la dimérisation des récepteurs couplés aux protéines g
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Année 2007-2008
Mémoire bibliographique
Marina Lavigne Claire Portugal
La dimérisation des récepteurs couplés aux
protéines G
2
Résumé
Les GPCRs ou récepteurs couplés aux protéines G permettent la
communication intercellulaire de par leur diversité. En effet, ils sont capables de
reconnaître différentes molécules transportant l’information extracellulaire ainsi que
des stimuli sensoriels. Tous les GPCRs possèdent une structure commune
constituée de 7 hélices transmembranaires, une extrémité N-terminale extracellulaire
et une extrémité C-terminale intracellulaire permettant l’interaction avec les protéines
G qui leur sont spécifiques.
Malgré leur grande diversité, le mécanisme de transduction du signal est
conservé. Le GPCR est activé par fixation de son agoniste, ce qui induit des
changements conformationnels. Il peut alors interagir avec sa protéine G partenaire,
qui une fois activée, pourra réguler l’activité de divers effecteurs.
Il y a encore une vingtaine d’années, le modèle d’activation des protéines G
décrivait un récepteur monomérique. Cependant, de nombreuses études ont depuis
mis en évidence l’homo- et l’hétérodimérisation des GPCRs.
En particulier, pour le récepteur au leukotriène B4 : BLT1, il a été montré qu’il
homodimérise quand il est solubilisé dans du détergent après expression chez E.
coli. En effet, il semblerait que ce récepteur interagisse avec sa protéine G associée
sous forme d’un complexe pentamérique impliquant un dimère de BLT1 et une
protéine G hétérotrimérique. Cependant, le récepteur monomérique est capable
d’activer la protéine G, mais l’activation complète de cette dernière nécessite la
dimérisation.
Les études antérieures ont été menées uniquement in vitro, mais aucune
preuve n’a été apportée sur le fait que BLT1 homodimériserait in vivo. Notre projet de
recherche présente différentes expériences dont le but est de démontrer la validité
du modèle de BLT1 dimérique in vitro puis in vivo. Pour cela, nous proposons de
réaliser de l’immunoprécipitation sur des membranes de leucocytes humains ainsi
que des expériences de BRET menées sur des cellules Cos-7 exprimant notre
récepteur recombinant.
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Sommaire Résumé Sommaire
I. INTRODUCTION 1. Structure des GPCRs 2. Mécanisme général de la transduction du signal 3. Dimérisation des GPCRs
4. Importance des phénomènes de dimérisation a. Rôle de la dimérisation dans l’adressage à la membrane plasmique b. Rôle de la dimérisation dans l’activation du récepteur c. Rôle de la dimérisation dans l’internalisation 5. Le récepteur BLT1 II. RESULTATS 1. Matériels et méthodes 2. Activation de la protéine G 3. Changements conformationnels de l’hétérodimère R : R0 induits par l’agoniste a. Changements conformationnels du récepteur R b. Changements conformationnels du récepteur R0
4. Caractéristiques conformationnels du dimère BLT1 en présence de concentration saturante de LTB4 a. Hétérodimère RL : R0
L b. Homodimère RL : RL 5. Conclusion III. PROJET DE RECHERCHE 1. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vitro 2. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vivo a. Immunoprécipitation à partir de membranes de leucocytes b. Expériences de BRET c. Localisation cellulaire de la dimérisation de BLT1 3. Perspectives
Bibliographie
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I. Introduction
Les GPCRs (G-Protein-Coupled Receptors) forment la famille de protéines
membranaires la plus vaste (30%) et les gènes codant pour ces récepteurs
représentent entre 1 et 5 % du génome selon l’organisme. Les GPCRs se retrouvent
chez les protozoaires, les métazoaires diploblastiques les plus anciens, les plantes,
les levures, le nématode C. elegans, la drosophile et les vertébrés (Bockaert et Pin,
1999 ; Bockaert et al., 2002).
Le rôle des GPCRs est de permettre une communication intercellulaire car
leur diversité confère la reconnaissance de différentes molécules transportant
l’information extracellulaire (hormones, neurotransmetteurs, facteurs de croissance et
de développement) et des stimuli sensoriels (lumière, molécules olfactives et
gustatives). La fixation de l’agoniste entraîne leur activation : ils sont alors capables
d’activer les protéines G spécifiques auxquelles ils sont couplés. Ces dernières
pourront alors stimuler ou inhiber différentes voies de signalisation (Bockaert et Pin,
1999 ; Gether, 2000 ; Kobilka, 2002).
1. Structure des GPCRs La caractéristique structurale commune à tous les GPCRs est la présence de
7 hélices transmembranaires connectées par trois boucles extracellulaires (E1 à E3)
et trois boucles intracellulaires (I1 à I3). L’extrémité N-terminale est positionnée du
côté extracellulaire, tandis que la queue C-terminale est positionnée du côté
intracellulaire et permet, entre autres, l’interaction avec les protéines G
intracellulaires (figure 1) (Bockaert et al., 2002).
En fonction de leur topologie, il a été établi un classement des GPCRs : ils se
divisent en trois classes principales qui possèdent toutes un pont disulfure entre les
boucles E1 et E2. La classe A est la famille la plus vaste et la plus étudiée qui
regroupe notamment la rhodopsine, les récepteurs olfactifs et les récepteurs
adrénergiques. Elle est caractérisée par une faible homologie de séquence avec
uniquement quelques résidus clés conservés : le domaine DRY localisé au niveau de
la boucle I2. Cette région est particulièrement importante lors de la transduction du
signal via la protéine G associée. Pour la majorité de ces récepteurs, le site actif est
localisé au niveau du domaine transmembranaire. La classe B regroupe quant à elle
5
une vingtaine de GPCRs sensibles aux hormones, dont les récepteurs au glucagon,
à la calcitonine, et à la GnRH (Gonadrotopin-Releasing Hormone). Elle ne présente
pas de caractéristique commune avec la classe A et se distingue par un domaine N-
terminal important (environ 100 résidus). C’est d’ailleurs au niveau de ce domaine
que se fixent les ligands. Enfin, la classe C regroupe les récepteurs métabotropiques
au glutamate et au GABAB (γ-Amino-Butyric Acid), le récepteur au calcium et les
récepteurs aux goûts sucré et unami (Kolakowski, 1994 ; Bockaert et al., 2002). Ici,
c’est le domaine N-terminal, appelé Venus flytrap, qui est caractéristique de par son
importance (entre 500 et 600 résidus) et sa structure bilobée au niveau de laquelle
vient se fixer le ligand.
Figure 1 : Topologie des GPCRs
L’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité C-terminale intracellulaire. Ils présentent trois
boucles extracellulaires (E1 à 3) et trois boucles intracellulaires (I1à 3). Notons la présence d’un pont
disulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de N-glycosylation au niveau du domaine N-terminal
ainsi qu’un site d’acylation par des composés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4.
