impact toxique des nanoparticules sur une bactérie modèle

Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –

Ferrari 5 Mai 2008

Impact Toxique des Nanoparticules Impact Toxique des Nanoparticules sur une Bactsur une Bactéérie Modrie Modèèlele

ValValéérie Siron & rie Siron & Roselyne FerrariRoselyne Ferrari

10 nm

2 µM

ANR ECCODYN 2006ANR ECCODYN 2006--20082008

Journées Scientifiques de l’Environnement - 5 & 6 Mai 2008

1/19


Ferrari 5 Mai 2008

Grand Canyon, Arizona, USA

IndustriellesNaturelles

Rio solimoes

& Rio Negro,Amazonas, Brazil

Anthropogéniques

Soleil couchant à

Ivry, 1873, Guillaumin

1 µm

100 nm

Bactérie Magnétotactique

Fuego

de Antigua, Guatemala

2nm 6nm

Quantum Dots

Oxyde de Silicium

Oxyde de Titane Oxyde de Zinc

1 nm 100 nm1 Å 1 µmNanoparticules :

2/19

Les erreurs du PassLes erreurs du Passéé :

-- Amiante :Amiante : minéral utilisé

dans l’industrie entre 1960 et 19801995 : maladie professionnelle reconnue : l’asbestose

Pourquoi Pourquoi éétudier la toxicittudier la toxicitéé des nanoparticules ?des nanoparticules ?

20082008 : 500 produits sur le marché international contiennent des nanoparticules

Nombre en augmentationNombre en augmentation

-- Pas de lPas de léégislation gislation pour le suivi de l’utilisation de ces particules dont les caractéristiques révolutionnaires sont évidentes-- Trop peu de travauxTrop peu de travaux par des laboratoires indépendants étudient la toxicité

de ces nanoparticules

MAISMAIS

-- DDT : DDT : 1er Insecticide moderne développé

en 1948 1962 : DDT accusé

d’être cancérigène et

d’empêcher la reproductionMais toujours utilisé

dans la lutte contre le paludisme

3/19Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –

Ferrari 5 Mai 2008


Ferrari 5 Mai 2008

Les acteurs de notre Les acteurs de notre éétude : Les oxydes de Zinc tude : Les oxydes de Zinc -- ZnOZnO

Synthèse des nanoparticules de ZnO – ITODYS – Université Paris-Diderot

Brayner et al., Nano-Letters (2006)

B

A

B

A

B

A

B A BA

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

Zn-AcetateSurfactant : Tri-n-octylphosphine oxide (topo)

PolyVinylpyrrolidone (pvp)Solvant

: Diethylenglycol

Δ180°C

ZnOSurfactantsBA 10 nm

ZnO : Semi conducteur

Crème solaire

4/19


Ferrari 5 Mai 2008

Les acteurs de notre Les acteurs de notre éétude : tude : EscherichiaEscherichia colicoli

2 µM

Escherichia coli

Bioaccumulation????

Shewanella Cyanobactéries

Premier MaillonPremier Maillon

Dernier MaillonDernier Maillon

Organismes environnementaux

BioBio--accumulationaccumulationdes nanoparticulesdes nanoparticules dans la

chaîne alimentaire

??

Étude de l’impact des ZnO sur E. coli

- Bactéries pouvant se retrouver dans l’environnement- Conditions de croissance bien maîtrisées- Génome entièrement séquencé- Banque de «

mutants

»

disponibles

5/19


Ferrari 5 Mai 2008

ÉÉtude du Comportement des tude du Comportement des nanoparticules de ZnOnanoparticules de ZnO

Part 1Part 1

-

Caractérisation des Nanoparticules dans différents milieux : • Milieu de synthèse• Milieu de culture Luria

bertani

(LB)

• Milieu naturel : Eau de Seine

- Évaluation de la spéciation des nanoparticules dans les milieux testés• Protocole 1 -

Centrifugation

• Protocole 2 -

Ultrafiltration• Résultats d

’une modélisation dans les milieux

6/19


Ferrari 5 Mai 2008

CaractCaractéérisation des nanoparticules de ZnO dans le milieu de synthrisation des nanoparticules de ZnO dans le milieu de synthèèsese

• Microscopie Électronique en Transmission (MET)

Réseau cristallin d’une nanoparticule de ZnO de 19 nm

• Diffusion des rayons X à

petit angle (SAXS)

Confirmation de la taille des plus petites particules : 16 +/-

4nmMise en évidence d’agrégats de 150 +/-

20nm dans le DEG

Couche de Surfactant

Variabilité dans la taille des particules utilisées pour l’étude Forme = bâtonnets

Stabilité

des nanoparticules de ZnO ?

