Immunologie : principes et applicationsaux maladies neurologiques

Dr T. VINCENTLaboratoire d’Immunologie

Hôpital St ELOI - CHU Montpellier

MAI = rupture de tolérance

* Tolérance centrale (« élimination physique »)

délétion des clones auto-réactifs

* Tolérance périphérique (« élimination fonctionnelle »)

contrôle des clones auto-réactifs persistants

LT: thymusLB: moelle osseuse

anergieLymph Treg...

MAI = RI contre Ag du soi

MAI à médiation humorale: myasthénie, S. de Guillain Barré, Devic

MAI à médiation cellulaire: SEP

Réponse humorale: lymphocytes B / plasmocytes / auto-Ac

Réponse cellulaire: lymphocytes T effecteurs TH1 IFN

TH17 IL17

“quelles sont les maladies neurologiquespériphériques ou centrales

qui ont un immuno-marqueur qui sert au diagnostic et au suivi des patients”

Qu’est ce qu’un “bon” bio-marqueur ??Qu’est ce qu’un “bon” bio-marqueur ??

- sensible: capacité à dépister tous les patients

- spécifique: capacité à ne détecter que les patients

- précoce

- corrélé à la clinique: poussées - rémissions

Existe-t-il ??Existe-t-il ??

Où et comment le chercher ??Où et comment le chercher ??

- accessible

- facile à identifier

Quel paramètre cibler ??Quel paramètre cibler ??

- Tolérance centrale: évaluation de la fonction thymique

phénotypage lymphocytaire: LT naïfs (CD45RA+)

TREC (T cell Receptor Excision Circles) / PCR

- Tolérance périphérique: Treg CD4+CD25+Foxp3+

analyse quantitative: phénotypage lymphocytaire

analyse fonctionnelle: culture cellulaire

Quel paramètre cibler ??Quel paramètre cibler ??

- Réponse cellulaire: clones de LT auto-réactifs

phénotypage lymphocytaire: activation T (HLA-DR) ELISPOT tétramères dosage des cytokines effectrices (IFN, IL17...)

- Réponse humorale: Auto-Ac

Présents dans le sérum = accessibles techniques d’identification “simples”

souvent témoins de la maladie (onconeuronaux) parfois pathogènes (SGB, Devic)

Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??

dépistage

Immunofluorescence indirecte (IFI)Immunofluorescence indirecte (IFI)

avantages inconvénients

- Sensible

- Dépistage simultané deplusieurs Ac

- peu onéreux

- peu spécifique

- lecture parfois délicate

- opérateur dépendant

A

B

C

WM

GL

ML

MLWM

MLWM

NMO-IgG

Anti-endothelium

Marquage atypiquede la BHE

Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??

Identification +/- quantification

ELISAELISA

avantages inconvénients

- Quantitatif

- Sensible

- +/- spécifique

- Spécificité parfois moyenneEx: anti-gangliosides

- Où fixer le cut-off ?? Ex: anti-MAG

Exemple des neuropathies périphériquesAvec Ac anti-myéline / MAG

dépistage indentification

- Sensibilité: 73%- Spécifique: 96%

ELISA anti-MAGELISA anti-MAGIFI sur nerf sciatiqueIFI sur nerf sciatique

Cut-off à 1000 BTU- sensibilité: 95% - spécifique: 87%

Cut-off à 10 000 BTU- sensibilité: 62%- spécifique: 100%

Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??

Identification +/- quantification

Western blotWestern blot

avantages

- identifications multiples

inconvénients

- perte des épitopes conformationnels- lecture parfois délicate

40 kDa

30 kDa

50 kDa

60 kDa

WB EuroimmunExtrait de cervelet de primate

Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??

Identification +/- quantification

immunodotimmunodot

avantages

- conformation respectée- Sensible- Spécifique

inconvénients

- au mieux semi-quantitatif

Anti-GT1a ++Anti-GQ1b +++

IgG

IgM

Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??

Identification +/- quantification

Test cellulaire (CBA)Test cellulaire (CBA)

avantages

- conformation native- Sensible- Spécifique- +/- quantitatif

inconvénients

- lourdeur (culture)- non standardisable

Lignée AQP4+

Lignée AQP4-

Bio-marqueurs:

beaucoup de candidatsmais peu d’élus...

