Influence d'une deshydratation et d'une congelation (- 196°C) sur les ultrastructures des plantules d'Al1iurn cepa. ~ t u d e aprks impregnation metallique

MONIQUE COLSON Universite' Pierre et Mnrie Curie, Lnborntoire de Cytologic ve'ge'tale expe'rimentale, 12, rue Cuvier, 75230 Paris, France

Requ le 10 septembre 1981

COLSON, M; 1982. Influence d'une deshydratation et d'une congelation (- 196°C) sur les ultrastructures des plantules dlAllium cepa. Etude aprks impregnation mitallique. Can. J. Bot. 60: 1545-1553.

Une deshydratation artificielle appliquee B des plantules d'Allium cepa igCes de 3 jours, au debut de leur phase de croissance, entraine des changements physiologiques et ultrastructuraux. La technique de l'impregnation osmique fait apparaitre diverses alterations des dictyosomes, du reticulum, de l'enveloppe nuclkaire. La deshydratation des plantules s'accompagne d'une diminution du pouvoir reducteur de divers compartiments cellulaires. Cet affaiblissement caracterise aussi les m&mes organites des tissus de la graine en vie ralentie. Sous l'effet d'une dessiccation des plantules, les tissus entrent a nouveau en vie latente et deviennent resistants au froid. Lorsque les plantules dCshydratCes artificiellement sont traitees par l'azote liquide (- 196"C), les cellules ne subissent que des modifications 1Cgkres. Les alterations demeurent reversibles aussi bien aprks la dessiccation qu'h la suite d'une congelation ii - 196°C. L'tvolution des structures et leur rCactivitC aprks la technique de l'impregnation osmique a CtC suivie au cours de la rehydratation.

COLSON, M; 1982. Influence d'une deshydratation et d'une congelation (- 196°C) sur les ultrastructures des plantules d'Allium cepa. Etude aprks impregnation mitallique. Can. J . Bot. 60: 1545-1553.

Artificial dehydration of 3-day-old seedlings of Allium cepa produces physiological and ultrastructural changes. Osmium fixation caused various alterations in dictyosomes, the endoplasmic reticulum, and the nuclear envelope. Seedling dehydration was accompanied by a lowering of the reduction capacity of various cell components. This lower reduction capacity also affected the same organelles in seed tissues. When seedlings were dehydrated, their tissues returned to a resting state, and became cold resistant. When artificially dehydrated seedlings were treated with liquid nitrogen (-196"C), cells only underwent slight changes. These alterations were reversible both after dehydration and after freezing to - 195OC. During rehydration, the changesin cell structures and their reactivity following the osmic fixation technique were observed.

[Journal translation]

Introduction Au cours de l'hydratation les semences deviennent

sensibles a certains facteurs de l'environnement. Selon 1'Ctat de leur dCveloppement, une certaine dessiccation des plantules est possible sans que leur pouvoir germina- tif soit rCduit (Bonnier 1892). L'effet d'une dkshydrata- tion artificielle peut cependant avoir des consCquences sur les phases ultCrieures de la croissance. Un traitement de dessiccation peut stimuler la germination des semen- ces d'Avoine et de Tomate (Berrie et Drennan 1971), de Carotte et de Mais (Austin et al. 1969; Hegarty 1970), de Laitue (Heydecker et Coolbear 1977) et de Coton (Thomas et Christiansen 1971). Durant les premikres heures de l'imbibition de la plantule, des ARN et des protCines sont synthCtisCs (Sen et Osborne 1974). MalgrC le traitement de dishydratation, ces molCcules nCoformCes persistent sans altCrations notables. Au cours de la rkhydratation, elles seraient responsables du fait que la germination est stirnulee. Par contre, la rCsistance des plantules au traitement de dessiccation disparait au moment ou la radicule Cmerge (Hanson 1973). Pour les semences de Mays, le seuil oh elles deviennent altCrables a une dkshydratation artificielle correspond aux phases de l'initiation de la synthkse de

1'ADN et a celle de la duplication du genome (Deltour et Jacqmard 1974).

Les germinations d'Alliurn cepa supportent une dCs- hydratation artificielle. Toutefois, leur resistance depend de 1'Ctat de dCveloppement de la plantule au moment du traitement. On peut llapprCcier d'aprks la phase de croissance de la radicule. Le comportement de certaines structures cellulaires a CtC suivi pendant les traitements de dessiccation. Leur evolution a CtC CtudiCe ensuite au cours de la rkhydratation. Les techniques ultrastructurales utilisees comprenaient la double fixa- tion (glutaraldkhyde, tCtroxyde d'osmium) d'une part, l'imprkgnation osmique d'autre part. Cette technique- ci, rarement employCe avec les tissus a faible teneur en eau, comme ceux des graines en vie ralentie (Colson 1980), met en Cvidence d'une f a ~ o n sClective certains compartiments cellulaires.

