraction between human RAD52 and RPA is required fo rhomologous recombination in mammalian cells, J . Biol .Chem . 271 (1996) 18996—19000 .

[72] S . Vispé, C . Cazaux, C. Lesca, M . Defais, Overexpression o fRad51 protein stimulates homologous recombination and in -creases resistance of mammalian cells to ionizing radiation ,Nucleic Acids Res . 26 (1998) 2859—2864 .

Oncogene (1999) 18, 4515-452 1© 1999 Stockton Press All rights reserved 0950-9232/99 $12 .00

http://wvm .stockton-press .co .uk/on c

Human POMp75 is identified as the pro-oncoprotein TLS/FUS : bothPOMp75 and POMp100 DNA homologous pairing activities areassociated to cell proliferation

Pascale Bertrand"' 2' 4 , Alexandre T Akhmedov 2' 4,5 , Fabien Delacote l , Antoine Durrbach' an dBernard S Lopez*''° 2

'CEA, DSV, DRR, CNRS UMR 217, 60-68 ay . du Général Leclerc, BP6, 92265, Fontenay aux Roses, France ; 2lnstitut Curie ,

Section de Biologie, 26 rue d'Ulm, 75231 Paris Cedex 05, France ; 3 Groupe Hospitalier Bichat-Claude Bernard, 46 rue Henr i

Huchard, 75877 Paris Cedex 18, France

We have previously developed an assay to measure DN Ahomologous pairing activities in crude extracts : ThePOM blot . In mammalian nuclear extracts, we detectedtwo major DNA homologous pairing activities :POMp100 and POMp75 . Here, we present the purifica-tion and identification of POMp75 as the pro-oncopro-tein TLS/FUS. Because of the pro-oncogene status o fTLS/FUS, we studied in addition, the relationshipsbetween cell proliferation and POM activities . We sho wthat transformation of human fibroblasts by SV40 largeT antigen results in a strong increase of both POMp10 0and TLS/POMp75 activities . Although detectable levelsof both POMpIOO are LS/r OMp 7 5 areobserved i nnon-immortalized fibroblasts or lymphocytes, fibroblast sat mid confluence or lymphocytes stimulated byphytohaemaglutinin, show higher levels of POM activ-ities . Moreover, induction of differentiation of mouse F 9line by retinoic acid leads to the inhibition of bot hPOMp100 and TLS/POMp75 activities . Comparison ofPOM activity of TLS/FUS with the amount of TL Sprotein detected by Western blot, suggests that the PO Mactivity could be regulated by post-translation modifica-tion. Taken together, these results indicate tha tPOMp100 and TLS/POMp75 activitites are present innormal cells but are connected to cell proliferation .Possible relationship between cell proliferation, responseto DNA damage and DNA homologous pairing activit yof the pro-oncoprotein TLS/FUS are discussed .

Keywords : TLS/FUS; DNA homologous pairing; cellproliferation ; recombinatio n

Introductio n

DNA homologous pairing (DHP), a central step inhomologous recombination, is implicated in funda-mental processes such as chromosome pairing (Roeder ,

1990 ; Kleckner, 1996), gene inactivation (Rossignoland Faugeron, 1994), initiation of some replicatio nprocesses (Formosa and Alberts, 1986 ; Malkova et al . ,

1996) and DNA repair (Friedberg et al ., 1995) .

*Correspondence : BS Lope z4 The first two authors contributed equally to this stud y

5 Current address : Basel Institute for Immunology, Grenzacherstrass e487 Postfach, CH-4005 Basel, Switzerlan dReceived 1 April 1999 ; revised 29 June 1999 ; accepted 29 June 1999

The RecA protein from Escherichia coli representsthe paradigm for DHP proteins . In vivo its role inmutagenesis, DNA repair and recombination is wel ldocumented . In vitro, RecA protein is able to pairsingle stranded DNA (ssDNA) with double strandedDNA (dsDNA) in a homology dependent manner (forreview see Roca and Cox, 1990 ; Radding, 1991 ; West ,1992; Kowalczykowski and Eggleston, 1994) . Besidesthe RecA protein, the bacterial RecO and RécTproteins are also able to promote in vitro D-loopformation, the first DNA heteroduplex intermediateformed between recombining DNA (Luisi-DeLuca,1993 ; Noirot and Kolodner, 1998) .-"I-n- euita.lybtes th esituation gains in complexity . The Saccharomycescerevisiae ScRad51 protein displays structural an dbiochemical similarities with RecA protein (Abous-sekhra et al., 1992 ; Basile et al., 1992 ; Shinohara et al . ,1992 ; Sung, 1994). However, S . cerevisiae possesse sthree other recA homologues : RAD55, RAD57 (Kansand Mortimer, 1991 ; Lovett, 1994) and the meiosi sspecific DMC1 (Bishop et al., 1992) . In mammaliancells, the situation seems to be even more complex .Indeed, a growing number of Rad5l homologues ar ereported . They include : RAD51, HsREC2/RAD51 B ,RAD51C, RAD51D, XRCC2 and XRCC3 (Shinoharaet al., 1993 ; Yoshimura et al., 1993 ; Albala et al., 1997 ;Rice et al., 1997; Dosanjh et al ., 1998 ; Pittman et al. ,1998 ; Cartwright et al ., 1998). Additionally, a humanDmcl protein able to promote in vitro D-loopformation has been reported (Li et al ., 1997) .Mammalian RAD51 protein has developed newfunctions since, in contrast with recA in bacteria andwith ScRAD51 in yeast, it is an essential gene probabl yinvolved in cell proliferation (Tsuzuki et al., 1996 ;Yamamoto et al ., 1996) . Human Rad5l protein hasalso been described as interacting with tumorsuppressor proteins such as p53, Brcal and Brca2(Sturzbecher et al ., 1996 ; Buchhop et al ., 1997 ; Scullyet al ., 1997 ; Mizuta et al., 1997 ; Marmorstein et al. ,1998) .