2. Mécanisme général de la transduction du signal Malgré la grande diversité des GPCRs, le mécanisme fondamental de
transduction du signal est conservé (figure 2.A) (Bockaert et Pin, 1999 ; Gether,
2000 ; Kobilka, 2002).
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Le GPCR au repos est activé après interaction avec son agoniste au niveau
du domaine extracellulaire ou du domaine transmembranaire. Cette fixation entraîne
des changements de conformation du GPCR : on observe une rotation de TM6 dans
le sens des aiguilles d’une montre, ainsi qu’un mouvement relatif des TMs 3 et 6 (ce
qui résulte en leur éloignement) (figure 2.B) (Kobilka, 2002). Le récepteur ainsi activé
peut interagir, grâce à sa partie intracellulaire, avec les sous-unités α et βγ de la
protéine G. Au niveau de la sous-unité α de la protéine G ainsi activée, on observe
un échange GDP-GTP, et les sous-unités α et βγ sont dissociées. Les 2 sous-unités
vont alors pouvoir réguler l’activité de divers effecteurs membranaires ou
cytosoliques. Ces effecteurs sont, en général, des canaux ioniques ou des enzymes
productrices d’un second messager assurant une amplification considérable du
signal. Enfin, de par l’activité GTPase intrinsèque de la sous-unité α, la protéine G
est alors réassociée, ce qui stoppe l’interaction avec les effecteurs.
Il est à noter que tant que le récepteur est activé par son ligand, le cycle
d’échange GDP-GTP peut continuer.
Figure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changements conformationnels
relatifs du domaine transmembranaire
A. Un GPCR au repos (1) est activé par la liaison d'un agoniste spécifique (2). Le changement de
conformation du complexe agoniste-récepteur, induit par cette liaison, permet l'activation de l'échange
du GDP par du GTP et donc l'activation de la protéine G hétérotrimérique : les sous-unités Gα et Gβγ
intracellulaires (3) vont aller réguler l'activité de divers effecteurs membranaires ou cytosoliques (4).
Le déclenchement de l'activité phosphatase, intrinsèque à la sous-unité Gα entraîne la réassociation
des sous-untités Gα et Gβγ (5) et le retour à l'état initial (1).
B. L’activation du récepteur par la fixation de son agoniste entraîne des changements
conformationnels. On observe la rotation dans le sens des aiguilles d’une montre de TM6 et un
éloignement des TMs 3 et 6.
A
7
Il existe trois grands mécanismes permettant de mettre fin au signal induit par
le stimulus extracellulaire : c’est la désensibilisation (Perron et al., 2003 ; Perez et
Karnik, 2005). Le premier est la régulation de la concentration en agoniste. Lorsque
le ligand est relargué dans une fente synaptique, très souvent, deux processus
entraînent une diminution de la concentration synaptique en agoniste : il s‘agit de la
recapture pré-synaptique et de la dégradation de l’agoniste par des enzymes
spécifiques. Le deuxième mécanisme est le découplage fonctionnel par
phosphorylation et l’internalisation du complexe ligand-récepteur (figure 3).
↓
Figure 3 : Internalisation d’un GPCR Le récepteur est découplé de la protéine G par phosphorylation par une GRK (G-protein Receptor
Kinase). Le récepteur phosphorylé est reconnu par l’arrestine qui induit son endocytose clathrine-
dépendante. Il sera alors, soit recyclé à la membrane après déphosphorylation et élimination de
l’agoniste, soit dégradé après fusion de la vésicule d’endocytose avec le lysosome.
Le couplage GPCR-protéine G est peu à peu inhibé grâce à une phosphorylation par
les GRK (G-protein Receptor Kinases), la PKA (Protein Kinase A) ou la PKC (Protein
Kinase C) de la région intracellulaire du récepteur responsable de l’activation des
protéines G. Le récepteur phosphorylé est alors reconnu par des protéines arrestines
qui se lient au récepteur, et empêchent donc l’échange GDP-GTP au niveau de la
8
protéine G. Après liaison des arrestines, le complexe ligand-récepteur est internalisé
dans des vésicules recouvertes de clathrine. Les récepteurs endocytés peuvent ainsi
subir un recyclage à la membrane plasmique (ce qui nécessite une
déphosphorylation du récepteur et une élimination du ligand), ou une dégradation
avec la fusion des vésicules d’endocytose avec les lysosomes. Enfin, la
désensibilisation peut faire intervenir la régulation du nombre total de récepteurs à la
surface cellulaire lors d’une exposition longue à l’agoniste. Deux phénomènes sont
impliqués : une diminution de la synthèse des récepteurs et une augmentation de
leur dégradation.
3. Dimérisation des GPCRs Jusqu’à il y a peu de temps, on estimait que les GPCRs existaient et
fonctionnaient en tant que monomères. Cependant, de nombreuses études
biochimiques et biophysiques ont permis de mettre en évidence des homo- et
hétérodimères de GPCRs (Milligan, 2004 ; Bulenger et al., 2005). Il semblerait que,
pour la plupart (en particulier ceux de la classe C), la dimérisation soit constitutive et
se produise tôt lors de la biosynthèse, à savoir au niveau du réticulum
endoplasmique (Terrillon et Bouvier, 2004 ; Bulenger et al., 2005 ; Pin et al., 2005).
Dans un dimère, la zone de contact des GPCRs est située au niveau de leur
domaine membranaire, en particulier au niveau de TM6. Un modèle de dimérisation
a été proposé, dans lequel les hélices transmembranaires des GPCRs participent à
la formation d’un « swapping domain » (figure 4) (Goudson et al., 2000). Ce modèle
illustre des résultats expérimentaux obtenus sur des mutants incapables de fixer
l’agoniste quand ils sont exprimés seuls et qui recouvrent cette capacité quand
d'autres récepteurs fonctionnels sont coexprimés (Monnot et al., 1996). Dans ce
modèle proposé, modèle "swapping", la dimérisation des récepteurs fait apparaître
deux sites actifs similaires à celui du monomère, mais constitué des domaines
transmembranaires provenant des deux monomères (Goudson et al., 2000).
Cependant, cette hypothèse est largement controversée. Dans le cas des récepteurs
à la dopamine D2 (D2DR), des expériences réalisées par coexpression d’un mutant
ponctuel (muté en TM3) avec un mutant tronqué (ne possédant que les TMs 1 à 5)
ne permettent pas de restaurer des propriétés de liaison avec leur ligand. Ceci
démontre, qu’au moins dans le cas des D2DRs, les TMs 1 à 5 ne peuvent pas
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réaliser de « swapping » avec les TMs 6 et 7 (Lee et al., 2000). Cette étude, ainsi
que d’autres, remettent en cause ce mécanisme de dimérisation pour tous les autres
GPCRs.
Figure 4 : Modèle de dimérisation : le « swapping-domain »
A. Les deux protomères sont caractérisés par un site de fixation. Ces deux sites de fixation sont
reformés après dimérisation par « swapping ». Le « swapping » consiste en l’interaction entre
différents TMs des deux protomères afin de constituer un dimère fonctionnel.