Des plantules de diffkrentes espkces placCes en anhydrobiose peuvent rCsister aux basses tempkratures (Becquerel 1932; Sun 1958). Les semences dlAlliurn cepa, hydratCes durant 3 h, deviennent sensibles a une congClation a - 196°C (Colson 1979). Toutefois, si on dCshydrate artificiellement des plantules de 3 jours, elles acquikrent a nouveau une certaine rCsistance a un

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traitement par l'azote liquide. Nous avons recherchk les modifications que pouvait dkclencher la congklation sur ce materiel ainsi dkshydrate.

Materiel et techniques Trairernent des plantules

Des semences d'Allium ,cepa, varittt "jaune paille des Vertus", fournies par les Etablissements Vilmorin, ont ttt rnises a germer sur papier filtre hurnide, a 21°C, a I'obscuritt, durant des ptriodes varites de quelques heures a plusieurs jours (1 a 10 jours). Aprks 3 jours d'hydratation, les gerrnina- tions ont C t t stlectionntes d'aprks la longueurde leur radicule. Trois lots ont CtC distinguts, dont les radicules ttaient comprises entre 0-2, 2-4 et 4-6mm. Ces germinations, plactes 5 I'air libre, se dtshydrataient pendant 24 h. Une fraction de chaque lot Ctait alors irnmergte dans I'azote liquide pendant 10 rnin. Aprks la dtshydratation suivie ou non de congtlation les sernences ttaient replackes sur milieu humide, a 21°C, ?I l'obscuritt, durant des ptriodes tchelonntes de 1 h a 4 jours.

A chaque stade, la teneur en eau des divers tchantillons Ctait estirnte par rapport au poids sec. Celui-ci Ctait obtenu en placant le lot de semences dans une ttuve a 120°C, pendant 24 h.

Techniques d'irude pour la rnicroscopie e'lectronique Des tchantillons ont t t C prtlevts a l'extrtmitt de la radicule

dans diverses conditions: graines normalement hydratCes; graines hydrattes, puis dtshydrattes artificiellernent; germina- tions hydrattes, puis dtshydrattes, puis soumises a une congtlation; graines ayant subi ces divers traitements et rthydrattes sur un milieu hurnide pendant des durtes varites. 11s ont ttt fixts par une solution de tttroxyde d'osrnium (l%, 2 h, 21 "C), tamponnte au vtronal (pH 7,4), puis imprtgnts dans le tttroxyde d'osmium non tamponnt (2%, 3 jours, 48°C). Les pikces ttaient dtshydratkes et incluses dans 1'Araldite. Sans traiternent contrastant, les coupes Ctaient observtes avec un microscope tlectronique Hitachi H u l l 1 E. D'autres tchantillons ont CtC fixts par une solution de glutaraldthyde a 4% dans du tampon cacodylate (pH 7,4, 45 min, 4°C) puis post-fixts par du tttroxyde d'osmium I%, tamponnk par une solution a base de vkronal. Aprks dtshydra- tation et inclusion dans I'Araldite, les sections ultrafines Ctaient contrastCes par le permanganate de potassium en solution aqueuse a 1 %.

Resultats Observations physiologiques

Teneur en eau des germinations Les germinations d'Allium cepa sont ~Clectionnees, le

3e jour d'imbibition, selon 1'Ctat de croissance de la radicule, 1, 3 ou 5 mm. Leur dessiccation artificielle provoque une forte diminution de la teneur en eau au cours des 3 premieres heures. Apres 24 h, la proportion d'eau (9% du poids sec) est comparable a celle des graines en vie ralentie. Si on hydrate 2 nouveau ces plantules, l'entree d'eau s'effectue tres rapidement (fig. 1, B). Puis de (15 a 72 h) la teneur en eau augmente plus lentement. Aprks 72 h, la vitesse d'hydratation s'accroit

?i nouveau. L'absorption d'eau s'effectue en trois phases successives, comme pendant l'imbibition des semences (fig. 1 , A). Toutefois, elle est plus rapide dans les plantules artificiellement deshydratees.