Facing this extreme complexity and both structuralhomologues and enzymatic activities redundancy, th ebiochemical screen for new DHP activities i nmammalian cells constitutes a possible complementar yapproach . However, this approach has often beencompromised by the presence of exonuclease activitie sthat can lead to artefacts (Kaslan and Heyer, 1994) .We have developed an in vitro assay to measure DNAhomologous pairing activities on nitrocellulose mem-branes: the POM (Pairing On Membrane) blot(Bertrand et al., 1993). The main characteristics of

TLS/POMp75 DNA pairing activity in cell proliferatio nP Bertrand et a l

-516the RecA-mediated pairing reaction are conserve dunder the POM blot conditions (Bertrand et al . ,

1993, 1995) . In mammalian nuclear extracts, the assayhas revealed two major homologous pairing activities ,displayed by proteins of apparent molecular weight o f100 kDa (POMpl00) and 75 kDa (POMp75) . Animportant characteristic of these proteins is that the yare able to promote stable DNA plectonemic jointformation without requiring associated exonucleas eactivity (Akhmedov et al., 1995) . Recently, POMp 100activity has been reported to be increased in extractsfrom Fanconi anemia cells, a hereditary syndrom eassociated with cancer predisposition, hypersensitivityto DNA interstrand crosslinks and genome instabilit y(Thyagarajan and Campbell, 1997). Human POMp7 5(HsPOMp75) activity is also increased in Ataxi aTelangiectasia (AT) cells (manuscript in preparation) ,a hereditary syndrome associated with cancer predis-position, cell cycle defects, increased sensitivity t oionizing radiation and a high level of spontaneou shomologous recombination (Meyn, 1993 ; Luo et al . ,

1996) .In the present study, we describe the purification of

POMp75 and its identification as the human pro -oncogene TLS (also named FUS) . TLS (Translocate din LipoSarcomas) is a member of a family of genes ,that include the Ewing sarcoma (EWS) gene an d1iiAT /Tl /' C~

,. : .. ~-associates.+~ iio TTTTT >i I'IIL Gild.~ RNA

~i

Tt i'(-II)UO polylilei

ase II (Bertolotti et al ., 1996). In sarcomas orleukemias, chromosomal translocation of TLS orEWS with specific partners creates fusion oncopro-teins (Delattre et al., 1992 ; Çrozat et al., 1993 ;Rabbitts et al ., 1993 ; Ichikawa et al., 1994) .However, despite intense investigations, little i sknown about the function of the cellular genes(Ron, 1997) . Our results suggest a new role fo r

TLS: promotion of DNA homologous pairing . Inaddition, considering TLS is a pro-oncogene and th epossible role for the major DHP protein, Rad5l i ncell proliferation, we have analysed the relationshi pbetween the DHP activity of TLS/POMp75 and cel l

proliferation .

Results

Identification of POMp75 as TLS/FU S

Using the POM blot assay, we have previouslycharacterized a '75-kDa DHP activity (P0M75) i nhuman nuclear extracts, that does not require anassociation with exonuclease activity to pair homo-logous DNA (Akhmedov et al ., 1995) . To identify theP0M75 protein, we fractionated protein extracts b ycolumn chromatography and screened for the P0M7 5activity by using the POM blot assay on eac hchromatography fraction (see Materials and meth -

ods) . As shown in Figure la, POMp75 activity elute dwith a polypeptide of an apparent 75-kDa molecula r

weight .The purified HsPOMp75 was additionally resolve d

on a long SDS – PAGE gel and the band containing th eprotein was excised and used to raise polyclonalantibody against POMp75 and to perform microse-quencing of POMp75 . Microsequencing yielded four

peptides (Figure lb) . A search of the database revealed

that they all belong to the human TLS/FUS protei n(Crozat et al ., 1993 ; Rabbitts et al., 1993) .

To confirm this result, we performed two additionalexperiments . First, TLS was immunoprecipitated fromnuclear extract with the monoclonal anti-TLS 4H1 1antibody (Zinzsner et al ., 1997) . HsPOMp75 activity i srecovered in the TLS immuno-conjugate as POMP 10 0is not (Figure 2a) . Thus the monoclonal anti-TLSantibody specifically recognizes the POMp75 activity .Second, the cDNA encoding TLS has been cloned in aGST-fusion bacterial expression vector . In bacteriatransfected with the fusion construct, both anti-GSTand anti-POMp75 antibodies (raised against' th eprotein purified here) recognize a peptide with amolecular weight corresponding to the fusion GST-TLS protein (Figure 2b) .

TLS/FUS activity has been described to beimportant for the growth factor independence o fBCR/ABL transformed cells (Perrotti et al ., 1998) .We thus examined the DHP activity displayed by TL Sin different conditions known to modulate cellproliferation .

Transformation offibroblasts with SV40 large T antigenstimulates POM activities

We have analysed the POM activities in three differentpiiaia ry- fibroblast strains and- in their- correspondin gSV40 transformed derivatives (Figure 3a) .