B. Dans le cas de protomères mutés incapables de fixer leur agoniste, on s’attend à ce que la
dimérisation par « swapping » restaure la capacité de liaison à l’agoniste.
4. Importance des phénomènes de dimérisation a. Rôle de la dimérisation dans l’adressage à la membrane plasmique
L’export du réticulum endoplasmique est l’étape limitante de la maturation des
GPCRs puisque les récepteurs mal "foldés" ou possédant un signal de rétention sont
retenus dans le réticulum endoplasmique. La dimérisation intervient alors en
permettant de masquer ces signaux de rétention ou des patchs hydrophobes de ces
récepteurs, ce qui permet le transport du récepteur dimérique au niveau de la
membrane plasmique via la voie de la sécrétion.
B
Supprimé :
Supprimé : : le récepteur dimérique pourra ainsi être transporté jusqu’à la membrane plasmique
10
Dans l’exemple du récepteur GABAB, une hétérodimérisation précoce dans le
réticulum endoplasmique est obligatoire. Le récepteur GABAB1 possède un signal de
rétention au réticulum endoplasmique dans sa partie C-terminale et ne peut être
exprimé à la membrane plasmique que s'il est associé au récepteur GABAB2.
L’hétérodimérisation de ces récepteurs est assurée par une interaction coiled-coil de
leurs extrémités C-terminales, interaction qui masque le signal de rétention du
récepteur GABAB1 (Jones et al., 1998 ; Robbins et al., 2001).
b. Rôle de la dimérisation dans l’activation du récepteur Pour le récepteur GABAB, l’hétérodimérisation de GABAB1 et GABAB2 est
nécessaire pour l’obtention d’un récepteur fonctionnel (Galvez et Pin, 2003 ; Pin et
al., 2005). Dans le dimère, GABAB1 fixe l’agoniste tandis que GABAB2 en est
incapable. En revanche, GABAB1 ne peut pas activer les protéines G. La formation
de l’hétérodimère est donc indispensable pour permettre une transactivation où
GABAB1 fixe l’agoniste et GABAB2 active la protéine G (figure 5).
Figure 5 : Rôle de la dimérisation dans l’activation des GPCRs : le récepteur au GABAB Le récepteur au GABAB est un hétérodimère constitué de 2 protomères : GABAB1, seul capable de
fixer l’agoniste et GABAB2, seul capable d’activer la protéine G. La dimérisation se fait par interaction
de type coiled-coil entre les extrémités C-terminales des 2 protomères. Elle permet de former le
récepteur fonctionnel par transactivation des 2 protomères. Un protomère est constitué de 2 lobes
(LB) formant le domaine Venus-flytrap et d’une partie transmembranaire. Les flèches + jaunes
représentent la transactivation entre les 2 protomères. La flèche + bleue représente l’activation de la
protéine G par le dimère.
Mis en forme : Indice
Mis en forme : Indice
Supprimé : e
Supprimé : Ainsi, la sous-unité
Supprimé : peut être exprimée à la surface cellulaire
Supprimé : En effet, son association, notamment via une interaction de type coiled-coil en C-terminal, masque le signal de rétention et permet l’adressage à la membrane plasmique d’un récepteur fonctionnel
Supprimé : ed
11
c. Rôle de la dimérisation dans l’internalisation Pour beaucoup d’hétérodimères, la stimulation d’un seul des protomères est
suffisante pour entraîner la co-internalisation des deux protomères (Perron et al.,
2003). Dans d’autres cas, certains récepteurs qui ne subissent pas d'internalisation
après leur interaction avec leur ligand, empêchent l'internalisation des récepteurs
auxquels ils sont associés. C’est le cas en particulier du récepteur aux opioïdes κ qui
inhibe l’endocytose du récepteur aux opioïdes δ (Terrillon et Bouvier, 2004).
5. Le récepteur BLT1 Le récepteur BLT1 au LTB4 (LeukoTriène B4) est un GPCR de classe A, le
seul GPCR à avoir été exprimé dans E. coli puis correctement "foldé".
D’une part, BLT1 isolé est essentiellement sous forme dimérique (l’interaction
entre les deux protomères se fait au niveau de leur TM6), en présence ou en
absence d’agoniste. D’autre part, quand le ligand LTB4 se fixe sur son récepteur, la
forme dimérique de ce récepteur est stabilisée (Banères et Parello, 2003).
Le récepteur dimérique interagit avec la protéine G sous forme d’un complexe
pentamérique (LTB4-BLT1)2-Gαβγ. Dans le pentamère, il est possible que chaque
protomère interagisse avec des loci différents de la protéine G.
De plus, dans le récepteur BLT1 homodimérique, un phénomène coopératif a
été mis en évidence puisque la fixation de l’agoniste sur un seul des protomères
induit des changements conformationnels du protomère associé libre de tout ligand
(Mesnier et Banères, 2004).
Enfin, lors de la formation du complexe pentamérique, on observe une
augmentation de l’affinité du récepteur pour l’agoniste. Ce changement d’affinité est
probablement lié à des changements conformationnels du récepteur quand il
interagit avec la protéine G (Banères et Parello, 2003).
Il apparaît donc que la protéine G contrôlerait les changements
conformationnels du récepteur BLT1 dimérique. Dans la publication « Asymmetric
Conformational Changes in a GPCR Dimer Controlled by G-Proteins » parue en
2006 dans « The EMBO Journal », Damian et al. ont étudié cette hypothèse sur le
récepteur BLT1.
Supprimé : ne peuvent pas subir d’endocytose induite par le ligand agissent comme des dominants négatifs après hétérodimérisation avec un récepteur capable d’endocyter :
Supprimé : c
Supprimé :
Supprimé : s
Supprimé : conformation dimérique
Supprimé : serait
Supprimé : non-chargé
Supprimé : en
Supprimé : travaillant
Supprimé : dimérique
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II. Résultats
Dans cette publication, les auteurs ont choisi d’étudier les changements
conformationnels de chaque monomère de récepteur BLT1 lors de la formation du
dimère. Les auteurs ont analysé à la fois les changements conformationnels résultant
de la fixation de l’agoniste LTB4 sur un ou deux des protomères, et l’influence du
couplage avec la protéine G sur ces changements conformationnels.
1. Matériels et méthodes Les auteurs ont travaillé majoritairement sur l’hétérodimère de BLT1 R : R0
(reconstitué dans un environnement de micelles lipidiques) composé du récepteur
sauvage R et du récepteur mutant R0. Ce mutant de BLT1 est caractérisé par une
mutation de sa cystéine97 (localisée au niveau de l’hélice transmembranaire TM3) en
alanine. Cette mutation ponctuelle n’affecte pas la structure du récepteur R0. En
revanche, son affinité pour l’agoniste LTB4 est réduite de 100 fois (la constante de
dissociation de BLT1 passe ainsi de 1,8.10-9 M pour le récepteur sauvage R à
2,4.10-7 M pour le récepteur mutant R0) (Mesnier et Banères, 2004). Du fait de cette
différence d’affinité pour LTB4 entre les protomères de l’hétérodimère, il est possible
de charger l’agoniste de façon séquentielle. Ainsi, à faible concentration, LTB4 se fixe
sur le site de haute affinité du protomère R, tandis qu’en concentration saturante,
LTB4 sera fixé à la fois sur les sites des récepteurs sauvage et du mutant.