Variation du pouvoir germinatif, effets morphologi- ques d'un traitement de dbhydratatiotz

Des graines, mises 5 germer durant 3 jours a 21°C et dont les radicules ne sont pas encore sorties du tkgu- ment, sont dkshydratees pendant 24 h. Elles sont placees ensuite dans des conditions d'humidite favorables. Leur pouvoir germinatif atteint 80% par rapport aux plants non deshydrates. La proportion des germinations qui survivent est moindre quand les radicules des plantules initiales sont plus longues (fig. 2, A). Elle est de 68% pour le lot dont les radicules mesurent I mm en moyenne. Le taux de survie est de 62% quand les germinations selectionnCes ont des radicules de 3 mm de longueur. Les germinations dont la radicule est com- prise entre 4 et 6 mm ne survivent pas ti une dkshydrata- tion de 24h. Quand les germinations des lots 0, 1 et 3 mm sont deshydratkes, puis congelees Zi la tempkrature de - 196°C pendant 10 min, les taux de survie atteignent respectivement 60, 45 et 40% (fig. 2, B).

Quand les germinations dont la radicule mesure 1-3 mm sont soumises 5 une deshydratation artificielle, elles subissent des changements physiologiques. La croissance de leur radicule se trouve ralentie par rapport ?i celle de lots temoins du m&me 2ge. La dessiccation peut declencher aussi des troubles morphologiques. Ainsi, la radicule s'accroit parfois en prenant une forme helicoidale. Cet aspect est probablement la rksultante de perbubations de divers tropismes tels que le geotro- pisme, l'hydrotropisme . . . .

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hydrototion ( h )

FIG. 1. Variation de la teneur en eau par rapport au poids sec (A) des semences et (B) des germinations dkshydrattes 24 h, en fonction de la durte d'hydratation en heures 21°C.

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Si les graines dCshydratCes artificiellement sont ensuite congelCes, la cinetique de leur croissance ultCrieure n'est pas sensiblement modifiCe par rapport celle des tCmoins dCshydrat&s, non congelCs.

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Observations cytologiques Ultrastructures des cellules radiculaires te'moins Les cellules du cortex radiculaire des semences

d'Allium cepa hydratCes durant 3 jours sont trks vacuoli- sCes (fig. 3, v). Les noyaux arrondis contiennent des travCes irrCgulikres et fines de chromatine (fig. 3, ch). Aprks l'emploi de la technique de I'imprCgnation osmique, un dCp6t dense marque l'enveloppe nuclCaire (fig. 3, en). Cette technique permet aussi de caractkriser le rCseau Ctendu que forme le rkticulum endoplasmique (fig. 4, re). Les cellules corticales des semences hydratees durant 3 jours renferment des dictyosomes typiques (fig. 5, 6). Les saccules qui constituent les dictyosomes reduisent fortement le tCtroxyde d'osmium, ainsi que les vCsicules qui en dCrivent (vg).

Effets d'une de'shydratation de 24 h Les semences hydratCes pendant 3 jours subissent

longueur ( mm)

FIG. 2. Variation du pouvoir germinatif en pourcentage, en fonction de la longueur de la radicule en millimktres au moment du traitement de dkshydratation (A), suivi d'une congklation - 196°C (B) .

ensuite une dessiccation durant 24 h. Les cellules radiculaires corticales sont plus rCduites que les cellules analogues des tCmoins. Les cellules ont l'aspect plasmo- lysC, des espaces de retraction se sont formCs (fig. 6, er). Le cytoplasme est parseme de nombreuses petites vacuoles globuleuses (fig. 6 , v). Le systkme vacuolaire s'est fragment6 au cours de la dkshydratation. Dans le noyau, la chromatine (ch) est condensCe en amas. Aprks la technique de l'imprkgnation osmique, l'enveloppe nuclCaire n'est pas typiquement marquee (fig. 7, en). Les saccules du rCticulum endoplasmique sont faible- ment opacifiCs (fig. 8, re). Ca et la, existent un a deux saccules golgiens entourCs par un grand nombre de vCsicules (fig. 9, vg).