It has been reported previously that POM activitie swere undetectable in non immortalized cells (Thyagar-ajan et al., 1996). We show here that at least tw odifferent strains of fibroblasts (AS3 and 1 BR) exhibi tdetectable POMp100 and TLS/POMp75 activitie s(Figure 3a) . However, in the SV40 transformed cel llines, POMp100 and TLS/POMp75 activities are

265

peptide 1 : FGGPRDQGSRH D

31 7

peptide 2 : TGQPMINLYTDRETG335

peptide 3 : GEATVSFDDPPSA K349

peptide 4 : AAIDWFDG K

Figure I (A) Purification of HsPOMp75 from HeLa cell nuclei .Aliquots of peak fraction from each step were analysed by SDS —PAGE followed by coomassie staining (left panel) and by PO Massay (right panel) . HsPOMp75 co-purified with a polypeptide o fan apparent of 75-kDa molecular weight (Fractions II, IIIb, IV) .IIIb corresponds to the flow through and IIIc to one elutedfraction from the DEAF column . HsPOMp75 was resolved on along 9% SDS—PAGE . Pure HsPOMp75 polypeptide was excisedand microsequenced . (B) Peptide sequences of HsPOMp75,numbers correspond to amino acid residues in TLS sequenc e(Crozat et al., 1993 : Rabbitts et al., 1993 )

A .

`E- POMp7 5

POM blo tCoomassle blu e

B .

stimulated. Quantification of pairing activities inprimary and SV40-transformed fibroblasts cell line sindicates a ninefold increase for POMP l00 and afivefold for POMp75 in AS3wt2 compared to AS3 .Similar differences are observable between IBr an dlBr-SV. The difference is more pronounced betweenJacquot-SV and Jacquot since we do not detect PO Mactivity in the Jacquot fibroblast strain (Figure 3a) .When comparing the activities by POM blot (Figur e3a) to the amount of TLS protein detected by wester nblot (Figure 3b), it appears that the POM activity i snot directly related to the amount of TLS protein . This

B .cçr-Tr S

HNE PC 1P -TLS

. - GST-TL S

A .

Ab :

anti-GST

anti-POMp75

Figure 2 Identification of POMp75 as TLS/FUS . (A) POM blot :anti-TLS antibody can immuno-precipitate POMp75 activity inhuman nuclear extracts . HNE: HeLa nuclear extract . PC :Preclear. IP-TLS : immunoprecipitation with anti-TLS antibod y(see Materials and methods) (B) Western-blot: Anti-POMp7 5antibodies recognize TLS expressed in bacteria . Bacteria contain-ing either the GST-TLS fusion (+) or the empty expressio nvector (—) were induced with IPTG. Protein extracts wer eanalysed by Western blot with the anti-GST antibody (leftpanel) or the anti-POMp75 antibody (right panel)

TLS/POMp75 DNA pairing activity in cell proliferatio nP Bertrand et al

451 7indicates that some post-translation regulation maystimulate the POM activity of TLS protein . Other type sof immortalized cells (HeLa, L-cells, F9) show highlevel of POM activities, comparable to those observedin SV40 transformed fibroblasts . This suggests that theincrease in POM activities is a common response to cel limmortalization . One possible explanation is that th estrong increase in POM activities is related to a nincrease in cell proliferation which is a commoncharacteristic of transformed cell lines .

POM activities are stimulated in proliferating cells

If POM activities are correlated to cell proliferation,the state of confluence of primary fibroblasts shoul dinfluence the extent of these activities . This may explai nwhy in some respects no POM activities were detecte din extracts from primary fibroblasts (Thyagarajan e tal ., 1996) .

Thus we compared POM activities in extracts fro mcells harvested at mid confluence (i .e . proliferatingcells) to ones extracted from cells harvested .at highconfluence, i .e . in a quiescent state (Figure 4) . AS3fibroblasts harvested at mid confluence show a twofol dincrease in POM activity compared to extracts fro mquiescent cells . These results suggest that both PO Mactivities are correlated to the proliferation status o fthe- cells:-

To confirm this interpretation, we examined th ePOM activities in lymphocytes from peripheral bloo dafter treatment with PHA, a high efficient mitoge nstimulator . POMp 100 and TLS/POMp75 are bothclearly detected in non stimulated lymphocytes ,confirming their activity in non-immortalized cell s(Figure 5) . After addition of PHA, a twofoldstimulation for POMp 100 and a sevenfold stimulatio nfor TLS/POMp75 are detected (Figure 5, left panel) .The amount of TLS protein measured by western blo t(Figure 5, right panel) is not directly correlated to th eextent of POM 75 activity . These results support thehypothesis that POM activities are regulated by post -translation regulation and are increased in proliferatin gcells .

aC)

l'

.*-POMpIOO

POM blotfP0Mp7 5

'4 -POMp75

POMp100

POMp75

A.

B .

Figure 3 (A) Stimulation of POM activities by SV40 transforma-tion . (B) Western blot using an anti-TLS antibody . AS3, Jacquot ,1BR : non-transformed human fibroblasts . AS3wt2, Jacquot-SV ,1BR-SV : corresponding SV40-transformed fibroblasts

Figure 4 Confluence inhibits POM activities . Histograms showthe measurement of POM activities by Phosphorlmager . C :confluent cell culture ; NC: half-confluent cell culture . Th efibroblasts strain was AS3


518

Differentiation inhibits POM activities

Induction of differentiation leads to an arrest of cellproliferation . Therefore, if POM activities are linked t ocell proliferation, induction of differentiation shoul dinhibit these activities .