Department of Neurology, University of Heidelberg, Germany

Journal of Neuroinflammation 2010, 7:21

= Anti-ARHGAP26

- Caucasienne

- Pas d’antécédents particuliers

- “rhume” bénin 2 semaines auparavant

- ataxie cérébelleuse inflammatoire sub-aiguë Ataxie + dysarthrie + diplopie

Patiente de 33 ans

IFI sur coupe de cervelet de souris

Marquage intense de la couche moléculaire + cell de Purkinje+ substance blanche

Sérum 1/ 6000 – LCR 1/2000

IFI sur coupe de cervelet de singe + LCR

Sans pré-adsorption pré-adsorption / IP3R1

pré-adsorption / ARHGAP26

Ataxie Cérébelleuse Auto-immune (ACA)avec présence d’IgG1 anti-ARHGAP26

Canadian Pediatric Demyelinating Study

IFI sur coupe de cervelet de singe (IL) + sérum

Cellules de Purkinje + couche moléculaire

IFI sur coupe de cervelet de singe (IL) + sérum

Cellule de Purkinje et ses dendrites

- Caucasien

- Pas d’antécédents particuliers

- clinique de type « ADEM-like »

- monophasique: asymptomatique depuis 2 ans

Garçon de 4 ans

Anti-aquaporine-4

Le bio-marqueurs parfait ??

NMO-IgGNMO-IgG

Sensitivity :Sensitivity : 73% 73%

Specificity :Specificity : 91% 91%

Absent in MS

Early diagnosis specific treatment

WM

GL

ML

IIF on primate cerebellum slides (1/100)IIF on primate cerebellum slides (1/100)(the Binding Site)(the Binding Site)

Lig

né

e A

QP

4-L

ign

ée

AQ

P4+

Test cellulaireTest cellulaireAquaporine-4Aquaporine-4

SensibleAQP4 spécifiquequantitatif

100 101 102 103 104

EGFP

MFI228.3

293-EGFP 293-AQP4/EGFP

100 101 102 103 104

EGFP

MFI1.73

AP

C

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

EGFP

MFI1.70

100 101 102 103 104

EGFP

MFI69.4

AP

C

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

EGFP

MFI1.68

100 101 102 103 104

EGFP

MFI4.7

AP

C

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

1/8001/3200

1/51200

Corrélation Corrélation

concentration sérique des anti-AQP4concentration sérique des anti-AQP4 / /

Activité de la maladieActivité de la maladie

Jarius S et al. Antibody to aquaporin-4 in the long-term course of

neuromyelitis optica. Brain 2008;131:3072-80.

Takahashi T et al. Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO: a study on antibody titre. Brain

2007;130:1235-43.

Maladie de DevicMaladie de Devic

Au diagnostic: - screening IFI

- identification / quantification rAQP4

Pour le suivi: Test quantitatif rAQP4

Waters P. et al., The International MS Journal 2008; 15: 99-105, p 4

Mc Keon et al. Arch Neurol. 2009 Sep;66(9):1134-8.

IFI-m RIPA CBA-IF CBA-FACS

Se (%) 47 33 39 30

Sp (%) 95 97 100 97

Antiaquaporin 4 antibodies detection by different techniques in neuromyelitis optica patients.

Fazio R. et al. Mult Scler. 2009 Oct; 15 (10) p1553-63

Titres NMO-IgG Mild # Severe

Pro

pidi

um io

dide

pos

itiv

e ce

lls

%

Corrélation Corrélation activité cytolytique / sévéritéactivité cytolytique / sévérité

Hinson SR, et al. Prediction of neuromyelitis optica attack severity by quantitation of

complement-mediated injury to aquaporin-4-expressing cells. Arch Neurol 2009;66:1164-7.

Corrélation Corrélation activité cytolytique / concentration sériqueactivité cytolytique / concentration sérique

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 100 200 300 400 500AQP4 (AU/ml)

Anti-AQP4 (UA/ml)

Ac

tivi

té c

yto

lyti

qu

e (U

A/m

l)

Absence de corrélation Absence de corrélation concentration sérique / évolutionconcentration sérique / évolution

An

ti-A

QP

4 (U

A/m

l)

rémission rechute

NMONMO

Au diagnostic: - screening IFI Sensibilité # 50-60 % spécificité > 90%

- identification / quantification rAQP4

Pour le suivi: rAQP4 concentration sérique ?? activité cytolytique ??