Effets d'une nouvelle hydratation L'imprCgnation osmique permet de suivre des pheno-

mknes cytologiques pendant l'entree de l'eau. Dans les plantules (radicules mesurant 1 2 3 mm), au

dCbut de la rkhydratation de 1 h, les espaces de retraction diminuent (fig. 10, er). Les structures demeurent peu impregnkes. Quelques vCsicules dissCminCes dans le cytoplasme ont un contenu opaque aux electrons (fig. 10, vr). Aprks 6 h de rehydratation des plantules, l'enve- loppe nuclCaire acquiert nouveau la propriCtC de rCduire l'osmium (fig. 1 1, en). Les saccules de reticu- lum imprCgnes (re) sont plus longs et plus nombreux. Apres une periode de rehydratation de 18 h, la reparti- tion et l'aspect des elements de rCticulum (fig. 12, re) deviennent analogues aux cellules temoins (fig. 4, re). Les dictyosomes (fig. 13, d) retrouvent la morphologie antkrieure. Cependant, de nombreuses vCsicules (vg) de diametres varies persistent dans les territoires adjacents aux saccules. Les modifications ultrastructurales obser- vCes sur les radicules dCshydratCes sont en grande partie rkversibles. Toutefois, dans le cas des plantules plus avancCes (lot dont les radicules atteignaient 5 mm au moment de la dkshydratation), m&me aprks plusieurs heures de rehydratation, de profondes modifications ultrast~cturales subsistent. Le noyau demeure digit6 (fig. 14, n). L'enveloppe nuclCaire n'est pas impregnCe (en). Dans le cytoplasme, des vCsicules diverses sont opacifiees (vr). Dans ce cas, la dessiccation a donc provoquC des altCrations irrkversibles. Cependant, dans certaines cellules, les dictyosomes conservent un aspect typique et sont bien impregnCs (fig. 15, 6).

Ultrastructure des plantules de'shydrate'es et conge- le'es

Quand les plantules de 1 a 3 mm, dCshydratCes artificiellement, sont traitCes ensuite par l'azote liquide, leurs cellules ne subissent que des modifications mineu- res a l'echelle ultrastmcturale.

Dans le cytoplasme condense, les saccules du reticu- lum sont faiblement marquCs par des dCp6ts denses (fig. 16, re). Certains ne sont pas opacifiCs (fig. 17, re).

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L'enveloppe nuclkaire ne reduit pas l'osrniurn (fig. 16, en).

Au cours de la rkhydratation des plantules de 1 rnrn, la rnorphologie et la rkactivite du rkticulurn (fig. 18, re) des dictyosomes, de l'enveloppe nuclkaire (fig. 19, d, en) sont restaurks. Toutefois, le caractkre rkversible du phknomkne n'est pas observk pour le lot dont les racines rnesurent 3 rnrn au moment des traiternents. Bien que les saccules de rkticulurn soient irnpregnes, ils diffkrent des temoins par leur bordure sinueuse, et leurs aspects pectinis (fig. 20, re).

Discussion La technique de l'irnprkgnation osrnique employee

sur les plantules d'Allium cepa dkshydratkes artificiel- lernent fait apparaitre la sensibilitk des cytomernbranes aux modifications hydriques. Bien que le processus physico-chirnique de l'irnprkgnation reste ma1 connu (Marty 1973; Carrapiso et Pais 198 l ) , il est possible que le milieu d'irnpregnation constitue un cornposk orga- nornetallique avec certains lipides ou phospholipides des membranes (Nieubauer et al. 1969).

Mod$cations ultrastructurales des dictyosomes et du rtticulum

Aprks la dkshydratation naturelle qui s'effectue au

cours de la maturation des graines de Pin, de Blk, de Laitue, de Riz, les dictyosornes ne sont plus distincts (Sirnola 1974; Swift et O'Brien 1972; Paulson et Srivastava 1968; Bechtel et Porneranz 1977). Des vksicules golgiennes remplacent les dictyosomes typi- ques aprks un traiternent de dkshydratation des Mousses (Noailles 1978) ou des racines de Mays (Nir et al. 1969). Au cours de la desiccation de racines de Ma'is, le reticulum s'organise en nappes parallkles (Ciarnporova 1976). Par contre, un traiternent de dkshydratation des ernbryons de Seigle, hydrates au prkalable durant 3 h, provoque une fragmentation du rkticulurn (Sargent et al. 198 1). Dans les ernbryons d'Allium cepa en vie ralentie, des vCsicules representent des klernents de rkticulurn qui ont acquis une rnorphologie spkciale (Colson 1980).