Afin de suivre l’activation du dimère de BLT1, et donc ses changements
conformationnels, on fait appel à la fluorescence intrinsèque du tryptophane (Trp).
Afin de simplifier l’analyse en faisant abstraction de possibles interférences dans les
spectres d’émission de fluorescence, tous les résidus Trp (excepté le résidu Trp234
du protomère d’intérêt) ont été mutés en leucines dans les protomères du dimère
d’étude. Le choix de suivre l’émission de fluorescence du Trp234 a été fait en prenant
en compte les caractéristiques de ce résidu. D’une part, le Trp234 est localisé dans
TM6 qui est connu comme étant le principal domaine impliqué lors de la dimérisation.
Supprimé : O
Supprimé : été
Supprimé : sur le site de plus faible affinité
Supprimé : dans la
13
D’autre part, le Trp234 est le seul résidu de BLT1 dont les propriétés de fluorescence
sont sensibles à l’activation du récepteur.
Dans le but d’analyser uniquement les changements du protomère d’intérêt (R
ou R0 selon l’expérience), le Trp234 de ce protomère a été marqué par l’ajout d’un
groupement hydroxy en position 5 (5-OH-Trp234) lors de la biosynthèse dans une
souche d’E. coli auxotrophe pour le Trp. Ainsi, il a été aisé de suivre les
changements de conformation du récepteur en excitant sélectivement le 5-OH-Trp à
315 nm et en suivant la fluorescence spécifique à 337 nm.
En complément de l’analyse des changements conformationnels du dimère de
BLT1 induits par la fixation de l’agoniste, les auteurs ont étudié le couplage du
récepteur à la protéine G en observant sa capacité à catalyser l’échange GDP-GTP
au niveau de la sous-unité α de la protéine G. Pour cela, ils ont utilisé l’analogue
non-hydrolysable du GTP marqué au soufre 35 ([35S]GTPγS), et ils ont suivi sa
fixation en fonction du temps.
En comparant la catalyse de l’échange GDP-GTP par le récepteur BLT1
recombinant produit dans E.coli et le récepteur natif dans des fractions
membranaires de cellules Chem-1 (lignée adhérente de rat, Chemicon) stablement
transfectées avec la séquence du BLT1 humain, il apparaît que le récepteur
recombinant est un bon modèle car il active les protéines G de la même manière que
le récepteur in vivo (figure 6).
Supprimé : ie
Supprimé :
14
Figure 6 : Comparaison de la capacité des récepteurs recombinant et natif à catalyser l’échange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α
On observe la fixation de [35S]GTPγS au niveau de la sous-unité α de la protéine G couplée avec le
récepteur BLT1 recombinant exprimé chez E. coli (A), ou le récepteur BLT1 natif exprimé dans des
fractions membranaires (B). Les profils de fixation de [35S]GTPγS étant similaires pour les deux types
de récepteurs, on considère que le récepteur exprimé chez E. coli est un bon modèle pour l’étude de
l’activation de la protéine G.
2. Activation de la protéine G L’hétérodimère R : R0 peut se présenter sous trois formes :
L’état R : R0 dans lequel les deux protomères du dimère sont libres,
L’état RL : R0 dans lequel seul le protomère R possédant le site de
fixation de haute affinité est chargé par LTB4 présent en faible concentration,
L’état RL : R0L dans lequel les deux sites de haute et faible affinités
sont chargés par LTB4 présent en concentration saturante.
Pour les états RL : R0 et RL : R0L, les mêmes profils de fixation du GTP ont été
observés (figure 7.A), ces profils étant caractérisés par une augmentation de la
fixation de [35S]GTPγS en fonction du temps. Ce résultat a permis de conclure que la
Supprimé :
Supprimé : ’amener à la
Supprimé : sion
15
fixation de l’agoniste LTB4 sur un seul des protomères du dimère de BLT1 suffit à
l’activation complète de la protéine G associée.
Etant donnés ces résultats, les auteurs se sont interrogés sur la nécessité de
la dimérisation pour l’activation de la protéine G. Afin de répondre à cette question, le
complexe pentamérique formé par la protéine G hétérotrimérique et le dimère de
BLT1 chargé par deux molécules de LTB4 a été mis en présence du peptide isolé
TM6 (Banères et Parello, 2003). Ce peptide permet de dissocier le dimère, et ainsi
d’observer la capacité du monomère à catalyser l’échange GDP-GTP au niveau de la
sous-unité α de la protéine G, c’est-à-dire à activer la protéine G (figure 7.B). Pour le
monomère sauvage, de même que pour le monomère mutant, sa capacité à activer
la protéine G a été mise en évidence. Cependant, l’échange GDP-GTP qui a pu être
observé est plus lent que pour la forme dimérique du récepteur. Ceci indique que,
bien que la protéine G puisse être activée par la forme monomérique de BLT1, son
activation complète nécessite la dimérisation du récepteur.
Figure 7 : Fixation de [35S]GTPγS à la protéine G, en présence du dimère R : R0 à demi-chargé ou complètement
chargé ou en présence du monomère BLT1 chargé par LTB4
A. Echange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α
catalysé par le dimère en absence d’agoniste (cercles),
après fixation de l’agoniste sur le site de haute affinité
de R (carrés), et en concentration saturante en LTB4
(triangles).
B. Echange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α
catalysé par le récepteur BLT1 sauvage en présence
de concentration saturante en LTB4, et en absence
(cercles vides) ou en présence (cercles remplis) du
peptide TM6.
Supprimé :
16
3. Changements conformationnels de l’hétérodimère R : R0 induits par l’agoniste
a. Changements conformationnels du récepteur R Afin de suivre sélectivement les changements conformationnels du protomère
sauvage au niveau de l’hétérodimère R : R0, celui-ci a été marqué par le 5-OH-Trp
en position 234. Puis, l’hétérodimère a été stimulé avec l’agoniste LTB4 en présence
ou non de protéine G.
Il est apparu qu’en absence ou en présence de protéine G, les changements
conformationnels subits par R après fixation de LTB4 séquentiellement sur R et R0
sont identiques. A faible concentration d'agoniste, LTB4 se fixe au niveau du site de
haute affinité de R (état RL : R0), R se retrouve alors dans son état complètement
actif. De plus, R ne subit pas de changement conformationnel supplémentaire en
concentration saturante de LTB4. Dans ces conditions, une deuxième molécule de
LTB4 se fixe au niveau du site de faible affinité de R0 (état RL : R0L) (figure 8).
