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GUILLAUME DAGENAIS
EFFET DES PIGMENTS XANTHOPHYLLES JAUNES DU GLUTEN DE MAÏS ET UTILISATION DE DIFFÉRENTS
" " NIVEAUX DE LYSINE DANS LA MOULEE D'ELEVAGE; IMPACTS SUR LES PERFORMANCES ET LA COLORA TION DE LA TRUITE ARC-EN-CIEL
(ONCHORYNCHUS MYKISS)
Mémoire présenté à la Faculté de's études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en sciences animales pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES ANIMALES FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LA V AL QUÉBEC
2008
© Guillaume Dagenais, 2008
11
RÉSUMÉ
L'utilisation de gluten de maïs (GM) jaune dans les moulées d ' aquaculture est une pratique de plus en plus courante. En plus d ' être très digeste, le GM est faible en phosphore et contient plus de 60% de protéines digestes. Le GM jaune est très concentré en pigments caroténoïdes xanthophylles jaunes. TI a cependant été démontré que ces pigments ont un pouvoir colorant indésirable sur la chair des salmonidés. Lè GM est aussi pauvre en lysine et les régimes alimentaires contenant un haut ni veau de GM peuvent montrer une légère déficience en lysine, ce qui limite la déposition protéique chez les poissons. Quatre régimes alimentaires (36% de protéines digestibles, 19 Ml kg-1 d ' énergie digestible, 50 ppm d' astaxanthine) ont été formulés pour contenir 12% de farine de poisson et 30% de GM blanc ou jaune. Un régime contenant 36% de farine de poisson et aucun GM a également été utilisé. Les moulés ont été distribuées à des truites arc-en-ciel (poids initial = 119 g) élevés à 12 0 C pendant 140 jours. Le premier objectif de cette étude était d'étudier l'effet des pigments xanthophylles sur la déposition des pigments dans la chair de la truite arc-en:ciel. Le second objectif consistait à étudier l'effet de différents niveaux de lysine dans la moulée sur les performances et la pigmentation de la truite arc-en-ciel.
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AVANT-PROPOS
J'aimerais tout d'abord remercier mon directeur de recherche, le Dr. Grant W. Vandenberg, avec qui j'ai su découvrir le vrai sens du mot recherche. Je remercie tout autant un grand chercheur en alimentation aquacole, le Dr. Dominique Bureau de l'Université de Guelph en Ontario pour ses précieux conseils ainsi que Dr. Matilde DeFrancesco, pour la fabrication de la moulée ainsi que ses conseils lors de la planification du projet.
Le projet n'aurait jamais eu lieu sans le support financier du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (Ottawa, ON), de La Société de Recherche et de Développement en Aquaculture Continentale inc. (SORDAC) (Québec, Qc) et du R~seau Aquaculture Québec (RAQ) (Rimouski, Qc). Pour leur collaboration, j'aimerais aussi remercier Degussa (Burlington, ON), Radient Technologies (Burlington, ON), Martin Mills (Elmira, ON) et Ontario Corn Producers Association (OCPA) (Guelph, ON).
Autant pour leur soutien technique que moral, j'aimerais remercier les membres de l ' équipe Vandenberg; A. Bélanger-Lamonde, E. Boucher, A. Desmeules, S. Houle, E. Proulx. Un grand merci aux étudiantes qui m'ont aidé avec les analyses de laboratoire; J. Fournier, A. Potvin et S.-M. Scantland-Marchand. Un merci tout particulier à P. Dubé de l'Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels (IN AF) (Québec, Qc) pour avoir fait les anal yses HPLC et aux techniciens du laboratoire de sciences animales de l' Uni versité Laval; M. Gingras, F. Giguère, et S. Daigle pour leur aide technique. Mille mercis à toute l'équipe du Laboratoire de Recherche en Sciences Aquatiques (LARSA) ; 1. Frenette, S. Higgins ainsi que J-C. Therrien pour leur support technique aux systèmes aquacoles.
Finalement, je voudrais remercier ma famille, mes amis et ma conjointe pour leur soutien moral tout au long de mes études. '
IV
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ ... ; .................................................................................................................... -....... ii AVANT-PROPOS ................................................................................................................ iii TABLE DES MATIÈRES ..................................................................................................... iv LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................... vi LISTE DES FIGURES ........................................................................................................ vii CHAPITRE 1 : REVUE DE LITTÉRATURE ....................................................................... 1
1.1 La production aquacole ................................................................................................. 2 1.2 Sous-produits de poisson .............................................................................................. 3 1.3 Utilisation de protéines végétales dans les régimes alimentaires ................................. 4
1.3.1. Le gluten de mais .................................................................................................. 6 1.3.2. Phosphore vs facteurs antinutritionnels ............................................................... 6 1.3.3 Les acides aminés .................................................................................................. 7
1.4 Généralités sur les caroténoïdes .................................................................................... 8 1.4.1 Les xanthophylles ......................................... ........................................................ 10
1.5 Utilisation de gluten de maïs jaune dans les moulées ................................................. 11 1.6 Les pigments et le choix du consommateur. ........................................ : ...................... 11 1.7 Facteurs influençant la pigmentation .......................................................................... 12 1.8 Digestion et absorption des caroténoïdes .................................................................... 13 1.9 Composition des ingrédients vs. pigmentation des poissons ...................................... 15
1.9.1 Supplémentation en lipides alimentaires ............................................................. 15 1.10 Les protéines structurales et la pigmentation ............................................................ 16 1.11 Compétition lutéine vs. autres pigments ................................................................... 17 1.12 Utilisation du gluten de maïs blanc dans les moulées d'aquaculture ....................... 19 1.13 Extraction et quantification des caroténoïdes ........................................................... 20 1.14 Conclusion ................................................................................................................ 21
CHAPITRE 2 : THE EFFECTS OF YELLOW XANTHOPHYLLS PIGMENTS FROM CORN GLUTEN MEAL AND DIETARY LYSINE LEVEL ON PERFORMANCE AND FLESH PIGMENTATION OF RAINBOW TROUT (ONCORHYNCHUS MYKISS) ..... 23 Résumé ............................................................................................................. -..................... 24 Abstract ................................................................................................................................. 24
1. Introduction ................................................................................................................... 25 _ 2. Materials and Methods .................................................................................................. 26
2.1 Diet formulation ...................................................................................................... 26 2.2 Experimental design and fish sampling .................................................................. 28 2.3 Colorimetrie Analysis ............................................................................................. 29 2.4 Digestibility ............................................................................................................ 29 2.5 Chemical Analyses .................................................................................................. 29 2.6 Carotenoid Analysis .................................................................. ~ ............................. 30
2.6.1 Pigment extractionfrom corn gluten, diet, flesh andfeces ............................. 30 2.6.2 HPLC Analysis ................................................................................................. 31
2.7 Statistical Analysis .................................................................................................. 32 3. Results ........................................................................................................................... 32
3.1 Ingredients and Experimental Diets ............ : .......................................................... 32
v
3.2 Growth period ........................................................................................................ 33 3.3 Apparent digestibility of the experimental diets .................................................... 33 3.4 Carcass and filet composition ................................................................................ 34 3.5 Coloration .............................................................................................................. 35
3.5.1 Colorimetrie analyses ..................................................................................... 35 3.5.2 Carotenoid analysls ........................... ~ ............................................................. 35
4. Discussion ..................................................................................................................... 36 4.1 Growth performances ............................................................................................. 36 4.2 Digestibility .......................................................................... ' .................................. 36 4.3. Protein and lipid composition ................................................................................. 37 4.4 Flesh coloration ....................................................................................................... 37 4.4.1 Colorimetrie analyses .......................................................................................... 37 4.4.2 Carotenoid concentration in jlesh ....................................................................... 38
5. Conclusion ......................... ~ .......................................................................................... 40 Acknowledgments ............................................................................................................ 40
REFERENCES (ARTICLE) ......................................................... · ........................................ 41 CONCLUSION GÉNÉRALE ..................... ~ ......................................................................... 45 RÉFÉRENCES ..................................................................................................................... 47
VI
LISTE DES TABLEAUX
Table 1: Formulation of the experimental diets .................................................................... 26 Table 2 : Amino acid and chemical analysis of experimental diets and key dietary
ingredients .... ~ ........... ~ ............................................................................................. 27 Table 3: Xanthophyllieveis in experimental diets ...................................................... ......... 32 Table 4: Growth performance of rainbow trout fed with the experimental diet for 140
days ......................................................................................................................... 33 Table 5: Apparent digestibility coefficient (ADC) of nutrients and pigments ..................... 34 Table 6: Proximal filet analysis (wet weight basis) ........................................................ ...... 34 Table 7 :Coloration of trout flesh ...................................................................... ~ .......... .. ...... 35
Vll
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Molécule de lutéine-jaune(a), molécule de zéaxanthine-jaune(b), molécule d' astaxanthine-rouge( c) ........................................................................................... 9
1 -
CHAPITRE 1
REVUE DE LITTÉRATURE
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1.1 La production aquacole
TI Y a cinquante ans, les ressources océaniques étaient considérées comme illimitées et
suffisantes à la consommation humaine. Depuis, la surexploitation des stocks des pays
pauvres faite par les flottes de pêche des pays étrangers, en général riches, surpasse la
capacité réelle de renouvellement des stocks naturels de poissons. Au cours des trente
dernières années, les techniques de pêche sont devenues de plus en plus industrialisées et
les prises se sont mises à diminuer sans cesse. Les fermes aquacoles de poissons et de
mollusques ont gagné en nombre et ce, à une rapidité étonnante afin d'atténuer le manque
de ressources océaniques (Tidwell et Allan, 2002). Selon la F AO (2006), l ' aquaculture est
probablement l'industrie alimentaire ayant la croissance la plus rapide. En effet, la
production mondiale ~st passée de lM de tonne en 1950 à 59,4M de tonnes en 2004. Ce
chiffre représente 70,3 milliards de $US en revenus. Aiken et Sinclair (1995) prévoient
qu'en 2025 il Y aura un déficit de 55 inillion de tonnes entre les débarquements de pêche
(60 millions de tonnes) et la demande (115 millions de tonnes).
À ce jour, pratiquement 50 % de tous les poissons consommés sur Terre seraient issus de la
production aquacole, la Chine possédantprès de 70 % du marché aquacole mondial (FAO,
2006). En 2004, environ 75 % (soit 105,6 millions de tonnes) de la production mondiale de
poisson est vendue pour la consommation, les 25 % restants, soit 34,8 millions de tonnes,
étant destinés aux produits non alimentaires, en particulier à la fabrication de farine et
d'huile de poisson. Au Canada, le saumon de l'Atlantique et du Pacifique sont les
principales espèces en élevage. En 2004, la production totale de salmonidés au Canada se
chiffrait à 101 645 tonnes pour une valeur de 315 046 000 $US. La production de truite arc
en-ciel, quant à elle, était évaluée à 1 150 tonnes représentant 4 519 000 $US en revenus
(FAO, 2006).
L'aquaculture, comme plusieurs autres activités humaines, produit des déchets qui, s'ils ne
sont pas gérés correctement, sont susceptibles de nuire à l'environnement. En aquaculture
intensive, une quantité considérable de déchets organiques sont produits sous une forme
particulaire ou soluble (moulée non-consommée, fèces et produits d 'excrétion) provoquant
3
une augmentation de la concentration en nitrates et en phosphates dans le milieu naturel.
Un plus grand apport en éléments nutritifs vient accroître la fertilité du milieu naturel
(augmentation de la production primaire), puis la consommation d'oxygène par les
bactéries et microalgues, menant ainsi à l'eutrophisation et l'anoxie du milieu environnant.