La dkshydratation artificielle des plantules d'Allium cepa 2gkes de 3 jours provoque des modifications ultrastructurales profondes. Les dictyosornes ne sont plus distincts. Le reticulum forme des groupes compacts de saccules. Dans le cytoplasrne, diverses vksicules apparaissent. Les unes peuvent &tre relikes aux dictyo- sornes, les autres sont issues de la fragmentation de certains profils de rkticulurn. Aprks l'ernploi de la technique de l'irnprkgnation osrnique, les propriktks rkductrices, trks lirnitkes, de ces organites, sont cornpa- rables a celles des tissus en vie ralentie.

FIG. 3-5. Plantules tCmoins 2gCes de 3 jours. ImprCgnation osmique. Fig. 3. Vue gCnkrale d'une cellule du cortex radiculaire. L'appareil vacuolaire (v) est form6 de grandes inclusions claires qui fusionnent. L'enveloppe nuclCaire (en) et de multiples saccules de reticulum endoplasmique (re) sont imprCgnCs. ch, chromatine. x 4 200. Fig. 4. Longs saccules de reticulum diversement orientCs (re). X 18 000. Fig. 5. Dictyosomes (6) dont les divers saccules ont rCduit le rtactif. vg, vCsicules golgiennes opacifiCes. X 36 000.

FIG. 6-9. Plantules 2gCes de 3 jours dCshydratCes pendant 24 h a 21°C. Fig. 6. Aprks dkshydratation, l'appareil vacuolaire est fragment6 (v). Dans le noyau (n) chromatine (ch) condensCe, pa, parois dont leprofil est sinueux; er, espace de rktraction entre la paroi (pa) et le plasmalemme (pl). Fixation: glutaraldkhyde tCtroxyde d'osmium contrastant: KMnO,. x 6 000. Fig. 7-9. ImprCgnation osmique. Fig. 7. L'enveloppe nuclCaire (en) n'est pas imprCgnCe. La chromatine (ch) se prCsente sous forme d'Cpaisses travCes. X 11 000. Fig. 8. Groupes compacts de saccules de rkticulurn (re) imprCgnCs de faqon irrkgulikre, flkche simple, saccules 1Cgkrement opacifikes; flkche double, zone non imprCgnCe. X 36 000. Fig. 9. Nombreuses vCsicules, vg, dCrivant probablement de dictyosomes prkexistants. x 24 000.

FIG. 10-15. Piantules de 3 jours (radicules mesurant 1 a 5 mm) dCshydratCes 24 h, puis rChydratCes pendant 1, 6 ou 18 h. ImprCgnation osmique. Fig. 10. Radicule de 1 mm, rihydratation 1 h. Les cellules du mCrist2me sont peu imprkgnkes; l'enveloppe nuclCaire (en) n'est pas opacifiCe, vr, vCsicules denses; pa, paroi; er, espace de rktraction. X4100. Fig. 11. Radicule de 1 mm, rkhydratation 6 h. L'imprCgnation des cellules est comparable a celle des cellules tCmoins (fig. 4). en, enveloppe nuclCaire; re, rCseau de rCticulum, v, inclusions vacuolaires. X 3000. Fig. 12. Radicule de 1 mm, rkhydratation des plantules pendant 18 h. Longs saccules de rkticulurn (re) imprCgnCs. L'enveloppe du noyau (en) est dense aux Clectrons. X 18 000. Fig. 13. Radicule de 1 mm, rkhydratation 18 h. Dictyosomes (6) dont les saccules sont opacifikes; vCsicules golgiennes (vg) a proximitC. Dans le cytoplasme nombreuses vCsicules (vr) imprCgnCes en chapelet. re, rCticulum. X 23 000. Fig. 14. Radicule de 5 mm, rkhydratation pendant 18 h. L'enveloppe nuclCaire (en) n'est pas imprCgnCe. Noyau (n) lob6 dont la chromatine (ch) parait condensee. Dans le cytoplasme, nombreuses vCsicules opacifiCes (vr) de dimensions variCes. X8400. Fig. 15. M&me radicule que la fig. 14. L'intCgritC des dictyosomes (6) est parfois conservCe. x 31 000.