Figure 8 : Activation du protomère R dans l’hétérodimère R : R0 en absence et présence de
protéine G A. En absence de protéine G, fixation de LTB4 sur R :
R0 (ratio de fixation X, carrés vides) et
changements normalisés dans la fluorescence du
5-OH-Trp234 du protomère R (carrés remplis) en
fonction du log de la concentration en LTB4.
B. En présence de protéine G, fixation de LTB4 sur R :
R0 (ratio de fixation X, carrés vides) et
changements normalisés dans la fluorescence du
5-OH-Trp234 du protomère R (carrés remplis) en
fonction du log de la concentration en LTB4.
Les états RL : R0 et RL : R0L sont indiqués sur la
courbe.
Mis en forme : Indice
Supprimé : e R
Supprimé :
Supprimé : celui-ci a été marqué avec le
Supprimé : quand
Supprimé : la
Supprimé : est
Supprimé : Lorsqu’en
Supprimé :
Supprimé : quand, en concentration
17
b. Changements conformationnels du récepteur R0 Afin de suivre sélectivement les changements conformationnels du protomère
mutant au niveau de l’hétérodimère R : R0, celui-ci a été marqué avec le 5-OH-Trp en
position 234. Puis, l’hétérodimère a été stimulé avec l’agoniste LTB4 en présence ou
non de protéine G.
Les résultats obtenus se sont avérés différents de ceux obtenus pour le
protomère sauvage (figure 9).
En absence de protéine G (figure 9.A), l’activation du récepteur R0 se fait en
deux temps. En faible concentration d'agoniste, LTB4 se fixe sur le site de haute
affinité de R (état RL : R0), R0 passe alors dans un état conformationnel intermédiaire
entre les états inactif et actif. En concentration saturante, LTB4 se fixe au niveau du
site de faible affinité de R0 (état RL : R0L), le récepteur mutant entre ainsi dans son
état complètement actif.
En présence de protéine G (figure 9.B), tout comme en absence de protéine
G, en faible concentration d'agoniste, LTB4 se fixe sur le site de haute affinité de R
(état RL : R0), R0 passe alors dans un état conformationnel intermédiaire. En
revanche, en concentration saturante, la deuxième molécule de LTB4 se fixe sur R0
(état RL : R0L), mais R0 ne subit alors pas de changement conformationnel
supplémentaire et reste donc dans son état intermédiaire.
Figure 9 : Activation du protomère R0 dans l’hétérodimère R : R0 en absence et présence de protéine G
A. En absence de protéine G, fixation de LTB4 sur R : R0
(ratio de fixation X, carrés vides) et changements
normalisés dans la fluorescence du 5-OH-Trp234 du
protomère R0 (carrés remplis) en fonction du log de la
concentration en LTB4.
B. En présence de protéine G, fixation de LTB4 sur R : R0
(ratio de fixation X, carrés vides) et changements
normalisés dans la fluorescence du 5-OH-Trp234 du
protomère R0 (carrés remplis) en fonction du log de la
concentration en LTB4.
Les états RL : R0 et RL : R0L sont indiqués sur la courbe.
Supprimé :
Supprimé : Tout d’abord, lorsqu’e
Supprimé : nfin, lorsqu’e
Supprimé : , lorsqu’e
18
Ces résultats ont permis de souligner le fait que le couplage du dimère BLT1 à la
protéine G influence les changements conformationnels du récepteur, notamment en
empêchant le protomère R0 d’atteindre sa conformation pleinement active.
4. Caractéristiques conformationnels du dimère BLT1 en
présence d'une concentration saturante de LTB4 a. Hétérodimère RL : R0
L En absence de protéine G et en concentration saturante en LTB4, les deux
protomères de l’hétérodimère présentent les mêmes spectres d’émission de
fluorescence, et donc les mêmes caractéristiques conformationnels. En effet, R et R0
se retrouvent tous deux dans leur état complètement actif (figure 10.A).
Cependant, en présence de protéine G et en concentration saturante en LTB4,
les spectres d’émission de fluorescence de R et R0 diffèrent. Seul le protomère
sauvage atteint l’état complètement actif tandis que le protomère mutant reste bloqué
dans l’état intermédiaire (figure 10.B).
Ces résultats indiquent que la protéine G induit une conformation asymétrique
du dimère BLT1.
Figure 10 : Conformations de R et R0 en absence ou en présence de protéine G
A. Spectre d’émission de fluorescence de R ou R0
marqués au 5-OH-Trp, en absence de protéine G et
en absence ou présence de concentration saturante
en LTB4.
B. Spectre d’émission de fluorescence de R ou R0
marqués au 5-OH-Trp, en présence de protéine G et
en absence ou présence de concentration saturante
en LTB4.
Mis en forme : Indice
Supprimé : complètement chargé
19
b. Homodimère RL : RL En absence de protéine G et en concentration saturante en LTB4, les
protomères sauvages présentent les mêmes spectres d’émission de fluorescence
que les protomères sauvage et mutant dans l’hétérodimère RL : R0L. Tous les deux
se retrouvent donc leur état pleinement actif (figure 11).
De la même façon que pour l’hétérodimère RL : R0L, en présence de protéine
G et en concentration saturante en LTB4, un seul des deux protomères est présent
dans son état actif tandis que l’autre reste bloqué dans l’état intermédiaire (figure 11).
Il apparaît donc que, comme pour l’hétérodimère RL : R0L, la protéine G induit
une conformation asymétrique du dimère BLT1 dans laquelle un seul des protomères
est présent dans son état complètement
actif.
Figure 11 : Activation du récepteur dans le dimère BLT1 en absence ou présence de protéine G
La figure représente les changements normalisés de la
fluorescence dans l’hétérodimère R : R0 et dans
l’homodimère R : R en absence et en présence de protéine
G. Dans tous les cas d’étude, seul un des protomères du
dimère est marqué au 5-OH-Trp234 : R0 dans l’hétérodimère
et un des protomères R dans l’homodimère.
Les barres d’erreur correspondent à la déviation standard
de la valeur moyenne calculée sur trois expériences
indépendantes.
20
5. Conclusion D’une part, cette étude a permis de mettre en évidence le fait que l’activation
d’un seul des protomères d’un récepteur BLT1 dimérique permet de déclencher
l’activation complète de la protéine G. De plus, le monomère est lui-même capable
d’assurer l’activation de la protéine G. Cependant, l’activation complète nécessite
l’étape de dimérisation du récepteur. On peut donc supposer que cette dimérisation
augmente l’efficacité de couplage du fait que les deux protomères interagissent avec
des régions distinctes de la protéine G associée.
D’autre part, la preuve a été apportée que la protéine G est responsable du
fonctionnement asymétrique du dimère BLT1 : en concentration saturante en
agoniste LTB4, un seul des protomères est complètement activé, l’autre restant
bloqué dans un état intermédiaire entre états inactif et actif.