The F9 . line (or EC) is a mouse teratocarcinoma linethat can be induced to differentiate by addition o fRetinoic Acid (Strickland et al ., 1980) . In the presenc eof retinoic acid, POM activities show an eightfol ddecrease for both POMp100 and POMp75 (Figure 6 ,left panel) . cAMP alone does not induce differentiatio nper se, but potentiates the effect of retinoic acid .Consistent with this, treatment of F9 cells with cAM Palone has no effect on POM activities, while doubl etreatment with retinoic acid plus cAMP results in amore pronounced inhibition (13-fold for POMplO Oand 60-fold for POMp75) than treatment with retinoi cacid alone (Figure 6, left panel). Differentiationinduction also leads to a decrease in the amount o fTLS protein detected by Western blot (Figure 6, righ tpanel) . However the effect is much more pronouncedon the activity than on the amount of protein (compar eFigure 6, left and right panel) .

Moreover, POM activities are also inhibited (nine -fold for POMp 100 and fivefold for POMp75) in HL6 0cells, 48 h after treatment with DMSO, a differentia -tion

Y

TheseYt

i Yu r Inducesl

rui this oeil =line (dal .[1Gl shown)

. results indicate that both POMp 100 and TLS/POMp7 5

Figure 5 PHA stimulates POM activities in lymphocytes fro mperipheral blood (left panel) . Western blot using an anti-TL Santibody (right panel) . Lymphocytes from peripheral blood weregrown in absence (mock) or in presence of 5 ( -*/ml PHA durin g48 h

POM blot

Western blo tanti-TL S

Figure 6 Induction of differentiation inhibits POM activities i nmouse F9 line (left panel) . Western blot using an anti-TL Santibody (right panel) . Cells were treated with cAMP, retinoi cacid (Ret . Ac .) or both reagents (Ret . Ac. +cAMP) . 0 ---=mocktreated control cells

activities are inhibited by activating differentiation .These results also confirm that both POMplOO an dTLS/POMp75 activities are associated with cellproliferation .

Discussion

Using the POM blot assay, we described previouslytwo DNA homologous pairing activities in mammalia nnuclear extracts : POMp100 and POMp75 . Interest-ingly, neither POMplOO nor POMp75 require asso-ciated exonuclease activities to promote homologouspairing (Akhmedov et al., 1995) . In this study, we sho wthat the cellular form of the pro-oncoprotein TLS/FU Sis identical to POMp75 . TLS/FUS is a RNA (Zinszneret al., 1997) and a DNA binding protein (Perrotti etal., 1998) . We show here that the DHP activit yexhibited by TLS/FUS (POMp75) varies as a functionof cell proliferation in different cell types: fromdifferent tissues (transformed or primary fibroblasts ,lymphocytes, embryonic cells), from different mamma-lian species (human, mouse) . However, the compariso nof the amount of TLS protein measured by Wester nblot and DHP activities detected by POM blot,suggests a post translation modification of TLS,regulating its DHP activity. TLS has been shown t oeé a target of the kinase c-Abl that could represent agood candidate for the regulation of TLS activity o nthe DNA (Perrotti et al., 1998) . In contrast to what ha sbeen published previously (Thyagarajan et al., 1996) ,we clearly detect both POMplOO and TLS/POMp7 5activities in non immortalized fibroblasts, the level o fthese activities depending on the state of confluence o fthe cells . This observation was confirmed by theunambiguous detection of POMplOO and TLS /POMp75 activities in non immortalized lymphocytes .Fibroblasts transformed by SV40 display a stron gstimulation of POM activities . These results ar econfirmed by the stimulation of POM activities b ythe mitogen activator PHA in human non-immorta-lized lymphocytes. We also show that induction o fdifferentiation leads to the inhibition of POM activities .Taken together, the results show that both POMplO O

d TLS/POMp75 activities are associated with cellproliferation . Therefore, the state of confluence isimportant when comparing POM activities in extractsof primary fibroblasts . It cannot be excluded that TL Sis associated to cell proliferation via its role in RNAprocessing. Indeed, TLS, EWS and TAF(II)68 hav ebeen described to be associated with the transcriptionmachinery TFIID and the RNA. polymerase II(Bertolotti et al ., 1996) . However since DNA-repairand recombination proteins can interact with the RN Apolymerase II (Maldonado et al., 1996), it is no tknown whether TLS plays two different roles (one i nRNA processing and the other in DNA metabolism) o rwhether the two functions are connected . Interestingly ,it has been shown that RecA protein displays affinityfor RNA (Golub et al ., 1992) .

Rad5l, the major eukaryotic DHP protein, has alsobeen reported to be associated with cell proliferatio n(Tsuzuki et al ., 1996 ; Yamamoto et al ., 1996) andRad5l devoid chicken cells accumulate chromosom ebreaks during the G2/M phase leading to cell deat h(Sonoda et al., 1998) . This raises the question of how

mock PHA

POMp1o0 –►

POMp75 —1

POM blot

(kDa )

-120-

- 72-

- 42-

mock PHA

Western blo tanti-TL S

POMpIOO –► -

POMp75 –► -4–POMp7 5

(kDs )

-120-

-72

DHP activities can participate in cell proliferation. Onehypothesis relies on the fact that strand exchange o fhomologous DNA is associated with some particularreplication events in bacteria (Hong et al ., 1996) ,phages or virus (Formosa and Alberts, 1986 ; Bortner etal ., 1993) . Also, in both prokaryotes and eukaryotes ,one of the post replication repair processes uses DN Astrand exchange (for review see Friedberg et al., 1995) .More specifically, replication initiated by strandexchange at a double strand break site has bee ndescribed in yeast ; some of these events requiring apathway independent of RAD51 (Malkova et al. ,1996). Finally, a role for Rad51 during replication inmammalian cells has been discussed elsewhere(Edelmann and Kucherlapati, 1996) .