Ce problème est retrouvé en majeure partie dans des milieux fermés où OIes changements
d'eau sont peu fréquents. L'altération et la destruction des habitats naturels, le transfert de
maladies aux populations endémiques et la pression de pêche exercée sur les stocks
sauvages afin d'en extraire l'huile et les protéines pour l'alimentation de poissons d 'élevage
sont quelques autres exemples d'impacts de l'industrie aquacole sur l'environnement listés
par la FAO en 2006. Au cours des six dernières années, des progrès considérables ont été
faits en matière de développement durable en aquaculture afin de pallier ces problèmes.
Afin d'être en mesure de diminuer les coûts de production ainsi que l'impact des rejets
aquacoles sur le milieu naturel, l'efficacité de rétention des nutriments doit être améliorée
pour chaque espèce en prenant en considération ses besoins alimentaires (Satoh et al.,
2003). Le perfectionnement des régimeses en vue d'obtenir une meilleure rétention du
phosphore par les poissons est une des principales stratégies visant à réduire les impacts de
l'aquaculture sur l'environnement (Lall, 1991; Sugiura et al., 2000). De plus, l'utilisation
de moulées contenant un niveau de phosphore s'approchant des besoins nutritionnels (sans
toutefois les dépasser) a été montrée comme étant un bon moyen de réduire efficacement
les rejets de phosphore dans les effluents de pisciculture (Cho et Bureau, 2001).
1.2 Sous-produits de poisson
L'industrie de la pêche fournit environs 26 millions de tonnes de protéines via les prises
accidentelles, constituant à elle seules 90% des sous-produits de poisson utilisés dans le
monde (New, 1996). Ces sous-produits sont utilisés dans plusieurs secteurs agricoles,
notamment dans l'industrie porcine, bovine et aviaire. Ils proviennent principalement
d'espèces à basse valeur commerciale comme la sardine, le hareng ou l'anchois. En
aquaculture, les sous-produits de poissons sont incorporés aux régimes d'espèces
4
carnivores à haute valeur protéique comme les salmonidés, le thon et les crevettes (FAO,
2006). Traditionnellement, les farines de poisson représentaient la principale source
protéique des diètes. Le niveau d'inclusion se situe entre 35 et 50% de la diète sur une base
de matière sèche (Cowey et Cho, 1992).
Les farines et les huiles de poisson constituent une bonne source d'acides aminés (lysine et
méthionine) et d'acides gras (acide eicosapentanoique (EP A) et acide dicosahexanoique
(DHA)) en plus d'être hautement digestes (Naylor et al., 2000). L'utilisation de tels types
d'ingrédients dans la moulée d'élevage comporte aussi des désavantages, autant au niveau
des coûts de production que des impacts sur l'environnement. Les farines . de poi~son font
parti des ingrédients les plus coûteux dans les moulées d'aquaculture. TI est estimé que plus
de 50% des dépenses se rapportant à la production de poissons sont reliés aux coûts de la
moulée (Tidwell et al., 2005). De plus, la demande pour ce type de sous-produit augmente
constamment dû à la grande popularité des produits d'élevage de toute sorte. TI est donc
profitable pour les producteurs d'utiliser des moulées d'élevage contenant des produits plus
disponibles sur le marché et ~oins dispendieux.
1.3 Utilisation de protéines végétales dans les régimes alimentaires
Les farines végétales sont de plus en plus utilisées comme substitut aux farines de poisson.
La faible teneur en phosphore des protéines végétales constitue le principal avantage à leur
utilisation en alimentation. De nombreuses recherches portent sur le remplacement des
farines de poisson par des farines végétales (OUi et al., 1994 ; Gomes et al., 1995 ; Hardy,
1996 ; Bjerkeng et al., 1997 ; Storebakken et al., 1998 ; Sugiura et al., 1999 ; Carter et
Hauler, 2000 ; Kissil et al., 2000 ; Refstie et al., 2001 ; Opstvedt et al., 2003 ; Lim et al.,
2004). En général, ces études ont montré que le remplacement des farines de poisson par
des protéines végétales entraîne une réduction de la croissance ou une diminution de
. l'efficacité alimentaire, dépendamment de .la source protéique et du taux de remplacement
dans les moulées.
5
L'utilisation des nutriments ou l'interférence d'un nutriment sur un autre causée par
l'incorporation de plusieurs ingrédients dans une diète sont d'une grande complexité dans le
processus d'évaluation des ingrédients. L'évaluation des ingrédients se fait en trois étapes
soit: 1) la digestibilité des ingrédients, 2) la sapidité (palatability) des ingrédients et 3)
l'utilisation des nutriments par le poisson ainsi que les interférences causées par ceux -ci.
Les définitions de chaqu'e terme sont données par Glencross et al. (2007). La digestibilité
des ingrédients se définit comme étant la mesure du niveau d'énergie et de nutriments qu'un
animal peut obtenir à partir d'un ingrédient particulier par l'intermédiaire de processus de
digestion et d'absorption. Avant.qu'un ingrédient puisse être utilisé avec -succès dans les
moulées sa sapidité doit être déterminée. La sapidité se définit comme étant la combinaison
de l'attractivité et de l'ingestion d'un ingrédient ou d'une moulée. Cette valeur est donc de
la plus haute importance en recherche nutritionnelle. En effet, l'ingrédient aura une valeur
limitée s'il cause une diminution de l'ingestion de la moulée et ce, peu importe le niveau de
digestibilité, de biodisponibilité ou l'origine énergétique de l'ingrédient.
Hardy (1996) a répertorié les ingrédients végétaux les plus utilisés en alimentation aquacole
ainsi que les désavantages liés à leur utilisation. Les ingrédients montrant une alternative
aux farines de poisson étaient le soya, les sous produits de volaille, le canola, la farine de
plumes, le gluten de maïs et le gluten de blé. Cependant, la plupart des sources protéiques
végétales montrent un ou plusieurs désavantages, limitant ainsi leur utilisation dans les
moulées d'aquaculture (FAO, 2006). La faible sapidité et digestibilité des protéines
végétales, le faible contenu en acides aminés, la haute teneur en cendres et la présence de
facteurs antinutritionnels (trypsine et phytates) sont les principaux désavantages liés à
l'utilisation de protéines végétales (Hardy, 1996 ; Sugiura et al., 1999 ; Francis et al. 2001;
Krog~ahl et al., 2003). La déposition des protéines est grandement influencée par le type
d'acides-aminés essentiels composant la protéine et par la digestibilité de cette dernière
(Weede, 1997). Il existe des coûts reliés à l'amélioration de la digestibilité ' et de
l'absorption des composantes végétales de la moulée due à la suppression des facteurs
antinutritionnels et à l'ajout d'acides aminés (FAO, 2006). Le choix d'un bon substitut
protéique est dont primordial.
6
1.3.1. Le gluten de maïs
Le gluten est une protéine amorphe inter-mélangée avec l'endosperme amylacé du grain, on
le retrouve dans la plupart des céréales. Le gluten de maïs (GM) est un sous-produit obtenu
par séparation des farines et de l'amidon du grain de maïs. Cet ingrédient est composé de
plus de 60% de protéines et contient moins de 5% de lipides (Mente et al., 2003). Le GM
est de plus en plus utilisé comme substitut protéique végétal dans le but de réduire
l'utilisation de farines animales. L'industrie de la volaille en est un bon exemple. De plus,
le GM de par sa coloration jaune représente une bonne source de pigments, aidant ainsi le
jaune d' œuf à avoir une coloration jaune désirable (Cha et al., 2000). Son utilisation dans
les moulées pour salmonidés a fait l'objet de nombreuses publications (Alexis et aL , 1985 ;
Moyano et al., 1992 ; Morales et al., 1994 ;.Gomes et al., 1995 ; Hardy, 1996 ; Skonberg et
al., 1998 ; Yamamoto et al., 2002; Mente et al., 2003 ; Satoh et al., 2003 ; Mundheim et
al., 2004). Cho et al. (1982), ont découvert que la digestibilité du GM était de plus de 90%
pour la truite arc-en-ciel. Selon Weede (1997), il est possible de remplacer les farines de
poisson par du GM à un niveau de 25% dans la moulée pour salmonidés sans diminution de
la croissance. Cependant, selon l'auteur, la consommation de nourriture et la croissance
seraient affectées lorsque le niveau de substitution atteint 50% ou plus (truites de 98g, 12
semaines). D'un autre côté, les études de Gomes et al. (1995) ont démontré qu ' il était
possible de remplacer 50% des protéines animales par les protéines végétales. Une étude
menée par Mente et al. (2003) a démontré qu'un remplacement de 50% des farines de
poisson par le GM était faisable sans toutefois affecter la composition en acides aminés de
la chair du saumon atlantique. Les différences dans les performances de croissance des
études de Weede et Mente peuvent s'expliquer par une différence dans le poids initial des
salmonidés, la prise alimentaire ainsi que la quantité de farines de poisson utilisées dans les
moulées expérimentales.
1.3.2. Phosphore vs facteurs antinutritionnels
La principale s'Ource . de phosphore, présente dans les eaux des effluents d'installation
aquacole, provient de la moulée. La concentration et la biodisponibilité du phosphore dans
les diètes représentent deux facteurs importants affectant la rétention de celui-ci dans la
moulée ingérée (NRC, 1993; Sugiura et al., 1999). À une concentration protéique
7
d'environ 60%, les farines de poisson contiendraient entre 1,67 et 4,21 % de phosphore
(Cheng et al., 2003). Les poissons digèrent mieux le phosphore contenu dans les farines de
poisson que dans les constituants végétaux. Cependant, pour une même quantité de
protéines, il est avantageux d'un point de vue environnemental d'utiliser le GM dans les
moulées si le contenu en phosphore est bien absorbé par le poisson. Le GM, comme la
plupart des protéines végétales, est pauvre en phosphore (0,6 à 0,7%) (NRC, 1993). De
plus, la digestibilité apparente (ADC) du contenu protéique du GM (87%) est relativement
plus élevée que celle de certaines autres protéines végétales (83% soya, 76% - gru de blé,
61 % - farine de trèfle) utilisées dans la fabrication des moulées d' aquaculture (NRC, 1993).
La digestibilité élevée du gluten de maïs par rapport aux autre~ protéines végétales
s'explique en grande partie par une faible concentration en facteurs antinutritionnels. Le
seul, facteur antinutritionnel retrouvé dans le gluten de maïs étant le phytate. Selon les
ingrédients végétaux, approximativement les deux tiers du phosphore total sont présent
sous forme de phytate ou d'hexaphosphate d'inositol (Mendosa et al., 1997) et sont
faiblement retenu par les poissons. Outre la faible disponibilité en phosphore du phytate,
celui-ci interagit directement et indirectement avec différents composants de la moulée et
vient réduire leur biodisponibilité (Suguira et al., 1999).
1.3.3 Les acides aminés
L' alimentation de la truite arc-en-ciel, comme chez la plupart des poissons, doit
comprendre 10 acides aminés (arginine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine,
phénylalanine, thréonine, tryptophane et valine) essentiels à sa croissance et sa survie. Les
acides aminés peuvent être fournis sous forme de protéines intactes faisant partie des
ingrédients alimentaires ou sous une forme cristalline comme suppléments alimentaires.
Les acides aminés libres ont trois origines possibles soit: par l'absorption intestinale
d'acides aminés libres, par la synthèse métabolique ou par l'hydrolyse des protéines
corporelles ou alimentaires (Mambrini et Guillaume, 1999). L'utilisation accrue des
protéines végétales dans l'alimentation des salmonidés au cours des dernières années a
conduit à une hausse d'utilisation des acides aminés purifiés afin d'éviter les carences
provoquées par des niveaux élevés de farines . végétales dans les moulées (Ambardekar et
Reigh, 2007).
8
Le GM est riche en leucine (Cha et al., 2000), mais contient très peu de lysine (NRC,
1993). La lysine est un acide aminé limitant primaire et essentiel absent de plusieurs
sources protéiques végétales disponibles pour les poissons (Encarnaçao et al., 2006). Le
caractère essentiel de cet acide aminé fait en sorte que le poisson ne peut le produire par
lui-même, il doit donc l'obtenir via son régime alimentaire. De plus, comme la lysine est un
acide aminé limitant et primaire, il devient impossible que la synthèse protéique puisse bien
se faire sans celui-ci. TI est donc nécessaire de supplémenter la moulée en lysine afin de
pouvoir maximiser la déposition protéique chez la truite lorsque la moulée contient une
certaine proportion de protéine de source végétale.