Pour résumer, le fait qu’un seul des protomères soit capable d’activer la
protéine G démontre que ce protomère interagit avec la sous-unité α de la protéine
G. Le deuxième protomère, voyant sa conformation limitée par le couplage avec la
protéine G, interagit lui-aussi de façon spécifique avec son partenaire intracellulaire.
Cependant, il reste encore à déterminer si cette interaction se fait également au
niveau de la sous-unité α sur une région distincte de celle avec laquelle interagit le
premier protomère, ou si elle se fait au niveau de la sous-unité βγ de la protéine G.
III. Projet de recherche
Les principales études menées sur le récepteur au LTB4 ont permis de mettre
en évidence son homodimérisation in vitro. Le récepteur BLT1 humain a été produit
chez E. coli puis correctement foldé (Banères et al., 2003). Ce récepteur recombinant
présente, en présence de protéine G, une affinité pour LTB4 (la constante de
dissociation Kd mesurée est de 1,8.10-9 M) qui est très proche de celle du récepteur
Supprimé :
Supprimé : D’une part, c
Supprimé : . De plus, le monomère est lui-même capable d’assurer l’activation de la protéine G
Supprimé : la
Supprimé :
Supprimé : De plus, l
Supprimé : (mais avec
Supprimé : )
21
humain exprimé dans les cellules Cos-7 (Kd ≈ 10-9 M). De plus, le récepteur isolé
dans du détergent est capable d’activer l’échange GDP-GTP au niveau de la sous-
unité α de la protéine G associée, et ce, en présence de concentration saturante de
LTB4. Enfin, le récepteur interagit de manière spécifique avec la sous-unité Gαi
tandis qu’il est incapable d’interagir avec la sous-unité Gαq (Banères et Parello,
2003). Tous ces éléments prouvent que le récepteur recombinant BLT1 est un bon
modèle pour l’étude du récepteur natif.
En 2004, Mesnier et Banères ont montré que, solubilisé dans un détergent
adéquat (dans notre cas, l’hexadecyl-β-D-maltoside), le récepteur BLT1 recombinant
est présent essentiellement sous forme dimérique, et ce, en présence ou non
d’agoniste. En outre, la présence de l’agoniste LTB4 stabilise ces dimères. De la
même façon, il a été montré que BLT1 recombinant dimérise dans des liposomes
reconstitués. Ces différentes observations laisseraient penser que BLT1
homodimérise in vivo.
De plus, des expériences de cross-link chimique ont permis d’estimer l’état
d’oligomérisation du récepteur BLT1 recombinant solubilisé dans du détergent et en
présence de protéine G purifiée. L’analyse par gel-filtration puis SDS-PAGE des
complexes formés a mis en évidence la formation d’un complexe pentamérique
constitué d’un dimère de BLT1 et d’une protéine G hétérotrimérique (Banères et
Parello, 2003).
Enfin, plus récemment, Damian et al. (2006) se sont interrogés sur le rôle de
la dimérisation dans l’activation de la protéine G. Pour cela, le récepteur BLT1
reconstitué dans des liposomes a été mis en présence du peptide TM6 afin de
dissocier les dimères. Cette expérience a révélé que les monomères sont capables
d’activer la protéine G, mais de manière moindre que le récepteur sous forme
dimérique. Le rôle de la dimérisation dans l’activation de la protéine G n’est donc pas
clairement défini.
En fin de compte, les études précédentes ayant été menées uniquement in
vitro sur un récepteur recombinant, on peut se demander si la dimérisation observée
ne résulterait pas d’un artefact expérimental. Il serait donc intéressant de confirmer
par des expériences supplémentaires les résultats obtenus précédemment in vitro,
ainsi que de prouver l’existence de l’homodimérisation de BLT1 in vivo.
22
1. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vitro Comme décrit par Banères et al. (2003), le récepteur BLT1 recombinant est
produit chez E. coli dans un vecteur pET21b (figure 12). Il est exprimé en fusion avec
un tag His en C-terminal. Après induction par l’IPTG, le récepteur BLT1 est produit
en corps d'inclusion. Après solubilisation dans l'urée 8 M, le récepteur est purifié sur
colonne Ni-NTA (Nickel- NitriloTriacetic Acid), puis refoldé. Enfin, le tag C-terminal
est clivé par digestion à la thrombine.
Figure 12 : Vecteur pET21b Ce vecteur comprend une origine de réplication bactérienne (ori pBR322), un gène de sélection
(AmpR) permettant la synthèse d’une β-lactamase, un promoteur T7 régulé par un opérateur lac O, le
gène lac I permettant la régulation de l’opérateur lac O et enfin un tag histidine que l’on retrouvera en
C-terminal de notre protéine de fusion. La protéine d'intérêt est clonée en utilisant les sites uniques de
restriction du site de clonage multiple (MCS).
Le problème majeur rencontré lors de la production du récepteur recombinant
est sa surexpression. En effet, celle-ci pourrait être à l’origine d’une dimérisation
artefactuelle. Par exemple, il a été montré pour le récepteur à la neurotensine NST1
(GPCR de classe A) que, pour une faible concentration en détergent,
l’oligomérisation du récepteur est dépendante de sa concentration. En effet, à faible
pET21b (5442 pb)
AmpR
ori pBR322
MCS Promoteur T7
lac I
His-tag
Supprimé : la fraction membranaire est récupérée puis dénaturée dans l’urée. Le récepteur recombinant est alors purifié
23
concentration, il est présent sous forme monomérique, tandis qu’à forte
concentration, il dimérise (White et al., 2007).
Il serait donc utile d’étudier si la concentration du récepteur BLT1 recombinant
a un effet sur son état d’oligomérisation.
Il a été précédemment montré que le détergent hexadecyl-β-D-maltoside est
idéal pour l’étude de la dimérisation de BLT1 (Mesnier et Banères, 2004). C’est
pourquoi nous travaillons avec ce dernier à faible concentration. En effet, de fortes
concentrations en détergent pourraient interférer avec la dimérisation du récepteur.
Cette étude nécessite une gamme de concentrations de BLT1 purifié et
solubilisé dans le détergent. Puis, une gel-filtration permet de déterminer la masse
moléculaire des espèces présentes en solution sachant, qu’en théorie, les masses
moléculaires des monomère et dimère sont respectivement de 37,9 kDa et 75,8 kDa.
Enfin, une électrophorèse en conditions non-dénaturantes permet d’estimer la
proportion de chaque espèce pour une concentration de BLT1 donnée.
Des expériences contrôles peuvent être réalisées en utilisant différents
détergents tels que le β-D-dodecyl maltoside dans lequel le récepteur est présent
dans un équilibre monomère-dimère (Mesnier et Banères, 2004). Ceci nous permet
de vérifier que ce n’est pas l’utilisation d’un détergent particulier qui induit la
dimérisation. De plus, le Kd du dimère peut être également modifié par la
concentration du détergent (White et al., 2007). Il est donc nécessaire de réaliser un
contrôle supplémentaire où la dimérisation est étudiée pour une concentration élevée
en détergent.