In sharp contrast with the simple annealing of twocomplementary ssDNA, DHP is a more complexprocess, during which a search for homology takesplace on one duplex DNA partner . This reactionrequires highly specialized proteins and allows th erepair of breaks in the DNA (Meselson and Radding ,1975 ; Szostak et al., 1983) . In yeast, this process i sinvolved in chromosome pairing during meiosis and i nresistance to radiation, both processes involving th erepair of DNA double strand breaks (Roeder, 1990 ;Kleckner, 1996) . The relevance of the DHP activity forTLS/FUS may be attested to by the phenotype of th enull mutant mice . indeed, 1LS- - mice exhi b itenhanced radiation sensitivity and male sterility dueto chromosome pairing defects during meiosis (D Ron ,personal communication) . Interestingly, phosphoryla-tion by c-Abl stimulates the DNA binding activity o fTLS (Perrotti et al ., 1998), which is on the other han da prerequisite for DHP . Indeed, c-Abl is expressed a thigh levels in 'spermatocytes, cABL-'- mice exhibi tdefects of spermatogenesis (Kharbanda et al., 1998) ;and c-Abl is activated by ionizing radiation (Khar-banda et al ., 1995) . Taken together, these observation ssuggest that the DHP activity of TLS/FUS/POMp7 5may be modulated by c-Abl, in response to DNAdamage. In contrast, phosphorylation by c-Ab linactivates the DHP activity of HsRad5l (Yuan e tal ., 1998). Because of this antagonistic effect, it istempting to speculate that RAD51 and TLS couldrepresent alternative DHP pathways. Work is inprogress to address this question .

Materials and method s

Reagent s

Nitrocellulose membranes Hybond C-super (0 .2 and 0 .45 pm)were purchased from Amersham. ATP, ATPyS, dNTPs ,protease inhibitors, Proteinase K, DNA restriction an dmodification enzymes were purchased from BoehringerMannheim .

DNA

Wild type bacteriophage M13 duplex and ssDNA wereprepared as described (Sambrook et al ., 1989) . Duplex DNAwas labeled with "P by filling in the 5 ' protruding ends usingDNA Polymerase I large fragment, as described (Sambrooket al., 1989) .


451 9Plasmids

The HsTLS cDNA was amplified by PCR from a plasmi dcontaining the TLS cDNA and using primers Lina l(TAGCCGCTCGAGAACCTAGGACTGCAGGGATCCG-CC TCAA AC GATT AT AC CC AA CA AG CA AC CC) an dLina2 (CTAGCCCAAGCTTCTCGAGGGGGAGCCAGG-CTAATTAATACGGCCT) which contain BamHI and Xholsites respectively . After digestion, the PCR product wa sinserted into pGEX-4T-1 (Pharmacia Biotech) digested wit hBarnHI/XhoI . The resulting plasmid was named TLS-pGE X(pBL85) in which TLS is fused to a GST tag .

Bacterial expression

Xl2blue bacteria (Stratagene) were transformed with pBL8 5or pGEX 4T-l . Ten ml of bacteria containing either pBL8 5or empty pGEX4T-1 expression vector were grown at 37°C inLB medium to OD – 0 .25 followed by induction with 0 .5 m M

isopropyl /3-D-thiogalactoside for 90 min . The cells wereharvested and lysed in Laemmli buffer (50 pl) . The sampleswere boiled 5 min and resolved on a 10% SDS–PAGE gel .

Western immunoblots and immunoprecipitatio n

For GST–TLS protein detection, western blot wasperformed using standard methods with a 1/10 000 dilutionof primary anti-POMp75 antibody in TBST buffer (10 m M

Tris, pH 8/150 mM NaCl/0 .05% Tween-20) and reveale d ng a . «n F.CT ,_Western blotting analysis system (Amersham),--.aci. .ü

..

.x. ~... J ~~v

The membrane was stripped by incubation in the strippingECL Western blot buffer (62 .5 mM Tris pH 6 .7, 2% SDS ,100 mM 2-Mercaptoethanol) . After verifying the absence o fsignal, the same membrane was incubated 1 h in a 1/200 0anti-GST antibody (Amersham) in TBST buffer . Afterwashes the membrane was incubated 1 h in a 1/2500 dilutio nof protein G-HRP Conjugate (BioRad) and visualized usin gthe ECL kit .

To detect the amount of TLS protein in different extracts ,western blot was performed with a 1/10 dilution of anti-TL Smonoclonal antibody 4H11 previously described (Zinszner e tal., 1997) .

For immunoprecipitation, 200 µg of HeLa nuclear extractwas diluted in IP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7 .5, 1 m M

EDTA, 0 .5% NP40) and was first incubated 1 h at 4°C wit huncoupled-protein G-Sepharose beads (Pharmacia) . Thebeads were harvested by centrifugation at 2000 r .p .m. for1 min and the supernatant was then incubated 1 h at 4° Cwith anti-TLS 4H11 previously coupled on protein G-Sepharose in IP buffer+ 150 mM NaCl. The beads werewashed in IP buffer containing 150 mM NaCl and 1% NP40 .The proteins bound to protein G-sepharose (from thepreclear : control) and the immunoprecipitated proteins wer eeluted in Laemmli buffer and the activity was analysed b yPOM assay .