7/19


Ferrari 5 Mai 2008

CaractCaractéérisation des nanoparticules de ZnO dans les milieux testrisation des nanoparticules de ZnO dans les milieux testééss

(c) (d)

(a) (b)

Mili

eu d

e C

ultu

reLu

ria-B

erta

ni(L

B)

Eau

de

Sei

ne

stér

ilisé

es

Images de Microscopie Électronique à

Transmission

Agrégation des nanoparticulesde ZnO dans le

milieu de culture et dans l’eau de Seine

Hypothèse :Dans l’eau de Seine,

association des agrégats des nanoparticules

8/19


Ferrari 5 Mai 2008

Devenir des NPs de ZnO Devenir des NPs de ZnO –– Protocole 1Protocole 1

Protocole

Centrifugation 20 103

G

Quantification du zinc dans le surnageant

Dosage de fraction libre du zinc??Dosage de nanoparticules de ZnO? ou

Dosage d’un mélangeZnO/Zn2+?

Milieu de CultureMilieu de CultureLBLB

Eau de SeineEau de Seine

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10

0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Temps (h)

Frac

tion

du z

inc

tota

l dan

s le

sur

nage

ant %

NPsdans le culot

Prélèvement

Interaction NPs/milieu

En LB : solubilisation des NPs

En eau de Seine : agrégation des NPs

Mais Autre Protocole

Protocole de Centrifugation

9/19


Ferrari 5 Mai 2008

UltraFiltration : -

Seuil de coupure de 1KD Pas de passage des NPs-

Pas de rétention du zinc ionique, membrane perméable au zinc

L’eau de Seine n’induit pas une solubilisation des nanoparticules

Frac

tion

du z

inc

tota

l inf

érie

ure

à1K

D (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

03h6h

Eau de Seine

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

ZnO

Modélisation : 98 % du zinc est sous forme de nanoparticules de ZnO

Devenir des NPs de ZnO Devenir des NPs de ZnO –– Protocole 2 Protocole 2 –– Eau de SeineEau de Seine

10/19


Ferrari 5 Mai 2008

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ZnO-topo IV 2,5mM ZnO-pvpII 2,5mM Zn2+ 1,25mM

03h6h

LB

Frac

tion

du z

inc

tota

l inf

érie

ure

à1K

D (%

)Devenir des NPs de ZnO Devenir des NPs de ZnO –– Protocole 2 Protocole 2 –– LBLB

UltraFiltration : -

Seuil de coupure de 1KD Pas de passage des NPs-

Rétention de 50% du zinc ionique par la Matière organique du milieu

LB

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

ZnO

Donc, % de zinc libre est équivalent dans les deux protocoles réalisés

Solubilisation d’une grande majorité

des NPs introduites dans le milieu LB

Modélisation : 60 % du zinc est sous forme de nanoparticules de ZnO

11/19

ÉÉtude de la toxicittude de la toxicitéé des nanoparticules de ZnOdes nanoparticules de ZnO& &

Comparaison avec lComparaison avec l’’ion Znion Zn2+2+

1.

Effet des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique sur la croissance bactérienne

3.

Impact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactérienne

2.

Effet des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique sur la viabilité

bactérienne

4.

Implication d’un éventuel stress oxydatif

Part 2Part 2

12/19Siron –

Ferrari 5 Mai 2008 Interaction nanoparticules / bactérie modèle

Nom

bre

d’E

. col

i(10

8C

FU/m

L)

Temps (heures)N

ombr

e d’

E. c

oli(

108

CFU

/mL)

Temps (heures)

ZnOZnO ZnZn2+2+

Dans le milieu de culture - LB

croissance inhibée

en fonction1.

du temps d’interaction

2.

de la concentration

Les nanoparticules de ZnO inhibent la croissance bactérienne en LB

Action bactériostatique des nanoparticules

Effet des nanoparticules sur la croissance bactEffet des nanoparticules sur la croissance bactéérienne (1/2)rienne (1/2)

13/19Siron –


1mM

0.25mM

Ctl

Nom

bre

d’E

. col

i(10

8C

FU/m

L)

Temps (heures)N

ombr

e d’

E. c

oli(

108

CFU

/mL)

Temps (heures)