En supposant que l’homodimérisation de BLT1 en présence de détergent soit
confirmée in vitro par cette expérience, on pourra alors orienter notre étude sur
l’existence de cette même homodimérisation in vivo.
24
2. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vivo a. Immunoprécipitation à partir de membranes de leucocytes
L’anticorps polyclonal de lapin dirigé contre le récepteur BLT1 humain étant
disponible (GeneTex), il est possible de réaliser une immunoprécipitation afin de
vérifier la dimérisation du récepteur in vivo.
Le récepteur BLT1 est majoritairement exprimé chez l’homme dans les
leucocytes, c’est pourquoi nous choisissons de travailler sur des membranes de
leucocytes humains.
La démarche expérimentale est de purifier les leucocytes à partir
d’échantillons sanguins. Puis, les cellules sont soumises à un cross-link et une lyse.
La fraction membranaire ensuite récupérée est solubilisée dans du détergent. On
peut alors réaliser l’immunoprécipitation afin de récupérer les complexes stabilisés
par le cross-linker. Ces complexes sont ensuite analysés sur gel natif dans le but de
vérifier la présence de l’homodimère dont la taille attendue est d’environ 76 kDa. On
peut également s’attendre à détecter le complexe pentamérique (dimère BLT1-
protéine G) qui a une masse théorique de 161,9 kDa (Banères et Parello, 2003).
Les bandes correspondant à ces différentes espèces peuvent enfin être
analysées par spectrométrie de masse pour déterminer leur masse moléculaire
exacte, et par spectrométrie de masse en tandem afin d’identifier les partenaires de
BLT1 dans ces complexes.
Cependant, le problème majeur de l’immunoprécipitation est la possibilité
d’agrégation artefactuelle des récepteurs suivant les conditions de solubilisation et
de précipitation utilisées. En effet, les GPCRs sont de nature hydrophobe et ont donc
tendance à s’agréger en solution. Il est alors important de réaliser des expériences
de contrôle pour évaluer ce problème. D’une part, il sera pertinent de tester différents
détergents aux propriétés physico-chimiques variées (par exemple : β-D-dodecyl
maltoside et hexadecyl-β-D-maltoside) afin d’être sûr que le détergent n’est pas à
l’origine des interactions observées. D’autre part, il faudra également tester différents
agents cross-linkers (tels que : le formaldéhyde, le 2-iminothiolane hydrochloride et le
dithiobis [succinimidyl propionate]) pour les mêmes raisons.
25
b. Expériences de BRET Le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) et le BRET
(Bioluminescence Resonance Energy Transfer) sont des techniques très utilisées
pour visualiser directement les dimères de GPCR dans les cellules vivantes. Le
BRET mesure le transfert d’énergie provenant de la dégradation catalytique de la
coelenterazine par la Renilla luciférase (Rluc) vers l’accepteur EYFP (Enhanced
Yellow Fluorescent Protein) qui émet de la fluorescence en retour. L’excitation
d’EYFP est directement dépendante de la proximité moléculaire entre le donneur
(Rluc) et l’accepteur (EYFP) (figure 13).
Figure 13 : Le principe du BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)
A. La coelenterazine, substrat de la Renilla luciférase (Rluc) est dégradé, ce qui libère une énergie
lumineuse mesurable à 480 nm. Si EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) est localisée à
moins de 50 Ǻ, il y a transfert d’énergie du donneur (Rluc) vers l’accepteur (EYFP) et émission de
fluorescence à 530 nm.
B. Le BRET a largement été utilisé pour détecter la dimérisation des GPCRs à la membrane
plasmique.
B
A
26
Nous choisirions d’utiliser le BRET plutôt que le FRET car cette technique
présente plusieurs avantages :
- Par BRET, l’excitation d’EYFP est mesurable quand les deux
protéines sont localisées à une distance maximale de 50 Ǻ, contre
100 Ǻ pour le FRET.
- La méthode BRET ne nécessite pas une excitation de fluorescence
par une source lumineuse externe, contrairement au FRET. Cette
technique n’endommage donc pas les cellules et est insensible au
photoblanchiement.
Dans le but de réaliser cette expérience, il est nécessaire d’exprimer le
récepteur BLT1 recombinant dans des cellules mammifères. Pour cela, nous
choisissons des cellules Cos-7 puisque des études antérieures sur BLT1
recombinant ont déjà été menées dans cet hôte (Banères et Parello, 2003). Comme
décrit par Kroeger et al. (2001), l’ADNc de BLT1 est cloné par PCR dans le vecteur
pcDNA3 (Invitrogen) (figure 14), dans lequel on a également inséré en C-terminal la
région codante soit pour Rluc (récepteur donneur), soit pour EYFP (récepteur
accepteur).
Figure 14 : Vecteur pcDNA3 Ce vecteur eucaryote va être utilisé pour
exprimer le récepteur BLT1 en fusion avec soit
Rluc, soit EYFP en C-terminal. Il est
caractérisé par un gène de résistance
procaryote à l’ampicilline, un gène de
résistance eucaryote à la néomycine, une
origine de réplication f1, ainsi qu’un promoteur
CMV (CytoMegaloVirus).
27
Les deux plasmides sont alors transfectés dans les cellules hôtes, puis après
ajout du substrat de la Renilla luciférase, à savoir, la coelenterazine, on mesure la
fluorescence à 480 nm (émission de Rluc) et à 530 nm (émission d’EYFP). Afin de
vérifier que l’émission de lumière à 530 nm est bien spécifique d’EYFP, on mesure la
fluorescence à 530 nm dans une cellule transfectée par la construction BLT1/Rluc
seule, aucun signal ne devra alors être détecté. Le signal BRET est quantifié par le
calcul du ratio : (lumière émise à 530 nm) / (lumière émise à 480 nm).
Avant tout, il est nécessaire de valider nos constructions en vérifiant qu’elles
partagent les mêmes caractéristiques que le récepteur BLT1 natif. Pour cela, on peut
utiliser la microscopie confocale afin de démontrer que les protéines de fusion sont
bien exprimées à la membrane plasmique. De plus, des expériences de fixation de
LTB4 radioactif permettront de s’assurer que les fusions ne modifient pas l’affinité du
récepteur pour son agoniste naturel.
Si une homodimérisation est observée, d’autres contrôles pourront être
envisagés (figure 15). D’une part, en contrôle positif, on pourra utiliser une fusion
entre Rluc et EYFP qui devra donner un signal BRET plus important que nos
constructions BLT1/Rluc et BLT1/EYFP. D’autre part, afin de démontrer que le signal
observé ne résulte pas d’une interaction non-spécifique entre Rluc et EYFP, on co-
exprimera Rluc et EYFP (non-fusionnées) dans des cellules Cos-7 : aucun signal ne
devra être enregistré. Enfin, pour vérifier la spécificité d’interaction entre les deux
monomères BLT1, deux contrôles sont envisageables :
- D’une part, la co-expression de BLT1/Rluc avec la construction
récepteur β2-adrénergique/EYFP. Ces deux récepteurs n’étant pas
sensés hétérodimériser, aucun signal ne devra être détecté.