1.4 Généralités sur les caroténoïdes
Les caroténoïdes forment le groupe de pigments naturels le plus important et le plus
largement distribué chez les êtres vivants. Plus de 650 caroténoïdes retrouvés sous leur
forme naturelle ont été identifiés. jusqu'à maintenant (Matsuno, 2001). Si la plus grande
part de la synthèse naturelle .des pigments caroténoïdes est effectivement réalisée par les
végétaux, certains microorganismes tels que des bactéries et des levures possèdent aussi la
capacité de les synthétiser (Guillou, 1991). Les animaux, quant à eux, sont incapables de
produire les caroténoïdes de novo; toutefois la plupart des espèces peuvent en modifier la
structure moléculaire grâce à certaines réactions métabolique~ (Matsuno, 2001). Les
pigments caroténoïdes retrouvés chez les animaux proviennent donc de leur alimentation.
Ce sont des substances polyéniques liposolubles caractérisées par un grand nombre de
doubles liaisons conjuguées qui leur donnent une coloration variant du jaune au rouge
(fig. 1) (Choubert et al., 2001). Cette structure chimique originale permet l'existence d'un
grand nombre de stéréoisomères qui donnent à chacune des molécules des propriétés
chimiques (oxydation) et physiques (absorption de la lumière) uniques. La présence de
nombreuses doubles liaisons est aussi la cause de l'instabilité qui caractérise ces pigments.
En effet, les caroténoïdes sont facilement détruits et deviennent incolores sous l'action de
hautes températures, de la lumière, de l'oxygène et dés acides (Choubert, 1994). Chez les
plantes, ce sont des pigments accessoires de la photosynthèse. Ils peuvent agir en
9
transférant à la chlorophylle l'énergie lumineuse absorbée dans les gammes du spectre
. visible situées entre le violet et le rouge ou saisir l'énergie de la chlorophylle, en particulier
en cas d'excès de lumière (rôle photoprotecteur). Les caroténoïdes sont retrouvés dans les 1
chloroplastes, plus particulièrement les chromoplastes.
OH
0a HO~
o OH
HO o
Figure 1: Molécule de lutéine-jaune(a), molécule de zéaxanthine-jaune(b), molécule d' astaxanthine-rouge( c). -
L'utilisation des pigments caroténoïdes par l'homme a subi une expansion rapide depuis le
début des années cinquante, soit depuis la maîtrise de la. synthèse totale des formes
moléculaires naturelles et artificielles (Guillou, 1991). Certains animaux d'élevage
reçoivent maintenant dans leur alimentation des suppléments de pigments caroténoïdes leur
permettant d'obtenir les caractéristiques pigmentaires propre à leur espèce et, dans certains
cas, de subvenir à leurs besoins physiologiques en caroténoïdes. Au-delà de leur rôle
pigmentaire, ces composés sont susceptibles d'avoir des activités biologiques, certaines
d'entre elles étant fondamentales: précurseur de la vitamine A, activité antioxydante ou
immuno-stimulante (Choubert et al., 2001). Ces pigments sont aussi d'excellents
anticancérigènes et possèdent des vertus antitumorales (Krinsky, 1994).
10
1.4.1 Les xanthophylles
Les caroténoïdes sont divisés en deux grands groupes: 1) les carotènes, constitués
uniquement de carbone et d'hydrogène et 2) les xanthophylles possédant, de plus, des
atomes d'oxygène (Guillou, 1991 ; Higuera-Ciapara et al., 2006). L'astaxanthine, la lutéine
et la zéaxanthine font partie des xanthophylles et sont les molécules à l'étude dans ce
projet. Elles possèdent chacune 40 atomes de carbone et deux structures cycliques aux
extrémités de la molécule (Fig. 1). L'astaxanthine est un pigment grandement utilisé pour
l'élevage des salmonidés. Son rôle principal est de donner à la chair une couleur rouge
orangée caractéristique de certaines espèces de salmonidés. L'astaxanthine est le type de
pigment le plus utilisé dans l'industrie aquacole mondiale. Depuis 1990, la compagnie
Hoffmann-Laroche Inc. a commencé une production à grande échelle d'astaxanthine
synthétique et depuis, domine le marché mondial de production de pigments, un marché
aujourd'hui évalué à 175 M de dollars (Higuera-Ciapara et al., 2006).
La lutéine et la zéaxanth!ne sont retrouvées dans plusieur~ types d'aliments dont le maïs
jaune, les jaunes d' œufs, les légumes comme le brocoli, les pois verts, le choux de
Bruxelles, les épinards, la laitue, les kiwis et dans certains fruits comme le melon miel
(Alves-Rodrigues et Shao, 2004). Ces pigments sont fréquemment utilisés dans l'industrie
de la volaille comme colorants naturels afin de rehausser la pigmentation de la chair et des
œufs (Lu et al., 2005). Le GM jaune est hautement concentré en caroténoïdes (200 - 400
~g/g), plus précisément en lutéine et en zéaxanthine (Lu et al., 2005). Ces deux
xanthophylles s' y retrouvent sous une forme non estérifiée. Chez l'humain, plusieurs études
ont suggéré que la lutéine et la zéaxanthine auraient des fonctions biologiques spécifiques,
non seulement au niveau des activités anticancérigènes et antitumorales, mais aussi dans la
protection contre les maladies dégénératives de l' œil. De plus, selon N aguib (2000),
l'activité antioxydante de l'astaxanthine serait dix fois plus élevée que celle des autres
caroténoïdes. Il existe peu d'études dans la littérature ayant rapport à l'influence des
caroténoïdes sur le système immunitaire des poissons matures. Les études portent surtout
sur la survie, la croissance, la performance et la résistance aux maladies des larves de
plusieurs espèces (Amar et al., 2004). Thompson et al. (1994) ont découvert que
l'astaxanthine et la vitamine A amplifient l'activité des antiprotéases du sang de la truite
Il
arc-en-ciel tandis que Amar et al. -(2001) ont prouvé qu'en présence de vitamines, les
caroténoïdes de sources synthétiques et naturelles auraient un effet bénéfique sur les
mécanismes de bio-défense de la truite arc-en-ciel.
1.5 Utilisation de gluten de maïs jaune dans les moulées
L'utilisation du GM jaune dans les moulées d'aquaculture est limitée en raison de sa grande
concentration en pigments xanthophylles jaunes. ,En effet, selon Skonberg et al. (1998), à
un taux d'inclusion de plus de 15 %, le gluten de maïs causerait une coloration jaunâtre à la
chair de poissons à chair blanche. C'est pourquoi les fabricants de moulée limitent à 5 %
son incorporation dans les moulées d'élevage. Peterson et al. (1966), furent les premiers à
se rendre compte de l'effet colorant des xanthophylles sur la chair des poissons. ils ont en
effet remarql;1é que l'inclusion d'un extrait de paprika riche en xanthophylles dans la
moulée de truite résultait en une coloration jaunâtre indésirable de la peau. La lutéine
extraite à partir de pétales de rose a également été déposée rapidement dans la peau et la
chair de la truite, résultant en une coloration jaune. Selon Lee (1987), il serait possible de
discerner une coloration jaunâtre de la chair du poisson chat lorsque les caroténoïdes sont
retrouvés à plus de 0,6 ~g/g de chair.
1.6 Les pigments et le choix du consommateur
L'une des particularités de l'aquaculture par rapport à la pêche est qu ' il est possible
d'obtenir un certain contrôle sur la qualité de la chair de poissons destinés à la
consommation. Bien qu'il n'existe pas de définition simple des facteurs de qualité de la
chair, la valeur nutritionnelle, la sécurité, la saveur, la couleur, la préservation et le type de
transformation sont tous primordiaux (Haard, 1992). Les salmonidés sont reconnus pour
leur couleur caractéristique rouge-orangée. Les consommateurs utilisent la couleur comme
signe de qualité du produit (saveur et fraicheur) (Alfnes et al., 2006). En nature, les
salmonidés obtiennent leur coloration par l'ingestion de crustacés tandis qu'en élevage, des
12
pigments synthétiques sont ajoutés à la moulée. C'est à ce niveau que l'astaxanthine et la
canthaxanthine ont un rôle à jouer. L'utilisation de ce genre de pigments rouges a été
hautement documentée depuis plus de 25 ans (Revue par .Higuera-Ciapara, 2006 ; Baker et
al., 2002 ; Choubert et al., 2005 ; Moretti et al., 2006 ; Ytrestoyl et Bjerkeng, 2007 a et b).
li existe deux types de pigments rouges synthétiques sur le marché. Le premier est
l'astaxanthine, disponible sous le nom commercial Carophyll Pink TM. La canthaxanthine
quant à elle est aussi utilisée comme pigment sous le nom Carophyll Red™. L ' astaxanthine
est préférée à la canthaxanthine, car elle est déposée plus efficacement dans le muscle
(Storrebakken et No, 1992), probablement à cause d'une meilleure absorption intestinale
(Torrisen, 1989).
Une étude menée par Alfnes et al. (2006) auprès de consommateurs de saumons d'élevage
stipule que les consommateurs sont prêts à payer significativement plus cher pour des filets
de saumons ayant une teinte .rougeâtre «normale» que pour des filets plus pâles. Sans
l'ajout de pigments artificiels, la commercialisation des saumons d'élevage serait
considérablement plus ardue .
. 1.7 Facteurs influençant la pigmentation
Chez les poissons, la déposition des caroténoïdes montre de grandes variations
intramusculaires (Ytrestoyl et Bjerkeng, 2007 b). La concentration musculaire de
caroténoïdes peut s'élever à 59 mg/kg chez le saumon Sockeye sauvage (Oncorhynchus
nerka) (Turujman et al., 1997), tandis qu'elle n'est que de 25 mg/kg chez la truite arc-en
ciel (Storebakken et al. ,- 1986 ; Bjerkeng et al., 1992). Plusieurs facteurs sont susceptibles
d'affecter la pigmentation des salmonidés, dont la taille du poisson, la génétique, les
facteurs sexuels, l'âge, le temps de supplémentation en pigments, la composition des
aliments, la source et la concentration des caroténoïdes dans celui -ci. La température de
l'eau et la photopériode sont des facteurs environnementaux pouvant aussi influencer la
pigmentation.
13
Torrissen (1989) a réussi à prouver qu'il existe un effet du poids du poisson sur la
déposition des caroténoïdes. En considérant le poids moyen de ses échantillons, une
relation linéaire à été trouvée entre le poids et la concentration en astaxanthine dans la chair
(dans la période intermédiaire de croissance). Selon Guillou (1991), les différentes races et
familles d'une même espèce de poisson ne disposent pas des mêmes capacités
physiologiques leur permettant d'accumuler de façon égale les caroténoïdes alimentaires.
Chez les salmonidés, la pigmentation du muscle ne serait pas influencée par le sexe, mais
plutôt par la maturation sexuelle des individus (Torrissen et Naevdal, 1988). Comme il sera
vu plus loin dans le texte (section 1.10), les muscles servent de réserve pigmentaire (et
lipidique, car les pigments sont liposolubles). Les pigments sont redistribués dans la peau
chez le mâle et dans les ovaires chez la femelle pendant la période de maturation des
gonades. De plus, la température du milieu d'élevage a une influence sur la pigmentation
des poissons; elle modifie leur taux métabolique, la prise alimentaire et le temps de
rétention des aliments dans l'intestin (Olsen et Mortensen, 1997). Selon Choubert et
Storebakken (1996), la concentration des caroténoïdes dans la moulée aurait aussi un effet
sur la digestibilité des pigments. La pigmentation de la chair des truites ne dépend pas
seulement de la quantité de pigments présents dans la moulée, mais aussi de facteurs
métaboliques comme l'absorption et le transport des caroténoïdes dans le sang (section
1.8). Selon Barbosa et al. (1999), seulement 3 à 18 % de l'astaxanthine ingérée seraient
effectivement déposés dans la chair. La faible déposition des pigments serait en partie
expliquée par la faible digestibilité de l' astaxanthine (Foss et al., 1987). Toutefois, la
mesure de la digestibilité ne donne qu'une idée de ce qui a été effectivement fixé par le
poisson, car elle ne tient pas compte de la dégradation des caroténoïdes dans le tractus
digestif.