Purification of HsPOM75

All the purification procedures were performed at 4°C .Nuclear extracts (Fraction I) from 5 x 10 9 HeLa cell sprepared as described (Dignam et al., 1983) was centrifuge dat 100 000 g for 2 h . The pellet formed was resuspended inbuffer A (20 mM Tris-HCl (pH 7 .5), 2 mM DTT, 10 %glycerol) + 100 mM NaCl + 6 M urea and loaded onto aHiTrap SP (5 ml; Pharmacia) column equilibrated withbuffer A + 100 mM NaCl + 6 M urea . After washes in samebuffer, a gradient of 100–600 mM NaCl was developed inbuffer A+ 6 M urea. The fractions containing the peak ofHsPOMp75 activity eluted at about 350 mM NaCl wer epooled (Fraction II) . This fraction was diluted in buffe rA+ 6 M urea, and was loaded onto a DEAF MemSep 100 0(Waters) column, equilibrated with buffer A + 100 mM

TLS/POMp75 DNA pairing activity in cell proliferationP Bertrand et a l

4520NaCl + 6 M urea . The flow-through (Fraction IIIb) wa sapplied onto a HiTrap Heparin column (1 ml ; Pharmacia)equilibrated in Buffer A + 200 mM NaCl + 6 M urea and agradient of 250 — 600 mM NaCl in buffer A+ 6 M urea wa sapplied . The HsPOM75 activity eluted at about 400 mM

NaCl . Fraction IV (pooled fractions) was concentrated on aCentricon-30 microconcentrator (Amicon) and stored insmall aliquots at D 80[x . Fraction IV was resolved on along 9% SDS —PAGE, and the gel containing the 75 kD apolypeptide was excised and used to raise rabbit polyclonalantibodies and to performed microsequencing of the protein .After digestion, peptides were purified on HPLC ; sequencewas performed on an ABI 473 sequencer. Microsequence ha sbeen performed in the laboratory of proteins microsequen-cing at the Pasteur Institute in Paris (analysis no :94G430) .Internal peptide sequences obtained were compared wit hEMBL and Swiss Prot databank using Blast program .

Preparation of mammalian nuclear extract s

Nuclei from 2 to 50 10 8 cells were isolated by hypotonic lysi sand nuclear extracts were prepared as described previously(Lopez and Coppey, 1987) .

Pairing on membrane assay (PAGE/POM)

The POM assay was performed as previously describe d(Akhmedov et al ., 1995) . Briefly, 15 Eg of nuclear extrac twere loaded and protein samples were electrophoreticallyresolved on SDS-l0% polyacrylamide gels with 4% stackin ggels af 4C ; . After ereaxdphofesis, the 15ôl tpèptid.ës- were-electrophoretically transferred onto nitrocellulose membranecoated with ssDNA prepared as described previousl y(Bertrand et al., 1993; Akhmedov et al ., 1995) . Themembrane was then incubated in the standard mixtur econtaining incubation buffer with 0 .6 Du dNTPs, 0 .1 mM

ATPEE and 0 .5 to 1 [:/ml end-labeled dsDNA with a specifi cactivity of 10 6 c .p .m ./E . Incubation was carried out for 2 hat 37M. After incubation, the membrane was treated with0 .1 mg/ml of Proteinase K for 2 h at 50T. The membranewas then washed with 20 SSC, 0 .1% SDS at 651 for15 min. Joint DNA molecules were detected by autoradio -

graphy and quantified using Phosphorlmager (Molecula rDynamics) .

Cell culture and induction of cellular differentiatio n

Mammalian fibroblasts strains were grown in MEM mediu msupplemented with 10% of FCS . F9 cells were grown inDMEM medium supplemented with 15% FCS (under 12 %CO 2) . 1 0 8 cells were treated with 0 .2 Chi retinoic acid for 24 h ,then 1 mM cAMP was added. The cells were grown for 2additional days . For single treatments, 10 8 cells were treatedwith 0 .2 1:1\4 retinoic acid alone for , 3 days or with cAMPalone for 2 days . Induction of differentiation was confirme dby Northern blot analysis of c-myc expression . 10 8 HL60 cellswere grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10 %FCS. HL60 cells were induced to differentiate with 1 .3 %DMSO during 24 or 48 h. The extracts of the differenttreated cells were prepared in parallel .

Isolation of peripheral blood lymphocytes and PHA treatmen t

Lymphocytes and monocytes were isolated from blood by aFicoll gradient . After adherence of the monocytes, th elymphocytes were maintained for 48 h in RPMI 1640medium supplemented with 10% FCS in absence or i npresence of 5 Et /ml PHA . The induction of the proliferatio nwas verified by flow cytometry after BrdU incorporation .

AcknowledgementsThis work was supported by ARC and Électricité deFrance . We are grateful to D Rouillard (Institut Curie ,Paris) for flow cytometry analysis, M Prosperi (InstitutCurie, Paris) for c-myc expression analysis and to CLevalois for helpful technical assistance . We thank Drs JCoppey (Institut Curie, Paris) and A Sarrasin (IFC1 ,Villejuif) for providing us with the fibroblasts strains an dtheir corresponding SV40 transformed lines and to D Ro n(NYU) for the TLS cDNA and the 4H11 monoclonal anti -TLS antibody . Thanks are due to S Gangloff, P Radicell aand J Smith for helpful discussions and critical reading o fthe manuscript .

Reference s

Aboussekhra A, Chanet R, Adjiri A and Fabre F. (1992) ..Mol . Cell Biol., 12, 3224—3234 .

Akhmedov AT, Bertrand P, Corteggiani E and Lopez BS .(1995) . Proc . Natl .Acad. Sci . USA, 92, 1729—1733 .

Albala JS, Thelen MP, Prange C, Fan W, Christensen M ,Thompson LH and Lennon GG . (1997) . Genomics, 46 ,476-479 .

Basile G, Aker M and Mortimer RK . (1992) . Mol. Cell Biol . ,12, 3235—3246 .