FIG. 16-20. Plantules de 3 jours (radicules de 1 i 3 mm) dCshydratCes 24 h, soumises a un traitement de congklation de 10 min (fig. 16 et 17), puis r6hydratCes pendant 15 h (fig. 18 h 20). Impregnation osmique. Fig. 16. Radicule de 1 mm. Tr2s peu de structures sont imprCgnCes. en, enveloppe nuclkaire non opacifite; re, rCticulum faiblement marquC. X6000. Fig. 17. Radicule de 1 mm. Des saccules de rCticulum (re) demeurent distincts sans &tre imprkgnCs. x 36000. Fig. 18. Dans le mCristknle des plantules (radicules 1 mm) dCshydratCes congelCes, puis rChydratCes; le reticulum (re) est fortement opacifiC. Les empilements des saccules tentent a se disperser. X 23 000. Fig. 19. Radicule de 1 mm. L'enveloppe nuclkaire (en), les saccules des dictyosomes (6) et les vCsicules golgiennes (vg) sont bien imprCgnCes. X 36 000. Fig. 20. Radicule de 3 mm. Les profils de rkticulum (re) s'opacifient lkgkrement; les saccules sont courts, avec une morphologie irrCgulikre. x 23 000.

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Les troubles provoquCs par la dkshydratation artifi- cielle, sont rkversibles, puisque, quand les plantules ont CtC rChydratCes, la distribution et les caractkres des saccules imprCgnCs redeviennent les m&mes que chez les tCmoins (plantules de 3 jours). Un rCseau complexe de saccules se trouve opacifik. Les vCsicules golgiennes rCgressent et des dictyosomes typiques se forment.

Sensibilite'du noyau et de l'enveloppe nucliaire dans les plantules de'shydrate'es ou re'hydrate'es

L'aspect de la chromatine se modifie dans des materiels trks divers. C'est le cas pour les embryons de BlC, au cours d'un traitement d'endurcissement B la sCcheresse (Marinos et Fife 1972), les racines de Mais en voie de dkshydratation (Nir et al. 1969; Ciamporova 1976; Crevecceur et al. 1976), ou encore les graines de Seigle pendant leur maturation (Hallam 1972). Par contre, dans les feuilles dCshydratCes de Borya nitida, la chromatine nucleaire conserve un aspect disperse (Gaff et al. 1976). Une dkshydratation peut se manifester au cours des gelCes hivernales. Une cristallisation extra- cellulaire se produit dans les feuilles d'lris. Les cellules se dtshydratent et prennent l'aspect plasmolysC (Gene- vks 1957). Dans le noyau, la chromatine se condense. De, m&me, un refroidissement graduel des rameaux d'EpicCa dCclenche une dkshydratation des bourgeons. Ce traitement provoque une retraction du protoplasme et une .condensation de la chromatine (Dereuddre 1980).

Quand des germinations d'Allium cepa 2gCes de 3 jours sont deshydratkes pendant 24 h, la chromatine apparait condensCe a 1'Cchelle ultrastructurale. Son aspect devient comparable a celui observe dans les graines en vie ralentie (Colson 1979). La formation des travtes Cpaisses d'htterochromatine est en rapport avec la faible teneur en eau du materiel. La technique de I'imprCgnation osmique met en Cvidence des propriCtCs particulikres de l'enveloppe nucleaire. Dans les radicu- les des plantules dCshydratCes artificiellement, comme dans le cas des radicules embryonnaires d'Allium cepa (Colson 1980) elle n'a pu &re imprCgnCe. La rCactivitC de l'enveloppe nucltaire est retablie au cours de la rkhydratation. Cette proprietC depend etroitement de 1'Ctat gtntral d'hydratation du tissu. Le caractkre rC- versible de cette rCactivitC est un bon indice de l'etat vi- vant des cellules. Ce comportement souligne l'impor- tance de l'enveloppe nucleaire, qui constitue un compar- timent intermkdiaire entre le nuclCoplasme et le cyto- plasme, et qui contr6le les relations entre eux.

Les plantules d7Allium cepa peuvent supporter une congelation (- 196°C) a la suite d'une deshydratation artificielle. Le pourcentage des survivants, bien que plus faible, n'est pas nkgligeable. Ces plantules avaient cependant subi un debut de germination, avec une Cvolution cytologique qui traduisait des phenomenes biochimiques ou structuraux importants (hydrolyse des riserves, biosyntheses croissance cellulaire.. .). Les tissus qui ont subi la deshydratation artificielle Ctaient dans un Ctat fonctionnel (vie active) trks different de celui des tissus de la graine (vie ralentie). Les structures qui se sont appauvries en eau rapidement sont placees artificiellement dans un Ctat de vie latente qui s'accom- pagne d'un accroissement de la rCsistance au froid. Le traitement par l'azote liquide, dans les conditions oh il a Cte appliquC, n'entraine pas de perburbations notables. Le comportement des structures cellulaires ressemble celui des graines non germees congelees (Colson 1979). L'influence du froid se trouve masquCe par les effets tres prononcCs de la dkshydratation qui la preckde.

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