1.8 Digestion et absorption des caroténoïdes
Les caroténoïdes étant liposolubles, ils suivent sensiblement le même chemin que les
lipides lors de la digestion et l'absorption de ceux -ci. La digestion consiste à briser la
matrice des aliments et relâcher les caroténoïdes à l'intérieur de petites gouttelettes
14
lipidiques dans l'intestin. Les pigments sont ensuite transférés des gouttelettes lipidiques
aux micelles. Les micelles servent à transporter les caroténoïdes dans le milieu aqueux de
l'intestin. Elles sont formées de sels biliaires, de phospholipides, d'acides gras libres et de
triacylglycérols (FuIT et Clark, 1997). Tyssandier et al. (2001) ont étudié les facteurs
majeurs gouvernant le tran'sfert des caroténoïdes, des gouttelettes lipidiques jusqu'aux
micelles. Selon eux, ce transfert serait une étape clé dans l'absorption des caroténoïdes. Us
en sont venus à la conclusion que le pH du milieu, l'hydrophobicité des caroténoïdes et la
concentration en sels biliaires pourraient jouer un rôle dans le taux de transfert et, donc, sur
le niveau d'absorption des caroténoïdes. Une étude menée par Olsen et al. (2005), a
démontré que la solubilité de l' astaxanthine dans les micelles dépend de la taille et la
composition de celles-ci. Les pigments quittent ensuite les micelles, entrent dans les
cellules absorbantes de la muqueuse intestinale et sont dirigés vers les chylomicrons. Les
chylomicrons sont responsables du transport des caroténoïdes de la muqueuse intestinale
jusqu'au foie, via le système sanguin et lymphatique (Tyssandier et al., 2002).
Les lipoprotéines sont en charge d'effectuer le transport des caroténoïdes du foie jusqu'aux
tissus périphériques. Chez ces dernières, on retrouve les lipoprotéines à très basse densité
(VLDL), à basse densité (LDL), à densité intermédiaire (ILDL) et à haute densité (HDL).
Selon Page et Davies (2003), le foie serait responsable des pertes d'une grande portion des
caroténoïdes ingérés. En effet, le taux de sortie des caroténoïdes du foie serait limité à la
fois par la capacité des LDL à transporter les pigments (Reboul e! al., 2005) et par la
quantité de récepteurs de LDL sur les hépatocytes (cellules du foie). Les lipoprotéines du
sang et les cellules du foie seraient donc les principaux éléments responsables du transport
des pigments vers les tissus périphériques. Le rein est aussi impliqué dans le métabolisme
d'excrétion des caroténoïdes (Schiedt et al., 1988). En effet, si le système sanguin devient
saturé en caroténoïdes, ceux-ci seront transportés vers le rein puis dans l'urine et les fèces.
15
1.9 Composition des ingrédients vs. pigmentation des, poissons
Parmi les nombreux facteurs pouvant influencer la pigmentation de la chair des poissons
(section 1.7) on retrouve la composition des aliments (Torrissen, 1985). La pigmentation
des poissons peut-être influencée très différemment en fonction des sources de pigments
caroténoïdes ajoutées aux aliments (Guillou, 1991). Les végétaux et les levures sont
hautement concentrés en caroténoïdes, par contre ils ne sont pas toujours utilisables par le
poisson. Les fabricants de moulée pour poissons utilisent principalement des caroténoïdes
purs et stabilisés, produits par synthèse chimique (Guillou, 1991). La pigment~tion
tissulaire sera grandement influencée par la nature et la forme moléculaire des caroténoïdes
ajoutés à l'aliment, même si ces derniers sont synthétiques. Une étude menée par Torrissen
(1989) a montré que l' astaxanthine est déposée plus efficacement dans la chair que la
canthaxanthine. Les dissimilitudes au niveau de la conformation des molécules sont
responsables des différents niveaux d'absorption et de déposition des deux types de
pigments (Foss et al., 1984 ; Torrissen, 1986 ; Stokebakken et al., 1987).
1.9.1 Supplémentation en lipides alimentaires
Plusieurs études ont montré qu'il était possible d'accroître la fixation des caroténoïdes dans
les muscles de salmonidés en modifiant le niveau de lipides alimentaires (Bjerkeng et al.,
1997; Torrissen, 1998; Nickell et Bromage, 1998 (a); J3'arbosa et al., 1999). Le
consommateur recherche cependant des produits faibles en gras. Olsen et al. (2005) ont
tenté de résoudre ce problème en ne modifiant que la structure des lipides ajoutés à la .
moulée. Selon les auteurs, il est possible de modifier le milieu digestif par l'inclusion ou la
modification des phospholipides, des gras saturés ou des acides biliaires. En effet, en
modifiant les émulsions lipidiques intestinales ou les propriétés des micelles, il est possible
d'accroître significativement l'utilisation et la rétention des pigments chez les salmonidés.
16
1.10 Les protéines structurales et la pigmentation
La structure musculaire du poisson est divisée en une série de myomères et en fibres
musculaires intégrés par de courts tendons dans des feuillets de collagène appelés
myoseptes (Johns ton et al., 2000). Des réseaux de fibres de collagène entourent les fibres
musculaires. Les fibres musculaires, disposées selon un patron hélicoïdal entre les
myomères contigus, montrent un agencement géométrique complexe. Les fibres des
muscles blancs contiennent beaucoup de myofibrilles (1 Jlm de diamètre) qui contiennent à
leur tour des filaments d'actine et myosine. L'actomyosine, quant à elle, est une protéine
formée par l'assemblage d'actine et de myosine. Cette protéine entre en jeu dans le
processus de contraction des fibres musculaires.
Selon Saha et al. (2006), les caroténoïdes seraient intimement liés à l'actomyosine chez le
saumon. Les auteurs ont en effet découvert que l' astaxanthine serait présente à l'intérieur
de la fraction insoluble (fraction lipidique) de l'actomyosine isolée à partir des myofibrilles.
Ils ont aussi démontré que la liaison ' astaxanthine-fibres musculaires serait différente selon
l' hydrophobicité des protéines. Ces auteurs n'ont cependant pas établi quelle composante
de l' actomyosine est responsable de la déposition de l' astaxanthine. Matthews et al. (2006)
ont démontré que l' a-actinine serait la protéine responsable de la déposition de
l'astaxanthine chez le saumon. En plus de prouver qu'il y a une protéine principalement
responsable de la rétention de l' astaxanthine à long terme chez les saumons adultes, les
auteurs ont montré que l'affinité de ce pigment pour l'a-actinine est approximativement la
même chez le flétan de l'Atlantique, une espèce à chair blanche (Matthews et al., 2006) .
. Bjerkeng et Berge (2000) ont comparé les coefficients de digestibilité apparente de
l'astaxanthine et la composition en caroténoïdes des muscles, du foie, du rein et du plasma
chez le saumon de l'Atlantique et le flétan Atlantique. Ils ont constaté que les caroténoïdes
étaient présents en plus grand nombre dans le plasma et les échantillons de tissus des
saumons, même si le coefficient de digestibilité apparente de l' astaxanthine est plus élevé
chez le flétan. Cependant, tous les isomères d'astaxanthine étaient sélectivement accumulés
dans le sang et les muscles du saumon, tandis qu'il en avait beaucoup moins chez le flétan.
17
Ces résultats suggèrent que la protéine de liaison de l' astaxanthine, l' a-actinine, ne peut
être un facteur limitant à la déposition de l' astaxanthine dans la chair des salmonidés
(Matthews et al., 2006).
Un régime alimentaire pauvre en protéines implique une haute synthèse protéique lié à une
augmentation du niveau d'ARN dans tout le corps. L'activité ribosomale demeure
cependant constante. L'augmentation de la synthèse protéique est donc toujours
accompagnée par un niveau plus élevé de dégradation des protéines et par une diminution
de la rétention protéique (Langar et Guillaume, 1994; Langar et al., 1993). La rétention des
protéines est probablement plus basse lorsque les truites sont alimentées avec du GM
(déficient en lysine). Une moins bonne rétention des protéines peut résulter en une faible
efficacité de la pigment~tion. TI est aussi possible que les pigments soient dégradés en
même temps que les protéines. Le transport et l'entrée des pigments dans les _ cellules et
même la quantité de protéines liant le pigment peuvent ne pas êtres affectés par le niveau de
lysine dans' les régimes alimentaires. Un niveau suffisant de lysine dans les moulées à base
de GM a comme effet de ~iminuer la synthèse ainsi que la dégradation des protéines tout en
augmentant la rétention du complexe protéine-pigment.
1.11 Compétition lutéine vs. autres pigments
Avec l'introduction de matières premières d'origine végétale, plusieurs caroténoïdes font
maintenant partie intégrante de l'alimentation des poissons (Olsen et Baker, 2006). L'étude
des mécanismes menant à la fixation des différents types de pigments devient alors
essentielle. Les caroténoïdes ne sont pas tous digérés et absorbés selon les mêmes voies
métaboliques. Selon Tyssandier et al. (2001), la B-carotène (hautement _ polaire) est
retrouvée dans les gouttelettes lipidiques avec les triacylglycérollors de la digestion, tandis
que les xanthophylles (peu polaires) sont localisés à la surface des gouttelettes en présence ·
de phospholipides. L'étude démontre que les xanthophylles ont une plus grande facilité que
les carotènes à se déplacer des gouttelettes lipidiques jusqu'aux micelles, ceci étant dû à
leur position à la surface de celles-ci. Ceci qui laisse croire que la biodisponibilité des
càroténoïdes est inversement corrélée à leur hydrophobicité. Les xanthophylles possèdent
18
une structure et une polarité similaires. TI est donc possible qu'il y ait une compétition pour
l'absorption intestinale ou musculaire de ceux -ci en supposant qu'ils soient absorbés par
diffusion facilitée. Chez les salmonidés, l'astaxanthine est absorbée plus efficacement que
la zéaxanthine et la lutéine. La fixation de l'astaxanthine et de la canthaxanthine chez les ,
salmonidés est généralement faible, celle-ci étant caractérisé par une faible efficacité de
rétention (3 % à 20 % du total des pigments retrouvés dans la chair des salmonidés) (Foss
et al., 1984; Choubert et Storebakken 1989; Smith et al., 1992). Cette faible fixation
représente une préoccupation majeure en raison du coût élevé des pigments dans les
aliments (Nickell et Bromage, 1998 b). Aucune étude ne démontre la proportion de lutéine
effectivement transportée ou, fixée dans les fibres musculaires que ce soit de façon active ou
passive.
li existe très peu d'études comparant les mécanismes d'absorption et de compétition des
différents xanthophylles. Selon une étude menée par Kaushik et al. (2002), les caroténoïdes
apportés par les protéines d'origine végétale entreraient en compétition avec les
caroténoïdes ajoutés à l'aliment pour la pigmentation. Olsen et Baker (2006) ont évalué
l'efficacité d'absorption, de déposition et de rétention de l' astaxanthine et de la lutéine ainsi
qu'une interaction possible entre les deux pigments. lis ont démontré qu'à un haut niveau
d'inclusion, l' astaxanthine (54 mg/kg moulée) et la lutéine (23 mg/kg moulée) subissaient
une compétition négligeable lors de l'absorption au niveau des fibres musculaires. lis ont
aussi observé une sélection très claire en faveur de la déposition de l' astaxanthine qui, selon
eux, serait expliquée par une absorption différente des deux types de pigments dans
l'intestin. La lutéine utilisée l~rs de cette étude était sous forme synthétique et encapsulée,
tout comme l' astaxanthine . synthétique. Aucune étude ne prouve que l' astaxanthine
synthétique, m~nie si son efficacité pour la pigmentation est déjà prouvée, est fixée de la
même manière que l' astaxanthine retrouvée dans les produits naturels comme les algues,
les sous-produits de crustacés et les levures. li devient alors difficile de comparer des
résultats de lutéine naturellement retrouvée dans le gluten jaune à la lutéine synthétique.
