impact de la variabilité génétique du blé sur son
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Impact de la variabilité génétique du blé sur son allergenicité : apport de l'allergénomique et de la
quantification par MRM
Roberta Lupi, Hélène Rogniaux, Sandra Denery-Papini, Colette Larré 29/10/2015
.02 Roberta Lupi/ Graines 2015 26/03/ 2015
Qu’est-ce qu’une allergie alimentaire?
Réponse anormale du système immunitaire d’un individu à l’ingestion d’une molécule (allergène)
Sensibilisation
Déclenchement aliment
intestin
IgE
mastocyte
histamine
Réaction immunitaire en 2 phases
Manifestations immédiates et différées
.03 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/2015
1-4% de la population mondiale (3-4% France) Différences en fonction de l’âge 2-8% enfants (5-7% - 15 ans, France) 1-2% adultes
Top 14 des allergènes en EU
Prévalence des allergies alimentaires
Wheat
.04 Roberta Lupi/Graines 2015
29/10/ 2015
26/03/ 2015
Prévalence des allergies au blé • Allergie alimentaire
Enfants : 0,2 à 0,5% de la population (Revue Zuidmeer 2008 - TPO)
Adultes : 0,2% de la population au Japon (Morita 2012 – SPT, IgE)
Adultes : 7,5% des réactions sévères aux aliments (Réseau Allergo-Vigilance – E Beaudouin et DA Moneret-Vautrin 2014)
• Allergie respiratoire : 15 % des professionnels
Le blé : un aliment mais aussi un allergène Fait partie des trois céréales les plus cultivées et consommées dans le monde Production mondiale : 650 Mt
Gluten : propriétés viscoélastiques
Protéines solubles (20%) Albumines/Globulines
.05 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015
Genre Triticum
Blé dur Triticum turgidum durum AA BB
= 5% du blé cultivé 14% de protéines
Blé tendre
Triticum aestivum AA BB DD = 95% du blé cultivé
11% protéines
Les blés cultivés
Autres blés (Surfaces très restreintes) • Triticum monococcum AA (Engrain= petit épeautre) • Triticum turgidum AA BB (Blé khorazan = kamut®, Farro) • Triticum spelta AA BB DD (épeautre) • …
.06 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015
Variabilité de la réponse allergique
Fraction Soluble T. aestivum T. durum
R. Lupi et al. / Journal of Cereal Science 60 (2014) 179-186
R. Lupi et al. / Journal of Cereal Science 60 (2014) 179-186
Lupi et al J of Cereal Science (2014)
Différences entre variétés
.07 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015
Complexité de la fraction A/G
Identification des allergènes du blé:
l’approche "allergénomique"
Immunoblots avec des sérums de patients
1 2 3 4 7 6
14 15 13
39 37 42
43 44 45
33
Globulin; 7
AAIs; 0 enolase; 2
serpin; 5
TPIsomerase; 2
G3P deshydroge
nase; 4
Engrain, A
Globulin; 15
AAIs; 3
enolase; 4
serpin; 4
TPIsomerase; 4
G3P deshydroge
nase; 0
BobWhite, ABD Svevo, AB
Globulin; 11
AAIs; 2
enolase; 1
serpin; 3
TPIsomerase; 0
G3P deshydroge
nase; 4
Variabilité génétique des protéines fixant les IgE
Lupi et al, J of Proteomics (2013); Larré et al, J of Proteomics (2011)
.08 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015
• Détection et quantification par les IgE (Pb sérum)
• Dosage de certains allergènes par des techniques immunochimiques (ELISA), peu d’anticorps spécifiques disponibles.
• Dosage par LC-HPLC développé pour un seul allergène actuellement (Prandi et al, 2014)
Dosage des allergènes du blé
OBJECTIF
Etat de l’art
Mise en place d’une méthode de quantification relative, ciblée, par spectrométrie de masse MS/MS
(méthode de pseudoMRM : Multiple Reaction Monitoring)
.09 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015
Matériel et démarche
T. monococcum T. durum T. aestivum
AA AABB AABBDD
Genesi, Masaccio Pitagora, Casanova, Kamut Engrain, DV92
Analyse du protéome de la fraction A/G Identification des allergènes
Choix des protéines cibles
Peptides protéotypiques + transitions
Choix des peptides et des transitions
Analyse quantitative par MRM
Rogniaux et al., Proteomics 2015, 15, 1736–1745
Quantification of 12 allergens in 7 genotypes
T. monococcum T. durum T. aestivum
AA AABB AABBDD
Genesi, Masaccio Pitagora, Casanova, Kamut Engrain, DV92
Rogniaux et al., Proteomics 2015, 15, 1736–1745
.011 Roberta Lupi/Protéome Vert 26/03/ 2015
Instrument LTQ-Orbitrap VELOS Traitement de données avec Skyline
Pitagora (T durum) Genesi (T. Aestivum)
Méthode ciblée
Ions de transitions 1 ion pour la quantification (CV<10%) 2 ions pour qualifier la transition
Quantification par intégration des pics
6 1.4
.012 Roberta Lupi/Protéome Vert 29/10/ 2015
Hexa Di Tetra
Di
Hexa
Tetra
Quantification of 12 allergens in 7 genotypes
.013 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015
• Quantification simultanée de douze allergènes du blé • Mise en évidence d’une variabilité de l’allergénicité intra et inter espèce composition en allergènes quantité relative • Caractérisation de la composition en allergènes par variété • Lien entre réponses allergiques observées entre les génotypes et la
distribution en allergène.
Conclusions
• Utilisation au cours des étapes de sélection ( faible quantité de blé requise) • Méthode de détection d’allergènes spécifiques dans des aliments avec une
limite : Cas particulier : AAI 0,19 orthologues contenant le peptide ciblé présents dans l’orge
• Evolution possible vers de la quantification absolue • Complémentaires de dosages ELISA en l’absence d’anticorps spécifiques
Perspectives
.014 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015
Remerciements
Collaborations externes INRA UMR 1095 GDEC/UBP Clermont (G. Branlard) Università degli Studi della Tuscia, DAFNE, Italy ( S. Masci) Department of Biotechnology,Università degli Studi di Verona, Italy (C. Rizzi) Servizio di Allergologia ed Immunologia Clinica, 33100 Udine, Italy (M. De Carli) Service d'Allergologie, CH Jean Monnet, 88021 Epinal (D.A. Moneret-Vautrin, E. Beaudouin) Unité Allergologie Générale CHU – ANGERS, (M. Drouet)
BIBS
Hélène Rogniaux Virginie Lollier Marija Pavlovic Marion Hamon Mathilde Joint Audrey Geairon
Colette Larré Sandra Denery Olivier Tranquet Mathilde Claude Maxime Perot Laure Castan Florence Pineau Gilbert Deshayes Chantal Brossard Marie Bodinier Gregory Bouchaud Valérie Echasserieau
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