Bertolotti A, Lutz Y, Heard DJ, Chambon P and Tora L .(1996) . EMBO J., 15, 5022-5031 .

Bertrand P, Akhmedov AT and Lopez BS . (1995) . Biochimie ,77, 840—847 .

Bertrand P, Corgeggiani E, Dutreix M, Coppey J and Lope zBS . (1993) . Nucleic Acids Res ., 21, 3653-3657 .

Bishop DK, Park D, Xu L and Kleckner N . (1992) . Cell, 69 ,

439—456 .Bortner C, Hernandez TR, Lehman IR and Griffith J . (1993) .

J . Mol. Biol ., 231, 241—250 .Buchhop S, Gibson MK, Wang XW, Wagner P, Sturzbeche r

HW and Harris CC . (1997) . Nucleic Acids Res ., 25, 3868 —

3874 .Cartwright R, Tambini CE, Simpson PJ and Thacker J .

(1998) . Nucleic Acids Res ., 26, 3084-3089 .Crozat A, Aman P, Mandahl N and Ron D . (1993) . Nature ,

363, 640—644 .

Delattre 0, Zucman J, Plougastel B, Desmaze C, Melot T ,Peter M, Kovar H, Joubert I, de Jong P, Rouleau G ,Aurias A and Thomas G . (1992) . Nature, 359, 162-165 .

Dignam JD, Lebovitz RM and Roeder RG . (1983) . Nuclei cAcids Res ., 11, 1475—1489 .

Dosanjh MK, Collins DW, Fan W, Lennon GG, Albala JS ,Shen Z and Schild D . (1998) . Nucleic Acids Res ., 26 ,1179-1184 .

Edelmann W and Kucherlapati R . (1996) . Proc . Natl . Acad .Sci . USA, 93, 6225—6227 .

Formosa T and Alberts BM . (1986) . Cell, 47, 793-806 .Friedberg EC, Walker GC and Siede W . (1995) . DNA repair

and mutagenesis . ASM Press : Washington, D .C .Golub El, Ward DC and Radding CM . (1992) . Nucleic Acids

Res ., 20, 3121—3125 .Hong X, Cadwell GW and Kogoma T . (1996) . Mol .

Microbiol ., 21, 953—961 .Ichikawa H, Shimizu K, Hayashi Y and Ohki M . (1994) .

Cancer Res ., 54, 2865—2868 .Kans JA and Mortimer RK . (1991) . Gene, 105, 139—140 .Kaslan E and Heyer WD. (1994) . J. Biol . Chem., 269 ,

14103—14110 .Kharbanda S, Pandey P, Morris PL, Whang Y, Xu Y ,

Sawant S, Zhu LJ, Kumar N, Yuan ZM, Weichselbaum R ,Sawyers CL, Pandita TK and Kufe D . (1998) . Oncogene ,16, 1773—1777 .


452 1Kharbanda S, Ren R, Pandy P, Shafman TD, Feller SM ,

Weichselbaum RR and Kufe DW . (1995) . Nature, 376 ,785–788 .

Kleckner N. (1996) . Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 93, 8167 —8174 .

Kowalczykowski SC and Eggleston AK . (1994) . Annu. Rev .Biochem ., 63, 991–1043 .

Li Z, Golub EI, Gupta R and Radding CM . (1997) . Proc .Natl . Acad. Sci . USA, 94, 11221—11226 .

Luisi-DeLuca C. (1995) . J. Bacteriol., 177, 566—572 .Lopez B and Coppey J . (1987) . Nucleic Acids Res ., 15, 6813--

6826 .Lovett ST . (1994) . Gene, 142, 103—106 .Luo CM, Tang W, Mekeel KL, DeFrank JS, Anne PR an d

Powell SN . (1996) . J . Biol. Chem., 271, 4497–4503 .Maldonado E, Shiekhattar R, Sheldon M, Cho H, Drapkin

R, Rickert P, Lees E, Anderson CW, Linn S and Reinber gD. (1996) . Nature, 381, 86—89 .

Malkova A, Ivanov EL and Haber JE . (1996) . Proc . Natl .Acad. Sci . USA, 93, 7131—7136 .

Marmorstein LY, Ouchi T and Aaronson SA . (1998) . Proc .Natl . Acad. Sci . USA, 95, 13869–13874 .

Meselson MS and Radding CM . (1975) . Proc. Natl. Acad .Sci . USA, 72, 358—361 .

Meyn MS . (1993) . Science, 260, 1327—1330 .Mizuta R, LaSalle JM, Cheng HL, Shinohara A, Ogawa H ,

Copeland N, Jenkins NA, Lalande M and Alt FW . (1997) .Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 94, 6927—6932 .

Noirot P and Kolodner RD . (1998) . J. Biol . Chem ., 273 ,12274–12280 .

~.prr(f{'a Îl B ~, ..n fonat i

TlR,

~ii e."-z R, S~k tr s.ki 1r~ _

Fye

r

,

c

t

r..

._

ib`i,aï Li ,

Salomoni P, Grassilli E, Lozzo RV, Cooper DR an dCalabretta B . (1998) . EMBO J ., 17, 4442–4455 .

Pittmann DL, Weinberg LR and Schimenti JC . (1998) .Genomics, 49, 1.03 -111 .

Rabbitts TH, Forster A, Larson R and Nathan P . (1993) .Nat . Genet ., 4, 175–180 .

Radding CM . (1991) . J. Biol . Chem., 266, 5355—5358 .Rice MC, Smith ST, Bullrich F, Havre P and Kmiec EB .

(1997) . Proc . Natl. Acad. Sci . USA, 94, 7417–7422 .Roca AI and Cox MM . (1990) . Crit . Rev. Biochem . Mol.