19
1.12 Utilisation du gluten de maïs blanc dans les moulées d'aquaculture
À ce jour, aucune étude n' a été publiée sur l'utilisation du GM blanc dans les moulées
d'élevage, que ce soit dans l'industrie bovine, porcine ou aquacole. Hardy (2001) a fait des
essais sur l'utilisation du GM blanc dans la moulée d'aquaculture. En substituant différents
pourcentages de farines de poisson par le gluten de maïs blanc, il a obtenu des
performances .de croissance similaires à celles rapportées par Weede (1997), qui aurait fait
le même type d'expérience en utilisant du gluten de maïs jaune. Selon Hardy, l'ajout
croissant de GM dans les moulées a mené à une diminution progressive du poids final des
poissons et a une augmentation des ratios de conversion alimentaire. il estime cependant
que la supplémentation des moulées contenant du GM blanc · avec de la lysine ou d'autres
acides aminés pourrait se traduire par l'utilisation accrue de GM blanc dans les ' rations
comme un élément de remplacement des farines de poisson. Les principales conclusions de
Hardy sont: 1) les rations contenant du GM blanc ne confèrent pas de coloration jaunâtre à
la chair des poissons d'élevage et ce, à des niveaux d'inclusion très élevés Uusqu'à 36 %) et
2) le GM blanc peut représenter jusqu'à 25 % de la ration, en supposant que les régimes
alimentaires sont soigneusement formulés afin de compenser toutes carences en acides
aminés. Dans son étude, Hardy recommande de vérifier s'il existe une compétition entre les
pigments xanthophylles jaunes du GM et l'astaxanthine lors de l'absorption et de la
déposition des pigments chez les salmonidés et d'observer si l'utilisation du GM ~lanc
réduit ou élimine ce problème potentiel.
Très peu d'études ont été faites dans le but de régler les problèmes de pigmentation jaunâtre
causés par l'utilisation du GM jaune chez les poissons d'élevage. De plus, il peut être
difficile de trouver du GM blanc sur le marché actuel, son utilisation n'étant pas très
populaire dans le secteur agricole. C'est pourquoi certains auteurs préfèrent transformer le
GM jaune, celui-ci étant plus disponible sur le marché. Cook et al. (1993) ont signalé
l'existence de nombreuses techniques d'extraction dans le but de produire du maïs décoloré.
En effet, les problèmes de pigmentation peuvent êtres réglés en éliminant les pigments
caroténoïdes · jaunes du GM soit par extraction à l'aide de solvants ou par le biais de
20
méthodes de blanchiment (Gross, 1991). Les techniques de blanchiment des pigments tels
que les caroténoïdes et les chlorophylles à l'aide de la lipoxygénase sont connues depuis les
années 30 (Cha et al., 2000). L'oxydation des carotènes et des xanthophylles dépend de
l'oxydation simultanée des acides gras insaturés. Les acides gras insaturés sont oxydés par
des enzymes oxydase et le produit de l'oxydation de ces gras vient oxyder à son tour les
caroténoïdes (Cha et al., 2000). Une étude faite par Park et al. (1997) démontre qu ' il est
possible de réduire la quantité de caroténoïdes dans le GM par une extraction à l'aide
d ' éthanol et de butanol. Selon les auteurs, l'extraction à partir de solvants serait plus
efficace que le blanchiment. Ils ont cependant remarqué qu ' il serait plus profitable
d'utiliser le processus de blanchiment que d ' extraire les pigments à l'aide de solvants en
raison du moindre coût des traitements et de la réduction des pertes solides.
1.13 Extraction et quantification des caroténoïdes
II existe plusieurs techniques permettant de déterminer la coloration de la chair de poiss0n.
La première, la plus simple, nécessite l'utilisation d'une charte de couleur.
Malheureusement, cette charte existe seulement dans les teintes de rouge obtenues. par
l'addition d'astaxanthine ou de canthaxanthine dans les moulées. TI est donc impossible de
l'utiliser dans le but de comparer des teintes de jaune. Il est donc nécessaire d'utiliser
d'autres techniques afin de déterminer la coloration de poissons d'élevage nourris avec de
la moulée contenant d'autres pigments que des xanthophylles rouges. De plus, même si les
chartes de couleur sont économiques et relativement faciles à utiliser, les mesures
instrumentales sont plus précises, plus objectives et moins sujettes aux variations causées
par la luminosité (Baden et al., 1998).
Plusieurs techniques sont utilisées afin de quantifier la couleur dans les filets des
salmonidés. Un de ces systèmes est le CIE L*a*b* (CIE, 2007). La couleur y est
représentée par un système cartésien de coordonnées en trois dimensions où les axes
représentent chacun un paramètre associé à la coloration. L'intensité de la luminosité est
représentée par .le L *, les variations de a* représentent le chroma rouge (positif) à vert
21
(négatif) et les variations de 0* représentent le chroma jaune (positif) à bleu (négatif)
respectivement (Choubert et al., 1997 ; Hatlen et al., 1998). La quantification de la couleur
à l'aide de ces paramètres nécessite l'utilisation d'un colorimètre. Une photo de la chair est
prise à l'aide du colorimètre et l'appareil vient ensuite numériser les différents paramètres
de chromaticité et de luminosité. Le désavantage majeur de cette technique pour la
quantification de la coloration (dans la présente étude) est qu ' il est impossible de savoir
quel type de pigment provoque la coloration. En effet, les valeurs L *, a* et b* n ' informent
pas sur le type de xanthophylle détecté ni sur la concentration des pigments dans la chair de
poisson. Pour ce faire, une extraction des pigments en laboratoire ainsi qu ' une
quantification de ceux-ci par des appareils spécialisés sont requises.
Les caroténoïdés sont habituellement extraits d'échantillons biologiques à l ' aide de
solvants solubles dans l'eau (Liaaen-Jensen et Schiedt, 1995). Une saponification est
souvent nécessaire afin de retirer les lipides contaminant les échantillons riches en graisses.
De plus, comme les caroténoïdes sont pour la plupart liposolubles, la saponification permet
aux pigments de se dissocier des lipides. La quantification des différents pigments se fait
par chromatographie. Depuis le ~lieu des années 90, le HPLC (High-performance liquid
chromatography) est de plus en plus utilisé. Ce type d'appareil permet d ' identifier et de
quantifier plusieurs types de pigments se retrouvant dans un même échantillon et ce, à des
longueurs d'ondes différentes. De plus, la haute sensibilité du HPLC permet la détection
d'infimes quantités de pigments ainsi que de leurs différents isomères (Pfander et Riesen,
1995).
1.14 Conclusion
En conclusion, les chercheurs en aquaculture sont sans cesse confrontés à de nouveaux
défis tant au niveau des impacts de l'industrie aquacole sur l'environnement que de
l'amélioration des performances de croissance. La, qualité de la chair du poisson est aussi
. d'une grande importance. La couleur de la chair entre autres, influence grandement le choix
du consommateur. L'utilisation de certains types de farines végétales dans les moulées
22
d'aquaculture est susceptible de modifier la coloration de la chair du poisson. Le GM jaune,
utilisé comme substitut protéique aux farines de poisson, impose une coloration jaunâtre à
la chair lorsqu'il est inclu à un haut niveau dans la moulée.
Le projet comporte donc deux hypothèses de recherche:
1. L 'utilisation de gluten de maïs blanc dans la moulée réduira les problèmes associés
à la coloration jaunâtre indésirable de la chair de truite d'élevage.
2. L' ajout de lysine dans la moulée jumelée à un haut pourcentage d ' inclusion de
gluten de maïs augmentera la fixation protéique et la pigmentation de la chair.
Cette présente étude a pour objectif principal de remplacer le GM jaune par du GM blanc
dans la moulée dans le but de régler le problème de coloration indésirable de la chair des
poissons. Les· régimes expérimentaux comprendront aussi différents niveaux de lysine afin
de tester l'effet de cet acide aminé sur la croissance des truites et la concentration finale des
différentes xanthophylles déposées dans la chair.
\.
23
CHAPITRE 2
THE.EFFECTS OF YELLOW XANTHOPHYLLS PIGMENTS FROM
CORN GLUTEN MEAL AND DIETARY LYSINE LEVEL ON
PERFORMANCE AND FLESH PIGMENTATION OF RAINBOW TROUT
(ONCORHYNCHUS MYKISS)
24
Résumé
L'utilisation de gluten de maïs (CGM) jaune dans les moulées d'aquaculture est une pratique de plus en plus courante. TI a cependant été démontré que les pigments xanthophylles du CGM jaune ont un pouvoir colorant indésirable sur la chair des salmonidés. Le CGM est pauvre en lysine et les régimes alimentaires contenant un haut niveau de CGM peuvent montrer une légère déficience en lysine, ce qui limite la déposition protéique chez les poissons. La possible interaction entre les pigments du CGM et le niveau de lysine alimentaire a été testée chez la truite arc-en-ciel. Quatre régimes alimentaires (36% de protéines digestibles, 19 MJ kg-l d'énergie digestible, 50 ppm d'astaxanthine) ont été formulés pour contenir 12% de farine de poisson et 30% de CGM blanc ou jaune. Un régime contenant 36% de farine de poisson et aucun CGM a également été utilisé. Les moulés ont été distribuées à des truites arc-en-ciel (poids initial = 119 g) élevés à 12 ° C pendant 140 jours. Les poissons nourris avec les régimes alimentaires à base de CGM ont des poids finaux significativement plus faibles que les poissons alimentés avec le régime contrôle. Les xanthophylles jaunes sont retrouvés en concentration significativement plus élevée (p<0,05) et l'astaxanthine en concentration plus faible (non significatif) chez les poissons nourris avec le CGM jaune. La lysine n'a eu aucun effet sur le poids final, mais a eu un effet significatif (p<0,05) sur la concentration protéique de la chair et a aussi tendance à faire augmenter (non significativement) la concentration en astaxanthine dans la . chair.
Abstract
Yellow xanthophylls from corn gluten meal (CGM) have been reported to impart a yellowish coloration to flesh of fish and have anecdotally been reported to negatively affect efficiency of pigmentation in salmonids. CGM is low in lysine and diets with high levels of CGM may be marginally deficient in lysine which may limit protein deposition. The potential interaction between pigments from CGM and dietary lysine level was examined in a study with rainbow trout. Four diets (36% digestible protein, 19 MJ kg-l digestible energy, 50 ppm astaxanthin) were formulated to contain 12% fish meal and 30% of white or yellow CGM. A control diet containing 36% fish meal and no CGM was also used. The experimental were fed to rainbow trout (initial weight = 119 g) reared at 12°C for 140 days. The fish fed the diets with CGM had significantly lower final weights compared to fish fed the control diet. Fish fed with yellow CGM had significantlY higher xanthophylls concentration (P<0:05) and slightly lower (non-significant) flesh astaxanthin concentration than fish fed white CGM. Lysine had no effect on final weight but had a significant effect (p<0.05) on flesh protein concentration and tended to increase (non-significantly) flesh astaxanthin concentration.