Akman-Demir G. et al. J Neurol. 2010 Oct 17. [Epub ahead of print]

Pronostic: NMO-IgG+ EDSS = 5.1 2.2 (n=21)NMO-IgG- EDSS = 3.5 1.7 (n=14)

NMO-IgGNMO-IgG

Recurrent optic neuritis:Recurrent optic neuritis: 10% 10%

LETM:LETM: 25% 25%

Risk of relapses

Risk of NMO

« NMO-related« NMO-relatedDiseases »Diseases »

Valeur ajoutée d’unexamen biologique

De la bonne interprétation d’un résultat biologiqueDe la bonne interprétation d’un résultat biologique

D’après H.Delacour et al. Immuno-analyse et biologie spécialisée (2009) 24, 92-99

Probabilbité pré-test (%) Probabilbité post-test (%)

forte

faible

Très forte

moyenne

Très faible

(+)

(-)

(+)

(-)

interventionintervention

abstentionabstention

indécisionindécision

Seuil d’affirmationDe la maladie

Seuil d’exclusionDe la maladie

Préscription de Préscription de l’analyse biologiquel’analyse biologique

Communicating diagnostic accuracy

Question 1

• Sensitivity: 95%

• Specificity: 90%

• Pre-test probability: 2.5%

• Post-test probability ???

• 10%

• 20%

• 50%

• 80%

• 90%

Communicating diagnostic accuracy

Question 1

• Sensitivity: 95%

• Specificity: 90%

• Pre-test probability: 2.5%

• Post-test probability ???

• 10%

• 20%

• 50%

• 80%

• 90%

Communicating diagnostic accuracy

Question 1

• Sensitivity: 95%

• Specificity: 90%

• Pre-test probability: 2.5%

• Post-test probability ???

• 10%• 20% (9% of respondents)

• 50%

• 80%

• 90%

Tendance à surestimer la probabilité d’une maladie après un résultat biologique positif

Rapports de vraisemblance“likelihood ratios”

RV+ : probabilité d’avoir un test + si on est malade /probabilité d’avoir un test + si on n’est pas malade

= Se / (1 – Sp)

RV- : probabilité d’avoir un test - si on est malade /probabilité d’avoir un test - si on n’est pas malade

= (1 – Se) / Sp

Rapports de vraisemblance“likelihood ratios”

RV+ RV-Apport

diagnostique

>10

5-10

2-5

1-2

1

<0.1

0.1-0.2

0.2-0.5

0.5-1

1

Très fort

Fort

Modéré

Faible

Nul

Probabilité pré-test x RV = probabilité post-test

Nomogramme de FaganNomogramme de FaganH.Delacour et al. Immuno-analyse et biologie spécialisée (2009) 24, 92-99

Probabilbité pré-test (%) Probabilbité post-test (%)Rapport de

vraissemblance

99

990.1

0.1

RV-

RV+

Probabilité pré-test x RV = probabilité post-test

anti-GM1+, anti-MAG 1000-2000 U...

problème de certains positifs faibles

Mr Thierry L. (53 ans)

- HIV + - HCV + (1995)- infactus du myocarde (02/2011)- Kc du grêle + métastases hépatiques (2011)- diabète, maladie bipolaire...

- Juin 2011: syndrôme cérébelleux + déficit moteur membre inf GTDM et IRM # normaux

Recherche d’Ac onconeuronaux

IFI sur lame de cervelet de primate (1/100)IFI sur lame de cervelet de primate (1/100)

y = 0,0011x2 + 0,7621x + 3,1273

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 100 200 300 400 500 600 700

delta MFI

UA

/ml

100 101 102 103 104

EGFP

293.027

293-AQP4/GFP

EGFP100 101 102 103 104

EGFP

293.015

293-GFP

EGFP

An

ti-I

gG

-AP

C

Anti-AQP4 = 368 UA / ml

NMO paranéoplasique ?

NMO post-infectieuse ??

Faux positif ???

RV+ = sensibilité / (1 - spécificité)

= 49

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Anti-AQP4

Probabilité pré-test

pro

bab

ilit

é p

ost-

test

CONCLUSIONS

* la vérité d’un jour n’est pas forcément celle du lendemain...* la vérité d’un jour n’est pas forcément celle du lendemain...

* toujours considérer le contexte clinique * toujours considérer le contexte clinique probabilité pré-test probabilité pré-test

Prescription ciblée

* attention de ne pas sur-estimer la valeur d’un résultat positif* attention de ne pas sur-estimer la valeur d’un résultat positif

Probabilité post-test = RV x probabilité pré-test

Quelle technique / sensibilité / spécificité / RV

* Attention aux performances diagnostique d’un test biologique* Attention aux performances diagnostique d’un test biologique