- D’autre part, la co-expression de BLT1/Rluc, BLT1/EYFP et BLT1
non taggué : dans ce cas, le récepteur sauvage entrera en
compétition avec les deux autres, ce qui devra résulter en une
diminution du signal.
Enfin, il a été montré précédemment que LTB4 stabilise la dimérisation
(Banères et Parello, 2003). Donc, en traitant avec LTB4 les cellules co-exprimant
BLT1/Rluc et BLT1/EYFP, les dimères étant favorisés, on devra observer une
augmentation du signal.
28
Figure 15 : Expériences de BRET A. Constructions co-exprimées dans les cellules Cos-7 pour tester l’homodimérisation.
B. Contrôle positif : fusion de Rluc et EYFP. Le signal BRET obtenu doit être optimal.
C. Contrôle négatif : co-expression de Rluc et EYFP non-fusionnées. Ce contrôle permet de vérifier
qu’il n’y a pas d’interaction non-spécifique entre les deux tags et donc pas de signal BRET.
D. Contrôle permettant de vérifier la spécificité de l’homodimérisation de BLT1. Le récepteur β2-
adrénergique n’étant pas sensé dimériser avec BLT1, aucun signal ne devra être observé quand les
deux constructions sont co-exprimées dans les cellules Cos-7.
E. Contrôle supplémentaire permettant de vérifier la spécificité de l’homodimérisation. Quand les deux
fusions sont co-exprimées avec le BLT1 sauvage (non-taggué), il y a compétition et donc diminution
du signal.
Après avoir démontré que BLT1 homodimérise in vivo, on peut se demander à
quelle étape de la biosynthèse du récepteur cette dimérisation se produit. A savoir si
comme pour le récepteur GABAB, elle se produit dans le réticulum endoplasmique
(Terrillon et Bouvier, 2004 ; Bulenger et al., 2005 ; Pin et al., 2005) ou après
adressage à la membrane plasmique.
Rluc EYFP + Signal
BLT1
BLT1 EYFP
BLT1 Rluc
+
+Signal +
BLT1 Rluc
EYFP BLT1
+ Signal ++
Rluc EYFP Signal +++
β2R EYFP
BLT1 Rluc
+ Signal
A
C
D
E
B
29
c. Localisation cellulaire de la dimérisation de BLT1 Dans ce but, une étude utilisant la bréfeldine A, drogue qui bloque la formation
des vésicules allant du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi, peut être
réalisée.
On utilise la même construction que précédemment, soit une co-expression
dans les cellules Cos-7 de BLT1/Rluc et BLT1/EYFP. Puis, les cellules transfectées
sont traitées à la bréfeldine A : les récepteurs sont donc bloqués au niveau du
réticulum endoplasmique. Ainsi, si un signal BRET est détecté, cela signifie que la
dimérisation se produit dans le réticulum endoplasmique.
Comme contrôle positif, on pourra utiliser des cellules Cos-7 exprimant les
récepteurs GABAB1/Rluc et GABAB2/EYFP. Après traitement à la bréfeldine A, on
s’attendra à observer un signal BRET étant donné que le récepteur GABAB dimérise
au niveau du réticulum endoplasmique.
3. Perspectives S’il apparaît que l’homodimérisation de BLT1 est bien confirmée in vivo, il sera
alors intéressant d’étudier sa capacité à hétérodimériser avec d’autres GPCRs de la
même famille ou partageant une plus faible homologie. En effet, il a été montré que
par exemple, les récepteurs δ-opioïde et κ-opioïde sont capables de s’associer.
L’hétérodimérisation pourra être mise en évidence par co-
immunoprécipitation. Il est à noter que l’expérience d’immunoprécipitation sur les
membranes de leucocytes envisagée dans notre projet de recherche peut déjà
révéler la présence de nouveaux partenaires de BLT1. Ces protéines seront alors
identifiées par une analyse de spectrométrie de masse en tandem. Après
caractérisation des partenaires, une analyse par BRET pourra confirmer l’existence
de tels hétérodimères dans les cellules vivantes.
La découverte d’hétérodimères pourrait avoir une importance physiologique et
pharmacologique. En effet, si les deux monomères de l’hétérodimère activent des
protéines G différentes, on peut supposer que de nouvelles voies de signalisation
pourront être activées. De plus, en utilisant des ligands bivalents, il serait alors
possible de cibler spécifiquement ces hétérodimères, dans le cas où ils
présenteraient un intérêt thérapeutique.
30
Bibliographie
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Supprimé : ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶<sp>¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶<sp>Figure 1 : Topologie des GPCRs¶L’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité C-terminale intracellulaire. Ils présentent 3 boucles extracellulaires (E1 à 3) et 3 boucles intracellulaires (I1à 3). Notons la présence d’un pont disulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de N-glycosylation au niveau du domaine N-terminal ainsi qu’un site d’acylation par des composés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4.¶ ¶¶<sp><sp><sp>¶¶¶Figure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changements conformationnels relatifs du domaine transmembranaire¶... [1]
Page 33: [1] Supprimé petite fleur 03/02/2008 14:04:00
Figure 1 : Topologie des GPCRs L’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité C-terminale intracellulaire. Ils
présentent 3 boucles extracellulaires (E1 à 3) et 3 boucles intracellulaires (I1à 3).
Notons la présence d’un pont disulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de N-
glycosylation au niveau du domaine N-terminal ainsi qu’un site d’acylation par des
composés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4.
Figure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changements conformationnels relatifs du domaine transmembranaire
A. Un GPCR au repos (1) est activé par la liaison d'un agoniste spécifique (2). Le
changement de conformation du complexe agoniste-récepteur, induit par cette
liaison, permet l'activation de l'échange du GDP par du GTP et donc l'activation de la
protéine-G hétérotrimérique : sous-unités Gα� et Gβγ�� intracellulaires (3) qui vont
aller réguler l'activité de divers effecteurs (4) membranaires ou cytosoliques. Le
déclenchement de l'activité phosphatase, intrinsèque à la sous-unité G� entraîne la
réassociation des sous-untités Gα� et Gβγ�� (5) et le retour à l'état initial (1).
A
B. L’activation du récepteur par la fixation de son agoniste entraîne un changement
conformationnel. On observe la rotation dans le sens des aiguilles d’une montre de
TM6 et un éloignement des TMs 3 et 6.
↓
Figure 3 : Internalisation d’un GPCR
Le récepteur est découplé de la protéine G par phosphorylation par la GRK (G-
protein Receptor Kinase). Le récepteur phosphorylé est reconnu par l’arrestine qui
induit son endocytose clathrine-dépendante. Il sera alors, soit recyclé à la membrane
après déphosphorylation et élimination de l’agoniste, soit dégradé après fusion de la
vésicule d’endocytose avec le lysosome.