25
1. Introduction
Corn gluten meal (CGM) is a protein rich (ca. 60% CP), low phosphorous and highly
digestible by-product of wet milling of corn for starch and high fructose corn syrup
production. Corn gluten meal has been successfully used in feeds for a number of aquatic
species and has been shown to be highly digestible and palatable for salmonids (Bureau and
Cho, 1994). Its use in salmonid feeds has been the subject of numerous publications (Alexis
et al., 1985 ; Moyano et al., 1992 ; Morales et al., 1994 ; Gomes et al., 1995 ; Hardy, 1996 ;
Skonberg et al., 1998 ; Yamamoto et al., 2002; Mente et al., 2003 ; Satoh et al., 2003 ;
Mundheim et al., 2004). Corn gluten meal has low levels of available lysine and
phosphorus (P). These nutritional shortcomings are easily addressed using lysine and P
supplements. Since corn gluten meal has low levels of total P, its use in fish feeds can
reduce overall dietary P levels and reduces the overall output of P from fish culture
operations (Cho and Bureau, 2001).
Corn gluten meal contains significant levels (200-500 mg/kg) of xanthophyll (lutein and
zeaxanthin) carotenoid pigments. Yellow xanthophyll carotenoids of CGM. impart
undesirable yellow flesh coloration to certain fish species (Lee, 1987; Lovell, 1998) thereby
reducing their market value (Alfnes et al., 2006). Inclusion level of more than 15%, CGM
(after 12 weeks of feeding) confer yellowish coloration to rainbow trout (Skonberg et al. ,
1998). There are anecdotal evidences that the use of moderate levels of dietary corn gluten
meal levels can negatively affects pigmentation of salmon and trout fed pigmented feeds
(i.e. feed supplemented with the expensive pink and orange pigments imparting an
attractive pink or red pigmentation of flesh), resulting in less desirable filet color, and thus
final product quality. The potential negative effect of dietary xanthophyll pigments is an
issue of significant concern for many fish feed manufacturers around the world.
The reduction of xanthophyll pigments has been the target of sorne effort. Cha et al. (2000)
reduced the xanthophyll content of CGM through soy flower. Hardy (2001) tested the use
of newly developed white CGM in non-pigmented rainbow trout feeds.
26
The study's primary objective was to exarmne the effect of xanthophyll pigments on
pigment deposition. Second objective was to examine the effect of different dietary lysine
level on performance and flesh pigmentation of rainbow trout.
2. Materials and Methods
2.1 Diet formulation
Four isoproteic and isoenergetic diets containing 44% digestible protein, 24 MJ DE kg-1
and 50 ppm astaxanthin (Carophyl Pink TM, Hoffmann-LaRoche Inc. Nutley, NJ, USA)
were formulated to contain 12% fish meal (Table 1). Diets were formulated to contain 30%
of yellow or white corn gluten meal. Diets 2 and 4 contained yellow CGM and the Diets 3
and 5 contained white CGM (30% of di et inclusionr The yellow and white CGM were
supplied by CASCO (London, ON, Canada). The white corn gluten meal was manufactured
on a pilot scale in Mexico from white corn variety. A control di et (Diet 1) containing 36%
fish meal and no CGM (36% digestible protein, 19 MJ DE kg-l,50 ppm astaxanthin) was
also used. In order to examine the effect of different dietary lysine level on performance
and flesh pigmentation of fish, 1.7% of crystalline lysine was added to diets 4 and 5.
Table 1: Formulation of the experimental diets
Diets 1 2 3 4 5 % Incorporation
Ingredients Fish meal, herring menhaden,
36 12 12 12 12 68% CP Poultry by-product meal, 56% CP 10 10 10 10 10 Feather meal, 82% CP 8 5 5 4 4 Corn gluten meal, 60% CP 30 30 White corn gluten meal 60% CP 30 30 Soy protein concentrate* 10 10 10 10 10 Wheat middlings, 17% CP 16.1 11.6 Il.6 10.9 10.9 Fish /vegetable oil blend 18 19.5 19.5 . 19.5 19.5 Lysine sulfate (BioLys, 52% Lysine) 1.7 1.7 Carophyl pink (8% astaxanthin) 0.0625 0.0625 0.0625 0.0625 0.0625 Vi tamin / Mineral / B inder* * 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 Total actual 100 100 100 100 100 * HP300 Hamlet Protein, Aaarhus, Denmark
** Tapia-Salazar et al. (2006)
27
The diets were mixed using a Hobart . mixer (Hobart Ltd., Don Mills, ON, Canada) and
pelleted using a laboratory steam pellet mill (California Pellet Mill Co., San Francisco,
California, USA). The feed pellets were dried in a forced air drier at room temperature for
24h.
Table 2 : Amino acid and chemical analysis of experimental diets and key dietary ingredients.
Amino Acid 'Diet (g 100g-1 DM)
1 2 3 4 5 Methionine 0.91 0.89 0.93 0.87 0.91 Cystine 0.68 0.75 0.79 0.70 0.75 Lysine 2.64 1.72 1.77 2.58 2.57 Threonine 1.74 1.65 1.69 1.62 1.66 Arginine 2.87 2.34 2.40 2.27 2.31 Isoleucine 1.79 1.83 1.89 1.79 1.83 Leucine 3.16 5.04 5.26 4.84 5.25 Valine 2.27 2.17 2.23 2.13 2.14 Histidine 0.99 0.96 0.99 0.95 0.98 Phen ylalanine 1.82 2.30 2.38 . 2.21 2.36 Glycine 3.27 2.44 2.44 2.34 2.36 Serine 2.21 2.34 2.44 2.20 2.38 Alanine 2.55 3.16 3.24 3.05 3.24 Asparctic Acid 3.84 3.40 3.52 3.34 3.44 Glutamic Acid 6.02 7.82 8.10 7.61 8.05
Yellow White Fish Composition (DM basis) analyzed(%) CGM CGM meal
Dry matter 94.9 95.4 93.8 93.8 94.4 87.7 89.8 85.6 Crude protein (N x6.25) 46.8 46.3 47.3 47.0 47.3 67.5 69.2 67.3
Lipid 26.1 25.6 26.7 25.0 26.0 1.0 5.2 11.0
Ash 9.2 5.5 5.0 5.4 5.3 1.9 1.3 18.5
Lysine 2.64 1.72 1.77 2.58 2.57
Energy (Ml/kg) 24.5 25.5 25.5 25.4 25.5
The proximate composition of white and yellow corn gluten meal (CGM) was similar
(Table 2) and CGM had a similar crude protein concentration than the fish meal used in the
diet formulations. Thus, substitution of the CGM for fish meal in the various experimental
diets was performed on an equal protein value basis. Yellow CGM contained less lipid than
28
white CGM (Table 2). This fact is probably due ta genetic factors of corn hybrids. Minor
adjustments were made in the percentage of fish oil in the experimental diets as fish meal
was replaced with CGM to account for differences in lipid levels between fish meal and
CGM (Table 1 and 2).
2.2 Experimental design and fish sampling
A total of 220 triploids rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) obtained from Pisciculture
des Alléghanys inc. (Saint-Philémon, QC, Canada) were adapted to experimental
conditions for two weeks prior to the start of the experiment. During that period, they were
fed a commercial trout feed (Carey Feed Mills Ltd., Fredericton, NB, Canada) once a day.
The fish were kept in accordance with the guidelines of the Comité de Protection des
Animaux de l'Université Laval (CPAUL, Québec, QC, Canada). The study was carried out
in a fresh water recirculating system at the Laboratoire de Recherche en Sciences
Aquatiqu.es (LARSA) of Université Laval (Québec, QC, Canada). T~e fish were randomly
distributed in twenty 160 L Swedish tanks (11 fish/tank, initial weight 119 g/fish ±15)
reared for a total of 140 days at 12 ± 0.5 Oc under a 12h light : 12h dark photoperiod. Fish
biomass remained below 40 kg m3 -1 per tank at the end of the experiment. At the beginning
of the experiment, a pooled sample of 40 fish was sampled for chemical composition
analysis (initial carcass sample).
The five experimental diets were randomly allocated ta four tanks each. Fish were hand-fed
to apparent satiation twice daily, five days a week. Weekend feeding was done using a belt
feeder at a feeding rate equal ta approximatel y 80% of average dail y ration served in the
previous week.
The trout were weighed every 28 days to determine the weight gain and feed conversion
ratio (FCR, feed:gain). At the end of the experiment, seven fish per tank were sampled for
analysis. Fish were euthanized using lethal dose (300 ppm) of tricaine methanesulphonate
(MS222, Argent Laboratories, Vancouver, BC, Canada) and then weighed. A pooled
sample of four fish per tank was taken for proximal analysis.
29
2.3 Colorimetrie Analysis
The fish samples were cooked in an autoclave, ground into homogeneous slurry in a food
processor, freeze dried, finely ground, and stored at -20 oC until analyzed. The three
remaining fish were weighed, eviscerated and filleted. Pigmentation was assessed using a
CR-300 Chroma Meter (Minolta Camera Co. Ltd., Osaka, Japan). Surface color
measurements (L *, a *, b*) were carried out on fresh skinless fillets at three sites (dorsal,
ventral and caudal); each measure was taken on both fillets. Fillet samples were pooled by
tank and stored in vacuum dealed bags at -80 oC until analyzed for carotenoid content and
proximal analyses (crude protein, lipid, ash and gross energy).
2.4 Digestibility
Collection of fecal material was carried out in the final two weeks of the growth trial to
eval,uate the apparent digestibility of the nutrients. An inert marker (Sipernat 50™,
Degussa-Hüls. Brampton, ON, Canada) was included at 2% in the five experimental diets.
Tanks were adapted with a modified Guelph settling column (Cho et al., 1982) to collect
faecal material. Two feces samples per tank were collected over the first and the second
week period for a total of eight samples per diet overall. Tanks have been cleaned before
each sampling to ensure that the y are no feces or indigestible marker residues remained in
tanks. Feces were stored at -20°C and freeze dried prior to analysis for the determination of
apparent digestibility coefficient (ADC) for pigments, nutrients and energy.
2.5 Chemical Analyses
U sing standard methods (AOAC, 2002), feed, carcass, fillet, and feces were analyzed for
dry matter (vacuum oven at 65 oC for 18 h) and ash (incineration at 550 oC for 18h). Crude
protein (%N x 6.25) was analysed with a Kjedahl method using a 1030 Kjeltec
autoanalyzer (Tecator, Hoganas, Sweden), gross energy using an adiabatic bomb
calorimeter (Model 1272, Parr Instruments Inc., Moline, IL) and totallipid was determined
by the petroleum-ether extraction (Ankom XT-20 Fat Extractor, Ankom, Macedon, NY)
(Table 2).
30
For determination of amino acid profile of diets (Table 2), representative samples from
each diets were anal yzed in duplicate, according to LIames and Fontaine (1994) by Evonik
Degussa laboratory in Germany.
Determination of apparent digestibility coefficient (ADC) for the nutrient, pigments or
energy of control and experimental diets have been calculated according to Cho et al.
(1982):
ADC = 1 - ( F/D x DilFi)
Where F = % nutrient (or kJ g-l gross energy) of feces; D = % nutrient (or kJ g-l gross
energy) of diet; Di = % indigestible marker (AIA) of diet; Fi = % indigestible marker (AIA)
of feces.
2.6 Carotenoid Anal ysis
2.6.1 Pigment extractionfrom corn gluten, diet, jlesh andfeces.
Pigments were extracted from corn gluten meal, diet, flesh and feces samples using a
modification of Moros et al. (2002) procedure. To protect the xanthophyll from light and
oxygen-induced degradation, the extraction was done under dim yellow lighting and
nitrogen atmosphere. For xantbophyll extraction of feed and feces, 600 mg of cold ground
sample was placed in a 50 ml plastic Falcon test tube and 10 ml of cold 0.1 % BHT -acetone
(w:v) solution was added to each test tube. For feed extraction, the tubes were immerged in
an ultrasonic bath (FS-14, Solid state/Ultrasonic, Fisher Scientific, USA) at 50°C for 35
min to disaggregate the starch-coated matrix of gelatine, carbohydrates and antioxidants of
astaxanthin (Schuep and Schierle, 1995). Test tubes were sealed with screw caps and
placed in a 70°C water bath (Model 2870, Precision, Thermo) for 5 min or until acetone
was brought to its boiling .point. Feces and feed samples were then removed from their
respective bath and 300 ~l (feces samples) or 1000 ~l (diet samples) of KOH 80% (w:v)
was added to each tube. Samples were then vortexed for 30 sec. and returned to the water
bath during 10 minutes for saponification to occur. Following saponification, the test tubes
were immediately placed in an ice bath to cool, and then 4 ml of cold deionizedwater was
31
poured into each test tube, followed by 4 ml of hexane. The test tubes were then vortexed
for 30 sec. and immediately centrifuged in a (RC3C, Dupont, Canada) at 2500 rpm (660 x
g) for 10 minutes.