Biol., 25, 415–456 .Roeder GS. (1990) . Trends Genet ., 6, 385—389 .

Ron D . (1997) . Curr . Top . Microbiol. Immunol ., 220, 131 —142 .

Rossignol JL and Faugeron G . (1994) . Experientia, 50, 307 –317 .

Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T . (1989) . Molecula rCloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Sprin gHarbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, Ne wYork .

Scully R, Chen J, Plug A, Xiao Y, Weaver D, Feunteun J ,Ashley T and Livingston DM . (1997) . Cell, 88, 265—275 .

Shinohara A, Ogawa H, Matsuda Y, Ushio N, Ikeo K an dOgawa T . (1993) . Nat . Genet ., 4, 239–243 .

Shinohara A, Ogawa H and Ogawa T . (1992) . Cell, 69, 457 —470 .

Sonoda E, Sasaki MS, Buerstedde JM, Bezzubova 0 ,Shinohara A, Ogawa H, Takata M, Yamaguchi-Iwai Yand Takeda S . (1998) . EMBO J., 17, 598—608 .

Strickland S, Smith KK and Marotti KR . (1980) . Cell, 21 ,347—355 .

Sturzbecher HW, Donzelmann B, Henning W, Knippschil dU and Buchhop S . (1996) . EMBO J., 15, 1992—2002 .

Sung P . (1994) . Science, 265, 1241–1243.Szostak JW, Orr-Weaver TL, Rothstein RJ and Stahl FW .

(1983) . Cell, 33, 25—35 .Thyagarajan B and Campbell C . (1997) . J. Biol. Chem ., 272 ,

23328–23333 .Thyagarajan B, McCormick-Graham M, Romero DP and

Campbell C . (1996) . Nucleic Acids Res ., 24, 4084–4091 .Tsuzuki T, Fujii Y, Sakumi K, Tominaga Y, Nakao K ,

Sekiguchi M, Matsushiro A, Yoshimira Y and Morita T .(1996) Proc . Nall . Acad. Sci . USA, 93, 6236—6240 .

West SC . (1992) . Ann. Rev . Biochem ., 61, 603—640 .Yamamoto A, Taki T, Yagi H, Habu T, Yoshida K ,

Yoshimura Y, Yamamoto K, Matsushiro A, Nishimun eY and Morita T . (1996) . Mol . Gen. Genet ., 251, 1–12 ..

Yoshimura Y, Morita T, Yamamoto A and Matsushiro A .(1993) . Nucleic Acids Res., 21, 1665 .

Yuan ZM, Huang Y, Ishiko T, Nakada S, Utsugisawa T ,Kharbanda S, Wang R, Sung P, Shinohara A, Weichsel-baum R and Kufe D . (1998) . J. Biol. Chem ., 273, 3799 –3802 .

Zinszner H, Sok J, Immanuel D, Yin Y and Ron D . (1997) . J .Cell Sci ., 110, 1741–1750 .

Titre et résumé

La réparation des cassures double brin : deux mécanismes en compétition et en étroite relatio n

avec le cycle cellulaire .

Les cassures double brin sont des dommages extrêmement toxiques pour la cellule, bie n

qu'elles soient parfois induites pour engendrer de la diversité génétique . Deux mécanismes

permettent la réparation de ces dommages : la recombinaison non homologue (NHEJ) ou l a

recombinaison homologue (RH) . Certaines tumeurs ont pour origine une mauvaise réparatio n

de ces cassures . De plus, les cancers sont souvent associés à une dérégulation des mécanisme s

de réparation des cassures double brin . Il est donc primordial de comprendre comment ce s

deux mécanismes sont régulés entre eux . Cette étude démontre qu'une inactivation du NHE J

stimule la réparation des cassures double brin par la RH . Toutefois, cette canalisation vers la

RH est étroitement liée au cycle cellulaire . Le NHEJ répare les cassures double brin e n

G1/début de S tandis que la RH est active en fin de S/G2. Ainsi, cette compétition ne sembl e

possible uniquement si les cassures double brin non réparées en G1 traversent la phase S afi n

d'être réparées en G2 par la RH. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de la

régulation des mécanismes de réparation .

Title and Summary

Double strand break repair : two mechanisms in competition but tightly linked to cell cycle

DNA double strand breaks (DSB) are highly toxic damage although they can be induced t o

create genetic diversity . Two distinct pathways can repair DSB : Homologous Recombination

(HR) and Non Homologous End Joining (NHEJ) . If un- or mis- repaired, this damage can lea d

to cancer. Thus, it is essential to investigate how these two pathways are regulated for DS B

repair. NHEJ inhibition leads to HR DSB repair stimulation . However, this channeling to HR

is tightly linked to cell cycle since NHEJ and HR are active in Gl/early S and late S/G2 ,

respectively. Our results suggest that G1-unrepaired DSB go through S phase to be repaire d

by HR in G2 . Those results allow a better understanding of DSB repair mechanisms

regulation .

Discipline

Radiobiologie

Mots clés

Réparation ; Cassures double brin ; Cycle cellulaire ; Recombinaison Homologue ; NHEJ ;

Wortmannin ; XRCC4 ; Rad51 ; p53 ; Radiations ionisantes ; Mammifères .

Adresse du laboratoire

Laboratoire d'étude des Mécanismes de régulation de la Recombinaison homologue (LMR )

UMR CEAICNRS 21 7Département de Radiobiologie et Radiopathologie, Commissariat à l'énergie Atomiqu e

92265 Fontenay aux Roses

la réparation des cassures double brin de l'adn chez les

Documents