ZnOZnO ZnZn2+2+

Dans le milieu de culture - LB

Observation de l’effet des ions issus de la solubilisation des NPs

&&

Pas de différences des effets pour ZnO et Zn2+

Ctl

0,25mM

1mM

Ctl

0,25mM

1mM

2,5mM

ZnO-topoZnO-pvp

Effet des nanoparticules sur la croissance bactEffet des nanoparticules sur la croissance bactéérienne (2/2)rienne (2/2)

14/19Siron –



Ferrari 5 Mai 2008

Effet des nanoparticules sur la viabilitEffet des nanoparticules sur la viabilitéé cellulairecellulaire

Protocole :

LB

Eau deSeine

Pas de différence observée entre ZnO & Zn2+

effet des ZnO solubilisées

1mM : Toxicité

ZnO > Zn2+

+ on la conc en NPs+ les agrégats de ZnO

-

Interaction bactéries / NPs ou Zn2+ à

différentes concentrations-

Prélèvement à

différents temps d’incubation, dilutions et étalement sur boite de Pétri -

Dénombrement des colonies capables de se multiplier après traitement-

Rapport Essai / Contrôle0,25 mM

1 mM2,5 mM

ZnO Zn2+

Agrégats de NPs 2,5 mM : Toxicité

ZnO > Zn2+

Toxicité

agrégats de NPs = toxicité

Zn2+

0,25 mM : Toxicité

ZnO < Zn2+

Agrégats de NPs leuraction

0

20

40

60

80

100

3 6 9 24

0

20

40

60

80

100

ZnO Zn(II) ZnO Zn(II) ZnO Zn(II) ZnO Zn(II)

Cro

issa

nce

bact

érie

nne

% (e

ssai

/con

trôl

e)

Temps (heures)

15/19


Ferrari 5 Mai 2008

250 nm500nm

Non-traitées Traitées avec 2.5mM de ZnO (3h)

Apparition d’éléments

intracellulaires contenant du zinc et

du phosphore

Modification de la morphologie

bactérienne et de la taille des bactéries

2 µm

Non-traitées

2 µm

Traitées avec 2.5mM de ZnO (3h)

Impact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactImpact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactéériennerienne

• Microscopie Électronique à

Balayage (MEB)

• Microscopie Électronique à

Transmission (MET)

16/19


Ferrari 5 Mai 2008

Comparaison entre une souche sauvage et une souche Sod(délétée des gènes sodA

sodB)

Implication du stress oxydatif dans la toxicitImplication du stress oxydatif dans la toxicitéé des des NPsNPs

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Control

1mM ZnO-TOPOIV

1mM ZnO-PVPII

1mM ZnCl2

Control

1mM ZnO-TOPOIV

1mM ZnO-PVPII

1mM ZnCl2

Sauvage

Mutant SOD

17/19


Ferrari 5 Mai 2008

PerspectivesPerspectives

•

Nanoparticules agrégées dans le milieu de synthèse mais également dans les

milieux étudiés pour des temps courts d’interaction

• Protocole 1, 2 & modélisation :

- LB : Solubilisation progressive des nanoparticules de ZnO

- Eau de Seine : Agrégation des nanoparticules de ZnO

ÉÉtude du Comportement des nanoparticules de ZnOtude du Comportement des nanoparticules de ZnO

ConclusionConclusion

•

Détermination du devenir des nanoparticules dans différents milieux (Ajout de

Matière organique de diverses origines, polluants, …

)

• Influence des bactéries sur le devenir des nanoparticules

18/19


Ferrari 5 Mai 2008

PerspectivesPerspectives

ConclusionConclusion

•

Effet bactériostatique & bactéricide des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique en LB

• Effet bactéricide des nanoparticules de ZnO même agrégées en eau de Seine• MEB : Modification de la morphologie bactérienne•

MET : Apparition de particules intracellulaires contenant du zinc et

du

phosphore après traitement au ZnO

ÉÉtude de la toxicittude de la toxicitéé des nanoparticules de ZnOdes nanoparticules de ZnOComparaison ZnO / ZnComparaison ZnO / Zn2+2+

• MEB : Y a-t-il une modification de la morphologie bactérienne en présence de Zn2+ ?

• MET : Présence des particules intracellulaires avec Zn2+

?

•

En eau de Seine, recherche de sites d’action des NPs «

agrégées

»

et poursuite de

l’étude d’un stress oxydatif éventuel

Effet similaire dû

à

une solubilisation des NPs de ZnO

19/19

impact toxique des nanoparticules sur une bactérie modèle

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