A slightly different extraction technique was also used for flesh xanthophylls extraction.
Frozen fillets from three previously pooled fish were untaken from -80°C and unfrozen at
piece temperature for approximately 45 minutes. The wet filets were homogenized, then, 10
ml of cold acetone was added to 2g (± 0.01) of ground wet fish mixture in a Falcon tube .
. The mixture was homogenized with a handheld homogenizer (TI8, Ultra Turrax,.city, state,
USA) for 30 sec. The test tubes were sealed and placed in a 70°C water bath for 5 min. The
flesh samples were then removed from the bath and 1.25 ml KOH 80% (w:v) was added to
each tube. Samples were vortexed for 30 sec. and retumed to the water bath for 10 minutes.
After saponification, 5 ml of cold deionized water and 5 ml of hexane was added to the
mixture. The samples were then vortexed and centrifuged as described above.
Top layer of the test tubes containing hexane and the different pigments from diet, flesh or
feces was removed with a Pasteur pipet and added to a separate test tube. The hexane wash
was repeated two more times. AU hexane extracts were combined in the samè test tube.
Hexane was evaporated under a stream of nitrogen until dryness (1 h). The residue was then
solubilised in 150 ~l of methanol/MTBE solution (mobile phase A). Samples were stored at
-20 oC under nitrogen until injection into the HPLC column.
2.6.2 HPLC Analysis
The HPLC system was composed of a Waters automatic injector 717 with a Waters pump
600-MS, a photodiode array detector at450 and 475nm (Waters 996) and a system
controller (Waters 600-MS) running with Millenium 3.2 software. The carotenoids were
injected in a C-30 Carotenoid column (4.6 mm x 250 mm) with a guard column (4 mm x 23
mm). The solvents were methanol and methyl-tert-butyl-ether (Chromasolv® Plus, 99.9%,
for HPLC, Aldrich, Oakville, ON, Canada). The gradient systèm (mobile phase A and B)
and standards were prepared according to the method described in the publication of Moros
et al. (2002). Astaxanthin standard (A9335 - 250mg) was obtained from Sigma-Aldrich
32
Canada Ltd. (Oakville, ON, Canada), lutein (020307S-5mg) and zeaxanthin (020306S-
5mg) standards were fro.m ICC (Indo.fine Chemical Co.mpany, Hillsbo.rough, NJ, USA).
2.7 Statistical Analysis
Data were analyzed as a co.mpletely rando.mized blo.ck design using the GLM pro.cedure o.f
SAS 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Statistical significance was accepted at a
pro.bability value o.f p < 0.05 and the individu al tank was co.nsidered the experimental unit.
Significance differences between diets were determined by perfo.rming an analysis o.f
covariance (ANCOVA) for the chroma a* and b* and moisture, lipid and energy
co.mpositio.n o.f carcass; the co.variate was fish weight. The difference between diets was
also. perfo.rmed using a o.ne-way analysis o.f variance (ANDV A) fo.r the caro.teno.id
co.ncentratio.n in flesh, the digestibility and the gro.wth facto.rs. Variables were analysed
using multiple co.mpariso.n co.ntrasts and Least Significant Difference test (LSD) to. test the
effect o.f CGM type co.mbine with lysine level o.n different parameters o.f flesh.
3. Results
3.1 Ingredients and Experimental Diets
Astaxanthin level were similar amo.ng the five diets (Table 3). No. lutein and zeaxanthin
were fo.und in Diets 1, 3 and 5, pro.ving that yello.w CGM is the main facto.r causing the
presence o.f yello.w xantho.phylls in Diets 2 and 4. The levels o.f lutein and zeaxanthin fo.und
in these two. diets were also. similar.
Table 3: Xantho.phyllieveis in experimental diets.
Diets 1 2 3 4 5 ~g g-l feed
Xanthophylls (DM basis) Astaxanthin (~g/g) 25.7 24.5 28.0 28.7 27.1 Lutein (~g/g) 0.0 15.9 0.0 17.1 0.0 Zeaxanthin (~g/g) 0.0 10.0 0.0 10.9 0.0
33
3.2 Growth period
Weight gain and thermal-unit growth coefficient (TGC) were significantly influenced (p <
0.05) by the presence of CGM in the diets (Table 4). Feed conversion ratio (FCR, feed (as
is): live weight gain) did not differ significantly between diets. CGM type had no effect on
fish performances.
Table 4: Growth performance of rainbow trout fed with the experimental diet for 140 days
Diet Treatment l Performance2
Yellow White Initial Final Intake Mortality TGC FCR
Lysine (feed: CGM CGM weight (g) weight(g) (g DM/fish) (nb. fish) (%)
gain)
1 120 506a 446a 0 0.181 a 1.15
2 + 118 385b 292b 0 0.141 b 1.09
3 + 121 383b 289b 3 0.138b 1.10
4 + + 119 345b 259c 2 . 0.125b 1.15
5 + + 118 377b 274bc 0 0.138b 1.06
Significance
Pooled SEM3 1 30 7 0.013 0.06
1 Presence (+) or absence (-) of the ingredient in the respective diet 2 Column means followed by different letters differ significantly (p<0.05) 3 Pooled standard error of mean
3.3 Apparent digestibility of the experimental diets
Apparent digestibility coefficient (ADC) of astaxanthin (Astx), lutein (Lut), zeaxanthin
(Zeax), dry matter (DM), crude protein (CP), lipid, ash · and gross 'energy (GE) of the diets
are reported in Table 5. Pigments ADC tended to be higher when the feeds were lysine
supplemented. Control diet containing no CGM had a significant (p<0.05) effect on ADC
of an parameters.
34
Table 5: Appare.nt digestibility coefficient (ADC) of nutrients and pigments
Diet Treatment l Parameters2 (%)
Yellow White Lysine DM CP Lipid Ash GE(MJ/kg) Astx Lut
CGM CGM 1 77a 87a 91 a 38a 85a 69a ND 2 + 71 b 83b 84b 22b 78b 48c SO 3 + 71 b 81 b 85b 22b 77b 51 c ND 4 + + 68b 79b 85b 18b 75b 56bc 55 5 + + 71 b 83b 8Sb 20b 78b 63ab ND
Significance . Pooled SEM3 4 2 1 4 4 3 7
1 Presence (+) . or absence (-) of the ingredient in the respective diet 2 Column means followed by different letters differ significantly (p<O.OS) 3 Pooled standard error of mean ND: Not detected
3.4 Carcass and filet composition
There was no effect (p>O.OS) of CGM type on the different proximal analyses for both,
carcass and filet composition (Table 6). However, lysine supplementation in diets 4 and S
had a significant effect (p<0.05) on CP composition of carcass and filet. Lysine level had
also a significant effect on lipid composition of the carcass.
Table 6: Proximal filet analysis (wet weight basis).
Diet Treatment I Parameters~ Yellow White
Lysine Moisture CP Lipid Ash
CGM CGM (%) . (%) (%) (%)
Fillet composition 4.0b 1.2b 1 74.3 20.2a
2 + 74.1 18.Sb S.8a 1.3ab
3 + 73.6 18.7b 6.0a 1.3ab
4 + + 73.7 19.8a 4.3b 1.4a
5 + + 73.2 20.2a 4.2b 1.4a
Significance Pooled SEM3 0.4 0.2 0.5 0.1
I Presence (+) or absence (-) of the ingredient in the respective die~ 2 Column means followed by different letters differ significantly (p<0.05) 3 Pooled standard error of mean
GE (MJ/kg)
15.7b
18.5a
19.3a
19.3a
19.2a
O.S
Zeax
ND 54 ND 56 ND
6
3S
3.S Coloration
3.5.1 Colorimetrie analyses
Results from colorimetrie an·al ysis are p~esented in table 7. Luminance (L *) of fish flesh
fed with Diet 1 differ significantly (p<O.OS) of trout fed with Diets 2 ta S (Table 7).
However, there are significant differences (p<O.OS) for the yellow col our of flesh (chroma
b*) between the fish fed with white and yellow CGM. No differences in red col our (a*)
were found for fish fed with the five different diets.
Table 7 :Coloration of trout flesh.
Diet . Treatment l Colorimetrie Carotenoids 1 . 2 concentration (~g/g) ana ySlS
Yellow White Lysine L b Astx Lut Zeax
CGM CGM a
1 39.9c 14.2 16.2ab 6.3ab ND ND 2 + 44.6a 13.3 17.7a 3.6b 0.8 0.8a
3 + 44.7a 14.1 lS.9b 6.Sab ND O.l b
4 + + 43.1 ab 13.3 17.9a 6.1 ab 0.8 0.8a
S + + 42.3b 12.4 14.8b 9.3a ND 0.2b
Signifieance Pooled SEM3 O.S 0.8 0.6 1.2 0.2 0.1
1 Presence (+) or absence (-) of the ingredient in the respective diet 2 Column means followed by different letters differ significantly (p<O.OS) 3 Pooled standard error of mean ND: Not detected
3.5.2 Carotenoid analysis
The astaxanthin concentration of flesh did not differ significantly (p>O.OS) between fish fed
with the five different diets (Table 7). ·However, the carotenoids analyses have shown that
lysine supplementation (diets 4 and S) tend to increase the astaxanthin concentration in
trout flesh. The astaxanthin concentration differs significantly between fish fed with diet 2
and S only. Lutein has been found only in trout fed with yellow CGM. Zeaxanthin has been
found in aIl fish fleshexcept for those fed with the control di et. Lysine supplementation
seems ta have a small effect on lutein and zeaxanthin concentration of flesh.
36
4. Discussion
4.1 Growth performances
The present study shows a lower growth rate when CGM is used in trout feed at 30%
inclusion (Table 4). The TGC and final weight differed significantly (p <0.05) depending
on the origin of the protein source in. diets (fish meal or CGM). However, there was no
statistical differences in growth performance depending on CGM. type (Diets 2 to 4),
confirming that white CGM can be included at the same level as yellow CGM in diets
without affecting growth performance. Fish fed with diets containing CGM showed a lower
growth rate than those fed with a fish meal-based diet. In our study, the cause of the lower
performance is difficult to explain. The diets were formulated to meet aIl known nutritional
requirements, including essential amino acids. However, CGM is highly palatable
(Robinson et al., 2001), contains low levels of many antinutritional factors, except phytic
acid (Moyano et al., 1992) and is highly digestible (NRC, 1993).
4.2 Digestibility
Digestibility data for carotenoids may be difficult to interpret as this measurement does not
differentiate between absorption and degradation in the digestive tract. This measure
however allows to make a comparison between digestibility of a fishmeal control diet and
plant protein diets. Carotenoid apparent digestlbility coefficient (ADC) in salmonids is
relatively low compared to essential nutrients and typically ranges between 40 and 60%
(Bjerkeng et al., 1997; Bjerkeng and Berge, 2000; Ytrest0yl et al., 2004; and Ytrest0yl et
al., 2006). Digestion releases carotenoids within smalllipid droplets in the intestines. The
pigments are then transferred in lipid droplets and into the micelles that move across the
unstirred water layer adjacent to the microvilli. They are finally up taken by the enterocyte
and incorporated into chylomicrons. Po or utilization may be explained in general terms by
poor uptake from the intestinal tract and by po or retention of the absorbed astaxanthin at
)east partly caused by metabolic transformation (Schiedt et al., 1985). In the present study,
astaxanthin digestibility was range between 48 and 69% (Table 5J. Theses high values
compare favourably with previous estimates of digestibility might be due to an
37
amelioration of the extraction technique that allows detecting more pigments in the HPLC
system.
There is no effect of CGM type on the digestibility of dry matter (DM), crude protein (CP),
lipid, ash and gross energy (GE) (Table 5). The results show that feed containing white
CGM is as digestible as feeds containing yellow CGM. The only significant differences
found for the digestibility of these various components are in the control diet. These
differences could be caused by the addition of CGM in diets that altered pellet density and
hardness. The loss of feed in tanks would then underestimate the digestibility value of
different components.
4.3. Protein and lipid composition
The present study shows that there is a significant effect (p <0.05) of the different lysine
levels on the protein and lipid concentration of trout fillets (Table 6). Theses results are in
agreement with Cheng et al. (2003) who showed that lysine supplementation in plant
protein meal-based diets increased crude protein (CP) levels and reduced fat content in
whole body of rainbow trout. R~dehutscord et al. (2000) demonstrated that retenti on of
lysine and CP in trout body increased with · increased dietary lysine level disregarding
dietary CP level and retention of fat decreased with increased lysine supplementation.
4.4 Flesh coloration
4.4.1 Colorimetrie analyses
Several techniques are used to quantify flesh col our. One of the systems commonly used is
the CIE L * a * b * (CIE 2007). The colour is represented by a three dimension Cartesian
coordinates systemwhere each axis represent a parameter associated with the colouration.
The intensity of the light is represented by L *, the a * variations represent the red chroma
(600 positive) to green (-600 negative) and the b* variations represent the yellow chroma
(600 positive) to blue (-600 negative), respectively (Choubert et al. 1997; Hatlen et al.
1998). The colorometry results (Table 7) show that there is a significant difference in the
38
L * value between control diet and other four diets. This fact is in accordance with the
results of D ' Souza et al. (2006) who found a significantly lighter col or in the fillets from
trout fed the soy di et. The lighter color of the fillets has been attributed to lower
pigmentation (astaxanthin) in the soy diets as compared to diets containing fish meal where
the fish meal serves as a source of astaxanthin (Hardy, 1996; de Francesco et al. , 2004).
As expected, the b* value was significantly higher (p<0.05) in trout flesh fed with yellow
CGM diets (diet 2 and 4) than those fed with white CGM diet (diet 3 and 5). These results
are in accordance with Skonberg et al. (1998) who concluded that raw fillets from fi sh fed
with corn gluten-based diet (22.5% of diet) had a hig~est b* value than fi sh fed with di et
containing no yellow CGM. The different lysine levels and CGM type did not have a
significant effect on a* value (p>0.05).
4.4.2 Carotenoid concentration inflesh
Lutein was found onl y in trout flesh fed with yellow CGM (Table 7) indicating that this
ingredient is the main source of lutein in the di et. Zeaxanthin was measured in aIl fish flesh
except for those fed with diet 1. This fact suggests that white CGM may contain
·zeaxanthin. Lutein was found in the flesh at concentrations of 0.77 and 0.80~g g-l when
yellow CGM was present in diets. It is possible to discern a yellow coloration of white fish
flesh when carotenoids are found at concentration over 0.6~g g-l flesh (Lee, 1987). In this
study, it was not possible to distinguish the yellow coloration with the naked eye. This was
probably caused by the presence of astaxanthin mas king the yellowish coloration of flesh.
This fact has been demonstrated by Skonberg et al. (1998) proving that twelve weeks of
feeding with a expensi ve red pigment -supplemented feeds was sufficient to mask the
yellow color in fillets associated with high dietary inclusion of yellow CGM.
When yellow CGM is used in feeds, the level of astaxanthin in flesh is lower than when
white CGM is used, suggesting a possible competition between yellow xanthophylls (lutein
and zeaxanthin) and astaxanthin. Indeed, astaxanthin concentrations are ranged between
3.55 and 6.07~g g-l when yellow CGM is used and 6.50 to 9.29~g g-l when white CGM is
ùsed in feeds (Table 7). These results are in accordance with Kaushik et al. (2002) who
39
found that even in the presence of an adequate amount of astaxanthin in the diet, muscle
colour attributes are modified and muscle retention and concentration of astaxanthin are
lowered in the presence of very high levels of yellow CGM (de Francesco et al., 2004). On
the other hand, Olsen and Baker (2006) found that lutein does not influence flesh
astaxanthin pigmentation in the Atlantic salmon. Moreover, authors showed a weak but
non-significant tendency of lower flesh astaxanthin content, at a feed dose of 23/lg of lutein
g-l. However, this experiment has been done with synthetic lutein which may not be
absorbed in the same way as lutein from vegetable sources.
High level of lysine tends to increase astaxanthin concentration in trout flesh (Table 7).
Matthews et al. (2006) reported that a-actinin would be the protein responsible for the
astaxanthin binding in salmon. Assuming that lysine is involved in a-actinin deposition or
retention, it could also affect the astaxanthin concentration in flesh. However, no study has
yet been completed on the possible influence of lysine on pigment deposition in trout. A
poordietary protein quality involves a high protein synthesis linked to an increase of whole
body RNA level, ribosomal activity being constant and with the higher protein synthesis
rate always accompanied by a higher rate of protein degradation and a lower efficiency of
protein retention (Langar and Guillaume, 1994; Langar et al., 1993). The higher rate of
protein synthesis and degradation (higher protein turnover) seen in these studies with
protein of lower quality is highly relevant to the lysine hypothesis in our study. The
"protein quality" in' high corn gluten meal diet is poorer since it is probably sub-optimal in
lysine, i.e. level doesn't maximize protein deposition (Encarnaçao et al., 2004). Protein
,turnover is likely higher in high corn gluten meal diets slightly deficient in lysine. This
higher protein turnover may result in less efficient pigment deposition. More protein is
degraded and therefore the pigments may be degraded with protein. Transport and entry of
pigments into the cell or even amount of protein to bind the pigment may not be affected by
lysine level in feed. Adequate supply of lysine decrease protein turnover; protein retenti on
becomes more efficient, less protein is synthesize but less is degraded.
40
5. Conclusion
Utilisation of white CGM and lysine in aquaculture feed has several advantages. The
present study has shown that at an inclusion level of 30% in feed, yellow CGM impart a
yellow coloring effect on rainbow trout flesh (feed 140 days) contrary to white CGM that
has no undesirable coloring effect. It is therefÇ)re no longer necessary to use astaxanthin in
order to mask the yellowish coloration of flesh caused by yellow CGM. Moreover, CGM-
. synthetic-lysine based feed results in a significant increase of protein % and a reduction of
fat % of trout flesh. Synthetic lysine also tends to increase astaxanthin pigmentation
effectiveness, possibly through reducing structural protein degradation process. The
combination lysine-white CGM in diets could reduce feeding costs associated with
astaxanthin utilisation in aquaculture.
Acknowledgments
The financial and/or technical assistance of the N atural Sciences and Engineering Research
Council of Canada (NSERC) (Ottawa, ON, Canada), La Société de Recherche et de
Développement en Aquaculture Continentale inc. (SORDAC) (Quebec, Qc, Canada), and
Le Réseau Aquaculture Québec (RAQ) (Rimouski, Qc, Canada), Evonik (Kennesaw, GA.
USA), Radient Technologies (Burlington, ON, Canada), Martin Mills (Elmira, ON,
Canada) and Ontario Corn Producers Association (OCPA) (Guelph, ON, Canada) for
financial and technical support. The assistance of A. Desmeules and P. Dubé are
acknowledged.
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45
CONCLUSION GÉNÉRALE
Plusieurs stratégies visant à réduire les impacts de l'aquaculture sur l'environnement ont
été développées ces dernières années. Le perfectionnement des moulées en vue d'obtenir
une diminution des rejets de phosphore dans l'environnement représente une des
principales solutions. Pour ce faire, il est possible de remplacer les farines de poissons par
des farines végétales dans les moulées. La faible teneur en phosphore des protéines
végétales constitue le principal avantage de leur utilisation en alimentation. Le gluten de
maïs (GM) jaune constitue un bon substitut aux farines animales, car il est composé de plus
de 60% de protéines, est très digestible pour la truite et contient très peu de facteurs
antinutritionnels. Sa grande concentration en pigments xanthophylles jaunes en limite
cependant l'utilisation. En effet, lorsque le GM jaune est inclus à un haut niveau dans les
moulées, les xanthophylles jaunes causent une coloration jaunâtre indésirable à la chair de
poissons.
Cette étude avait pour objectif de tester l'utilisation du GM blanc dans les moulées pour
salmonidés afin de contrer les problèmes de coloration infligé par le GM jaune à la chair
des poissons d'élevage. À ce jour, aucune étude n'a été publiée sur l'utilisation du GM
blanc dans les moulées d'élevage, que ce soit dans l'industrie bovine, porcine ou aquacole.
Les données recueillies ont permis de constater que la chair des truites nourries avec le GM
blanc contient une concentration significativement plus basse de caroténoïdes
xanthophylles que les truites nourries avec le GM jaune. De -plus, les poissons alimentés
avec les diètes à base de GM blanc ne montraient pas de différence significative de
croissance par rapport aux truites nourries avec le GM jaune. Cet ingrédient peut donc être
utilisé à un niveau d'inclusion similaire au GM jaune sans toutefois induire une coloration
jaunâtre indésirable à la chair des truites arc-en-ciel. Les truites nourries avec les régimes à
base de GM n'ont cependant pas eu d'aussi bon indices de croissance que les truites
nourries avec la moulée témoin, contenant plus de farines de poisson. Ceci étant
probablement causé par une grande friabilité de la moulée qui a entraîné une désagrégation
de celle-ci une fois dans l'eau des bassins.
46
La présente étude démontre qu'un haut niveau de lysine a eu un effet significatif sur la
concentration en protéines des filets. Ces résultats étaient attendus puisque le GM est
déficient en lysine. L'ajout de cet acide aminé dans un régime en haute teneur en GM vient
donc maximiser la rétention des protéines du GM dans la chair de la truite. L'incorporation
d'un haut niveau de lysine des moulées à base de GM à aussi montré une augmentation non
significative de la concentration en astaxanthine dans la chair. Jusqu'à maintenant, aucune
étude n'avait encore testé l'effet qu'aurait cet acide aminé sur la pigmentation de la chair
des poissons. Il a cependant été prouvé que ce caroténoïde est intimement lié aux protéines
musculaires des salmonidés. Il est donc possible que l'augmentation de la rétention des
protéines et la diminution de la dégradation de celles-ci dans les muscles aient pour effet de
diminuer la dégradation de l' astaxanthine dans la chair des truites.
Les résultats de pigmentation montrent une plus grande concentration d' astaxanthine dans
la chair lorsque les truites sont nourries avec les moulées à base de GM blanc, ce qui porte
à croire qu'il existe une compétition entre les xanthophylles jaunes et l'astaxanthine à un
niveau quelconque. Une moulée contenant un haut niveau de GM jaune nécessiterait donc
beaucoup plus d'astaxanthine qu'une moulée à base de GM blanc afin de masquer la
coloration jaunâtre de la chair. L'utilisation d'une moulée à base de GM blanc
supplémentée en lysine permettrait aux fabriquant de moulée d'utiliser une moins grande
quantité d' astaxanthine pour obtenir la coloration rougeâtre typique des salmonidés.
Afin de mieux comprendre l'effet de différents niveaux de lysine sur la pigmentation de la
chair des poissons, il serait intéressant de faire une expérience dans laquelle différents
niveaux d'astaxanthine et de lysine sont incorporés à la moulée afin de constater à quel
point la lysine peut influencer la fixation musculaire des caroténoïdes.
47
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